АНТИТЕЛА ПРОТИВ MST1R И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ Российский патент 2014 года по МПК A61K39/00 

Предшествующий уровень техники

MST1R (рецептор стимулирующего макрофаги белка 1; MST1R человека, номер доступа в GenBank NM_002447.2), также описанный как RON или CDw136, представляет собой родственную c-Met тирозинкиназу, находящуюся в клетках эпителиального происхождения. Одноцепочечный предшественник, состоящий из 1400 аминокислот расщепляется на связанный дисульфидной связью гетеродимер, состоящий из внеклеточной α-цепи 40кДа и β-цепи 150кДа, которая содержит внутриклеточный тирозинкиназный домен. Подобно c-Met, MST1R индуцирует рост инвазивных клеток, миграцию, диссоциацию клеток и вхождение в матрикс. [Wang, et al., Carcinogenesis 24, 1291-1300, 2003; Lee, et al., Clin. Cancer Res. 11, 2222-2228, 2005]. Обе тирозинкиназы сверхэкспрессируются при ряде злокачественных опухолей, таких как рак молочной железы, легкого или предстательной железы [O'Toole, et al., Cancer Res. 66, 9162-9170, 2006]. Единственным лигандом MST1R, известным до настоящего времени, является MSP, стимулирующий макрофаги белок. Связывание MSP запускает аутофосфорилирование тирозинкиназного домена MST1R. Активированный таким образом MST1R запускает ряд каскадов в различных путях. [Wang, et al., Carcinogenesis 24, 1291-1300, 2003; O'Toole, et al., Cancer Res. 66, 9162-9170, 2006]. Также сообщалось об образовании биологически активных укороченных вариантов MST1R вследствие сплайсинга мРНК [Wang, et al., Carcinogenesis 24, 1291-1300, 2003]. Например, в некоторых образцах колоректальной карциномы выявлен вариант MST1RΔ160, и его сверхэкспрессия без лиганда опосредовала образование опухолей у "голых" мышей [Zhou et al., Oncogene 22, 186-197, 2003]. Антитела против MST1R, такие как IMC-41A10, блокируют взаимодействие лиганд-рецептор и являются эффективными ингибиторам рецептора и нисходящей передачи сигнала, клеточной миграции и образования опухоли [O'Toole, et al., Cancer Res. 66, 9162-9170, 2006].

В заключение, антитела, блокирующие активность MST1R имеют потенциальную терапевтическую применимость при злокачественной опухоли человека.

Сущность

Объектом изобретения являются антитела человека и гуманизированные антитела против MST1R.

Другим объектом являются антитела, которые безопасны для человека.

Еще одним объектом изобретения являются способы лечения заболевания и/или состояний, связанных с активацией MST1R, с использованием одного или нескольких антител по изобретению. Эти и другие объекты более подробно описаны в настоящем документе.

В одном из вариантов осуществления выделенное антитело или функциональный фрагмент, содержащий антиген-связывающую область, специфичны к MST1R.

Такое антитело или его функциональный фрагмент могут содержать антиген-связывающую область, содержащую область H-CDR3 (CDR3 тяжелой цепи) с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:1 или 4; антиген-связывающая область может дополнительно содержать область H-CDR2 (CDR2 тяжелой цепи) с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:2 или 5; и антиген-связывающая область также может содержать область H-CDR1 (CDR1 тяжелой цепи) с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:3 или 6. Такое антитело или его функциональный фрагмент могут содержать антиген-связывающую область, содержащую область L-CDR3 (CDR3 легкой цепи) с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:7, 8, 9, 10, 11 или 12; антиген-связывающая область может дополнительно содержать область L-CDR1 (CDR1 легкой цепи) с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:13 или 15; и антиген-связывающая область также может содержать область L-CDR2 (CDR2 легкой цепи) с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:14 или 16.

Антитела (и их функциональные фрагменты), описываемые в настоящем документе, могут содержать антиген-связывающую область, специфичную к эпитопу MST1R, где эпитоп содержит один или несколько аминокислотных остатков аминокислоты с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:17. Для определенных антител эпитоп может быть линейным, тогда как для других он может быть конформационным (т.е., прерывным). Антитело или его функциональный фрагмент с одним или несколькими из этих свойств могут содержать антиген-связывающую область, содержащую область H-CDR3 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:1 или 4; антиген-связывающая область может дополнительно содержать область H-CDR2 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:2 или 5; и антиген-связывающая область также может содержать область H-CDR1 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:3 или 6. Такое специфичное против MST1R антитело по изобретению может содержать антиген-связывающую область, содержащую область L-CDR3 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:7, 8, 9, 10, 11 или 12; антиген-связывающая область может дополнительно содержать область L-CDR1, приведенную в SEQ ID NO:13 или 15; и антиген-связывающая область также может содержать область L-CDR2 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:14 или 16.

Варианты пептидов последовательностей, описываемых в настоящем документе также включены в различные варианты осуществления изобретения. Таким образом, варианты осуществления включают антитела против MST1R с аминокислотной последовательностью тяжелой цепи, область CDR которых по меньшей мере на 60 процентов идентична областям CDR с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 5 или 6; и/или область CDR которых по меньшей мере на 80 процентов гомологична областям CDR с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 5 или 6. Кроме того, изобретение включает антитела против MST1R с аминокислотной последовательностью легкой цепи, область CDR которых по меньшей мере на 60 процентов идентична областям CDR с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 или 16; и/или область CDR которых по меньшей мере на 80 процентов гомологична областям CDR с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 или 16.

Описываемое в настоящем документе антитело может представлять собой IgG (например, IgG₁), тогда как фрагмент антитела может представлять собой, например, Fab или scFv. Таким образом, фрагмент антитела по изобретению может представлять собой или может содержать антиген-связывающую область, ведущую себя одним или несколькими способами, как описано в настоящем документе.

Другой вариант осуществления также относится к выделенным последовательностям нуклеиновых кислот, каждая из которых может кодировать антиген-связывающую область антитела человека или его функциональный фрагмент, специфичные к эпитопу MST1R. Такая последовательность нуклеиновой кислоты может кодировать вариабельную область тяжелой цепи антитела и содержать последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:18, 20, или последовательность нуклеиновой кислоты, в условиях с высокой жесткостью гибридизующуюся с комплементарной цепью SEQ ID NO:18 или 20. Нуклеиновая кислота может кодировать вариабельную область легкой цепи выделенного антитела или его функционального фрагмента и может содержать последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:22, 24, 26, 28, 30, 32, или последовательность нуклеиновой кислоты, в условиях с высокой жесткостью гибридизующуюся с комплементарной цепью SEQ ID NO:22, 24, 26, 28, 30 или 32.

Описываемые в настоящем документе нуклеиновые кислоты подходят для рекомбинантного получения. Таким образом, векторы и клетки-хозяева, содержащие последовательность нуклеиновой кислоты, описываемую в настоящем документе, также представляют собой дополнительные варианты осуществления.

Описываемые в настоящем документе композиции можно использовать для терапевтического или профилактического применения. Таким образом, эти варианты осуществления включают фармацевтическую композицию, содержащую антитело по изобретению (или функциональный фрагмент антитела) и его фармацевтически приемлемый носитель или эксципиент. В связанном аспекте другой вариант осуществления включает способы лечения нарушения или состояния, связанных с нежелательным присутствием MST1R или экспрессирующих MST1R клеток. Такой способ предусматривает стадии введения индивидууму, при необходимости, эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей антитело по изобретению, как описано или предусмотрено в настоящем документе.

Другие варианты осуществления относятся к выделенным эпитопам MST1R, в линейной или конформационной форме, и их использованию для выделения антитела или его функционального фрагмента, где антитело или фрагмент антитела содержат антиген-связывающую область, специфичную к указанному эпитопу. При этом конформационный эпитоп может содержать один или несколько аминокислотных остатков из SEQ ID NO:17. Эпитоп MST1R можно использовать, например, для выделения антител или их функциональных фрагментов (где каждое из антител или фрагментов антител содержит антиген-связывающую область, специфичную к такому эпитопу), включающего стадии приведения в контакт указанного эпитопа MST1R c библиотекой антител и выделения антител(а) или их функциональных фрагментов(а).

В другом варианте осуществления изобретение относится к выделенному эпитопу MST1R, по существу состоящему из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:17. Как используют в настоящем документе, такой эпитоп "по существу состоит из" одной из непосредственно предшествующих аминокислотных последовательностей плюс обладает дополнительными характеристиками, при условии, что дополнительные характеристики существенно не влияют на основные и новые характеристики эпитопа.

Изобретение также относится к набору, содержащему (i) выделенный эпитоп MST1R, содержащий один или несколько аминокислотных остатков аминокислотной последовательности SEQ ID NO:17; (ii) библиотеку антител и (iii) инструкции для использования библиотеки антител для выделения одного или нескольких представителей такой библиотеки, которые специфически связываются с таким эпитопом.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

Настоящее изобретение основано на открытии новых антител, специфичных или имеющих высокую аффинность к MST1R и способных обеспечивать терапевтический эффект у индивидуума. Описываемые в настоящем документе антитела, которые могут представлять собой антитела человека или гуманизированные антитела, можно использовать во многих ситуациях, как более подробно описано в настоящем документе.

Таким образом, антитело "человека" или функциональный фрагмент антитела человека определены как антитело или функциональный фрагмент антитела, не являющиеся химерными (например, не являющиеся "гуманизированными") и не полученные (целиком или частично) у не являющихся человеком видов. Антитело или функциональный фрагмент антитела человека может быть получено у человека, или они могут представлять собой синтетическое антитело человека. "Синтетическое антитело человека" определено в настоящем документе как антитело с последовательностью, целиком или частично, полученной in silico из синтетических последовательностей, основанных на анализе известных последовательностей антител человека. Конструирование последовательности антитела человека или его фрагмента in silico можно осуществлять, например, посредством анализа базы данных последовательностей антител или фрагментов антител человека и конструирования полипептидной последовательности с использованием данных, полученных из нее. Другим примером антитела или функционального фрагмента антитела человека является антитело или функциональный фрагмент антитела человека, кодируемые нуклеиновой кислотой, выделенной из библиотеки последовательностей антител человеческого происхождения (т.е., такая библиотека основана на антителах, полученных у человека, в качестве природного источника).

"Гуманизированное антитело" или функциональный фрагмент гуманизированного антитела определены в настоящем документе как антитело или функциональный фрагмент антитела, которые (i) получены из не являющегося человеком источника (например, у трансгенной мыши, обладающей гетерологичной иммунной системой), где антитело основано на последовательности зародышевой линии человека; или (ii) являются химерными, где вариабельный домен получен из не являющегося человеком источника, а константный домен имеет человеческое происхождение, или (iii) содержат привитые определяющие комплементарность области (CDR), где CDR вариабельного домена происходят из являющегося человеком источника, тогда как один или несколько каркасов вариабельного домена являются человеческого происхождения и константный домен (если присутствует) является человеческого происхождения.

Как используется в настоящем документе, антитело "специфически связывается с" антигеном, "специфично к" антигену или "специфически распознает" антиген (в настоящем документе MST1R), если такое антитело может различать такой антиген и один или несколько эталонных антигенов, так как специфичность связывания не является абсолютным, но является относительным свойством. В его наиболее общей форме (и когда не приведено определенного указания) "специфическое связывание" относится к способности антитела различать представляющий интерес антиген и неродственный антиген, как определено, например, в соответствии с одним из приведенных ниже способов. Такие способы включают, но ими не ограничиваются, вестерн-блоттинг, тесты ELISA, RIA, ECL, IRMA и пептидное сканирование. Например, можно проводить стандартный анализ ELISA. Оценку можно осуществлять посредством стандартного развития окраски (например, вторичное антитело с пероксидазой хрена и тетраметилбензидин с пероксидом водорода). Реакцию в определенных лунках оценивают по оптической плотности, например, при 450 нм. Обычный фон (=отрицательная реакция) может составлять 0,1 OD; обычная положительная реакция может представлять собой 1 OD. Это означает, что различие положительного/отрицательного может быть более чем 10-кратным. Как правило, определение специфичности связывания проводят с использованием не одного эталонного антигена, а набора приблизительно из трех-пяти неродственных антигенов, таких как порошковое молоко, BSA, трансферрин или т.п.

Однако "специфическое связывание" также может относиться к способности антитела различать антиген-мишень и один или несколько близкородственных антигенов, которые используют в качестве ориентиров, например, MST1R-мишень и семафорин-мишень. Кроме того, "специфическое связывание" может относиться к способности антитела различать различные части его антигена-мишени, например, различные домены или области MST1R, такие как эпитопы в N-концевой или в C-концевой области MST1R-мишени, или один или несколько ключевых аминокислотных остатков или участков из аминокислотных остатков MST1R-мишени.

Также, как используют в настоящем документе, "иммуноглобулин" (Ig) в настоящем документе определен как белок, принадлежащий классу IgG, IgM, IgE, IgA или IgD (или любому их подклассу), и включает все общеизвестные антитела и их функциональные фрагменты. "Функциональный фрагмент" антитела/иммуноглобулина в настоящем документе определен как фрагмент антитела/иммуноглобулина (например, вариабельная область IgG), который сохраняет антиген-связывающую область. "Антиген-связывающая область" антитела, как правило, находится в одной или нескольких гипервариабельных областях антитела, т.е., в областях CDR-1, -2 и/или -3; однако "каркасные" области вариабельного домена также могут играть важную роль в связывании антигена, такую как обеспечение поддержки для CDR. В различных вариантах осуществления "антиген-связывающая область" содержит по меньшей мере аминокислотные остатки 4-103 вариабельного домена легкой цепи (VL) и 5-109 вариабельного домена тяжелой цепи (VH), аминокислотные остатки 3-107 VL и 4-111 VH, и являются полными цепями VL и VH (положения аминокислот 1-109 VL и 1-113 VH; нумерация по WO 97/08320). Характерный класс иммуноглобулинов для применения в вариантах осуществления, описываемых в настоящем документе, представляет собой IgG. "Функциональные фрагменты" по изобретению включают домен F(ab')₂-фрагмента, Fab-фрагмент и scFv. F(ab')₂ или Fab можно конструировать для минимизации или полного устранения межмолекулярных взаимодействий в виде образования дисульфидных связей, которые происходят между доменами CH1 и CL.

