СПОСОБ ПРЕДСКАЗАНИЯ ТЕЧЕНИЯ ВИЧ-ЗАБОЛЕВАНИЯ Российский патент 2016 года по МПК G01N33/569 

Настоящее изобретение относится к области прогнозирования заболевания ВИЧ.

Инфицирование человека вирусом ВИЧ, как правило, диагностируется иммунодетекцией антител к ВИЧ в образцах плазмы крови. Многочисленные ИФА (иммуноферментный анализ) тест-системы для ВИЧ являются коммерчески доступными на сегодняшний день. Как правило, в известных ИФА тест-системах применяют полистироловые микролуночные стрипы, которые предварительно покрыты смесью ВИЧ-антигенов, ВИЧ-антигены в составе которой могут быть представлены ВИЧ-антигенами, экспрессированными в E. coli, например, такими как рекомбинантные ВИЧ-1 gp41, gp120 и ВИЧ-2 gp36 гликопротеины.

Как только инфицирование вирусом ВИЧ диагностировано, должно осуществляться последующее определение прогрессирования заболевания ВИЧ, в том числе с целью определения времени начала медикаментозной антиретровирусной терапии (APT). Для этого необходимо осуществление способа, обеспечивающего определение стадий ВИЧ для указанного индивидуума.

Системы для определения стадий и классификации заболевания ВИЧ являются необходимыми средствами, обеспечивающими клинических врачей и пациентов необходимой информацией для клинического ведения. В настоящее время применяют две основные классификации, соответственно (I) система Всемирной Организации Здравоохранения (ВОЗ) - Система Клинических Стадий и Классификации Заболеваний и (II) классификация Американских Центров Контроля и Профилактики Заболеваний (Centers for Disease Control and Prevention, CDC).

Система Клинических Стадий и Классификации Заболеваний ВОЗ для ВИЧ/СПИД главным образом основана на определении клинических событий без обязательного требования наличия результатов лабораторного исследования. Система клинических стадий ВОЗ широко применяется в странах с ограниченными ресурсами, и было доказано, что она является практичной и полезной в учреждениях как первого уровня, так и специализированного уровня.

Система стадий заболеваний CDC оценивает тяжесть заболевания ВИЧ путем подсчета количества CD4+ T-лимфоцитов (CD4) и по наличию специфических ВИЧ-ассоциированных состояний. В соответствии с системой стадий заболеваний CDC, определение СПИД включает в себя всех ВИЧ-инфицированных индивидуумов, имеющих количество CD4 менее 200 клеток/мкл, или процентом CD4 (от общего количества лимфоцитов) менее 14%, а также индивидуумов с ВИЧ-ассоциированными состояниями и симптомами. Таким образом, в соответствии с системой CDC, определение количества CD4 представляет собой стандартное лабораторное исследование для оценки стадии ВИЧ и прогнозирования, а также для мониторинга прогрессирования СПИД и риска оппортунистических заболеваний. Определение количества CD4-клеток также направляет врача при постановке дифференциального диагноза пациентов с симптомами, а также в принятии решения относительно начала антиретровирусной терапии (APT) и начала профилактики оппортунистических инфекций.

При отсутствии лечения ВИЧ-инфекции, в результате репликации ВИЧ, как правило, образуются миллиарды новых копий ВИЧ ежедневно. Исследование РНК ВИЧ в плазме (вирусной нагрузки) количественно оценивает вирусную нагрузку ВИЧ в плазме. В регионах с доступом к мониторингу вирусной нагрузки, определение вирусной нагрузки является стандартным средством, которое применяется для контроля реакции на лечение у пациентов, получающих APT, и, в сочетании с определением количества CD4-клеток, для оценки прогрессирования ВИЧ (см. в особенности Mellors et al., 1996, Science, Vol.272(5265): 1167-170).

СПИД является пандемическим заболеванием, от которого страдают более 30 миллионов человек во всем мире, с более чем 2 миллионами новых инфицированных в год. На сегодняшний день СПИД остается смертельным заболеванием, от которого в 2009 году погибло более 2 миллионов человек.

Помимо необходимости в доступности множества различных терапевтических подходов лечения или для непрерывного совершенствования существующих типов APT, также существует постоянная необходимость в наличии множества способов для определения стадий и прогнозирования с тем, чтобы обеспечить врачей точными или дополнительными средствами, направленными, главным образом, на определение подходящего временного периода для начала APT, и на то, чтобы помочь им правильно адаптировать лечение к конкретным особенностям прогрессирования заболевания индивидуально для каждого конкретного случая.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к in vitro способу прогнозирования прогрессирования заболевания ВИЧ-1 у пациента, инфицированного вирусом ВИЧ-1, включающему этапы:

а) измерение уровня антител к 3S-пептиду в образце, взятом у указанного пациента,

б) сравнение уровня антител, измеренного на этапе а), с контрольным значением, которое является показателем прогрессирования заболевания ВИЧ-1.

ОПИСАНИЕ ФИГУР

Фигура 1 представляет собой график, изображающий кривые Каплана-Мейера, показывающие время выживания за период 120 месяцев пациентов, инфицированных ВИЧ-1, количество CD4 у которых более 200 клеток/мкл, и имеющих уровень анти-3S антител соответственно выше (кривая №1) или ниже (кривая №2) заданного контрольного значения (здесь, заданное контрольное значение или «отсекающее» значение составляет 50). Ось абсцисс: период времени после даты инфицирования, выраженный в месяцах. Ось ординат: распределение выживаемости (100% = 1 единица).

Фигура 2 представляет собой график, изображающий кривые Каплана-Мейера, показывающие время выживания за период 36 месяцев пациентов, инфицированных ВИЧ-1, количество CD4 у которых более 200 клеток/мм³, и имеющих уровень анти-3S антител соответственно выше (кривая №1) или ниже (кривая №2) заданного контрольного значения (здесь заданное контрольное значение или «отсекающее» значение составляет 50). Ось абсцисс: период времени после даты инфицирования, выраженный в месяцах. Ось ординат: распределение выживаемости (100% = 1 единица).

Фигура 3 представляет собой график, изображающий кривые Каплана-Мейера, показывающие время выживания за период 36 месяцев пациентов, инфицированных ВИЧ-1, количество CD4 у которых более 200 клеток/мм³, и имеющих уровень вирусной нагрузки соответственно выше (кривая №1) или ниже (кривая №2) заданного контрольного значения (здесь заданное контрольное значение или «отсекающее» значение составляет log4). Ось абсцисс: период времени после даты инфицирования, выраженный в месяцах. Ось ординат: распределение выживаемости (100% = 1 единица).

Фигура 4 иллюстрирует график, изображающий кривые Каплана-Мейера, показывающие время выживания за период 36 месяцев пациентов, инфицированных ВИЧ-1, количество CD4 у которых более 200 клеток/мм³, и классифицированных по 4 классам: соответственно (I) уровень анти-3S антител выше заданного контрольного значения (>50) и вирусная нагрузка ниже либо равна заданному контрольному значению (<=log4) (кривая №1), (II) уровень анти-3S антител выше заданного контрольного значения (>50) и вирусная нагрузка выше заданного контрольного значения (>log4) (кривая №2), (III) уровень анти-3S антител ниже либо равен заданному контрольному значению (<=50) и вирусная нагрузка ниже либо равна заданному контрольному значению (<=log4) (кривая №3), и (IV) уровень анти-3S антител ниже либо равен заданному контрольному значению (<=50) и вирусная нагрузка выше заданного контрольного значения (>log4) (кривая №4). Ось абсцисс: период времени после даты инфицирования, выраженный в месяцах. Ось ординат: процент живых людей (100% = 1 единица).

