СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТЕТРАПИРРОЛЬНЫХ СОЕДИНЕНИЙ И ТЕТРАПИРРОЛЬНЫЕ СОЕДИНЕНИЯ Российский патент 2016 года по МПК C07D487/22 C12P17/18 C12N1/21 

Область техники

Настоящее изобретение относится к способу получения тетрапиррольного соединения и получаемому в результате тетрапиррольному соединению.

Уровень техники

Тетрапиррольные соединения, такие как порфирин и хлорофилл, являются важными соединениями, которые применяются в качестве различных лекарственных и фармацевтических средств, таких как противоопухолевые средства и, кроме того, они также применялись в качестве пищевых добавок и катализаторов окислительно-восстановительных реакций в области электроники. Такое тетрапиррольное соединение обычно получают способом химического синтеза. Однако подобный способ химического синтеза достаточно сложен, поскольку требует использования специального оборудования (производственного оборудования) и специфичного катализатора, а некоторые из способов химического синтеза могут оказывать неблагоприятное воздействие на окружающую среду из-за применяемого в них растворителя.

В противоположность этому был предложен способ получения тетрапиррольного соединения, основанный на применении микроорганизма. Например, был известен способ, в котором культивируют вариант микроорганизма, принадлежащего к роду Plectonema, который является видом фотосинтезирующих бактерий, а затем получаемый в результате протохлорофиллид выделяют и очищают из среды культивирования (см., например, патентный документ 1, указанный ниже). Кроме того, был известен способ, в котором культивируют фотосинтезирующие бактерии, чтобы затем, таким образом, выделять и получать образующиеся в результате тетрапиррольные соединения (см., например, патентные документы 2 и 3, указанные ниже). Кроме того, также был известен способ, в котором микроорганизм, принадлежащий к роду Arthrobacter, культивировали в среде, содержащей специфическое соединение, а затем образующийся уропорфирин выделяли из среды культивирования (см., например, патентный документ 4, указанный ниже).

Патентный документ 1: неакцептованная заявка на патент Японии Hei 5-91866; патентный документ 2: неакцептованная заявка на патент Японии Hei 5-244937; патентный документ 3: неакцептованная заявка на патент Японии 2000-23691; патентный документ 4: неакцептованная заявка на патент Японии Hei 5-38295.

Описание изобретения

Задачи, решаемые изобретением

В процессе применения способа, раскрытого в патентном документе 1, синтезируемый протохлорофиллид требуется собрать из выращенных бактериальных клеток, а более конкретно, необходимо разрушить бактериальные клетки и затем выделить и очистить продукт с помощью, например, методики экстракции. Кроме того, при внедрении одного из способов, раскрытых в патентных документах 2-4, в среду культивирования необходимо вводить 5-аминолевулиновую кислоту, служащую в качестве предшественника тетрапиррольного соединения.

Таким образом, задачей настоящего изобретения является решение предшествующих проблем, связанных с предшествующими стандартными способами, а более конкретно, в предоставлении простого способа получения тетрапиррольного соединения с применением бактериальных клеток Escherichia coli без использования какого-либо предшественника тетрапиррольного соединения.

Способы решения задач

Способ получения тетрапиррольного соединения согласно настоящему изобретению отличается тем, что бактериальные клетки Escherichia coli, которые не могут экспрессировать ген ypjD (b2611) вследствие его изменения или мутации, выращиваются в среде культивирования, и что образующееся в результате тетрапиррольное соединение, содержащее в молекуле кольцевую структуру порфирина, выделяют и очищают из среды культивирования.

Способ получения настоящего изобретения дополнительно отличается тем, что он включает стадии добавления к среде культивирования металла, способного превращаться в ионы соответствующего металла в вышеуказанной среде культивирования, или добавления соединения металла, способного диссоциировать на соответствующие ионы, в качестве сырья, а затем сбора или выделения образующегося в результате тетрапиррольного соединения, содержащего металл.

Способ получения согласно настоящему изобретению дополнительно характеризуется тем, что вышеуказанное тетрапиррольное соединение является соединением, которое несет четыре метильные группы, а также четыре сложноэфирные этиловые группы или ацетатные группы (пропионатные группы) на своем порфириновом кольце.

Кроме того, способ получения тетрапиррольного соединения согласно настоящему изобретению также отличается тем, что он включает стадии культивирования бактериальных ячеек Escherichia coli, которые не могут экспрессировать ген ypjD (b2611) вследствие его изменения или мутации, в среде культивирования, которая в качестве сырья включает Mn, способный превращаться в соответствующие ионы в среде культивирования, или Mn-содержащее соединение, способное диссоциировать на соответствующие ионы в среде культивирования, а затем сбора или выделения, из среды культивирования, образующегося в результате тетрапиррольного соединения, содержащего в молекуле порфириновую кольцевую структуру, в центре которой скоординирован Mn.

Тетрапиррольное соединение настоящего изобретения представлено следующей формулой:

[C ₃₆ H ₃₆ O ₈ N ₄ ∙Mn(III)] ⁺

Технический результат изобретения

Согласно настоящему изобретению тетрапиррольное соединение может быть получено при культивировании бактериальных клеток Escherichia coli, в частности клеток Escherichia coli, которые не могут экспрессировать ген ypjD (b2611) вследствие его изменения или мутации, в среде культивирования, с последующим получением или выделением образующегося в результате тетрапиррольного соединения, содержащего в молекуле порфириновую кольцевую структуру и, таким образом, настоящее изобретение позволяет легко получить тетрапиррольное соединение без применения какого-либо предшественника.

Наилучший способ осуществления изобретения

В варианте осуществления способа получения тетрапиррольного соединения согласно настоящему изобретению, тетрапиррольное соединение получают путем культивирования Escherichia coli, предпочтительно в олиготрофной культуральной среде, с последующим выделением и очисткой целевого тетрапиррольного соединения из олиготрофной среды культивирования, получая, таким образом, тетрапиррольное соединение, содержащее порфириновую кольцевую структуру. Согласно настоящему изобретению тетрапиррольное соединение может быть получено в Escherichia coli, продуцирующей его в процессе культивирования и пролиферации бактериальных клеток, с последующим выделением тетрапиррольного соединения, секретируемого в среду культивирования. Предпочтительно в качестве среды культивирования применять олиготрофную культуральную среду, чтобы исключить какое-либо влияние компонентов, таких как природные вещества, присутствующие в культуральной среде, которые могут помешать выделению тетрапиррольного соединения. В качестве подобных олиготрофных культуральных сред предпочтительно применяют, например, культуральные среды, которые содержат глюкозу или лактозу, однако настоящее изобретение не ограничивается их применением.

