ТРИ- ИЛИ ТЕТРАСПЕЦИФИЧЕСКИЕ АНТИТЕЛА Российский патент 2015 года по МПК C07K16/46 C07K16/22 C12P21/08 A61K39/395 

Настоящее изобретение относится к новым три- или тетраспецифическим антителам, их получению и применению.

Предпосылки создания изобретения

В данной области известны сконструированные белки, такие как би- или мультиспецифические антитела, которые могут связываться с двумя или большим количеством антигенов. Такие мультиспецифические связывающие белки можно создавать с помощью методов клеточного слияния, химической конъюгации или рекомбинантной ДНК.

В последние годы создано широкое разнообразие форматов рекомбинантных мультиспецифических антител, таких, например, как четырехвалентные биспецифические антитела, полученные путем слияния, например, антитела IgG-формата и одноцепочечных доменов (см., например, Morrison S.L. и др.. Nature Biotech 15, 1997, ее. 159-163; WO 2001/077342; и Coloma M.J„ Nature Biotech 25, 2007, ее. 1233-1234).

Было разработано также несколько других новых форматов, в которых уже не сохранялась основная структура антитела (IgA, IgD, IgE, IgG или IgM), таких как димерные (диабоди), тримерные (триабоди) или тетрамерные (тетрабоди) антитела, миниантитела, несколько одноцепочечных форматов (scFv, бис-scFv), которые могут связываться с двумя или большим количеством антигенов (Holliger Р. и др.. Nature Biotech 23, 2005, ее. 1126 - 1136; Fischer N.. Leger О., Pathobiology 74, 2007, ее. 3-14; Shen J и др.. Journal of Immunological Methods 318, 2007, ее. 65-74; Wu С.и др.. Nature Biotech 25, 2007, ее. 1290-1297).

Во всех указанных форматах используют линкеры либо для слияния основной структуры антитела (IgA, IgD, IgE, IgG или IgM) с дополнительным связывающим белком (например, scFv), либо для слияния, например, двух Fab-фрагментов или scFv (Fischer N., Leger О., Pathobiology 74, 2007, ее. 3-14). Хотя очевидно, что линкеры дают преимущества при создании биспецифических антител, с ними могут быть связаны также проблемы терапевтического плана. Фактически эти чужеродные пептиды могут вызывать иммунный ответ против самого линкера или области стыка между белком и линкером. Кроме того, гибкая природа этих пептидов делает их более чувствительными к протеолитическому расщеплению, что может приводить к плохой стабильности, агрегации и повышенной иммуногенности антитела. Кроме того, может существовать необходимость в поддержании эффекторных функций, таких, например, как комплементзависимая цитотоксичность (CDC) или антитело-обусловленная клеточнозависимая цитотоксичность (ADCC), которые опосредуются Fc-областью, путем сохранения высокой степени сходства с встречающимися в естественных условиях антителами.

Таким образом, в идеальном варианте необходимо создавать биспецифические антитела, структура которых очень близка к общей структуре встречающихся в естественных условиях антител (типа IgA, IgD, IgE, IgG или IgM) и имеет минимальное отклонение от человеческих последовательностей.

В соответствии с одним из подходов биспецифические антитела с высокой степенью сходства со встречающимися в естественных условиях антителами создавали с помощью технологии квадром (квадрогибридом) (см. Milstein С.и А.С.Cuello, Nature, 305, 1983, ее. 537-540) на основе соматического слияния двух различных клеточных линий гибридом, которые экспрессируют мышиныемоноклональные антитела с требуемыми для биспецифического антитела специфичностями. В результате случайного спаривания тяжелых и легких цепей двух различных антител в образующейся линии клеток гибрида-гибридомы (или квадромы) получают вплоть до 10 различных видов антител, из которых только одно представляет собой требуемое функциональное биспецифическое антитело. Из-за присутствия полученных в результате ошибочного спаривания побочных продуктов и в значительной степени сниженного выхода продукта требуются более сложные процедуры очистки (см., например, Morrison S.L., Nature Biotech 25, 2007, ее. 1233-1234). В целом, эта же проблема, связанная с ошибочно спаренными побочными продуктами, сохраняется и при применении методов рекомбинантной экспрессии.

Подход, с помощью которого можно обойти проблему, связанную с полученными в результате ошибочных спариваний побочными продуктами, известный под названием «Knobs-info-holes»-технология (взаимодействие по типу «выступ-впадина»), направлен на усиление спаривания тяжелых цепей двух различных антител путем интродукции мутаций в СН3 -домены для модификации поверхности раздела в области контакта. На одной цепи, имеющие большие размеры аминокислоты заменяли на аминокислоты с короткими боковыми цепями для создания «впадины». И, наоборот, аминокислоты с более крупными боковыми цепями интродуцировали в другой СН3-домен, создавая «выступ». Путем совместной экспрессии этих двух тяжелых цепей (и двух идентичных легких цепей, которые должны соответствовать обеим тяжелым цепям), достигали высоких выходов гетеродимерной конструкции («выступ-впадина») по сравнению с выходом гомодимерной конструкции («впадина-впадина» или «выступ-выступ») (Ridgway J. В. и др.. Protein Eng. 9, 1996, ее. 617-621; и WO 1996/027011). Процентное содержание гетеродимера можно дополнительно повышать путем ремоделирования поверхностей раздела двух СН3-доменов с помощью технологии фагового дисплея и интродукции дисульфидного мостика с целью стабилизации гетеродимеров (Merchant A.M и др.. Nature Biotech 16, 1998, ее. 677-681; Atwell S„ Ridgway J.B., Wells J.A„ Carter P., J Mol Biol 270, 1997, ее. 26-35). Новые подходы к технологии «knobs-into-holes» описаны, например, в ЕР 1870459А1. Хотя указанный формат, вероятно, является очень привлекательным, в настоящее время отсутствуют данные о его усовершенствовании в направлении клинического применения. Одним из важных ограничений этой стратегии является то, что легкие цепи двух родительских антител должны быть идентичными для предупреждения ошибочного спаривания и формирования неактивных молекул. Таким образом, эта технология не пригодна в качестве основы для более легкого создания рекомбинантных три- или тетраспецифических антител к трем или четырем антигенам с использованием в качестве исходных двух антител к первому и второму антигену, поскольку сначала должны быть оптимизированы тяжелые цепи этих антител и/или идентичные легкие цепи, а затем необходимо добавлять дополнительные антигенсвязывающие пептиды, обладающие специфичностью в отношении третьего и четвертого антигена.

В WO 2006/093794 описаны композиции гетеродимерных связывающих белков. В WO 99/37791 описаны многоцелевые производные антител. В статье Morrison S.L. и др., J. Immunol. 160, 1998, ее. 2802-2808 описано влияние замены домена вариабельной области на функциональные свойства IgG.

Краткое изложение сущности изобретения Настоящее изобретение относится к триспецифическому или тетраспецифическому антителу, содержащему:

а) легкую цепь и тяжелую цепь полноразмерного антитела, обладающего способностью специфически связываться с первым антигеном; и

б) модифицированную легкую цепь и модифицированную тяжелую цепь полноразмерного антитела, обладающего способностью специфически связываться со вторым антигеном, в которых вариабельные домены VL и VH заменены друг на друга, и/или в которых константные домены CL и СН1 заменены друг на друга; и

в) в котором от одного до четырех антигенсвязывающих пептидов, обладающих способностью специфически связываться с одним или двумя другими антигенами, слиты посредством пептида-коннектора с С- или N-концом легких цепей или тяжелых цепей, указанных в подпунктах а) и/или б).

Другим вариантом осуществления изобретения является способ получения триспецифического или тетраспецифического антитела, предлагаемого в изобретении, заключающийся в том, что осуществляют стадии, на которых

а) трансформируют клетку-хозяина

- векторами, которые содержат молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие

аа) легкую цепь и тяжелую цепь антитела, обладающего способностью специфически связываться с первым антигеном; и

аб) модифицированную легкую цепь и модифицированную тяжелую цепь полноразмерного антитела, обладающего способностью специфически связываться со вторым антигеном, в которых вариабельные домены VL и VH заменены друг на друга, и/или в которых константные домены CL и СН1 заменены друг на друга; и

ав) в которых от одного до четырех антигенсвязывающих пептидов, обладающих способностью специфически связываться с одним или двумя другими антигенами, слиты посредством пептида-коннектора с С- или N-концом легких цепей или тяжелых цепей, указанных в подпунктах аа) и/или аб);

б) культивируют клетку-хозяина в условиях, в которых может осуществляться синтез указанной молекулы антитела; и

в) выделяют молекулу антитела из культуры. Следующим вариантом осуществления изобретения является клетка-хозяин, содержащая

-векторы, которые содержат молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие

а) легкую цепь и тяжелую цепь антитела, обладающего способностью специфически связываться с первым антигеном; и

б) модифицированную легкую цепь и модифицированную тяжелую цепь полноразмерного антитела, обладающего способностью специфически связываться со вторым антигеном, в которых вариабельные домены VL и VH заменены друг на друга, и/или в которых константные домены CL и СН1 заменены друг на друга; и

в) в которых от одного до четырех антигенсвязывающих пептидов, обладающих способностью специфически связываться с одним или двумя другими антигенами, слиты посредством пептида-коннектора с С- или N-концом легких цепей или тяжелых цепей, указанных в подпунктах а) и/или б).

Следующим вариантом осуществления изобретения является композиция, предпочтительно фармацевтическая или диагностическая композиция, которая содержит антитело, предлагаемое в изобретении.

Следующим вариантом осуществления изобретения является фармацевтическая композиция, которая содержит антитело, предлагаемое в изобретении, и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый эксципиент.

Следующим вариантом осуществления изобретения является способ лечения пациента, который нуждается в терапии, отличающийся тем, что вводят пациенту в терапевтически эффективном количестве антитело, предлагаемое в изобретении.

Согласно изобретению соотношение между триспецифическим или тетраспецифическим антителом и нежелательными побочными продуктами можно повышать путем замены конкретных доменов только в той паре тяжелой цепи и легкой цепи (HC/LC) полноразмерного антитела, которая обладает способностью специфически связываться со вторым антигеном (второе антитело). Таким путем можно снижать количество нежелательных ошибочных спариваний легкой цепи с несоответствующей ей тяжелой цепью (т.е. легкой цепи первого антитела с тяжелой цепью второго антитела или легкой цепи второго антитела с тяжелой цепью первого антитела).

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение относится к триспецифическому или тетраспецифическому антителу, содержащему:

а) легкую цепь и тяжелую цепь полноразмерного антитела, обладающего способностью специфически связываться с первым антигеном; и

б) модифицированную легкую цепь и модифицированную тяжелую цепь полноразмерного антитела, обладающего способностью специфически связываться со вторым антигеном, в которых вариабельные домены VL и VH заменены друг на друга, и/или в которых константные домены CL и СН 1 заменены друг на друга; и

в) в котором от одного до четырех антигенсвязывающих пептидов, обладающих способностью специфически связываться с одним или двумя другими антигенами, слиты посредством пептида-коннектора с С- или N-концом легких цепей или тяжелых цепей, указанных в подпунктах а) и/или б).

В одном из вариантов осуществления изобретения триспецифическое или тетраспецифическое антитело, предлагаемое в изобретении, содержит в качестве антигенсвязывающих пептидов, указанных в подпункте в), один или два антигенсвязывающих пептида, обладающих способностью специфически связываться с одним или двумя другими антигенами.

В одном из вариантов осуществления изобретения триспецифическое или тетраспецифическое антитело, предлагаемое в изобретении, отличается тем, что антигенсвязывающие пептиды выбраны из группы, включающей scFv-фрагмент и scFab-фрагмент.

В одном из вариантов осуществления изобретения триспецифическое или тетраспецифическое антитело, предлагаемое в изобретении, отличается тем, что антигенсвязывающие пептиды представляют собой scFv-фрагменты.

В одном из вариантов осуществления изобретения триспецифическое или тетраспецифическое антитело, предлагаемое в изобретении, отличается тем, что антигенсвязывающие пептиды представляют собой scFab-фрагменты.

В одном из вариантов осуществления изобретения триспецифическое или тетраспецифическое антитело, предлагаемое в изобретении, отличается тем, что антигенсвязывающие пептиды слиты с С-концом тяжелых цепей, указанных в подпунктах а) и/или б).

В одном из вариантов осуществления изобретения триспецифическое или тетраспецифическое антитело, предлагаемое в изобретении, содержит в качестве антигенсвязывающих пептидов, указанных в подпункте в), один или два антигенсвязывающих пептида, обладающих способностью специфически связываться с одним дополнительным антигеном.

В одном из вариантов осуществления изобретения триспецифическое или тетраспецифическое антитело, предлагаемое в изобретении, содержит в качестве антигенсвязывающих пептидов, указанных в подпункте в), два идентичных антигенсвязывающих пептида, обладающих способностью специфически связываться с третьим антигеном. Предпочтительно эти оба идентичных антигенсвязывающих пептида слиты посредством одного и того же пептида-коннектора с С-концом тяжелых цепей, указанных в подпунктах а) и б). Предпочтительно указанные два идентичных антигенсвязывающих пептида представляют собой либо scFv-фрагмент, либо scFab-фрагмент.

В одном из вариантов осуществления изобретения триспецифическое или тетраспецифическое антитело, предлагаемое в изобретении, содержит в качестве антигенсвязывающих пептидов, указанных в подпункте в), два антигенсвязывающих пептида, обладающих способностью специфически связываться с третьим и четвертым антигенами. В одном из вариантов осуществления изобретения указанные два антигенсвязывающих пептида слиты оба посредством одного и того же пептида-коннектора с С-концом тяжелых цепей, указанных в подпунктах а) и б). Предпочтительно указанные два идентичных антигенсвязывающих пептида представляют собой либо scFv-фрагмент, либо scFab-фрагмент.

Согласно изобретению, соотношение между требуемым триспецифическим или тетраспецифическим антителом и нежелательными побочными продуктами (образующимися вследствие ошибочного спаривания легкой цепи с «несоответствующей» тяжелой цепью антитела, обладающего способностью специфически связываться с другим антигеном) можно повышать путем замены конкретных доменов только в одной паре тяжелой цепи и легкой цепи (HC/LC). В то время как первая из двух пар полноразмерных HC/LC-цепей происходит из антитела, обладающего способностью специфически связываться с первым антигеном, и остается практически без изменения, вторая из двух пар полноразмерных HC/LC-цепей происходит из антитела, обладающего способностью специфически связываться со вторым антигеном, и ее модифицируют путем следующих замен:

- в легкой цепи:

замена вариабельного домена VL легкой цепи на вариабельный домен VH тяжелой цепи антитела, обладающего способностью специфически связываться со вторым антигеном, и/или константного домена CL легкой цепи на константный домен СН1 тяжелой цепи антитела, обладающего способностью специфически связываться со вторым антигеном, и

- в тяжелой цепи: замена вариабельного домена VH тяжелой цепи на вариабельный домен VL легкой цепи антитела, обладающего способностью специфически связываться со вторым антигеном, и/или константного домена СН1 тяжелой цепи на константный домен CL легкой цепи антитела, обладающего способностью специфически связываться со вторым антигеном.

Затем с таким обеспечивающим указанное выше улучшенное соотношение биспецифическим антителом сливают от одного до четырех антигенсвязывающих пептидов, обладающих способностью специфически связываться с одним или двумя другими антигенами, присоединяя их посредством пептида-коннектора к С- или N-концу легких цепей или тяжелых цепей указанных двух антител, обладающих способностью специфически связываться с первым и вторым антигеном, в результате чего получают триспецифическое и тетраспецифическое антитело, предлагаемое в изобретении.