Фигура 5 иллюстрирует график, изображающий кривые Каплана-Мейера, показывающие время выживания за период 120 месяцев пациентов, инфицированных ВИЧ-1, количество CD4 у которых более 200 клеток/мм³, и классифицированных по 4 классам: соответственно (I) уровень анти-3S антител выше заданного контрольного значения (>50) и вирусная нагрузка ниже либо равна заданному контрольному значению (<=log4) (кривая №1), (II) уровень анти-3S антител выше заданного контрольного значения (>50) и вирусная нагрузка выше заданного контрольного значения (>log4) (кривая №2), (III) уровень анти-3S антител ниже либо равен заданному контрольному значению (<=50) и вирусная нагрузка ниже либо равна заданному контрольному значению (<=log4) (кривая №3), и (IV) уровень анти-3S антител ниже либо равен заданному контрольному значению (<=50) и вирусная нагрузка выше заданного контрольного значения (>log4) (кривая №4). Ось абсцисс: период времени после даты инфицирования, выраженный в месяцах. Ось ординат: процент живых людей (100% = 1 единица).

Фигура 6 иллюстрирует график, изображающий кривые Каплана-Мейера, показывающие время выживания за период 120 месяцев пациентов, у которых отсутствует СПИД, количество CD4 у которых более 200 клеток/мм³, и классифицированных по 4 классам: соответственно (I) уровень анти-3S антител выше заданного контрольного значения (>50) и вирусная нагрузка ниже либо равна заданному контрольному значению (<=log4) (кривая №1), (II) уровень анти-3S антител выше заданного контрольного значения (>50) и вирусная нагрузка выше заданного контрольного значения (>log4) (кривая №2), (III) уровень анти-3S антител ниже либо равен заданному контрольному значению (<=50) и вирусная нагрузка ниже либо равна заданному контрольному значению (<=log4) (кривая №3), и (IV) уровень анти-3S антител ниже либо равен заданному контрольному значению (<=50) и вирусная нагрузка выше заданного контрольного значения (>log4) (кривая №4). Ось абсцисс: период времени после даты инфицирования, выраженный в месяцах. Ось ординат: процент живых людей (100% = 1 единица).

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к новому независимому маркеру, который является показателем статуса прогрессирования заболевания ВИЧ-1 у пациентов, инфицированных ВИЧ-1. Настоящее изобретение относится к новым способам для определения прогноза прогрессирования заболевания ВИЧ-1 с применением указанного нового независимого маркера.

Согласно настоящему изобретению было установлено, что уровень антител против специфического пептида ВИЧ-1 (3S-пептида), определенного в образце, взятом у обследованного ВИЧ-1-инфицированного индивидуума, является показателем прогрессирования заболевания ВИЧ-1 у указанного индивидуума.

Указанный 3S-пептид, который представляет собой пептид, являющийся производным гликопротеина gp41 вируса ВИЧ-1, является известным как таковой. В данной области техники было показано, что 3S-пептид запускает мембранную экспрессию белка NKp44L в CD4 T-клетках. Считалось, что экспрессия NKp44L на поверхности CD4 Т-клеток играет ключевую роль в лизисе CD4 T-клеток активированными NK-клетками (NK - natural killers, естественные киллеры) при ВИЧ-1 инфекции, и, следовательно, специфические антитела к 3S-пептиду могут влиять на течение заболевания (см. Vieillard et al., 2005, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.102: 10981-10986).

Также в данной области техники было показано, что анти-3S антитела были обнаружены у некоторых ВИЧ-1-инфицированных пациентов, принадлежащих к очень специфической группе пациентов, имеющей название ALT, которая включает в себя исключительно ВИЧ-1-инфицированных пациентов, имеющих редкий фенотип бессимптомного долгосрочного выживания (см. Vieillard et al., 2006, AIDS, Vol.20(14): 1795-1804). Vieillard с соавт. (2006) показали наличие в указанной ALT группе пациентов корреляции между (I) снижением количества CD4+ T-клеток и (II) снижением уровня анти-3S антител. Vieillard с соавт. (2006) также показали, что наличие анти-3S антител было связано с высоким уровнем CD4+ T-клеток, у данных высокоспецифических ВИЧ-инфицированных индивидуумов.

Vieillard с соавт. (2006) заключили, что наличие анти-3S антител может влиять на течение заболевания посредством ингибирования экспрессии NKp44L и чувствительности CD4 к лизису NK-клетками. Также Vieillard с соавт. (2006) установили, что наличие анти-3S антител в сыворотке помогало контролировать количество CD4. Данные авторы отметили, что уменьшение общей CD4 T-клеточной популяции была тесно связана с исчезновением анти-3S антител. Данные авторы наблюдали, что уменьшение общей CD4 T-клеточной популяции было тесно связано с исчезновением анти-3S антител. Данные авторы также добавили, что производство анти-3S антител, возможно, могло бы способствовать замедлению прогрессирующего уменьшения количества CD4 Т-клеток.

В настоящее время согласно настоящему изобретению было обнаружено, что уровень анти-3S антител представляет собой надежный маркер прогрессирования состояния заболевания ВИЧ-1 у ВИЧ-1-инфицированного пациента.

Неожиданно изобретатели показали, что уровень анти-3S антител надежно свидетельствует о прогрессировании заболевания ВИЧ-1.

Дополнительно, было показано в настоящем изобретении, что уровень анти-3S антител является маркером, свидетельствующим о прогрессировании заболевания ВИЧ-1, даже в том случае, если данный маркер применяют отдельно.

Более того, было показано в настоящем изобретении, что уровень анти-3S антител является маркером, свидетельствующим о прогрессировании заболевания ВИЧ-1, независимым от других маркеров для прогнозирования ВИЧ-1, которые обычно применяют, включая количество CD4 в качестве маркера для прогнозирования и вирусную нагрузку в качестве маркера для прогнозирования.

В настоящем описании указано, что результаты по настоящему изобретению были получены на общей группе ВИЧ-1-инфицированных пациентов, а именно на группе ВИЧ-1-серопозитивных пациентов, а не на группе пациентов, имеющих редкий фенотип бессимптомного долгосрочного выживания, такой как группа ALT, которую изучали Vieillard с соавт. (2006).

По определению, механизмы прогрессирования ВИЧ-инфекции у индивидуумов с бессимптомным долгосрочным выживанием отличаются от тех, которые могут иметь место в общей популяции ВИЧ-инфицированных. Это еще раз полностью иллюстрируется результатами изобретения, которые раскрываются в настоящем описании.

Согласно настоящему изобретению было обнаружено, что в общей популяции ВИЧ-1-инфицированных пациентов отсутствует корреляция между (I) снижением количества CD4+ T-клеток и (II) снижением уровня анти-3S антител в отличие от данных Vieillard с соавт. (2006), полученных для группы пациентов ALT. Результаты настоящего изобретения еще раз иллюстрируют, что специалист в данной области не мог ожидать пользы от результатов, полученных от ВИЧ-инфицированных индивидуумов с бессимптомным долгосрочным выживанием, для понимания прогрессирования заболевания ВИЧ в общей популяции ВИЧ-инфицированных индивидуумов.

Дополнительно, как отмечено выше, в данной области техники считалось, для специфической группы пациентов ALT, что уровень анти-3S антител значительно коррелирует с количеством CD4 T-клеток. Следует напомнить, что предыдущие результаты Vieillard соавт. (2006) в большей степени дают образовательную информацию специалистам в данной области о том, что по причине наличия строгой корреляции, обнаруженной между уровнем анти-3S антител и количеством CD4-клеток, была обнаружена строгая зависимость между (I) маркером для прогнозирования заболевания ВИЧ-1, а именно количеством CD4-клеток, и (II) биологическим параметром ВИЧ-1-инфицированных пациентов, а именно, уровнем анти-3S антител. Даже если допустить гипотетическую возможность того, что специалист в данной области примет во внимание результаты Vieillard соавт. (2006), ранее раскрытая избыточная информация, которая ожидаемо была бы получена из количества CD4-клеток и уровня анти-3S антител, разубедила бы специалиста в данной области исследовать возможность того, что уровень анти-3S антител может являться маркером для прогнозирования прогрессирования заболевания ВИЧ-1.