Escherichia coli, используемая в настоящем изобретении, предпочтительно не может экспрессировать ген ypjD (b2611) вследствие его изменения или мутации. Конкретные примеры включают клетки Escherichia coli, полученные из штамма K12 и штаммов BL21. Например, в настоящей заявке предпочтительно применяются клетки Escherichia coli, полученные из штаммов K12, которые не могут экспрессировать ген ypjD (b2611) вследствие его изменения. Примеры штаммов Escherichia coli, которые не могут экспрессировать ген ypjD (b2611) в результате мутации, включают штаммы Escherichia coli, в которых транспозон гена ypjD (b2611) встроен в ген штамма. Такие мутантные штаммы находятся в таком состоянии, в котором их функция по экспрессии гена ypjD (b2611) частично или полностью удалена. В данной связи, штаммы K12 можно получить, например, от National Bio-Resources, а штаммы B21 можно получить, например, от TAKARA BIO. Кроме того, различные штаммы, в которых транспозон гена ypjD (b2611) встроен в их ген, включают, например, штаммы JD23504, которые можно получить от National Bio-Resources.

В данном варианте осуществления штаммы Escherichia coli сначала культивируют в олиготрофной культуральной среде. В связи с этим предпочтительно, чтобы штаммы Escherichia coli прекультивировались в подходящей культуральной среде, отличной от олиготрофной культуральной среды, например, в среде LB, после чего прекультивированные штаммы (или прекультивированные продукты) инокулируют в олиготрофную культуральную среду, выполняя, таким образом, основное культивирование.

Условия культивирования Escherichia coli не ограничиваются какими-либо конкретными условиями, при этом штаммы Escherichia coli могут культивироваться в условиях, используемых на настоящий момент для их пролиферации. То же справедливо и для следующего случая, а именно, когда штаммы Escherichia coli сначала прекультивируют, а затем выполняют основное культивирование, заменяя среду культивирования другой средой. Например, бактериальные клетки прекультивируют в среде LB, при температуре 15-40°C в течение 6-24 часов, а затем полученную суспензию клеток подвергают основному культивированию в олиготрофной культуральной среде при температуре 20-40°С в течение 12-96 часов. Таким образом, бактериальные клетки пролиферируют или растут в культуральной среде, и в результате может быть получена культура (культивированный продукт), которая имеет цветной тон, характерный для предполагаемого тетрапиррольного соединения.

Затем предполагаемое тетрапиррольное соединение может быть выделено из вышеуказанного культивированного продукта с помощью способа, подробно описанного ниже.

Более конкретно, культивированный продукт центрифугируют, получая супернатант, подвергаемый последующей фильтрации, после чего тетрапиррольное соединение выделяют из фильтрата посредством адсорбции с использованием, например, колонки, заполненной ионообменной смолой, или обращенно-фазовой колонки. Например, среду культивирования, полученную после культивирования бактериальных клеток, центрифугируют с целью осаждения, бактериальных клеток, получая, таким образом, супернатант, содержащий культуру (культивированный продукт). Затем супернатант фильтруют через фильтр, имеющий заданный размер пор (например, 0,22 мкм), после чего полученный фильтрат наносят на вышеуказанную колонку, заполненную ионообменной смолой, чтобы таким образом адсорбировать предполагаемые продукты на смоле. После этого, культивированный продукт элюируют с ионообменной смолы с использованием, например, раствора 20% ацетонитрила-0,1% трифторуксусной кислоты, а затем полученный элюат лиофилизируют. В данном случае также можно применять элюирующий раствор, приготовленный путем добавления водного раствора кислоты или щелочи к органическому растворителю в предыдущей стадии элюции. Согласно данному варианту осуществления получают один или, по меньшей мере, два вида тетрапиррольных соединений, при этом от нескольких миллиграммов до нескольких десятков миллиграммов тетрапиррольных соединений может быть получено, например, из 500 мл суспензии клеток.

Продукт, выделенный согласно вышеуказанным методикам, может быть проанализирован, например, с помощью ЯМР (Ядерный Магнитный Резонанс) спектроскопии, чтобы таким образом подтвердить, действительно ли тетрапиррольные соединения присутствуют в продукте. Кроме того, при анализе продукта с помощью спектрофотометрического измерения можно обнаружить, что соединения имеют пик поглощения в пределах области длины волны, характерной для красителей. В большинстве случаев соединения, которые представляют собой красители, показывают симметричный пик, подобный наблюдаемому для хлорофилла, гема или фталоцианина. Подобные соединения-красители могут применяться в качестве фотокатализаторов или материалов-переносчиков электронов, в которых электроны переходят в возбужденное состояние при облучении их лучами света. Кроме того, они участвуют в окислительно-восстановительной (редокс) реакции, протекающей в водном растворе или через клеточную мембрану, и таким образом, можно считать, что они могут аналогичным путем функционировать в батарее.

Как было подробно описано выше, согласно настоящему изобретению, тетрапиррольные соединения и металлосодержащие тетрапиррольные соединения (комплексы), например, порфирины, такие как порфин, порфирин и порфириновый комплекс, могут быть получены с применением Escherichia coli и, таким образом, в данном способе никогда не потребуется использовать производственное оборудование и катализаторы, подбираемые в зависимости от вида целевых соединений, в отличие от их получения с помощью способов химического синтеза, при этом в первом способе не требуется применять какой-либо растворитель и, соответственно, практически исключено, что данный способ может неблагоприятно влиять на окружающую среду. Кроме того, не требуется добавлять какой-либо предшественник тетрапиррольного соединения, например, 5-аминолевулиновую кислоту, в питательную среду при культивировании Escherichia coli и, кроме того, достаточно выделить тетрапиррольные соединения, секретированные в среду культивирования, при этом нет необходимости выделять их из клеток бактерий. Другими словами, способ, применяемый в настоящем изобретении, не требует применения какого-либо специфического соединения и оборудования для культивирования Escherichia coli и выделения образующегося тетрапиррольного соединения и, соответственно, способ обеспечивает легкое получение тетрапиррольных соединений. Тетрапиррольные соединения, полученные таким образом, могут применяться в различных областях промышленности, таких как здравоохранение, пищевая и электронная промышленность.

