СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ЗЛОКАЧЕСТВЕННОЙ ОПУХОЛИ Российский патент 2016 года по МПК G01N33/574 A61P35/02 

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к способу определения присутствия злокачественной опухоли или ее тяжести, способу выбора способа ее терапии или оценки эффекта способа терапии или способу оценки риска рецидива злокачественной опухоли или присутствия или отсутствия рецидива, и к диагностическому набору для аналогичных целей.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В последние годы ежегодно более чем у 10 миллионов людей диагностируют злокачественные опухоли, более чем 7 миллионов людей умирают от злокачественных опухолей, и эти цифры проявляют тенденцию к росту. Правильный диагноз, подходящее лечение, оценка эффекта лечения и предсказание и предотвращение рецидива злокачественной опухоли считаются важными факторами для выживания пациентов со злокачественными опухолями. В настоящее время для того, чтобы получить о них полезную информацию, гистопатологический диагноз, генетическое тестирование, диагностическую визуализацию, клинические тесты крови и т.д. осуществляют отдельно или в комбинации. В частности, определение уровня опухолевого маркера в образце крови является удобным и относительно недорогим способом тестирования.

Злокачественные опухоли, как правило, разделяют на карциномы и саркомы. Согласно новой классификации ВОЗ, гемопоэтические опухоли, которые являются типом саркомы, как правило, разделяют на лейкозы и злокачественные лимфомы. Лейкоз разделяют на острый лейкоз (быстрый рост) и хронический лейкоз (медленный рост), а острый лейкоз разделяют на острый лимфоцитарный лейкоз (ALL) и острый миелолейкоз (AML). ALL дополнительно разделяют, основываясь на типе клеток, на T-клеточный ALL и B-клеточный ALL.

В том случае, когда уровень бластов в костном мозге составляет 20% или выше, состояние диагностируют как AML, а в том случае, когда уровень бластов в костном мозге составляет ниже 20%, состояние диагностируют как миелодиспластический синдром (MDS).

В случае острого лейкоза (AL), самым главным является немедленное начало его лечения, поскольку он демонстрирует быстрое развитие. Когда предполагают AL или его рецидив, клетки костного мозга анализируют посредством аспирации костного мозга для точного диагноза. Однако этот тест нельзя использовать часто, поскольку он является очень инвазивным для пациентов.

При хроническом лейкозе (CL), который отличается от L тем, что сохраняется способность к дифференциации и созреванию, хронический миелолейкоз (CML) классифицируют как миелопролиферативное нарушение (MPD), а хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL) классифицируют как злокачественную лимфому. CL не имеет конкретных симптомов и прогрессирует медленно. Однако, поскольку CL иногда может переходить в AL (острая трансформация) в долгосрочной перспективе, периодическое наблюдение необходимо во время и после лечения.

Между тем, злокачественную лимфому, как правило, разделяют на лимфому Ходжкина (HL) и неходжкинскую лимфому (NHL).

В Японии приблизительно 90% случаев злокачественной лимфомы представляют собой NHL, и часто наблюдают фолликулярную лимфому, которая представляет собой медленно растущую лимфому низкой степени злокачественности, и диффузную В-крупноклеточную лимфому, которая представляет собой быстро растущую лимфому средней степени злокачественности. Лечение NHL меняется в зависимости от классифицированной стадии и степени злокачественности. Среди случаев лимфомы, в частности, лимфома низкой степени злокачественности прогрессирует медленно и она менее чувствительна к лечению, и может произойти повышение злокачественности и переход в лейкоз. Следовательно необходимо внимательно последующее наблюдение симптомов лимфомы низкой степени злокачественности.

Злокачественная лимфома возникает в лимфатических узлах в виде очагов. Поскольку лимфатические узлы присутствуют по всему организму, очаговые участки злокачественной лимфомы сложно найти по сравнению со случаем лейкоза. В частности, в случае ее рецидива, в реальности сложно обнаружить конкретные очаговые участки. Следовательно, очень важно определить очаговый участок и масштаб патологического состояния в организме, что требует дорогостоящей диагностической визуализации, такой как КТ, МРТ или ПЭТ, и высоко инвазивной аспирации костного мозга.

Для того, чтобы оценить распространение и тяжесть заболевания и эффект от его лечения, осуществляют анализ крови на лактатдегидрогеназу (LDH), C-реактивный белок (CRP), β2-микроглобулин, ферритин, растворимый рецептор интерлейкина-2 (sIL-2R) и т.д. Однако известно, что тестовые значения для этих пунктов в анализе крови повышаются при дисфункции печени, дисфункции почек, бактериальной инфекции и заболеваниях коллагена, таких как ревматоидный артрит и SLE. Следовательно, эти факторы, повышающие тестовые значения, следует принимать во внимание с осторожностью, когда диагностируют гемопоэтическую опухоль, основываясь на описанных выше пунктах анализа крови.

При клиническом исследовании опухолевые маркеры, такие как α-фетопротеин, CEA и CA19-9 используют для обнаружения карцином, таких как злокачественная опухоль печени, злокачественная опухоль поджелудочной железы, злокачественная опухоль ободочной кишки и т.д. Когда любой из этих маркеров используют отдельно, во многих случаях, органоспецифичность и чувствительность обнаружения злокачественной опухоли являются недостаточными. Таким образом, множество опухолевых маркеров часто анализируют в комбинации и, следовательно, существует потребность в разработке пунктов анализа, которые могут выполнять функции новых опухолевых маркеров.

LR11 (родственник рецептора LDL с 11 лиганд-связывающими повторами) представляет собой новый белок, похожий на рецептор LDL, у которого идентифицировано присутствие структуры, характерной для семейства рецепторов LDL (патентный документ 1 и непатентный документ 1). Сообщалось, что экспрессия LR11 поддерживается, в частности, в утолщенных участках интимы сосудов, созданных посредством миграции и пролиферации гладкомышечных клеток (непатентный документ 2). Кроме того, также известно следующее: растворимый LR11 присутствует в крови млекопитающих; уровень растворимого LR11 у пациентов с атеросклерозом значительно выше, чем у здоровых субъектов (патентный документ 2); и уровень растворимого LR11 является независимым фактором, который определяет толщину интима медиа (IMT) (непатентный документ 3). Кроме того, также известен способ быстрого и правильного определения уровня растворимого LR11 в крови и цереброспинальной жидкости (патентный документ 3, непатентный документ 4).

ДОКУМЕНТЫ ИЗВЕСТНОГО УРОВНЯ ТЕХНИКИ

Патентные документы

Патентный документ 1: JP09-163988 A

Патентный документ 2: WO2008155891

Патентный документ 3: WO2009116268

Непатентные документы

Непатентный документ 1: J. Biol. Chem. 1996; 271, 24761-24768

Непатентный документ 2: Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 1999; 19, 2687-2695

Непатентный документ 3: J. Clin. Invest. 2008; 118, 2733-2746

Непатентный документ 4: Clin. Chem. 2009; 55, 1801-1808

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Задача настоящего изобретения состоит в том, чтобы предоставить способ определения присутствия злокачественной опухоли или ее тяжести, способ выбора способа ее терапии или оценки эффекта способа терапии или способ оценки риска рецидива злокачественной опухоли или присутствия или отсутствия рецидива. Другая задача настоящего изобретения состоит в том, чтобы предоставить диагностический реактив для этого. Еще одна другая задача настоящего изобретения состоит в том, чтобы предоставить диагностический набор для аналогичных целей.

