СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ ГИПЕРЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ К ЯДУ ПЧЕЛЫ (APIS MELLIFERA) Российский патент 2017 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к области медицины, а именно к аллергологии и иммунологии, и может быть использовано при диагностике гиперчувствительности (ГЧ) больных аллергическими заболеваниями (АЗ) к яду пчел, что в дальнейшем позволит разработать адекватные профилактические мероприятия и стратегию выбора терапии, в том числе проведения аллергенспецифической иммунотерапиии (гипосенсибилизации) при аллергии к яду указанных насекомых.

ГЧ лежит в основе большинства заболеваний аллергического генеза, которые широко распространены и представляют собой серьезную социальную, экономическую и медицинскую проблему [Хаитов P.M. Клиническая аллергология. Руководство для практических врачей. М.: Медпресс-информ, 2002, 623 с.]. В литературе имеется множество доказательств того, что насекомые, как и большинство представителей типа Членистоногие, являются источниками аллергенов, способствующих формированию сенсибилизации у человека [Golden D.B., Marsh D.G., Kwiterovich К.A. et al. Natural history of Hymenoptera venom sensitivity in adults. // Allergy and Clin. Immunol. 1998. V. 102. P. 702-731; Федоскова Т.Г. Аллергия к «нежалящим» насекомым (распространенность, клиническая характеристика, специфическая диагностика и аллергенспецифическая иммунотерапия). Дисс. …докт. мед. наук, М.: ФГБУ «ГНЦ институт иммунологии» ФМБА России, 2008, 317 с.].

Гиперчувствительность - объективно воспроизводимые проявления и симптомы, развивающиеся при воздействии определенных факторов окружающей среды в дозах, не вызывающих этих проявлений у нормальных индивидуумов - является важным критерием аллергических состояний. Понятие гиперчувствительности объединяет все виды проявлений гиперреактивности (ГР) организма, в том числе опосредованной синтезом специфических IgE (истинная аллергия). В результате прямого действия токсинов яда пчелы на мембрану тучной клетки и других клеток-мишеней (базофилов и др.), в отличие от истинной (IgE-опосредованной) аллергической реакции может формироваться ГР организма к воздействующему фактору по типу ложной или псевдоаллергической реакции (не-IgE опосредованной), с последующей либерацией гистамина и других медиаторов воспаления и, как следствие, проявлением ГР в виде клинических признаков патофизиологической стадии ответной реакции организма [Федосеева В.Н., Рахманин Ю.А. Экологические аспекты гиперреактивности организма к факторам окружающей среды: Монография. М.: МАКС Пресс, 2012, 190 с.].

Таким образом, реакции ГЧ у больных АЗ возникают при ужалении пчелами не только по типу истинной аллергии с образованием специфических IgE, но и по типу формирования псевдоаллергических реакций. Последние характеризуются отсутствием высоких уровней специфических IgE и вовлечением в процесс ГЧ клеток-мишеней (преимущественно тучных клеток и базофилов) с либерацией медиаторов (гистамин, лейкотриены и др.) и последующей реализацией их действия на органах-мишенях [Адо А.Д. Общая аллергология. 2-е издание, переработаное и дополненное. - М.: Медицина, 1978, 464 с.]. Важную роль в патогенезе ГЧ в данном случае играет состояние клеточной мембраны клеток-мишеней. Большое значение при этом имеют процессы дегрануляции и либерации медиаторов, вызывающих состояние гиперчувствительности при воздействии яда пчелы.

При возникновении у пациента реакции ГЧ к укусам пчелы практическому врачу необходимо провести дифференциальную диагностику между истинной аллергией и неаллергической гиперчувствительностью с целью определения стратегии лечения - либо проведения аллерген-специфической иммунотерапии при IgE - обусловленной истинной аллергии, либо проведения терапии, направленной на стабилизацию мембраны клеток мишеней и снижение интоксикации и либерации медиаторов воспаления (санация очагов хронической инфекции, применение антилейкотриеновых препаратов и других лекарственных средств). Проведение дифференциальной диагностики требует разработки и применения системы методов диагностики состояний ГЧ у больных АЗ при ужалении пчелой. Диагностика реакций при этом требует условий in vitro в связи с высокой реактогенностью яда пчелы.