Таким образом, полученные триспецифическое и тетраспецифическое антитела, предлагаемые в изобретении, представляют собой искусственные антитела, содержащие

а) легкую цепь и тяжелую цепь антитела, обладающего способностью специфически связываться с первым антигеном; и

б) легкую цепь и тяжелую цепь антитела, обладающего способностью специфически связываться со вторым антигеном,

где легкая цепь (антитела, обладающего способностью специфически связываться со вторым антигеном) содержит вариабельный домен VH вместо VL

и/или константный домен СН1 вместо CL

где тяжелая цепь (антитела, обладающего способностью специфически связываться со вторым антигеном) содержит вариабельный домен VL вместо VH

и/или константный домен CL вместо СНl.

Согласно дополнительному объекту изобретения такое улучшенное соотношение между требуемым двухвалентным биспецифическим антителом и нежелательными побочными продуктами можно еще более улучшать путем осуществления модификаций СН3-доменов полноразмерных антител, которые обладают способностью специфически связываться с первым и вторым антигенами, присутствующих в три- или тетраспецифическом антителе.

Так, в одном из предпочтительных вариантов осуществления изобретения СН3-домены указанного три- или тетраспецифического антитела (содержащиеся в тяжелой цепи и в модифицированной тяжелой цепи), предлагаемого в изобретении, можно изменять с помощью технологии «knob-into-holes», которая описана подробно на нескольких примерах, например, в WO 96/027011, у Ridgway J.B. и др.. Protein Eng 9, 1996, ее. 617-621; и у Merchant A.M. и др., Nat Biotechnol 16, 1998, ее. 677-681. При использовании этого метода взаимодействующие поверхности двух СН3-доменов изменяют с целью повышения гетеродимеризации обеих тяжелых цепей, содержащих эти два СН3-домена. Каждый из. двух СH3-доменов (двух тяжелых цепей) может представлять собой «выступ», а другой представлять собой «впадину». Введение дисульфидного мостика дополнительно стабилизирует гетеродимеры (Merchant А.М, и др.. Nature Biotech 16, 1998, ее. 677-681; Atwell S. и др., J Mol Biol 270, 1997, ее. 26-35) и повышает выход продукта.

Таким образом, согласно одному из объектов изобретения триспецифическое или тетраспецифическое антитело дополнительно отличается тем, что

СН3-домен тяжелой цепи полноразмерного антитела, указанного в подпункте а), и СН3-домен модифицированной тяжелой цепи полноразмерного антитела, указанного в подпункте б), каждый соприкасается друг с другом на поверхности раздела, которая представляет собой исходную поверхность раздела между СН3-доменами антитела;

при этом поверхность раздела изменена для стимулирования формирования триспецифического или тетраспецифического антитела, где изменение отличается тем, что:

I) СН3-домен одной тяжелой цепи изменен

таким образом, чтобы на исходной поверхности раздела СН3-домена одной тяжелой цепи, которая соприкасается с исходной поверхностью раздела СН3-домена другой тяжелой цепи в три- или тетраспецифическом антителе,

аминокислотный остаток был заменен на аминокислотный остаток, который имеет большую по объему боковую цепь, создавая тем самым «выпуклость» на поверхности раздела СН3-домена одной тяжелой цепи, которая может помещаться в «полость» на поверхности раздела СН3-домена другой тяжелой цепи, и

II) СН3-домен другой тяжелой цепи изменен

таким образом, чтобы на исходной поверхности раздела второго СН3-домена, которая соприкасается с исходной поверхностью раздела первого СН3-домена в три- или тетраспецифическом антителе,

аминокислотный остаток был заменен на аминокислотный остаток, который имеет меньшую по объему боковую цепь, создавая тем самым «полость» на поверхности раздела второго СН3-домена, в которую может помещаться «выпуклость» на поверхности раздела первого СН3-домена.

Предпочтительно указанный аминокислотный остаток, который имеет большую по объему боковую цепь, выбирают из группы, включающей аргинин (R), фенилаланин (F), тирозин (Y), триптофан (W).

Предпочтительно указанный аминокислотный остаток, который имеет меньшую по объему боковую цепь, выбирают из группы, включающей аланин (А), серин (S), треонин (Т), валин (V).

Согласно одному из объектов изобретения оба СН3-домена дополнительно изменяют путем интродукции цистеина (С) в качестве аминокислоты в соответствующие положения каждого СН3-домена таким образом, чтобы мог образоваться дисульфидный мостик между обоими СН3-доменами.

В одном из предпочтительных вариантов осуществления изобретения триспецифическое или тетраспецифическое антитело содержит мутацию T366W в СН3-домене имеющей «выступ» цепи («knobs-цепь») и мутации T366S, L368A, Y407V в СН3-домене имеющей «впадину» цепи («hole-цепь»). Можно применять также дополнительный связывающий цепи дисульфидный мостик между СН3-доменами (Merchant A.M. и др.. Nature Biotech. 16, 1998, ее. 677-681), например, путем интродукции мутации Y349C в СН3-домен имеющей «выступ» цепи и мутации Е356С или мутации S354C в СН3-домен имеющей «впадину» цепи. Так, в другом предпочтительном варианте осуществления изобретения триспецифическое или тетраспецифическое антитело имеет мутации Y349C, T366W в одном из двух СН3-доменов и мутации Е356С, T366S, L368A, Y407V во втором из двух СН3-доменов или указанное триспецифическое или тетраспецифическое антитело имеет мутации Y349C, T366W в одном из двух СН3-доменов и мутации S354C, T366S, L368A, Y407V во втором из двух СН3-доменов (дополнительная мутация Y349C в одном из СН3-доменов и дополнительная мутация Е356С или S354C во втором СН3-домене образуют расположенный между цепями дисульфидный мостик) (нумерация во всех случаях соответствует нумерации EU по Кэботу). В альтернативном варианте или дополнительно можно применять также и другие технологии «knobs-in-Ьо1ез»-типа, описанные в ЕР 1870459А1. Предпочтительным примером мутаций для рассматриваемого триспецифического или тетраспецифического антитела являются мутации R409D; К370Е в СН3-домене имеющей «выпуклость» цепи и мутации D399K; Е357К в СН3-домене имеющей «впадину» цепи (нумерация во всех случаях соответствует нумерации EU по Кэботу).

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения триспецифическое или тетраспецифическое антитело содержит мутацию T366W в СН3-домене имеющей «выпуклость» цепи и мутации T366S, L368A, Y407V в СН3-домене имеющей «впадину» цепи и дополнительные мутации R409D; К370Е в СН3-домене имеющей «выпуклость» цепи и мутации D399K; Е357К в СН3-домене имеющей «впадину» цепи.

В следующем предпочтительном варианте осуществления изобретения триспецифическое или тетраспецифическое антитело содержит мутации Y349C, T366W в одном из двух СН3-доменов и мутации S354C, T366S, L368A, Y407V во втором из двух СН3-доменов или указанное триспецифическое или тетраспецифическое антитело содержит мутации Y349C, T366W в одном из двух СН3-доменов и мутации S354C, T366S, L368A, Y407V во втором из двух СН3-доменов и дополнительно содержит мутации R409D; К370Е в СН3-домене имеющей «выпуклость» цепи и мутации D399K; Е357К в СН3-домене имеющей «впадину» цепи.

Понятие «полноразмерное антитело» обозначает антитело, состоящее из двух тяжелых цепей антитела и двух легких цепей антитела (см. фиг.1). Тяжелая цепь полноразмерного антитела представляет собой полипептид, состоящий из расположенных в направлении от N-конца к С-концу вариабельного домена тяжелой цепи антитела (VH), константного домена 1 тяжелой цепи антитела (СН1), шарнирной области антитела (HR), константного домена 2 тяжелой цепи антитела (СН2), и константного домена 3 тяжелой цепи антитела (СН3), сокращенно обозначенных как VH-CH1-HR-CH2-CH3; и необязательно константного домена 4 тяжелой цепи антитела (СН4) в случае антитела подкласса IgE. Предпочтительно тяжелая цепь полноразмерного антитела представляет собой полипептид, состоящий из расположенных в направлении от N-конца к С-концу VH, СН1, HR, СН2 и СН3. Легкая цепь полноразмерного антитела представляет собой полипептид, состоящий из расположенных в направлении от N-конца к С-концу вариабельного домена легкой цепи антитела (VL) и константного домена легкой цепи антитела (CL), сокращенно обозначенных как VL-CL. Константный домен легкой цепи (CL) может относиться к к- (каппа) или К- (лямбда)-типу. Цепи полноразмерного антитела сцеплены друг с другом посредством межполипептидных дисульфидных связей между доменом CL и СН1-доменом (т.е. между легкой и тяжелой цепью) и между шарнирными областями тяжелых цепей полноразмерного антитела. Примерами типичных полноразмерных антител являются встречающиеся в естественных условиях антитела типа IgG (например, IgG 1 и IgG2), IgM, IgA, IgD и IgE. Полноразмерные антитела, предлагаемые в изобретении, могут происходить из одного вида, например, представлять собой человеческие антитела, или они могут представлять собой химерные или гуманизированные антитела. Полноразмерные антитела, предлагаемые в изобретении, содержат два антигенсвязывающих центра, каждый из которых образован парой VH и VL, которые оба специфически связываются с одним и тем же антигеном. С-концом тяжелой или легкой цепи полноразмерного антитела обозначают последнюю аминокислоту на С-конце рассматриваемой тяжелой или легкой цепи. В контексте настоящего изобретения понятие «пептид-коннектор» обозначает пептид, аминокислотные последовательности которого предпочтительно являются синтетическими. Такие пептиды-коннекторы, предлагаемые в изобретении, применяют для слияния антигенсвязывающих пептидов с С- или N-концом цепей полноразмерного и/или модифицированного полноразмерного антитела с образованием триспецифического или тетраспецифического антитела, предлагаемого в изобретении. Предпочтительно пептиды-коннекторы, указанные в подпункте в), представляют собой пептиды, аминокислотная последовательность которых состоит по меньшей мере из 5 аминокислот, предпочтительно состоит из 5 - 100, более предпочтительно из 10-50 аминокислот.В одном из вариантов осуществления изобретения пептид-коннектор представляет собой конструкцию (GxS)n или (GxS)nGm, где G обозначает глицин, S обозначает серии и (х=3, n=3, 4, 5 или 6, и m=0, 1, 2 или 3) или (х=4, n=2, 3, 4 или 5 и m=0, 1, 2 или 3), предпочтительно х=4 и n=2 или 3, более предпочтительно х=4, n=2. В одном из вариантов осуществления изобретения пептид-коннектор представляет собой конструкцию (G4S)2.

Понятие «антигенсвязывающий пептид» используют для обозначения одновалентного антигенсвязывающего фрагмента или производного полноразмерного антитела, включающего вариабельный домен тяжелой цепи антитела (VH) и/или вариабельный домен легкой цепи антитела (VL), или пару VH/VL, которые выведены из полноразмерного антитела или фрагментов антитела, таких как домен VH и/или домен VL, одноцепочечный Fv- (scFv-) фрагмент, или одноцепочечный Fab- (scFab-) фрагмент.Предпочтительно антигенсвязывающий пептид содержит по меньшей мере вариабельный домен тяжелой цепи антитела (VH) и вариабельный домен легкой цепи антитела (VL). В предпочтительном варианте осуществления изобретения такие антигенсвязывающие пептиды выбирают из группы, включающей домен VH, одноцепочечный Fv- (scFv-) фрагмент и одноцепочечный Fab- (scFab-) фрагмент, предпочтительно из группы, включающей одноцепочечный Fv- (scFv-) фрагмент и одноцепочечный Fab- (scFab-) фрагмент.

В контексте настоящего описания понятия «сайт связывания» или «антигенсвязывающий центр» обозначают область(и) молекулы антитела, с которой(ыми) фактически связывается лиганд (например, антиген или фрагмент антигена) и который выведен из антитела. Антигенсвязывающий центр включает вариабельные домены тяжелой цепи антитела (VH) и/или вариабельные домены легкой цепи антитела (VL), или пары VH/VL.

Антигенсвязывающие центры, обладающие способностью специфически связываться с требуемым антигеном, можно выводить из а) известных антител к антигену или б) новых антител или фрагментов антител, полученных de novo с помощью методов иммунизации с использованием, среди прочего, либо белка, либо нуклеиновой кислоты антигена или его фрагментов, или с помощью метода фагового дисплея.

Антигенсвязывающий центр антитела, предлагаемого в изобретении, может содержать шесть гипервариабельных участков (CDR), которые вносят различный вклад в аффинность сайта связывания с антигеном. Они представляют собой три вариабельных домена (CDR-участки) тяжелой цепи (CDRH1, CDRH2 и CDRH3) и три вариабельных домена (CDR-участки) легкой цепи (CDRL1, CDRL2 и CDRL3). Размер CDR и каркасных участков (FR) определяют путем сравнения с компилированной базой данных аминокислотных последовательностей, в которых такие участки были определены на основе вариабельности последовательностей. Под объем изобретения подпадают также функциональные антигенсвязывающие центры, содержащие меньшее количество CDR (т.е. такие, в которых специфичность связывания обеспечивается тремя, четырьмя или пятью CDR). Например, для связывания может оказаться достаточным неполный (т.е. включающий менее 6) набор CDR. В некоторых случаях может оказаться достаточным наличие VH- или VL-домена.

Специфичность антитела характеризует избирательное распознавание антителом конкретного эпитопа антигена. Например, встречающиеся в естественных условиях антитела являются моноспецифическими. Биспецифические антитела представляют собой антитела, которые обладают специфичностью связывания с двумя различными антигенами. Соответственно, триспецифические антитела представляют собой антитела, предлагаемые в изобретении, которые обладают специфичностью связывания с тремя различными антигенами. Тетраспецифические антитела, предлагаемые в изобретении, представляют собой антитела, предлагаемые в изобретении, которые обладают специфичностью связывания с четырьмя различными антигенами.

Когда антитела обладают более чем одной специфичностью, то распознаваемые эпитопы могут быть ассоциированы с одним антигеном или несколькими антигенами.

В контексте настоящего описания понятие «моноспецифическое» антитело обозначает антитело, которое имеет один или несколько сайтов связывания, каждый из которых связывается с одним и тем же эпитопом одного и того же антигена.

В контексте настоящего описания понятие «валентность» означает наличие определенного количества сайтов связывания в молекуле антитела. Например, встречающееся в естественных условиях антитело или полноразмерное антитело, предлагаемое в изобретении, имеет два сайта связывания и является двухвалентным. Таким образом, понятие «трехвалентный» означает наличие трех сайтов связывания в молекуле антитела. В контексте настоящего описания понятие «трехвалентное, триспецифическое» антитело обозначает антитело, которое имеет три антигенсвязывающих центра, каждый из которых связывается с отличным от других антигеном (или отличным от других эпитопом антигена). Антитела, предлагаемые в настоящем изобретении, имеют от трех до шести сайтов связывания, т.е. они являются трех-, четырех-, пяти- или шестивалентными (предпочтительно трех- или четырехвалентными) и являются три- или тетраспецифическими.

«scFv-фрагмент» или «одноцепочечный Fv-фрагмент» (см. фиг.26) представляет собой полипептид, состоящий из вариабельного домена тяжелой цепи антитела (VH), вариабельного домена легкой цепи антитела (VL) и одноцепочечного Fv-линкера, в котором указанные домены антитела и указанный одноцепочечный Fv-линкер расположены в направлении от N-концу к С-концу в одном из следующих порядков: а) VH-одноцепочечный Ру-линкер-УЬ, б) VL-одноцепочечный Ру-линкер-УН; предпочтительно а) VH-одноцепочечный Fv-mraKep-VL, и в котором указанный одноцепочечный Fv-линкер представляет собой полипептид, аминокислотная последовательность которого состоит по меньшей мере из 15 аминокислот, в одном из вариантов осуществления изобретения она состоит по меньшей мере из 20 аминокислот.Понятие «N-конец» обозначает последнюю аминокислоту на N-конце, понятие «С-конец» обозначает последнюю аминокислоту на С-конце.