В частных аспектах, настоящее изобретение относится к способу прогнозирования тяжести прогрессирования заболевания ВИЧ-1, который возможно применять в особенности для мониторинга протекания СПИД, а также мониторинга терапевтической эффективности антиретровирусной терапии.

Настоящее изобретение относится к in vitro способу прогнозирования прогрессирования заболевания ВИЧ-1 у пациента, инфицированного вирусом ВИЧ-1, включающему следующие этапы:

а) измерение уровня антител к 3S-пептиду в образце, взятом у указанного пациента,

б) сравнение уровня антител, измеренного на этапе а), с контрольным значением, которое является показателем прогрессирования заболевания ВИЧ-1.

Как показано в примерах настоящего описания, корреляция была обнаружена между уровнем анти-3S антител, а не их присутствием, и прогнозом прогрессирования заболевания ВИЧ-1 в общей популяции ВИЧ-1 инфицированных пациентов.

В данном описании подразумевается, что «заболевание ВИЧ-1» включает в себя по существу все физиологические условия, которые испытывал на себе индивидуум, который был заражен вирусом ВИЧ-1, начиная от момента заражения вирусом до даты смерти индивидуума, независимо от того, является ли смерть индивидуума прямым или косвенным следствием инфицирования вирусом. Следует напомнить, что инфицирование индивидуума вирусом ВИЧ-1 вызывает состояние хронического заболевания, которое постепенно приводит к снижению эффективности работы иммунной системы и делает ВИЧ-1-инфицированных индивидуумов восприимчивыми к оппортунистическим инфекциям и опухолям. Таким образом, заболевание ВИЧ-1 включает в себя период первичной инфекции (или острой инфекции), период сероконверсии, период бессимптомной стадии, раннюю и среднюю стадии симптоматического заболевания ВИЧ-1, а также позднюю стадию заболевания ВИЧ-1 (также называемую СПИД).

Согласно настоящему изобретению, анти-3S антитела к пептиду, имеющему последовательность SEQ ID №2, включают антитела, которые специфически связываются с контрольным полипептидом, имеющим аминокислотную последовательность, представляющую собой пептидную последовательность NH₂-SWSNKS-COOH (SEQ ID №1). В настоящем описании данные антитела имеют общее название «анти-3S антитела». Это также может относиться к антителам, связывающимся с пептидом, имеющим аминокислотную последовательность, которая является очень сходной с последовательностью SEQ ID №2. Пептиды, имеющие последовательность, которая является очень сходной с последовательностью SEQ ID №2, представляют собой пептиды, содержащие аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID №3 и SEQ ID №4, которые представляют собой пептиды, имеющие длину, составляющую 16 аминокислотных остатков, и содержащие аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID №3 и SEQ ID №4, например которые представляют собой (I) вариант пептида SEQ ID №2, где аминокислотный остаток серина в положении 11 заменен на остаток треонина и (II) вариант пептида SEQ ID №2, в котором аминокислотный остаток лизина в положении 10 заменен на остаток аргинина.

В данном описании подразумевается, что антитела к 3S-пептиду представляют собой антитела, которые связываются с пептидом SEQ ID №2.

Согласно настоящему изобретению, анти-3S антитела предпочтительно представляют собой поликлональные антитела, которые связываются с 3S-пептидом, и которые содержатся в образце, взятом у ВИЧ-инфицированного индивидуума.

Предпочтительно, 3S-пептид представляет собой пептид, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID №2.

По настоящему изобретению, анти-3S антитела предпочтительно представляют собой поликлональные антитела, которые связываются с 3S-пептидом, и которые содержатся в образце, взятом у ВИЧ-инфицированного индивидуума.

Предпочтительно, 3S-пептид представляет собой пептид, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID №2.

Как подразумевается в настоящем описании, «уровень» маркера для прогнозирования заболевания ВИЧ представляет собой количественное значение указанного маркера для прогнозирования в образце, например, в образце, взятом у ВИЧ-инфицированного индивидуума. В некоторых вариантах осуществления изобретения указанное количественное значение не представляет собой абсолютное значение, которое фактически измерено, а представляет собой конечное значение, полученное в результате принятия во внимание отношения сигнала к фону, имеющего место при определенном формате анализа и/или учете калибровочных контрольных значений, которые применяют для увеличения воспроизводимости измерений уровня маркера заболевания ВИЧ от анализа к анализу. В некоторых вариантах осуществления изобретения "уровень" маркера для прогнозирования заболевания ВИЧ выражается в произвольных единицах, так как важно, чтобы одинаковые единицы сравнивались при сравнении (I) от анализа к анализу, или (II) одного ВИЧ-инфицированного пациента с другим, или (III) анализов, выполненных в различные периоды времени для одного и того же пациента, или (IV) уровня маркера для прогнозирования ВИЧ, измеренного в образце, взятом от пациента, и заданным контрольным значением (которое также может быть названо в настоящем описании «отсекающим» значением).

Действительно, независимо от того, какого типа числовые единицы применяют для выражения уровня анти-3S антител в образце, измеренное значение отражает количество анти-3S антител, которое содержится в исследуемом образце, или, наиболее предпочтительно, концентрацию анти-3S антител в указанном образце.

Также показательным является то, что вирусную нагрузку ВИЧ в качестве маркера для прогнозирования возможно выразить в числовых единицах, которые отражают количество копий генома ВИЧ, содержащихся в исследуемом образце крови пациента, или альтернативно, концентрацию копий генома ВИЧ в исследуемом образце пациента.

Аналогичным образом, другие маркеры для прогнозирования ВИЧ могут быть выражены в числовых единицах, отражающих, соответственно (I) количество CD4 T-клеток в исследуемом образце или, альтернативно, их концентрацию, и (II) процент CD4 T-клеток среди всех лимфоцитов, присутствующих в исследуемом образце.

Как подразумевается в настоящем описании, образец, собранный у пациента, включает любые жидкости организма, которые, как ожидается, содержат антитела, и в первую очередь кровь и производные крови. Согласно изобретению, образец, собранный у пациента включает образец цельной крови, образец сыворотки крови и образец плазмы крови.

Как показано в примерах настоящего описания, in vitro способ согласно изобретению позволяет определять вероятность раннего или отсроченного возникновения состояния иммуносупрессии у ВИЧ-инфицированных пациентов. Следовательно, in vitro способ прогнозирования прогрессирования заболевания ВИЧ согласно изобретению возможно осуществлять с целью определения временных периодов для отслеживания клинических показателей ВИЧ-инфицированных пациентов, а затем для принятия решения о возможности начала антиретровирусного терапевтического лечения.

Как также показано в примерах настоящего описания, vitro способ согласно изобретению позволяет определить прогноз прогрессирования заболевания ВИЧ у ВИЧ-инфицированных пациентов, которые уже находятся в состоянии иммуносупрессии вследствие вирусной инфекции. Другими словами, vitro способ согласно изобретению позволяет различить (I) ВИЧ-инфицированных иммуносупрессированных пациентов, имеющих высокую вероятность раннего начала симптоматической стадии заболевания ВИЧ, и (II) ВИЧ-инфицированных иммуносупрессированных пациентов, имеющих низкую вероятность раннего начала симптоматической стадии заболевания ВИЧ.

