НАБОР ДЛЯ КОНСЕРВАЦИИ НАТИВНЫХ ЭРИТРОЦИТОВ Российский патент 2015 года по МПК A61K31/716 A61K31/52 A61K38/38 A61K47/10 A61K47/12 

Заявляемое изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, и может найти применение в клинических лабораториях, службе крови, а также в лабораториях судебной медицины.

В клинической диагностике консервированные эритроциты (тест-эритроциты) применяются для выявления антител к антигенам эритроцитов и установления их специфичности. Исследование антител проводится при определении группы крови перекрестным методом, при скрининге антител другой специфичности у реципиентов перед трансфузией, для диагностики гемолитической болезни новорожденных и др.

Указанная область применения предъявляет особые требования к сохранности эритроцитов. От них требуются:

- отсутствие гемолиза, который приводит к разрушению целостности эритроцитов и снижению их способности к взаимодействию с антителами;

- отсутствие веществ, фиксирующих мембрану эритроцитов, так как фиксация мембраны приводит к невозможности их использования для выявления антител методом прямой агглютинации;

- отсутствие в составе компонентов, вызывающих неспецифическую агрегацию эритроцитов;

- отсутствие образования сгустков эритроцитов при хранении, так как их присутствие мешает оценке результатов реакции агглютинацию при выявлении антител;

- сохранение в течение 2 месяцев после заготовки активности антигенов, присутствующих на эритроцитах.

Известны многочисленные консерванты, используемые для хранения нативных эритроцитов, предназначенных для трансфузий, например SAGM, Adsol (AS-1), Nutricell (AS-3), PAGGS-sorbitol, PAGGS-mannitol, MAP, Erythro-Sol и др. Каждый из этих консервантов содержит аденин и глюкозу в разных концентрациях, хлорид натрия (кроме Erythro-Sol), маннит, сорбит и/или цитрат натрия в качестве мембранных протекторов, фосфаты (кроме SAGM и Adsol). Они обеспечивают хранение нативных эритроцитов в течение 35-42 дней после заготовки, при этом допускается наличие минимального гемолиза эритроцитов и образование сгустков эритроцитов. Однако к ним не предъявляются требования сохранения активности антигенов. Активность антигенов эритроцитов при хранении консервированной донорской крови снижается, особенно антигенов систем Даффи, Кидд, Келл. В силу этого обстоятельства консерванты, используемые для хранения эритроцитов, предназначенных для трансфузий, не пригодны для сохранения тест-эритроцитов.

Известен раствор для консервации энзимированных эритроцитов, используемых в изосерологических реакциях экспресс-определения антител систем Rh, Lewis и Р, который включает аденин, инозин, лимонную кислоту, глюкозу, фосфат натрия, гидроксид натрия и дополнительно мертиолат натрия в количестве 0,10-0,15 г/л [RU 2012331, А61K 31/00, 1994]. Раствор может также включать хлорид кальция. Указанный раствор позволяет сохранить агглютинирующую активность и специфичность реакции агглютинации тест-эритроцитов в течение 2-3 недель в обычных, нестерильных условиях.

Недостатком указанного раствора, кроме короткого времени сохранения способности давать специфическую реакцию гемагглютинации, является тот факт, что при обработке эритроцитов энзимами разрушаются некоторые антигены эритроцитов, например антигены системы Келл, что приводит к невозможности выявить антитела к этим антигенам. Энзимированные эритроциты длительного хранения не рекомендованы к использованию международными требованиями, что ограничивает область их применения методиками специального назначения, для которых они могут быть приготовлены непосредственно перед исследованием.

Наиболее близким по совокупности существенных признаков к заявляемому способу является консервирующий раствор для нативных эритроцитов, стандартных по всем клинически значимым эритроцитарным изосерологическим системам [RU 2049466, А61K 31/18, 1995]. Раствор содержит аденин, инозин, глюкозу, лимонную кислоту, гидроксид натрия и фосфат натрия. Кроме этих компонентов консервирующий раствор содержит также пенициллин и стрептомицин в количестве по 5,0-10,0 г/л, что, по данным заявителя, расширяет спектр сохраняемых эритроцитарных антигенов и удлиняет срок сохранности полноценной эритроцитарной панели. Нативные эритроциты помещаются в указанный консервирующий раствор после отмывки физиологическим раствором, то есть 0,9%-ным водным раствором хлористого натрия

Однако у больных и у доноров в крови могут уже присутствовать антитела к пенициллину, что вызывает взаимодействие консервированных эритроцитов с сыворотками и приводит к ложноположительному результату при исследовании антител к эритроцитам. Стрептомицин имеет узкий спектр действия на бактерии и малоэффективен. По нашим данным эритроциты, обработанные консервантом указанного состава, довольно быстро подвергаются бактериальному загрязнению, что не позволяет сохранить их диагностические качества на достаточно продолжительный срок.

Технический результат, на достижение которого направлено заявляемое изобретение, заключается в получении нативных эритроцитов, сохраняющих не менее 2 месяцев способность антигенов мембраны связываться с соответствующими клинически значимыми антителами.