Понятие «одноцепочечный Fv-линкер», используемое при описании одноцепочечного Fv-фрагмента, обозначает пептид, аминокислотные последовательности которого предпочтительно получены синтетическим путем. Такой одноцепочечный Fv-линкер представляет собой пептид, аминокислотная последовательность которого состоит по меньшей мере из 15 аминокислот, в одном из вариантов осуществления изобретения она состоит по меньшей мере из 20 аминокислот и предпочтительно она состоит из 15-30 аминокислот.В одном из вариантов осуществления изобретения одноцепочечный линкер представляет собой конструкцию (GxS)n, где G обозначает глицин, S обозначает серии, (х=3 и п=4, 5 или 6) или (х=4 и п=3, 4, 5 или 6), предпочтительно х=4, n=3, 4 или 5, более предпочтительно х=4, n=3 или 4. В одном из вариантов осуществления изобретения одноцепочечный Fv-линкер представляет собой конструкцию (648)3 или (048)4.

Кроме того, одноцепочечные Fv-фрагменты предпочтительно стабилизируют с помощью дисульфидных связей. Такую дополнительную дисульфидную стабилизацию одноцепочечных антител обеспечивают путем интродукции дисульфидной связи между вариабельными доменами одноцепочечных антител, она описана, например, в WO 94/029350, у Rajagopal V. и др., Prot. Engin. 10, 1997, ее. 1453-1459; Kobayashi H. и др.. Nuclear Medicine & Biology 25, 1998, ее. 387-393; и у Schmidt M. и др., Oncogene 18, 1999, ее. 1711 -1721.

В одном из вариантов стабилизированных с помощью дисульфидной связи одноцепочечных Fv-фрагментов дисульфидную связь между вариабельными доменами одноцепочечных Fv-фрагментов, которые содержатся в антителе, предлагаемом в изобретении, выбирают независимо для каждого одноцепочечного Fv-фрагмента из связей между:

I) положением 44 в вариабельном домене тяжелой цепи и положением 100 в вариабельном домене легкой цепи,

II) положением 105 в вариабельном домене тяжелой цепи и положением 43 в вариабельном домене легкой цепи, и

III) положением 101 в вариабельном домене тяжелой цепи и положением 100 в вариабельном домене легкой цепи.

В одном из вариантов осуществления изобретения дисульфидная связь между вариабельными доменами одноцепочечных Fv-фрагментов, содержащихся в антителе, предлагаемом в изобретении, находится между положением 44 в вариабельном домене тяжелой цепи и положением 100 в вариабельном домене легкой цепи.

«scFab-фрагмент» или «одноцепочечный Fab-фрагмент» (см. фиг.2а) представляет собой полипептид, состоящий из вариабельного домена тяжелой цепи антитела (VH), константного домена 1 антитела (СН1), вариабельного домена легкой цепи антитела (VL), константного домена легкой цепи антитела (CL) и линкера, где указанные домены антитела и указанный линкер расположены в направлении от N-конца к С-концу в одном из следующих порядков: a) VH-CHl-nHHKep-VL-CL, б) VL-CL-линкер-VН-СH, в) VH-CL-линкер-VL-CHl или г) VL-CH1-линкер-VH-CL; и где указанный линкер представляет собой полипептид, состоящий по меньшей мере из 30 аминокислот, предпочтительно из 32 - 50 аминокислот.Указанные одноцепочечные Fab-фрагменты, а именно, a) VH-CHl-nHHKep-VL-CL, б) VL-CL-линкер-VH-CHL, в) VН-СL-линкер-VL-СН1 и г) VL-CH1-линкер-VH-CL, стабилизируют с помощью встречающейся в естественных условиях дисульфидной связи, расположенной между CL-доменом и СН1-доменом. Понятие «N-конец» обозначает последнюю аминокислоту на N-конце, понятие «С-конец» обозначает последнюю аминокислоту на С-конце.

В контексте настоящего изобретения понятие «линкер» обозначает пептид, аминокислотная последовательность которого предпочтительно получена синтетическим путем. Такие пептиды применяют согласно изобретению для связывания a) VH-CH1 с VL-CL, б) VL-CL с VH-CH1, в) VH-CL с VL-CH1 или г) VL-CH1 с VH-CL с образованием следующих одноцепочечных Fab-фрагментов, предлагаемых в изобретении: а) VH-CH1-линкер-VL-CL, б) VL-CL-линкер-VH-СН1, в) VH-CL-линкер-VL-CHI или г) VL-CH1-линкер-VH-CL. Такой линкер, присутствующий в одноцепочечных Fab-фрагментах, представляет собой пептид, аминокислотная последовательность которого состоит по меньшей мере из 30 аминокислот, предпочтительно из 32-50 аминокислот.В одном из вариантов осуществления изобретения линкер представляет собой конструкцию (GxS)n, где G обозначает глицин, S обозначает серин, (х=3, n=8, 9 или 10 и m=О, 1, 2 или 3) или (х=4 и n=6, 7 или 8 и m=0, 1, 2 или 3), предпочтительно х=4, n=6 или 7 и m=0, 1, 2 или 3, более предпочтительно х=4, n=7 и m=2. В одном из вариантов осуществления изобретения линкер представляет собой (G4S)6G2.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения указанные домены антитела и указанный линкер в одноцепочечном Fab-фрагменте расположены в направлении от N-конца к С-концу в одном из следующих порядков:

а) VH-CH1-линкер-VL-CL или б) VL-CL-линкер-VH-CH1, более предпочтительно VL-CL-линкер-VH-CH1.

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения указанные домены антитела и указанный линкер в одноцепочечном Fab-фрагменте расположены в направлении от N-конца к С-концу в одном из следующих порядков:

a) VH-CL-линкер-VL-CHI или б) VL-CH1-линкер-VH-CL.

Необязательно в указанном одноцепочечном Fab-фрагменте в дополнение к присутствующей в естественных условиях дисульфидной связи между CL-доменом и СН1-доменом осуществляют дисульфидную стабилизацию вариабельного домена тяжелой цепи антитела (VH) и вариабельного домена легкой цепи антитела (VL) путем интродукции дисульфидной связи между следующими положениями:

I) положение 44 в вариабельном домене тяжелой цепи и положение 100 в вариабельном домене легкой цепи,

II) положение 105 в вариабельном домене тяжелой цепи и положение 43 в вариабельном домене легкой цепи, или

III) положение 100 в вариабельном домене тяжелой цепи и положение 100 в вариабельном домене легкой цепи (во всех случаях нумерация соответствует нумерации EU по Кэботу).

Указанную дополнительную дисульфидную стабилизацию одноцепочечных Fab-фрагментов обеспечивают путем интродукции дисульфидной связи между вариабельными доменами VH и VL одноцепочечных Fab-фрагментов. Методы интродукции не встречающихся в естественных условиях дисульфидных мостиков с целью стабилизации одноцепочечного Fv-фрагмента описаны, например, в WO 94/029350, у Rajagopal и др., Prot. Engin. 10, 1997, ее. 1453-1459; Kobayashi и др.. Nuclear Medicine & Biology 25, 1998, ее. 387-393; и у Schmidt и др., Oncogene 18, 1999, ее. 1711-1721. В одном из вариантов осуществления изобретения необязательная дисульфидная связь между вариабельными доменами одноцепочечных Fab-фрагментов, содержащихся в антителе, предлагаемом в изобретении, находится между положением 44 вариабельного домена тяжелой цепи и положением 100 вариабельного домена легкой цепи. В одном из вариантов осуществления изобретения необязательная дисульфидная связь между вариабельными доменами одноцепочечных Fab-фрагментов, содержащихся в антителе, предлагаемом в изобретении, находится между положением 105 вариабельного домена тяжелой цепи и положением 43 вариабельного домена легкой цепи (во всех случаях нумерация соответствует нумерации EU по Кэботу).

В одном из вариантов осуществления изобретения предпочтительными являются одноцепочечные Fab-фрагменты без указанной необязательной дисульфидной стабилизации между вариабельными доменами VH и VL одноцепочечных Fab-фрагментов.

Полноразмерные антитела, предлагаемые в изобретении, содержат константные области иммуноглобулина из одного или нескольких классов иммуноглобулинов. Классы иммуноглобулинов включают изотипы IgG, IgM, IgA, IgD и IgE, а в случае IgG и IgA, также их подтипы. В предпочтительном варианте осуществления изобретения полноразмерное антитело, предлагаемое в изобретении, имеет структуру константного домена, которая соответствует структуре антитела IgG-типа.

В контексте настоящего описания понятия «моноклональное антитело» или «композиция моноклонального антитела» относятся к препарату молекул антител одинакового аминокислотного состава.

Понятие «химерное антитело» относится к антителу, содержащему вариабельную область, т.е. связывающую область, полученную из одного и того источника или из одних и тех же видов, и по меньшей мере часть константной области, полученную из другого источника или других видов, и его, как правило, получают с использованием методов рекомбинантой ДНК. Предпочтительными являются химерные антитела, которые содержат мышиную вариабельную область и человеческую константную область. Другими предпочтительными формами «химерных антител», подпадающих под объем настоящего изобретения, являются антитела, константная область которых модифицирована или изменена по сравнению с исходным антителом с целью получения свойств, предлагаемых в изобретении, прежде всего касательно связывания Clq и/или связывания Fc-рецептора (FcR). Такие химерные антитела обозначают также как «антитела переключенного класса». Химерные антитела являются продуктом экспрессии генов иммуноглобулинов, содержащих сегменты ДНК, которые кодируют вариабельные области иммуноглобулинов, и сегменты ДНК, которые кодируют константные области иммуноглобулинов. Методы получения химерных антител включают обычные методы рекомбинантной ДНК и генной трансфекции, которые хорошо известны в данной области (см., например, Morrison S.L. и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81,1984, ее. 6851-6855; US 5202238 и US 5204244).

Понятие «гуманизированное антитело» относится к антителам, в которых каркасные или «гипервариабельные участки» (CDR) модифицированы так, что они содержат CDR иммуноглобулина другой специфичности по сравнению со специфичностью родительского иммуноглобулина. В предпочтительном варианте осуществления изобретения для получения «гуманизированного антитела» мышиный CDR трансплантируют в каркасный участок человеческого антитела (см., например, Riechmann L. и др.. Nature 332, 1988, ее. 323-327; и Neuberger M.S. и др.. Nature 314, 1985, ее. 268-270). Другими формами «гуманизированных антител», подпадающих под объем настоящего изобретения, являются антитела, константная область которых дополнительно модифицирована или изменена по сравнению с исходным антителом с целью получения свойств, предлагаемых в изобретении, прежде всего касательно связывания Clq и/или связывания Fc-рецептора (FcR).

Понятие «человеческое антитело» в контексте настоящего описания относится к антителам, вариабельные и константные области которых выведены из последовательностей иммуноглобулина человеческой зародышей линии. Человеческие антитела хорошо известны в данной области (van Dijk M.A. и van de Winkel J.G., Curr. Opin. Chem. Biol. 5, 2001, ее. 368-374). Человеческие антитела можно получать также в трансгенных животных (например, мышах), которые в результате иммунизации могут продуцировать полный спектр или определенную часть человеческих антител при отсутствии производства эндогенного иммуноглобулина. Перенос набора генов иммуноглобулинов человеческой зародышевой линии в такую мутантную мышиную зародышевую линию должен приводить к производству человеческих антител после антигенной стимуляции (см., например, Jakobovits А., и др., Ргос.Natl. Acad. Sci. USA 90, 1993, ее. 2551-2555; Jakobovits А. и др.. Nature 362, 1993, ее. 255-258; Bruggemann M. и др.. Year Immunol. 7, 1993, ее. 33-40). Человеческие антитела можно получать также с помощью фаговых дисплейных библиотек (Hoogenboom H.R. и Winter, G., J. Mol. Biol. 227, 1992, ее. 381-388; Marks J.D. и др., J. Mol. Biol. 222, 1991, ее. 581-597). Для получения человеческих моноклональных антител можно использовать также методы, разработанные Cole с соавторами и Воегпег с соавторами (Cole и др.. Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, под ред. Alan R. Liss, 1985, с.77; и Воеrner Р., и др., J. Immunol. 147, 1991, ее. 86-95). Как уже было отмечено для химерных и гуманизированных антител, предлагаемых в изобретении, понятие «человеческое антитело» включает также такие антитела, константная область которых модифицирована с целью получения свойств, предлагаемых в изобретении, прежде всего касательно связывания C1q и/или связывания FcR, например, путем «переключения класса», т.е. замены или мутации Fc-областей (например, IgG1 на IgG4 и/или IgGl/IgG4-мутация).

Понятие «рекомбинантное человеческое антитело» в контексте настоящего описания относится ко всем человеческим антителам, которые получают, экспрессируют, создают или выделяют с помощью методов рекомбинации, например, к антителам, выделенным из клетки-хозяина, такой как NSO- или СНО-клетка, или из животного (например, мыши), которое является трансгенным из-за присутствия человеческих генов иммуноглобулинов или антител, экспрессируемых с использованием рекомбинантного экспрессионного вектора, которым трансфектирована клетка-хозяин. Такие рекомбинантные человеческие антитела имеют вариабельную и константную области, которые находятся в преобразованной форме. Рекомбинантные человеческие антитела, предлагаемые в изобретении, подвергают соматической гипермутации in vivo. Таким образом, аминокислотные последовательности VH- и VL-областей рекомбинантных антител представляют собой последовательности, которые, хотя и выведены из последовательностей VH и VL человеческой зародышевой линии и родственных им линий, могут не существовать в естественных условиях в спектре зародышевой линии человеческих антител in vivo.

Понятие «вариабельная область (домен)» (вариабельный домен легкой цепи (VL), вариабельный домен тяжелой цепи (VH)) в контексте настоящего описания относится к областям каждой из пары легких и тяжелой цепей, которые участвуют непосредственно в связывании антитела с антигеном. Домены вариабельных человеческих легких и тяжелых цепей имеют одинаковую общую структуру, и каждый домен содержит четыре каркасных участка (FR), последовательности которых являются весьма консервативными, связанных тремя «гипервариабельными участками» (или определяющими комплементарность участками, CDR). Каркасные участки адоптированы к β-складчатой конформации, а CDR могут образовывать петли, соединяющие β-складчатую структуру. CDR в каждой цепи сохраняют их трехмерную структуру с помощью каркасных участков и образуют вместе с CDR из других цепей антигенсвязывающий центр. CDR3-участки тяжелой и легкой цепей антитела играют особенно важную роль в специфичности связывания/аффинности антител, предлагаемых в изобретении, и поэтому являются дополнительным объектом изобретения.

Понятия «гипервариабельный участок» или «антигенсвязывающий центр антитела» в контексте настоящего описания относятся к аминокислотным остаткам антитела, которые ответственны за связывания антигена. Гипервариабельный участок содержит аминокислотные остатки из «определяющих комплементарность участков» или «CDR». «Каркасные» или «РК»-участки представляют собой участки вариабельной области, отличные от указанных в настоящем описании остатков гипервариабельного участка. Таким образом, легкие и тяжелые цепи антитела содержат в направлении от N- к С-концу участки FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 и FR4. CDR каждой цепи разделены аминокислотами указанного каркасного участка. В частности, CDR3 тяжелой цепи представляют собой участок, который вносит наибольший вклад в связывание с антигеном. CDR- и FR-участки определяют с помощью стандартной номенклатуры Кэбота (Kabat и др.. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5-изд., изд-во Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991).

