ГЛЮКУРОНИДИРОВАННЫЙ АЦЕТАМИНОФЕН КАК МАРКЕР РАССТРОЙСТВ ПЕЧЕНИ Российский патент 2015 года по МПК G01N33/94 

СВЯЗАННАЯ ЗАЯВКА

По данной заявке испрашивается приоритет по предварительной патентной заявке США серийный № 61/194835, поданной 1 октября 2008 года, которая в полном объеме включена в настоящий документ в качестве ссылки.

ИЗЛОЖЕНИЕ ИНТЕРЕСА ПРАВИТЕЛЬСТВА

Данное изобретение выполнено при поддержке правительства по R01 DK068039, предоставленному Национальными Институтами Здравоохранения. Правительство обладает определенными правами на данное изобретение.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Ацетаминофен (APAP) является наиболее часто используемым неопиоидным анальгетиком и стандартным антипиретическим и анальгетическим средством, с которым сравнивают большинство других схожих продуктов. Метаболизм APAP, подавляющая часть которого протекает в печени, хорошо изучен (фиг. 1). По меньшей мере одна вторая часть введенной дозы образует конъюгаты с глюкуроновой кислотой (GLUC) и одна третья часть с сульфатом (SULF). По ферментативному пути CYP-450-зависимой оксидазы со смешанной функцией, главным образом через CYP2E1, протекает метаболизм приблизительно 5-9%. Это ведет к образованию токсичного реактивного промежуточного метаболита (NAPQI), который впоследствии образует конъюгат с глутатионом для образования нетоксичных конъюгатов с цистеином и меркаптуровой кислотой. В неизмененном виде почки экскретируют менее 5% рекомендованной дозы ацетаминофена. Ацетаминофен подвергается первоочередной элиминации из организма и имеет короткое время полужизни в плазме (2,0-2,4 часа).

APAP является хорошим примером интегральной роли, которую играют эффлюксные транспортеры в экскреции метаболитов лекарственного средства из печени. Для всех метаболитов APAP необходим эффлюксный транспорт для того, чтобы экскретироваться из печени, и каждый из них можно определить как в желчи, так и в моче. Исследования предрасположенности in vivo и эксперименты с функциональным транспортом in vitro указывают на то, что ABC-транспортеры ABCC2, ABCC3, ABCC4 и ABCG2 обладают способностью переносить различные неконъюгированные и конъюгированные лекарственные средства, включая метаболиты APAP. ABCC2 и ABCG2 расположены на канальцевой (апикальной) мембране гепатоциотов, через которую они экскретируют свои субстраты в желчные канальцы. Таким образом, в здоровой печени билиарная экскреция конъюгатов APAP с SULF, GLUC и GSH преимущественно опосредована ABCC2, тогда как, по видимому, ABCG2 также участвует в экскреции конъюгатов APAP-SULF. ABCC3 и ABCC4 экспрессируются на синусоидальной (базолатеральной) мембране гепатоцитов и холангиоцитов, из которых они выбрасывают свои субстраты в кровь. Синусоидальная экскреция метаболит APAP-GLUC из гепатоцитов преимущественно опосредована ABCC3, тогда как ABCC4, по видимому, опосредует экскрецию метаболитов APAP-SULF. Недавние исследования показали, что ABCC3 и ABCC4 выполняют аналогичную роль в оттоке APAP-SULF.

В недавнем исследовании (Drug. Metabolism and Disposition, 35:1970-1978 (2007)) на модели неалкогольного стеатогепатита (НАСГ) на крысах, полученной путем содержания крыс на метионин-, холин-недостаточной (МХН) диете в течение восьми недель, показали увеличение экспрессии белков эффлюксных транспортеров ABCC3 и ABCC4 в печени. Введение этим МХН крысам больших доз APAP (1 ммоль/кг) (эквивалентно дозе в 10 грамм для человека массой 68 килограмм или дозе в 17 грамм для человека массой 113 кг) привело к сдвигу экскреции APAP-GLUC от билиарной экскреции к экскреции в плазму по отношению к контролю. Однако при условии, что люди с недостаточностью метионина и холина не существуют и что в модели на крысах вводили большие дозировки APAP, было сделано предположение о том, что МХН крысы не являются хорошей моделью для людей с НАСГ или для исследования метаболизма лекарственных средств в печени человека. Как правило, принимается, что ни одна модель на животных в точности не воспроизводит НАСГ человека. Множество биохимических различий делает любое прямое сравнение потенциально переполненным артефактами. Например, в МХН модели отсутствует резистентность к инсулину, которая зачастую является компонентом НАСГ (Rinella ME and Green RM, J Hepatol. 2004 Jan; 40(1):47-51.). Кроме того, тогда как у людей стеатоз возникает при типичной западной диете, богатой жирами, которая ведет к увеличению результирующего потока липидов через печень, в МХН модели стеатоз и стеатогепатит вызваны биохимическим нарушением метаболизма липидов. Таким образом, прямое сравнение МХН модели и человека является неуместным. В особенности это касается МХН диеты, поскольку нельзя описать количественные параметры эффектов этой неестественной диеты в сравнении с эффектами повреждения печени.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В первом аспекте настоящее изобретение относится к способам диагностики расстройства печени у человека, которые включают

(a) определение количества ацетаминофен(APAP)-глюкоронида в образце плазмы и/или в образце мочи, полученном от человеческого субъекта после введения человеческому субъекту ацетаминофена (APAP), где человеческий субъект с риском расстройства печени;

(b) сравнение количества APAP-глюкоронида в образце плазмы и/или образце мочи с контролем; и

(c) идентификация человеческого субъекта в качестве обладающего расстройством печени, если количество APAP-глюкоронида в образце плазмы и/или образце мочи повышено по сравнению с контролем.

