Способ стимуляции выработки эритропоэтина клетками костного мозга in vitro Российский патент 2017 года по МПК G01N33/68 

Изобретение относится к области экспериментальной биологии и медицины и касается способа стимуляции выработки эритропоэтина in vitro.

Существуют разные способы стимуляции выработки цитокинов, в том числе эритропоэтина, различными клетками костного мозга [1, 3].

Известен способ стимуляции выработки эритропоэтина неприлипающими клетками костного мозга in vitro с помощью ингибитора протеинкиназы р38, который добавляют в концентрации 300 мкМ в культуру ткани и инкубируют при 37°С, 5% СО₂ и 100% влажности воздуха в течение 24 часов [5]. Данный способ является наиболее близким по технической сущности, механизму действия и достигаемому результату к заявляемому и выбран в качестве прототипа.

Недостатком данного способа является его недостаточная эффективность.

Задачей, решаемой данным изобретением, является повышение эффективности способа.

Поставленная задача достигается тем, что in vitro культивируют фракцию CD4+ (cluster designation 4-положительные)-клеток костного мозга в СО₂-инкубаторе при 37°С, 5% СО₂ и 100% влажности воздуха в течение 24 часов в полной культуральной среде следующего состава: 90% среды RPMI-1640, 10% ЭТС, 280 мг/л L-глутамина, 50 мг/л гентамицина, при добавлении ингибитора фосфатидилинозитол-3-киназы (PI3K) в концентрации 50 мкМ (микромоль).

Новым в предлагаемом изобретении является использование в качестве клеток костного мозга, вырабатывающих эритропоэтин, фракции CD4+-клеток костного мозга и использование ингибитора PI3K в качестве стимулятора продукции эритропоэтина.

На сегодняшний день среди различных фармакологических средств, применяемых в качестве гемостимуляторов [3], наиболее широко используются препараты на основе эндогенных стимуляторов кроветворения (эритропоэтин и колониестимулирующие факторы), которые, связываясь со специфическими рецепторами, запускают многочисленные сигнальные механизмы, участвующие в реализации ключевых функций клетки - дифференцировки, пролиферации, старения, опухолевой трансформации [2, 4, 6-8]. Особого внимания заслуживают препараты на основе рекомбинантного эритропоэтина [1, 3]. Для разработки лекарственных препаратов с таргетным действием для модуляции выработки эндогенных гемопоэтинов путем активации/ингибирования внутриклеточного сигналинга [4, 6] в рамках разрабатываемой в НИИФиРМ им. Е.Д. Гольдберга (Томский НИМЦ) «Стратегии фармакологической регуляции внутриклеточной сигнальной трансдукции в регенераторно-компетентных клетках» [4] исследование синтеза данного гемопоэтина в системе in vitro является основой методологии создания средств с эритропоэзстимулирующей активностью [1]. В связи с этим разработка эффективных способов продукции эритропоэтина с помощью модификаторов активности внутриклеточного сигналинга представляется актуальной.

Известен ряд сигнальных молекул, участвующих в определении функциональной, в том числе секреторной, активности некоторых клеток костного мозга [2, 5-8]. Однако участие и роль фосфатидилинозитол-3-киназы (PI3K) в продукции эритропоэтина CD4+-клетками костного мозга, представляющими собой отдельную фракцию неприлипающих миелокариоцитов (преимущественно Т-лимфоциты) [1, 3], до сих пор не изучены.

Факт использования фракции CD4+-клеток костного мозга при добавлении в культуральную среду ингибитора PI3K с достижением нового технического результата, заключающегося в эффективной стимуляции выработки эритропоэтина in vitro, для специалиста является неочевидным. Эксперимент показал непредсказуемые результаты.

Новые свойства не вытекают явным образом из уровня техники в данной области. Идентичной совокупности признаков не обнаружено при исследовании уровня техники по патентной и научно-медицинской литературе.

Предлагаемое изобретение может быть использовано в экспериментальной биологии и медицине.

Исходя из вышеизложенного следует считать заявляемое техническое решение соответствующим критериям: «Новизна», «Изобретательский уровень», «Промышленная применимость».

Способ осуществляют следующим образом.