Кроме того, примеры настоящего описания демонстрируют, что in vitro способ прогнозирования прогрессирования заболевания ВИЧ согласно изобретению позволяет различить (I) ВИЧ-инфицированных пациентов с высокой вероятностью долгосрочного выживания и (II) ВИЧ-инфицированных пациентов с низкой вероятностью долгосрочного выживания.

На этапе а) способа уровень анти-3S антител возможно измерять любым способом выявления антител, хорошо известным специалистам в данной области. Таким образом, уровень анти-3S антител возможно измерять любым видом иммуноанализа, включая, но не ограничиваясь ими, ИФА, радиоиммуноанализ, флуоресцентный иммуноанализ, иммуноаффинная хроматография, иммунопреципитация и тому подобные.

В определенных вариантах осуществления изобретения уровень анти-3S антител измеряют с помощью иммуносорбентного анализа, который включает в себя способ ИФА.

На этапе а), уровень анти-3S антител выражается как значение, указывающее на фактический сигнал, исходящий непосредственно или косвенно, от комплексов, образованных (I) 3S-пептидами, которые применяются в качестве наживки в способе детекции антител и (II) анти-3S антителами, присутствующими в исследуемом образце крови пациента.

Как правило, при осуществлении способов детекции антител, например, иммунологических, таких как ИФА, уровень сигнала (т.е. уровень анти-3S антител) выражается в Произвольных Единицах (ПЕ). Произвольные Единицы, как правило, определяют после вычитания сигнала фонового шума, причем последний измеряют в образце того же типа, что и образец пациента (например, образец сыворотки крови или образец плазмы крови), который, как известно, очищают от анти-3S антител. Как правило, Произвольные Единицы определяют после калибровки способа детекции антител, применяя серийные калибровочные стандарты (например, серийные образцы, где каждый образец содержит известное количество анти-3S антител).

На этапе б) in vitro способа прогнозирования прогрессирования заболевания ВИЧ согласно изобретению, количественное значение уровня анти-3S антител, которое измеряют на этапе а), сравнивают с заданным контрольным значением, являющимся показателем для прогнозирования заболевания ВИЧ. Указанное заданное контрольное значение является «показателем для прогнозирования заболевания ВИЧ», так как оно позволяет различить (I) "благоприятный" прогноз прогрессирования заболевания ВИЧ для значений, измеренных на стадии а), которые находятся выше указанного контрольного значения и (II) "неблагоприятный" прогноз прогрессирования заболевания ВИЧ для значений, измеренных на стадии а), которые находятся ниже указанного контрольного значения.

Как раскрывается в примерах настоящего изобретения, путем построения кривых Каплана-Мейера на основе значений уровня анти-3S антител, полученных в образцах, собранных у большой группы ВИЧ-инфицированных индивидуумов, у которых были под наблюдением различные соответствующие клинические параметры, включая время выживания, исследователи установили значение уровня анти-3S антител, которое обеспечивает возможность различить (I), пациентов с благоприятным исходом, в том числе с отсроченным спонтанным прогрессированием заболевания ВИЧ и длительным временем выживания и (II) пациентов с неблагоприятным исходом, в том числе неотсроченным спонтанным прогрессированием ВИЧ-инфекции и коротким временем выживания.

В качестве пояснения, при применении формата анализа ИФА, который раскрывается в примерах настоящего описания, заданное контрольное значение, которое также возможно определить как «отсекающее» значение, составляет 50. Таким образом, применяя формат анализа ИФА, который раскрывается в примерах, если в образце, взятом у ВИЧ-инфицированного пациента, уровень анти-3S антител, измеренный на этапе a) in vitro способа согласно изобретению, составляет менее 50, то такой пациент классифицируется как пациент с неблагоприятным исходом. Напротив, если в образце, взятом у ВИЧ-инфицированного пациента, уровень анти-3S антител, измеренный на этапе a) in vitro способа согласно изобретению, составляет более 50, то такой пациент классифицируется как пациент с благоприятным исходом.

Для осуществления in vitro способа прогнозирования заболевания ВИЧ согласно изобретению, для сравнения на этапе б) применяют контрольное значение, которое также возможно определить как «отсекающее» значение, которое возможно определить, как описано ниже.

Контрольное («отсекающее») значение для анти-3S антител в качестве маркера для прогнозирования возможно заранее определить путем осуществления способа, включающего следующие этапы:

а) обеспечение сбора образцов от ВИЧ-инфицированных пациентов;

б) обеспечение для каждого образца, предоставленного на этапе а), информации, относящейся к фактическому клиническому исходу о соответствующих ВИЧ-инфицированных пациентах;

в) обеспечение серий произвольных количественных значений для уровня анти-3S антител;

г) количественная оценка уровня анти-3S антител в каждом образце, взятом у пациента, содержащемся в коллекции, обеспеченной на этапе а);

д) классификация указанных образцов пациентов на две группы по одному конкретному произвольному количественному значению, полученному на этапе б), соответственно:

(I) первая группа, включающая образцы пациентов, в которых количественное значение уровня анти-3S антител ниже, чем указанное произвольное количественное значение, содержащееся в указанных сериях количественных значений;

(II) вторая группа, включающая образцы пациентов, в которых количественное значение уровня анти-3S антител выше, чем указанное произвольное количественное значение, содержащееся в указанных сериях количественных значений;

в соответствии с чем получены две группы образцов пациентов для указанного конкретного количественного значения, где образцы пациентов каждой группы отдельно пронумерованы;

е) вычисление статистической значимости между (I) количественным значением указанного биологического маркера, полученного на стадии г), и (II) фактического клинического исхода пациентов, относящихся к первой и второй группам, определенным на этапе д), у которых были собраны образцы сыворотки/плазмы;

ж) исследование путем этапов д) и е) различных произвольных значений;

з) установление в качестве указанного контрольного значения («отсекающего» значения), значения, соответствующего произвольной количественной величине, для которой была получена самая высокая статистическая значимость (наиболее значимой), из тех величин, которые наблюдались на этапе ж).

Как было раскрыто выше, указанный способ позволяет установить «отсекающее» значение, позволяющее различить прогноз благоприятного и неблагоприятного исхода.

Как подразумевается в настоящем описании, и показано в примерах данного описания, (I) прогноз неблагоприятного исхода включает высокую вероятность того, что клинические симптомы СПИД появятся в течение временного периода 6-72 месяцев после времени инфицирования ВИЧ, а также короткое время выживания пациентов, имеющих количество CD4 T-клеток менее 500 клеток/мм³ (включая пациентов, имеющих количество CD4 T-клеток менее 200 клеток/мм³), в то время как (II) прогноз благоприятного исхода включает низкую вероятность того, что клинические симптомы СПИД появятся в течение временного периода 6-72 месяцев после инфицирования ВИЧ, а также длительное время выживания пациентов, имеющих количество CD4 Т-клеток менее 500 клеток/мм³ (включая пациентов, имеющих количество CD4 T-клеток менее 200 клеток/мм³).

В определенных предпочтительных вариантах осуществления этапа б) способа определения отсекающих значений, описанного выше, указанную информацию, относящуюся к фактическому клиническому исходу, получают для ВИЧ-инфицированных пациентов, которые выбираются из группы, состоящей из (I) продолжительности периода выживания при отсутствии СПИД (AFS) и (II) времени выживания пациентов, имеющих количество CD4 T-клеток менее 500 клеток/мм³ или менее 200 CD4 клеток/мм³ (TCDB).

Как показано в примерах настоящего описания, точность прогноза заболевания ВИЧ при применении анти-3S антител в качестве маркера для прогнозирования, возможно дополнительно улучшить сочетанием данного маркера для прогнозирования с одним или более известным маркером для прогнозирования ВИЧ, например вирусной нагрузкой ВИЧ.