Уровень техники

В 80-90 гг. XX века диагностика ГЧ у больных на ужаления пчелами была преимущественно направлена на выявление специфических IgE, с использованием метода иммуноферментного анализа (ИФА). По настоящее время определение специфических IgE в сыворотках крови больных в клинических лабораториях проводят в большинстве случаев с использованием водно-солевых экстрактов аллергенов. Проведение исследования (постановка теста) основано на использовании смеси очищенных аллергенов и экстрактов аллергенов, в присутствии которых антитела класса Е связываются с ними и образуют комплексы «антиген -антитело», количество которых в дальнейшем измеряется и фиксируется. Чувствительность этих тестов составляет от 60% до 95%, а их специфичность от 30% до 95% [Siles R.I., Hsien F.Y. Allergy blood testing: A practical guide for clinicians // Cleveland Clinic Journal of Medicine. 2011. V. 78 (9). P. 585-592].

Данные тесты дешевы при использовании, однако имеют свои недостатки. Использование экстрактов может приводить к увеличению как ложноположительных результатов из-за присутствия компонентов с высокой перекрестной реактивностью или загрязнения аллергенами из других источников, так и ложноотрицательных из-за отсутствия или деградации основных аллергенных белков в экстракте.

Методы диагностики АЗ с применением не экстрактов аллергенов из натурального сырья, а отдельных очищенных или полученных рекомбинантным путем аллергенных молекул, что принято называть молекулярной аллергодиагностикой. Первая коммерческая система in vitro для подобного анализа ImmunoCAP ISAC («Phadia АВ», Швеция) - биочип, содержащий 103 компонента из более 50 натуральных источников аллергенов и включающий в себя основные клинически значимые видоспецифичные и перекрестно-реактивные маркеры, появилась в 2007 г. [Мокроносова М.А., Коровкина Е.С. Компонентная диагностика - новая эра в клинической аллергологии // Терапевтический архив. 2013. №10. С. 4-8 - прототип].

В настоящее время в составе яда пчелы выявлено двенадцать различных аллергенов, а коммерческие формы аллергенов разработаны только для двух основных аллергенов Api m1 (фосфолипаза A2), и Api m4 (мелиттин), что значительно ограничивает использование этого метода для выявления у больных АЗ гиперчувствительности ко всему спектру сенсибилизирующих компонентов, входящих в состав яда пчелы. Существенным недостатком указанного метода является невозможность выявления псевдоаллергического ответа на формирование гиперреактивности у больного к яду пчелы, что затрудняет снижение реактивности организма в условиях ужаления пчелой, профилактических мероприятий в условиях острых реакций на ужаления, определения прогноза развития тяжелых системных гиперергических реакций. Выявление в этих случаях псевдоаллергических реакций у больных при дифференциальной диагностике дает возможность рекомендаций способов терапии, направленных на стабилизацию мембран клеток-мишеней (базофилов), и снижение гиперреактивности организма к яду пчел.

Недостатком всех существующих методов диагностики гиперреактивности к яду пчел на основе IgE-специфических реакций является полное исключение возможности в условиях клинико-лабораторной диагностики выявить другой тип аллергической реактивности на яд пчелы, требующих иных терапевтических подходов к терапии. К числу недостатков методов определения специфических IgE следует также отнести их высокую стоимость.

Определение специфических IgE к яду пчелы нами применялось в качестве скрининг-теста для диагностики у больного аллергической реактивности при проведении дифференциальной диагностики истинных и псевдоаллергических реакций на яд пчел.

Достигаемым техническим результатом является дифференциальная диагностика истинных и псевдоаллергических реакций на яд пчел, что в последующем позволит назначить адекватное специфическое лечение с учетом формирования блокирующих (защитных) антител, эффекта стабилизации мембран клеток-мишеней аллергических реакций.