В данном варианте осуществления способ настоящего изобретения также включает стадии введения в олиготрофную культуральную среду металла, способного превращаться в соответствующие ионы в вышеуказанной среде, или металлосодержащего соединения, способного диссоциировать на соответствующие ионы, а затем выделения тетрапиррольного соединения или комплекса, содержащего металл. Достаточно, чтобы такой металл обладал способностью превращаться в соответствующие ионы. Соединение, содержащее такой металл, растворимо в кислотном, щелочном или нейтральном водном растворе. Примеры вышеуказанных металлов включают, по меньшей мере, один металл, выбранный из группы, состоящей из золота (Au), меди (Cu), калия (K), марганца (Mn), цинка (Zn) и рутения (Ru). Кроме того, металл может быть добавлен в питательную среду в форме неорганического соединения металла или органического соединения металла. Примеры таких неорганических соединений металлов включают сульфаты, карбонаты, нитраты, тиосульфаты, оксиды, нитриды или галогениды вышеуказанных металлов. Кроме того, примеры вышеуказанных органических соединений металлов включают ауротиомалат натрия и малат цинка.

Как описано выше, введение в олиготрофную культуральную среду металла, способного превращаться в соответствующие ионы в среде культивирования, или металлосодержащего соединения, способного диссоциировать на соответствующие ионы, позволяет получать тетрапиррольное соединение или комплекс, имеющий специфическую окраску, которая может изменяться в зависимости от вида применяемого металла. Более конкретно, если бактериальные клетки Escherichia coli выращиваются в питательной среде, металл или соединение металла, включенные в бактериальные клетки Escherichia coli, превращаются в окрашенное соединение, цвет которого зависит от конкретного металла, включаемого в бактериальные клетки вследствие функционирования гена Escherichia coli. Затем соединение высвобождается из клеток в виде продукта и, таким образом, секретированное соединение может быть выделено из среды культивирования, и впоследствии применяться в качестве красителя. Чтобы получить соединение, имеющее желаемую окраску, достаточно правильно подобрать металл в зависимости от требуемого цвета, причем это, конечно, устраняет необходимость в разработке для каждого из рассматриваемых соединений новых способов, которые могут изменяться в зависимости от цветного тона, придаваемого соединениям, в отличие от получения таких соединений с помощью способов химического синтеза. К тому же, получаемые в результате соединения могут применяться в различных областях, например, в области фотокатализаторов и аккумуляторов света, включая также области, например, материалов оптической записи, материалов записи информации, материалов переноса электронов, полупроводниковых элементов и электродов.

Настоящее изобретение не ограничивается вариантами осуществления, описанными выше, и включает их различные вариации, не отступающие от сущности настоящего изобретения.

Далее настоящее изобретение описано со ссылкой на следующие примеры.

Пример 1

Вариант со вставкой, в который был встроен транспозон гена ypjD (b2611) (JD23504, доступный от National Bio-Resources), выращивали в 2 мл питательной среды LB (бакто-триптон: 1%, бакто-дрожжевой экстракт: 0,5%, NaCl: 0,5%) при 37°C в течение 12 часов. Затем 1 мл полученной клеточной суспензии добавляли к 500 мл водного раствора, приготовленного путем добавления 9 г KH₂PO₄, 21 г K₂HPO₄, 2 г (NH₄)₂SO₄, 1 г дигидрата лимонной кислоты, 3,6 г глюкозы и 200 мг MgSO₄ в 1 л деионизованной воды, после чего клетки подвергали основному культивированию при 37°C в течение 24 часов.

Культуральная жидкость, полученная таким образом, как установили, являлась бесцветной в начале основного культивирования, однако ее цвет постепенно становился розовым по истечении 24 часов. Указанную культуральную жидкость обрабатывали на центрифуге для осаждения клеток, присутствующих в ней, после чего полученный супернатант фильтровали через фильтр, имеющий размер пор 0,22 мкм. Затем полученный фильтрат пропускали через колонку с анионообменной смолой, и впоследствии культуру, адсорбированную на смоле, элюировали с использованием раствора 20% ацетонитрила-0,1% трифторуксусной кислоты в качестве элюента, а затем элюат лиофилизировали. Таким образом, получили продукт, окрашенный в розовый цвет.

Указанный продукт подвергали различным, выполняемым на аналитическом оборудовании анализам, как подробно описано ниже, и подтверждали, что продукт представлял собой тетрапиррольное соединение, имеющее структуру, показанную на фиг.1. Обозначения A-G, присутствующие на фиг.1, соответствуют отметкам, определяющим соответствующие пики спектра ¹³C-ЯМР, как показано на фиг.4 (на последующих фигурах они также показаны). Кроме того, продукт анализировали с помощью ЯМР-спектрометрии и подтверждали, что тетрапиррольное соединение совершенно точно присутствовало в продукте. Кроме того, присутствие калия (K) обнаруживали с помощью масс-спектрального анализа ICP (индуктивно связанной плазмы) и, таким образом, установили, что соединение было получено в форме соединения, ионно-связанного с K или в форме комплекса с ним. Кроме того, продукт также подвергали спектрофотометрическому анализу, и в результате было подтверждено, что в продукте наблюдался симметричный пик, включающий полосу Соре, специфичную для порфирина, как показано на фиг.2. На фиг.2 наблюдаются два пика при длинах волн 395 нм и 549 нм, соответственно. Это прямо указывает, что продукт является органическим красителем, несущим свободные электроны, способные подвергаться переносу.

Тетрапиррольное соединение, полученное выше, растворяли в различных растворителях (образец 1 и образец 2), полученные образцы подвергали двумерной ЯМР-спектрометрии (COSY, NOESY, HSQC, HMBC), с последующим анализом полученных спектров и структурным анализом соединения.