СРЕДСТВА РЕШЕНИЯ ПРОБЛЕМ

Авторы настоящего изобретения осуществляли обширные исследования с целью найти новый маркер злокачественной опухоли. К большому удивлению, авторы настоящего изобретения обнаружили, что растворимый LR11 присутствует в значительно более высокой концентрации в образцах текучих веществ организма, взятых у пациентов со злокачественными опухолями, чем в таковых, взятых у здоровых субъектов. Авторы настоящего изобретения также обнаружили, что концентрация растворимого LR11 снижается до нормального уровня на протяжении лечения злокачественной опухоли и повышается снова при рецидиве злокачественной опухоли, и что концентрацию растворимого LR11 можно использовать в качестве опухолевого маркера, который эффективен для определения присутствия злокачественной опухоли или ее тяжести, для выбора способа ее терапии или оценки эффекта способа терапии, или для оценки риска рецидива злокачественной опухоли или присутствия или отсутствия рецидива. Настоящее изобретение выполнено на основе этих открытий.

Соответственно, настоящее изобретение относится к способу определения присутствия злокачественной опухоли или ее тяжести, способу выбора способа ее терапии или оценки эффекта способа терапии или способу оценки риска рецидива злокачественной опухоли или присутствия или отсутствия рецидива, который отличается тем, что способ включает 1) стадию измерения концентрации и/или количества растворимого LR11 в образце, полученном от субъекта и 2) стадию сравнения значения, полученного выше, со значением растворимого LR11 в образце, полученном от группы здоровых субъектов.

Настоящее изобретение также относится к композиции реактивов или набору для определения присутствия злокачественной опухоли или ее тяжести, для выбора способа ее терапии или оценки эффекта способа терапии или для оценки риска рецидива злокачественной опухоли или присутствия или отсутствия рецидива, эта композиция реактивов или набор содержит реактив, который может определять концентрацию и/или количество растворимого LR11 в образце, полученном от субъекта, и эту композицию реактивов или набор используют в сравнении определяемого значения со значением растворимого LR11 в образце, полученном от группы здоровых субъектов.

Настоящее изобретение также относится к диагностическому набору для определения присутствия злокачественной опухоли или ее тяжести, для выбора способа ее терапии или оценки эффекта способа терапии или для оценки риска рецидива злокачественной опухоли или присутствия или отсутствия рецидива, который отличается тем, что диагностический набор содержит реактив, который может определить концентрацию и/или количество растворимого LR11.

ПОЛЕЗНЫЙ ЭФФЕКТ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Согласно способу по настоящему изобретению, измеряют концентрацию растворимого LR11 в образце, полученном от пациента с подозрением на присутствие злокачественной опухоли, и измеренную выше концентрацию сравнивают с концентрацией LR11, измеренной у здорового субъекта, чтобы тем самым получить информацию, которую можно использовать для определения присутствия злокачественной опухоли или ее тяжести или для выбора способа ее терапии или оценки эффекта способа терапии. Кроме того, даже после излечения злокачественной опухоли, риск рецидива злокачественной опухоли или присутствия или отсутствия рецидива можно оценивать посредством непрерывного мониторинга уровня растворимого LR11.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ РИСУНКОВ

Фиг.1. График, на котором представлены результаты наблюдения за изменениями уровней растворимого LR11 в сыворотке у пациентов с острым миелолейкозом от момента до начала лечения до ремиссии.

Фиг.2. График, на котором представлена процентная доля пациентов с острым миелолейкозом, обладающих низким уровнем белка растворимого LR11 (<20 нг/мл) в ремиссии, и пациентов с острым миелолейкозом, обладающих высоким уровнем белка растворимого LR11 (≥20 нг/мл) в ремиссии.

Фиг.3. График, на котором представлена степень общей выживаемости пациентов с острым миелолейкозом, обладающих низким уровнем белка растворимого LR11 (<20 нг/мл), и пациентов с острым миелолейкозом, обладающих высоким уровнем белка растворимого LR11 (≥20 нг/мл).

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Далее настоящее изобретение описано подробно. Один характерный признак настоящего изобретения заключается в том, что растворимый LR11 используют в качестве маркера злокачественной опухоли.

Целевая злокачественная опухоль по настоящему изобретению относится к карциноме и гемопоэтической опухоли, которая является видом саркомы. Примеры карциномы включают злокачественную опухоль желудка, злокачественную опухоль печени, злокачественную опухоль поджелудочной железы, злокачественную опухоль легких, злокачественную опухоль предстательной железы, злокачественную опухоль мочевого пузыря, злокачественную опухоль пищевода, злокачественную опухоль молочной железы, злокачественную опухоль шейки матки, злокачественную опухоль яичников, злокачественную опухоль ободочной кишки, злокачественную опухоль толстой кишки, и злокачественную опухоль желчного пузыря. Примеры гемопоэтической опухоли включают острый лейкоз, хронический лейкоз и злокачественную лимфому, такую как неходжкинская лимфома. Однако, целевые злокачественные опухоли не ограничены указанными выше примерами.

Способ определения по настоящему изобретению включает (1) стадию измерения концентрации и/или количества растворимого LR11 в образце, полученном от субъекта, и (2) стадию сравнения значения, полученного выше, со значением растворимого LR11, полученного в группе здоровых субъектов.

На выбор субъекта по настоящему изобретению не налагается никаких ограничений при условии, что субъект может страдать злокачественной опухолью. Примеры субъекта включают человека и других млекопитающих, таких как мышь, крыса, кролик, свинья, собака и кошка.

Примеры образца, получаемого от субъекта, включают кровь (сыворотка, плазма), цереброспинальную жидкость, лимфу, мочу, ткани и клетки. Среди них кровь (в частности, сыворотка) является предпочтительной благодаря простоте получения образца.

Также образец, получаемый от субъекта, предпочтительно представляет собой образец, полученный от животного (в частности, человеческого субъекта), у которого предполагают наличие злокачественной опухоли, более конкретно, от человеческого субъекта, у которого предполагают наличие злокачественной опухоли в результате исследования с использованием стандартного опухолевого маркера.

Концентрацию или количество растворимого LR11 в образце, полученном от субъекта, определяют с использованием вещества, обладающего аффинностью к растворимому LR11. На выбор вещества, обладающего аффинностью к растворимому LR11, не накладывается конкретных ограничений при условии, что вещество может связываться с растворимым LR11. Примеры вещества включают белки, которые специфически связываются с растворимым LR11, такие как аполипопротеин E (apo E), apo E-богатый VLDL (β-VLDL), RAP (белок 39-40 кДа, ассоциированный с рецептором), uPA (урокиназный активатор плазминогена), PAI-1 (ингибитор активатора плазминогена 1 типа) и комплекс uPA-PAI-1 (белки) и антитела против растворимого LR11. Среди них RAP и антитела против растворимого LR11 являются предпочтительными, причем антитела против растворимого LR11 являются особенно предпочтительными.