В контексте настоящего описания понятия «связывание»/«который специфически связывается»/«специфическое связывание» относятся к связыванию антитела с эпитопом антигена, что определяют путем анализа in vitro, предпочтительно с помощью анализа резонанса поверхностного плазмона (BIAcore-анализ, фирма GE-Healthcare, Уппсала, Швеция) с использованием очищенного антигена дикого типа. Аффинность связывания характеризуют с помощью понятий ka (константа скорости ассоциации антитела при формировании комплекса антитело/антиген), kd (константа диссоциации) и К_D(k_D/ka). В одном из вариантов осуществления изобретения наличие связывания или специфического связывания означает, что аффинность связывания (К_D) составляет 10 молей/л или менее, предпочтительно от 10 до 10 молей/л. Так, три- или тетраспецифическое антитело, предлагаемое в изобретении, предпочтительно специфически связывается с каждым антигеном, в отношении которого оно обладает специфичностью, что характеризуется аффинностью связывания (К_D), составляющей 10^-8 молей/л или менее, предпочтительно от 10^-9 до 10^-13 молей/л.

Связывание антитела с FcyRIII можно оценивать с помощью BIAcore-анализа (фирма GE-Healthcare, Уппсала, Швеция). Аффинность связывания определяют с помощью понятий ka (константа скорости ассоциации антитела при формировании комплекса антитело/антиген), kd (константа диссоциации) и k_D(k_D/ka).

Понятие «эпитоп» включает любую полипептидную детерминанту, обладающую способностью специфически связываться с антителом. В некоторых вариантах осуществления изобретения эпитопная детерминанта включает химически активные поверхностные группы молекул, такие как аминокислоты, боковые цепи Сахаров, фосфорил или сульфонил, и в некоторых вариантах осуществления изобретения они могут иметь специфические трехмерные структурные характеристики и/или специфические характеристики заряда. Эпитоп представляет собой область антигена, которая связывается антителом.

В некоторых вариантах: осуществления изобретения считается, что антитело специфически связывается с антигеном, когда оно преимущественно распознает свой антиген-мишень в сложной смеси белков и/или макромолекул.

В другом варианте осуществления изобретения три- или тетраспецифическое антитело, предлагаемое в изобретении, отличается тем, что указанное полноразмерное антитело относится к подклассу человеческого IgG1 или подклассу человеческого IgG1, имеющему мутации L234A и L235A.

В другом варианте осуществления изобретения три- или тетраспецифическое антитело, предлагаемое в изобретении, отличается тем, что указанное полноразмерное антитело относится к подклассу человеческого IgG2.

В другом варианте осуществления изобретения три- или тетраспецифическое антитело, предлагаемое в изобретении, отличается тем, что указанное полноразмерное антитело относится к подклассу человеческого IgG3.

В другом варианте осуществления изобретения три- или тетраспецифическое антитело, предлагаемое в изобретении, отличается тем, что указанное полноразмерное антитело относится к подклассу человеческого IgG4 или подклассу человеческого IgG4, имеющему дополнительную мутацию S228P.

Предпочтительно три- или тетраспецифическое антитело, предлагаемое в изобретении, отличается тем, что указанное полноразмерное антитело относится к подклассу человеческого IgG1, подклассу человеческого IgG4, имеющему дополнительную мутацию S228P.

При создании настоящего изобретения было установлено, что три- или тетраспецифические антитела, предлагаемые в изобретении, обладают улучшенными характеристиками, такими как биологическая или фармакологическая активность, фармакокинетические свойства или токсичность. Их можно применять, например, для лечения заболеваний, таких как рак.

В контексте настоящего описания понятие «константная область» обозначает совокупность доменов антитела, отличных от вариабельной области. Константная область не принимает непосредственного участия в связывании с антигеном, но она обладает различными эффекторными функциями. Антитела подразделяют в зависимости от аминокислотной последовательности константной области их тяжелых цепей на классы: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, a некоторые из них можно дополнительно подразделять на подклассы, такие как IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4, IgAl и IgA2. Константные области тяжелой цепи, соответствующие различным классам антител, обозначают символами α, β, ε, γ и µ соответственно. Константные области легкой цепи (CL), которые могут присутствовать во всех пяти классах антител, обозначают символами к (каппа) и λ (лямбда).

В контексте настоящего описания понятие «константная область, выведенная из человеческого источника» обозначает константную область тяжелой цепи человеческого антитела подкласса IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 и/или константную область легкой каппа- или лямбда-цепи. Такие константные области хорошо известны в данной области, и они описаны, например, у Kabat Е.А. (см., например, Johnson, G. и Wu, T.T., Nucleic Acids Res. 28, 2000, ее. 214-218; Kabat Е.А. и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72, 1975, ее. 2785-2788).

В то время как антитела подкласса IgG4 обладают небольшой способностью к связыванию с Fc-рецептором (FcyRIIIa), антитела других подклассов IgG характеризуются выраженной способностью к связыванию. Однако изменение таких остатков, как Pro238, Asp265, Asp270, Asn297 (утрата углевода Fc), Рrо329, Leu234, Leu235, Gly236, Gly237, Ile253, Ser254, Lys288, Thr307, Gln311, Asn434 и His435, также приводит к снижению способность к связыванию с Fc-рецептором (Shields R.L. и др., J. Biol. Chem. 276, 2001, ее. 6591-6604; Lund J. и др., FASEB J. 9, 1995, ее. 115-119; Morgan А. и др., Immunology 86, 1995, ее. 319-324; ЕР 0307434).

В одном из вариантов осуществления изобретения антитело, предлагаемое в изобретении, обладает более низкой способностью к связыванию с FcR по сравнению с антителом подкласса IgGl. В этом варианте полноразмерное родительское антитело с точки зрения связывания с FcR относится к подклассу IgG4 или подклассу IgGl или IgG2, имеющему мутацию в S228, L234, L235 и/или D265, и/или содержит мутацию PVA236. В одном из вариантов осуществления изобретения мутации в полноразмерном родительском антителе представляют собой S228P, L234A, L235A, L235E и/или PVA236. В другом варианте осуществления изобретения мутации в полноразмерном родительском антителе представляют собой: S228P в случае IgG4 и L234A и L235A в случае IgGl.

Константная область антитела принимает непосредственное участие в ADCC (антитело-обусловленная клеточнозависимая цитотоксичность) и CDC (комплементзависимая цитотоксичность). Активация комплемента (CDC) инициируется в результате связывания фактора Clq системы комплемента с константной областью антител большинства из подклассов IgG. Связывание Clq с антителом происходит в результате определенных белок-белковых взаимодействий в так называемом сайте связывания. Такие сайты связывания константных областей известны в данной области, и они описаны, например, у Lukas T.J. и др., J. Immunol. 127, 1981, ее. 2555-2560; Bunkhouse R. и Cobra J.J„ Mol. Immunol. 16, 1979, ее. 907-917; Burton D.R. и др.. Nature 288, 1980, ее. 338-344; Thomason J.E. и др., Mol. Immunol. 37, 2000, ее. 995-1004; Idiocies E.E. и др., J. Immunol. 164, 2000, ее. 4178-4184; Hearer M. и др., J. Virol. 75, 2001, ее. 12161-12168; Morgan А. и др.. Immunology 86, 1995, ее. 319-324; и в ЕР 0307434. Такими сайтами связывания константной области являются, например, сайты, в которых присутствуют аминокислоты L234, L235, D270, N297, Е318, К320, К322, Р331 и Р329 (нумерация согласно нумерации EU по Кэботу).

Понятие «антитело-обусловленная клеточнозависимая цитотоксичность (ADCC)» относится к лизису человеческих клеток-мишеней, опосредованному антителом, предлагаемым в изобретении, в присутствии эффекторных клеток. Уровень ADCC оценивают предпочтительно путем обработки препарата экспрессирующих антиген клеток антителом, предлагаемым в изобретении, в присутствии эффекторных клеток, таких как свежевыделенные мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) или очищенные эффекторные клетки из лейкоцитарных пленок, типа моноцитов или естественных клеток-киллеров (NK) или постоянно выращиваемой линии NK-клеток.

Понятие «комплементзависимая цитотоксичность (CDC)» обозначает процесс, инициируемый связыванием фактора Clq системы комплемента с Fc-фрагментом большинства подклассов антител IgG-изотипа. Связывание Clq с антителом происходит в результате определенных белок-белковых взаимодействий в так называемом сайте связывания. Такие сайты связывания Fc-фрагмента известны в данной области (см. выше). Такие сайты связывания Fc-фрагмента представляют собой сайты, в которых присутствуют аминокислоты L234, L235, D270, N297, Е318, К320, К322, Р331 и Р329 (нумерация согласно нумерации EU по Кэботу). Антитела подклассов IgG1, IgG2 и IgG3, как правило, обладают способностью к активации комплемента, включая связывание с C1q и С3, в то время как IgG4 не активирует систему комплемента и не связывается с С1g и/или С3.

Клеточно-опосредованные эффекторные функции моноклональных антител можно усиливать путем конструирования его олигосахаридного компонента, как это описано у Umana Р. и др.. Nature Biotechnol. 17, 1999, ее. 176-180 и в US 6602684. Антитела IgG1-типа, которые являются наиболее широко применяемыми терапевтическими антителами, представляют собой гликопротеины, которые имеют консервативный N-сцепленный сайт гликозилирования на Asn297 в каждом из доменов СН2. Два сложных биантенных олигосахарида, присоединенных к Asn297, расположены между СН2-доменами, формируя протяженные области контакта с полипептидным каркасом, и их присутствие является важным для опосредуемых антителом эффекторных функций, таких как антитело-обусловленная клеточнозависимая цитотоксичность (ADCC) (Lifely M. R. и др., Glycobiology 5, 1995, ее. 813-822; Jefferis R. и др., Immunol. Rev. 163, 1998, со. 59-76; Wright А. и Morrison S.L., Trends Biotechnol. 15, 1997, ее. 26-32). В статье Umana P. и др.. Nature Biotechnol. 17, 1999, ее. 176-180 и в WO 99/54342 продемонстрировано, что сверхэкспрессия в клетках яичника китайского хомячка (СНО) p(l,4)-N-ацетилглюкозаминилтрансферазы III («GnTIII»), которая представляет собой гликозилтрансферазу, катализирующую образование бисекционных олигосахаридов, существенно повышает ADCC-активность антител in vitro. Изменения состава присоединенного к Asn297 углевода или его элиминация оказывает влияние также на связывание с FcyR и Clq (Umana P. и др.. Nature Biotechnol. 17, 1999, ее. 176-180; Davies J. и др., Biotechnol. Bioeng. 74, 2001, ее. 288-294; Mimura Y. и др., J. Biol. Chem. 276, 2001, ее. 45539-45547; Radaev S. и др., J. Biol. Chem. 276, 2001, ее. 16478-16483; Shields R.L. и др., J. Biol. Chem. 276, 2001, ее. 6591-6604; Shields R.L. и др., J. Biol. Chem. 277, 2002, ее. 26733-26740; Simmons L.C. и др., J. Immunol. Methods 263, 2002, ее. 133-147).

Методы усиления клеточно-опосредуемых эффекторных функций моноклональных антител описаны, например, в WO 2005/018572, WO 2006/116260, WO 2006/114700, WO 2004/065540, WO 2005/011735, WO 2005/027966, WO 1997/028267, US 2006/0134709, US 2005/0054048, US 2005/0152894, WO 2003/035835, WO 2000/061739.

В одном из предпочтительных вариантов осуществления изобретения три-или тетраспецифическое антитело является гликозилированным (если оно содержит Fc-фрагмент антитела подкласса IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4, предпочтительно подкласса IgG1 или IgG3) с сахарной цепью на Asn297, при этом количество фукозных остатков в указанной сахарной цепи составляет 65% или менее (нумерация согласно Кэботу). В другом варианте осуществления изобретения количество фукозных остатков в указанной сахарной цепи составляет от 5 до 65%, предпочтительно от 20 до 40%. В контексте настоящего описания «Asn297» обозначает аминокислоту аспарагин, присутствующую примерно в положении 297 в Fc-фрагменте. Вследствие минорных вариаций последовательности антител Asn297 может располагаться также на несколько аминокислот (как правило, не более чем на±3 аминокислоты) дальше или ближе в направлении к С-концу по отношению к положению 297, т.е. между положениями 294 и 300. В одном из вариантов осуществления изобретения предлагаемое в изобретении гликозилированное антитело изотипа IgG представляет собой человеческое антитело подкласса IgG1, человеческое антитело подкласса IgG1, имеющее мутации L234A и L235A, или антитело подкласса IgG3. В другом варианте осуществления изобретения количество остатков N-гликолилнейраминовой кислоты (NGNA) составляет 1% или менее и/или количество остатков N-концевой альфа-1,3-галактозы составляет 1% или менее в указанной сахарной цепи. Предпочтительно сахарная цепь обладает характеристиками N-сцепленных гликанов, присоединенных к Asn297 антитела, которое рекомбинантно экспрессируется в СНО-клетке.

Выражение «сахарная цепь обладает характеристиками N-сцепленных гликанов, присоединенных к Asn297 антитела, которое рекомбинантно экспрессируется в СНО-клетке» означает, что сахарная цепь на Asn297 полноразмерного родительского антитела, предлагаемого в изобретении, имеет такую же структуру и последовательность сахарных остатков за исключением фукозного остатка, что и антитело, экспрессируемое в немодифицированных СНО-клетках, например, как описано в WO 2006/103100.

В контексте настоящего описания понятие «NGNA» обозначает сахарный остаток N-гликолилнейраминовой кислоты.

Гликозилирование человеческого IgG1 или IgG3 имеет место на Asn297 в виде гликозилирования, осуществляемого с помощью сложного биантенного олигосахарида с коровым фукозилированием, на концах которого располагаются вплоть до 2 остатков Gal. Константные области человеческих тяжелых цепей подклассов IgG1 или IgG3 подробно описаны у Kabat E.A. и др.. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5-е изд., изд-во Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991 и у Briiggemann M. и др., J. Exp.Med. 166, 1987, ее. 1351-1361; Love T.W. и др.. Methods Enzymol. 178, 1989, ее. 515-527. Эти структуры обозначают как гликановые остатки GO, Gl (a 1,6 или а 1,3) или G2 в зависимости от количества концевых остатков Gal (Raju T.S., BioProcess Int. 1, 2003, ее. 44-53). СНО-тип гликозилирования Fc-фрагментов антитела описан, например, у Routier F.H., Glycoconjugate J. 14, 1997, ее. 201-207. Антитела, которые рекомбинантно экспрессируются в СНО-клетках-хозяевах с немодифицированной схемой гликозилирования, как правило, являются фукозилированными на Asn297 по меньшей мере на 85%, Модифицированные олигосахариды в полноразмерном родительском антителе могут быть гибридными или сложными. Предпочтительно бисекционные восстановленные/нефукозилированные олигосахариды являются гибридными. В другом варианте осуществления изобретения бисекционные восстановленные/нефукозилированные олигосахариды являются комплексными.

В контексте изобретения понятие «количество фукозы» означает количество указанного сахара в сахарной цепи на Asn297 по отношению к сумме всех гликоструктур, присоединенных к Asn 297 (например, комплексных, гибридных структур и структур с высоким содержанием маннозы), которое измеряют с помощью MALDI-TOF-масс-спектрометрии и рассчитывают в виде среднего значения. Относительное количество фукозы выражают в виде процента содержащих фукозу структур относительно всех гликоструктур, идентифицированных с помощью MALDI-TOF в обработанном N-гликозидазой F образце (например, комплексных, гибридных структур и структур с высоким содержанием маннозы соответственно).