Во втором аспекте настоящее изобретение относится к способам идентификации человеческого субъекта с риском нежелательной реакции на лекарственное средство, которые включают

(a) определение количества ацетаминофена (APAP) в образце плазмы и/или образце мочи, полученных от человеческого субъекта после введения человеческому субъекту ацетаминофена (APAP), где человеческий субъект нуждается в лечении терапевтическим лекарственным средством;

(b) сравнение количества APAP-глюкоронида в образце плазмы и/или образце мочи с контролем; и

(c) идентификация человеческого субъекта в качестве обладающего риском нежелательной реакции на лекарственное средство, если количество APAP-глюкоронида в образце плазмы и/или образце мочи повышено по сравнению с контролем.

В третьем аспекте настоящее изобретение относится к способам определения соответствующей дозировки терапевтического лекарственного средства для человеческого субъекта, которые включают

(a) определение количества ацетаминофена (APAP) в образце плазмы и/или образце мочи, полученных от человеческого субъекта после введения человеческому субъекту ацетаминофена (APAP), где человеческий субъект нуждается в лечении терапевтическим лекарственным средством;

(b) сравнение количества APAP-глюкоронида в образце плазмы и/или образце мочи с контролем; и

(c) определение того, что человеческий субъект должен получать нестандартную дозировку лекарственного средства, если количество APAP-глюкоронида в образце плазмы и/или образце мочи повышено по сравнению с контролем.

В четвертом аспекте настоящее изобретение относится к машиночитаемому носителю, который содержит набор инструкций для управления устройством для измерения метаболитов, чтобы осуществлять стадии измерения, сравнения и идентификации любого варианта осуществления способов по первому, второму и третьему вариантам осуществления.

Варианты осуществления по каждому из этих аспектов по изобретению предоставлены в настоящем документе.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ РИСУНКОВ

На фиг. 1 представлена схема метаболизма ацетаминофена.

На фиг. 2 предоставлены авторадиограммы, отражающие экспрессию печеночных ABCC3 и ABCC4 у людей с NAFLD.

На фиг. 3A-B показан белок ABCC2, который в печени нормальных здоровых пациентов локализован на очень четко очерченных краях канальцевой мембраны (A), но явно размыт в мембранных везикулах, удаленных от канальца в печени с НАСГ (B).

На фиг. 4 показаны концентрации APAP и его основных метаболитов в плазме через 4 часа.

На фиг. 5 представлен график, отражающий концентрации APAP и метаболитов APAP в моче нормальных здоровых добровольцев, пациентов со стеатозом и пациентов с стеатогепатитом.

На фиг. 6A-C приведены графики анализов APAP-Gluc в плазме для НАСГ (A), воспаления печени (B) и фиброза печени (C).

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Все процитированные источники включены в настоящий документ в качестве ссылки в полном объеме. В рамках этой заявки, если не указано иначе, использованные способы можно найти в любом из некоторых хорошо известных источников, таких как: Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook, et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press), Gene Expression Technology (Methods in Enzymology, Vol. 185, edited by D. Goeddel, 1991. Academic Press, San Diego, CA), «Guide to Protein Purification» in Methods in Enzymology (M.P. Deutshcer, ed., (1990) Academic Press, Inc.); PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Innis, et al. 1990. Academic Press, San Diego, CA), Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 2nd Ed. (R.I. Freshney. 1987. Liss, Inc. New York, NY), Gene Transfer and Expression Protocols, рр. 109-128, ed. E.J. Murray, The Humana Press Inc., Clifton, N. J.), и каталог Ambion 1998 (Ambion, Austin, TX).

Как используют в настоящем документе, формы единственного числа включают множественное число до тех пор, пока в контексте явно не будет указано иное. «И», как используют в настоящем документе, взаимозаменяемо используют вместе с «или» до тех пор, пока в явной форме не будет указано иное.

В первом аспекте настоящее изобретение относится к способу диагностики расстройства печени у человека, включающему

(a) определение количества APAP-глюкоронида в образце плазмы и/или образце мочи, полученных от человеческого субъекта после введения человеческому субъекту ацетаминофена (APAP), где человеческий субъект имеет риск расстройства печени;

(b) сравнение количества APAP-глюкоронида в образце плазмы и/или образце мочи с контролем; и

(c) идентификация человеческого субъекта в качестве обладающего расстройством печени, если количество APAP-глюкоронида в образце плазмы и/или образце мочи повышено по сравнению с контролем.

В предпочтительном варианте осуществления этого первого аспекта способ включает в себя

(a) введение ацетаминофена (APAP) человеческому субъекту с риском расстройства печени;

(b) получение образца плазмы и/или образца мочи от человеческого субъекта;

(c) измерение количества APAP-глюкоронида в образце плазмы и/или образце мочи;

(d) сравнение количества APAP-глюкоронида в образце плазмы и/или образце мочи с контролем; и

(e) идентификация человеческого субъекта в качестве обладающего расстройством печени, если количество APAP-глюкоронида в образце плазмы и/или образце мочи повышено по сравнению с контролем.

Автор настоящего изобретения показал, что способы по изобретению предусматривают неинвазивный анализ крови или анализ мочи для идентификации людей-пациентов с различными расстройствами печени.

Человеческий субъект может представлять собой любого человека с риском расстройства печени, включая подростковых и взрослых человеческих субъектов. Образцы плазмы и/или мочи получали от человеческого субъекта стандартными способами, которые хорошо известны специалистам в данной области.

Как используют в настоящем документе, термин «расстройства печени» включает любое заболевание печени у людей, при которых проявляются изменения метаболизма ацетаминофена, как продемонстрировано в настоящем документе, включая в качестве неограничивающих примеров фиброз печени, гепатит, неалкогольный стеатогепатит (НАСГ), алкогольный стеатогепатит, стеатогепатит, индуцированный токсином, первичный склерозирующий холангит, цирроз и сепсис.