Антитело против растворимого LR11 может представлять собой моноклональное антитело или поликлональное антитело, при условии, что антитело вступает в реакцию с растворимым LR11, очищенным от сыворотки. Однако, предпочтительно используют моноклональное антитело. Антитело можно получать посредством широко известного способа. В одной процедуре получения поликлонального антитела, животных, таких как мыши, крысы, хомяки, кролики, козы, овцы и куры, используют для иммунизации иммуногеном. Антисыворотку можно получать посредством подкожного, внутрикожного или интраперитонеального введения антигена животному один или несколько раз, и извлечения антисыворотки из сыворотки. Когда в качестве антигена используют белок или пептид, иммунизацию предпочтительно осуществляют с использованием смеси иммуногена и адъюванта, проявляющего иммуностимулирующий эффект.

Моноклональное антитело можно получать посредством известного способа получения моноклонального антитела; например, "Monoclonal Antibody" (Hideaki NAGAMUNE and Hiroshi TERADA, Hirokawa-shoten, 1990) или "Monoclonal Antibody" (Jame W. Golding, 3rd edition, Academic Press, 1996). Также моноклональное антитело можно получать способом ДНК-иммунизации (смотрите, например, Nature, 12 марта 1992 года; 356: 152-154, или J. Immunol. Methods Mar 1; 249 147-154).

Антиген, используемый в получении антитела, может представлять собой белок LR11, его фрагмент (пептид) или вектор, содержащий кДНК, кодирующую белок LR11. Для того, чтобы получить моноклональное антитело, которое распознает высокоупорядоченную структуру LR11, полноразмерный вектор LR11, конструкция, содержащая полноразмерный ген LR11 человека, является наиболее подходящим геном антигена для использования в иммунизации. Альтернативно, для иммунизации можно использовать конструкцию, содержащую часть последовательности LR11 в качестве гена антигена. В одном режиме ДНК-иммунизации одну или несколько из указанных выше генных конструкций подкожно инъецируют животным (мыши, крысе и т.д.) отдельно или в комбинации посредством любых различных способов трансфекции (например, внутримышечная инъекция, электропорация, иммунизация посредством генной пушки) для внедрения генной конструкции(й) в клетки.

Моноклональное антитело можно получать способом, включающим культивирование гибридом, получаемых стандартным способом, и выделение целевого антитела из культурального супернатанта; или способом, включающим введение гибридомы млекопитающему, совместимому с гибридомой, и сбор перитонеального выпота млекопитающего.

Если необходимо, антитело можно дополнительно очищать перед использованием. Примеры способов очистки/выделения антител включают известные способы, такие как высаливание (например, преципитация сульфатом аммония), гель-фильтрация (например, с использованием Sephadex), ионообменная хроматография и аффинная очистка (например, с использованием колонки с белком A).

На способ определения растворимого LR11, содержащегося в образце, полученном от субъекта, конкретные ограничения не накладываются. Однако предпочтительно используют иммунологический способ с использованием антитела против растворимого LR11, способ с использованием аффинности RAP или т.п. или комбинацию этих способов. Примеры иммунологического способа по настоящему изобретению включают иммуноокрашивание (вестерн-блоттинг), твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA), иммунонефелометрию (TIA или LTIA), иммуноферментный анализ, хемилюминесцентный иммунологический анализ и флуоресцентный иммуноанализ. Альтернативно, для иммунологического способа также можно использовать сэндвич ELISA с использованием антитела и вещества, обладающего аффинностью к LR11 (например, RAP). Кроме того, предпочтительно используют предварительную обработку, чтобы элюировать растворимый LR11, который содержит стадию абсорбции растворимого LR11, содержащегося в образце, на нерастворимом носителе, несущем вещество, обладающее аффинностью к LR11 (например, RAP), и затем промывание и элюирование абсорбированного растворимого LR11 с использованием подходящего буфера, поскольку такой процесс предварительной обработки делает возможным удаление белковых загрязнений, содержащихся в образце точный анализ растворимого LR11.

Кроме того, модифицированный способ ELISA, в котором используют предварительную обработку образца поверхностно-активным веществом, ранее созданный авторами настоящего изобретения (Clin. Chem. 2009; 55, 1801-1808), является особенно предпочтительным, поскольку способ достигает очень высокой точности с помощью очень простой процедуры.

Для того, чтобы получить количественные или полуколичественные значения, предпочтительно осуществляют сравнение с эталонным количеством/концентрацией LR11. В этом случае, эталонный LR11, используемый в изобретении, предпочтительно представляет собой, например, растворимый LR11 сыворотки, обладающий известной концентрацией, LR11, извлеченный из культивируемых клеток или культурального супернатанта гладкомышечных клеток или клеточной линии нейробластов, рекомбинантный LR11, или синтетический пептид, используемый в качестве иммуногена при получении антитела.

Затем полученные таким образом значения измерений сравнивают со значениями измерений растворимого LR11 в группе здоровых субъектов.

Предпочтительно, значение измерения растворимого LR11 в группе здоровых субъектов определяют предварительно аналогичным способом, какой используют при определении значения измерения растворимого LR11 в указанном выше образце, полученном от субъекта. Эталонное значение, используемое на стадии сравнения, предпочтительно получают с помощью статистической обработки значений измерений растворимого LR11 в группе здоровых субъектов. Предпочтительно, эталонное значение определяют статистически в отношении каждого целевого нарушения.

Авторы настоящего изобретения обнаружили, что когда субъекты имеют злокачественную опухоль, злокачественную опухоль с более высокой тяжестью или риск ее рецидива, как описано ниже в примерах в настоящем документе, концентрация или количество растворимого LR11 в образце, полученном от субъектов, значительно выше, чем в группе здоровых субъектов. Следовательно, сравнение концентрации растворимого LR11 в образце, полученном от субъекта, или количества растворимого LR11, содержащегося в образце, с эталонным значением делает возможным определение присутствия злокачественной опухоли или ее тяжести, выбор способа ее терапии, оценку эффекта способа терапии, оценку риска рецидива злокачественной опухоли или определение присутствия или отсутствия рецидива.

Тяжесть злокачественной опухоли является показателем степени развития злокачественной опухоли. В настоящем изобретении, в случае гемопоэтической опухоли, выражение «определение присутствия злокачественной опухоли или ее тяжести» может относиться к классификации опухоли в соответствии с классификацией ВОЗ, поскольку лейкоз и злокачественна лимфома классифицированы в ней подробно и их тяжесть оценена ВОЗ. ВОЗ разделяет неходжкинские лимфомы на «высокую степень злокачественности», «среднюю степень злокачественности» и «низкую степень злокачественности» в отношении степени клеточной пролиферации. В этом случае приведенное выше выражение может относиться к этой процедуре классификации. Типичные примеры неходжкинской лимфомы включают фолликулярную лимфому, диффузную В-крупноклеточную лимфому и T-лимфобластную лимфому.

Карциному классифицируют в соответствии с классификацией TNM, которая представляет собой всемирно принятую классификацию стадий и она основана на размерах опухоли и степени развития, состоянии метастазирования в регионарные лимфатические узлы и присутствии отдаленных метастазов. Здесь также используют дополнительную классификацию стадий, основанную на классификации TNM, которая может предусматривать как степень развития злокачественной опухоли, так и степень распространения злокачественной опухоли. В случае карциномы приведенное выше выражение может относиться к этим процедурам классификации.