Описываемое в настоящем документе антитело может быть получено из библиотеки рекомбинантных антител, которая основана на аминокислотных последовательностях, сконструированных in silico и кодируемых нуклеиновыми кислотами, полученными синтетически. Конструирование последовательности антител in silico осуществляют, например, с помощью анализа базы данных последовательностей человека и конструируя полипептидную последовательность с использованием данных, полученных из нее. Способы конструирования и получения созданных in silico последовательностей описаны, например, в Knappik et al., J. Mol. Biol. 296: 57-86, 2000; Krebs et al., J. Immunol. Methods. 254:67-84, 2001; и в патенте США № 6300064, выданном Knappik et al., которые включены в объем настоящей заявки в качестве ссылки в полном объеме.

(Описываемые в настоящем документе антитела)

На всем протяжении настоящего описания, приводится указание на следующие эталонные антитела: "ном. антител" или "LACS" или "MOR" X. MOR X представляет собой антитело с вариабельной областью тяжелой цепи, соответствующей SEQ ID NO:18 или 20 (ДНК)/SEQ ID NO:19 или 21 (белок) и с вариабельной областью легкой цепи, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO:22, 24, 26, 28, 30 и 32 (ДНК)/SEQ ID NO:23, 25, 27, 29, 31 и 33 (белок).

В одном из примеров в описании представлено антитело с вариабельной областью тяжелой цепи, соответствующей SEQ ID NO:18 (ДНК)/SEQ ID NO:19 (белок), и с вариабельной областью легкой цепи, соответствующей SEQ ID NO:22 (ДНК)/SEQ ID NO:23 (белок).

В одном из примеров в описании представлено антитело с вариабельной областью тяжелой цепи, соответствующей SEQ ID NO:20 (ДНК)/SEQ ID NO:21 (белок), и с вариабельной областью легкой цепи, соответствующей SEQ ID NO:24 (ДНК)/SEQ ID NO:25 (белок).

В одном из примеров в описании представлено антитело с вариабельной областью тяжелой цепи, соответствующей SEQ ID NO:18 (ДНК)/SEQ ID NO:19 (белок), и с вариабельной областью легкой цепи, соответствующей SEQ ID NO:26 (ДНК)/SEQ ID NO:27 (белок).

В одном из примеров в описании представлено антитело с вариабельной областью тяжелой цепи, соответствующей SEQ ID NO:18 (ДНК)/SEQ ID NO:19 (белок), и с вариабельной областью легкой цепи, соответствующей SEQ ID NO:28 (ДНК)/SEQ ID NO:29 (белок).

В одном из примеров в описании представлено антитело с вариабельной областью тяжелой цепи, соответствующей SEQ ID NO:18 (ДНК)/SEQ ID NO:19 (белок), и с вариабельной областью легкой цепи, соответствующей SEQ ID NO:30 (ДНК)/SEQ ID NO:31 (белок).

В одном из примеров в описании представлено антитело с вариабельной областью тяжелой цепи, соответствующей SEQ ID NO:18 (ДНК)/SEQ ID NO:19 (белок), и с вариабельной областью легкой цепи, соответствующей SEQ ID NO:32 (ДНК)/SEQ ID NO:33 (белок).

В другом аспекте изобретение относится к приведенным ниже антителам.

В одном из примеров в описании представлено антитело, содержащее антиген-связывающую область, содержащую область H-CDR3 (CDR3 тяжелой цепи) с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:1 или 4; антиген-связывающая область может дополнительно содержать область H-CDR2 (CDR2 тяжелой цепи) с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:2 или 5; и антиген-связывающая область также может содержать область H-CDR1 (CDR1 тяжелой цепи) с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:3 или 6. Такое антитело может содержать антиген-связывающую область, содержащую область L-CDR3 (CDR3 легкой цепи) с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:7, 8, 9, 10, 11 или 12; антиген-связывающая область может дополнительно содержать область L-CDR1 (CDR1 легкой цепи) с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:13 или 15; и антиген-связывающая область также может содержать область L-CDR2 (CDR2 легкой цепи) с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:14 или 16.

Изобретение также относится к антителу, содержащему антиген-связывающую область (i) область H-CDR3 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1, область H-CDR2 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2 и область H-CDR1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:3, (ii) область H-CDR3 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:4, область H-CDR2 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:5 и область H-CDR1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:6.

В одном из вариантов осуществления также представлено антитело, содержащее антиген-связывающую область, выбранную из группы, состоящей из (i) области L-CDR3 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:7, области L-CDR1 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:13 и области L-CDR2 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:14, (ii) области L-CDR3 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:8, области L-CDR1 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:15 и области L-CDR2 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:16, (iii) области L-CDR3 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:9, области L-CDR1 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:13 и области L-CDR2 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:14, (iv) области L-CDR3 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:10, области L-CDR1 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:13 и области L-CDR2 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:14, (v) области L-CDR3 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:11, области L-CDR1 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:13 и области L-CDR2 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:14 или (vi) области L-CDR3 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:12, области L-CDR1 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:13 и области L-CDR2 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:14.

В другом варианте осуществления представлено антитело, содержащее антиген-связывающую область, выбранную из группы, состоящей из (i) области H-CDR3 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:1, области H-CDR2 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:2, области H-CDR1 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:3, области L-CDR3 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:7, области L-CDR1 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:13 и области L-CDR2 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:14, (ii) области H-CDR3 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:4, области H-CDR2 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:5, области H-CDR1 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:6, области L-CDR3 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:8, области L-CDR1 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:15 и области L-CDR2 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:16, (iii) области H-CDR3 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:1, области H-CDR2 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:2, области H-CDR1 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:3, области L-CDR3 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:9, области L-CDR1 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:13 и области L-CDR2 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:14, (iv) области H-CDR3 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:1, области H-CDR2 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:2, области H-CDR1 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:3, области L-CDR3 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:10, области L-CDR1 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:13 и области L-CDR2 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:14, (v) области H-CDR3 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:1, области H-CDR2 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:2, области H-CDR1 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:3, области L-CDR3 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:11, области L-CDR1 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:13 и области L-CDR2 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:14 и (vi) области H-CDR3 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:1, области H-CDR2 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:2, области H-CDR1 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:3, области L-CDR3 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:12, области L-CDR1 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:13 и области L-CDR2 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:14.

В другом аспекте изобретение относится к приведенным ниже антителам.

Один из вариантов осуществления также относится к антителу, содержащему (i) тяжелую цепь с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:49 или 51; и (ii) легкую цепь с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы SEQ ID NO:53, 55, 57, 59, 61 и 63.

Другой вариант осуществления относится к антителу, выбранному из группы (i) тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:49 и легкой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:53 (обозначенное как "MOR07919"), (ii) тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:51 и легкой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:55 (обозначенное как "MOR07692"), (iii) тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:51 и легкой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:57 (обозначенное как "MOR07923"), (iv) тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:51 и легкой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:59 (обозначенное как "MOR07924"), (v) тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:51 и легкой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:61 (обозначенное как "MOR07925"), (vi) тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:51 и легкой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:63 (обозначенное как "MOR07926").

В одном из аспектов изобретение относится к антителам с антиген-связывающей областью, которая может специфически связываться с одной или несколькими областями MST1R-мишени с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:17 или обладает высокой аффинностью к ним. То, что антитело обладает "высокой аффинностью" к антигену указывает, если измерение аффинности составляет по меньшей мере 100 нМ (моновалентная аффинность Fab-фрагмента) в виде K_D. Антитело или антиген-связывающая область, описываемые в настоящем документе, могут связываться с MST1R, например, с аффинностью приблизительно менее 100 нМ, приблизительно менее 60 нМ или приблизительно менее 30 нМ. Дополнительные варианты осуществления включают антитела, которые связываются с MST1R с аффинностью приблизительно менее 10 нМ или приблизительно менее 3 нМ. В частности, выделенные антитела человека или гуманизированные антитела или их функциональные фрагменты, содержащие антиген-связывающую область, которая специфична к частичному пептиду MST1R с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:17, где антитело или его функциональный фрагмент обладают аффинностью к частичному пептиду MST1R в виде K_D приблизительно менее 10 нМ, приблизительно менее 5 нМ, приблизительно менее 1 нМ, приблизительно менее 0,5 нМ или приблизительно менее 0,1 нМ, как определено посредством поверхностного плазмонного резонанса. Тогда как аффинность к частичному пептиду MST1R в виде K_D приблизительно менее 10 нМ, приблизительно менее 5 нМ, приблизительно менее 1 нМ, приблизительно менее 0,5 нМ или менее 0,1 нМ, как определено посредством титрования равновесия раствора. Например, аффинность описываемого в настоящем документе антитела против MST1R может составлять приблизительно 0,98 нМ или 0,02 нМ (моновалентная аффинность Fab-фрагмента).

В таблице 1 приведены обобщенные данные об аффинности эталонных антител, описываемых в настоящем документе, как определено посредством поверхностного плазмонного резонанса (Biacore) и титрования равновесия раствора (SET):

ТАБЛИЦА 1:
Аффинности антител Антитело (Fab) BIACORE (Fab) K _D [нМ] SET (Fab) K _D [нМ] MOR07692 0,80 0,25 MOR07919 0,98 0,27 MOR07923 0,07 0,02 MOR07924 0,20 0,03 MOR07925 0,02 0,01 MOR07926 0,13 0,04

Для таблицы 1 аффинность антител MOR X измеряли с помощью поверхностного плазмонного резонанса (Biacore) на иммобилизованном рекомбинантном MST1R человека. Исследования Biacore проводили на непосредственно иммобилизованном антигене. Fab-формат MOR X демонстрирует диапазон моновалентной аффинности к иммобилизованному белку MST1R приблизительно от 0,02 и 0,98 нМ с демонстрирующим наибольшую аффинность Fab MOR07925 со следующими Fab MOR07923 и MOR07926. Кроме того, в исследованиях SET Fab-формат MOR X демонстрирует диапазон аффинности приблизительно от 0,01 и 0,27 нМ с демонстрирующим наибольшую аффинность Fab MOR07925 с последующими Fab MOR07923 и MOR07924.

Другой характеристикой описываемых в настоящем документе антител является их специфичность к области в пределах N-концевой области MST1R. Например, описываемые в настоящем документе MOR X могут специфически связываться с N-концевой областью MST1R.

Тип эпитопа с которым связывается антитело, как описано в настоящем документе, может быть линейным (т.е. один последовательный участок аминокислот) или конформационным (т.е. несколько участков аминокислот). Для определения того, является ли эпитоп конкретного антитела линейным или конформационным, специалист в данной области может анализировать связывание антител с перекрывающимися пептидами (например, 13-мерные пептиды с перекрытием 11 аминокислот), покрывающими различные домены MST1R. Анализ ELISA проводили с использованием рекомбинантного частичного пептида MST1R с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:17. Так как MOR X не подходил для иммуноблот-анализа для детекции денатурированной формы того же рекомбинантного белка MST1R, то MOR X должен обладать конформационными эпитопами в пределах аминокислотных остатков SEQ ID NO:17.

Описываемое в настоящем документе антитело перекрестно связывается у видов, у людей и по меньшей мере одного другого вида, который может представлять собой, например, обезьяну или мышь. Антитело, которое перекрестно взаимодействует, например, по меньшей мере с яванским макаком, может обеспечивать большую гибкость и преимущества по сравнению с известными антителами против MST1R-мишени для целей проведения исследований in vivo у нескольких видов с одним и тем же антителом.

В одном из вариантов осуществления описываемое антитело не только способно связываться с MST1R, но также способно ингибировать активацию MST1R. Ингибирование рецептора приводит к подавлению свойственной рецептору киназной активности и подавляет передачу сигнала. Такое подавление может происходить, например, вследствие ограничения связывания лиганда с MST1R, изменения конформации MST1R или интернализации MST1R. Более конкретно, описываемое в настоящем документе антитело может опосредовать свой терапевтический эффект с помощью MST1R с помощью антитела-эффекторных функций.

Другой вариант осуществления относится к ингибированию активности MST1R в зависимом от лиганда фосфорилировании MST1R, описываемыми в настоящем документе антителами. Величина IC₅₀ описываемого антитела в зависимой от MSP системе анализа передачи сигнала MST1R, такой как "анализ люциферазы под действием Elk1", составляет по меньшей мере 100 нг/мл, по меньшей мере 50 нг/мл, по меньшей мере 20 нг/мл, по меньшей мере 10 нг /мл или по меньшей мере 5 нг/мл.

Другое описываемое в настоящем документе антитело также ингибирует независимую от лиганда активацию MST1R.

Дополнительное описываемое в настоящем документе антитело также ингибирует фосфорилирование ERK в ответ на лиганд MST1R MSP.

Другое описываемое в настоящем документе антитело также подавляет стимулируемую MSP пролиферацию опухолевых клеток, экспрессирующих MST1R.