Антитела, предлагаемые в изобретении, получают методами рекомбинации. Таким образом, один из объектов настоящего изобретения относится к нуклеиновой кислоте, которая кодирует антитело, предлагаемое в изобретении, а другой объект относится к клетке, содержащей указанную нуклеиновую кислоту, которая кодирует антитело, предлагаемое в изобретении. Методы рекомбинантного получения хорошо известны в данной области, и они включают осуществление экспрессии белка в прокариотических и эукариотических клетках и последующее выделение антитела и, как правило, очистку до достижения фармацевтически приемлемой степени чистоты. Для осуществления экспрессии указанных выше антител в клетке-хозяине нуклеиновые кислоты, кодирующие соответствующие модифицированные легкую и тяжелую цепи, встраивают в экспрессионные векторы с помощью стандартных методов. Экспрессию осуществляют в соответствующих прокариотических или эукариотических клетках-хозяевах, таких как СНО-клетки, NSO-клетки, 8Р2/0-клетки, НЕК293-клетки, COS-клетки, РЕК. С6-клетки, клетки дрожжей или клетки E.coli, и антитело выделяют из клеток (из супернатанта или клеток после лизиса). Общие методы рекомбинантного получения антител хорошо известны из существующего уровня техники, и они описаны, например, в обзорных статьях Makrides S.C., Protein Expr. Purif. 17, 1999, ее. 183-202; Geisse S. и др.. Protein Expr. Purif. 8, 1996, ее. 271-282; Kaufman R.J., Mol. Biotechnol. 16, 2000, ее. 151-161; Werner R.G., Drug Res. 48, 1998,ее.870-880.

Три- или тетраспецифические антитела, предлагаемые в изобретении, можно отделять от культуральной среды с помощью общепринятых методов очисти иммуноглобулинов, таких, например, как, хроматография на белок А-сефарозе, хроматография на гидроксилапатите, гель-электрофорез, диализ или аффинная хроматография. ДНК и РНК, которые кодируют моноклональные антитела, можно легко выделять и секвенировать с помощью общепринятых методов. Клетки гибридом могут служить источником таких ДНК и РНК. После выделения ДНК можно встраивать в экспрессионные векторы, которыми затем трансфектируют клетки-хозяева, такие как НЕК293-клетки, СНО-клетки или клетки миеломы, которые в ином случае не могут продуцировать белок иммуноглобулина, для обеспечения синтеза рекомбинантных моноклональных антител в клетках-хозяевах.

Варианты (или мутанты) аминокислотной последовательности три- или тетраспецифического антитела создают путем внесения соответствующих нуклеотидных изменений в ДНК антитела или с помощью нуклеотидного синтеза. Однако такие модификации можно осуществлять лишь в очень ограниченном масштабе, например, как указано выше. Например, модификации не должны приводить к изменению указанных выше характеристик антитела, таких как изотип IgG и способность связываться с антигеном, но они могут повышать выход рекомбинантного продукта, стабильность белка или облегчать процесс очистки.

В контексте настоящего описания понятие «клетка-хозяин» относится к клеточной системе любого типа, которую можно сконструировать так, чтобы она продуцировала антитела, предлагаемые в настоящем изобретении. В одном из вариантов осуществления изобретения в качестве клеток-хозяев применяют НЕК293-клетки и СНО-клетки. В контексте настоящего описания понятия «клетка», «клеточная линия» и «клеточная культура» используются взаимозаменяемо, и все определения, в которые входят эти понятия, включают потомство. Так, выражения «трансформанты» и «трансформированные клетки» включают, прежде всего, первичные рассматриваемые клетки, а также культуры, выведенные из них, независимо от количества переносов. Следует также иметь в виду, что все потомство может не быть строго идентичным касательно содержания ДНК вследствие случайных или неумышленных мутаций. Эти понятия включают варианты потомства, которые обладают такой же функцией или биологической активностью, что и отобранная путем скрининга исходная трансформированная клетка. В тех случаях, когда следует применять другие обозначения, это должно быть очевидно из контекста.

Экспрессия в NSO-клетках описана, например, у Barnes L.M. и др., Cytotechnology 32, 2000, ее. 109-123; Barnes L.M. и др., Biotech. Bioeng. 73, 2001, ее. 261-270. Кратковременная экспрессия описана, например, у Durocher Y. и др., Nucl. Acids. Res. 30, 2002, с.Е9. Клонирование вариабельных доменов описано у Orlandi R. и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 1989, ее. 3833-3837; Carter P. и др., Ргос.Natl. Acad. Sci. USA 89, 1992, ее. 4285-4289; и Norderhaug L. и др., J. Immunol. Methods 204, 1997, ее. 77-87. Предпочтительная система для кратковременной экспрессии (НЕК293) описана Schlaeger E.-J. и Christensen К. в Cytotechnology 30, 1999, ее. 71-83 и у Schlaeger E.-J., J. Immunol. Methods 194, 1996,ее. 191-199.

Контролирующие последовательности, которые можно применять для прокариотических организмов, представляют собой, например, промоторную последовательность, необязательно операторную последовательность и сайт связывания рибосом. Известно, что для эукариотических клеток применяют промоторы, энхансеры и сигналы полиаденилирования.

Нуклеиновая кислота «функционально связана», когда она находится в функциональной связи с другой нуклеотидной последовательностью. Например, ДНК предпоследовательности или лидерной секреторной последовательности функционально связана с ДНК полипептида, если при ее экспрессии образуется предбелок, который участвует в секреции полипептида; промотор или энхансер функционально связан с кодирующей последовательностью, если он оказывает воздействие на транскрипцию последовательности; или сайт связывания рибосом функционально связан с кодирующей последовательностью, если он расположен так, что облегчает трансляцию. Как правило, понятие «функционально связаны» означает, что последовательности ДНК, будучи связаны, являются смежными, а в случае лидерной секреторной последовательности, являются смежными и находятся в рамке считывания. Однако для энхансеров не является необходимым, чтобы они были смежными. Связывание осуществляют путем лидирования в соответствующих сайтах рестрикции. Если такие сайты не существуют, то в соответствии с принятой практикой применяют синтетические олигонуклеотидные адаптеры или линкеры.

Очистку антител для удаления других клеточных компонентов или других примесей, например, других клеточных нуклеиновых кислот или белков, осуществляют с помощью стандартных методов, включая обработку щелочью/ДСН, CsCl-бэндинг, хроматографию на колонках, электрофорез в агарозном геле и другие методы, хорошо известные в данной области (см. в Current Protocols in Molecular Biology, под ред. Ausubel F. и др., изд-во Greene Publishing and Wiley Interscience, New York, 1987). Для очистки белков разработаны и нашли широкое распространение различные методы, такие как аффинная хроматография с использованием белков микроорганизмов (например, аффинная хроматография на белке А или белке G), ионообменная хроматография (например, катионообменная (с использованием карбоксиметиловых смол), анионообменная (с использованием аминоэтиловых смол) хроматография и хроматография со смешанной формой разделения), тиофильная адсорбция (например, с использованием бета-меркаптоэтанола и других SH-лигандов), хроматография на основе гидрофобного взаимодействия или адсорбционная хроматография ароматических соединений (например, с использованием фенил-сефарозы, аза-аренофильных смол или мета-аминофенилбороновой кислоты), металлхелатирующая аффинная хроматография (например, с использованием материала, обладающего аффинностью к Ni(II) и Cu(II)), гель-фильтрация и электрофоретические методы (такие как гель-электрофорез, капиллярный электрофорез) (Vijayalakshmi M.A., Appl. Biochem. Biotech. 75, 1998, ее. 93-102).

Одним из объектов изобретения является фармацевтическая композиция, которая содержит антитело, предлагаемое в изобретении. Другим объектом изобретения является применение антитела, предлагаемого в изобретении, для приготовления фармацевтической композиции. Следующим объектом изобретения является способ приготовления фармацевтической композиции, которая содержит антитело, предлагаемое в изобретении. Еще одним объектом настоящего изобретения является композиция, например, фармацевтическая композиция, которая содержит антитело, предлагаемое в настоящем изобретении, включенное в состав препаративной формы в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем.

Одним из вариантов осуществления изобретения является три- или тетраспецифическое антитело, предлагаемое в изобретении, которое предназначено для лечения рака.

Другим объектом изобретения является фармацевтическая композиция, предназначенная для лечения рака.

Следующим объектом изобретения является применение антитела, предлагаемого в изобретении, для приготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения рака.

Следующим объектом изобретения является способ лечения пациента, страдающего раком, который заключается в том, что вводят антитело, предлагаемое в изобретении, пациенту, нуждающемуся в таком лечении.

В контексте настоящего описания понятие «фармацевтический носитель» включает любой и все растворители, дисперсионные среды, покрытия, антибактериальные и противогрибковые агенты, придающие изотоничность и замедляющие абсорбцию агенты и т.п., которые являются физиологически совместимыми. Предпочтительно носитель можно применять для внутривенного, внутримышечного, подкожного, парентерального, спинального или эпидермального введения (например, путем инъекции или инфузии). Композицию, предлагаемую в настоящем изобретении, можно вводить с помощью различных методов, известных в данной области. Как должно быть очевидно специалисту в данной области, путь и/или форму введения можно варьировать в зависимости от требуемых результатов.

Для введения соединения, предлагаемого в изобретении, с помощью определенных путей введения может оказаться необходимым наносить на соединение покрытие из материала, препятствующего его инактивации, или осуществлять введение соединения совместно с таким материалом. Например, соединение можно вводить индивидууму в соответствующем носителе, например, в липосомах или в разбавителе. К фармацевтически приемлемым разбавителям относятся физиологический раствор и водные забуферивающие растворы. К фармацевтически приемлемым носителям относятся стерильные водные растворы или дисперсии и стерильные порошки для приготовления стерильных инъекционных растворов или дисперсий непосредственно перед введением. Применение таких сред и агентов для обладающих фармацевтической активностью субстанций известно в данной области.

В контексте настоящего описания понятия «парентеральное введение» и «введение парентеральным путем» означают пути введения, отличные от энтерального введения и местного применения, как правило, они относятся к введению путем инъекции и включают (но, не ограничиваясь только ими) внутривенную, внутримышечную, внутриартериальную, подоболочечную, внутрикапсульную, внутриглазную, внутрисердечную, внутрикожную, внутрибрюшинную, транстрахеальную, подкожную, субкутикулярную, внутрисуставную, субкапсулярную, субарахноидальную, интраспинальную, эпидуральную и интрастернальную инъекцию и инфузию.

В контексте настоящего описания понятие «рак» относится к пролиферативным заболеваниям, таким как лимфомы, лимфолейкозы, рак легкого, немелкоклеточный рак легкого (NSCL), альвеолярно-клеточный рак легкого, рак кости, рак поджелудочной железы, рак кожи, рак головы или шеи, кожная или внутриглазная меланома, рак матки, рак яичника, ректальный рак, рак анальной области, рак желудка, гастральный рак, рак ободочной кишки, рак молочной железы, карцинома фаллопиевых труб, карцинома эндометрия, карцинома шейки матки, карцинома влагалища, карцинома вульвы, болезнь Ходжкина, рак пищевода, рак тонкого кишечника, рак эндокринной системы, рак щитовидной железы, рак паращитовидной железы, рак надпочечников, саркома мягких тканей, рак мочеиспускательного канала, рак пениса, рак предстательной железы, рак мочевого пузыря, рак почки или мочеточника, почечно-клеточная карцинома, карцинома почечной лоханки, мезотелиома, печеночно-клеточный рак, билиарный рак, неоплазмы центральной нервной системы (ЦНС), опухоли позвоночника, глиома ствола головного мозга, мультиформная глиобластома, астроцитомы, шванномы, эпендимоны, медуллобластомы, менингиомы, плоскоклеточные карциномы, аденома гипофиза и саркома Юинга, включая рефракторные варианты любого из указанных выше видов рака и комбинации одного или нескольких видов рака.

Указанные композиции могут содержать также адъюванты, такие как консерванты, смачивающие агенты, эмульгаторы и диспергирующие агенты. Отсутствие микроорганизмов можно обеспечивать как с помощью процедур стерилизации (см. выше), так и путем включения различных антибактериальных и противогрибковых средств, таких, например, как парабен, хлорбутанол, фенол, сорбиновая кислота и т.п.Может оказаться целесообразным включать в композиции агенты для придания изотоничности, такие как сахара, хлорид натрия и т.п.Кроме того, можно пролонгировать абсорбцию инъекционной фармацевтической формы путем включения веществ, которые замедляют абсорбцию, таких как моностеарат алюминия и желатин.

Вне зависимости от выбранного пути введения соединения, предлагаемые в настоящем изобретении, которые можно применять в пригодной гидратированной форме, и/или фармацевтические композиции, предлагаемые в настоящем изобретении, приготавливают в виде фармацевтически приемлемых форм лекарственного средства с помощью общепринятых методов, известных специалистам в данной области.

Фактические уровни доз действующих веществ в фармацевтических композициях, предлагаемых в настоящем изобретении, можно варьировать для получения количества действующего вещества, которое является эффективным для достижения требуемого терапевтического ответа у конкретного пациента при использовании конкретной композиции и пути введения, но не является токсичным для пациента. Выбранный уровень доз должен зависеть от различных фармакокинетических факторов, включая активность конкретных применяемых композиций, предлагаемых в настоящем изобретении, путь введения, время введения, скорость экскреции конкретного применяемого соединения, продолжительность лечения, другие лекарственные средства, соединения и/или материалы, которые используют в сочетании с конкретными применяемыми композициями, возраст, пол, вес, состояние, общее состояние здоровья и предшествующая история болезни пациента, подлежащего лечению, и другие подобные факторы, хорошо известные в области медицины.

Композиция должна быть стерильной и текучей в той степени, чтобы композицию можно было вводить с помощью шприца. Помимо воды предпочтительным носителем является изотонический забуференный физиологический раствор.

Соответствующую текучесть можно поддерживать, например, путем использования покрытия, такого как лецитин, путем поддержания требуемого размера частиц в случае дисперсии и путем применения поверхностно-активных веществ. Во многих случаях предпочтительно включать в композицию агенты для придания изотоничности, например, сахара, многоатомные спирты, такие как маннит или сорбит, и хлорид натрия.

В контексте настоящего описания понятие «трансформация» относится к процессу переноса векторов/нуклеиновой кислоты в клетку-хозяина. Если в качестве клеток-хозяев применяют клетки, оболочки которых не представляют собой труднопреодолимые барьеры, то трансфекцию осуществляют, например, методом, основанным на осаждении фосфатом кальция, описанного у Graham и Van der Eh, Virology 52, 1978, с.546 и далее. Однако можно применять также и другие методы интродукции ДНК в клетки, такие как инъекция в ядра или слияние протопластов. Если используют прокариотические клетки или клетки, имеющие значительные клеточные оболочки, то в качестве метода трансфекции можно применять обработку кальцием с использованием хлорида кальция, описанную у Cohen F.N. и др., PNAS 69, 1972, с.7110 и далее.

В контексте настоящего описания понятие «экспрессия» относится к процессу, посредством которого осуществляется транскрипция нуклеиновой кислоты в мРНК, и/или к процессу, посредством которого транскрибированная мРНК (которую называют также транскриптом) впоследствии транслируется с образованием пептидов, полипептидов или белков. Транскрипты и кодируемые полипептиды в целом называют генным продуктом. Если полинуклеотид выводят из геномной ДНК, то экспрессия в эукариотической клетке может включать сплайсинг мРНК.