В том случае, когда ремиссии достигают посредством терапии, направленной на индукцию ремиссии, предполагаемую терапевтическую цель считают достигнутой. Здесь, в случае гемопоэтической опухоли, термин «ремиссия» относится к состоянию, в котором в крови или костном мозге не обнаруживают лейкозные клетки или злокачественную лимфому.

Выбор способа терапии и оценки эффекта способа терапии можно оценивать посредством мониторинга изменений размеров начальной опухоли. Когда концентрация растворимого LR11 не снижается до нормального уровня после лечения, риск рецидива можно оценивать как высокий, а когда концентрация растворимого LR11 возрастает во время промежуточной стадии или после ремиссии, достигнутой посредством определенного лечения, возможность рецидива опухоли можно оценивать как высокую. Кроме того, согласно способу по настоящему изобретению, можно предсказывать прогноз. Например, можно предсказать выживаемость от 2 до 3 лет.

Кроме того, предпочтительно проводить определение присутствия злокачественной опухоли и т.д., не только с использованием значений измерений растворимого LR11, но также в сочетании с известным опухолевым маркером. Примеры таких известных опухолевых маркеров включают α-фетопротеин, CEA, CA19-9, CA125, PIVKA-II, SCC, SLX, эластазу I, фрагмент цитокератина-19 и DUPAN2.

Набор по настоящему изобретению отличается тем, что содержит реактив, который может определить растворимый LR11. Примеры такого реактива предпочтительно включают, но без ограничения, реактив, который содержит вещество, которое обладает аффинностью к растворимому LR11, например, антитело против растворимого LR11 или описанные выше белки, такие как RAP. Набор может содержать другие элементы, нежели такие реактивы, например, реакционный буфер и реактор, необходимый для обнаружения растворимого LR11. Набор по настоящему изобретению может дополнительно содержать данные о значениях измерений растворимого LR11 у здоровых субъектов и протокол для осуществления сравнения измерений растворимого LR11 с этими данными.

ПРИМЕРЫ

Далее настоящее изобретение описано в виде примеров, которые не следует рассматривать в качестве ограничения изобретения.

Ссылочный пример 1: Получение моноклонального антитела против растворимого LR11 посредством ДНК-иммунизации

(1) Конструкция экспрессирующего вектора

Фрагмент гена, который представляет собой аминокислотную последовательность (от 1000 до 1550) (SEQ ID NO:1) и который формирует часть полноразмерного гена LR11 (Q92673), встраивали в экспрессирующий вектор для млекопитающих, содержащий метку FLAG (pcDNA3.1, продукт Invitrogen). Экспрессирующий вектор содержит фрагмент ДНК, кодирующий пептид, сформированный из GPI якорной последовательности, полученной из щелочной фосфатазы человека. Вектор использовали как вектор LR11 [1000-1550].

(2) Подтверждение продукта экспрессии CHO

Подтверждение экспрессии продукта целевого гена на клеточных мембранах, как ожидали, с помощью сконструированного таким образом вектора LR11 [1000-1550] перед иммунизацией проводили посредством эксперимента по временной трансфекции с использованием клеток CHO (клетки яичника китайского хомяка). В частности, за сутки до иммунизации клетки CHO высевали в 6-луночный планшет по 1×10⁶ клеток/лунка и культивировали в течение ночи при 37°C в 5% CO₂. В день трансфекции разведение плазмиды (3 мкг плазмидной ДНК+500 мкл D-MEM) и разведение липофектамина 2000 (9 мкл липофектамина 2000+500 мкл D-MEM) в достаточной мере смешивали вместе в полистироловой круглой пробирке и осуществляли инкубацию при комнатной температуре в течение 20 минут. После удаления культурального супернатанта предварительно высеянных клеток CHO продукт инкубации осторожно добавляли в планшет с тем, чтобы предотвратить перемещение клеток CHO. Дополнительную инкубацию осуществляли в течение пяти часов при 37°C в 5% CO₂ и удаляли супернатант. Среду D-MEM, содержащую 5% FCS, добавляли в планшет и культивировали клетки CHO в течение 24 часов при 37°C в 5% CO₂. На следующий день клетки удаляли из планшета с использованием буфера для диссоциации (продукт Invitrogen) и подвергали проточной цитометрии (FCM). Анализ FCM осуществляли следующим образом. Конкретно в реакции с первичным антителом клетки взаимодействовали с антителом ANTI-FLAG (зарегистрированная торговая марка) M2 (продукт SIGMA) в 3% FCS-содержащем фосфатном буфере (pH: 7,2 (PBS)) при 4°C в течение 30 минут. В реакции со вторичным антителом клетки промывали 3% FCS-содержащим PBS, и затем проводили реакцию с PE-меченным антителом против IgG мыши (продукт Beckman) в 3% FCS-содержащем PBS при 4°C в течение 30 минут. После этого клетки промывали 3% FCS-содержащим PBS и суспендировали в PBS, содержащем подходящее количество 3% FCS. Суспензию подвергали проточной цитометрии. Анализ выявил, что происходила экспрессия продукта целевого гена на поверхностях клеточных мембран посредством сконструированного вектора LR11 [1000-1550].

(3) Получение антитела посредством ДНК-иммунизации

В ДНК-иммунизации вектор LR11 [1000-1550], полученный выше в (1), или частицы золота, сенсибилизированные вектором LR11 [1000-1550], подкожно инъецировали иммунизируемым животным (мыши или крыс) с помощью генной пушки, чтобы тем самым внедрить вектор в клетки. Более конкретно, вектор LR11 [1000-1550] (200 мкг/частицы золота по 25 мг) вводили каждому животному с помощью Helios (зарегистрированная торговая марка) Gene Gun Optimization Kit (продукт Bio-Rad, USA) в соответствии с прилагаемой к ней инструкции. Иммунизацию осуществляли четыре раз с интервалами в две недели. При четвертой иммунизации брали небольшое количество образца антисыворотки. Антисыворотку разводили в 1000 раз 3% FCS-содержащим PBS, и разведение антисыворотки использовали в качестве первичного антитела в анализе FCM. Анализ FCM также осуществляли с использованием клеток CHO, в которых временно экспрессировали продукт целевого гена (получено в (2)) (далее в настоящем документе также могут обозначаться как клетки с усиленной экспрессией), на основании чего подтверждали повышение титра антител. Моноклональное антитело получали стандартным способом слияния клеток. Конкретно животное, которое подвергалось финальной повторной иммунизации дважды, рассекали и обычным способом выделяли антителопродуцирующие клетки. Выделенные таким образом клетки сливали с миеломными клетками мыши, чтобы тем самым получить антителопродуцирующие штаммы гибридом. Эти гибридомы культивировали и часть культурального супернатанта брали в качестве образца. Посредством иммуноферментном анализа и FCM с использованием клеток с усиленной экспрессией выбирали образец, который взаимодействовал с антигенным белком и не взаимодействовал с неантигенным белком. Иммуноферментный анализ с использованием клеток с усиленной экспрессией осуществляли следующим образом. Сначала клетки с усиленной экспрессией иммобилизовали в 96-луночном планшете и проводили реакцию с гибридомным культуральным супернатантом в качестве первичного антитела. После завершения реакции с первичным антителом планшет промывали и в него добавляли вторичное антитело. Вторичное антитело представляет собой антитело, которое может распознавать иммуноглобулин мыши или иммуноглобулин крысы первичного антитела и которое мечено пероксидазой хрена (HRP). После завершения реакции добавляли флуоресцентный субстрат, соответствующий ферменту, которым мечено вторичное антитело, и планшет анализировали с помощью флуоресцентного считывателя планшетов.