Раскрытие изобретения

Нами разработан комплексный метод диагностики гиперчувствительности к яду пчелы (непереносимости больных ужалений пчелой), который включает выявление следующего комплекса данных (для реализации нашего метода диагностики требуется обязательное определение всего нижеуказанного комплекса данных, т.к. определение именно данного комплекса позволит дифференцировать истинные и псевдоаллергические реакции на яд пчел):

- данных «положительного» анамнеза, т.е. наличие обязательного факта ужаления пациента в анамнезе пчелой (Apis mellifera), с последующими нежелательными патологическими реакциями различной степени тяжести.

Самым опасным проявлением ГР является анафилактический шок, нередко сопровождающийся для больного смертельным исходом. Риск развития анафилактических реакций возрастает у больных с истинной аллергией к яду пчел, осложненной наличием повышенного содержания гистамина в тканях (в т.ч. мастоцитоза), с высоким уровнем сывороточной триптазы в связи с тяжелым проявлением реакций анафилактического типа и высокими значениями общего IgE (для пациентов с аллергическими реакциями от 200 до 500 МЕ/мл и выше);

- данных об уровне специфических IgE к яду пчелы по оценке качества стабильности к воздействующему фактору клеток-мишеней, а именно: определение экспрессии CD63+, CD203c при контакте базофилов крови с аллергенами яда пчелы;

- данных о реакции клеток - мишеней аллергии (базофилов, эозинофилов) с выделением медиаторов воспаления (гистамина, лейкотриенов, базальная триптаза) при действии специфических аллергенов яда пчелы.

Разработанный метод позволяет верифицировать характер аллергической реакции у больных с непереносимостью ужалений пчелами, оценить реакции активации рецепторного типа клеток-мишеней (базофилов), либерацию медиаторов воспаления, осуществлять диагностику специфических IgE-опосредованных аллергических реакций и не-IgE-опосредованных реакций ГЧ на аллерген яда пчелы.

Разработанный метод диагностики позволит в дальнейшем подобрать адекватную стратегию специфической (или неспецифической) терапии, исключив тем самым риск развития осложнений при проведении лечения, а также определить стратегию профилактики и терапии состояния непереносимости яда пчелы.

Разработанный метод основан на выявленной нами корреляции данных положительного инсектного аллергоанамнеза и данных специфического аллергообследования in vitro в случае наличия у пациента достоверных анамнестических данных о реакции гиперчувствительности после ужаления пчелой.

Диагностические критерии указаны в таблице 1.

Уровень IgE определяли с помощью набора по определению специфического IgE и аллергена яда пчелы фирмы Dr. Fooke (Германия). По данным фирмы - производителя, указанным в инструкции по применению к набору, концентрация специфических IgE, выраженная в международных единицах на мл (МЕ/мл), имеет с классом реакции по IgE-связыванию следующие соотношения: 0 класс - <0,35, 1 класс - 0,35-0,7 МЕ/мл, 2 класс - 0,7-3,5 МЕ/мл, 3 класс - 3,5-17,5 МЕ/мл, 4 класс - 17,5-50 МЕ/мл.

Клинические примеры:

№1. IgE-опосредованная реакция.

Пациентка К. 32 лет. С детства страдает аллергическим ринитом с бытовой сенсибилизацией. В течение пяти лет дважды перенесла острые системные реакции после ужаления пчелой.

Впервые после ужаления возник выраженный ангионевротический отек, слабость, умеренные симптомы интоксикации. Состояние было верифицировано, как средне-тяжелая системная реакция после ужаления пчелой, далее не обследовалась.

Повторно после ужаления пчелой отмечено нарастание тяжести симптомов. Отмечено резкое снижение артериального давления, шум в ушах, головная боль, одышка, боль в области эпигастрия, ангионевротический отек лица и воротниковой зоны. Пациентка помещена в условия реанимационного отделения стационара.

Полученные результаты обследования представлены в таблице 2.

На основании полученных данных диагностировано наличие IgE-опосредованной реакции.

Назначено: эпинефрин, системные глюкокортикостероиды, бета 2 агонисты. На фоне применения указанных лекарственных средств отмечена положительная динамика.