«Вектор» представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты, в частности самореплицирующуюся, которая переносит встроенную молекулу нуклеиновой кислоты в клетки-хозяева и/или между клетками-хозяевами. Понятие включает векторы, функция которых состоит, прежде всего, во встраивании ДНК или РНК в клетку (например, хромосомная интеграция), в репликационные векторы, функция которых, прежде всего, состоит в репликации ДНК или РНК, и в экспрессионные векторы, функция которых состоит, прежде всего, в транскрипции и/или трансляции ДНК или РНК. Под понятие подпадают также векторы, которые обладают несколькими указанными функциями.

«Экспрессионный вектор» представляет собой полинуклеотид, который при интродукции в соответствующую клетку-хозяина может транскрибироваться и транслироваться в полипептид. Понятие «экспрессионная система» относится, как правило, к приемлемой клетке-хозяину, содержащей экспрессионный вектор, функцией которой может быть выход требуемого продукта экспрессии.

Следующие примеры, перечень последовательностей и чертежи даны с целью лучшего понимания настоящего изобретения, полный объем которого представлен в приведенной ниже формуле изобретения. Очевидно, что могут быть сделаны модификации в изложенных процедурах без отклонения от сути изобретения.

Описание аминокислотных последовательностей

SEQ ID NO: 1 последовательность легкой цепи антитела к Ang-2 (<Ang-2>);

SEQ ID NO: 2 содержащая «выступы» последовательность тяжелой цепи<Ang-2> со слитым на С-конце scFv антитела к EGFR (<EGFR>);

SEQ ID NO: 3 последовательность легкой цепи антитела к VEGF (<VEGF>), несущая замену CH1-CL;

SEQ ID NO: 4 содержащая «впадину» последовательность тяжелой цепи<VEGF>, несущая замену CH1-CL и слитая на С-конце с scFv антитела к IGF-1R (<IGF-1R>);

SEQ ID NO: 5 содержащая «выступы» последовательность тяжелой цепи<Ang-2>со слитым на С-конце scFab<EGFR>;

SEQ ID NO: 6 содержащая «впадину» последовательность тяжелой цепи<VEGF>, несущая замену CH1-CL и слитая на С-конце с scFab<IGF-1R>;

SEQ ID NO: 7 содержащая «впадину» последовательность тяжелой цепи<VEGF>, несущая замену CH1-CL и слитая на С-конце с scFv<EGFR>;

SEQ ID NO: 8 содержащая «впадину» последовательность тяжелой цепи<VEGF>, несущая замену CH1-CL;

SEQ ID NO: 9 содержащая «впадину» последовательность тяжелой цепи<VEGF>, несущая замену CH1-CL и слитая на С-конце с scFab<EGFR>;

SEQ ID NO: 10 содержащая «выступы» последовательность тяжелой цепи<Ang-2>со слитым на С-конце scFab<IGF-1R>.

Описание чертежей

На чертежах показано:

на фиг.1 - схематическое изображение структуры полноразмерного антитела без СН4-домена, которое обладает способностью специфически связываться с первым антигеном (1) с помощью двух пар тяжелых и легких цепей, содержащих расположенные в общепринятом порядке вариабельные и константные домены;

на фиг.2а - схематическое изображение структуры четырех возможных одноцепочечных Fab-фрагментов, обладающих способностью специфически связываться с антигеном;

на фиг.2б - схематическое изображение структуры одноцепочечных Fv-фрагментов, обладающих способностью специфически связываться с антигеном;

на фиг.3а-г - схематическое изображение структуры предлагаемых в изобретении различных три- или тетраспецифических антител, характеризующихся тем, что в полноразмерном антителе присутствуют замены VL/VH-доменов и/или CL/CH1-доменов в легкой/тяжелой цепи антитела, обладающего способностью специфически связываться со вторым антигеном (без дополнительных модификаций СН3-доменов по типу «knobs-into-holes» и с указанными модификациями);

на фиг.4а - схематическое изображение структуры предлагаемого в изобретении тетраспецифического антитела, распознающего ангиопоэтин-2, VEGF-A, EGFR и IGF-1R, которое является четырехвалентным и в котором применена дисульфидная стабилизация одноцепочечных Fv-фрагментов, служащих в качестве антигенсвязывающих пептидов (пример 1);

на фиг.4б - схематическое изображение структуры предлагаемого в изобретении тетраспецифического антитела, распознающего ангиопоэтин-2, VEGF-A, EGFR и IGF-1R, которое является четырехвалентным и в котором одноцепочечные Fab-фрагменты служат в качестве антигенсвязывающих пептидов (пример 1);

на фиг.5а - схематическое изображение структуры предлагаемого в изобретении триспецифического антитела, распознающего ангиопоэтин-2, VEGF-A и EGFR, которое является четырехвалентным и в котором применена дисульфидная стабилизация одноцепочечных Fv-фрагментов, служащих в качестве антигенсвязывающих пептидов (пример 2);

на фиг.5б - схематическое изображение структуры предлагаемого в изобретении триспецифического антитела, распознающего ангиопоэтин-2, VEGF-A и EGFR, которое является четырехвалентным и в котором одноцепочечные Fab-фрагменты служат в качестве антигенсвязывающих пептидов(пример 2);

на фиг.6 - схематическое изображение структуры предлагаемого в изобретении триспецифического антитела, распознающего ангиопоэтин-2, VEGF-A и EGFR, которое является трехвалентным и в котором применена дисульфидная стабилизация одноцепочечных Fv-фрагментов, служащих в качестве антигенсвязывающих пептидов (пример 3);

на фиг.7 - схематическое изображение структуры предлагаемого в изобретении тетраспецифического антитела, распознающего EGFR, IGF-1R, с-Met и HER3, которое является четырехвалентным и в котором применена дисульфидная стабилизация одноцепочечных Fv-фрагментов, служащих в качестве антигенсвязывающих пептидов;

на фиг.8 - результаты анализа предлагаемого в изобретении тетраспецифического антитела, распознающего ангиопоэтин-2, VEGF-A, EGFR и IGF-1R, которое является четырехвалентным и в котором одноцепочечные Fab-фрагменты служат в качестве антигенсвязывающих пептидов (пример 1), полученные методом гель-фильтрации с использованием 26/60 Superdex 200-колонки с высоким уровнем загрузки;

на фиг.9 - результаты анализа предлагаемого в изобретении тетраспецифического антитела, распознающего ангиопоэтин-2, VEGF-A, EGFR и IGF-1R, которое является четырехвалентным и в котором одноцепочечные Fab-фрагменты служат в качестве антигенсвязывающих пептидов (пример 1), полученные методом SDS-PAGE в нативных и денатурирующих условиях;

на фиг.10 - результаты анализа предлагаемого в изобретении триспецифического антитела, распознающего ангиопоэтин-2, VEGF-A и EGFR, которое является четырехвалентным и в котором одноцепочечные Fab-фрагменты служат в качестве антигенсвязывающих пептидов (пример 2), полученные методом гель-фильтрации с использованием 26/60 Superdex 200-колонки с высоким уровнем загрузки;

на фиг.11 - результаты анализа предлагаемого в изобретении триспецифического антитела, распознающего ангиопоэтин-2, VEGF-A и EGFR, которое является четырехвалентным и в котором одноцепочечные Fab-фрагменты служат в качестве антигенсвязывающих пептидов (пример 2), полученные методом SDS-PAGE в нативных и денатурирующих условиях.

Примеры

Материалы и общие методы

Общая информация, касающаяся нуклеотидных последовательностей легких и тяжелых цепей человеческого иммуноглобулина, представлена у: Kabat Е.А. и др.. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5-ое изд., изд-во Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991. Аминокислоты цепей антител пронумерованы и на них сделаны ссылки согласно нумерации EU (Edelman G.M. и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 63, 1969, ее. 78-85; Kabat Е.А. и др.. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5-ое изд., изд-во Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991).

Методы рекомбинантной ДНК

Для манипуляций с ДНК применяли стандартные методы, описанные у Sambrook J. и др.. Molecular cloning: A laboratory manual; изд-во Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989. Реагенты для молекулярной биологии использовали согласно инструкциям производителей.

Синтез генов

Требуемые сегменты генов получали из олигонуклеотидов, созданных путем химического синтеза. Генные сегменты длиной 600-1800 пар оснований, которые фланкированы уникальными сайтами, распознаваемыми рестриктазами, собирали путем отжига и лигирования олигонуклеотидов, включая ПЦР-амплификацию и последующее клонирование через указанные сайты рестрикции, например, KpnI/SacI или AscI/PacI в клонирующем векторе pGA4, основой которого является плазмида pPCRScript (фирма Stratagene). Последовательности ДНК субклонированных генных фрагментов подтверждали путем секвенирования ДНК. Синтез генных фрагментов осуществляли в порядке, представленном в спецификации фирмы Geneart (Регенсбург, Германия).

Определение последовательностей ДНК

Последовательности ДНК определяли путем секвенирования двух цепей на фирме MediGenomix GmbH (Мартинсрид, Германия) или фирме Sequiserve GmbH (Фатерштеттен, Германия).

Анализ последовательностей ДНК и белков и обработка данных о последовательностях

Применяли пакет программ фирмы GCG (Genetics Computer Group, Мэдисон, шт.Висконсин), версия 10.2 и Infomax's Vector NT1 Advance suite, версия 8.0 для создания, картирования, анализа, аннотирования и иллюстрации последовательностей.

Экспрессионные векторы

Для экспрессии описанных антител применяли варианты экспрессионных плазмид, предназначенных для кратковременной экспрессии (например, в клетках HEK293-EBNA или HEK293-F), либо на основе кДНК-конструкции с использованием промотора CMV с интроном А или без него, либо на основе геномной конструкции с использованием промотора CMV.

Помимо кассеты экспрессии антитела векторы содержали:

- сайт инициации репликации, обеспечивающий репликацию указанной плазмиды в Е. coli, и

- ген Р-лактамазы, который придает устойчивость в Е. coli к ампициллину. Транскрипционная единица гена антитела состояла из следующих элементов:

- уникальный(ые) сайт(ы) рестрикции на 5'-конце,

- немедленно-ранний энхансер и промотор из человеческого цитомегаловируса,

- расположенная за ним последовательность интрона А в случае экспрессии на основе кДНК- конструкции,

- 5'-нетранслируемая область гена человеческого антитела,

- сигнальная последовательность тяжелой цепи иммуноглобулина,

- цепь человеческого антитела (дикого типа или с заменой доменов) либо в виде кДНК-конструкции, либо в виде геномной конструкции с экзон-интронной конструкцией иммуноглобулина,

- 3'-нетранслируемая область с сигнальной последовательностью полиаденилирования и

- уникальный(ые) сайт(ы) рестрикции на 3'-конце.

Слияние генов, содержащих описанные цепи антитела, как указано ниже, осуществляли с помощью ПЦР и/или синтеза генов и сборки с использованием известных методов и процедур рекомбинации путем соединения соответствующих сегментов нуклеиновых кислот, например, с использованием уникальных сайтов рестрикции, в соответствующих векторах. Субклонированные нуклеотидные последовательности подтверждали секвенированием ДНК. Для осуществления кратковременных трансфекций плазмиды создавали в ббльших количествах посредством получения плазмид из трансформированных культур Е. coli (набор Nucleobond AX, фирма Macherey-Nagel).

Методики культивирования клеток

Применяли стандартные методики культивирования клеток, описанные в Current Protocols in Cell Biology, под ред. Bonifacino J.S., Dasso M., Harford J.B., Lippincott-Schwartz J. и Yamada K.M., изд-во John Wiley & Sons, Inc., 2000.

Три- или тетраспецифические антитела экспрессировали путем кратковременной котрансфекции соответствующими экспрессионными плазмидами выращенных в виде прикрепленных культур клеток HEK293-EBNA или выращенных в виде суспензионных культур клеток HEK29-F, как будет описано ниже.

Кратковременные трансфекций в системе HEK293-EBNA

Для экспрессии трех- или тетраспецифических антител осуществляли кратковременную котрансфекцию соответствующими экспрессионными плазмидами (например, кодирующими тяжелую цепь и модифицированную тяжелую цепь, а также соответствующую легкую цепь и модифицированную легкую цепь) выращенных в виде прикрепленных культур клеток HEK293-EBNA (линия клеток почки человеческого эмбриона 293, экспрессирующая ядерный антиген вируса Эпштейна-Барра; Американская коллекция типовых культур, депонирована под номером АТСС № CRL-10852, партия 959 218), которые культивировали в среде DMEM (модифицированная по методу Дульбекко среда Игла, Gibco®), дополненной 10% FCS (фетальная телячья сыворотка, Gibco®) с ультра низким содержанием IgG (Ultra Low IgG FCS), 2 мМ L-глутамином (Gibco®) и 250 мкг/мл генетицина (Gibco®). Для трансфекции применяли реагент для трансфекции типа FuGENE™ 6 (фирма Roche Molecular Biochemicals), используя соотношение реагента FuGENE™ (мкл) и ДНК (мкг) 4:1 (диапазон от 3:1 до 6:1). Белки экспрессировали, применяя соответствующие плазмиды, с использованием плазмид, кодирующих (модифицированные и дикого типа) легкую цепь и тяжелую цепь, в молярном соотношении 1:1 (эквимолярное соотношение), диапазон от 1:2 до 2:1 соответственно. Клетки подпитывали в день 3 L-глутамином до концентрации 4 мМ, глюкозой (фирма Sigma) и NAA (амид никотиновой кислоты) (фирма Gibco). В дни с 5 по 11 после трансфекции собирали путем центрифугирования супернатанты клеточных культур, содержащие три- или тетраспецифическое антитело, и хранили при -20°С. Общую информацию, касающуюся рекомбинантной экспрессии человеческих иммуноглобулинов, например, в НЕК293-клетках, см. у Meissner P. и др., Biotechnol. Bioeng. 75, 2001, ее. 197-203.

Кратковременные трансфекции в системе HEK293-F

Три- или тетраспецифические антитела получали путем кратковременной трансфекции соответствующими плазмидами (например, кодирующими тяжелую цепь и модифицированную тяжелую цепь, а также соответствующую легкую цепь и модифицированную легкую цепь), используя систему HEK293-F (фирма Invitrogen) согласно инструкции производителя. В целом, метод состоял в следующем: НЕК293-F-клетки (фирма Invitrogen), выращенные в виде суспензионной культуры либо во встряхиваемой колбе, либо в ферментере с мешалкой в бессывороточной среде для экспрессии типа FreeStyle™ 293 (фирма Invitrogen), трансфектировали смесью четырех экспрессионных плазмид и 293-фектином или фектином (фирма Invitrogen). В 2-литровую встряхиваемую колбу (фирма Corning) высевали клетки HEK293-F с плотностью 1,0×10 клеток/мл в 600 мл и инкубировали при 120 об/мин, 8% СО₂. Через 1 день клетки трансфектировали при плотности клеток примерно 1,5х10 клеток/мл примерно 42 мл смеси А), содержащей 20 мл Opti-MEM (фирма Invitrogen) с 600 трансфектировали при плотности клеток примерно 1,5х10 клеток/мл с помощью мкг общей плазмидной ДНК (1 мкг/мл), которая кодирует тяжелую цепь или модифицированную тяжелую цепь соответственно и соответствующую легкую цепь, в эквимолярном соотношении, и смеси Б), содержащей 20 мл среды Opti-МЕМ+1,2 мл 293-фектина или фектина (2 мкл/мл). В зависимости от поглощения глюкозы в процессе ферментации добавляли раствор глюкозы. Через 5-10 дней собирали супернатант, содержащий секретированное антитело, и либо очищали антитела непосредственно из супернатанта, либо супернатант замораживали и помещали на хранение.

Определение белка

Концентрацию белков очищенных биспецифических четырехвалентных антител и их производных определяли на основе оптической плотности (ОП) при 280 нм, используя коэффициент молярной экстинкции, рассчитанный на основе аминокислотной последовательности согласно методу, который описан у Расе и др.. Protein Science, 4, 1995, ее. 2411-1423.