Из клеток костного мозга выделяют CD4+-клетки, которые (в концентрации 2⋅10⁶ клеток/мл) инкубируются в полной культуральной среде следующего состава: 90% среды RPMI-1640, 10% ЭТС, 280 мг/л L-глутамина, 50 мг/л гентамицина, 50 мкМ ингибитора PI3K, в СO₂-инкубаторе при 37°С, 5% СO₂ и 100% влажности воздуха в течение 24 часов. По окончании инкубации кондиционные среды после центрифугирования при 1500 об/мин в течение 10 минут собирают с помощью пипетки.

Предлагаемый способ был изучен в экспериментах на мышах-самцах линии C57BI/6JY в количестве 14 шт., массой 20-22 г. Животные получены из отдела экспериментальных биологических моделей НИИФиРМ им. Е.Д. Гольдберга Томского НИМЦ. Исследования проводили в соответствии с правилами лабораторной практики (GLP), Приказом МЗСР РФ №708н от 23.08.2010 «Об утверждении правил лабораторной практики».

Пример 1

Суспензию костномозговых клеток, полученную в стерильных условиях (боксе, оборудованном ламинаром), разделяли по фенотипу иммуномагнитным сортером "EasySep" (производства "STEMMCELL", США) методом негативной селекции, используя Mouse Naive CD4+ Т Cell Isolation Kit (производства "STEMMCELL", США) согласно методическим указаниям производителя. Полученные СD4+-клетки (в концентрации 2⋅10⁶ клеток/мл) инкубировали в течение 24 часов в полной культуральной среде следующего состава: 90% среды RPMI-1640 («Sigma», США), 10% ЭТС («Sigma», США), 280 мг/л L-глутамина («Sigma», США), 50 мг/л гентамицина («Sigma», США) и 50 мкМ ингибитора PI3K («Calbiochem», США), при 37°С, 5% СO₂ и 100% влажности [1]. Концентрация ингибитора PI3K («Calbiochem», США) в 50 мкМ была отобрана в предварительных экспериментах в качестве наиболее эффективной.

Контролями №1 и №2 служили СD4+-клетки и неприлипающие клетки костного мозга соответственно, а группами сравнения: способ прототип - культивирование неприлипающих клеток костного мозга при добавлении ингибитора протеинкиназы р38 в концентрации 300 мкМ, и неприлипающие клетки костного мозга при добавлении 50 мкМ ингибитора PI3K.

Для получения неприлипающих клеток костного мозга для контроля №2 и способа прототипа суспензию костномозговых клеток, полученную в стерильных условиях (боксе, оборудованном ламинаром), инкубировали в течение 45 мин в среде RPMI-1640 («Sigma», США), содержащей 10% ЭТС («Sigma», США), в 90 мм пластиковых чашках Петри («Corning», США) диаметром 35 мм в течение 40-50 мин при 37°С, 5% СO₂ и 100% влажности для выделения неадгезирующей (неприлипающей) фракции миелокариоцитов [2]. После чего с помощью пипетки собирали неприлипающие миелокариоциты, которые (в концентрации 2⋅10⁶ клеток/мл) инкубировались в течение 24 часов в полной культуральной среде вышеописанного состава с добавлением или без добавления соответствующих ингибиторов.

При культивировании клеток в контроле и группах сравнения использовали аналогичную предлагаемому изобретению технику [2, 3].

По окончании инкубации кондиционные среды собирали с помощью пипетки и определяли в них уровень эритропоэтина методом ИФА с помощью набора фирмы «R&D systems» (США) согласно методическим указаниям фирмы-производителя.

В ходе эксперимента показано, что добавление ингибитора PI3K в культуру СD4+-клеток костного мозга значительно повышало уровень содержания эритропоэтина в кондиционных средах по сравнению с таковым в кондиционных средах: полученных от CD4+ и неприлипающих клеток костного мозга без ингибитора; а также при добавлении в культуру неприлипающих миелокариоцитов ингибитора протеинкиназы р38 (по способу прототипу) и PI3K (табл.).

Полученные результаты свидетельствуют о важной роли PI3K в реализации секреторной функции CD4+-клеток, представляющих собой мобильные элементы гемопоэзиндуцирующего микроокружения (преимущественно Т-лимфоциты) [1, 3]. При этом добавление в культуру ингибитора PI3K приводит к выраженной стимуляции продукции эритропоэтина CD4+-клетками костного мозга.