№2. Не IgE-опосредованная реакция

Пациентка Ш. 58 лет. С 20-летнего возраста страдает хронической рецидивирующей крапивницей. В течение последних 10 лет пять раз подвергалась ужалению пчелой. Наблюдалось развитие умеренно выраженного ангиоотека в области ужаления, который купировался приемом антигистаминных средств. При последнем ужалении наблюдались головная боль, тошнота, слабость, умеренное понижение артериального давления, единичные симптомы волдырной сыпи, умеренный отек в области ужаления. Больная была госпитализирована.

Полученные результаты обследования представлены в таблице 3.

На основании полученных данных диагностировано наличие не IgE-опосредованной реакции.

Назначено: системные глюкокортикостероидные средства. На фоне применения указанных лекарственных средств отмечена положительная динамика.

Проведение дифференциальной диагностики обычно бывает затруднено схожей клинической картиной симптомов истинной инсектной аллергии и пседоаллергии при ужалении, т.к. их развитие обусловлено высвобождением одних и тех же медиаторов воспаления при различном патогенезе заболевания. Проведенные нами исследования показали, что только проведение диагностики с применением всех указанных методов в комплексе обеспечивает точную верификацию диагноза. Исключение хотя бы одного из методов обследования значимо снижает точность диагностических мероприятий.

Изобретение относится к области медицины, а именно к аллергологии и иммунологии, и может быть использовано при дифференциальной диагностике гиперреактивности (ГР) к яду пчел. Для этого выявляют в анамнезе пациента контакта с пчелой Apis mellifera. Определяют уровень общего IgE, уровень специфичного IgE к яду пчелы, гистамина, лейкотриенов, базальной триптазы, экспрессии CD63+ и CD203c при контакте базофилов крови с аллергенами яда пчелы, гистамина, лейкотриенов. При наличии в анамнезе контакта с пчелой Apis mellifera с последующими реакциями различной степени тяжести, уровне общего IgE более 100 МЕ/мл, уровне специфических IgE более 0,7 МЕ/мл, CD63+ более 10%, CD203c более 10%, уровне лейкотриенов более 200 пкг/мл, уровне гистаминолиберации от 10±3,2% до 50±5,3%, повышенном уровне базальной триптазы диагностируют IgE-опосредованную реакцию. При наличии в анамнезе контакта с пчелой Apis mellifera с последующими реакциями различной степени тяжести, уровне общего IgE менее 100 МЕ/мл, уровне специфических IgE менее 0,7 МЕ/мл, CD63+ менее 10%, CD203c более 10%, уровне лейкотриенов менее 200 пкг/мл, уровне гистаминолиберации до 15%, нормальном уровне базальной триптазы диагностируют не IgE-опосредованную реакцию. Разработанный комплексный метод позволяет осуществить дифдиагностику истинных и псевдоаллергических реакций на яд пчел, что в последующем позволит назначить адекватное специфическое лечение с учетом формирования блокирующих (защитных) антител. 2 пр., 3 табл.

Способ дифференциальной диагностики гиперчувствительности к яду пчелы Apis mellifera, включающий

выявление в анамнезе пациента контакта с пчелой Apis mellifera, определение: уровня общего IgE, уровня специфичного IgE к яду пчелы, гистамина, лейкотриенов, базальной триптазы, экспрессии CD63+ и CD203c при контакте базофилов крови с аллергенами яда пчелы, гистамина, лейкотриенов,

и при наличии в анамнезе контакта с пчелой Apis mellifera, с последующими реакциями различной степени тяжести, уровне общего IgE более 100 МЕ/мл, уровне специфических IgE более 0,7 МЕ/мл, CD63+ более 10%, CD203c более 10%, уровне лейкотриенов более 200 пкг/мл, уровне гистаминолиберации от 10±3,2% до 50±5,3%, повышенном уровне базальной триптазы, диагностируют IgE-опосредованную реакцию;

и при наличии в анамнезе контакта с пчелой Apis mellifera, с последующими реакциями различной степени тяжести, уровне общего IgE менее 100 МЕ/мл, уровне специфических IgE менее 0,7 МЕ/мл, CD63+ менее 10%, CD203c более 10%, уровне лейкотриенов менее 200 пкг/мл, уровне гистаминолиберации до 15%, нормальном уровне базальной триптазы, диагностируют не IgE-опосредованную реакцию.