Как используют в настоящем документе, «ацетаминофен» (APAP) представляет собой хорошо известное средство для снижения боли и жара, а также содержащие его составы, структура которого показана на фиг. 1. Человеческому субъекту можно вводить любую подходящую дозировку APAP. Хотя человеческому субъекту можно ввести более чем одну дозу APAP, показанная максимальная доза 1000 мг является предпочтительной для минимизации риска токсичности, которая при этом все же облегчает анализ образования метаболитов. В одном из предпочтительных вариантов осуществления всех аспектов и вариантов осуществления изобретения человеческому субъекту вводят общую дозу APAP между 250 мг и 1000 мг. В одном из предпочтительных вариантов осуществления человеческие субъекты не принимают APAP, по меньшей мере, в течение 24 часов перед анализом. В одном из предпочтительных вариантов осуществления всех аспектов и вариантов осуществления изобретения человеческому субъекту вводят общую дозу APAP между 250 мг и 1000 мг. Можно вводить любой подходящий состав APAP, включая в качестве неограничивающих примеров жидкие пероральные лекарственные формы и твердые пероральные лекарственные формы.

Как используют в настоящем документе, «APAP-глюкоронид» относится к одному конкретному метаболиту APAP, структура которого показана на фиг. 1.

Как используют в настоящем документе, «контроль» представляет собой любое средство для нормализации количества APAP-глюкоронида, которое измеряют у человеческого субъекта со здоровой печенью. В одном из предпочтительных вариантов осуществления контроль включает предварительно определенные уровни APAP-глюкоронида, полученные от нормального индивидуума или популяции (т.е. от тех, кто достоверно не страдает от расстройства печени, представляющего интерес).

Как используют в настоящем документе, «повышенное» количество APAP-глюкоронида по отношению к контролю может представлять собой любое повышение относительно контроля и предпочтительно представляет собой статистически значимое повышение (например p<0,05). В различных предпочтительных вариантах осуществления повышенный уровень APAP-глюкоронида представляет собой различие в 1,2 раза, 1,4 раза, 1,5 раза, 2 раза, 3 раза, 4 раза, 5 раз или более количества APAP-глюкоронида в образце крови или мочи относительно соответствующего контроля.

Образцы плазмы и/или мочи, полученные в любой подходящий момент времени после введения APAP для определения APAP-глюкоронида, можно использовать в способах по всем аспектам и вариантам осуществления изобретения. В одном из предпочтительных вариантов осуществления всех аспектов и вариантов осуществления изобретения количество APAP-глюкоронида измеряют в образце плазмы и измерение выполняют между 1 минутой и 180 минутами после введения APAP; более предпочтительно между 1 минутой и 120 минутами после введения APAP и даже более предпочтительно между 1 минутой и 60 минутами после введения APAP. В различных дополнительных предпочтительных вариантах осуществления измерение выполняют между 10 минутами и 180 минутами; 30 минутами и 180 минутами; 45 минутами и 180 минутами; 60 минутами и 180 минутами; 10 минутами и 120 минутами; 30 минутами и 120 минутами; 45 минутами и 120 минутами; 10 минутами и 60 минутами; 30 минутами и 60 минутами; и 45 минутами и 60 минутами. В другом предпочтительном варианте осуществления по всем аспектам и вариантам осуществления изобретения количество APAP-глюкоронида измеряют в образце мочи, где измерение выполняют между 120 минутами и 480 минутами после введения APAP; более предпочтительно между 120 минутами и 360 минутами после введения APAP; и даже более предпочтительно между 120 минутами и 300 минутами после введения APAP или между 120 минутами и 240 минутами после введения APAP. В различных дополнительных предпочтительных вариантах осуществления измерение выполняют между 180 минутами и 480 минутами; 180 минутами и 360 минутами; 180 минутами и 300 минутами; 180 минутами и 240 минутами; 240 минутами и 480 минутами; 240 минутами и 360 минутами; 240 минутами и 300 минутами; 300 минутами и 480 минутами; 300 минутами и 360 минутами; 360 минутами и 480 минутами. В различных дополнительных предпочтительных вариантах осуществления можно выполнять 1, 2, 3, 4 или более измерений, например, для того, чтобы оценить увеличение APAP-глюкоронида по сравнению с контролем в один или несколько моментов времени. Способы могут дополнительно включать определение и/или измерение других анализируемых веществ в плазме и/или моче, включая в качестве неограничивающих примеров APAP, APAP-сульфат, APAP-NAC и APAP-CG/CYS.

Чтобы получить образец плазмы и/или мочи для измерения APAP-глюкоронида можно выполнять любые подходящие стадии обработки. В одном образцовом варианте осуществления белки преципитируют из образцов плазмы и/или мочи, используя стандартные способы, и центрифугируют; затем полученный супернатант используют для стадии измерения способов по изобретению.

Измерение количества APAP-глюкоронида в образце плазмы и/или образце мочи можно осуществить любым подходящим способом измерения анализируемого вещества, включая в качестве неограничивающих примеров хроматографию (такую как высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ), газовая хроматография (ГХ), ГХ-масс-спектрометрия (ГХ-МС), тонкослойная хроматография (ТСХ) и т.д.), ядерный магнитный резонанс (ЯМР), спектроскопию, электрохимические способы, капиллярный электрофорез и иммунологические способы.

В дополнительном предпочтительном варианте осуществления любого приведенного выше варианта осуществления стадии измерения, сравнения и идентификации выполняют автоматически; в этом варианте осуществления эти стадии можно осуществлять с использованием автоматизированного устройства, такого как устройство для осуществления любого из приведенных выше способов. В такие устройства встроен машиночитаемый носитель, содержащий инструкции для управления устройством, чтобы осуществлять стадии измерения, сравнения и идентификации.

Образцы плазмы и/или мочи, полученные от тестируемого человеческого субъекта, можно хранить перед измерением APAP-GLUC; подходящие условия хранения известны специалистам в данной области. Например, образцы можно заморозить при подходящих температурах на период хранения желаемой длительности; в одном из вариантов осуществления образцы стабильны в течение периода времени вплоть до одного года при температуре -80°C.

В одном из предпочтительных вариантов осуществления по этому первому аспекту человеческий субъект обладает риском неалкогольного стеатогепатита (НАСГ). Заболевание неалкогольного ожирения печени (NAFLD) включает спектр патологических повреждений, которые варьируют от стеатоза печени до формы жирового воспаления печени, известного как неалкогольный стеатогепатит (НАСГ), наиболее тяжелой формы NAFLD. Гистологические признаки, независимо связанные с диагнозом НАСГ в биоптатах человека, включают жировой гепатоз, увеличение гепатоцитов, воспаление долек, гиалин Мэллори и перисинусоидальный фиброз. Кроме того, НАСГ имеет возможность развития в цирроз, требующий пересадки печени.