Определение концентрации антител в супернатантах

Концентрацию антител и их производных в супернатантах клеточных культур определяли путем иммунопреципитации с белок А-агарозными гранулами (фирма Roche). 60 мкл белок А-агарозных гранул отмывали трижды в TBS-NP40 (50 мМ Трис, рН 7,5, 150 мМ NaCl, 1% Nonidet-P40). Затем 1 -15 мл супернатанта клеточной культуры наносили на белок А-агарозные гранулы, предварительно уравновешенные в TBS-NP40. После инкубации в течение 1 ч при комнатной температуре гранулы отмывали на фильтрующей колонке типа Ultrafree-MC (фирма Amicon), используя однократно 0,5 мл TBS-NP40, дважды 0,5 мл двукратного (2х) забуференного фосфатом физиологического раствора (2×ЗФР, фирма Roche) и быстро четыре раза, используя 0,5 мл ЮОмМ Na-цитратного буфера, рН 5,0. Связанное антитело элюировали, добавляя 35 мкл буфера для образцов NuPAGE® LDS (фирма Invitrogen). Половину образца объединяли с восстановителем для образцов NuPAGE® или оставляли в невосстановленной форме соответственно и выдерживали в течение 10 мин при 70°С. Затем по 5-30 мкл применяли для осуществления ДСН-ПААГ с использованием 4-12% бис-Трис-гелей NuPAGE® (фирма Invitrogen) (применяя буфер MOPS для осуществлении ДСН-ПААГ в невосстанавливающих условиях и буфер MES в виде подвижного буфера с антиоксидантной добавкой NuPAGE® (фирма Invitrogen) для осуществлении ДСН-ПААГ в восстанавливающих условиях) и окрашивали кумасси бриллиантовым голубым.

Концентрацию антител и их производных в супернатантах клеточных культур оценивали количественно с помощью аффинной ЖХВР-хроматографии. В целом, метод состоял в следующем: супернатанты клеточных культур, содержащие антитела и их производные, которые связывались с белком А, вносили на колонку Applied Biosystems Poros A/20 в 200 мМ КН₂РО₄, 100 мМ натрий-цитратный буфер, рН 7,4 и элюировали из матрикса с помощью 200 мМ NaCl, 100 мМ лимонной кислоты, рН 2,5 с использованием системы Agilent HPLC 1100. Элюированный белок оценивали количественно с помощью УФ-абсорбции и интегрирования площадей пиков. Очищенное стандартное антитело в виде IgG1 служило в качестве стандарта.

В альтернативном варианте концентрацию антител и их производных в супернатантах клеточных культур оценивали с помощью «сэндвич»-IgG-ELISA. В целом, метод состоял в следующем: 96-луночные титрационные микропланшеты, обладающие высокой способностью связывать стрептавидин А (планшеты типа StreptaWell High Bind Strepatavidin А (фирма Roche)), сенсибилизировали из расчета 100 мкл/лунку биотинилированным античеловеческим IgG F(ab')₂<h-Fcγ>BI, применяемым в качестве иммобилизованной молекулы (фирма Dianova), в концентрации 0,1 мкг/мл в течение 1 ч при комнатной температуре или в другом варианте в течение ночи при 4°С и затем отмывали трижды, используя 200 мкл/лунку ЗФР, 0,05% Твин (ЗФРТ, фирма Sigma). Добавляли в лунки по 100 мкл/лунку серийных разведении в ЗФР (фирма Sigma) супернатантов клеточных культур, содержащих соответствующее антитело, и инкубировали в течение 1-2 ч на шейкере для титрационных микропланшетов при комнатной температуре. Лунки отмывали трижды, используя 200 мкл/лунку ЗФРТ, и выявляли связанное антитело с помощью 100 мкл F(ab')₂<hFcγ>POD (фирма Dianova) в концентрации 0,1 мкг/мл в качестве идентифицирующего антитела в течение 1-2 ч на шейкере для титрационных микропланшетов при комнатной температуре. Несвязанное идентифицирующее антитело отмывали трижды, используя 200 мкл/лунку ЗФРТ, а связанное идентифицирующее антитело выявляли, добавляя 100 мкл ABTS/лунку. Определение абсорбции осуществляли на спектрометре типа Тесап Fluor при длине волны 405 нм (длина референс-волны 492 нм).

Очистка белков

Белки очищали из профильтрованных супернатанов клеточных культур согласно стандартным протоколам. В целом, метод состоял в следующем: белки вносили на колонку, заполненную белок А-сефарозой (фирма GE Healthcare), и отмывали ЗФР. Элюцию антител осуществляли при рН 2,8 с последующей немедленной нейтрализацией образца. Агрегированный белок отделяли от мономерных антител гель-фильтрацией (Superdex 200, фирма GE Healthcare) в ЗФР или в 20 мМ гистидине, 150 мМ NaCl, рН 6,0. Фракции мономерных антител объединяли, при необходимости концентрировали, используя, например, центрифужный концентратор типа MILLIPORE Amicon Ultra (30 MWCO (молекулярновесовой предел), замораживали и хранили при -20°С или -80°С.Часть образцов оставляли для последующего аналитического изучения белка и его аналитической характеризации, например, с помощью ДСН-ПААГ, гель-фильтрации (ГФ) или масс-спектрометрии.

ДСН-ПААГ

Применяли систему геля NuPAGE® Pre-Cast (фирма Invitrogen) согласно инструкции производителя. В частности использовали 10% или 4-12% бис-Трис Pre-Cast-гели NuPAGE®, Novex® (рН 6,4) и подвижные буферы, такие как NuPAGE® MES (гели, применяемые в восстанавливающих условиях, подвижный буфер с антиоксидантной добавкой NuPAGE®) или MOPS (гели, применяемые в невосстанавливающих условиях).

Аналитическая гель-фильтрация

В качестве гель-фильтрации (ГФ), предназначенной для определения агрегированного и олигомерного состояния антител, применяли ЖХВР-хроматографию. В целом, метод состоял в следующем: очищенные на белке А антитела вносили на колонку типа Tosoh TSKgel G3000SW в 300 мМ NaCl, 50 мМ КН₂РO₄/К₂НРO₄, рН 7,5 в системе Agilent HPLC 1100, или на колонку Superdex 200 (фирма GE Healthcare) в 2 хЗФР в ЖХВР-системе Dionex. Количество элюированного белка определяли на основе УФ-абсорбции и интегрирования площадей пиков. В качестве стандарта применяли стандарт для гель-фильтрации фирмы BioRad (Gel Filtration Standard 151-1901).

Масс-спектрометрия

Общую дегликозилированную массу антител, полученных в результате кроссинговера, определяли и подтверждали с помощью масс-спектрометрии с ионизацией электроспреем (ESI-MC). В целом, метод состоял в следующем: 100 мкг очищенных антител дегликозилировали с помощью 50 ME N-гликозидазы F (РНОазаР, фирма ProZyme) в 100 мМ КН₂РO₄/К₂НРО₄, рН 7 при 37°С в течение 12-24 ч при концентрации белка вплоть до 2 мг/мл и затем обессоливали с помощью ЖХВР на колонке Sephadex G25 (фирма GE Healthcare). Массу соответствующих тяжелых и легких цепей определяли с помощью ESI-MC после дегликозилирования и восстановления. В целом, метод состоял в следующем: 50 мкг антитела в 115 мкл инкубировали с 60 мкл 1М ТСЕР и 50 мкл 8М гидрохлорида гуанидина после обессоливания. Общую массу и массу восстановленных тяжелых и легких цепей определяли с помощью ESI-MC с использованием МС-системы Q-Star Elite, снабженной источником NanoMate®.

Biacore-анализ с использованием ECD IGF-1R (IGF-1R-ECD)

Связывание созданных антител с человеческими внеклеточными доменами (ECD, Extracellular Domains) IGF-1R, EGFR, HER3 и c-Met исследовали также с помощью метода резонанса поверхностного плазмона, используя устройство типа BIACORE T100 (фирма GE Healthcare Biosciences AB, Упсала, Швеция). В целом, метод состоял в следующем: для оценки аффинности козьи антитела к человеческому IgG JIR 109-005-098 иммобилизовывали на СМ5-чипе посредством аминового сочетания для презентации антител к человеческому ECD, Fc-специфических. Связывание оценивали в HBS-буфере (HBS-P (ЮмМ HEPES, 150 мМ NaCl, 0,005% Твин 20, рН 7,4) при 25°С.ECD c-Met, IGF-1R или EGFR (полученные от фирмы R&D Systems или полученные путем очистки при создании изобретения) добавляли в раствор в различных концентрациях. Ассоциацию оценивали путем инъекции ECD в течение промежутка времени от 80 с до 3 мин; диссоциацию оценивали путем отмывки поверхности чипа HBS-буфером в течение 3-10 мин и значение KD определяли, используя модель связывания Ленгмюра при соотношении 1:1. Из-за низкой плотности загрузки и уровня захвата получали данные о связывании одновалентного ECD. Данные, полученные для отрицательного контроля (например, кривые, полученные только для буфера), вычитали из кривых, полученных для образца, для коррекции присущего системе сдвига основного уровня и для снижения шумовых сигналов. Применяли программу Biacore Т 100 Evaluation, версия 1.1.1 для анализа сенсограмм и для расчета данных, касающихся аффинности. На фиг.11 представлена схема Biacore-анализа.

Biacore-анализ связывания с ANGPT2 и VEGF

Связывание созданных антител с человеческими ANGPT2 и VEGF исследовали также с помощью метода резонанса поверхностного плазмона, используя устройство типа BIACORE T100 (фирма GE Healthcare Biosciences АВ, Упсала, Швеция). В целом, метод состоял в следующем: для оценки аффинности козьи поликлональные антитела к hIgG-Fcg (<hIgG-Fcg>) иммобилизовывали на СМ5- или СМ4-чипе посредством аминового сочетания для презентации антител к человеческим ANGPT2 и VEGF. Связывание оценивали в HBS-буфере (HBS-P (ЮмМ HEPES, 150 мМ Nad, 0,005% Твин 20, рН 7,4) с добавлением 5 мМ Са^+или без него, при 25°С.Очищенные ANGPT2 -His или VEGF 165/VEGF 121 -His соответственно (полученные от фирмы R&D Systems или полученные путем очистки при создании изобретения) добавляли в раствор в различных концентрациях. Ассоциацию оценивали путем инъекции ANGPT2/VEGF в течение 3 мин; диссоциацию оценивали путем отмывки поверхности чипа HBS-буфером в течение 3-10 мин и значение KD определяли, используя модель связывания Ленгмюра при соотношении 1:1. Данные, полученные для отрицательного контроля (например, кривые, полученные только для буфера), вычитали из кривых, полученных для образца, для коррекции присущего системе сдвига основного уровня и для снижения шумовых сигналов. Применяли программу Biacore T100 Evaluation, версия 1.1.1 для анализа сенсограмм и для расчета данных, касающихся аффинности.

Biacore-анализ одновременного связывания

Одновременное связывание тетра- и триспецифических антител с EGFR, IGF-1R, Ang-2 и VEGF или EGFR, IGF-1R, HER3 и c-Met или EGFR, Ang-2 и VEGF соответственно.

Связывание тетра- или триспецифических форматов антител сравнивали со связыванием антител в виде IgG «дикого типа», из которых были выведены связывающие модули и биспецифические антитела. Эти анализы осуществляли помощью указанного выше метода резонанса поверхностного плазмона (Biacore- анализ). Для того, чтобы продемонстрировать наличие одновременного связывания, проводили анализ способности к связыванию с помощью технологии резонанса поверхностного плазмона (SPR) с использованием устройства Biacore T100 (фирма Biacore АВ, Уппсала).

Захватывающее антитело к человеческому IgG иммобилизовывали на поверхности биосенсорного чипа СМ5 посредством аминового сочетания. Проточные ячейки активировали смесью 1:1 0,1М N-гидроксисукцинимида и 0,1М 3-(N,N-диметиламино)пропил-N-этилкарбодиимида при скорости потока 5 мкл/мин. Антитело к человеческому IgG вносили путем инъекции в ацетате натрия, рН 5,0, в концентрации 10 мкг/мл, в результате чего поверхностная плотность составляла примерно 12000 RU. Служащую в качестве референс-контроля проточную ячейку обрабатывали таким же образом, но вместо захватывающего антитела применяли используемые в качестве наполнителя буферы. Поверхности блокировали путем инъекции 1М этаноламина/HCl, рН 8,5. Мультиспецифические антитела разводили в HBS-P и вносили путем инъекции при скорости потока 5 мкл/мин. Время контакта (фаза ассоциации) составляло 1 мин для антител, применяемых в концентрации от 1 до 50нМ. EGFR/IGF-1R/HERS/c-Met-ECD и Ang-2 или VEGF соответственно вносили путем инъекции в возрастающих концентрациях. Все взаимодействия осуществляли при 25°С (стандартная температура). После каждого цикла связывания вносили путем инъекции раствор для регенерации, представляющий собой 3М хлорид магния, в течение 60 с со скоростью потока 5 мкл/мин для удаления всего не связанного ковалентно белка. Сигналы регистрировали со скоростью один сигнал в секунду. Образцы вносили путем инъекции в возрастающих концентрациях.,

Пример 1

Получение, экспрессия, очистка и характеризация тетраспецифического и четырехвалентного антитела, обладающего способностью распознавать ангиопоэтин-2. VEGF-A. EGFR и IGF-1R

В первом варианте тетраспецифическое и четырехвалентное антитело, обладающее способностью распознавать ангиопоэтин-2, EGF-A, EGFR и IGF-1R, создавали путем слияния посредством (С48)4-коннектора стабилизированных с помощью дисульфидной связи scFv к EGFR с С-концевой областью первой тяжелой цепи и scFv к IGF-1R с С-концом второй тяжелой цепи несущего замену СН1/СL(Cкаппа)-доменов антитела, модифицированного с помощью технологии «knobs-into-holes», вариабельные домены которого распознают ангиопоэтин-2 и VEGF (фиг.4а). Последовательности соответствующих четырех цепей антитела представлены в SEQ ID NO: I, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4.

Основные данные Уровень экспрессии (выход) - мг/мл 14,5 Степень очистки (гомогенность после очистки на белке А) - % 91,3 Выход после ГФ - мг/мл 10,4 Гомогенность после препаративной ГФ - % 99,7

Во втором варианте тетраспецифическое и четырехвалентное антитело, обладающее способностью распознавать ангиопоэтин-2, VEGF-A, EGFR и IGF-1R, создавали путем слияния посредством (С48)2-коннектора стабилизированных с помощью дисульфидной связи scFv к EGFR с С-концевой областью первой тяжелой цепи и scFv к IGF-1R с С-концом второй тяжелой цепи несущего замену СН1/СЦСкаппа)-доменов антитела, модифицированного с помощью технологии «knobs-into-holes», вариабельные домены которого распознают ангиопоэтин-2 и VEGF (фиг.46). Последовательности соответствующих четырех цепей антитела представлены в SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 6.

Основные данные Уровень экспрессии (выход) - мг/мл 12,2 Степень очистки (гомогенность после очистки на белке А) - % 74,4 Выход после ГФ - мг/мл 6,8 Гомогенность после препаративной ГФ - % 98,4

В следующем варианте аналогично процедуре, описанной во втором примере, тетраспецифическое и четырехвалентное антитело, обладающее способностью распознавать ангиопоэтин-2, VEGF-A, EGFR и IGF-1R, создавали путем слияния посредством (G4S)2-коннектора стабилизированных с помощью дисульфидной связи scFv к EGFR с С-концевой областью второй тяжелой цепи и scFv к IGF-1R с С-концом первой тяжелой цепи несущего замену СН1/СL(Скаппа)-доменов антитела, модифицированного с помощью технологии «knobs-into-holes», вариабельные домены которого распознают ангиопоэтин-2 и VEGF (аналогичного антителу, представленному на фиг.46, но в котором scFab к IGF-1R слит с несущей «выступы» тяжелой цепью, обладающей способностью связываться с ANG2, и scFab к EGFR слит с несущей «впадины» тяжелой цепью, обладающей способностью связываться с VEGF). Последовательности соответствующих четырех цепей антитела представлены в SEQ ID NO: I, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 10.