Как показано в примерах, точность прогноза заболевания ВИЧ по уровню анти-3S антител выше точности прогноза по одному другому известному маркеру для прогнозирования, а именно по вирусной нагрузке. Однако, примеры также показывают, что точность in vitro способа прогнозирования заболевания ВИЧ согласно изобретению возможно улучшить сочетанием (I) вирусной нагрузки в качестве маркера и (II) уровня анти-3S антител в качестве маркера.

Таким образом, в некоторых вариантах осуществления in vitro способа прогнозирования заболевания ВИЧ согласно изобретению, указанный способ включает дополнительные этапы:

1) измерение вирусной нагрузки ВИЧ в указанном образце, взятом у указанного пациента, и

2) сравнение значения вирусной нагрузки, измеренного на этапе 1) с контрольным значением, которое является показателем прогрессирования заболевания ВИЧ.

В варианте осуществления способа, описанном выше, вирусную нагрузку возможно измерять любым из обычных способов, хорошо известным специалистам в данной области техники. В качестве пояснения, вирусную нагрузку возможно измерять путем применения способа, раскрытого Jennings с соавт. (2005, J Clin Microbiol, Vol.43(12): 4950-4956). Более того, контрольное значение для количественного определения вирусной нагрузки возможно определить с помощью тех же способов, которые описаны здесь для расчета заданного контрольного значения (или «отсекающего» значения) уровня анти-3S антител.

Специалист в данной области техники легко поймет, что заданное контрольное значение («отсекающее» значение) для вирусной нагрузки в качестве маркера может варьировать в зависимости от применяемого формата анализа вирусной нагрузки.

В качестве пояснения, заданное контрольное значение («отсекающее» значение), составляющее log4, применяют в примерах для осуществления in vitro способа прогнозирования заболевания ВИЧ согласно изобретению.

Не желая быть связанными какой-либо конкретной теорией, изобретатели полагают, что vitro способ прогнозирования заболевания ВИЧ согласно изобретению возможно осуществлять, сочетая анти-3S антитела в качестве маркера для прогнозирования с одним или более маркером для прогнозирования заболевания ВИЧ.

Указанный один или более маркер для прогнозирования заболевания ВИЧ возможно выбрать из группы, включающей (I) вирусную нагрузку, (II) абсолютное количество CD4 T-клеток и (III) процент CD4+ T-лимфоцитов.

В соответствии с данными вариантами осуществления изобретения, vitro способ прогнозирования заболевания ВИЧ согласно изобретению может включать следующие этапы:

а) измерение уровня анти-3S антител и по меньшей мере одного другого маркера для прогнозирования заболевания ВИЧ в образце, полученном от ВИЧ-инфицированного пациента, и

б) сравнение, для каждого маркера для прогнозирования заболевания ВИЧ, измеренного на этапе а), итогового значения маркера с контрольным значением для указанного маркера для прогнозирования.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения, указанный один или более другой маркер для прогнозирования заболевания ВИЧ, выбирают из группы, включающей (I) ВИЧ-вирусную нагрузку, (II) абсолютное количество CD4 T-клеток, (III) процент CD4 T-клеток и (IV) отношение CD4+/CD8+ T-лимфоцитов. К ним относятся следующие сочетания маркеров для прогнозирования заболевания ВИЧ:

- уровень анти-3S антител в сочетании с маркером (I) выше,

- уровень анти-3S антител в сочетании с маркером (II) выше,

- уровень анти-3S антител в сочетании с маркером (III) выше,

- уровень анти-3S антител в сочетании с маркером (IV) выше,

- уровень анти-3S антител в сочетании с маркерами (I) и (II) выше,

- уровень анти-3S антител в сочетании с маркерами (I) и (III) выше,

- уровень анти-3S антител в сочетании с маркерами (I) и (IV) выше,

- уровень анти-3S антител в сочетании с маркерами (II) и (III) выше,

- уровень анти-3S антител в сочетании с маркерами (II) и (IV) выше,

- уровень анти-3S антител в сочетании с маркерами (III) и (IV) выше,

- уровень анти-3S антител в сочетании с маркерами (I), (II) и (III) выше,

- уровень анти-3S антител в сочетании с маркерами (I), (II) и (IV) выше,

- уровень анти-3S антител в сочетании с маркерами (II), (III) и (IV) выше,

- уровень анти-3S антител в сочетании с маркерами (I), (III) и (IV) выше,

- уровень анти-3S антител в сочетании с маркерами (I), (II), (III) и (IV) выше.

В зависимости от того, выше или ниже значение каждого маркера, измеренное на этапе а), по отношению к контрольным значениям, с которыми они сравниваются на этапе б), определяется «благоприятный» прогноз прогрессирования заболевания ВИЧ или «неблагоприятный» прогноз прогрессирования заболевания ВИЧ. Действительно, (I) значение анти-3S антител, которое выше заданного значения классифицируется как «благоприятный» прогноз, тогда как значение вирусной нагрузки, которое ниже заданного контрольного значения, классифицируется как параметр «неблагоприятного» прогноза.

Действительно, результаты этапа б) включают ситуации, в которых (I) по меньшей мере для одного исследованного маркера для прогнозирования ВИЧ, значение маркера, измеренное на этапе а), классифицировали как «неблагоприятный» прогноз по указанному маркеру (т.е. маркер возможно обозначить как «низкий»), и (II) по меньшей мере для одного исследованного маркера для прогнозирования ВИЧ, значение маркера, измеренное на этапе а), классифицировали как «благоприятный» прогноз по указанному маркеру (т.е. маркер возможно обозначить как «высокий»). В таких ситуациях, прогноз прогрессирования заболевания ВИЧ определяется с учетом количества, и, возможно, соответствующих статистических весов, «высоких» маркеров и «низких» маркеров. В некоторых вариантах осуществления изобретения, измеренное значение для каждого исследованного маркера балансируют путем воздействия на указанные измеренные значения маркера численных факторов, которые материализуют его вес и статистическую значимость в прогнозировании прогрессирования заболевания ВИЧ.

В вариантах осуществления способа для прогнозирования прогрессирования заболевания ВИЧ согласно изобретению, в котором анти-3S антитела как маркер для прогнозирования сочетаются с одним или несколькими другими маркерами для прогнозирования ВИЧ этап б) осуществляется путем математической интеграции значений, измеренных на этапе а) для каждого исследованного маркера для прогнозирования ВИЧ, и их сравнения с каждым из соответствующих контрольных значений, чтобы таким образом сформировать одно прогнозируемое значение (например, «неблагоприятный» прогноз или «благоприятный» прогноз) полученного составного маркера для прогнозирования заболевания ВИЧ. Формирование составных маркеров, объединяющих сочетание из двух или более маркеров хорошо известно специалистам в данной области техники.

В качестве пояснения, составные маркеры для прогнозирования заболевания ВИЧ могут быть результатом линейной комбинации каждого из отдельных маркеров для прогнозирования, включенных в него, где возможно применять логистическую регрессию для оценки соответствующего веса каждого отдельного маркера для прогнозирования, входящего в состав составного маркера для прогнозирования. В качестве альтернативы, для установления прогностического значения применяемой комбинации маркеров возможно применять соответствующие математические модели.

Настоящее изобретение дополнительно относится к способу мониторинга эффективности терапевтического лечения заболевания ВИЧ, обеспечивая точный прогностический показатель прогрессирования заболевания. Данный способ контроля является очень важным как (I) для определения возможных терапевтических лекарственных средств, так и (II) для контроля лечения пациентов данными препаратами.