Как описано в настоящем документе, автор настоящего изобретения обнаружил, что у людей-пациентов с НАСГ, транспортер ABCC2 неправильно локализован на канальцевой мембране, а вместо этого в печени с НАСГ локализован в мембранных везикулах вдали от канальца. Такую аберрантную локализацию транспортера ABCC2 не идентифицировали в МХН модели на крысах, описанной в Lickteig et al. (2007). Также автор настоящего изобретения обнаружил, что у людей-пациентов с НАСГ экспрессия печеночных ABCC3 и ABCC4 подвергается повышающей регуляции. Не ограничиваясь каким-либо механизмом действия, автор настоящего изобретения предполагает, что в печени измененный перенос ABCC2 в мембранные везикулы изменяет расположение APAP-GLUC, способствуя удержанию в плазме через ABCC3 и/или ABCC4 (и затем экскреции в мочу), а не билиарному клиренсу через ABCC2.

Способы по этому варианту осуществления могут служить для стратификации субъектов, страдающих от NAFLD, и проведения различий между теми, кто страдает от НАСГ, и теми, кто имеет жировой гепатоз. Настоящие способы диагностики НАСГ основаны на биопсии печени. Таким образом, неинвазивные способы диагностики НАСГ имеют клиническое значение и позволяют быстрее начать лечение НАСГ, включая в качестве неограничивающих примеров агрессивные программы снижения веса и лечение терапевтическими лекарственными средствами.

В предпочтительном варианте осуществления человеческий субъект с риском НАСГ страдает от одного или нескольких из заболевания неалкогольного ожирения печени, метаболического синдрома при стеатозе, ожирения, дислипидемии, резистентности к инсулину, сердечно-сосудистого заболевания и диабета.

В другом предпочтительном варианте осуществления первого аспекта по изобретению у человеческого субъекта существует риск фиброза печени. Фиброз печени представляет собой чрезмерно обильное заживление ран, при котором в печени образуется избыточная соединительная ткань. Происходит чрезмерное образование и/или недостаточное разрушение внеклеточного матрикса. Сам по себе фиброз не является причиной симптомов, но может вести к портальной гипертензии (рубцевание нарушает ток крови через печень) или циррозу (неспособность должным образом замещать разрушенные клетки печени ведет к дисфункции печени). Современные способы диагностики фиброза печени основаны на биопсии печени. Таким образом, неинвазивные способы диагностики фиброза печени обладают клиническим значением. В предпочтительном варианте осуществления человеческий субъект с риском фиброза печени страдает от или ранее страдал от одного или нескольких состояний, предрасполагающих к фиброзу печени, выбранных из группы, состоящей из недостаточности α₁-антитрипсина, болезни Вилсона, фруктоземии, галактоземии, гликогенозов III, IV, VI, IX и X типов, гемохроматоза, болезни Гоше, синдрома Цельвегера, тирозинемии, бактериальной инфекции, вирусной инфекции (например, вирусом гепатита B (HBV) или вируском гепатита C (HCV)), паразитарной инфекции, синдрома Бадда-Киари, алкоголизма, наркозависимости, сердечной недостаточности, окклюзионного заболевания вен печени, непроходимости желчных путей и тромбоза воротной вены.

Далее более подробно описано то, что автор настоящего изобретения обнаружил, что человеческие субъекты с фиброзом печени имеют повышенное количество APAP-GLUC в плазме и моче в сравнении с человеческими субъектами без фиброза печени. Способы по изобретению позволяют быстрее начать лечение фиброза печени, включая в качестве неограничивающих примеров устранение причины повреждения печени, например, посредством противовирусной терапии для элиминации HBC или HCV; воздержание от алкоголя при алкогольном заболевании печени; удаление тяжелых металлов, таких как железо или медь, при гемохроматозе и болезни Вилсона, соответственно; или снижение давления в желчных протоках при непроходимости желчных путей.

Гистологически фиброз печени, как правило, разделяют на легкий (минимальное рубцевание вокруг кровеносных сосудов), умеренный (рубцевание распространяется за пределы кровеносных сосудов печени) или тяжелый (рубцевания образуют мостики между кровеносными сосудами). В предпочтительном варианте осуществления человеческий субъект идентифицируют в качестве имеющего тяжелый фиброз печени, если количество APAP-глюкоронида в образце плазмы и/или образце мочи повышено по сравнению с контролем. В дополнительном предпочтительном варианте осуществления человеческий субъект страдает от НАСГ.

В другом предпочтительном варианте осуществления первого аспекта по изобретению у человеческого субъекта с риском гепатита воспаление печени отличается диффузным или очаговым некрозом. Основными случаями являются конкретные вирусы гепатита, алкоголь и лекарственные средства. Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления человеческий субъект страдает или страдал ранее от одного или нескольких расстройств, выбранных из группы, состоящей из алкоголизма, наркозависимости, бактериальной инфекции, вирусной инфекции (такой как гепатит A, B, C, D и/или E), грибковой инфекции, протозойной инфекции, гельминтной инфекции, инфекции спирохетами, саркоидоза, язвенного колита и болезни Крона.

Далее более подробно описано то, что автор настоящего изобретения обнаружил, что человеческие субъекты с воспалением печени (гепатитом) имеют повышенное количество APAP-GLUC в плазме и моче по сравнению с человеческими субъектами без фиброза печени. Как правило, воспаление печени гистологически делят на легкое (менее 2-х очагов воспаления), умеренное (2-4 очага воспаления) или тяжелое (более 4-х очагов воспаления). В предпочтительном варианте осуществления человеческий субъект идентифицируют в качестве имеющего умеренное или тяжелое воспаление печени, если количество APAP-глюкоронида в образце плазмы и/или образце мочи повышено по сравнению с контролем. В наиболее предпочтительном варианте осуществления человеческий субъект идентифицируют в качестве имеющего тяжелое воспаление печени, если количество APAP-глюкоронида в образце плазмы и/или образце мочи повышено по сравнению с контролем. В дополнительном предпочтительном варианте осуществления человеческий субъект страдает от НАСГ и/или фиброза печени.