Затем осуществляли клонирование способом предельных разведений, на основании чего гибридому, постоянно показывающую высокий титр антител, выбирали в качестве штамма гибридомы, продуцирующей моноклональное антитело.

Впоследствии осуществляли массовое получение моноклонального антитела из перитонеального выпота следующим образом. Бестимусным мышам, которых предварительно обрабатывали пристаном (0,5 мл), выполняли интраперитонеальные инъекции клонированных гибридомных клеток (от 1×10⁶ до 3×10⁶) в фосфатно-солевом буфере (pH: 7,4) (0,5 мл). Приблизительно через две недели у бестимусных мышей собирали перитонеальный выпот и проводили аффинную очистку моноклонального антитела с использованием белка A.

Обнаружили, что два типичных моноклональных антитела против растворимого LR11 (полученное от мыши M3, полученное от крысы R14), которые получали посредством ДНК-иммунизации, взаимодействуют с растворимым LR11, полученным из сыворотки человека и сыворотки кролика.

Ссылочный пример 2: Очистка растворимого LR11, извлеченного из сыворотки кролика

Культивировали E. coli, трансформированные вектором, несущим ген RAP человека, pGEX2T (продукт GE Healthcare Bioscience) (т. е. E. coli DH5α), и центрифугировали культивированный продукт, чтобы тем самым извлечь из него клетки. Клетки, извлеченные из культуры (3 л), суспендировали в PBS (pH: 7,2), содержащем 0,2% лизоцима и 0,5% Triton X-100, и разрушали клетки обработкой ультразвуком. Слитный белок RAP/GST, содержавшийся в супернатанте после центрифугирования жидкости разрушенных клеток, заставляли проходить через Glutathione Sepharose 4 FF (продукт GE Healthcare Bioscience) (10 мл), чтобы тем самым абсорбировать на геле, и промывали гель в PBS (pH: 7,2 (далее в настоящем документе употребляли такой же pH, если не указано иное)), чтобы тем самым получить смолу RAP-Sepharose. Смолу RAP-Sepharose (10 мл) смешивали с сывороткой кролика (1 л) и оставляли смесь взаимодействовать в течение ночи при 4°C в условиях умеренного перемешивания. После завершения реакции смолу RAP-Sepharose упаковывали в колонку и промывали в PBS. Затем растворимый LR11 кролика элюировали из смолы с использованием цитратного буфера (pH: 5,0) и концентрировали элюент, а концентрированный элюат диализировали против PBS. Полученную таким образом жидкость смешивали со смолой Sepharose, химически связанной с моноклональным антителом против растворимого LR11 (M3), и смесь оставляли взаимодействовать в течение ночи при 4°C в условиях умеренного перемешивания. Затем растворимый LR11 кролика элюировали из смолы с использованием цитратного буфера (pH: 3,0). Элюат концентрировали и отделяли/очищали посредством гельфильтрационной хроматографии (Supedex 200; продукт GE Healthcare Bioscience) с использованием PBS. Элюированные фракции растворимого LR11 объединяли и концентрировали, чтобы тем самым предоставить очищенный растворимый LR11 кролика. Содержание растворимого белка LR11 определяли посредством отделения белка LR11 с помощью электрофореза в полиакриламидном геле с SDS и обнаружения белка растворимого LR11 с помощью окрашивания серебром. Также вычисляли уровень очищенного растворимого LR11 кролика на основе интенсивности окраски полосы бычьего сывороточного альбумина (BSA) с известной концентрацией. Уровень LR11 использовали в качестве калибровочного стандарта для использования в ELISA, который осуществляли ниже в настоящем документе в ссылочном примере 3.

Ссылочный пример 3: Обнаружение растворимого LR11 в сыворотке с помощью ELISA

Моноклональное антитело против растворимого LR11 (M3) разводили в PBS до 10 мкг/мл и раствор антитела добавляли в микропланшет (продукт NUNC) в объеме 100 мкл/лунка. Антитело иммобилизовали при комнатной температуре в течение 2 часов. Микропланшет промывали в PBS, содержащем 0,05% Tween 20 (PBST), и PBST, содержащий 1% BSA (BSA-PBST), добавляли в микропланшет в объеме 200 мкл/лунка и блокировали при комнатной температуре в течение одного часа. Отдельно сыворотку человека разводили в 11 раз смесью для обработки образца (3:1) из 7% MEGA-9 (продукт Dojindo Laboratories) и HBR (продукт Scantibodies Laboratory). Также, полученный от кролика растворимый LR11, очищенный в ссылочном примере 2, серийно разводили указанной выше смесью для обработки образца, чтобы тем самым получить калибровочный стандарт. Каждый из указанных выше разведенных образцов добавляли в микропланшет в объеме 100 мкл/лунка и оставляли взаимодействовать в течение ночи при комнатной температуре. Затем меченое биотином моноклональное антитело против растворимого LR11 (R14) разводили в BSA-PBST до концентрация 0,4 мкг/мл и разведенное антитело добавляли в микропланшет в объеме 100 мкл/лунка, за чем следовала реакция при комнатной температуре в течение четырех часов. После промывания микропланшета в PBST, меченный пероксидазой стрептавидин (продукт PIERCE), разведенный в BSA-PBST до 0,2 мкг/мл, добавляли в микропланшет в объеме 100 мкл/лунка, за чем следовала реакция при комнатной температуре в течение одного часа. После промывания микропланшета в PBST, жидкий субстрат TMB добавляли в микропланшет в объеме 100 мкл/лунка, и содержимое микропланшета оставляли развивать окраску при комнатной температуре в течение 30 минут. Затем развитие окраски останавливали добавлением 1,5 н. серной кислоты в микропланшет в объеме 100 мкл/лунка, и измеряли поглощение с помощью считывателя микропланшетов (погл. 450 нм). Уровень растворимого LR11 в образце вычисляли с помощью калибровочной кривой, полученной из измерений калибровочного стандарта. Умножая результаты на коэффициент разведения, получали соответствующую концентрацию растворимого LR11 человека в сыворотке.

Пример 1: Растворимый LR11 в качестве гемопоэтического опухолевого маркера

У 81 человека, у которых была диагностирована гемопоэтическая опухоль в первом медицинском исследовании, брали образцы сыворотки. В каждом образце определяли концентрацию растворимого LR11 и сравнивали ее с уровнем сыворотки растворимого LR11 в группе здоровых субъектов (87 человек без липидного нарушения).

