Способ получения эритроцитарного диагностикума Советский патент 1983 года по МПК A61K39/00 

к4

СО 00 QD

Изобрете1ше относится к медицине, а именно к способам получения эритро- цитарного цкагностикума цпя выявления белков, способных нейтрализовать биологическую активность эндотоксинов различных грамотрицательных бактерий.

Известен способ получения эритроцитарного циагностикума для выявл&ния антител путем выделения из мутанта 5аетпопе в« minnisota R1595 гликолипида с последующей сорбцией его на эритроцитах, причем сорбировать гликолипид можно только после обработки его щ&лочьюГ/ Однако известный способ недостаточно чувствителен, поскольку гидролиз щелочью приводит к потере антигенных детерминант, что снижает чувствительность .диагностикума.

Целью изобретения является повышение специфической чувствите;,ьности эритроцитарного ойагносгтнкума.

Указанная цель достигается тем, что согласно способу получения эритроцитарного диагностикума .для выявления антител путем, выделения из мутанта Soiemoaeee«mmntsotct R595 гликолипида с последующей сорбцией егона эритроцитах, нативный гликолипид сорбируют на эритроцитах в присутствии бычьего сывороточного альбумина.

Способ осуществляется следующим об«разом.

Свежие человеческие эритроциты груяпы 0/1Рн+ отмывают 0,9%-ным раствором хлористого натрия от плазмы (цент. рифугтфуют 15 мин при 25ОО с , супернатант отбрасывают эрнтрогаты вновь суспендируют и физиологическом растворе, процедуру повторяют трижды). Отмытые эритроциты суспендируют в стандарт ном солевом растворе (4,5 г цитрата натрия + 8,8 г хлористого натрия, дистилированной воды до 1 л) до конечной концети ашш 5-6% и циализуют против формалина, объем которого составляет 1/5 часть от объема суспендированных эритроцитов, 5-6 сут при 4-6°, периодически помешивая. После диализа эритро. циты отмывают от избытка формалина стандартным солевым раствором, готовят 5СЧ|р-ную суспензию в этом же растворе, добавляют формалин до концетгтрапии 1% и хранят в таком виде при .

6 мл 50%-ной суспензии эритроц№тов отмывают трижды от формалина стацдартньл солевым растворен,

5 мг танина растворяют в 20О мл О,15 М натрий-фосфатного буфера {l66 м

0,15 М раствора хлористого натрия + 1ОО мл 0,15 М натрий-фосфатного буфера ,2) суспендируют в этом растворе формалиннзированные эритро5 циты, инкубируют 10 мин при 37° и. цетрифугируют 15 мин при . Супернатант отбрасывают, эритроциты суспеноируют в том же буфере, вновь центрифугируют;

0 к полученной после центрифугирования суспензии эритроцитов добавЛ1Пот 0,15 М натрий-фосфатный буфер ,4, содержащий комплекс гликолипида с . бычьим сывороточным альбумином в

5 концентрации 2ОО мкг гликолипида

в 1 мл. Для получения комплекса 10 мг гликолипида, полученного хлороформ; метанольной экстракцией (2), растворяют в 10 мл деионизированной воды,

20 добавляя триэтиламин до концентрашш 1,5%, затем добавляют 0,5 мл раствора, садержащего бычий сывороточный альбумин в концентрации 1 мл/мг, перемешивают и затем отгоняют триэтил25 амин на роторном испарителе. После отгонки триэтиламина комплекс глико.гшшада с быч.ьим сывороточным альбумином разводят фосфатным буфером ( (0,19 М, ,4) так, что концентрация гликолипкда составляет 2ОО мкг/мл.

Далее смесь эритроцитов и комплекс са гликолипида с альбумином инкуб руют 30 мин при 37, отмывают три)35 ды стандартным солевым раствором, содержащем 0,03% бычьего сывороточного альбумина, готовят 10%-ную су опензию эритроцитов в этом же растворе, добавляют формалин до конечной концент

40 рацйи 0,1% и .хранят при 4°.

Для постановки реакции пассивной гемагглютинадки готовят 1%-ную суо. пензию эритроцитов в стандартном солевом растворе, содержащем 0,03% аль-

45 бумина. В каждую лунку вносят по 50 мк соответствующего разведения сыворотки, гфиготовленного на мeдинaлвepoнaлoвo f буфере ,6 и по 25 мкл 1%-ной суспензии эритроцитов.

В опытах пассивной гемагглютинаЦ0И (РПГА) кроличьи сыворотки против гликолипида и липида А реагировали с получешшш эритроцитарным диагностикумом в разведении 1:1О24 и 1:256 соответственно, тогда как эритроциты, сенсибилизированные только бычьим сывороточным альбумином, агглютил&. ровались теми же сыворотками в разделении 1:16 и 1:8 соответственно. Реакция пассивной гемагглютинашш ,эритроцитов, сенсибилизированных гл колкпидом в комплексе с бычьим сывороточным альбумином при добавлении кроличьих сывороток против гликолипида специфически ингибировагасъ гликоляпи;дом или липидом А в концентрации 0,2 мкгЛлл и 1 мкг/мл соответственно. При использовании сывороток против липида А реакция ингибировалась го.

Вид сенситина, использованного для получения ди 1гностикума 1

Твдры РПГА

Гипериммунная кро лнчь. липид сыворотка 39 гликолюшцом или лшшаом А в концент рации 1 мкг/мл. При сравнительном изучении пред- ложенного .днагностикума с 1фототшюм (эритроциты, сенсибилизированные глн колипнцом или лшшцом А после o6pa6oi s ки последних щелочью}; в РПГА с ио пользованием гипериммунных кроличьих сывороток к гликолипиду Ре и липиду А получены результаты,представленные табл. 1. Таблица

СПОССЖ ПОЛУЧЕНИЯ ЭРИТ РОЦИТАРНОГО ДИАГНОСТИКУМА «|пя выявленва антител путем вз мутанта 5ci€tnonet ci tninnisoto R 595 твколнпица с irocne,Ryioatefi сор&гаей его на эрятрооитах, о т л в ч а ю ш н ftСи тем, что, 6 целью повьппеняя спешн .фической чувстввтепьноств шагяоствку. ыа, натввный глвкопнпвд сорбяруют на эрвтроиитах в првоутствнв бычьего сывороточного альбумвна. 5

Нативный гликолипвд Re в комплексе с БСА

Гликолшгад Ре, обработанный щелочью (прототип)

Липид А в комплексе с БСА

Липид А, обработанный .щелочью Из табл. 1 вицно, что эритроциты, свнсяйииазфованные нативным. гликолипидом Re влв ф(шщаом А в комплексе с БСА облацахУг большей чувствитепьноойью в РПГА с автися 1вороткамв против гликолшщаа Re или лвпвоа А, чем эритро ,использовавшиеся в качестве прототипа

1:1024

1;256

1: 128

1:64 1: 256

1:512

1:4 Предложенный диагностнкум позволяет выявить антитела к гликолщшцу Re. t:. .хемотипа и липвду А в тех случаях, где они не обнаруживаются в РПГА с эритроцитами, сенсибилизированными глщхзпзатяам шш липяцом А после ш; о аботки щелочью (табл. 2),