В особенности, настоящее изобретение относится к способу мониторинга эффективности терапевтического лечения, включающему следующие стадии:

а) осуществление терапевтического лечения путем введения ВИЧ-1-инфицированному пациенту, нуждающемуся в данном лечении, фармацевтической композиции, включающей один или более антиретровирусных агентов, и

б) осуществление in vitro способа прогнозирования прогрессирования заболевания ВИЧ, описанного здесь, на образце, взятом у указанного пациента, и

в) соответствующая адаптация терапевтического лечения, которое осуществляли на этапе а), если это необходимо.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, терапевтическое лечение, которое выполняют на этапе а) продолжают, если определяют «благоприятный» прогноз, например высокую вероятность длительного выживания без перехода в стадию СПИД.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, терапевтическое лечение адаптируют (например, вводят в более высокой дозе или один или более активный ингредиент заменяют на более эффективные), если определяют «неблагоприятный» прогноз, например низкую вероятность длительного выживания без перехода в стадию СПИД.

В конкретном аспекте изобретение предусматривает введение эффективного количества противовирусного агента (или комбинации противовирусных агентов) ВИЧ-инфицированному индивидууму и контроль терапевтического исхода.

Как уже было указано ранее в данном описании, in vitro способ прогнозирования прогрессирования заболевания ВИЧ предпочтительно осуществляют известными способами иммунодетекции. Нижеследующие примеры иллюстрируют варианты осуществления in vitro способа прогнозирования ВИЧ путем иммуноферментного анализа (ИФА), который является весьма обычным способом иммунодетекции. Как и другие способы иммунодетекции, ИФА возможно осуществлять как неконкурентным, так и конкурентным способом.

При неконкурентном варианте ИФА немеченый антиген (например, 3S-пептид) связывается с твердым носителем или реакционной емкостью, такой как микротитрационный планшет или биочип.

Затем биологический образец (например, образец, собранный у ВИЧ-инфицированного пациента) объединяют с антигеном, связанным с реакционной емкостью, и антитела, которые присутствуют в биологическом образце (например, анти-3S антитела, которые присутствуют в образце, взятом у ВИЧ-инфицированного пациента) имеют возможность связаться с антигенами, иммобилизованными на твердом носителе, формируя, таким образом, иммунные комплексы.

После того, как иммунные комплексы были сформированы, избыток биологического образца удаляют и емкость промывают для удаления неспецифически связанных антител. Иммунные комплексы затем подвергают взаимодействию с соответствующими ферментно-меченными анти-иммуноглобулинами (которые могут также называться «вторичные антитела»). Вторичные антитела взаимодействуют с антителами (например, анти-3S антителами) в иммунных комплексах, а не с другими антигенами, связанными с реакционной емкостью. Вторичные антитела, специфично связывающиеся с антителами человека, хорошо известны в данной области техники и являются коммерчески доступными, как например антитела фирмы Sigma Chemical Co. (Сент-Луис, МО, США).

После второго этапа отмывки добавляют субстрат фермента. Фермент связан с вторичными антителами и катализирует реакцию, при которой происходит преобразование субстрата в детектируемый продукт. В присутствии избытка антигена количество продукта прямо пропорционально количеству антител (их также называют «первичные антитела»), присутствующих в образце пациента.

В некоторых вариантах осуществления изобретения продукт является флуоресцентным или люминесцентным, и его возможно измерить с применением технологии и оборудования, хорошо известных в данной области техники. В некоторых вариантах осуществления изобретения в результате ферментативной реакции происходит преобразование субстрата фермента в окрашенный продукт, который возможно измерить путем спектрофотометрии.

Типичные ферменты, которые могут быть связаны со вторичными антителами, включают пероксидазу хрена, глюкозооксидазу, глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназу, щелочную фосфатазу, бета-галактозидазу и уреазу.

Для осуществления ИФА подходящие твердые носители включают органические и неорганические полимеры, например, декстраны, природные или модифицированные целлюлозы, полиэтилен, полистирол, полиакриламиды, и т.д.

Для осуществления in vitro прогнозирования прогрессирования заболевания ВИЧ согласно изобретению, путем иммунодетекции анти-3S антител с применением 3S-пептида, указанный 3S-пептид возможно получить как (I) путем химического синтеза, так и (II) путем рекомбинантной экспрессии, например в клетках E.coli, трансформированных экспрессионной кассетой (в конечном счете, вставленной в рекомбинантный вектор, т.е. в рекомбинантную плазмиду), кодирующей указанный 3S-пептид.

Настоящее изобретение далее иллюстрируется, но никаким образом не ограничивается, нижеследующими примерами.

ПРИМЕРЫ

Пример 1: Определение уровня анти-3S антител в качестве маркера для прогнозирования прогрессирования заболевания ВИЧ

A. Материалы и методики

A.1. Пациенты

В группу ANRS SEROCO/HEMOCO, которую начали формировать в 1988 году, поступали ВИЧ-инфицированные взрослые, направленные из 21 больницы и от сети частных практикующих врачей. Исследование было одобрено Этическим Комитетом и все индивидуумы дали письменное информированное согласие. Пациентов подвергали тщательному клиническому и лабораторному обследованию при включении в исследование, а затем наблюдали каждые 3 или 6 месяцев в зависимости от их клинического состояния. Все СПИД-индикаторные заболевания проверяли в медицинских документах и рассматривали с участвующими врачами. Клиническое состояние пациентов, потерянных для последующего наблюдения, оценивали перекрестной проверкой с национальным регистром СПИДа. Сыворотку собирали при включении в исследование и при каждом посещении один раз в 6 месяцев и хранили при температуре минус 180°C.

В данном исследовании подходящие пациенты с известной датой сероконверсии были включены в группу в течение 24 месяцев после инфицирования и до 1996 года и мели в наличии криоконсервированные образцы сыворотки от момента включения в группу. ВИЧ-сероконверсия была задокументирована интервалом менее 24 месяцев между отрицательным и положительным анализом на антитела к ВИЧ, или неполным Вестерн-блотом с последующим полным Вестерн-блотом. Дата инфицирования определялась как дата неполного Вестерн-блота минус один месяц, или дата первичной симптоматической инфекции минус 15 дней, или как средняя точка между двумя анализами (Hubert 2000). 244 индивидуума с сероконверсией с имеющейся в наличии замороженной сывороткой включили в данный анализ. Последующее было подвергнуто цензуре в 1996 году до начала эры широкого применения кАРТ (комбинированной антиретровирусной терапии). Медианным годом инфицирования является 1989, а медиана времени наблюдения с момента инфицирования составила 6,5 лет.

A.2. Протокол исследования

Авторы рассмотрели 244 индивидуума с сероконверсией ВИЧ-1, не получавших лечения, которые были включены в группу SEROCO до 1996 года в течение 24 месяцев после инфицирования (медианный год включения в группу 1989). Последующее было подвергнуто цензуре в 1996 году, медиана времени наблюдения составила 6,5 лет. Ранний уровень анти-3S антител в момент включения в группу измеряли в замороженной сыворотке. Чтобы оценить роль анти-3S антител в риске прогрессирования заболевания, время с момента инфицирования до момента, когда количество CD4 составляет менее 200 клеток/мм³ (91 событие) и до клинического наступления СПИД (83 события) оценивали с помощью кривых Каплана-Мейера, сравнивая пациентов с антителами >50 единиц/мл с теми пациентами, у которых более низкий или неопределяемый уровень. Нескорректированный и скорректированный OP (относительный риск) оценивали на основе моделей регрессии Кокса.

A3. Измерение уровня анти-3S антител

Анализ ИФА осуществляли на плоскодонных 96-луночных микропланшетах (Maxisorp, Nunc).

Планшеты покрывали 3S-пептидом в концентрации 2 мг/мл в буфере PBS (phosphate buffered saline, фосфатно-солевой буфер) в течение 17 ночных часов при температуре 4°C. Планшеты дважды промывали раствором PBS/0,1% Tween, и затем блокировали в растворе PBS/3% обезжиренное молоко в течение 2 часов при температуре 37°C.