Относительно образца 1, его растворяли в CD₃OD, а затем полученный раствор подвергали ЯМР-спектроскопическому измерению в следующих условиях:

- используемый прибор: INOVA500 Model (Variant Company);

- резонансная частота: 499,8 МГц (¹H);

- стандарт: 3,31 м.д. (CD₂HOD, ¹H-ЯМР), 49,421 м.д. (CD₃OD, ¹³C-ЯМР);

- интегрирование: ¹H-ЯМР (16 раз); ¹³C-ЯМР (53428 раз); COSY (16 раз); NOESY (8 раз); HSQC (32 раза); HMBC (128 раз);

- другое условие: время смешивания в NOESY устанавливали на уровне 400 мс.

Кроме того, что касается образца 2, его растворяли в смешанном 90:10:0,1 CD₃CN/D₂O/CD₃COOD растворителе, а затем полученный раствор подвергали ЯМР-спектроскопическому измерению в следующих условиях:

- используемый прибор: INOVA500 Model (Variant Company;

- резонансная частота: 599,8 МГц (¹H);

- стандарт: 1,92 м.д. (CD₂HCN, ¹H), 1,28 м.д. (CD₃CN, ¹³C-ЯМР);

- интегрирование: ¹H-ЯМР (64 раза); ¹³C-ЯМР (50000 раз); COSY (16 раз); NOESY (16 раз); HSQC (32 раза); HMBC (128 раз);

- другое условие: время смешивания в NOESY устанавливали на уровне 400 мс.

Структурный анализ образца 1

Результаты ¹H-ЯМР спектрального анализа приведены на фиг.3 (растворитель: CD₃OD). В результате наблюдали сигналы при приблизительно 10,0-10,5 м.д. (d), приблизительно 4,3 м.д. (f), приблизительно 3,6 м.д. (g) и приблизительно 3,2 м.д. (e), которые, как предполагали, соответствовали предполагаемому компоненту. Отношение интенсивности сигналов, как установили, составляло приблизительно 1:2:3:2. Сигналы d-g идентичны сигналам, которые присутствуют на других фигурах.

Результаты ¹³C-ЯМР спектрального анализа приведены на Фиг. 4. Таким образом, предположили, что соединение являлось ароматическим из-за присутствия сигналов В и C.

В этой связи сигнал d, наблюдаемый в спектре ¹H-ЯМР, является характеристическим сигналом, который в данный момент не наблюдается в свете величины химического сдвига и, как предположили, он соответствовал порфириновому скелету, как кандидат, учитывая тот факт, что тестируемое соединение являлось ароматическим. Как описано ниже, при анализе результатов (фиг.5-9), полученных с помощью двумерной ЯМР-спектрометрии, при рассмотрении соединения как порфирин, результаты могут быть проанализированы без какого-либо противоречия. Кроме того, соединение, имеющее структуру, подобную анализируемой и показанной на фиг.1, описано в J. Org. Chem., 1999, Vol.164, № 21, pp.7973-7982, при этом величина химического сдвига, определенная с помощью ¹H-ЯМР спектрометрии, вполне соответствует значению, приведенному в статье. Таким образом, можно сделать корректный вывод, что соединение имеет структуру порфирина.

Далее подробно описан анализ спектра двумерного ЯМР.

Результаты спектрального анализа HSQC показаны на фиг.5. Спектрометрия HSQC представляет собой аналитический метод детектирования J¹ _CH. Результаты, полученные таким образом, также показаны на фиг.5. Что касается сигналов протонов, заглавные буквы соответствуют непосредственно связанным атомам углерода.

Результаты спектрометрического анализа COSY показаны на фиг.6. Спектрометрия COSY представляет собой аналитический метод детектирования спинового взаимодействия между ¹H-¹H. В результате анализа установили, что f и e вызвали спиновое взаимодействие, и предположили, что это могло соответствовать -CH₂-CH₂-X с высокой вероятностью при рассмотрении отношения интенсивности сигнала и величин химического сдвига для F и E. В данной связи, X представляет собой неидентифицированный компонент, структура которого еще не была выявлена.

Результаты спектрометрического анализа HMBC показаны на фиг.7. Спектрометрия HMBC представляет собой аналитический метод детектирования Jⁿ _CH (n = приблизительно 2-4), при этом данный метод дает гетероядерные корреляционные спектры удаленного взаимодействия. Анализ спектрограммы четко указывает присутствие таких корреляций, как (e, A), (e, B), (e, F), (g, B), (g, C), (f, A), (f, B), (f, C), (f, E). Данные корреляции никогда не противоречат предполагаемой структуре, как показано на фиг.1.

Результаты спектрометрического анализа NOESY показаны на фиг.8 и 9. Спектрометрия NOESY представляет собой аналитический метод детектирования присутствия обмена намагниченности и, соответственно, данный метод позволяет получить информацию относительно расстояния между ядерными спинами на основе сдвига намагниченности из-за кросс-релаксации. Анализ спектрограммы четко указывает присутствие таких ЯОЭ корреляций, как корреляции (g, e), (f, g), (f, e), (d, f), (d, e), (d, g). Указанные ЯОЭ корреляции четко поддерживают справедливость предполагаемой структуры, показанной на фиг.1.

Структурный анализ образца 2

Результаты ¹H-ЯМР спектрометрического анализа показаны на фиг.10, а результаты ¹³C-ЯМР спектрометрического анализа показаны на фиг.11 (растворитель: CD₃CN/D₂O/CD₃COOD=90:10:0,1). На фиг.10 сигналы, заключенные в два прямоугольника, соответствуют примесям. В результате сравнения со спектрами, наблюдаемыми для предыдущего образца 1, предположили, что структуры основных компонентов были идентичны друг другу. Это также подтверждалось аналитическими результатами соответствующих спектров COSY, NOESY, HSQC и HMBC.