(Варианты пептидов)

Антитела, описываемые в настоящем описания, не ограничены конкретными пептидными последовательностями, представленными в настоящем документе. Предпочтительнее также включены варианты этих полипептидов. На основании настоящего описания и общепринятых доступных технологий и источников специалист в данной области способен получать, тестировать и использовать функциональные варианты описываемых в настоящем документе антител, тогда как оценка этих вариантов со способностью подавлять обе/любую из зависимой и/или независимой от лиганда активации MST1R находится в объеме настоящего изобретения.

Вариант может включать, например, антитело, содержащее относительно пептидной последовательности, описываемой в настоящем документе, по меньшей мере одну измененную определяющую комплементарность область (CDR) (гипервариабельную) и/или каркасный (FR) (вариабельный) домен/положение. Для лучшей иллюстрации этой концепции, ниже приведено краткое описание структуры антитела.

Антитело состоит из двух пептидных цепей, где каждая содержит один (легкая цепь) или три (тяжелая цепь) константных домена и вариабельную область (VL, VH), где последняя из них в каждом случае состоит из четырех областей FR и трех расположенных с промежутками CDR. Антиген-связывающий участок формируется одной или несколькими CDR, тогда как области FR обеспечивают структурный каркас для CDR и, таким образом, играют важную роль в связывании антигена. Изменяя один или несколько аминокислотных остатков в области CDR или FR, специалист может обычным способом получать мутантные или разнообразные последовательности антител, которые можно подвергать скринингу относительно антигена, например, на наличие новых или улучшенных свойств.

На фиг. 1 (VH) и фиг. 2: (VL) приведены области CDR и FR (по определению Kabat) для определенных описываемых в настоящем документе антител и проведено сравнение аминокислот в данном положении друг с другом и с соответствующими последовательностями "основного гена" HuCAL (как описано в патенте США № 6300064).

Специалист в данной области может использовать данные на фиг. 1 и фиг. 2 для конструирования вариантов пептидов, которые находятся в объеме вариантов осуществления, описываемых в настоящем документе. В одном из вариантов осуществления варианты конструируют, заменяя аминокислоты в одной или нескольких областях CDR; вариант также может иметь одну или несколько измененных каркасных областей. В отношении сравнения новых антител друг с другом, остатки-кандидаты, которые можно заменять, включают остатки вариабельных областей легких и остатки вариабельных областей тяжелых цепей MOR X. Также изменения можно проводить в каркасных областях. Например, когда существует отличие остатка по сравнению с последовательностью зародышевой линии, можно изменять домен FR пептида.

Что касается сравнения новых антител с соответствующей консенсусной последовательностью или последовательностью "основного гена", остатки-кандидаты, которые можно изменять, включают остатки вариабельной области легкой цепи MOR X, такие как остатки VLλ3, и включают остатки вариабельной области тяжелой цепи MOR X, такие как остатки VH3. Альтернативно, специалист может провести такой же анализ, сравнивая аминокислотные последовательности, описываемые в настоящем документе, с известными последовательностями того же класса таких антител с использованием, например, способа, описываемого в Knappik et al. (J. Mol. Biol. 296, 57-86, 2000) и в патенте США № 6300064, выданном Knappik et al.

Кроме того, варианты могут быть получены с использованием одного из MOR X в качестве начальной точки для оптимизации с помощью изменения одного или нескольких аминокислотных остатков в последовательности MOR X, предпочтительно, аминокислотных остатков в одной или нескольких CDR, и с помощью скрининга полученного множества вариантов антител на варианты с улучшенными свойствами. Изменение одного или нескольких аминокислотных остатков в CDR-3 VL, CDR-3 VH, CDR-1 VL и/или CDR-2 VH можно проводить с помощью синтеза множества молекул ДНК с использованием технологии тринуклеотидного мутагенеза (TRIM) (Vimekäs, B., Ge, L., Plückthun, A., Schneider, K.C., Wellnhofer, G., and Moroney S.E. (1994) "Trinucleotide phosphoramidites: ideal reagents for the synthesis of mixed oligonucleotides for random mutagenesis." Nucl. Acids Res. 22, 5600).

(Варианты с консервативными аминокислотами)

Можно получать варианты полипептидов, которые сохраняют общую молекулярную структуру пептидной последовательности антитела, описываемого в настоящем документе. Учитывая свойства отдельных аминокислот, специалисту очевидны некоторые обоснованные замены. Замены аминокислот, т.е., "консервативные замены", можно проводить на основании сходства полярности, заряда, растворимости, гидрофобности, гидрофильности и/или амфипатического характера рассматриваемых остатков.

Например, (a) неполярные (гидрофобные) аминокислоты включают аланин, лейцин, изолейцин, валин, пролин, фенилаланин, триптофан и метионин; (b) полярные нейтральные аминокислоты включают глицин, серин, треонин, цистеин, тирозин, аспарагин и глутамин; (c) положительно заряженные (основные) аминокислоты включают аргинин, лизин и гистидин; и (d) отрицательно заряженные (кислые) аминокислоты включают аспарагиновую кислоту и глутаминовую кислоту. Как правило, замены можно проводить в пределах групп (a)-(d). Кроме того, глицин и пролин можно заменять друг на друга на основе их способности разрушать α-спирали. Подобным образом, определенные аминокислоты, такие как аланин, цистеин, лейцин, метионин, глутаминовая кислота, глутамин, гистидин и лизин более часто находятся в α-спиралях, тогда как валин, изолейцин, фенилаланин, тирозин, триптофан и треонин более часто находятся в β-складчатых слоях. Глицин, серин, аспарагиновая кислота, аспарагин и пролин, как правило, находятся в изгибах. Некоторые предпочтительные замены можно проводить в следующих группах: (i) S и T; (ii) P и G и (iii) A, V, L и I. Принимая во внимание известный генетический код и способы рекомбинантных и синтетических ДНК, специалист в данной области легко может сконструировать ДНК, кодирующую варианты с консервативными аминокислотами.

Как используется в настоящем документе, "идентичность последовательностей" двух полипептидных последовательностей, означает процент аминокислот, идентичных у двух последовательностей. "Гомология последовательностей" означает процент аминокислот, которые являются или идентичными, или которые представляют собой консервативные аминокислотные замены. Идентичность последовательность у полипептидных последовательностей по изобретению в областях CDR составляет по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70% или 80%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95%. Антитела по изобретению также обладают гомологией последовательностей в областях CDR по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95%.

(Молекулы ДНК)

Настоящее изобретение также относится к молекулам ДНК, кодирующим описываемое в настоящем документе антитело. Эти последовательности в качестве неограничивающих примеров включают молекулы ДНК, приведенные на фиг. 3A, 3B и 4A-4F.

Молекулы ДНК по изобретению не ограничены последовательностями, описываемыми в настоящем документе, но также включают их варианты. Варианты ДНК в различных вариантах осуществления можно описать по отношению их физических свойств в гибридизации. Специалисту в данной области будет понятно, что ДНК можно использовать для идентификации комплементарной ей ДНК и, так как ДНК является двухцепочечной, ее эквивалента или гомолога, с использованием способов гибридизации нуклеиновых кислот. Специалисту также понятно, что гибридизация может происходить менее чем при 100% комплементарности. Однако при соответствующем выборе условий способы гибридизации можно использовать для различения последовательностей ДНК на основе их структурного родства с конкретным зондом. Для руководства относительно условий см., Sambrook et al., 1989 (Sambrook, J., E.F. Fritsch, and T. Maniatis (1989) Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, USA) и Ausubel et al., 1995 (Ausubel, F.M., R. Brent, R.E. Kingston, D.D. Moore, J.G. Sedman, J.A. Smith, & K. Struhl. eds. (1995). Current Protocols in Molecular Biology. New York: John Wiley and Sons).

Структурное сходство двух последовательностей полинуклеотидов можно выражать как функцию "жесткости" условий, в которых две последовательности гибридизуются друг с другом. Как используется в настоящем документе, термин "жесткость" относится к степени, до которой условия неблагоприятны для гибридизации. Жесткие условия сильно неблагоприятны для гибридизации, и только наиболее структурно родственные молекулы будут гибридизоваться друг с другом в таких условиях. Наоборот, нежесткие условия благоприятствуют гибридизации молекул, демонстрирующих меньшую степень структурного родства. Таким образом, жесткость гибридизации, прямо коррелирует со структурным родством двух последовательностей нуклеиновой кислоты. Для установления гибридизации и родства пригодны следующие отношения (где T_m представляет собой температуру плавления дуплекса нуклеиновой кислоты):

a. T_m = 69,3 + 0,41(G+C)%

b. T_m дуплекса ДНК снижается на 1°C с каждым увеличением на 1% количества несоответствующих пар оснований.

c. (T_m)_μ2-(T_m)_μ1 = 18,5 log₁₀μ2/μ1

где μ1 и μ2 представляют собой ионные силы двух растворов.

Жесткость гибридизации является функцией многих факторов, включая общую концентрацию ДНК, ионную силу, температуру, размер зонда и присутствие средств, нарушающих образование водородных связей. Факторы, способствующие гибридизации, включают высокие концентрации ДНК, высокие ионные силы, низкие температуры, больший размер зонда и отсутствие средств, нарушающих образование водородных связей. Как правило, гибридизацию проводят в две стадии: стадия "связывания" и стадия "отмывки".

Сначала, на стадии связывания, зонд связывается с мишенью в условиях, благоприятствующих гибридизации. Как правило, жесткость, на этой стадии контролируют изменением температуры. Если не используют короткие (< 20 н.) олигонуклеотидные зонды, для высокой жесткости температура, как правило, составляет от 65°C и 70°C. Характерный раствор для гибридизации содержит 6X SSC, 0,5% SDS, 5X раствор Денхардта и 100 мкг неспецифической ДНК-носителя. См. Ausubel et al., раздел 2.9, дополнение 27 (1994). Конечно, известно множество различных, но функционально эквивалентных, параметров буфера. Если степень родства является более низкой, можно выбирать меньшую температуру. Температуры связывания для низкой жесткости составляют приблизительно от 25°C и 40°C. Средняя жесткость представляет собой по меньшей мере приблизительно от 40°C до приблизительно менее 65°C. Высокая жесткость составляет по меньшей мере приблизительно 65°C.

Затем с помощью отмывки удаляют избыток зонда. На этой стадии, как правило, применяют более жесткие условия. Таким образом, это представляет собой стадию "отмывки", которая является наиболее важным в определении родства с помощью гибридизации. Как правило, отмывочные растворы содержат низкие концентрации солей. Один из характерных растворов со средней жесткостью содержит 2X SSC и 0,1% SDS. Отмывочный раствор с высокой жесткостью содержит эквивалент (по ионной силе) приблизительно менее 0,2X SSC, с раствором с предпочтительной жесткостью, содержащим приблизительно 0,1X SSC. Температуры, связанные с различными видами жесткости, являются такими, как указано выше для "связывания". Также, как правило, отмывочный раствор в течение отмывки несколько раз сменяют. Например, характерные условия отмывки с высокой жесткостью включают двукратную отмывку в течение 30 минут при 55°C и трехкратную в течение 15 минут при 60°C.

Таким образом, настоящее изобретение относится к молекулам нуклеиновой кислоты, гибридизующимся с молекулами, указанными на фиг. 3A, 3B и 4A-4F, в условиях связывания и отмывки с высокой жесткостью, где такие молекулы нуклеиновой кислоты кодируют антитело или его функциональный фрагмент со свойствами, как описано в настоящем документе. Молекулы по изобретению (с точки зрения мРНК) представляют собой молекулы по меньшей мере на 75% или 80% (предпочтительно, по меньшей мере на 85%, более предпочтительно, по меньшей мере на 90%, а наиболее предпочтительно, по меньшей мере 95%) гомологичные или идентичные по последовательности с одной из молекул ДНК, описываемых в настоящем документе. В одном конкретном примере варианта осуществления изобретения положение 7 нуклеиновой кислоты в SEQ ID NO:18 или 20 можно заменять с C на G, таким образом изменяя кодон с CAA на GAA.

(Функционально эквивалентные варианты)

Еще один класс вариантов ДНК в объеме изобретения можно описать относительно кодируемого ими продукта (см. пептиды, перечисленные на фиг. 3C, 3D и 4G-4L). Эти функционально эквивалентные гены характеризуются тем, что они кодируют одни и те же пептидные последовательности, представленные на фиг. 3C, 3D и 4G-4L, вследствие вырожденности генетического кода. Аминокислотная последовательность на фиг. 3C также приведена как SEQ ID NO:19. Аминокислотная последовательность на фиг. 3D также приведена как SEQ ID NO:21. Аминокислотная последовательность на фиг. 4G также приведена как SEQ ID NO:23. Аминокислотная последовательность на фиг. 4H также приведена как SEQ ID NO:25. Аминокислотная последовательность на фиг. 4I также приведена как SEQ ID NO:27. Аминокислотная последовательность на фиг. 4J также приведена как SEQ ID NO:29. Аминокислотная последовательность на фиг. 4K также приведена как SEQ ID NO:31. Аминокислотная последовательность на фиг. 4L также приведена как SEQ ID NO:33.

Установлено, что варианты молекул ДНК, представленных в настоящем документе, могут быть сконструированы несколькими различными способами. Например, их можно конструировать как полностью синтетические ДНК. Способы эффективного синтеза олигонуклеотидов в диапазоне от 20 до приблизительно 150 нуклеотидов широкодоступны. См. Ausubel et al., раздел 2.11, дополнение 21 (1993). Можно синтезировать перекрывающиеся олигонуклеотиды и объединять способом, впервые опубликованным Khorana et al., J. Mol. Biol. 72:209-217 (1971); также см. Ausubel et al., выше, раздел 8.2. Синтетические ДНК предпочтительно, конструируют с удобными участками рестрикции, конструируемых на 5'- и 3'-концах гена для облегчения клонирования в соответствующий вектор.