Предлагаемый в качестве изобретения способ позволяет эффективно стимулировать выработку эритропоэтина клетками костного мозга in vitro.

Источники информации

1. Дыгай A.M., Жданов В.В., Гольдберг В.Е., Зюзьков Г.Н., Удут Е.В., Хричкова Т.Ю., Симанина Е.В., Мирошниченко Л.А., Ставрова Л.А. Методические рекомендации по изучению гемостимулирующей активности фармакологических веществ // Руководство по проведению доклинических исследований новых лекарственных средств. Часть первая / Под ред. А.Н. Миронова. М.: Гриф и К, 2013. С. 759-766 (944 с.).

2. Дыгай A.M., Жданов В.В., Мирошниченко Л.А., Удут Е.В., Зюзьков Г.Н., Симанина Е.В., Чайковский А.В., Ставрова Л.А., Трофимова Е.С., Бурмина Я.В. Участие сигнальных каскадов в регуляции эритропоэза при цитостатическом воздействии// Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2014. №9. С. 282-286.

3. Дыгай A.M., Жданов В.В., Удут Е.В. Фармакологическая регуляция эритропоэза. Москва, 2009.

4. Зюзьков Г.Н., Жданов В.В., Удут Е.В., Мирошниченко Л.А., Симанина Е.В., Полякова Т.Ю., Ставрова Л.А., Удут В.В., Минакова М.Ю., Дыгай A.M. Участие JAK1, JAK2 и JAK3 в стимуляции функций мезенхимных клеток-предшественников фактором роста фибробластов // Бюл. эксперим. биол. и медицины, 2016. №8. С. 206-209.8

5. Патент (RU) на изобретение №2589288 от 08.06.2016 г. Способ стимуляции выработки эритропоэтина в культуре клеток in vitro. Авторы: Дыгай A.M., Жданов В.В., Зюзьков Г.Н., Мирошниченко Л.А., Удут Е.В., Хричкова Т.Ю., Симанина Е.В., Шерстобоев Е.Ю., Агафонов В.И., Бурмина Я.В., Минакова М.Ю.

6. Dygai A.M., Zhdanov V.V., Zyuzkov G.N., Udut E.V., Miroshnichenko L.A., Simanina E.V., Chaikovskii A.V., Stavrova L.A., Danilets M.G. Role of NF-κB-dependent signaling and p38 mapk signaling pathway in the control of hemopoiesis during cytostatic administration // Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 2014. T. 157. №1. C. 32-36.

7. Grimberg A. Mechanisms by which IGF-I may promote cancer. // Cancer Biol Ther, 2003, 2, P. 630-635.

8. Whitmarsh A.J., Cavanagh J., Tournier C. et al. A mammalian scaffold complex that selectively mediates MAP kinase activation // Science. 1998, 281, p. 1671-1674.

Изобретение относится к экспериментальной биологии и медицине и касается способа стимуляции выработки эритропоэтина клетками костного мозга in vitro. Для этого CD4+-клетки костного мозга культивируют в СO₂-инкубаторе при 37°С, 5% СО₂ и 100% влажности воздуха в течение 24 часов. Инкубацию осуществляют в культуральной среде следующего состава: 90% среды RPMI-1640, 10% ЭТС, 280 мг/л L-глутамина, 50 мг/л гентамицина, 50 мкМ ингибитора фосфатидилинозитол-3-киназы (PI3K). Способ обеспечивает повышение выработки эритропоэтина за счет стимулирующего действия ингибитора PI3K на секреторную функцию CD4+-клеток. 1 табл., 1 пр.

Способ стимуляции выработки эритропоэтина клетками костного мозга in vitro, заключающийся в том, что клетки костного мозга культивируют в CO₂-инкубаторе при 37°C, 5% СО₂ и 100% влажности воздуха в течение 24 часов в полной культуральной среде следующего состава: 90% среды RPMI-1640, 10% ЭТС, 280 мг/л L-глутамина, 50 мг/л гентамицина с добавлением стимулятора, отличающийся тем, что культивируют фракцию CD4+-клеток костного мозга, а в качестве стимулятора используют ингибитор PI3K в концентрации 50 мкМ.