На фиг.12 показана увеличенная спектрограмма NOESY, наблюдаемая для образца 2. Наблюдали расщепление d протона на четыре сигнала и, таким образом, данные сигналы обозначили числами d1-d4 в порядке от стороны слабого магнитного поля (в порядке возрастания). Корреляции ЯОЭ обобщены следующим образом:

- для и d1 и d4 наблюдали ЯОЭ корреляции и с метильной группой, и -CH₂-CH₂-X;

- для d2 наблюдали ЯОЭ корреляцию только с -CH₂-CH₂-X;

- для d3 наблюдали ЯОЭ корреляцию только с метильной группой.

Расположение боковых цепей, как показано на фиг.1, было объяснено на основе того факта, что какой-либо явной корреляции ЯОЭ между метильными группами или между группами -CH₂-CH₂-X, в дополнение к предшествующим ЯОЭ корреляциям, не наблюдали.

Относительно нумерации сигналов ¹³C и сигналов ¹H, их пронумеровали так, чтобы сигналы, наблюдаемые в приблизительно идентичной области, были пронумерованы в общей массе. Это обусловлено тем, что скелет порфирина содержит повторяющуюся структуру, и поэтому его детальное отнесение было весьма затруднительным. Что касается числа повторов, то наблюдали четыре пика, которые можно было отнести к метильной группе (g) и, соответственно, число повторов может составлять 4.

Согласно предыдущим исследованиям, может быть подтверждено, что соединение имело структуру, показанную на фиг.1, в свете аналитических результатов образцов 1 и 2. В данном отношении, впрочем, достаточно, что число соответствующих боковых цепей, а более конкретно, метильных групп и групп -CH₂-CH₂-X в сумме равнялось четырем, при этом положение каждой присоединенной боковой цепи может быть любым из 8 сайтов, как показано на фиг.1, и это не противоречит предыдущим данным. Таким образом, их положение не ограничивается показанным на фиг.1.

Затем исследовали часть, соответствующую X в группе -CH₂-CH₂-X.

Продукт, полученный в вышеописанных исследованиях, подвергали следующему анализу.

(1) Качественный анализ с помощью пиролитической ГХ/МС

Для удаления ТФУ и т.п. образец нагревали до 280°C в течение 10 минут в нагревательной печи, затем проводили термическое разложение при 600°C, а продукты разложения разделяли и анализировали с использованием газового хроматографа/масс-спектрографа (далее называемого "ГХ/МС"), как подробно описано ниже.

Название прибора

Прибор, доступный от Agilent Technologies под торговой маркой HP5973: оборудован масс-селективным детектором; и HP6890: газовый хроматограф;

Прибор, доступный от FRONTIER LAB под торговой маркой PY-2020iD: устройство для разложения типа нагревательной печи.

Анализируемый образец

Раствор (0,5 мл), полученный при добавлении 1 мл AcCN к 2 мг каждого образца, приливали в кювету для проб, а затем AcCN удаляли посредством продувки кюветы азотом.

(2) Анализ с помощью масс-спектрографа с ионизацией электрораспылением

Для исследования молекулярной массы компонентов, присутствующих в растворе, каждый образец анализировали с использованием масс-спектрографа с ионизацией электрораспылением (далее называемого "ESI-MS"), как подробно описано ниже.

Название прибора: Qstar (Applied Biosystems).

Вводимый растворитель: AcCN/0,05% водный раствор муравьиной кислоты (50/50).

Метод введения: анализируемый раствор непосредственно вводили с использованием 30 мкл петлевого дозатора.

Режим измерения: режим измерения положительных ионов.

Анализируемый раствор: небольшое количество раствора, полученного при добавлении 1 мл AcCN к 2 мг каждого образца, вносили во флакон, а затем разбавляли приблизительно до 100 м.д. растворителем для введения.

Результаты, полученные в предыдущем анализе ГХ/МС, показали, что в образце присутствовал диоксид углерода. Кроме того, как видно из результатов (см. фиг.14), полученных в предыдущем анализе ESI-MS, были обнаружены фрагментарные ионы, имеющие молекулярную массу 59 (4 пика), и, соответственно, было подтверждено, что фрагмент включал сложноэфирную этиловую группу или группу уксусной кислоты (группу пропионовой кислоты).

Кроме того, вышеуказанный продукт анализировали с помощью метода пиролитической ГХ/МС, и в результате его главный компонент, как обнаружили, являлся пиррольным соединением, как показано на фиг.15. Указанный факт мог быть подтвержден посредством сравнения масс-спектрометрических данных каждого компонента с базой данных, и в результате могло быть подтверждено, что продукт содержал кольцевую структуру пиррола в молекуле. Кроме того, относительно точной молекулярной массы, ее получили для иона, образованного в результате присоединения иона водорода к продукту, как показано на фиг.13, и, таким образом, молекулярная масса, как определили, составила 654,2682 (=655,2760-1,0078). Из вышеизложенного подтверждали, что продукт являлся порфириновым соединением, несущим на боковых цепях 4 сложноэфирных этиловых группы или группы уксусной кислоты (группы пропионовой кислоты), а также 4 метильных группы, имел молекулярную массу 654 и соответствовал следующей молекулярной формуле: C₃₆H₃₈O₈N₄, и что в центре порфиринового цикла отсутствует какой-либо переходный металл.

Пример 2

Бактериальные клетки, более конкретно клетки штаммов Escherichia coli, в которых транспозон гена ypjD (b2611) был встроен в ген штаммов (вариант со вставкой транспозона: JD23504, доступный от National Bio-Resources), подвергали прекультивированию в 2 мл питательной среды LB (включающей бакто-триптон: 1%, бакто-дрожжевой экстракт: 0,5% и NaCl: 0,5%) при температуре 37°С в течение 12 часов. Полученную суспензию клеток (1 мл) добавляли в водный раствор, полученный при растворении, в одном литре деионизованной воды, 20 мг MnCl₂, 1 г дигидрата лимонной кислоты, 3,6 г глюкозы и 100 мг MgSO₄, а затем бактериальные клетки подвергали основному культивированию при температуре 37°C в течение 24 часов.