Исследуемую сыворотку/плазму инактивировали нагреванием (56°C, 45 мин), и затем добавляли в различных концентрациях (1/20, 1/200 и 1/2000) в трипликатах на 1 ч 30 мин при 37°C. Образцы сыворотки разводили в буфере для анализа (PBS, 3% обезжиренное молоко, 0,1% tween-20).

После двукратной отмывки в PBS/0,1% Tween, добавляли разведенные до концентрации 1/2000 конъюгированные с биотином антитела biotin-SP-conjugated rabbit anti-human IgG (Jackson ImmunoResearch) и инкубировали в течение одного часа при 37°C. Антитела, конъюгированные с биотином, разводили в буфере для анализа (PBS, 3% обезжиренное молоко, 0,1% tween-20).

После отмывки, биотин связывали, применяя разведенный до концентрации 1/5000 конъюгат ExtraAvidin Peroxidase conjugate (Sigma) в течение одного часа при 37°C. Конъюгат ExtraAvidin разводили в буфере для анализа (PBS, 3% обезжиренное молоко, 0,1% tween-20). После последней отмывки, окрашивание получали с применением раствора субстрата, и измеряли оптическую плотность (ОП) при длине волны 450 нм.

Планшеты дважды отмывали в PBS/0,1% Tween, а затем дважды в PBS, и окрашивание проявлялось в присутствии ТМБ (тетраметилбензидина) (Sigma) при комнатной температуре в темноте в течение 30 минут.

Химическую реакцию останавливали 4H H₂SO₄ и анализировали при длине волны 450 нм (Микропланшетный ридер, Molecular Devices).

В качестве негативного контроля применяли сыворотку человека AB (SAB) и плазму 10 неинфицированных доноров, разведенную в соотношении 1/20 буфером для анализа.

При количественном определении анти-3S антител применяли калибровочные стандарты, включающие разведения очищенных мышиных анти-3S антител, которые имеют название 15C8f2. Стандартная кривая соответствует последовательным 2-кратным разведениям данных моноклональных антител, со значением от 0 до 200 нг/мл. Моноклональные антитела разводили в буфере для анализа.

ОП исследуемых образцов приведены в линейной части стандартной кривой для получения соответствующей концентрации моноклональных антител 15C8f2, дающей тот же сигнал.

Значения анти-3S антител, выраженные в произвольных единицах, определяют с учетом коэффициента разбавления исследуемых образцов и объема. Предел обнаружения задается значениями, полученными для отрицательного контроля, и закреплен за значением 10 произвольных единиц.

A.4. Другие методики

Количество CD4 лимфоцитов определяли при каждом визите с помощью проточной цитометрии. Все уровни РНК ВИЧ-1 определяли ретроспективно в хранимой сыворотке.

Три лаборатории университета, принимающие участие в исследовании, применяли методику обратной транскрипции-полимеразной цепной реакции (тест Amplicor HIV-1 Monitor, Roche Molecular Systems, Neuilly-sur-Seine, количественное пороговое значение 400 копий/мл). Ранние уровни анти-3S антител на момент включения в группу измеряли в замороженной сыворотке (медиана времени, прошедшего с даты инфицирования: 9 месяцев).

A.5. Статистический анализ

Для сравнения качественных переменных применяли хи-квадрат Пирсона или точный тест Фишера, для непрерывных переменных применяли непараметрический тест Крускала-Уоллиса.

Для анализа пригодности уровня анти-3S антител в качестве маркера риска прогрессирования заболевания ВИЧ, время с момента инфицирования до момента, когда количество CD4 составляет менее 200 клеток/мм³ (91 событие) и до клинического наступления СПИД (83 события) оценивали с помощью кривых Каплана-Мейера. Кривые бессобытийной выживаемости для пациентов с антителами >50 единиц/мл сравнивали с таковыми для пациентов с более низким или недетектируемым уровнем, применяя логарифмический ранговый критерий. Нескорректированный и скорректированный ОР (относительный риск) оценивали, применяя модель Кокса.

Б. Результаты

72% индивидуумов с сероконверсией имели определяемые анти-3S антитела близко к сероконверсии (медиана времени с момента предполагаемого инфицирования: 9 месяцев), 53% составляли выше 50 единиц. Уровни анти-3S антител на момент включения в группу обратно коррелировали с уровнями ВИЧ-РНК, в то время как не было обнаружено связи с количеством CD4, как показано в Таблице 1 ниже. Таким образом, результаты показывают, что уровень анти-3S антител и количество CD4 T-клеток представляют собой независимые маркеры.

Таблица 1 Уровень анти-3S антител <10 11-50 51-85 86-120 121-180 >180 P   N=69 N=45 N=48 N=39 N=32 N=11   Содержание CD4^* 530 534 563 520 609 610 0,61 ^* Медиана

Прогрессирование в сторону количества CD4, составляющего менее 200/мм³ было значительно отсроченным у пациентов с анти-3S AT (антитела) >50, но эффект был переменным (значение переменной взаимодействия между анти-3S AT и временем: p=0,003). Эти результаты показаны на фигурах 1 и 2. Результаты Фигуры 1 и 2 показывают, что риск прогрессирования до количества CD4 T-клеток менее 200 CD4 T клеток/мм³ является отсроченным у пациентов, имеющих уровень анти-3S антител выше отсекающего значения, составляющего 50, если принять в расчет первые 120 месяцев после включения в группу (фигура 1, P логарифмического рангового критерия = 0,07; P Вилкоксона = 0,02) или первые 36 месяцев после включения (фигура 2; P логарифмического рангового критерия = 0,002, P Вилкоксона = 0,02). Результаты фигур 1 и 2 показывают, что уровень анти-3S антител представляет собой фактический маркер для прогнозирования прогрессирования заболевания ВИЧ, в частности, для прогнозирования выживания ВИЧ-инфицированных пациентов, имеющих количество CD4 T-клеток более 200/мм³.

В течение первых 3 лет после инфицирования относительный риск (OP) количества CD4<200/мм³ составляет 0,21 ([95% ДИ: 0,07-0,62], p=0,005).

Это преимущество выживаемости все еще наблюдалось после поправки на исходный уровень вирусной нагрузки и CD4, возраст и пол (скорректированный OP: 0,23 [0,07-0,73], p=0,01). Сходные результаты были получены для времени до наступления СПИД.

Кривые Каплана-Мейера показывают, что выживание пациентов с антителами >50 единиц/мл, и вирусной нагрузкой >log4 по сравнению с другими пациентами с вирусной нагрузкой >log4 длилось более 5-6 лет. Данные результаты показаны на фигурах 4-6. Фигура 3 иллюстрирует значения прогноза ВИЧ на основе только вирусной нагрузки ВИЧ в качестве маркера (p логарифмического рангового критерия = 0,005; P Вилкоксона=0,006). Оба биомаркера имеют различное собственное прогностическое значение, каждый из данных биомаркеров является независимым.

Фигура 3 иллюстрирует анализ уровня вирусной нагрузки ВИЧ в течение первых 36 месяцев после включения в группу, значения вирусной нагрузки классифицируются как находящиеся выше или ниже отсекающего значения log4.

Фигура 4 иллюстрирует совместный анализ (I) уровня анти-3S антител (выше ("высокий") или ниже ("низкий") отсекающего значения 50) и (II) уровня вирусной нагрузки ВИЧ (выше или ниже отсекающего значения log4), в течение 36 месяцев после заражения. Результаты фигуры 4 показывают, что определяется более точный прогноз прогрессирования заболевания ВИЧ, если уровень анти-3S антител в качестве маркера (ВИЧ-инфицированные пациенты, имеющие уровень анти-3S антител выше отсекающего значения 50) объединяется с вирусной нагрузкой в качестве маркера (значение вирусной нагрузки ниже отсекающего значения log4) (p логарифмического рангового критерия = 0,001; P Вилкоксона = 0,001). Такие же результаты для 120 месяцев после заражения показаны на фигуре 5 (p логарифмического рангового критерия = 0,0001; P Вилкоксона = 0,0001).