Во втором аспекте настоящее изобретение относится к способам идентификации человеческого субъекта с риском нежелательной реакции на лекарственное средство, которые включают

(a) определение количества APAP-глюкоронида в образце плазмы и/или образце мочи, полученном от человеческого субъекта после введения человеческому субъекту ацетаминофена (APAP), где человеческий субъект нуждается в лечении терапевтическим лекарственным средством;

(b) сравнение количества APAP-глюкоронида в образце плазмы и/или образце мочи с контролем; и

(c) идентификацию человеческого субъекта в качестве обладающего риском нежелательной реакции на лекарственное средство, если количество APAP-глюкоронида в образце плазмы и/или образце мочи повышено по сравнению с контролем.

В предпочтительном варианте осуществления этого второго аспекта способ включает в себя

(a) введение ацетаминофена (APAP) человеческому субъекту, нуждающемуся в лечении терапевтическим лекарственным средством;

(b) получение образца плазмы и/или образца мочи от человеческого субъекта;

(c) измерение количества APAP-глюкоронида в образце плазмы и/или образце мочи;

(d) сравнение количества APAP-глюкоронида в образце плазмы и/или образце мочи с контролем; и

(e) идентификацию человеческого субъекта в качестве обладающего риском нежелательной реакции на лекарственное средство, если количество APAP-глюкоронида в образце плазмы и/или образце мочи повышено по сравнению с контролем.

В третьем аспекте настоящее изобретение относится к способам определения соответствующей дозировки терапевтического лекарственного средства для человеческого субъекта, которые включают

(a) определение количества APAP-глюкоронида в образце плазмы и/или образце мочи, полученном от человеческого субъекта после введения человеческому субъекту ацетаминофена (APAP), где человеческий субъект нуждается в лечении терапевтическим лекарственным средством;

(b) сравнение количества APAP-глюкоронида в образце плазмы и/или образце мочи с контролем; и

(c) определение того, что человеческий субъект должен получать нестандартную дозировку лекарственного средства, если количество APAP-глюкоронида в образце плазмы и/или образце мочи повышено по сравнению с контролем.

В предпочтительном варианте осуществления этого третьего аспекта способ включает в себя:

(a) введение ацетаминофена (APAP) человеческому субъекту, нуждающемуся в лечении терапевтическим лекарственным средством;

(b) получение образца плазмы и/или образца мочи от человеческого субъекта;

(c) измерение количества APAP-глюкоронида в образце плазмы и/или образце мочи;

(d) сравнение количества APAP-глюкоронида в образце плазмы и/или образце мочи с контролем; и

(e) идентификацию человеческого субъекта в качестве того, кто должен получать нестандартную дозировку лекарственного средства, если количество APAP-глюкоронида в образце плазмы и/или образце мочи повышено по сравнению с контролем.

Все термины, общие для первого, второго и третьего аспектов по изобретению, имеют одинаковое определение; все варианты осуществления первого аспекта применимы ко второму и третьему аспектам по изобретению, если в контексте явным образом не указано иное.

Как описано в настоящем документе, автор настоящего изобретения обнаружил, что у людей-пациентов с НАСГ транспортер ABCC2 неправильно локализован на канальцевой мембране, а вместо этого локализован в мембранных везикулах вдали от канальцев в печени с НАСГ. Такую аберрантную локализацию транспортера ABCC2 не идентифицировали в МХН модели на крысах, описанной в Lickteig et al. (2007). Также автор настоящего изобретения обнаружил, что экспрессия печеночных ABCC3 и ABCC4 подвергается повышающей регуляции у людей-пациентов с НАСГ. Не ограничиваясь каким-либо механизмом действия, автор настоящего изобретения предполагает, что в печени измененный перенос ABCC2 в мембранные везикулы изменяет расположение APAP-GLUC, способствуя удержанию в плазме через ABCC3 и/или ABCC4 (и затем экскреции в мочу), а не билиарному клиренсу через ABCC2. Таким образом, пропорциональный сдвиг элиминации метаболитов APAP из желчи в плазму/мочу указывает на изменения экспрессии эффлюксных транспортеров и/или локализации в клетке, которые могут оказывать влияние на путь элиминации лекарственного средства и, таким образом, обуславливает способы идентификации тех человеческих субъектов, которые имеют риск нежелательной реакции на лекарственное средство вследствие изменения экспрессии и/или локализации эффлюксных транспортеров.

Как используют в настоящем документе, «с риском нежелательной реакции на лекарственное средство» обозначает, что человеческий субъект обладает большей вероятностью перенести одну или несколько нежелательных реакций, связанных с лекарственным средством, подлежащим приему. Такие возможные нежелательные реакции включают любые такие нежелательные реакции, как те, что перечислены в литературе о продукте для любого данного лекарственного средства, а также идиосинкразические нежелательные реакции.

Как используют в настоящем документе, «нестандартная дозировка лекарственного средства» обозначает, что лечащий врач должен изменить дозировку лекарственного средства, подлежащую введению человеческому субъекту, с учетом повышенного риска нежелательной реакции на лекарственное средство.

В различных предпочтительных вариантах осуществления второго и третьего аспектов по изобретению человеческий субъект, нуждающийся в лечении терапевтическим лекарственным средством, имеет риск или страдает от НАСГ, фиброза печени и/или воспаления печени. Человеческие субъекты с риском каждого из этих расстройств подробно описаны в первом аспекте по изобретению. В другом предпочтительном варианте осуществления человеческий субъект страдает от любого расстройства, ведущего к измерению экспрессии и/или локализации транспортеров ABCC2, ABCC3 и/или ABCC4. В одном из предпочтительных вариантов осуществления расстройство ведет к аберрнатной локализации транспортера ABCC2.