Виды заболеваний у 81 человека, у которых была диагностирована гемопоэтическая опухоль, включают острый лимфоцитарный лейкоз (6), острый миелолейкоз (11), хронический лимфоцитарный лейкоз (5), хронический миелолейкоз (7), лимфому Ходжкина (5), неходжкинскую лимфому (26), миелодиспластические синдромы (4), множественную миелому (8) и POEMS-синдром (9). Концентрацию растворимого LR11 в сыворотке определяли посредством способа ELISA, использованного в ссылочном примере 2. Принимая во внимание уровни растворимого LR11 у здоровых субъектов, задавали предварительное пороговое значение 20 нг/мл. В таблице 1 представлено число случаев усредненное значение LR11 в каждом случае заболевания. Из таблицы 1 ясно, что часто обнаруживали пациентов, которые показывали более высокую концентрацию растворимого LR11, чем пороговое значение, в частности в случаях лейкоза и неходжкинской лимфомы, по сравнению со здоровыми субъектами.

Таблица 1   Группа <20 нг/мл
Среднее значение (n) Группа ≥20 нг/мл
Среднее значение (n) Здоровые субъекты (n=87) 9 нг/мл (n=87) - Острый лимфоцитарный лейкоз (n=6) 17 нг/мл (n=1) 134 нг/мл (n=5) Острый миелолейкоз (n=11) 10 нг/мл (n=6) 28 нг/мл (n=5) Хронический лимфоцитарный лейкоз (n=5) 11 нг/мл (n=2) 127 нг/мл (n=3) Хронический миелолейкоз (n=7) 13 нг/мл (n=4) 32 нг/мл (n=3) Лимфома Ходжкина (n=5) 10 нг/мл (n=5) - Неходжкинская лимфома (n=26) 11 нг/мл (n=14) 45 нг/мл (n=12) Миелодиспластические синдромы (n=4) 8 нг/мл (n=4) - Множественная миелома (n=8) 11 нг/мл (n=7) 25 нг/мл (n=1) POEMS-синдром (n=9) 11 нг/мл (n=9) -

Пример 2: Применение значения растворимого LR11 к оценке эффекта способа терапии

В примере 1, у пяти пациентов диагностировали острый миелолейкоз и они показывали высокую концентрацию растворимого LR11. На фиг.1 представлены результаты наблюдения изменений уровней растворимого LR11 в сыворотке от момента до лечения до ремиссии этих пяти пациентов. Посредством лечения концентрации растворимого LR11 снижали до попадания в нормальный диапазон (≤20 нг/мл). Следовательно, у пациентов с гемопоэтическими опухолями присутствие опухоли или ее тяжесть значительно коррелирует с повышением растворимого LR11 в крови пациента.

Пример 3: Предсказание риска рецидива

Среди девяти пациентов, у которых диагностировали гемопоэтическую опухоль и которые вошли в стадию ремиссию посредством лечения, но страдали рецидивом опухоли, пять пациентов при рецидиве показывали концентрацию растворимого LR11 выше порогового значения (20 нг/мл). Пять из девяти пациентов (>50%) имели острый лимфоцитарный лейкоз (1), острый миелолейкоз (2 в 5), хронический лимфоцитарный лейкоз (1) и неходжкинскую лимфому (1 в 2). Следовательно, у пациентов с гемопоэтическими опухолями можно оценивать риск рецидива гемопоэтической опухоли или можно определить возможность ее рецидива посредством мониторинга уровня растворимого LR11 у целевого пациента.

Пример 4: Растворимый LR11 в качестве биомаркера при карциноме

В каждом случае карциномы, случайно выбирали пять пациентов и измеряли концентрацию растворимого LR11 в сыворотке каждого пациента. Аналогично примеру 1, задавали предварительное пороговое значение 20 нг/мл. Во всех случаях карциномы многие пациенты показывали более высокие концентрации растворимого LR11, чем пороговое значение (таблица 2).

Таблица 2   Группа <20 нг/мл
Среднее значение (n) Группа ≥20 нг/мл
Среднее значение (n) Злокачественная опухоль печени 16 нг/мл (n=2) 26 нг/мл (n=3) Злокачественная опухоль
поджелудочной железы 13 нг/мл (n=2) 24 нг/мл (n=3) Злокачественная опухоль ободочной кишки 15 нг/мл (n=4) 37 нг/мл (n=1) Злокачественная опухоль толстой кишки 10 нг/мл (n=3) 34 нг/мл (n=2) Злокачественная опухоль желчного пузыря 14 нг/мл (n=1) 36 нг/мл (n=4)

Пример 5: Оценка доли ремиссии

Среди 41 пациента, у которых диагностировали острый миелолейкоз и которые получали лечение, в группе нормально концентрации растворимого LR11 в сыворотке (<20 нг/мл), 20 из 21 пациента достигали полной ремиссии (CR) посредством лечения (высокая доля ремиссии: 95%), тогда как в группе высокой концентрации растворимого LR11 (≥20 нг/мл), только 13 из 20 пациентов достигли полной ремиссии посредством лечения (значительно более низкая доля ремиссии: 65%) (смотрите фиг.2). Следовательно, посредством измерения уровня растворимого LR11 у пациента с гемопоэтической опухолью, можно предсказать возможность ремиссии посредством ее лечения.

Пример 6: Зависимость между растворимым LR11 и выживаемостью

На фиг.3 представлена общая выживаемость (OS) 21 пациента с острым миелолейкозом, показывающего низкую концентрацию растворимого LR11 в сыворотке (<20 нг/мл), и 22 пациентов с острым миелолейкозом, показывающих высокую концентрацию растворимого LR11 в сыворотке (≥20 нг/мл). Как ясно из фиг.3, обнаружено, что уровень растворимого LR11 является важным прогностическим фактором, в частности, в коротком периоде (от 2 до 3 лет).

Группа изобретений относится к медицине и касается способа определения присутствия гемопоэтической опухоли или карциномы, включающего стадию измерения концентрации и/или количества растворимого LR11 в образце, полученном у субъекта, для получения значения измерения растворимого LR11 субъекта, стадию применения эталонного значения каждой опухоли, определенного статистической обработкой значений измерений растворимого LR11 в группе здоровых субъектов, для осуществления сравнения эталонного значения каждой опухоли со значением измерения растворимого LR11 субъекта и стадию сравнения значения измерения растворимого LR11 субъекта с эталонным значением каждой опухоли. Группа изобретений также касается способа определения тяжести гемопоэтической опухоли или карциномы, способа оценки риска рецидива гемопоэтической опухоли или карциномы. Группа изобретений обеспечивает создание эффективных способов определения присутствия гемопоэтической опухоли или карциномы, определения тяжести гемопоэтической опухоли или карциномы, оценки риска рецидива гемопоэтической опухоли или карциномы. 9 н. и 49 з.п. ф-лы, 6 пр., 3 ил., 2 табл.

1. Способ определения присутствия гемопоэтической опухоли или карциномы, который отличается тем, что способ включает
1) стадию измерения концентрации и/или количества растворимого LR11 в образце, полученном у субъекта, для получения значения измерения растворимого LR11 субъекта,
2) стадию применения эталонного значения каждой опухоли, определенного статистической обработкой значений измерений растворимого LR11 в группе здоровых субъектов, для осуществления сравнения эталонного значения каждой опухоли со значением измерения растворимого LR11 субъекта, и
3) стадию сравнения значения измерения растворимого LR11 субъекта с эталонным значением каждой опухоли, где когда концентрация или количество растворимого LR11 в образце, полученном от субъекта, выше, чем эталонное значение для опухоли, определенное статистической обработкой значений измерений растворимого LR11 в группе здоровых субъектов, то субъект имеет гемопоэтическую опухоль или карциному.