Среда культивирования (культуральный раствор), как установили, являлась бесцветной при инициировании основного культивирования, однако через 24 часа среда культивирования приобретала красновато-коричневый цвет. Среду культивирования подвергали обработке в центрифуге, чтобы таким образом осадить бактериальные клетки, после чего полученный супернатант фильтровали через фильтр с размером пор 0,22 мкм. Затем фильтрат пропускали через колонку с анионообменной смолой, культивированные материалы, адсорбированные на смоле, элюировали с использованием элюирующего раствора, состоящего из водного раствора 20% ацетонитрила-0,1% трифторуксусной кислоты, а затем элюат лиофилизировали. Таким образом, получили продукт, окрашенный в красновато-коричневый цвет.

Кроме того, вышеуказанный продукт анализировали с помощью метода пиролитической ГХ/МС, и в результате главный компонент, как обнаружили, являлся пиррольным соединением, как показано на фиг.16. Указанный факт мог быть подтвержден посредством сравнения масс-спектрометрических данных каждого компонента с данными, приведенными в базе данных, и в результате могло быть подтверждено, что продукт содержал кольцевую структуру пиррола в молекуле. Кроме того, продукт дополнительно подвергали масс-спектрометрическому анализу методом ESI-MS, и определили, что данное соединение имело молекулярную массу 707 (см. данные, приведенные на фиг.17), при этом четыре фрагмента, каждый из которых имел молекулярную массу 59, обнаруживали при измерении с помощью тандемной масс-спектрометрии (см. данные, приведенные на фиг.18), в анализе с помощью метода пиролитической ГХ/МС обнаружили присутствие CO₂, как в примере 1, и соединение включало в общей сложности 4 сложноэфирные этиловые группы или ацетатные группы (пропионатные группы). На фиг.19 показана спектральная диаграмма поглощения, наблюдаемая для того же продукта, имеющего окрашивание с оттенком оранжевого цвета.

Кроме того, из результатов элементного анализа РФЭС (см. данные, приведенные на фиг.20) установили, что соединение содержало атом Mn. На основе результатов, полученных с помощью точного масс-спектрометрического анализа, описанного выше, подтверждали, что продукт данного примера являлся соединением, имеющим структуру порфиринового соединения, общую с продуктом примера 1, и, кроме того, подтверждали, что продукт данного примера являлся продуктом, полученным в примере 1, от которого отщеплены два центральных атома водорода и в котором трехвалентный ион Mn скоординирован в центре, на основе точного анализа различия в массе между массой продукта примера 1 (имеющего молекулярную массу 654,2682) и массой продукта данного примера (как можно увидеть из данных, приведенных на фиг.17, продукт имеет молекулярную массу 707,1905) (более конкретно, 654,2682 (молекулярная масса продукта примера 1)-1,0078×2 (атомный вес H×2)+54,9380 (атомный вес Mn)=707,1906).

На основе вышеизложенного, таким образом, подтверждали, что полученный продукт являлся порфириновым соединением, которое несет четыре группы -CH₂-CH₂-COOH (пропионатные группы) и четыре метильные группы на боковых цепях, и которое имеет молекулярную массу (молекулярную массу в ионизированном состоянии) 707 и которое представлено формулой (в ионизированной форме) [C ₃₆ H ₃₆ O ₈ N ₄∙Mn(III)]⁺.

Пример 3

Бактериальные клетки, более конкретно клетки штаммов Escherichia coli, в которых транспозон гена ypjD (b2611) был встроен в ген штаммов (вариант со вставкой транспозона: JD23504, доступный от National Bio-Resources), подвергали прекультивированию в 2 мл питательной среды LB (включающей бакто-триптон: 1%, бакто-дрожжевой экстракт: 0,5% и NaCl: 0,5%) при температуре 37°С в течение 12 часов. Полученную суспензию клеток (1 мл) добавляли в водный раствор, полученный при растворении, в одном литре деионизованной воды, 25 мг ауротиомалата натрия, 1 г дигидрата лимонной кислоты, 3,6 г глюкозы и 100 мг MgSO₄, а затем бактериальные клетки бактериальные клетки подвергали основному культивированию при температуре 37°C в течение 24 часов.

Среда культивирования, как установили, являлась бесцветной в начале основного культивирования, однако через 24 часа среда культивирования становилась желтой. Среду культивирования подвергали обработке в центрифуге, чтобы таким образом осадить бактериальные клетки, после чего полученный супернатант фильтровали через фильтр с размером пор 0,22 мкм. Затем фильтрат пропускали через колонку с анионообменной смолой, культивированные материалы, адсорбированные на смоле, элюировали с использованием элюирующего раствора, состоящего из водного раствора 20% ацетонитрила-0,1% трифторуксусной кислоты, а затем элюат лиофилизировали. Таким образом, получили продукт, окрашенный в желтый цвет. Полученный продукт подвергали масс-спектрометрическому анализу ICP, и в результате обнаружили, что продукт содержал металлическое золото (Au). Кроме того, данный продукт аналогично анализировали с помощью метода пиролитической ГХ/МС, и в результате подтверждали, что продукт главным образом включает пиррольное соединение, и что соединение включает структуру пиррольного кольца в молекуле.

Пример 4

Бактериальные клетки, более конкретно клетки штаммов Escherichia coli, в которых транспозон гена ypjD (b2611) был встроен в ген штаммов (вариант со вставкой транспозона: JD23504, доступный от National Bio-Resources), подвергали прекультивированию в 2 мл питательной среды LB (включающей бакто-триптон: 1%, бакто-дрожжевой экстракт: 0,5% и NaCl: 0,5%) при температуре 37°С в течение 12 часов. Полученную суспензию клеток (1 мл) добавляли в водный раствор, полученный при растворении, в одном литре деионизованной воды, 20 мг CuCl₂, 1 г дигидрата лимонной кислоты, 3,6 г глюкозы и 100 мг MgSO₄, а затем бактериальные клетки подвергали основному культивированию при температуре 37°C в течение 24 часов.