В различных предпочтительных вариантах осуществления терапевтическое лекарственное средство представляет собой терапевтическое лекарственное средство, транспорт метаболита(ов) которого из печени происходит посредством транспортеров ABCC2, ABCC3 и/или ABCC4. В различных неограничивающих примерах такие терапевтические лекарственные средства включают доксорубицин, цисплатин, этопозид, метотрексат, морфин, эзетимиб, глюкоронированные конъюгированные лекарственные средства, конъюгированные с глутатионом лекарственные средства и конъюгированные с сульфатом лекарственные средства.

Человеческому субъекту можно вводить любую подходящую дозировку APAP. Несмотря на то, что человеческому субъекту можно вводить более чем одну дозу APAP, в предпочтительном варианте осуществления для облегчения анализа образования метаболитов вводят одну дозировку. В одном из предпочтительных вариантов осуществления человеческие субъекты не принимают APAP в течение по меньшей мере 24 часов перед анализом. В дополнительном предпочтительном варианте осуществления всех аспектов и вариантов осуществления изобретения человеческому субъекту вводят общую дозу APAP между 250 мг и 1000 мг. Можно вводить любой подходящий состав APAP, включая в качестве неограничивающих примеров жидкие пероральные лекарственные формы и твердые пероральные лекарственные формы.

В способах по всем аспектам и вариантам осуществления изобретения для определения APAP-глюкоронида можно использовать образцы плазмы и/или мочи, полученные в любой подходящий момент времени после введения APAP. В одном из предпочтительных вариантов осуществления всех аспектов и вариантов осуществления изобретения количество APAP-глюкоронида измеряют в образце плазмы и измерение выполняют между 1 минутой и 240 минутами после введения APAP; более предпочтительно между 1 минутой и 180 минутами после введения APAP и даже более предпочтительно между 1 минутой и 120 минутами или между 1 минутой и 60 минутами после введения APAP. В другом предпочтительном варианте осуществления по всем аспектам и вариантам осуществления изобретения количество APAP-глюкоронида измеряют в образце мочи, где измерение выполняют между 120 минутами и 480 минутами после введения APAP; более предпочтительно между 120 минутами и 360 минутами после введения APAP; и даже более предпочтительно между 120 минутами и 300 минутами или между 120 минутами и 240 минутами после введения APAP.

Для получения образца плазмы и/или мочи для измерения APAP-глюкоронида можно осуществлять любые подходящие стадии обработки. В одном образцовом варианте осуществления из образцов плазмы и/или мочи белки преципитируют, используя стандартные способы, и центрифугируют; затем полученный супернатант используют для стадии измерения способов по изобретению.

Измерение количества APAP-глюкоронида в образце плазмы и/или образце мочи можно осуществлять посредством любого подходящего способа измерения анализируемого вещества, включая в качестве неограничивающих примеров хроматографию (такую как высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ), газовая хроматография (ГХ), ГХ-масс-спектрометрия (ГХ-МС), тонкослойная хроматография (ТСХ) и т.д.), ядерный магнитный резонанс (ЯМР), спектроскопию, электрохимические способы, капиллярный электрофорез и иммунологические способы.

Как используют в настоящем документе, «контроль» представляет собой средство для нормализации количества APAP-глюкоронида, которое измеряют у человеческого субъекта со здоровой печенью. В одном из предпочтительных вариантов осуществления контроль содержит предварительно определенные уровни APAP-глюкоронида от здорового индивидуума или популяции (т.е. от тех, кто достоверно не страдает от расстройства печени, представляющего интерес).

Как используют в настоящем документе, «повышенное» количество APAP-глюкоронида по отношению к контролю может представлять собой любое повышение относительно контроля и предпочтительно представляет собой статистически значимое повышение (например, p<0,05). В различных предпочтительных вариантах осуществления повышенный уровень APAP-глюкоронида представляет собой различие в 1,2 раза, 1,4 раза, 1,5 раза, 2 раза, 3 раза, 4 раза, 5 раз или более в количестве APAP-глюкоронида в образце крови или мочи относительно соответствующего контроля.

В дополнительном предпочтительном варианте осуществления любого указанного выше варианта осуществления стадии измерения, сравнения и идентификации автоматизированы; в этом варианте осуществления эти стадии можно осуществлять, используя автоматизированное устройство, такое как устройство для осуществления любого указанного выше способа. Такие устройства содержат машиночитаемый носитель, содержащий инструкции для управления устройством для осуществления стадий измерения, сравнения и идентификации.

В четвертом аспекте настоящее изобретение относится к машиночитаемому носителю, содержащему набор инструкций для управления устройством для измерения метаболитов для осуществления стадий измерения, сравнения и идентификации любого варианта осуществления способов по первому, второму и третьему аспектам по изобретению. Как используют в настоящем документе, термин «машиночитаемый носитель» включает магнитные диски, оптические диски, органическую память и любую другую оперативную (например, оперативное запоминающее устройство («ОЗУ»)) или постоянную (например, постоянное запоминающее устройство («ПЗУ»)) систему хранения данных большой емкости, считываемую посредством ЦП. Машиночитаемый носитель включает взаимодействующие или взаимосвязанные машиночитаемые носители, которые существуют исключительно в системе обработки или распределены по нескольким взаимосвязанным системам обработки, которые могут быть расположены локально или удаленно относительно системы обработки. Как используют в настоящем документе, «устройство для измерения метаболитов» обозначает устройство, допускающее осуществление измерений метаболитов для осуществления изобретения, включая в качестве неограничивающих примеров хроматографические устройства (такие как устройства для высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), устройства для газовой хроматографии (ГХ), устройства ГХ-масс-спектрометрии (ГХ-МС), устройства для тонкослойной хроматографии (ТСХ) и т.д.), устройства для ядерного магнитного резонанса (ЯМР), устройства для спектроскопии, электрохимические устройства, устройства для иммунологического определения и устройства для капиллярного электрофореза.