Фигура 6 иллюстрирует прогноз риска прогрессирования в СПИД при применении совместного измерения (I) уровня анти-3S антител и (II) уровня вирусной нагрузки для 120 месяцев после заражения. Результаты рисунка 6 показывают прогноз прогрессирования заболевания ВИЧ высокой точности, с весьма значительными значениями P логарифмического рангового критерия = 0,0005 и P Вилкоксона = 0,0003 соответственно.

У подмножества пациентов снова измеряли уровень антител через 24-36 месяцев после включения в группу.

Пациенты с постоянно высоким уровнем антител все еще имели преимущество выживаемости без признаков заболевания, по сравнению с пациентами, у которых наблюдалось снижение уровня анти-3S антител ниже 50.

Наконец, в таблице 2 настоящего документа показано, что уровень анти-3S антител и вирусной нагрузки ВИЧ представляют собой два независимых маркера для прогнозирования прогрессирования заболевания ВИЧ у ВИЧ-инфицированных пациентов.

Таблица 2 Анти-3S Антитела Нескорректированный OP (ДИ 95%) p Скорректированный OP^** (ДИ 95%) p Анти-3S AT≤50 1   1   Анти-3S AT>50 0,21 (0,07-0,62) 0,005 0,31 (0,10-0,98) 0,046 ^** скорректированный с поправкой на возраст, пол, вирусную нагрузку и ВИЧ-ДНК.

Результаты Таблицы 2 также показывают, что риск прогрессирования за период, превышающий 36 месяцев, до количества CD4 T-клеток менее 200 клеток/мм³ является отсроченным у пациентов с уровнем анти-3S антител выше отсекающего значения 50, после поправки на возраст, пол, вирусную нагрузку и ВИЧ-РНК и ДНК.

Все данные результаты показывают, что уровень CD4, вирусная нагрузка и анти-3S антитела являются тремя независимыми маркерами для прогнозирования заболевания ВИЧ. Кроме того, пороговое значение анти-3S антител было определено как отсекающее значение между пациентами с неблагоприятным и благоприятным прогнозом.

Группа изобретений относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике, и может быть использована для in vitro прогнозирования прогрессирования ВИЧ-1 (вирус иммунодефицита человека типа 1) заболевания у пациента, инфицированного вирусом ВИЧ-1. Для этого проводят следующие этапы: а) измерение уровня антител к 3S-пептиду, имеющему последовательность SEQ ID №2, в образце, взятом у указанного пациента, б) сравнение уровня анти-3S антител, измеренного на этапе а), с контрольным значением уровня анти-3S антител, которое является показателем прогрессирования ВИЧ-1 заболевания, где (I) уровень, измеренный на этапе а), который находится выше указанного контрольного значения, указывает на «благоприятный» прогноз прогрессирования заболевания ВИЧ, или (II) уровень, измеренный на этапе а), который находится ниже указанного контрольного значения, указывает на «неблагоприятный» прогноз прогрессирования заболевания ВИЧ. Также предложен способ мониторинга эффективности терапевтического лечения ВИЧ-1. Группа изобретений позволяет прогнозировать прогрессирование заболевания, вызванного ВИЧ-1, в общей популяции ВИЧ-инфицированных пациентов. 2 н. и 6 з.п. ф-лы, 6 ил., 2 табл., 1 пр.

1. Способ in vitro прогнозирования прогрессирования ВИЧ-1 (вирус иммунодефицита человека типа 1) заболевания у пациента, инфицированного вирусом ВИЧ-1, включающий следующие этапы:
а) измерение уровня антител к 3S-пептиду, имеющему последовательность SEQ ID №2, в образце, взятом у указанного пациента,
б) сравнение уровня анти-3S антител, измеренного на этапе а), с контрольным значением уровня анти-3S антител, которое является показателем прогрессирования ВИЧ-1 заболевания,
где (I) уровень, измеренный на этапе а), который находится выше указанного контрольного значения, указывает на «благоприятный» прогноз прогрессирования заболевания ВИЧ, или (II) уровень, измеренный на этапе а), который находится ниже указанного контрольного значения, указывает на «неблагоприятный» прогноз прогрессирования заболевания ВИЧ.

2. Способ in vitro по п. 1, где этап (а) осуществляют путем иммунодетекции антител к пептиду, имеющему последовательность SEQ ID №2.

3. Способ in vitro по п. 1, где этап (а) осуществляют путем ИФА (иммуноферментный анализ) с применением полипептида, включающего пептид, имеющий последовательность SEQ ID №2, иммобилизованного на твердом носителе.

4. Способ in vitro по п. 1, дополнительно включающий следующие этапы:
1) измерение вирусной нагрузки ВИЧ-1 в указанном образце, взятом у указанного пациента, и
2) сравнение значения вирусной нагрузки, измеренного на этапе (1), с контрольным значением, которое является показателем прогрессирования ВИЧ-1 заболевания.

5. Способ in vitro по п. 1, где:
- этап (а) дополнительно включает измерение по меньшей мере одного другого маркера для прогнозирования ВИЧ-1 заболевания в образце, полученном от ВИЧ-1-инфицированного пациента, и
- этап (б) включает сравнение итогового значения маркера для каждого маркера для прогнозирования ВИЧ-1 заболевания, измеренного на этапе (а), с контрольным значением для указанного маркера для прогнозирования.

6. Способ in vitro по п. 5, где указанный один или более других маркеров для прогнозирования ВИЧ-1 заболевания выбирают из группы, состоящей из (I) ВИЧ-вирусной нагрузки, (II) абсолютного количества CD4 Т-клеток, (III) процента CD4 Т-клеток и (IV) отношения CD4+/CD8+ Т-лимфоцитов.

7. Способ in vitro по п. 6, где этап (а) включает измерение сочетания маркеров для прогнозирования ВИЧ-1 заболевания, выбранного из группы, состоящей из:
- уровень анти-3S антител в сочетании с маркером (I),
- уровень анти-3S антител в сочетании с маркером (II),
- уровень анти-3S антител в сочетании с маркером (III),
- уровень анти-3S антител в сочетании с маркером (IV),
- уровень анти-3S антител в сочетании с маркерами (I) и (II),
- уровень анти-3S антител в сочетании с маркерами (I) и (III),
- уровень анти-3S антител в сочетании с маркерами (I) и (IV),
- уровень анти-3S антител в сочетании с маркерами (II) и (III),
- уровень анти-3S антител в сочетании с маркерами (II) и (IV),
- уровень анти-3S антител в сочетании с маркерами (III) и (IV),
- уровень анти-3S антител в сочетании с маркерами (I), (II) и (III),
- уровень анти-3S антител в сочетании с маркерами (I), (II) и (IV),
- уровень анти-3S антител в сочетании с маркерами (II), (III) и (IV),
- уровень анти-3S антител в сочетании с маркерами (I), (III) и (IV),
- уровень анти-3S антител в сочетании с маркерами (I), (II), (III) и (IV).

8. Способ мониторинга эффективности терапевтического лечения ВИЧ-1 заболевания, включающий следующие этапы:
а) осуществление терапевтического лечения путем введения ВИЧ-1-инфицированному пациенту, нуждающемуся в данном лечении, фармацевтической композиции, включающей один или более антиретровирусных агентов, и
б) осуществление способа in vitro прогнозирования прогрессирования ВИЧ-1 заболевания по любому из пп. 1-7 на образце, взятом у указанного пациента, и
в) соответствующая адаптация терапевтического лечения, которое осуществляли на этапе (а), если это необходимо.