Указанные варианты антитела создавали как описано выше в разделе, посвященном общим методам, с помощью классических методов молекулярной биологии и осуществляли их кратковременную экспрессию в НЕК293-Р-клетках согласно описанному выше методу. После этого их очищали из супернатанта с помощью комбинации методов аффинной хроматографии на белке А и гель-фильтрации. Полученные продукты характеризовали с целью их идентификации с помощью масс-спектрометрии и для определения их аналитических характеристик, таких как степень чистоты, с помощью ДСН-ПААГ, а также для оценки содержания мономеров и стабильности (фиг.8-9, продукты, содержащие последовательности, представленные в SEQ ID NO: I, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 10).

Наличие (одновременного) связывания четырех специфичностей антитела с четырьмя применяемыми для сенсибилизации антигенами (ангиопоэтин-2, VEGF-A, EGFR и IGF-1R) было продемонстрировано с помощью Biacore-анализа с применением описанных выше методов.

Таблица: Связывание тетраспецифического и четырехвалентного антитела, обладающего способностью распознавать ангиопоэтин-2, VEGF-A, EGFR и IGF-1R, созданного с использованием последовательностей, представленных в SEQ ID NO: I, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 10).

Анализируемая субстанция k_a (1/Mc) k_d (1/c) K_D (нМ) EGFR (HER1) 3,1E+05* 3.9E-05* 12,8* [GF-1R     Низкая аффинность связывания Ang-2 и.о.*** и.о.*** 138 *** VEGF 5.0E+04* <1E-06'¹' <1Е-11*

* «захват» посредством античеловеческого антитела

** «захват» посредством HER1

*** находящийся на поверхности Ang-2

Пример 2

Получение, экспрессия, очистка и характеризация триспецифического и четырехвалентного антитела, обладающего способностью распознавать ангиопоэтин-2. VEGF-A и EGFR

В первом варианте триспецифическое и четырехвалентное антитело, обладающее способностью распознавать ангиопоэтин-2, VEGF-A, EGFR и IGF-1R, создавали путем слияния посредством (048)4-коннектора стабилизированных с помощью дисульфидной связи scFv к EGFR с С-концевой областью двух тяжелых цепей несущего замену СН1/СL(Скаппа)-доменов антитела, модифицированного с помощью технологии «knobs-into-holes», вариабельные домены которого распознают ангиопоэтин-2 и VEGF (фиг.5а). Последовательности соответствующих четырех цепей антитела представлены в SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 7.

Основные данные Уровень экспрессии (выход) -мг/мл 20,1 Степень очистки (гомогенность после очистки на белке А) - % 64,1 Выход после ГФ - мг/мл 12,0 Гомогенность после препаративной ГФ - % 100

Таблица Связывание триспецифического и четырехвалентного антитела, обладающего способностью распознавать ангиопоэтин-2, VEGF-A и EGFR, схема которого представлена на фиг.5а. Аффинность связывания с k_a (1/Mc) k_d (1/c) K_D (нМ) EGFR (HER1) 4,7Е+04 2,3Е-04 6 hAng-2 1Е+06 1,7Е-04 0,2 hVEGF 1Е+05 <1Е-06 <0,1

Во втором варианте триспецифическое и четырехвалентное антитело, обладающее способностью распознавать ангиопоэтин-2, VEGF-A, EGFR и IGF-1R, создавали путем слияния посредством (С48)2-коннектора стабилизированных с помощью дисульфидной связи двух scFv к EGFR с С-концевой областью двух тяжелых цепей несущего замену CHl/СL(Скаппа)-доменов антитела, модифицированного с помощью технологии «knobs-into-holes», вариабельные домены которого распознают ангиопоэтин-2 и VEGF (фиг.56). Последовательности соответствующих четырех цепей антитела представлены в SEQ ID NO: I, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 9.

Указанные варианты антитела создавали как описано выше в разделе, посвященном общим методам, с помощью классических методов молекулярной биологии и осуществляли их кратковременную экспрессию в НЕК293-Р-клетках согласно описанному выше методу. После этого их очищали из супернатанта с помощью комбинации методов аффинной хроматографии на белке А и гель-фильтрации. Полученные продукты характеризовали с целью их идентификации с помощью масс-спектрометрии и для определения их аналитических характеристик, таких как степень чистоты, с помощью ДСН-ПААГ, а также содержания мономеров и стабильности (фиг.10-11, продукты, содержащие последовательности, представленные в SEQ ID NO: I, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 9).

Наличие (одновременного) связывания четырех специфичностей антитела с тремя применяемыми для сенсибилизации антигенами (ангиопоэтин-2, VEGF-A и EGFR) было продемонстрировано с помощью Biacore-анализа с применением описанных выше методов.

Таблица Связывание триспецифического и четырехвалентного антитела, обладающего способностью распознавать ангиопоэтин-2, VEGF-A и EGFR, схема которого представлена на фиг.56. Анализируемая субстанция k_a (1/Mc) k_d (1/c) K_D (нМ) EGFR(HERl) 3,7E+04* 3,4E-04* 2,7* Ang-2 н.о.** н.о.** 176** VEGF 6,7E+04* <1E-06* <0,01*

* «захват» посредством античеловеческого антитела

** находящийся на поверхности Ang-2

Пример 3

Получение, экспрессия, очистка и характеризация триспецифического и трехвалентного антитела, обладающего способностью распознавать ангиопоэтин-2. VEGF-A и EGFR

В первом варианте триспецифическое и трехвалентное антитело, обладающее способностью распознавать ангиопоэтин-2, VEGF-A, EGFR и IGF-1R, создавали путем слияния посредством (С48)4-коннектора стабилизированного с помощью дисульфидной связи scFv к EGFR с С-концевой областью двух тяжелых цепей несущего замену СН1/СL(Скаппа)-доменов антитела, модифицированного с помощью технологии «knobs-into-holes», вариабельные домены которого распознают ангиопоэтин-2 и VEGF (фиг.6). Последовательности соответствующих четырех цепей антитела представлены в SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 8.

Указанные варианты антитела создавали как описано выше в разделе, посвященном общим методам, с помощью классических методов молекулярной биологии и осуществляли их кратковременную экспрессию в НЕК293-Р-клетках согласно описанному выше методы. После этого их очищали из супернатанта с помощью комбинации методов аффинной хроматографии на белке А и гель-фильтрации. Полученные продукты характеризовали с целью их идентификации с помощью масс-спектрометрии и для определения их аналитических характеристик, таких как степень чистоты, с помощью ДСН-ПААГ, а также содержания мономеров и стабильности

Основные данные Уровень экспрессии (выход) -мг/мл 40,9 Степень очистки (гомогенность после очистки на белке А) - % 77,3 Выход после ГФ - мг/мл 22,3 Гомогенность после препаративной ГФ - % 100

Наличие (одновременного) связывания четырех специфичностей антитела с тремя применяемыми для сенсибилизации антигенами (ангиопоэтин-2, VEGF-A и EGFR) было продемонстрировано с помощью Biacore-анализа с применением описанных выше методов.

Изобретение относится к области биотехнилогии. Описан способ получения триспецифического или тетраспецифического антитела, где триспецифическое или тетраспецифическое антитело содержит: а) легкую цепь и тяжелую цепь полноразмерного антитела, обладающего способностью специфически связываться с первым антигеном; и б) модифицированную легкую цепь и модифицированную тяжелую цепь полноразмерного антитела, обладающего способностью специфически связываться со вторым антигеном, в котором вариабельные домены VL и VH заменены друг на друга и/или в котором константные домены CL и СН1 заменены друг на друга; и в) в котором от одного до четырех одноцепочечных антител, обладающих способностью специфически связываться с одним или двумя дополнительными антигенами, слиты посредством пептида-коннектора с С- или N-концом легких цепей или тяжелых цепей, указанных в подпункте а) и/или б); где способ включает этапы: i) трансформацию клетки-хозяина векторами экспрессии, включающими молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие легкую цепь и тяжелую цепь полноразмерного антитела, которое специфически связывает первый антиген; и модифицированную легкую и тяжелую цепь полноразмерного антитела, где вариабельные домены VL и VH заменены один на другой, и/или константные домены CL и СН1 замены один на другой, и где одно до четырех одноцепочечных антител слиты посредством пептида-коннектора с С- или N- терминальными концами легких цепей или тяжелых цепей (а) и/или (б); ii) культивирование клетки-хозяина при условиях, которые позволяют синтез указанной молекулы антитела; и iii) выделение указанной молекулы антитела из указанной культуры. Также представлена клетка-хозяин для получения указанных триспецифического или тетраспецифического антитела, содержащая векторы экспрессии, включающие молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие указанные антитела. Изобретение позволяет получить триспецифическое или тетраспецифическое антитело с высоким выходом за счет снижения неправильных спариваний цепей антитела. 2 н. и 11 з.п. ф-лы, 11 ил., 3 табл., 3 пр.

1. Способ получения триспецифического или тетраспецифического антитела, где триспецифическое или тетраспецифическое антитело содержит:
а) легкую цепь и тяжелую цепь полноразмерного антитела, обладающего способностью специфически связываться с первым антигеном; и
б) модифицированную легкую цепь и модифицированную тяжелую цепь полноразмерного антитела, обладающего способностью специфически связываться со вторым антигеном, в котором вариабельные домены VL и VH заменены друг на друга и/или в котором константные домены CL и СН1 заменены друг на друга; и
в) в котором от одного до четырех одноцепочечных антител, обладающих способностью специфически связываться с одним или двумя дополнительными антигенами, слиты посредством пептида-коннектора с С- или N-концом легких цепей или тяжелых цепей, указанных в подпункте а) и/или б);
где способ включает этапы:
i) трансформацию клетки-хозяина векторами экспрессии, включающими молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие
- легкую цепь и тяжелую цепь полноразмерного антитела, которое специфически связывает первый антиген; и
- модифицированную легкую и тяжелую цепь полноразмерного антитела, где вариабельные домены VL и VH заменены один на другой, и/или константные домены CL и СН1 замены один на другой, и
- где одно до четырех одноцепочечных антител слиты посредством пептида-коннектора с С- или N- терминальными концами легких цепей или тяжелых цепей (а) и/или (б);
ii) культивирование клетки-хозяина при условиях, которые позволяют синтез указанной молекулы антитела; и
iii) выделение указанной молекулы антитела из указанной культуры.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что антитело содержит в качестве указанных в подпункте в) одноцепочечных антител одно или два одноцепочечных антитела, которые обладают способностью специфически связываться с одним или двумя дополнительными антигенами.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что антитело содержит в качестве указанных в подпункте в) одноцепочечных антител одно или два одноцепочечных антитела, которые обладают способностью специфически связываться с третьим антигеном.

4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что антитело содержит в качестве указанных в подпункте в) одноцепочечных антител два идентичных одноцепочечных антитела, которые обладают способностью специфически связываться с третьим антигеном.

5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что антитело содержит в качестве указанных в подпункте в) одноцепочечных антител одно одноцепочечное антитело, которое обладает способностью специфически связываться с третьим антигеном, и одно одноцепочечное антитело, которое обладает способностью специфически связываться с четвертым антигеном.

6. Способ по одному из пп. 1-5, отличающийся тем, что одноцепочечные антитела выбраны из группы, включающей scFv-фрагмент и scFab-фрагмент.

7. Способ по одному из пп. 1-5, отличающийся тем, что одноцепочечные антитела представляют собой scFv-фрагменты.

8. Способ по п. 6, отличающийся тем, что одноцепочечные антитела представляют собой scFab-фрагменты.

9. Способ по п. 6, отличающийся тем, что одноцепочечные антитела слиты с С-концами тяжелых цепей, указанных в подпунктах а) и/или б).

10. Способ по п. 6, отличающийся тем, что в антителе СН3-домен тяжелой цепи полноразмерного антитела, указанного в подпункте а), и
СН3-домен модифицированной тяжелой цепи полноразмерного антитела, указанного в подпункте б), каждый соприкасается друг с другом на поверхности раздела, которая представляет собой исходную поверхность раздела между СН3-доменами антитела;
при этом поверхность раздела изменена для стимулирования формирования триспецифического или тетраспецифического антитела, где изменение отличается тем, что:
I) СН3-домен одной тяжелой цепи изменен
таким образом, чтобы на исходной поверхности раздела СН3-домена одной тяжелой цепи, которая соприкасается с исходной поверхностью раздела СН3-домена другой тяжелой цепи в три- или тетраспецифическом антителе,
аминокислотный остаток был заменен на аминокислотный остаток, который имеет большую по объему боковую цепь, создавая тем самым «выпуклость» на поверхности раздела СН3-домена одной тяжелой цепи, которая может помещаться в «полость» на поверхности раздела СН3-домена другой тяжелой цепи,
и
II) СН3-домен другой тяжелой цепи изменен таким образом, чтобы на исходной поверхности раздела второго СН3-домена, которая соприкасается с исходной поверхностью раздела первого СН3-домена в три- или тетраспецифическом антителе,
аминокислотный остаток был заменен на аминокислотный остаток, который имеет меньшую по объему боковую цепь, создавая тем самым «полость» на поверхности раздела второго СН3-домена, в которую может помещаться «выпуклость» на поверхности раздела первого СН3-домена.

11. Способ по п. 10, отличающийся тем, что в антителе аминокислотный остаток, который имеет большую по объему боковую цепь, выбран из группы, включающей аргинин (R), фенилаланин (F), тирозин (Y), триптофан (W), а аминокислотный остаток, который имеет меньшую по объему боковую цепь, выбран из группы, включающей аланин (А), серин (S), треонин (Т), валин (V).

12. Способ по п. 10 или 11, отличающийся тем, что в антителе оба СН3-домена дополнительно изменены путем интродукции цистеина (С) в качестве аминокислоты в соответствующие положения в каждом СН3-домене, в результате чего может формироваться дисульфидный мостик между обоими СН3-доменами.

13. Клетка-хозяин для получения триспецифического или тетраспецифического антитела, где триспецифическое или тетраспецифическое антитело содержит:
а) легкую цепь и тяжелую цепь полноразмерного антитела, обладающего способностью специфически связываться с первым антигеном; и
б) модифицированную легкую цепь и модифицированную тяжелую цепь полноразмерного антитела, обладающего способностью специфически связываться со вторым антигеном, в котором вариабельные домены VL и VH заменены друг на друга и/или в котором константные домены CL и СН1 заменены друг на друга; и
в) в котором от одного до четырех одноцепочечных антител, обладающих способностью специфически связываться с одним или двумя дополнительными антигенами, слиты посредством пептида-коннектора с С- или N-концом легких цепей или тяжелых цепей, указанных в подпункте а) и/или б);
и где клетка-хозяин содержит векторы экспрессии, включающие молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие
- легкую цепь и тяжелую цепь антитела, которое специфически связывает первый антиген; и
- модифицированную легкую и тяжелую цепь полноразмерного антитела, где вариабельные домены VL и VH заменены один на другой, и/или константные домены CL и СН1 замены один на другой, и
- где одно до четырех одноцепочечных антител слиты посредством пептида-коннектора с С- или N- терминальными концами легких цепей или тяжелых цепей (а) и/или (б).