Пример 1. Повышенная экспрессия печеночных эффлюксных транспортеров у людей с диагнозом НАСГ

Проводили исследования, чтобы определить, характерен ли для пациентов, страдающих от NAFLD, измененный метаболизм и расположение ацетаминофена. Образцы печени человека от пациентов со здоровой печенью, стеатозом, НАСГ с жировой инфильтрацией печени и конечной стадией НАСГ (криптогенный цирроз) получали из NIH, основанного Национальным Институтом Здравоохранения Liver Tissue Procurement and Distribution System (LTPADS).

Анализ белков иммуноблотом. Полноклеточные лизаты (20 мкг/лунка) разделяли посредством SDS-PAGE на 7,5% гелях и переносили на мембраны из ПВДФ в течение ночи при постоянном токе в 30 мА. Все мембраны блокировали в течение одного часа при комнатной температуре в 5% нежирном сухом молоке, изготовленном в фосфатно-солевом буфере с Tween 20 (PBST). Затем мембраны инкубировали в растворе первичных антител (разведение 1:2000 в PBST-молоко), состоящем или из моноклональных антител к ABCC3, ABCC4 (Abcam, Cambridge, MA), или из поликлональных антител к GAPDH (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) в течение ночи при температуре 4°C. После инкубации в течение ночи мембраны инкубировали в растворах вторичных антител, конъюгированных с пероксидазой хрена, (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) в течение одного часа при комнатной температуре. Связывание антител определяли, используя набор ECL Advance Western Blotting Detection (GE Healthcare Life Sciences, Piscataway, NJ) в соответствии с протоколом производителя.

На фиг. 2 показана экспрессия печеночных ABCC3 и ABCC4 у людей с NAFLD. В результате сравнения со здоровой печенью в печенях со стеатозом имело место небольшое изменение экспрессии ABCC3 и ABCC4; однако имело место значительное увеличение экспрессии белка в печени человека с НАСГ на любой стадии. Тогда как ранее считалась, что экспрессия этих транспортеров у человека обладает значительными индивидуальными отклонениями, похоже, что отклонение по большей части может быть обусловлено патологическим состоянием.

Пример 2. Измененная локализация ABCC2 в клетках печени человека с диагнозом НАСГ

Измененный клеточный перенос как средство регуляции функции ABCC2 подробно задокументирован в различных состояниях, таких как токсичность, индуцированная лекарственным средством, и беременность. Необходимым условием активности ABCC2 является правильная локализация на канальцевой мембране. Перемещение транспортера ABCC2 от канальцевой мембраны в мембранные везикулы может представлять собой эволюционное преимущество, которое позволяет клетке быстро регулировать активность транспорта без необходимости ожидания относительно медленного процесса разрушения белка/синтеза de novo.

Иммуногистохимическое окрашивание. В кратком изложении, тканевые срезы фиксированных формалином погруженных в парафин образцов печени человека депарафинизировали в ксилоле и регирдатировали в этаноле, с последующим восстановлением антигенов в цитратном буфере (pH 6,0). Активность эндогенной пероксидазы блокировали в 0,3% (об./об.) H₂O₂ в метаноле в течение 20 минут. Все срезы помещали в Shandon Sequenza™ Slide Racks (Thermo-Scientific, Waltham, MA) для инкубации с остальными реактивами. Фоновое окрашивание блокировали посредством инкубации всех образцов в Background Sniper™ (Biocare Medical, Concord, CA) в течение 10 минут. Затем образцы инкубировали в моноклональном антителе мыши MRP2 в течение ночи при 4°C. На следующий день образцы инкубировали в Mouse Probe и HRP Polymer (Biocare Medical, Concord, CA) в каждом в течение 15 минут для определения связанного антитела. Развитие окраски осуществляли посредством инкубации в Betazoid™ DAB (Biocare Medical, Concord, CA) в течение 3 минут с последующим блокированием в деионизированной воде. Проводили контрастное окрашивание всех образцов с использованием только что отфильтрованного раствора гематоксилина (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Все срезы визуализировали с использованием микроскопа Nikon Eclipse™ E4000 и камеры Sony Exwave™ DXC-390.

Как видно на фиг. 3, в печени обычного здорового пациента белок ABCC2 локализован на очень четко очерченных краях канальцевой мембраны, но явно размыт в мембранных везикулах, удаленных от канальца в печени с НАСГ. Этот механизм переноса ABCC2 далеко от места его активности позволяет гепатоциту эффективно регулировать и сохранять важные эндогенные компоненты в процессе клеточного стресса, при этом сохраняя экспрессию белка. Измененный клеточный перенос ABCC2 в мембранные везикулы изменяет расположение APAP-GLUC, чтобы содействовать удержанию в плазме, а не билиарному клиренсу.

Пример 3. У педиатрических пациентов с НАСГ уровни ацетаминофен-глюкоронида выше в плазме и моче, чем у пациентов со стеатозом

Проводили исследование среди педиатрических пациентов, у которых состояние заболевания подтверждали биопсией. В предварительном исследовании предпочтение отдали двадцати четырем педиатрическим пациентам (12-18 лет) по причине предполагаемого отсутствия усугубляющих факторов (например, употребления алкоголя, несанкционированного использования лекарственных средств) и увеличенной предрасположенности к детскому ожирению. С другой стороны, просто вследствие возраста у педиатрических пациентов ограничено количество существующих повреждений печени, которые могли возникнуть, где педиатрические пациенты неспособны развивать баллонную дистрофию, и ограничены отложением жира, воспалением и фиброзом.

