Способ стимуляции выработки гранулоцитарного колониестимулирующего фактора клетками костного мозга in vitro Российский патент 2022 года по МПК C12N5/71 C12N9/99 C07K14/535 

Изобретение относится к области экспериментальной биологии и медицины, и касается способа стимуляции выработки гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (Г-КСФ) in vitro.

Наиболее близким по технической сущности, механизму действия и достигаемому результату является способ стимуляции выработки гранулоцитарного колониестимулирующего фактора in vitro прилипающими клетками костного мозга с помощью ингибитора протеинкиназы р38, который добавляют в концентрации 300 мкМ в культуру ткани и инкубируют при 37°С, 5% СO₂ и 100% влажности воздуха в течение 24 часов [1]. Указанный способ выбран в качестве прототипа.

Недостатком данного способа является его низкая эффективность.

Задачей, решаемой данным изобретением, является повышение эффективности способа.

Поставленная задача достигается тем, что in vitro культивируют моноцитарную фракцию (СD11b⁺Lу-6G^-) клеток костного мозга в СО₂-инкубаторе при 37°С, 5% СО₂ и 100% влажности воздуха в течение 24 часов в полной культуральной среде следующего состава: 90% среды RPMI-1640, 10% ЭТС, 280 мг/л L-глутамина, 50 мг/л гентамицина, при добавлении ингибитора C-Jun N-terminal kinase (JNK).

Новым в предлагаемом изобретении является использование в качестве стимулятора выработки гранулоцитарного колониестимулирующего фактора CD11b⁺Ly-6G^- клетками костного мозга ингибитора JNK.

На сегодняшний день из большого разнообразия фармакологических веществ, применяемых для стимуляции гемопоэза [2, 3], наиболее широко используются препараты на основе ростовых факторов (эритропоэтин и колониестимулирующие факторы), взаимодействующих со специфическими рецепторами кроветворных клеток. Недостатком данных средств является достаточно высокий риск развития при их применении побочных эффектов и осложнений, связанных с плейотропностью и полифунцкиональностью цито-кинов, а также их иммуногенностью, обусловленной белковой природой указанных регуляторов физиологических функций [4-8].

Выявленные ранее в НИИФиРМ им. Е.Д. Гольдберга (Томский НИМЦ) особенности внутриклеточного сигналинга в прогениторных клетках различного класса позволили предложить «Стратегию фармакологической регуляции внутриклеточной сигнальной трансдукции в регенераторно-компетентных клетках» [8], предполагающую использование в качестве мишеней отдельных внутриклеточных сигнальных молекул клеток-предшественников и элементов микроокружения, опосредовано влияющих на течение ре-паративных процессов, в том числе за счет выработки ростовых факторов. При этом для разработки лекарственных препаратов с подобным таргетным действием [4, 6], исследование секреции Г-КСФ в системе in vitro представляет собой основу методологии создания средств с гемостимулирующей активностью в отношении гранулоцитарного ростка кроветворения [3].

Известен ряд сигнальных молекул, участвующих в реализации функциональной, в том числе секреторной, активности некоторых клеток костного мозга [8, 9]. Однако участие и роль C-Jun N-terminal kinase (JNK) в продукции гранулоцитарного колониестимулирующего фактора CD11b⁺Ly-6G^- клетками костного мозга до сих пор не известна.

Факт использования моноцитарной фракции CD11b⁺Ly-6G^- клеток костного мозга при добавлении в культуральную среду ингибиторов JNK с достижением нового технического результата, заключающегося в эффективной стимуляции выработки Г-КСФ in vitro, для специалиста является неочевидным. Эксперимент показал непредсказуемые результаты.

Новые свойства не вытекают явным образом из уровня техники в данной области. Идентичной совокупности признаков не обнаружено при исследовании уровня техники по патентной и научно-медицинской литературе.

Предлагаемое изобретение может быть использовано в экспериментальной биологии и медицине.

Исходя из вышеизложенного, следует считать заявляемое техническое решение соответствующим критериям: «Новизна», «Изобретательский уровень», «Промышленная применимость».

Способ осуществляют следующим образом:

Взвесь клеток костного мозга мышей (5×10⁶ клеток/мл) разделяют по фенотипу с использованием иммуномагнитного сортера "EasySep" (производства "STEMMCELL", США) методом негативной селекции, используя Mouse Monocyte Enrichment Kit, выделяя CD11b+Ly-6G^- клетки согласно методическим указаниям производителя. Полученные CD11b⁺Ly-6G^- клетки инкубируются в полной культуральной среде следующего состава: 90% среды RPMI-1640, 10% ЭТС, 280 мг/л L-глутамина, 50 мг/л гентамицина, при добавлении ингибиторов JNK в эффективной концентрации в СО₂-инкубаторе при 37°С, 5% СО₂ и 100% влажности воздуха в течение 24 часов. По окончании инкубации кондиционные среды после центрифугирования при 1500 об/мин в течение 10 минут собирают с помощью пипетки.