Как указано, способ получения вариантов начинается с одной из ДНК, как описано в настоящем документе, а затем проводится сайт-специфический мутагенез. См. Ausubel et al., выше, глава 8, дополнение 37 (1997). В характерном способе, ДНК-мишень клонируют в бактериофаг-носитель с одноцепочечной ДНК. Одноцепочечную ДНК выделяют и гибридизуют с олигонуклеотидом, содержащим желаемое изменение(я) нуклеотидов. Синтезируют комплементарную цепь и двухцепочечный фаг вводят хозяину. Некоторая часть получаемого потомства будет содержать желаемый мутант, который можно подтверждать с использованием секвенирования ДНК. Кроме того, доступны различные способы, увеличивающие вероятность того, что фаг-потомок будет представлять собой желаемого мутанта. Эти способы хорошо известны специалистам в данной области и для получения таких мутантов существуют коммерчески доступные наборы.

(Конструкции и экспрессия рекомбинантных ДНК)

Настоящее изобретение дополнительно относится к конструкциям рекомбинантной ДНК, содержащим одну или несколько нуклеотидных последовательностей, описываемых в настоящем документе. Эти рекомбинантные конструкции используют в отношении вектора, такого как плазмида, фагмида, фаг или вирусный вектор, в который встраивают молекулу ДНК, кодирующую любое описываемое антитело.

Кодируемый ген может быть получен способами, описанными в Sambrook et al., 1989 и Ausubel et al., 1989. Альтернативно, последовательности ДНК могут быть синтезированы химически с использованием, например, синтезаторов. См., например, способы, описываемые в Oligonucleotide Synthesis (1984, Gait, ed., IRL Press, Oxford), который полностью включен в настоящий документ в качестве ссылки. Рекомбинантные конструкции по изобретению содержаться в векторах экспрессии, способных экспрессировать РНК и/или белковые продукты, кодируемые ДНК. Вектор может дополнительно содержать регуляторные последовательности, включая промотор, функционально связанный с открытой рамкой считывания (ORF). Вектор дополнительно может содержать последовательность селективного маркера. Для эффективной трансляции вставленных кодирующих последовательностей гена-мишени также необходимыми могут быть сигналы специфической инициации и секреции в бактериях.

Настоящее изобретение также относится к клеткам-хозяевам, содержащим по меньшей мере одну из ДНК, как описано в настоящем документе. Клетка-хозяин фактически может представлять собой любую клетку, для которой доступны векторы экспрессии. Например, она может представлять собой клетку-хозяина высших эукариот, такую как клетка млекопитающего, клетку-хозяина низших эукариот, такую как дрожжевая клетка, и может представлять собой прокариотическую клетку, такую как бактериальная клетка. Введение рекомбинантной конструкции в клетку-хозяина можно осуществлять с помощью трансфекции с фосфатом кальция, липофекции, DEAE, опосредованной декстраном трансфекции, электропорации или инфицирования фагами.

(Экспрессия в бактериях)

Подходящие векторы экспрессии для использования в бактериях конструируют, встраивая структурную последовательность ДНК, кодирующую желаемый белок вместе с подходящими сигналами инициации и терминации трансляции, в фазе функционального считывания с функциональным промотором. Вектор содержит один или несколько фенотипических селективных маркеров и участок начала репликации для обеспечения поддержания вектора и, если желательно, для обеспечения амплификации в хозяине. Подходящие прокариотические хозяева для трансформации включают E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium и различные виды рода Pseudomonas, Streptomyces и Staphylococcus.

Бактериальные векторы могут быть основаны, например, на бактериофагах, плазмидах или фагмидах. Эти векторы могут содержать селективный маркер и бактериальный участок начала репликации, происходящие из коммерчески доступных плазмид, как правило, содержащих элементы хорошо известного клонирующего вектора pBR322 (номер доступа ATCC 37017). После трансформации подходящего штамма-хозяина и выращивания штамма-хозяина до подходящей плотности клеток, выбранный промотор дерепрессируют/индуцируют подходящими средствами (например, сдвиг температуры или химическая индукция) и клетки культивируют в течение дополнительного периода. Как правило, клетки собирают с помощью центрифугирования, разрушают физическими или химическими способами и полученный неочищенный экстракт сохраняют для дальнейшей очистки.

В бактериальных системах ряд векторов экспрессии могут быть, предпочтительно, выбраны в зависимости от применения, предполагаемого для экспрессируемого белка. Например, когда необходимо продуцировать большое количество такого белка, например, для получения антител или для скрининга библиотек пептидов, желательными могут быть векторы, направляющие экспрессию высоких уровней слитых белковых продуктов, которые легко очищать.

(Терапевтические способы)

Терапевтические способы предусматривают введение индивидууму, при необходимости, терапевтически эффективного количества антитела по изобретению. "Терапевтически эффективное" количество в настоящем документе определено, как количество антитела, которое представляет собой количество, достаточное для снижения количества MST1R-положительных клеток в обрабатываемой области у индивидуума - или в качестве однократной доза, или в соответствии со схемой лечения с несколькими дозами, отдельно или в комбинации с другими средствами, которое приводит к облегчению неблагоприятного состояния, но где количество является токсикологически допустимым. Индивидуум может представлять собой человека или не являющегося человеком животного (например, кролика, крысу, мышь, обезьяну или другого примата более низкого порядка).

Антитело по изобретению можно совместно вводить с известными лекарственными средствами, и в некоторых случаях можно модифицировать само антитело. Например, для потенциального дополнительного увеличения эффективности антитело можно конъюгировать с иммунотоксином или радиоактивно меченым антителом.

Описываемые в настоящем документе антитела можно использовать в качестве терапевтического или диагностического средства в ряде ситуаций, когда нежелательно экспрессируется или присутствует MST1R. Нарушения и состояния, особенно подходящие для лечения антителом по изобретению представляют собой экспрессирующие MST1R злокачественные опухоли и новообразования, например, рак молочной железы, рак легкого, рак толстой кишки, рак мочевого пузыря, рак кожи, рак поджелудочной железы, глиому, лимфому, рак предстательной железы, рак щитовидной железы, рак яичника, рак ЖКТ, рак печени, рак желудка и т.п.

Для лечения любого из указанных выше нарушений фармацевтические композиции для использования по настоящему изобретению можно сформулировать общепринятым способом с использованием одного или нескольких физиологически приемлемых носителей или эксципиентов. Любое описываемое в настоящем документе антитело можно вводить любым подходящим способом, который может изменяться в зависимости от типа подлежащего лечению нарушения. Возможные способы введения включают парентеральный (например, внутримышечный, внутривенный, внутриартериальный, внутрибрюшинный или подкожный), внутрилегочный и интраназальный и, при желании для местного иммуносупрессорного лечения, введение в очаги повреждения. Кроме того, любое описываемое антитело можно вводить с помощью импульсной инфузии, например, с уменьшающимися дозами антитела. Дозирование можно проводить с помощью инъекций, например, таких как внутривенная или подкожная инъекции, частично в зависимости от того, является ли введение кратковременным или длительным. Вводимое количество зависит от ряда факторов, таких как клинические симптомы, масса индивидуума, проводится ли введение других лекарственных средств. Специалисту в данной области очевидно, что в зависимости от подвергаемого лечению нарушения или состояния путь введения будет варьировать, и на основании конкретных для каждого индивидуума факторов он поймет, какой путь будет наиболее подходящим для индивидуума.

Определение терапевтически эффективного количества нового полипептида по настоящему изобретению в основном зависит от конкретного пациента, пути введения и характера подвергаемого лечению нарушения. Общее руководство можно найти, например, в публикациях International Conference on Harmonisation and in Remington's Pharmaceutical Sciences, chapters 27 and 28, pp. 484-528 (18th ed., Alfonso R. Gennaro, ED., Easton, PA.: Mack Pub. Co., 1990). Более конкретно, определение терапевтически эффективного количества зависит от таких факторов, как токсичность и эффективность лекарственного средства. Токсичность можно определять способами, хорошо известными в данной области и находящимся в указанных выше ссылках. Эффективность можно определять с использованием того же руководства в сочетании со способами, описанными ниже в примерах.

(Способы диагностики)

MST1R высоко экспрессирован на злокачественных клетках во многих злокачественных новообразованиях; таким образом, антитело против MST1R по изобретению можно использовать для отображения или визуализации участка или расположения возможного MST1R у пациента. В отношении этого антитело можно определяемо метить с использованием радиоактивных изотопов, аффинных меток (таких как биотин, авидин и т.д.), флуоресцентных меток, парамагнитных атомов и т.д. Способы проведения такого мечения хорошо известны в данной области. Клинические применения антител в диагностической визуализации рассмотрены в Grossman, H.B., Urol. Clin. North Amer. 13:465-474 (1986)), Unger, E.C. et al., Invest. Radiol. 20:693-700 (1985)) и Khaw, B. A. et al., Science 209:295-297 (1980)).

Детекция участков таких обнаруживаемо меченых антител может, например, указывать на MST1R. В одном из вариантов осуществления такое исследование проводят, выделяя образцы ткани или крови и инкубируя такие образцы в присутствии меченых антител. В одном из вариантов осуществления такой способ проводят неинвазивным способом с использованием магнитно-резонансной томографии, флюорографии и т.д. Такой диагностический тест можно использовать для мониторинга успеха лечения заболеваний, где присутствие или отсутствие MST1R-положительны клеток является значимым индикатором.

(Терапевтические и диагностические композиции)

Антитела по настоящему изобретению можно известными способами вводить в состав композиции с получением фармацевтически подходящих композиций, где описываемое в настоящем документе антитело (включая любой его функциональный фрагмент) комбинировано в смеси с фармацевтически приемлемым носителем. Подходящие носители и их состав описаны, например, в REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES (18th ed., Alfonso R. Gennaro, ED., Easton, PA.: Mack Pub. Co., 1990). Для получения фармацевтически приемлемой композиции, подходящей для эффективного введения, такие композиции должны содержать эффективное количество одного или нескольких антител по настоящему изобретению, вместе с подходящим количеством носителя.

Препараты можно подходящим способом вводить в состав с получением контролируемого высвобождения активного соединения. Препараты с контролируемым высвобождением можно получать с помощью использования полимеров с образованием комплекса с антителом против MST1R или абсорбции его. Контролируемую доставку можно осуществлять с помощью выбора подходящих макромолекул (например, сложных полиэфиров, полиаминокислот, поливинила, пирролидона, этиленвинила-ацетата, метилцеллюлозы, карбоксиметилцеллюлозы или сульфата протамина) и концентрации макромолекул, а также способов введения для получения контролируемого высвобождения. Другим возможным способом для контроля длительности действия с помощью препаратов с контролируемым высвобождением является введение антитела против MST1R в частицы полимерного вещества, такого как сложные полиэфиры, полиаминокислоты, гидрогели, поли(молочная кислота) или сополимеры этилена и винилацетата. Альтернативно, вместо введения этих средств в полимерные частицы, можно улавливать эти вещества в микрокапсулах, получаемых, например, способами коацервации или с помощью интерфазной полимеризации, например, гидроксиметилцеллюлозы или желатиновых микрокапсул и поли(метилметацилатных) микрокапсул, соответственно, или в коллоидных системах доставки лекарственных средств, например, липосомах, альбуминовых микросферах, микроэмульсиях, наночастицах и нанокапсулах или в микроэмульсиях. Такие способы описаны в Remington's Pharmaceutical Sciences (1980).

Соединения можно вводить в состав композиций для парентерального введения с помощью инъекции, например, с помощью болюсной инъекции или длительной инфузии. Составы для инъекции могут быть представлены в стандартной лекарственной форме, например, в ампулах или в контейнерах с несколькими дозами с добавленным консервантом. Композиции могут находиться в таких формах как суспензии, растворы или эмульсии в масляных или водных носителях и могут содержать средства для формулирования, такие как суспендирующие, стабилизирующие и/или диспергирующие средства. Альтернативно, активный ингредиент может находиться в форме порошка для разбавления перед использованием подходящим носителем, например, стерильной водой, не содержащей пирогены.

Композиции, при желании, можно представить в упаковке или в дозирующем устройстве, которые могут содержать одну или несколько стандартных лекарственных форм, содержащих активный ингредиент. Например, упаковка может содержать металлическую или пластиковую фольгу, такую как блистерная упаковка. К упаковке или дозирующему устройству можно прилагать инструкции для введения. Кроме того, упаковку или дозирующее устройство и композиции можно предоставлять в наборе для коммерческого распространения.

Различные варианты осуществления изобретения могут быть дополнительно разъяснены в представленных ниже демонстрационных примерах, которые предназначены для иллюстрации и, таким образом, не ограничивают объем описания изобретения.

Краткое описание рисунков

[Фиг. 1]

На фиг. 1 представлены аминокислотные последовательности различных вариабельных областей тяжелых цепей новых антител, и где разграничены области CDR и каркаса (FR). Последовательность VH3 (SEQ ID NO:80) выровнена с последовательностью вариабельной области тяжелой цепи MOR07692, MOR07923, MOR07924, MOR07925, MOR07926 (SEQ ID NO:19), а последовательность VH5 (SEQ ID NO:81) выровнена с последовательностью вариабельной области тяжелой цепи MORQ7919 (SEQ ID NO:21).