2. Способ определения тяжести гемопоэтической опухоли или карциномы, который отличается тем, что способ включает
1) стадию измерения концентрации и/или количества растворимого LR11 в образце, полученном у субъекта, для получения значения измерения растворимого LR11 субъекта,
2) стадию применения эталонного значения каждой опухоли, определенного статистической обработкой значений измерений растворимого LR11 в группе здоровых субъектов, для осуществления сравнения эталонного значения каждой опухоли со значением измерения растворимого LR11 субъекта, и
3) стадию сравнения значения измерения растворимого LR11 субъекта с эталонным значением каждой опухоли, где когда концентрация или количество растворимого LR11 в образце, полученном от субъекта, выше, чем эталонное значение для опухоли, определенное статистической обработкой значений измерений растворимого LR11 в группе здоровых субъектов, то субъект имеет тяжелую гемопоэтическую опухоль или карциному.

3. Способ оценки риска рецидива гемопоэтической опухоли или карциномы, который отличается тем, что способ включает
1) стадию измерения концентрации и/или количества растворимого LR11 в образце, полученном у субъекта, для получения значения измерения растворимого LR11 субъекта,
2) стадию применения эталонного значения каждой опухоли, определенного статистической обработкой значений измерений растворимого LR11 в группе здоровых субъектов, для осуществления сравнения эталонного значения каждой опухоли со значением измерения растворимого LR11 субъекта, и
3) стадию сравнения значения измерения растворимого LR11 субъекта с эталонным значением каждой опухоли, где когда концентрация или количество растворимого LR11 в образце, полученном от субъекта, выше, чем эталонное значение для опухоли, определенное статистической обработкой значений измерений растворимого LR11 в группе здоровых субъектов, то субъект имеет риск рецидива гемопоэтической опухоли или карциномы.

4. Способ по любому из пп. 1-3, где гемопоэтическая опухоль представляет собой лейкоз или злокачественную лимфому.

5. Способ по п. 4, где лейкоз представляет собой острый лейкоз или хронический лейкоз.

6. Способ по п. 4, где злокачественная лимфома представляет собой неходжкинскую лимфому.

7. Способ по любому из пп. 1-3, где карциному выбирают из группы, состоящей из злокачественной опухоли желудка, злокачественной опухоли печени, злокачественной опухоли поджелудочной железы, злокачественной опухоли легких, злокачественной опухоли предстательной железы, злокачественной опухоли мочевого пузыря, злокачественной опухоли пищевода, злокачественной опухоли молочной железы, злокачественной опухоли шейки матки, злокачественной опухоли яичников, злокачественной опухоли ободочной кишки, злокачественной опухоли толстой кишки и злокачественной опухоли желчного пузыря.

8. Способ по любому из пп. 1-3, где образец, полученный у субъекта, представляет собой любое из крови, сыворотки, плазмы, цереброспинальной жидкости и мочи.

9. Способ по любому из пп. 1-3, где измерение осуществляют с использованием белка, который может специфически связываться с растворимым LR11.

10. Способ по п. 9, где белок выбран из антитела против растворимого LR11, аро Е, β-VLDL, RAP, uPA, PAI-1 и комплекса uPA-PAI-1.

11. Композиция реактивов для определения присутствия гемопоэтической опухоли или карциномы, где эта композиция реактивов содержит реактив, который может определять концентрацию и/или количество растворимого LR11 в образце, полученном у субъекта, для получения значения измерения растворимого LR11 субъекта, и
где эту композицию реактивов используют для осуществления сравнения значения измерения растворимого LR11 субъекта с эталонным значением каждой опухоли, определенным статистической обработкой значений измерений растворимого LR11 в группе здоровых субъектов.

12. Композиция реактивов по п. 11, где гемопоэтическая опухоль представляет собой лейкоз или злокачественную лимфому.

13. Композиция реактивов по п. 12, где лейкоз представляет собой острый лейкоз или хронический лейкоз.

14. Композиция реактивов по п. 12, где злокачественная лимфома представляет собой неходжкинскую лимфому.

15. Композиция реактивов по п. 11, где карциному выбирают из группы, состоящей из злокачественной опухоли желудка, злокачественной опухоли печени, злокачественной опухоли поджелудочной железы, злокачественной опухоли легких, злокачественной опухоли предстательной железы, злокачественной опухоли мочевого пузыря, злокачественной опухоли пищевода, злокачественной опухоли молочной железы, злокачественной опухоли шейки матки, злокачественной опухоли яичников, злокачественной опухоли ободочной кишки, злокачественной опухоли толстой кишки и злокачественной опухоли желчного пузыря.

16. Композиция реактивов по любому из пп. 11-15, где образец, полученный у субъекта, представляет собой любое из крови, сыворотки, плазмы, цереброспинальной жидкости и мочи.

17. Композиция реактивов по любому из пп. 11-15, где измерение осуществляют с использованием белка, который может специфически связываться с растворимым LR11.

18. Композиция реактивов по п. 17, где белок выбран из антитела против растворимого LR11, аро Е, β-VLDL, RAP, uPA, PAI-1 и комплекса uPA-PAI-1.

19. Набор для определения присутствия гемопоэтической опухоли или карциномы, который содержит композицию реактивов, которая может определять концентрацию и/или количество растворимого LR11 в образце, полученном у субъекта, для получения значения измерения растворимого LR11 субъекта, и где набор применяют для осуществления сравнения значения измерения растворимого LR11 субъекта с эталонным значением каждой опухоли, определенным статистической обработкой значений измерений растворимого LR11 в группе здоровых субъектов.

20. Набор по п. 19, где гемопоэтическая опухоль представляет собой лейкоз или злокачественную лимфому.

21. Набор по п. 20, где лейкоз представляет собой острый лейкоз или хронический лейкоз.

22. Набор по п. 20, где злокачественная лимфома представляет собой неходжкинскую лимфому.

23. Набор по п. 19, где карциному выбирают из группы, состоящей из злокачественной опухоли желудка, злокачественной опухоли печени, злокачественной опухоли поджелудочной железы, злокачественной опухоли легких, злокачественной опухоли предстательной железы, злокачественной опухоли мочевого пузыря, злокачественной опухоли пищевода, злокачественной опухоли молочной железы, злокачественной опухоли шейки матки, злокачественной опухоли яичников, злокачественной опухоли ободочной кишки, злокачественной опухоли толстой кишки и злокачественной опухоли желчного пузыря.

24. Набор по любому из пп. 19-23, где образец, полученный у субъекта, представляет собой любое из крови, сыворотки, плазмы, цереброспинальной жидкости и мочи.

25. Набор по любому из пп. 19-23, где измерение осуществляют с использованием белка, который может специфически связываться с растворимым LR11.

26. Набор по п. 25, где белок выбирают из антитела против растворимого LR11, аро Е, β-VLDL, RAP, uPA, PAI-1 и комплекса uPA-PAI-1.