Предлагаемый способ был изучен в экспериментах на мышах-самцах линии С57 ВI/6 в количестве 16 шт., массой 20-22 г. Животные получены из отдела экспериментальных биологических моделей НИИФиРМ им. Е.Д. Гольдберга Томского НИМЦ. Исследования проводили в соответствии с правилами лабораторной практики (GLP), Приказом МЗСР РФ №708н от 23.08.2010 «Об утверждении правил лабораторной практики».

Пример 1.

Разделение клеток костного мозга по фенотипу проводили иммуномагнитным сор-тером "EasySep" (производства "STEMMCELL", США) методом негативной селекции, используя Mouse Monocyte Enrichment Kit (CD11b⁺Ly-6G^- Cells) согласно методическим указаниям производителя.

Суспензию костномозговых клеток, полученную в стерильных условиях (боксе, оборудованном ламинаром), разделяли по фенотипу с использованием иммуномагнитного сортера "EasySep" (производства "STEMMCELL", США) методом негативной селекции, используя Mouse Monocyte Enrichment Kit (CD11b⁺Ly-6G^- Cells) согласно методическим указаниям производителя. Выделенные CD11b⁺y-6G^- клетки инкубировались в течение 24 часов в полной культуральной среде следующего состава: 90% среды RPMI-1640 («Sigma», США), 10% ЭТС («Sigma», США), 280 мг/л L-глутамина («Sigma», США), 50 мг/л гентамицина («Sigma», США), с добавлением 10 мкМ ингибитора JNK «SP600125» (InvivoGen», США), либо 20 мкМ ингибитора JNK «IQ-1S» (Tocris Bioscience, США), при 37°С, 5% СO₂ и 100% влажности.

Концентрации ингибиторов JNK «SP600125» в 10 мкМ и «IQ-1S» в 20 мкМ были отобраны в предварительных экспериментах в качестве наиболее эффективных.

Контролем служили культуры клеток без добавления ингибитора JNK и способ прототип [1]. Выработка гранулоцитарного колониестимулирующего фактора способа прототипа являлась критерием эффективности предлагаемого изобретения.

По способу прототипу: суспензию костномозговых клеток, полученную в стерильных условиях (боксе, оборудованном ламинаром), инкубировали в течение 45 мин в среде RPMI-1640 ("Sigma", США), содержащей 10% ЭТС («Sigma», США), в 35 мм пластиковых чашках Петри («Corning», США) в течение 40-50 мин при 37°С, 5% СO₂ и 100% влажности для выделения прилипающей фракции миелокариоцитов. После чего с помощью пипетки собирали и удаляли неприлипающие миелокариоциты, а полученные прилипающие клетки (в концентрации 2×10⁶ клеток/мл) инкубировали в течение 24 часов в полной куль-туральной среде: 90% среды RPMI-1640 («Sigma», США), 10% ЭТС («Sigma», США), 280 мг/л L-глутамина («Sigma», США), 50 мг/л гентамицина («Sigma», США), с добавлением ингибитора протеинкиназы р38 «SB203580» (Calbiochem, США) в концентрации 300 мкМ, при 37°С, 5% СO₂ и 100% влажности.

По окончании инкубации собирали кондиционные среды (супернатанты) и определяли в них уровень содержания гранулоцитарного колониестимулирующего фактора методом ИФА, с помощью набора фирмы «R&D Systems» (USA) согласно методическим указаниям производителя.

В ходе эксперимента показано, что добавление любого из используемых ингибиторов JNK в культуру прилипающих клеток костного мозга, либо моноцитарной фракции СD11b⁺Lу-6G^- клеток значительно повышало уровень содержания Г-КСФ в кондиционных средах. При этом увеличение данного параметра регистрировалось как в сравнении с таковым в кондиционных средах, полученных от прилипающих клеток костного мозга без ингибиторов, так и в отношении аналогичного показателя при добавлении в культуру прилипающих миелокариоцитов ингибитора протеинкиназы р38 (по способу прототипу) (табл.).

Полученные результаты свидетельствуют о важной роли C-Jun N-terminal kinase-опосредованного сигналинга в регуляции секреторной функции стромальных элементов гемопоэзиндуцирующего микроокружения [2, 3]. При этом блокада JNK в прилипающих клетках костного мозга, а также непосредственно в СD11b⁺Lу-6G^- клетках в условиях in vitro сопровождалась выраженной стимуляцией продукции ими гранулоцитарного колониестимулирующего фактора.

Предлагаемый в качестве изобретения способ позволяет эффективно стимулировать выработку Г-КСФ клетками костного мозга in vitro.