[Фиг. 2]

Фиг. 2: На фиг. 2A и фиг. 2B представлены аминокислотные последовательности различных вариабельных областей легких цепей новых антител, и где разграничены области CDR и каркаса (FR). Последовательность VLκ3 (VLk3; SEQ ID NO:82) выровнена с последовательностями вариабельных областей легкой цепи MOR07692 (SEQ ID NO:23), MOR07923 (SEQ ID NO:27), MOR07924 (SEQ ID NO:29), MOR07925 (SEQ ID NO:31), MOR07926 (SEQ ID NO:33), а последовательность VLλ3 (VLl3; SEQ ID NO:83) выровнена с последовательностью вариабельной области легкой цепи MOR07919 (SEQ ID NO:25).

[Фиг. 3]

Фиг. 3: На фиг. 3A (MOR07692, MOR07923, MOR07924, MOR07925, MOR07926; SEQ ID NO:18) и фиг. 3B (MOR07919; SEQ ID NO:20) представлены последовательности нуклеиновой кислоты различных вариабельных областей тяжелых цепей новых антител. На фиг. 3C (MOR07692, MOR07923, MOR07924, MOR07925, MOR07926; SEQ ID NO:19) и фиг. 3D (MOR07919; SEQ ID NO:21) представлены аминокислотные последовательности различных вариабельных областей тяжелых цепей новых антител. Области CDR H-CDR1, H-CDR2 и H-CDR3 указаны с N-конца до C-конца полужирным шрифтом и подчеркнуты.

[Фиг. 4]

Фиг. 4: На фиг. 4A (MOR07692; SEQ ID NO:22), фиг. 4B (MOR07919; SEQ ID NO:24), фиг. 4C (MOR07923; SEQ ID NO:26), фиг. 4D (MOR07924; SEQ ID NO:28), фиг. 4E (MOR07925; SEQ ID NO:30) и фиг. 4F (MOR07926; SEQ ID NO:32) представлены последовательности нуклеиновой кислоты различных вариабельных областей легких цепей новых антител. На фиг. 4G (MOR07692; SEQ ID NO:23), фиг. 4H (MOR07919; SEQ ID NO:25), фиг. 4I (MOR07923; SEQ ID NO:27), фиг. 4J (MOR07924; SEQ ID NO:29), фиг. 4K (MOR07925; SEQ ID NO:31) и фиг. 4L (MOR07926; SEQ ID NO:33) представлены аминокислотные последовательности различных вариабельных областей легких цепей новых антител. Области CDR L-CDR1, L-CDR2 и L-CDR3 указаны с N-конца до C-конца полужирным шрифтом и подчеркнуты.

[Фиг. 5]

На фиг. 5 представлены аминокислотные последовательности вариабельных областей тяжелых цепей различных последовательностей основных генов антител, основанных на консенсусной последовательности библиотеки комбинаторных антител человека (HuCAL^®). Области CDR H-CDR1, H-CDR2 и H-CDR3 подчеркнуты и указаны от N-конца к C-кону. Верхняя линии представляет собой MOR07919 (SEQ ID NO:21), тогда как нижняя линия представляет собой MOR07692/7923/7924/7925/7926 (SEQ ID NO:19).

[Фиг. 6]

На фиг. 6 представлены аминокислотные последовательности вариабельных областей легких цепей различных последовательностей основных генов антител, основанных на консенсусной последовательности HuCAL. Области CDR L-CDR1, L-CDR2 и L-CDR3 подчеркнуты и указаны от N-конца к C-кону. Два набора линий от верха к низу представляют собой следующее: MOR07919 (SEQ ID NO:25); MOR07692 (SEQ ID NO:23); MOR07923 (SEQ ID NO:27); MOR07924 (SEQ ID NO:29); MOR07925 (SEQ ID NO:31); MOR07926 (SEQ ID NO:33), соответственно.

[Фиг. 7]

Фиг. 7: На фиг. 7A и фиг. 7B представлены последовательность нуклеиновой кислоты и аминокислотная последовательность различных новых тяжелых цепей антител (фиг. 7A: MOR07919; фиг. 7B: MOR07692, MOR07923, MOR07924, MOR07925 и MOR07926; соответственно), экспрессированных с pMORPH^®2_h_IgG1f. Области CDR приведены полужирным шрифтом и подчеркнуты. Аминокислотные последовательности лидерной области VH и константной области тяжелой цепи указаны курсивом или курсивом и полужирным шрифтом, соответственно. Участки рестрикции и участки отжига праймеров для секвенирования указаны выше или ниже последовательности. Последовательность нуклеиновой кислоты на фиг. 7A представляет собой SEQ ID NO:64, тогда как аминокислотная последовательность представляет собой SEQ ID NO:65. Последовательность нуклеиновой кислоты на фиг. 7B представляет собой SEQ ID NO:66, тогда как аминокислотная последовательность представляет собой SEQ ID NO:67.

[Фиг. 8]

На фиг. 8 представлена последовательность нуклеиновой кислоты (SEQ ID NO:68) и аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:69) легкой цепи лямбда нового антитела (MOR07919), экспрессированной с pMORPH^®2_h_Ig_lambda2. Области CDR приведены полужирным шрифтом и подчеркнуты. Аминокислотная последовательность лидерной области VL и константная область легкой цепи лямбда указаны курсивом или курсивом и полужирным шрифтом, соответственно. Участки рестрикции и участки отжига праймеров для секвенирования указаны выше или ниже последовательности.

[Фиг. 9]

Фиг. 9: На фиг. 9A-фиг. 9E представлены последовательность нуклеиновой кислоты и аминокислотная последовательность различных легких цепей каппа новых антител, экспрессированных с pMORPH^®2_h_Ig_kappa. Области CDR приведены полужирным шрифтом и подчеркнуты. Аминокислотная последовательность лидерной последовательности VL и константной области легкой цепи каппа указаны курсивом или курсивом и полужирным шрифтом, соответственно. Участки рестрикции и участки отжига праймеров для секвенирования указаны выше или ниже последовательности. Последовательность нуклеиновой кислоты на фиг. 9A представляет собой SEQ ID NO:70, тогда как аминокислотная последовательность представляет собой SEQ ID NO:71 (MOR07692). Последовательность нуклеиновой кислоты на фиг. 9B представляет собой SEQ ID NO:72, тогда как аминокислотная последовательность представляет собой SEQ ID NO:73 (MOR07923). Последовательность нуклеиновой кислоты на фиг. 9C представляет собой SEQ ID NO:74, тогда как аминокислотная последовательность представляет собой SEQ ID NO:75 (MOR07924). Последовательность нуклеиновой кислоты на фиг. 9D представляет собой SEQ ID NO:76, тогда как аминокислотная последовательность представляет собой SEQ ID NO:77 (MOR07925). Последовательность нуклеиновой кислоты на фиг. 9E представляет собой SEQ ID NO:78, тогда как аминокислотная последовательность представляет собой SEQ ID NO:79 (MOR07926).

[Фиг. 10]

На фиг. 10 представлен анализ FACS, демонстрирующих перекрестную реактивность выделенных антител (IgG1 MorphoSys - 2 мкг/мл) с ортологами MST1R.

[Фиг. 11]

Фиг. 11 демонстрирует активность связывания MOR07692, MOR07919, MOR07923, MOR07924, MOR07925 и MQR07926 с частью 25-571 MST1R человека по сравнению с контролем PBS. При анализе с применением t-критерия для n=3, значения p представляют собой следующее: MOR07692: 4,56E-07; MOR07919: 1,43E-05; MOR07923: 2,10E-05; MOR07924: 1,42E-06; MOR07925: 9,74E-07 и MOR07926:1,53E-06.

[Фиг. 12]

Фиг. 12 демонстрирует активность ингибирования репортера в транс-положении под действием Elk1 в отсутствие лиганда. При анализе с применением t-критерия и концентрации антитело 5 мкг/мл, значения p представляют собой следующее: MOR07692: 5,39E-06; MOR07919: 3,19E-04; и MOR07925: 3,78E-05.

[Фиг. 13]

Фиг. 13 демонстрирует ингибирование индуцированного 200 нг/мл MSP фосфорилирования с помощью MOR07692 по сравнению с контрольным hIgG в различные моменты времени (мин) при оптической плотности 450 нм с 570 нм эталоном). В момент времени 5 мин, значение p представляет собой 5,43E-05, тогда как в момент времени 15 мин, значение p представляет собой 4,76E-06.

[Фиг. 14]

Фиг. 14 представляет собой вестерн-блоттинг, иллюстрирующий ингибирование индуцированного 100 нг/мл MSP фосфорилирования ERK с помощью 1 мкг/мл MOR07692 по сравнению с отсутствием антитела и контрольными hIgG в присутствии или отсутствии 1 мкг/мл поперечно-сшитого антитела.

[Фиг. 15]

Фиг. 15 демонстрирует активность ингибирования специфических антител или контроля без антител при индуцированной MSP клеточной пролиферации (%) в присутствии или отсутствии 100 нг/мл MSP. Для различных антител значения p представляют собой следующее: MOR07692: 0,0001; MOR07919: 0,2037; MOR07923: 0,0106; MOR07924: 0,0203; MOR07925: 0,0042 и MOR07926: 0,0044.

[Фиг. 16]

Фиг. 16 демонстрирует ингибирование индуцированной MSP миграции посредством указанных антител против MST1R.

[Фиг. 17]

Фиг. 17 демонстрирует потенциал указанных антител против MST1R в индукции интернализации.

Примеры

(Клеточная культура и транзиторная трансфекция)

Клетки эмбриональной почки человека (HEK) 293FreeStyle™ выращивали в среде Freestyle 293 Medium (Invitrogen). 293α представлял собой стабильный трансфектант, получаемый трансфекцией клеток HEK293 векторами экспрессии с интегрином αv и интегрином β3. Клетки HEK293 и 293α выращивали в DMEM, содержащей 10% ЭТС. PC3 и T47D культивировали в RPMI, содержащей 10% ЭТС. Для пэннинга, скрининга и функциональных анализов, клетки HEK 293FreeStyle™ трансфицировали плазмидой ДНК с использованием 293fectin (Invitrogen). Клетки 293T и 293α трансфицировали плазмидой ДНК с использованием липофектамина 2000 (Invitrogen) по инструкциям поставщика.

(Проточная цитометрия ("FACS"))

Клетки (5×10⁵ клетки/лунку) инкубировали с Fab или антителами IgG в указанных концентрациях в 50 мкл буфера FACS (PBS, 5% ЭТС) в течение 60 мин при 4°C в круглодонных 96-луночных культуральных планшетах (Corning). Клетки дважды промывали, а затем инкубировали с конъюгированным с флуоресцеинизотиоцианатом (FITC) антителом для детекции в течение 30 мин при 4°C. Клетки снова промывали, ресуспендировали в 0,3 мл буфера FACS, а затем анализировали посредством проточной цитометрии в Cytomics FC500 (Beckman Coulter, Inc.). Данные анализировали посредством программного обеспечения FlowJo (Tomy digital biology Co., Ltd.). В качестве положительного контроля использовали поликлональные IgG козы против hMSP R (R&D systems) или антитело против FLAG M2 (Sigma), а в качестве отрицательного контроля использовали MOR03207 (антитело против лизоцима).

(Поверхностный плазмонный резонанс)

Кинетические константы k_on и k_off определяли с использованием серийных разведений соответствующих Fab, связывающихся с ковалентно иммобилизованным слитым белком MST1R-Fc (R&D systems) с использованием устройства BIAcore 3000 (Biacore). Для ковалентной иммобилизации антигена использовали стандартную химию связывания аминов EDC-NHS. Для прямого связывания слитого белка MST1R-Fc чипы детектора CM5 (Biacore) покрывали ≈600-700 РЕ в 10 мМ ацетатном буфере, pH 4,5. Для ячейки с эталонным потоком использовали соответствующее количество HSA (сывороточного альбумина человека). Кинетические измерения проводили в PBS (136 мМ NaCl, 2,7 мМ KC1,10 мМ Na₂HPO₄, 1,76 мМ KH₂PO₄ pH 7,4) при скорости потока 20 мкл/мин с использованием диапазона концентраций Fab 15,6-500 нМ. Время впрыска для каждой концентрации составляло 1 мин, с последующими 3 мин фазы диссоциации. Для регенерации использовали 5 мкл 10 мМ HCl. Все сенсограммы глобально выравнивали с использованием программного обеспечения оценки BIA версии 3.2 (Biacore).

(Титрование равновесия раствора (SET))

Определение аффинности в растворе в основном проводили, как описано в литературе (Friguet, B., Chaffotte, A. F., Djavadi-Ohaniance, L., and Goldberg, M. E. (1985) J. Immunol. Methods 77, 305-319). Для улучшения чувствительности и точности способа SET, способ модифицировали на основе классического ELISA до основанной на ECL технологии (Haenel, C., Satzger, M., Ducata, D. D., Ostendorp, R., and Brocks, B. (2005) AnalBiochem 339, 182-184).

Пример 1

(ПОЛУЧЕНИЕ АНТИТЕЛ ИЗ БИБЛИОТЕК HuCAL)

Для получения терапевтических антител против MST1R, проводили отбор с использованием библиотеки фагового дисплея HuCAL GOLD MorphoSys. HuCAL GOLD^® представляет собой библиотеку Fab на основе концепции HuCAL^® (Knappik et al. (J. Mol. Biol., 296, 57-86, 2000); Krebs et al., J. Immunol. Methods, 254, 67-84, 2001; Rothe et al., J. Mol. Biol., 376(4): 1182-200, 2008), в которой все шесть CDR диверсифицированы, и в которой для связывания Fab-фрагментов с поверхностью фага используют технологию CysDisplay™ (WO 01/05950).