Среда культивирования, как установили, являлась бесцветной в начале основного культивирования, однако через 24 часа среда культивирования приобретала синевато-зеленый цвет. Среду культивирования подвергали обработке в центрифуге, чтобы таким образом осадить бактериальные клетки, после чего полученный супернатант фильтровали через фильтр с размером пор 0,22 мкм. Затем фильтрат пропускали через колонку с анионообменной смолой, культивированные материалы, адсорбированные на смоле, элюировали с использованием элюирующего раствора, состоящего из 20% ацетонитрила-0,1% водного раствора трифторуксусной кислоты, а затем элюат лиофилизировали. Таким образом, получили продукт, окрашенный в зеленый цвет. Полученный продукт подвергали масс-спектрометрическому анализу ICP, и в результате обнаружили, что продукт содержал металлическую медь (Cu). Кроме того, данный продукт аналогично анализировали с помощью метода пиролитической ГХ/МС, и в результате подтверждали, что продукт главным образом включает пиррольное соединение, и что соединение включает структуру пиррольного кольца в молекуле.

Пример 5

Бактериальные клетки, более конкретно клетки штаммов Escherichia coli, в которых транспозон гена ypjD (b2611) был встроен в ген штаммов (вариант со вставкой транспозона: JD23504, доступный от National Bio-Resources), подвергали прекультивированию в 2 мл питательной среды LB (включающей бакто-триптон: 1%, бакто-дрожжевой экстракт: 0,5% и NaCl: 0,5%) при температуре 37°С в течение 12 часов. Полученную суспензию клеток (1 мл) добавляли в водный раствор, полученный при растворении, в одном литре деионизованной воды, 17 мг ZnCl₂, 1 г дигидрата лимонной кислоты, 3,6 г глюкозы и 100 мг MgSO₄, а затем бактериальные клетки подвергали основному культивированию при температуре 37°C в течение 24 часов.

Среда культивирования, как установили, являлась бесцветной в начале основного культивирования, однако через 24 часа среда культивирования приобретала зеленый цвет с красноватым оттенком. Полученную среду культивирования обрабатывали согласно методике, аналогичной используемой в примере 1, и в результате получили продукт зеленого цвета.

Данный продукт, полученный в вышеуказанном культивировании, имеющий оттенок зеленого цвета, анализировали с помощью масс-спектрометрии согласно методике ВП-МС. В результате продукт, как определяли, представлял собой смесь, молекулярная масса которой находилась в пределах диапазона от 307 до 1294, как видно из данных, приведенных на фиг.21. Кроме того, продукт аналогично анализировали с помощью масс-спектрометрии ICP, и в результате, таким образом, подтверждали, что продукт содержал элементарный цинк. Как видно из спектрофотометрической кривой поглощения, приведенной на фиг.22, продукт показывает два пика при длинах волн 372 нм и 445 нм, соответственно. Кроме того, продукт также анализировали с помощью метода пиролитической ГХ/МС, и в результате подтверждали, что продукт главным образом включает пиррольное соединение, и что пиррольное соединение включает структуру пиррольного кольца в молекуле.

Пример 6

Бактериальные клетки, более конкретно клетки штаммов Escherichia coli, в которых транспозон гена ypjD (b2611) был встроен в ген штаммов (вариант со вставкой транспозона: JD23504, доступный от National Bio-Resources), подвергали прекультивированию в 2 мл питательной среды LB (включающей бакто-триптон: 1%, бакто-дрожжевой экстракт: 0,5% и NaCl: 0,5%) при температуре 37°С в течение 12 часов. Полученную суспензию клеток (1 мл) добавляли в водный раствор, полученный при растворении, в одном литре деионизованной воды, 10 мг RuCl₃, 1 г дигидрата лимонной кислоты, 3,6 г глюкозы и 100 мг MgSO₄, а затем бактериальные клетки подвергали основному культивированию при температуре 37°C в течение 24 часов.

Культуральная среда или культуральная жидкость, как установили, являлась бесцветной в начале основного культивирования, однако через 24 часа среда культивирования приобретала синевато-зеленый цвет. Культуральную жидкость подвергали обработке в центрифуге, чтобы таким образом осадить бактериальные клетки, после чего полученный супернатант фильтровали через фильтр с размером пор 0,22 мкм. Затем фильтрат пропускали через колонку с анионообменной смолой, культивированные материалы, адсорбированные на смоле, элюировали с использованием элюирующего раствора, состоящего из 20% ацетонитрила-0,1% водного раствора трифторуксусной кислоты, а затем элюат лиофилизировали. Таким образом, получили продукт, окрашенный в зеленый цвет. Полученный продукт подвергали масс-спектрометрическому анализу ICP, и в результате обнаружили, что продукт содержал металлический рутений (Рутений). Кроме того, данный продукт аналогично анализировали с помощью метода пиролитической ГХ/МС, и в результате подтверждали, что продукт главным образом включает пиррольное соединение, и что пиррольное соединение включает структуру пиррольного кольца в молекуле.

Промышленная применимость

Тетрапиррольное соединение, полученное согласно настоящему изобретению, может применяться в различных областях, например, в областях фотокатализаторов и аккумуляторов света, также включая области, например, материалов для оптической записи, материалов для записи информации, материалов переноса электронов, полупроводниковых элементов и электродов.

Краткое описание фигур

[Фиг.1] На фиг.1 показаны спектры в качестве результата масс-спектрометрического анализа с помощью метода ВП-МС, наблюдаемы для продукта, полученного в примере 1.

[Фиг.2] На фиг.2 показана структурная формула продукта, полученного в примере 1.

[Фиг.3] На фиг.3 показаны спектры ¹H-ЯМР, наблюдаемые для Образца 1, полученного в примере 1.

[Фиг.4] На фиг.4 показаны спектры ¹³C-ЯМР, наблюдаемые для образца 1, полученного в примере 1.

[Фиг.5] На фиг.5 показаны спектры HSQC, наблюдаемые для образца 1, полученного в примере 1.

[Фиг.6] На фиг.6 показаны спектры COSY, наблюдаемые для образца 1, полученного в примере 1.

[Фиг.7] На фиг.7 показаны спектры HMBC, наблюдаемые для образца 1, полученного в примере 1.

[Фиг.8] На фиг.8 показаны спектры NOESY, наблюдаемые для образца 1, полученного в примере 1.

[Фиг.9] На фиг.9 показаны спектры NOESY, наблюдаемые для образца 1, полученного в примере 1.