Анализ высокоэффективной жидкостной хроматографией

Посредством анализа высокоэффективной жидкостной хроматографией определяли количество APAP и его метаболитов в образцах плазмы и мочи, основываясь на ранее описанных способах (Howie et al, 1977a; Chen et al, 2000; Slitt et al., 2003d). APAP и его метаболиты разрешали с использованием колонки с обратной фазой Zorbmax™ SB-C18 4,6 мм × 25 см с Phenomenex™ Security Guard Column Guard и элюировали, используя подвижную фазу, состоящую из 12,5% метанола для ВЭЖХ, 1% уксусной кислоты и 86,5% воды, в изократном режиме при скорости потока 1,2 мл/мин. За элюированием метаболитов следили при длине волны 254 нм. Время удержания APAP и его метаболитов определяли по сравнению с аутентичными стандартами. Поскольку этот способ ВЭЖХ не разделяет конъюгаты APAP с цистеинил-глицином и цистеином, то определяли их суммарное количество в виде APAP-CG/CYS. Образцы анализировали с использованием системы Beckman System Gold™ HPLC (Beckman Coulter, Inc., Fullerton, CA), оснащенной 128 нм модулем растворителя и 166 нм детектором. Количественно определение основано на интегрированных площадях пиков. Концентрации APAP и его метаболитов вычисляли с использованием калибровочной кривой для APAP, поскольку коэффициенты молярной экстинкции APAP и его конъюгированных метаболитов приблизительно равны (Howie et al., 1977b). Чтобы преципитировать белки в плазме и моче, образцы разбавляли 1:2, 1:2 и 1:3, соответственно, ледяным метанолом и центрифугировали при 4000×g в течение 30 минут при температуре 4°C. Полученные супернатанты собирали и разбавляли подвижной фазой 1:3 (моча) или 1:2 (плазма) перед анализом ВЭЖХ.

На фиг. 4 показана концентрация APAP и его основных метаболитов в плазме через 1 час после введения APAP. Среднее значение и медиана приведены в таблице 1.

Таблица 1   Среднее (нмоль/мл) Медиана (нмоль/мл) Здоровый 1 ч 29,9 29,0 Здоровый 2 ч 54,3 48,9 Здоровый 3 ч 46,7 39,2 Стеатоз 1 ч 30,5 32,6 Стеатоз 2 ч 44,3 41,1 Стеатоз 4 ч 35,5 35,3 НАСГ 1 ч 60,7 75,9 НАСГ 2 ч 72,7 66,4 НАСГ 4 ч 68,3 62,6

В плазме пациентов с стеатогепатитом концентрация APAP-GLUC значительно выше, чем у пациентов с простым стеатозом при измерении во все моменты времени. Дополнительно на фиг. 5 показана концентрация APAP и метаболитов APAP в моче обычных здоровых добровольцев, пациентов со стеатозом и пациентов со стеатогепатитом. До четырех часов между пациентами с НАСГ и другими группами различия уровней APAP-GLUC не выражены значительно вследствие временных ограничений образования мочи и опорожнения мочевого пузыря, а также условий метаболизма в печени и последующего распространения на почки. Эти данные ясно показывают возможность разработки неинвазивного анализа крови или анализа мочи для отграничения пациентов с НАСГ от пациентов просто со стеатозом.

Пример 4. Уровни ацетаминофен-глюкоронида выше в плазме педиатрических пациентов с фиброзом печени, чем у пациентов без фиброза печени.

Измерения посредством ВЭЖХ и другие детали экспериментов описаны в примере 3; данные приведены на фиг. 6. Гистологически фиброз печени характеризуют как легкий (минимальное рубцевание вокруг кровеносных сосудов), умеренный (рубцевание распространяется за пределы кровеносных сосудов печени) или тяжелый (рубцевание образует мостики между кровеносными сосудами).

Пример 5. Уровни ацетаминофен-глюкоронида выше в плазме педиатрических пациентов с воспалением печени, чем у пациентов без воспаления печени

Измерения посредством ВЭЖХ и другие детали экспериментов описаны в примере 3; данные приведены на фиг. 6. Гистологически воспаление печени характеризуют как легкое (менее 2-х очагов воспаления), умеренное (2-4 очага воспаления) или тяжелое (более 4-х очагов воспаления).

Настоящее изобретение относится к способу диагностики расстройств печени у человека, таких как неалкогольный стеатогепатит (НАСГ) и фиброз печени, а также машиночитаемому носителю, содержащему набор инструкций для управления устройством для измерения метаболитов с целью осуществления диагностики. Диагностику проводят путем определения количества ацетаминофена (АРАР)-глюкоронида в образце плазмы и/или образце мочи, полученном от человеческого субъекта после введения человеческому субъекту ацетаминофена (АРАР), где субъект имеет риск расстройства печени; сравнения полученного количества (АРАР)-глюкоронида с контролем; идентификации субъекта как страдающего НАСГ или фиброзом печени при повышенных уровнях АРАР-глюкоронида в одном или обоих образцах плазмы и образцах мочи в сравнении с контролем. 2 н. и 6 з.п. ф-лы, 1 табл., 5 пр., 6 ил.

1. Способ диагностики расстройства печени, выбранного из неалкогольного стеатогепатита (НАСГ) или фиброза печени у человека, включающий:
(a) определение количества ацетаминофен(АРАР)-глюкоронида в образце плазмы и/или образце мочи, полученном от человеческого субъекта после введения человеческому субъекту ацетаминофена (АРАР), где человеческий субъект имеет риск расстройства печени;
(b) сравнение количества АРАР-глюкоронида в образце плазмы и/или образце мочи с контролем; и
(c) идентификация человеческого субъекта как субъекта, страдающего НАСГ или фиброзом печени при повышенных уровнях АРАР-глюкоронида в одном или обоих образцах плазмы и образцах мочи по сравнению с контролем.

2. Способ по п. 1, где количество АРАР-глюкоронида измеряют в образце плазмы и где измерение выполняют между 1 минутой и 180 минутами после введения АРАР.

3. Способ по п. 1, где количество АРАР-глюкоронида измеряют в образце мочи и где измерение выполняют между 120 минутами и 480 минутами после введения АРАР.

4. Способ по п. 1, где человеческому субъекту вводят 250 мг - 1000 мг АРАР.

5. Способ по п. 2, где человеческому субъекту вводят 250 мг - 1000 мг АРАР.

6. Способ по п. 3, где человеческому субъекту вводят 250 мг - 1000 мг АРАР.

7. Способ по п. 1, где стадии измерения, сравнения и идентификации автоматизированы.

8. Машиночитаемый носитель, содержащий набор инструкций для управления устройством для измерения метаболитов для осуществления стадий измерения, сравнения и идентификации по п. 1