(A. Получение фагмиды, амплификация и очистка фагов)

Фагмидную библиотеку HuCAL GOLD^® амплифицировали в среде 2x YT, содержащей 34 мкг/мл хлорамфеникола и 1% глюкозу (2x YT-CG). После инфекции фага-помощника (VCSM13) с OD_{600 нм} 0,5 (30 мин при 37°C без перемешивания; 30 мин при 37°C при перемешивании с 250 об./мин.), клетки центрифугировали (4120 g; 5 мин; 4°C), ресуспендировали в 2x YT/34 мкг/мл хлорамфениколе/50 мкг/мл канамицине/0,25 мМ IPTG и выращивали в течение ночи при 22°C. Фаги из супернатанта осаждали PEG, ресуспендировали в PBS/20% глицерине и хранили при -80°C. Амплификация фагов между двумя стадиями пэннинга проводили следующим образом: клетки TG1 в середине логарифмической фазы роста инфицировали элюированными фагами и высевали на LB-агар, дополненный 1% глюкозы и 34 мкг/мл хлорамфеникола (LB-CG). После инкубации в течение ночи при 30°C, колонии соскребали и использовали для инокуляции 2xYT-CG до достижения OD_{600 нм} 0,5 и для инфекции добавляли фаги-помощники VCSM13, как описано выше.

(B. Пэннинг с использованием HuCAL GOLD ^® )

Для отбора фаги с антителами из HuCAL GOLD^® разделяли на шесть совокупностей, содержащих различные комбинации основных генов VH (совокупность 1: VH1/3/5 k, совокупность 2: VH1/3/5 λ, совокупность 3: VH2/4/6 k, совокупность 4: VH2/4/6 λ, совокупность 5: VH1-6 k, совокупность 6: VH1-6 λ). Эти совокупности индивидуально подвергали 3 стадиям цельноклеточного пэннинга на трансфицированных экспрессирующим MST1R вектором клетках HEK 293FreeStyle™ с последующей pH-элюцией и стадией постадсорбции на не несущих MST1R клетках HEK 293FreeStyle™ для истощения несоответствующих фагов с антителами. В конце оставшиеся фаги с антителами использовали для инфицирования клеток TG1 E. coli, которые затем высевали на планшеты с агаром и инкубировали в течение ночи при 30°C. На следующие сутки бактериальные колонии соскребали с планшетов, фаги выделяли и амплифицировали, как описано выше. Вторая и третья стадия отбора проводили как первая стадия. В дополнение к стандартному пэннингу для потенциальной идентификации клонов с повышенной активностью использовали технологию LCDR3-RapMAT^®. RapMAT^® представляет собой встроенный процесс созревания аффинности для быстрого отбора высокоаффинных антител. Эта технология основана на молекулярном конструировании библиотеки Fab HuCAL GOLD^®. Для способа RapMAT^® проводили две стадии стандартного пэннинга с раздельными совокупностями библиотек лямбда и каппа. Выбранные совокупности Fab после 2 стадии диверсифицировали посредством замены LCDR3 кассетами из библиотеки LCDR3. Полученные библиотеки Fab подвергали двум стадиям пэннинга в жестких условиях.

(C. Субклонирование и экспрессия растворимых Fab-фрагментов)

Вставки выбранных фагмид HuCAL GOLD^®, кодирующие Fab, субклонировали в вектор экспрессии pMORPH^®x9_Fab_FS (Rauchenberger et al., J. Biol. Chem. 278(40):38194-205, 2003) для облегчения быстрой экспрессии растворимых Fab. С этой целью кодирующие Fab вставки (ompA-VLCL и phoA-Fd) выбранных клонов вырезали из плазмидной ДНК посредством XbaI и EcoRI и клонировали в расщепленный XbaI/EcoRI вектор pMORPH^®x9_ FS. Fab, экспрессируемые в этом векторе, несут две C-концевые метки (FLAG™ и Strep-tag^® II) для детекции и очистки.

(D. Экспрессия и очистка Fab антител HuCAL GOLD ^® в E. coli)

Экспрессию Fab-фрагментов, кодируемых pMORPH^®x9_Fab_FS, в клетках TG1 E. coli осуществляли в перемешиваемых культурах в колбах с использованием 750 мл 2x среды YT, дополненной 34 мкг/мл хлорамфеникола. Культуры перемешивали при 30°C до достижения OD_{600 нм} 0,5. Экспрессию индуцировали добавлением 0,75 мМ IPTG в течение 20 часов при 30°C. Бактерии собирали посредством центрифугирования и получали периплазматическую фракцию с использованием 30-35 мл BBS. Fab очищали посредством Strep-tag^® II с использованием колонок с сефарозой Step-Tactin. Чистоту образцов анализировали совместно с калибровочными стандартами посредством SDS-PAGE в денатурированном восстановленном состоянии и посредством гель-хроматографии (SEC) в нативном состоянии. Концентрации белков определяли посредством УФ-спектрофотометрии (Krebs et al., J. Immunol. Methods 254, 67-84, 2001).

Пример 2

(КЛОНИРОВАНИЕ, ЭКСПРЕССИЯ И ОЧИСТКА IgG1 HuCAL^®)

Для экспрессии полноразмерного IgG1, фрагменты вариабельных доменов тяжелых (VH) и легких цепей (VL) субклонировали из вектора экспрессии Fab в векторы pMORPH^®2_hIg. Для субклонирования фрагментов VH использовали рестрикционные ферменты MfeI и BlpI. Для субклонирования фрагментов VL каппа или VL лямбда использовали рестрикционные ферменты EcoRV и BsiWI или HpaI, соответственно. После расщепления, фрагменты VH и VL выделяли из препаративного агарозного геля и лигировали в соответствующие векторы экспрессии IgG (фрагмент VH в pMORPH^®2_h_IgG1 f; фрагмент Vкаппа в pMORPH^®2_h_Igκ; фрагмент Vлямбда в pMORPH^®2_h_Igλ2). Полученные экспрессирующие IgG плазмиды охарактеризовывали посредством рестрикционного анализа и секвенирования. Транзиторную экспрессию полноразмерным IgG человек проводили в клетках HKB11, которые трансфицировали экспрессирующими тяжелые и легкие цепи IgG векторами. IgG выделяли из супернатантов клеточных культур посредством аффинной хроматографии посредством сефарозной колонки с белком A. Дополнительная последующая обработка включала замену буфера посредством гель-фильтрации и стерильную фильтрацию очищенных IgG. Контроль качества выявлял чистоту >90% посредством SDS-PAGE в восстанавливающих условиях и >90% мономерного IgG, как определяли посредством аналитической гель-хроматографии.

Пример 3

(Скрининг клонов Fab HuCAL^® и IgG1 HuCAL^® посредством ELISA)

Лунки 384-луночного планшета для микротитрования MaxiSorp™ покрывали 0,5 мкг/мл рекомбинантного слитого белка MST1R-Fc, разбавленного в PBS. Планшет инкубировали в течение ночи при 4°C. На следующие сутки лунки 3 раза промывали PBST (0,05% Tween20 в PBS), а затем блокировали MPBST (5% порошковое молоко в PBST) в течение 30 мин при комнатной температуре на шейкере для планшетов для микротитрования. Лунки перед добавлением первичных антител, т.е. предварительно блокированных экстрактов BEL Fab-клонов HuCAL^® или очищенных антител HuCAL^® и контрольных антител 3 раза промывали PBST. Планшеты инкубировали в течение 2 часов при комнатной температуре на шейкере для планшетов для микротитрования, а затем 3 раза промывали PBST. Для детекции антител HuCAL^® добавляли IgG козы к антителам человека с щелочной фосфатазой (Dianova, разбавленных 1:5000 в 0,5% порошковом молоке в PBST) и планшет инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре на шейкере для планшетов для микротитрования. Затем планшет 5 раз промывали TBST (0,05% Tween20 в TBS). Добавляли Attophos (AttoPhos Substrate Set, Roche) (разбавленного 1:10 в TBS) и измеряли флуоресценцию на сканере для планшетов для микротитрования TEC (испускание: 535 нм, возбуждение: 430 нм).

Пример 4

(АНАЛИЗ ПЕРЕКРЕСТНОЙ РЕАКТИВНОСТИ ПОСРЕДСТВОМ FACS)

Анализ FACS экспрессирующих ортологи MST1R клеток: конструировали экспрессирующий MST1R человека (нуклеотидная последовательность кДНК представлена в виде номера доступа GenBank: NM_002447.2), MST1R яванского макака и MST1R мыши (нуклеотидная последовательность кДНК приведена в виде номера доступа GenBank: NM_009074.1) вектор, содержащий N-концевую метку Flag (pFLAG-myc-CMV-19, Sigma). кДНК, кодирующую MST1R яванского макака амплифицировали посредством ПЦР с использованием кДНК желудка яванского макака в качестве матрицы с прямым и обратным праймерами с нуклеотидными последовательностями SEQ ID NO:34 и 35, соответственно. Посредством секвенирования ПЦР продукта, нуклеотидную последовательность ORF MST1R яванского макака идентифицировали, как представлено в SEQ ID NO:36. Соответствующая аминокислотная последовательность приведена в SEQ ID NO:37. Затем кДНК ORF MST1R человека, яванского макака и мыши, исключая области сигнальных пептидов, амплифицировали с использованием соответствующих прямых и обратных праймеров с нуклеотидными последовательностями SEQ ID NO:38 и 39 (человек), 40 и 41 (яванский макак) и 42 и 43 (мышь) с соответствующими сайтами клонирования, а затем клонировали в pFLAG-myc-CMV-19. Амплифицированный фрагмент MST1R человека кодирует аминокислоты, соответствующие номеру доступа GenBank: NP_002438.2 (SEQ ID NO:45). Фрагмент MST1R мыши кодирует аминокислоты, соответствующие номеру доступа GenBank: NP_033100.1 (SEQ ID NO:47), за исключением различий аминокислот в положениях: 688 (Leu на Pro), 713 (Ile на Val), 714 (Ala на Gly) и 719 (Ala на Val). Эти векторы экспрессии трансфицировали в клетки HEK293T. Для анализа FACS клетки инкубировали с 2 мкг/мл первичных антител с последующей инкубацией с мечеными FITC вторичными антителами, как описано выше. На фиг. 10 антитело против Flag подтверждает экспрессию каждого (MST1R человека, яванского макака и мыши) белка. MOR07692, MOR07923, MOR07924, MOR07925 и MOR07926 продемонстрировали связывание с MST1R человека и макака. С другой стороны, кроме MST1R человека и макака, MOR07919 также продемонстрировало связывание с MST1R мыши.

Нуклеотидную последовательность этих антител определяли на ДНК-секвенаторе. Определено, что нуклеотидная последовательность вариабельной области тяжелой цепи MOR07692, MOR07923, MOR07924, MOR07925 и MOR07926 является такой, как представлено на фиг. 3A и в SEQ ID NO:18. Нуклеотидная последовательность вариабельной области тяжелой цепи MOR07919 представлена на фиг. 3B и в SEQ ID NO:20. Определено, что аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи MOR07692, MOR07923, MOR07924, MOR07925 и MOR07926 является такой, как представлено на фиг. 3C и SEQ ID NO:19. Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи MOR07919 представлена на фиг. 3D и в SEQ ID NO:21.

Нуклеотидная последовательность вариабельной области легкой цепи MOR07692 представлена на фиг. 4A и в SEQ ID NO:22. Аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи MOR07692 представлена на фиг. 4G и в SEQ ID NO:23. Нуклеотидная последовательность вариабельной области легкой цепи MOR07919 представлена на фиг. 4B и в SEQ ID NO:24. Аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи MOR07919 представлена на фиг. 4H и в SEQ ID NO:25. Нуклеотидная последовательность вариабельной области легкой цепи MOR07923 представлена на фиг. 4C и в SEQ ID NO:26. Аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи MOR07923 представлена на фиг. 4I и в SEQ ID NO:27. Нуклеотидная последовательность вариабельной области легкой цепи MOR07924 представлена на фиг. 4D и в SEQ ID NO:28. Аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи MOR07924 представлена на фиг. 4J и в SEQ ID NO:29. Нуклеотидная последовательность вариабельной области легкой цепи MOR07925 представлена на фиг. 4E и в SEQ ID NO:30. Аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи MOR07925 представлена на фиг. 4K и в SEQ ID NO:31. Нуклеотидная последовательность вариабельной области легкой цепи MOR07926 представлена на фиг. 4F и в SEQ ID NO:32. Аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи MOR07926 представлена на фиг. 4L и в SEQ ID NO:33.

Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи CDR3 (H-CDR3) MORQ7692, MOR07923, MOR07924, MOR07925 и MOR07926 приведена в SEQ ID NO:1. Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи CDR3 (H-CDR3) MOR07919 приведена в SEQ ID NO:4.

Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи CDR2 (H-CDR2) MOR07692, MOR07923, MOR07924, MOR07925 и MOR07926 приведена в SEQ ID NO:2. Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи CDR2 (H-CDR2) MOR07919 приведена в SEQ ID NO:5.

Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи CDR1 (H-CDR1) MOR07692, MOR07923, MOR07924, MOR07925 и MOR07926 приведена в SEQ ID NO:3. Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи CDR1 (H-CDR1) MOR07919 приведена в SEQ ID NO:6.

Аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи CDR3 (L-CDR3) MOR07692, приведена в SEQ ID NO:7. Аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи CDR3 (L-CDR3) MOR07919 приведена в SEQ ID NO:8. Аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи CDR3 (L-CDR3) MOR07923 приведена в SEQ ID NO:9. Аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи CDR3 (L-CDR3) MOR07924 приведена в SEQ ID NO:10. Аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи CDR3 (L-CDR3) MOR07925 приведена в SEQ ID NO:11. Аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи CDR3 (L-CDR3) MOR07926 приведена в SEQ ID NO:12.

Аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи CDR2 (L-CDR2) MOR07692, MOR07923, MOR07924, MOR07925 и MOR07926 приведена в SEQ ID NO:14. Аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи CDR2 (L-CDR2) MOR07919 приведена в SEQ ID NO:16.

Аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи CDR1 (L-CDR1) MOR07692, MOR07923, MOR07924, MOR07925 и MOR07926 приведена в SEQ ID NO:13. Аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи CDR1 (L-CDR1) MOR07919 приведена в SEQ ID NO:15.

Нуклеотидная последовательность тяжелой цепи MOR07692 приведена в SEQ ID NO:50. Аминокислотная последовательность тяжелой цепи MOR07692 приведена в SEQ ID NO:51. Нуклеотидная последовательность легкой цепи MOR07692 приведена в SEQ ID NO:54. Аминокислотная последовательность легкой цепи MOR07692 приведена в SEQ ID NO:55.

Нуклеотидная последовательность тяжелой цепи MOR07923 приведена в SEQ ID NO:50. Аминокислотная последовательность тяжелой цепи MOR07923 приведена в SEQ ID NO:51. Нуклеотидная последовательность легкой цепи MOR07923 приведена в SEQ ID NO:56. Аминокислотная последовательность легкой цепи MOR07923 приведена в SEQ ID NO:57.

Нуклеотидная последовательность тяжелой цепи MOR07924 приведена в SEQ ID NO:50. Аминокислотная последовательность тяжелой цепи MOR07924 приведена в SEQ ID NO:51. Нуклеотидная последовательность легкой цепи MOR07924 приведена в SEQ ID NO:58. Аминокислотная последовательность легкой цепи MOR07924 приведена в SEQ ID NO:59.

Нуклеотидная последовательность тяжелой цепи MOR07925 приведена в SEQ ID NO:50. Аминокислотная последовательность тяжелой цепи MOR07925 приведена в SEQ ID NO:51. Нуклеотидная последовательность легкой цепи MOR07925 приведена в SEQ ID NO:60. Аминокислотная последовательность легкой цепи MOR07925 приведена в SEQ ID NO:61.

Нуклеотидная последовательность тяжелой цепи MOR07926 приведена в SEQ ID NO:50. Аминокислотная последовательность тяжелой цепи MOR07926 приведена в SEQ ID NO:51. Нуклеотидная последовательность легкой цепи MOR07926 приведена в SEQ ID NO:62. Аминокислотная последовательность легкой цепи MOR07926 приведена в SEQ ID NO:63.

Нуклеотидная последовательность тяжелой цепи MOR07919 приведена в SEQ ID NO:48. Аминокислотная последовательность тяжелой цепи MOR07919 приведена в SEQ ID NO:49. Нуклеотидная последовательность легкой цепи MOR07919 приведена в SEQ ID NO:52. Аминокислотная последовательность легкой цепи MOR07919 приведена в SEQ ID NO:53.

Пример 5

(АНАЛИЗ АКТИВНОСТИ СВЯЗЫВАНИЯ ПОСРЕДСТВОМ ELISA)

Лунки 96-луночного планшета для микротитрования MaxiSorp™ покрывали 1 мкг/мл рекомбинантным слитым белком MST1R-Fc (содержащим аминокислотную последовательность 25-571 MST1R человека, R&D) разбавленным в PBS. Планшет инкубировали в течение ночи при 4°C. На следующие сутки лунки однократно промывали буфером PBS-ЭТС (5% ЭТС в PBS), а затем блокировали буфером PBS-ЭТС в течение 1 часа при комнатной температуре. После удаления буфера PBS-ЭТС в покрытые MST1R-Fc лунки добавляли 4 мкг/мл первичного антитела и инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре. После однократной отмывки буфером PBS-ЭТС добавляли вторичное антитело и оставляли инкубироваться в течение 1 часа при комнатной температуре. После 3 раз отмывки буфером PBS-ЭТС, добавляли субстрат HRP (0,4 мг/мл дигидрохлорид о-фенилендиамина и 0,006% пероксид водорода в буфере для субстрата (50 мМ трицитрат натрия дегидрат, 100 мМ двузамещенный фосфат натрия, pH4,5)). После развития желтой окраски дополнительно добавляли 1 M HCl для остановки реакции. Измеряли оптическую плотность при 490 нм в сканере для планшетов для микротитрования EnVision. На фиг. 11 все полученные антитела (MOR07692, MOR07919, MOR07923, MOR07924, MOR07925 и MOR07926) продемонстрировали связывание с частью 25-571 MST1R человека. Каждое антитело было применимо для иммунопреципитации невосстановленного и неденатурированного MST1R, но не для вестерн-блоттинга для детекции восстановленного и денатурированного MST1R (данные не показаны). Это указывает на то, что эти антитела распознают нативную конформацию в пределах остатков аминокислот в SEQ ID NO:17.

Пример 6

(БИОЛОГИЧЕСКИЕ АНАЛИЗЫ)

(A. Анализ репортерного гена люциферазы под действием Elk1)

Функциональность антител тестировали посредством анализа репортерного гена люциферазы под действием Elk1. Принцип анализа основан на совместной трансфекции клеток 293α несколькими векторами. MST1R интегрируется в клеточную мембрану и активируется (фосфорилируется) с передачей сигнала на ERK (регулируемую внеклеточными сигналами киназу), когда он сверхэкспрессирован или его стимулирует MSP. Для тестирования функциональности антител, анализ репортерного гена люциферазы под действием Elk1 проводили следующим образом: сначала авторы конструировали вектор pFR-Luc2CP. Для конструирования pFR-Luc2CP, вектор pFR-Luc (Stratagene) расщепляли HindIII, обрабатывали ДНК-полимераза T4 для образования тупых концов и расщепляли BamHI с получением фрагмента длиной приблизительно 140 п.н., содержащего связывающего 5xGAL4 элемента и TATA-бокса. pGL4.12[luc2CP] (Promega) расщепляли EcoICRI/BglII, дефосфорилировали и лигировали с указанным выше фрагментом с получением pFR-Luc2CP. Затем клетки 293α транзиторно котрансфицировали c pcDNA-DEST40 MST1R, pcDNA-DEST40, pFA2-Elk1 (Stratagene), pFR-Luc2CP и pGL4.74 [hRluc/TK] (Promega) с использованием способа трансфекции с липофектамином 2000 (Invitrogen) и высевали на белые 96-луночные планшеты для клеточных культур. На следующие сутки после трансфекции клетки предварительно инкубировали с антителами в течение 1 часа, а затем в лунки добавляли лиганд (MSP человека). После 6 часов инкубации получали клеточные лизаты и активность люциферазы светляка (специфический сигнал) и активность люциферазы Renilla (сигнал для нормализации) измеряли с использованием системы анализа двойного люциферазного репортера (Promega). Для нормализации данных из каждой лунки рассчитывали отношение сигнала люциферазы светляка/Renilla. В таблице 2 представлены величины IC₅₀ в присутствии 100 нг/мл лиганда MSP. MOR07692, MOR07919, MOR07923, MOR07924, MOR07925 и MOR07926 продемонстрировали низкую величину IC₅₀ в диапазоне от 4 до 100 нг/мл. Как показано на фиг. 12 сверхэкспрессия MST1R сама по себе индуцировала независимую от лиганда активацию MST1R. MOR07925, MOR07919 и MOR07692 также подавляли этот тип активации MST1R.

Таблица 2:
Величина IC ₅₀ при анализе репортерного гена люциферазы под действием Elk1 ID клона IC₅₀ при анализе репортера (нг/мл) MOR07692 4,4 MOR07919 87,6 MOR07923 9 MOR07924 15,7 MOR07925 5,9 MОR07926 11,4

(B. ELISA для детекции фосфорилирования MST1R)

Изменение состояния фосфорилирования MST1R после обработки лигандом и/или антителом определяли посредством системы ELISA. После инкубации клеток PC3 в течение ночи (1×10⁶) на чашках диаметром 6 см клетки промывали PBS и инкубировали в 0,1% среде BSA-RPMI. После инкубации в течение ночи клетки обрабатывали 1 мкг/мл антитела MOR07692 в течение 1 часа при 37°C, а затем стимулировали 200 нг/мл рекомбинантого MSP (R&D systems) в течение от 0 мин до 15 мин. Затем получали клеточные лизаты и фосфорилированные формы MST1R измеряли в системе Human Phospho-MSP R/Ron ELISA (R&D systems) по инструкции поставщика. MOR07692 продемонстрировал полное ингибирование фосфорилирования MST1R стимулируемого добавлением лиганда MSP, как показано на фиг. 13.

(C. Вестерн-блоттинг для активированной ERK)

Изменение состояния фосфорилирования ERK после обработки лигандом и/или антителом определяли посредством вестерн-блоттинга. После культивирования клеток PC3 в течение ночи (2×10⁵) в 12-луночном планшете клетки промывали PBS и инкубировали в 0,1% среде BSA-RPMI. После инкубации в течение ночи клетки в течение 1 часа при 37°C обрабатывали 1 мкг/мл антитела MOR07692 с 1 мкг/мл аффинно очищенных антител козы к IgG-Fc человека (Cappel) или без них. После инкубации добавляли 100 нг/мл рекомбинантного MSP (R&D systems) и дополнительно инкубировали в течение 30 мин. Затем клетки лизировали с использованием буфера RIPA, содержащего complete mini (Roche) и ингибитор фосфатаз (Nakarai tesque). Лизаты очищали от клеточного дебриса посредством центрифугирования и определяли концентрации белка с использованием анализа белка BCA (PIERCE). Лизаты ресуспендировали в буфере, содержащем β-меркаптоэтанол и денатурировали при 99°C в течение 5 минут. Белок (10 мкг/полосу) разрешали посредством SDS-PAGE на 5-20% гелях. Белки переносили на мембрану PVDF (BioRad). Мембраны блокировали с использованием Blockace (Yukijirushi), в течение 1 часа при комнатной температуре и инкубировали в течение ночи при 4°C с поликлональными антителами против ERK или антителами против фосфо-ERK. После отмывки мембраны инкубировали с вторичными антителами к антителам кролика, конъюгированными с пероксидазой хрена (Amersham). Иммунореактивные полосы визуализировали на рентгеновских пленках с использованием субстрата ECL plus (GE Healthcare). На фиг. 14 представлено фосфорилирование ERK в ответ на лиганд MSP. Усиление в присутствии и отсутствии перекрестно связывающегося антитела против IgG-Fc человека почти полностью ингибировано добавлением MOR07692.

(D. Анализ клеточной пролиферации)

Клетки T-47D (5000 клеток/лунку), суспендированные в среде RPMI, содержащей 2% обработанную активированным углем/декстраном ЭТС (Hyclone), высевали на 96-луночные планшеты. Клетки инкубировали с 1 мкг/мл антитела в течение 1 часа при 37°C, а затем стимулировали 100 нг/мл рекомбинантного MSP. Через 5 суток инкубации измеряли клеточную АТФ с применением набора для анализа жизнеспособных клеток по люминесценции CellTiter-Glo (Promega) по инструкции поставщика. Как показано на фиг. 15, MOR07692, MOR07923, MOR07924, MOR07925 и MOR07926 однозначно подавляли стимулируемую MSP пролиферацию клеток T-47D. MOR07919 обладал наименьшей ингибирующей активностью по отношению к другим антителам.

(E. Анализ миграции)

Клетки BxPC-3 (5×10⁴ клетки/лунку), суспендированные в среде RPMI, содержащей 10% ЭТС, высевали на 96-луночные планшеты для анализа клеточной миграции Oris™ (Platypus Technologies, LLC.). После культивирования в течение ночи из тестируемых лунок удаляли пробки и среду заменяли на обработанную 2% активированным углем/декстраном ЭТС (Hyclone). Клетки инкубировали с 10 мкг/мл антител в течение 1 час при 37°C, а затем стимулировали 300 нг/мл рекомбинантого MSP. Через 24 часа инкубации наблюдали мигрировавшие клетки с использованием светлопольной микроскопии (Nikon), а затем их изображения анализировали посредством программного обеспечения Image J для расчета не содержащей клеток области. Как показано на фиг. 16, MOR07919, MOR07692 и MOR07925 однозначно подавляли стимулируемую MSP клеточную миграцию клеток BxPC-3. MOR07692 и MOR07925 по сравнению с MOR07919 обладали более высокой ингибирующей активностью.

(F. Анализ интернализации)

Для оценки способности антител к интернализации в качестве вторичных антител для обеспечения ингибирования синтеза белка и, в конечном счете, гибели клеток после интернализации в клетки использовали вторичный конъюгат Hum-ZAP (аффинно очищенные IgG козы к антителам человека с сапорином, представленные ADVANCED TARGETING SYSTEMS). Клетки PC3 (2000 клетки/лунку), суспендированные в среде RPMI, содержащей 10% ЭТС, высевали в 96-луночный плоскодонные белые планшеты для культур с прозрачным дном. На следующие сутки клетки предварительно инкубировали с антителами в течение 1 часа при 4°C. После удаления среды, содержащей антитела, в лунки добавляли 0,5 мкг/мл вторичного конъюгата Hum-ZAP. Планшеты инкубировали в течение 1 часа при 4°C, а затем в течение 3 суток при 37°C. Клеточную АТФ измеряли в виде считывания показаний жизнеспособности клеток с применением набора для анализа жизнеспособных клеток по люминесценции CellTiter-Glo (Promega) по инструкции поставщика. Как показано на фиг. 17, жизнеспособность клеток PC3 при обработке MOR07692, MOR07919, MOR07923, MOR07924, MOR07925 и MOR07926 значительно снижалась, позволяя предполагать потенциал этих антител к интернализации.