[Фиг.10] На фиг.10 показаны спектры ¹H-ЯМР, наблюдаемые для образца 2, полученного в примере 1.

[Фиг.11] На фиг.11 показаны спектры ¹³C-ЯМР, наблюдаемые для образца 2, полученного в примере 1.

[Фиг.12] На фиг.12 показаны увеличенные спектры NOESY, наблюдаемые для образца 2, полученного в примере 1.

[Фиг.13] На фиг.13 показаны спектры, иллюстрирующие относительное содержание, наблюдаемое для образца 2, полученного в примере 1.

[Фиг.14] На фиг.14 показаны результаты анализа, выполненного согласно ESI-MS.

[Фиг.15] На фиг.15 показаны результаты анализа продукта, полученного в примере 1, который выполнен с помощью пиролитической ГХ/МС.

[Фиг.16] На фиг.16 показаны результаты анализа продукта, полученного в примере 2, который выполнен с помощью пиролитической ГХ/МС.

[Фиг.17] На фиг.17 показаны результаты анализа продукта, полученного в примере 2, который выполнен с помощью масс-спектрометрического анализа ESI-MS.

[Фиг.18] На фиг.18 показаны результаты анализа продукта, полученного в примере 2, который выполнен с помощью тандемной масс-спектрометрии.

[Фиг.19] На фиг.19 показана спектрофотометрическая спектрограмма поглощения, наблюдаемая для продукта, полученного в примере 2.

[Фиг.20] На фиг.20 показаны результаты анализа продукта, полученного в примере 2, который выполнен с помощью элементного анализа РФЭС.

[Фиг.21] На фиг.21 показан масс-спектр (ВП-МС), наблюдаемый для культивированного продукта с зеленым оттенком, полученного в примере 5.

[Фиг.22] На фиг.22 показана спектрофотометрическая кривая поглощения, наблюдаемая для продукта с зеленым оттенком, полученного в примере 5.

Предложены варианты способа получения тетрапиррольного соединения и бактериальная клетка для его получения. Способ предусматривает выращивание бактериальных клеток Escherichia coli в среде культивирования с получением целевого соединения из среды культивирования. При этом указанное соединение имеет структуру порфиринового кольца, несущее 4 метильные группы и 4 сложноэфирные этиловые группы или пропионатные группы на порфириновом кольце. E. coli выбирают из группы, состоящей из E. coli K12, E. coli BL21, E. coli JD23504, которые не способны экспрессировать ген ypjD (b2611) в результате вставки транспозона гена ypjD (b2611) в ген клетки E. coli. При осуществлении варианта способа используют среду культивирования, включающую элементарные Mn, Au, Cu, Zn или Ru, способные превращаться в соответствующие ионы в среде культивирования, или Mn-содержащее, Au-содержащее, Cu-содержащее, Zn-содержащее, Ru-содержащее соединение, способное диссоциировать на соответствующие ионы в среде культивирования. Образовавшееся в результате сбора или выделения из среды культивирования тетрапиррольное соединение имеет структуру порфиринового кольца, в центре которого скоординированы Mn, Au, Cu, Zn или Ru. Изобретение позволяет получить тетрапиррольное соединение без применения его предшественника. 3 н. и 1 з.п. ф-лы, 22 ил., 6 пр.

1. Способ получения тетрапиррольного соединения, которое несет четыре метильные группы и четыре сложноэфирные этиловые группы или пропионатные группы на порфириновом кольце, отличающийся тем, что бактериальные клетки Escherichia coli, выбранные из группы, состоящей из Escherichia coli K12, Escherichia coli BL21, Escherichia coli JD23504, и не способные экспрессировать ген ypjD (b2611) в результате вставки транспозона гена ypjD (b2611) в ген клетки Escherichia coli, выращивают в среде культивирования и что образовавшееся в результате тетрапиррольное соединение, имеющее структуру порфиринового кольца, которое несет четыре метильные группы и четыре сложноэфирные этиловые группы или пропионатные группы на порфириновом кольце, получают из среды культивирования.

2. Способ получения тетрапиррольного соединения по п.1, включающий стадии добавления в среду культивирования металла, способного превращаться в соответствующие ионы в среде культивирования, или металлосодержащего соединения, способного диссоциировать на соответствующие ионы в среде культивирования, в качестве сырья, а затем сбора или выделения образовавшегося в результате тетрапиррольного соединения, содержащего металл.

3. Способ получения тетрапиррольного соединения, которое несет четыре метильные группы и четыре сложноэфирные этиловые группы или пропионатные группы на порфириновом кольце, отличающийся тем, что он включает стадии культивирования бактериальных клеток Escherichia coli, выбранных из группы, состоящей из Escherichia coli K12, Escherichia coli BL21, Escherichia coli JD23504, и не способных экспрессировать ген ypjD (b2611) в результате вставки транспозона гена ypjD (b2611) в ген клетки Escherichia coli в среде культивирования, которая включает, в качестве сырья, элементарный Mn, Au, Cu, Zn или Ru, способные превращаться в соответствующие ионы в среде культивирования, или Mn-содержащее, Au-содержащее, Cu-содержащее, Zn-содержащее, Ru-содержащее соединение, способные диссоциировать на соответствующие ионы в среде культивирования, а затем сбора или выделения из среды культивирования образовавшегося в результате тетрапиррольного соединения, имеющего структуру порфиринового кольца, в центре которого скоординированы Mn, Au, Cu, Zn или Ru.

4. Бактериальная клетка, которая представляет собой Escherichia coli, для получения тетрапиррольного соединения, которое несет четыре метильные группы и четыре сложноэфирные этиловые группы или пропионатные группы на порфириновом кольце, отличающаяся тем, что клетка Escherichia coli, выбранная из группы, состоящей из Escherichia coli K12, Escherichia coli BL21, Escherichia coli JD23504, и не способная экспрессировать ген ypjD (b2611) вследствие изменчивости его в результате вставки транспозона гена ypjD (b2611) в ген клетки Escherichia coli, и тетрапиррольное соединение имеет структуру порфиринового кольца, которое несет четыре метильные группы и четыре сложноэфирные этиловые группы или пропионатные группы на порфириновом кольце, и в центре порфиринового кольца отсутствует металл.