27. Композиция реактивов для определения тяжести гемопоэтической опухоли или карциномы, где эта композиция реактивов содержит реактив, который может определять концентрацию и/или количество растворимого LR11 в образце, полученном у субъекта, для получения значения измерения растворимого LR11 субъекта, и
где эту композицию реактивов используют для осуществления сравнения значения измерения растворимого LR11 субъекта с эталонным значением каждой опухоли, определенным статистической обработкой значений измерений растворимого LR11 в группе здоровых субъектов.

28. Композиция реактивов по п. 27, где гемопоэтическая опухоль представляет собой лейкоз или злокачественную лимфому.

29. Композиция реактивов по п. 28, где лейкоз представляет собой острый лейкоз или хронический лейкоз.

30. Композиция реактивов по п. 28, где злокачественная лимфома представляет собой неходжкинскую лимфому.

31. Композиция реактивов по п. 27, где карциному выбирают из группы, состоящей из злокачественной опухоли желудка, злокачественной опухоли печени, злокачественной опухоли поджелудочной железы, злокачественной опухоли легких, злокачественной опухоли предстательной железы, злокачественной опухоли мочевого пузыря, злокачественной опухоли пищевода, злокачественной опухоли молочной железы, злокачественной опухоли шейки матки, злокачественной опухоли яичников, злокачественной опухоли ободочной кишки, злокачественной опухоли толстой кишки и злокачественной опухоли желчного пузыря.

32. Композиция реактивов по любому из пп. 27-31, где образец, полученный у субъекта, представляет собой любое из крови, сыворотки, плазмы, цереброспинальной жидкости и мочи.

33. Композиция реактивов по любому из пп. 27-31, где измерение осуществляют с использованием белка, который может специфически связываться с растворимым LR11.

34. Композиция реактивов по п. 33, где белок выбран из антитела против растворимого LR11, аро Е, β-VLDL, RAP, uPA, PAI-1 и комплекса uPA-PAI-1.

35. Набор для определения тяжести гемопоэтической опухоли или карциномы, который содержит композицию реактивов, которая может определять концентрацию и/или количество растворимого LR11 в образце, полученном у субъекта, для получения значения измерения растворимого LR11 субъекта, и где набор применяют для осуществления сравнения значения измерения растворимого LR11 субъекта с эталонным значением каждой опухоли, определенным статистической обработкой значений измерений растворимого LR11 в группе здоровых субъектов.

36. Набор по п. 35, где гемопоэтическая опухоль представляет собой лейкоз или злокачественную лимфому.

37. Набор по п. 36, где лейкоз представляет собой острый лейкоз или хронический лейкоз.

38. Набор по п. 36, где злокачественная лимфома представляет собой неходжкинскую лимфому.

39. Набор по п. 35, где карциному выбирают из группы, состоящей из злокачественной опухоли желудка, злокачественной опухоли печени, злокачественной опухоли поджелудочной железы, злокачественной опухоли легких, злокачественной опухоли предстательной железы, злокачественной опухоли мочевого пузыря, злокачественной опухоли пищевода, злокачественной опухоли молочной железы, злокачественной опухоли шейки матки, злокачественной опухоли яичников, злокачественной опухоли ободочной кишки, злокачественной опухоли толстой кишки и злокачественной опухоли желчного пузыря.

40. Набор по любому из пп. 35-3 9, где образец, полученный у субъекта, представляет собой любое из крови, сыворотки, плазмы, цереброспинальной жидкости и мочи.

41. Набор по любому из пп. 35-39, где измерение осуществляют с использованием белка, который может специфически связываться с растворимым LR11.

42. Набор по п. 41, где белок выбирают из антитела против растворимого LR11, аро Е, β-VLDL, RAP, uPA, PAI-1 и комплекса uPA-PAI-1.

43. Композиция реактивов для оценки риска рецидива гемопоэтической опухоли или карциномы, где эта композиция реактивов содержит реактив, который может определять концентрацию и/или количество растворимого LR11 в образце, полученном у субъекта, для получения значения измерения растворимого LR11 субъекта, и
где эту композицию реактивов используют для осуществления сравнения значения измерения растворимого LR11 субъекта с эталонным значением каждой опухоли, определенным статистической обработкой значений измерений растворимого LR11 в группе здоровых субъектов.

44. Композиция реактивов по п. 43, где гемопоэтическая опухоль представляет собой лейкоз или злокачественную лимфому.

45. Композиция реактивов по п. 44, где лейкоз представляет собой острый лейкоз или хронический лейкоз.

46. Композиция реактивов по п. 44, где злокачественная лимфома представляет собой неходжкинскую лимфому.

47. Композиция реактивов по п. 43, где карциному выбирают из группы, состоящей из злокачественной опухоли желудка, злокачественной опухоли печени, злокачественной опухоли поджелудочной железы, злокачественной опухоли легких, злокачественной опухоли предстательной железы, злокачественной опухоли мочевого пузыря, злокачественной опухоли пищевода, злокачественной опухоли молочной железы, злокачественной опухоли шейки матки, злокачественной опухоли яичников, злокачественной опухоли ободочной кишки, злокачественной опухоли толстой кишки и злокачественной опухоли желчного пузыря.

48. Композиция реактивов по любому из пп. 43-47, где образец, полученный у субъекта, представляет собой любое из крови, сыворотки, плазмы, цереброспинальной жидкости и мочи.

49. Композиция реактивов по любому из пп. 43-47, где измерение осуществляют с использованием белка, который может специфически связываться с растворимым LR11.

50. Композиция реактивов по п. 49, где белок выбран из антитела против растворимого LR11, аро Е, β-VLDL, RAP, uPA, PAI-1 и комплекса uPA-PAI-1.

51. Набор для оценки риска рецидива гемопоэтической опухоли или карциномы, который содержит композицию реактивов, которая может определять концентрацию и/или количество растворимого LR11 в образце, полученном у субъекта, для получения значения измерения растворимого LR11 субъекта, и где набор
применяют для осуществления сравнения значения измерения растворимого LR11 субъекта с эталонным значением каждой опухоли, определенным статистической обработкой значений измерений растворимого LR11 в группе здоровых субъектов.

52. Набор по п. 51, где гемопоэтическая опухоль представляет собой лейкоз или злокачественную лимфому.

53. Набор по п. 52, где лейкоз представляет собой острый лейкоз или хронический лейкоз.

54. Набор по п. 52, где злокачественная лимфома представляет собой неходжкинскую лимфому.

55. Набор по п. 51, где карциному выбирают из группы, состоящей из злокачественной опухоли желудка, злокачественной опухоли печени, злокачественной опухоли поджелудочной железы, злокачественной опухоли легких, злокачественной опухоли предстательной железы, злокачественной опухоли мочевого пузыря, злокачественной опухоли пищевода, злокачественной опухоли молочной железы, злокачественной опухоли шейки матки, злокачественной опухоли яичников, злокачественной опухоли ободочной кишки, злокачественной опухоли толстой кишки и злокачественной опухоли желчного пузыря.

56. Набор по любому из пп. 51-55, где образец, полученный у субъекта, представляет собой любое из крови, сыворотки, плазмы, цереброспинальной жидкости и мочи.

57. Набор по любому из пп. 51-55, где измерение осуществляют с использованием белка, который может специфически связываться с растворимым LR11.

58. Набор по п. 57, где белок выбирают из антитела против растворимого LR11, аро Е, β-VLDL, RAP, uPA, PAI-1 и комплекса uPA-PAI-1.