Содержание всех патентов, патентных заявок, опубликованных заявок PCT и статей, книг, ссылок, справочных руководств и рефератов, цитируемых в настоящем документе, таким образом, в качестве ссылки в полном объеме включено для более полного описания существующего уровня техники в области, к которой принадлежит изобретение.

Так как в описанном выше объекте изобретения можно осуществлять различные изменения без отклонения от объема и сущности настоящего изобретения, следует понимать, что весь объект изобретения, содержащийся в приведенном выше описании или определенный в прилагаемой формуле изобретения, следует интерпретировать как описывающий и иллюстрирующий настоящее изобретение. С учетом приведенных выше указаний по настоящему изобретению возможно множество модификаций и вариаций.

Изобретение относится к биотехнологии. Описано антитело и его функциональный фрагмент, содержащие антиген-связывающие области, специфичные к MST1R. Изобретение также относится к последовательностям нуклеиновой кислоты, кодирующим указанные выше антитела, содержащим их векторам, фармацевтическим композициям и наборам с инструкциями по применению. Изобретение можно использовать для лечения нарушений и состояний, связанных с MST1R. Антитела по изобретению также можно использовать в области диагностики, а также для дальнейшего исследования роли MST1R в прогрессировании нарушений, связанных с опухолями. 18 н. и 34 з.п. ф-лы, 37 ил., 2 табл., 6 пр.

1. Выделенное антитело человека или гуманизированное антитело или их функциональный фрагмент, содержащие антиген-связывающую область, специфичную к части MST1R человека, соответствующей аминокислотным остаткам 25-571 MST1R человека, имеющему аминокислотную последовательность SEQ ID NO:17, где антиген-связывающая область содержит:
область H-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1 или 4;
область H-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2 или 5;
область H-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:3 или 6;
область L-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:7, 8, 9, 10, 11 или 12;
область L-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:13 или 15;
область L-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:14 или 16; и
где в отношении которого применяется следующее требование:
1) где указанное антитело или его функциональный фрагмент ингибирует зависимое и/или независимое от лиганда фосфорилирование MST1R;
2) аффинность указанного антитела или его функционального фрагмента в отношении указанной части MST1R человека, соответствующей аминокислотным остаткам 25-571 MST1R человека, в виде K_D, составляет около 10 нМ, менее чем около 5 нМ, менее чем около 1 нМ, менее чем около 0,5 нМ или менее чем около 0,1 нМ, что определено посредством поверхностного плазмонного резонанса или посредством титрования равновесия раствора;
3) указанное антитело или его функциональный фрагмент подавляет стимулируемую MSP клеточную пролиферацию клеток или миграцию опухолевых клеток, которые экспрессируют MST1R;
4) указанное антитело или его функциональный фрагмент интернализует MST1R; или
5) указанное антитело или его функциональный фрагмент перекрестно взаимодействует с MST1R человека и с MST1R по меньшей мере одного другого вида.

2. Антитело или его функциональный фрагмент по п.1, где указанное антитело или его функциональный фрагмент ингибирует зависимое и/или независимое от лиганда фосфорилирование MST1R и указанное антитело или его функциональный фрагмент, кроме того, ингибирует фосфорилирование ERK и/или Akt.

3. Антитело или его функциональный фрагмент по п.1, где указанное антитело или его функциональный фрагмент ингибирует зависимое и/или независимое от лиганда фосфорилирование MST1R.

4. Антитело или его функциональный фрагмент по п.3, где указанное антитело или его функциональный фрагмент, кроме того, ингибирует фосфорилирование ERK и/или Akt.

5. Антитело или его функциональный фрагмент по п.1, указанное антитело или его функциональный фрагмент перекрестно взаимодействует с MST1R человека и с MST1R по меньшей мере одного другого вида и указанный другой вид представляет собой мышь или обезьяну.

6. Антитело или его функциональный фрагмент по п.1, где указанная антиген-связывающая область содержит:
(i) область H-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1, область H-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2 и область H-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:3; или
(ii) область H-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:4, область H-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:5 и область H-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:6.

7. Антитело или его функциональный фрагмент по п.1, где антитело или его функциональный фрагмент содержит вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:19 или 21.

8. Антитело или его функциональный фрагмент по п.1, где указанная антиген-связывающая область содержит:
(i) область L-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:7, область L-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:13 и область L-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:14;
(ii) область L-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8, область L-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:15 и область L-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:16;
(iii) область L-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:9, область L-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:13 и область L-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:14;
(iv) область L-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:10, область L-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:13 и область L-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:14; и
(v) область L-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:11, область L-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:13 и область L-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:14;
(vi) область L-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:12, область L-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:13 и область L-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:14.

9. Антитело или его функциональный фрагмент по п.1, где антитело или его функциональный фрагмент содержат вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:23, 25, 27, 29, 31 или 33.

10. Антитело или его функциональный фрагмент по п.1, где антитело или его функциональный фрагмент содержит тяжелую цепь с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:49 или 51.

11. Антитело или его функциональный фрагмент по п.1, где антитело или его функциональный фрагмент содержит легкую цепь с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:53, 55, 57, 59, 61 или 63.

12. Антитело по п.1, которое выбрано из группы, состоящей из:
i) антитела, имеющего тяжелую цепь с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:49 и легкую цепь с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:53; и
ii) антитела, имеющего тяжелую последовательность с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:51 и легкую последовательность с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:55, 57, 59, 61 или 63.

13. Антитело по п.1, где антитело представляет собой IgG.

14. Антитело по п.13, где антитело представляет собой IgG1.

15. Антиген-связывающая область антитела или его функционального фрагмента по любому из пп.1-14.

16. Антиген-связывающая область по п.15, содержащая область H-CDR3 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:1 или 4.

17. Антиген-связывающая область по п.16, которая содержит область H-CDR2 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:2 или 5.

18. Антиген-связывающая область по п.17, которая содержит область H-CDR1 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:3 или 6.

19. Антиген-связывающая область по п.18, которая содержит:
(i) область H-CDR3 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:1, область H-CDR2 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:2 и область H-CDR1 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:3; или
(ii) область H-CDR3 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:4, область H-CDR2 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:5 и область H-CDR1 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:6.

20. Антиген-связывающая область по п.15, которая содержит вариабельную область тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:19 или 21.

21. Антиген-связывающая область по п.15, которая содержит область L-CDR3 с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO:7, 8, 9, 10, 11 и 12.

22. Антиген-связывающая область по п.21, которая содержит область L-CDR1 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:13 или 15.

23. Антиген-связывающая область по п.22, которая содержит область L-CDR2 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:14 или 16.

24. Антиген-связывающая область по п.23, где антиген-связывающая область содержит:
(i) область L-CDR3 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:7, область L-CDR1 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:13 и область L-CDR2 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:14;
(ii) область L-CDR3 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:8, область L-CDR1 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:15 и область L-CDR2 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:16;
(iii) область L-CDR3 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:9, область L-CDR1 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:13 и область L-CDR2 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:14;
(iv) область L-CDR3 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:10, область L-CDR1 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:13 и область L-CDR2 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:14;
(v) область L-CDR3 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:11, область L-CDR1 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:13 и область L-CDR2 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:14, или
(vi) область L-CDR3 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:12, область L-CDR1 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:13 и область L-CDR2 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:14.

25. Антиген-связывающая область по п.15, которая содержит вариабельную область легкой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:23, 25, 27, 29, 31 или 33.

26. Антиген-связывающая область по п.15, которая содержит аминокислотную последовательность тяжелой цепи SEQ ID NO:49 или 51.

27. Антиген-связывающая область по п.15, которая содержит аминокислотную последовательность легкой цепи SEQ ID NO:53, 55, 57, 59, 61 или 63.

28. Функциональный фрагмент по любому из пп.1-14, который представляет собой фрагмент антитела Fab или scFv.

29. Вариабельная область тяжелой цепи выделенного антитела или его функционального фрагмента для формирования антитела по п.1, где вариабельная область тяжелой цепи выделенного антитела, кодируется
(i) последовательностью нуклеиновой кислоты, содержащей SEQ ID NO:18 или 20 или
(ii) последовательностью нуклеиновой кислоты, в условиях с высокой жесткостью гибридизующейся с комплементарной цепью SEQ ID NO:18 или 20.

30. Вариабельная область легкой цепи выделенного антитела или его функционального фрагмента для формирования антитела по п.1, где вариабельная область легкой цепи выделенного антитела, кодируется
(i) последовательностью нуклеиновой кислоты, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO:22, 24, 26, 28, 30 и 32, или
(ii) последовательностью нуклеиновой кислоты, в условиях с высокой жесткостью гибридизующейся с комплементарной цепью последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO:22, 24, 26, 28, 30 и 32.

31. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, содержащая последовательность, которая кодирует антитело или его функциональный фрагмент по любому из пп.1-14 или 28 или антиген-связывающую область по любому из пп.15-27.

32. Молекула нуклеиновой кислоты, содержащая последовательность, которая кодирует вариабельную область тяжелой цепи выделенного антитела или его функционального фрагмента, по п.1, где молекула нуклеиновой кислоты содержит
(i) последовательность SEQ ID NO:18 или 20, или
(ii) последовательность нуклеиновой кислоты, в условиях с высокой жесткостью гибридизующуюся с комплементарной цепью SEQ ID NO:18 или 20.

33. Молекула нуклеиновой кислоты, содержащая последовательность, кодирующую вариабельную область легкой цепи выделенного антитела или его функционального фрагмента, по п.1, где молекула нуклеиновой кислоты содержит
(i) последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:22, 24, 26, 28, 30 и 32 или
(ii) последовательность нуклеиновой кислоты, в условиях с высокой жесткостью гибридизующуюся с комплементарной цепью последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO:22, 24, 26, 28, 30 и 32.

34. Вектор для экспрессии антитела или его функционального фрагмента, специфичного к части MST1R человека, соответствующей аминокислотным остаткам 25-571 MST1R человека, где вектор содержит молекулу нуклеиновой кислоты по любому из пп.31-33.

35. Выделенная клетка для экспрессии антитела или его функционального фрагмента, специфичного к части MST1R человека, соответствующей аминокислотным остаткам 25-571 MST1R человека, где клетка содержит вектор по п.34.

36. Выделенная клетка по п.35, где указанная клетка является бактериальной.

37. Выделенная клетка по п.35, где указанная клетка является клеткой млекопитающего.

38. Способ получения антитела или его функционального фрагмента, отличающийся тем, что используют вектор, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты по п.31.

39. Способ получения антитела или его функционального фрагмента путем культивирования выделенной клетки по любому из пп.35-37, содержащей вектор, который содержит молекулу нуклеиновой кислоты по п.31.

40. Антитело или его антиген-связывающий фрагмент, содержащее антиген-связывающую область, которая является специфичной в отношении MST1R человека, полученный способом по любому из пп.38 или 39.

41. Антитело человека по п.1, где антитело человека является синтетическим антителом человека.

42. Фармацевтическая композиция для ингибирования фосфорилирования MST1R и миграции клеток, содержащая эффективное количество антитела или его функционального фрагмента по любому из пп.1-14, 28, 40 или 41 и его фармацевтически приемлемый носитель или эксципиент.

43. Способ лечения заболевания или состояния, при которых будет эффективно ингибирование фосфорилирования MST1R и миграции клеток, включающий введение индивидууму, при необходимости, эффективного количества фармацевтической композиции по п.42.

44. Способ по п.43, где указанное нарушение или состояние вызвано фосфорилированием MST1R.

45. Способ по п.44, где указанное нарушение или состояние представляет собой злокачественную опухоль и/или неоплазию.

46. Способ по п.45, где указанное нарушение или состояние представляет собой: рак молочной железы, рак легких, рак толстого кишечника, рак мочевого пузыря, рак кожи, рак поджелудочной железы, глиому, лимфому, рак предстательной железы, рак щитовидной железы, рак яичника, рак ЖКТ, рак печени или рак желудка.

47. Применение фармацевтической композиции по п.42 для получения лекарственного средства для лечения нарушения или состояния, при котором будет эффективно ингибирование фосфорилирование MST1R и миграции клеток.

48. Применение по п.47, где указанное нарушение или состояние вызвано фосфорилированием MST1R.

49. Применение по п.48, где указанное нарушение или состояние представляет собой злокачественную опухоль и/или неоплазию.

50. Применение по п.49, где указанное нарушение или состояние представляет собой: рак молочной железы, рак легких, рак толстого кишечника, рак мочевого пузыря, рак кожи, рак поджелудочной железы, глиому, лимфому, рак предстательной железы, рак щитовидной железы, рак яичника, рак ЖКТ, рак печени или рак желудка.

51. Способ нацеливания на MST1R+ клетки у индивидуума или образец клеток MST1R+, включающий стадию приведения в контакт указанных MST1R+ клеток с антителом или его функциональным фрагментом по любому из пп.1-14, 28, 40 или 41.

52. Применение антитела или его функционального фрагмента по любому из пп.1-14, 28, 40 или 41 для получения лекарственного средства для нацеливания на MST1R+ клетки у индивидуума, включающее стадию приведения в контакт указанных MST1R+ клеток с указанным лекарственным средством.