Указанный результат достигается тем, что предлагается набор для консервации нативных эритроцитов, применяющихся для выявления антител к антигенам эритроцитов, включающий аденин, глюкозу и лимонную кислоту, состоящий из двух растворов: водного раствора для кратковременного пребывания эритроцитов, содержащего глюкозу, цитрат натрия, лимонную кислоту и бычий сывороточный альбумин при следующем соотношении компонентов (в г/л):

глюкоза 9,0-11,0 цитрат натрия 0,2-0,3 лимонная кислота 0,01-0,02 бычий сывороточный альбумин 0,95-1,05

и водного раствора для хранения эритроцитов, включающего дополнительно маннитол, цитрат натрия и бычий сывороточный альбумин при следующем соотношении компонентов (в г/л):

аденин 0,2-0,4 глюкоза 25,0-35,0 маннитол 6,0-8,0 цитрат натрия 0,2-0,3 лимонная кислота 0,05-0,07 бычий сывороточный альбумин 0,95-1,05 раствор для хранения эритроцитов может дополнительно включать бисептол в количестве 0,02-0,05 г/л раствор для хранения эритроцитов может также дополнительно включать дифлюкан в количестве 0,01-0,03 г/л

Все компоненты растворов выпускаются промышленностью.

Бисептол - смесь сульфаметоксазола и триметоприма, - вводят в раствор для хранения как комбинированное антибактериальное средство для предотвращения бактериального роста.

Дифлюкан, в котором активным компонентом является флуконазол, вводится как противокандидозное средство.

РН обоих растворов поддерживается в пределах значений 6,5-7,2 с помощью фосфатного солевого буфера.

Раствор для кратковременного пребывания эритроцитов используется для отмывания последних от плазмы вместо физиологического раствора; отмывка в растворе для кратковременного пребывания консервирует состояние эритроцитов, что позволяет предотвратить разрушение эритроцитов и устранить возможную адсорбцию белков на эритроциты; устранение адсорбции белков предотвращает неспецифическую реакцию антигенов при взаимодействии с антителами. Отмытые указанным раствором эритроциты затем хранят в растворе для хранения эритроцитов.

Разделение консервирования на две части способствует лучшему отмыванию и более продолжительному сохранению эритроцитов.

Для проверки консервирующих свойств заявляемого набора была определена активность антигенов непосредственно после заготовки эритроцитов и через 2 месяца хранения в заявляемом консерванте.

Исследование проведено на 32 образцах сыворотки и плазмы, содержащей антитела к антигенам эритроцитов. Эритроциты взаимодействовали с антисыворотками, содержащими антитела к антигенам, присутствующим на тест-эритроцитах: эритроциты А взаимодействовали с сыворотками, содержащими анти-А антитела, и не взаимодействовали с сыворотками анти-В. Эритроциты В взаимодействовали с сыворотками, содержащими анти-В антитела и не взаимодействовали с сыворотками анти-А. Эритроциты 0 ccDEEК-взаимодействовали с сыворотками, содержащими анти-с,-0,-Е, антитела и не взаимодействовали с сыворотками анти-С,-е,-К. Эритроциты О CCDeeK-взаимодействовали с сыворотками, содержащими анти-С,-0,-е антитела, и не взаимодействовали с сыворотками анти-с,-Е,-К. Тест-эритроциты cdeK+ взаимодействовали с сыворотками, содержащими анти-с,-е,-К антитела, и не взаимодействовали с сыворотками анти-0,-С,-Е.

Результаты испытаний представлены в таблице.

При хранении нативных эритроцитов в заявляемом составе не наблюдалось гемолиза эритроцитов и образования сгустков.

Как видно из таблицы, специфичность и активность антигенов эритроцитов в предложенном консерванте сохранялись в течение двух месяцев хранения, что делало их пригодными для использования при определении антител к антигенам эритроцитов. Все это позволяло получить достоверный результат при исследовании антител.

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, и описывает набор для консервации нативных эритроцитов, применяющихся для выявления антител к антигенам эритроцитов, состоит из двух растворов: водного раствора для кратковременного пребывания эритроцитов, содержащего 9,0-11,0 г/л глюкозы, 0,2-0,3 г/л цитрата натрия, 0,01-0,02 г/л лимонной кислоты и 0,95-1,05 г/л бычьего сывороточного альбумина, и водного раствора для хранения эритроцитов, включающего 0,2-0,4 г/л аденина, 25,0-35,0 г/л глюкозы, 6,0-8,0 г/л маннитола, 0,2-0,3 г/л цитрата натрия, 0,05-0,07 г/л лимонной кислоты и 0,95-1,05 г/л бычьего сывороточного альбумина.

Изобретение обеспечивает сохранение способности антигенов мембраны консервированных нативных эритроцитов связываться с соответствующими клинически значимыми антителами на срок не менее 2 месяцев. 2 з.п. ф-лы, 1 табл.

1. Набор для консервации нативных эритроцитов, применяющихся для выявления антител к антигенам эритроцитов, включающий аденин, глюкозу и лимонную кислоту, отличающийся тем, что он состоит из двух растворов: водного раствора для кратковременного пребывания эритроцитов, содержащего глюкозу, цитрат натрия, лимонную кислоту и бычий сывороточный альбумин при следующем соотношении компонентов (в г/л):
глюкоза 9,0-11,0 цитрат натрия 0,2-0,3 лимонная кислота 0,01-0,02 бычий сывороточный альбумин 0,95-1,05

и водного раствора для хранения эритроцитов, включающего дополнительно маннитол, цитрат натрия и бычий сывороточный альбумин при следующем соотношении компонентов (в г/л):
аденин 0,2-0,4 глюкоза 25,0-35,0 маннитол 6,0-8,0 цитрат натрия 0,2-0,3 лимонная кислота 0,05-0,07 бычий сывороточный альбумин 0,95-1,05

2. Набор по п. 1, отличающийся тем, что водный раствор для хранения эритроцитов может дополнительно включать бисептол в количестве 0,02-0,05 г/л.

3. Набор по п. 1, отличающийся тем, что водный раствор для хранения эритроцитов может дополнительно включать дифлюкан в количестве 0,01-0,03 г/л.