Цитируемая литература:

1. Патент (RU) на изобретение №2527888 от 14.06.2014 г. Способ стимуляции выработки гранулоцитарного колониестимулирующего фактора клетками костного мозга in vitro. Авторы: Дыгай A.M., Жданов В.В., Зюзьков Г.Н., Мирошниченко Л.А., Удут Е.В., Симанина Е.В., Ставрова Л.А., Чайковский А.В., Хричкова Т.Ю., Бурмина Я.В.

2. Дыгай А.М., Жданов В.В. Гранулоцитарный колониестимулирующий фактор. Фармакологические аспекты. Москва, 2009, с. 18-19.

3. Дыгай А.М., Жданов В.В., Гольдберг В.Е., Зюзьков Г.Н., Удут Е.В., Хричкова Т.Ю., Симанина Е.В., Мирошниченко Л.А., Ставрова Л.А. Методические рекомендации по изучению гемостимулирующей активности фармакологических веществ // Руководство по проведению доклинических исследований новых лекарственных средств. Часть первая / Под ред. А.Н. Миронова. - М.: Гриф и К, 2013. - С. 759-766 (944 с.).

4. Жданов В.В., Мирошниченко Л.А., Удут Е.В., Полякова Т.Ю., Зюзьков Г.Н., Симанина Е.В., Шерстобоев Е.Ю., Ставрова Л.А., Агафонов В.И., Минакова М.Ю., Дыгай A.M. Роль сигнальных молекул в регуляции гранулоцитопопэза при стрессиндуцирующем воздействии // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2018. Т. 166, №9. С. 315-319.

5. Grimberg A. Mechanisms by which IGF-I may promote cancer. // Cancer Biol Ther, 2003, 2, P. 630-635.

6. Dygai A.M., Zhdanov V.V., Zyuzkov G.N., Udut E.V., Miroshnichenko L.A., Simanina E.V., Chaikovskii A.V., Stavrova L.A., Danilets M.G. Role of NF-κВ-dependent signaling and p38 mapk signaling pathway in the control of hemopoiesis during cytostatic administration // Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 2014. T. 157. №1. C. 32-36.

7. Зюзьков Г.Н., Жданов B.B., Удут E.B., Мирошниченко Л.А., Симанина Е.В., Полякова Т.Ю., Ставрова Л.А., Удут В.В., Минакова М.Ю., Дыгай A.M. Участие JAK1, JAK2 и JAK3 в стимуляции функций мезенхимных клеток-предшественников фактором роста фибробластов // Бюл. эксперим. биол. и медицины, 2016.- №8. - С. 206-209.

8. Зюзьков Г.Н., Жданов В.В., Удут Е.В., Мирошниченко Л.А., Полякова Т.Ю., Ставрова Л.А., Удут В.В. Стратегия фармакологической регуляции внутриклеточной сигнальной трансдукции в регенераторно-компетентных клетках // Бюл. эксперим. биол. и медицины, 2018.- №10. - С. 435-445.

9. Зюзьков Г.Н., Суслов Н.И., Поветьева Т.Н., Нестерова Ю.В., Удут Е.В., Мирошниченко Л.А., Полякова Т.Ю., Афанасьева О.Г., Жданов В.В. Механизмы церебропротекторного действия ингибитора C-Jun N-terminal kinase (JNK) // Экспериментальная и клиническая фармакология, 2017. - Том 80. - №6. - С. 14.

Изобретение относится к области экспериментальной биологии и медицины и касается способа стимуляции выработки гранулоцитарного колониестимулирующего фактора in vitro. Сущность способа: CD11b⁺Ly-6G^- клетки костного мозга культивируют в СО₂-инкубаторе при 37°С, 5% СО₂ и 100% влажности воздуха в течение 24 часов в культуральной среде, содержащей 90% RPMI-1640, 10% ЭТС, 280 мг/л L-глутамина, 50 мг/л гентамицина и ингибитор C-Jun N-terminal kinase (JNK) в эффективной концентрации. Использование изобретения - обеспечивает повышение эффективности способа. Предлагаемый способ позволяет эффективно стимулировать выработку гранулоцитарного колониестимулирующего фактора клетками костного мозга in vitro. 1 табл., 1 пр.

Способ стимуляции выработки гранулоцитарного колониестимулирующего фактора клетками костного мозга in vitro, заключающийся в культивировании CD11b⁺Ly-6G^- клеток костного мозга в СО₂-инкубаторе при 37°С, 5% СО₂ и 100% влажности воздуха в течение 24 часов в среде, содержащей 90% RPMI-1640, 10% ЭТС, 280 мг/л L-глутамина, 50 мг/л гентамицина, с добавлением стимулятора, отличающийся тем, что в качестве стимулятора используют ингибитор C-Jun N-terminal kinase JNK в эффективной концентрации.