ПРЕПАРАТИВНАЯ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКАЯ КОЛОНОЧНАЯ СИСТЕМА Российский патент 2017 года по МПК G01N30/32 

Настоящее изобретение относится к препаративной хроматографической колоночной системе. Одной из особенностей данной системы является использование двух инфракрасных детекторов, один из которых располагается до хроматографической колонки и второй - после хроматографической колонки, для формирования и мониторинга градиента элюирования, а также непрерывной проверки качества колонок, используемых для высокоэффективной жидкостной хромотографии (ВЭЖХ). Другой особенностью является применение недавно разработанного смесительного контура с регулируемой закрываемой пузырьковой ловушкой, которая отделена от смесительного контура системы и может разделять объемный поток.

Уровень техники:

На сегодняшний день стандартные препаративные системы ВЭЖХ разрабатываются индивидуально, определенных размеров, так как сформировавшийся в системе градиент не вполне можно перенести на системы других размеров. Также практически невозможно перенести технологические условия в аналитические или полупрепаративные системы. Это в равной степени относится и к переносу градиентов в системы другой конструкции.

Как указывается далее, высокое содержание азота и газов в элюентах, применяющихся в различного вида хроматографиях, может привести к выделению растворенного в элюенте газа во время формирования градиента, что с одной стороны негативно влияет на ИК-измерение до хроматографической колонки, и, соответственно, на формирование градиента и его воспроизводимость. С другой стороны, это также влияет на колонки ВЭЖХ и, в частности, на колоночные насадки, так как газ также выделяется и в пределах насадки, что может привести к образованию там трещин или неоднородностей. В стандартных системах ВЭЖХ пузырьковые ловушки, которые устанавливаются в системах, не могут полностью выполнять функцию дегазации потому, что как и весь смесительный контур, они находятся под давлением.

В заявке US 2011/073548 раскрыты система и способ сепарации. Минимизация ширины полосы элюата в жидкостной хромотографии раскрыта в патенте ЕР 0444441. В патенте US 4,116,046 раскрыта система жидкостной хромотографии. В патенте ЕР 2113770 раскрыты устройство и способ уменьшения фракции этанола в жидкостной хромотографии.

Сущность изобретения

Градиент в препаративной системе ВЭЖХ обычно контролируется посредством заданных объемов подачи насосов, но фактический градиент не учитывается. Также не учитывается влияние объемной усадки.

В данном случае описывается новая многомасштабная система ВЭЖХ с дополнительным многофункциональным ИК-детектором, который можно установить на выбор - либо после хроматографической колонки, либо непосредственно до колонки (но в любом случае после насоса высокого давления), а также модифицированный градиентный смесительный контур с функцией дегазации.

В данной заявке в качестве одного из аспектов изобретения раскрыта хроматографическая система, состоящая из смесительного контура или смесительной камеры, пузырьковой ловушки, концентрационного детектора и одного или более насосов, и отличающаяся тем, что пузырьковая ловушка имеет перманентно открытое отверстие в наивысшей точке, степень открытия которой можно регулировать.

Газ, выделяющийся из жидкости, и избыток жидкости можно удалить из пузырьковой ловушки в любое время через перманентно открытое отверстие при предварительно заданном регулируемом объемном расходе. Более того, перманентно открытое отверстие улучшает дегазацию жидкости.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения пузырьковая ловушка расположена за пределами или после смесительного контура или смесительной камеры. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения поток, поступающий в пузырьковую ловушку, регулируется. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения регулировка осуществляется посредством клапана.

Наличие возможности регулировать поток, поступающий в пузырьковую ловушку, позволяет регулировать количество жидкости, которое поступает на хроматографическую колонку после того, как покинет смесительный контур, или которая удаляется из системы через пузырьковую ловушку в ее наивысшей точке. Это может, например, улучшить контроль или способствовать формированию предварительно заданного градиента хроматографической колонки. Требуемый объем сквозного потока можно отрегулировать вместе со вторым концентрационным детектором, расположенным после основного насоса системы, таким образом, чтобы можно было минимизировать или даже избежать того количества объемного потока, которое отделяется пузырьковой ловушкой. Это достигается посредством сравнения фактического градиента с заданным градиентом, а также регулировкой степени открытия клапана на линии к пузырьковой ловушке и клапана у ее наивысшей точки, соответственно.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения пузырьковая ловушка располагается в пределах смесительного контура или смесительной камеры.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения объемный поток можно регулировать благодаря перманентно открытому отверстию. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения регулировка осуществляется посредством клапана.

Регулирование количества избыточной жидкости в пузырьковой ловушке с одной стороны дает возможность контролировать качество дегазации. С другой стороны, позволяет регулировать объем сбрасываемой жидкости.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения первый прибор измерения объемного расхода расположен за перманентно открытым отверстием пузырьковой ловушки, а второй прибор измерения объемного расхода расположен после колонки.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения хроматографическая система включает в себя второй концентрационный детектор, располагающийся после основного насоса.

Далее рассматривается хроматографическая система, отличающаяся тем, что включает в себя два концентрационных детектора, первый из которых расположен в смесительном контуре или смесительной камере, а второй расположен после основного насоса.

В результате подобного расположения двух концентрационных детекторов, а именно, одного - в смесительном контуре или смесительной камере, а второго - после основного насоса, можно проверять эффективность хроматографической системы посредством сравнения показаний второго концентрационного детектора с показаниями первого концентрационного детектора. Если два сигнала отличаются (с учетом поправки на время, требующееся на прохождение первого концентрационного детектора и прохождение второго концентрационного детектора), можно сделать вывод, что эффективность системы снизилась.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения хроматографическая колонка располагается между основным насосом и вторым концентрационным детектором.

Следующим аспектом изобретения является применение указанной хроматографической системы с целью проверки эффективности всей хроматографической системы.

Следующим аспектом изобретения является применение указанной хроматографической системы с целью проверки целостности хроматографической колонки.

Расположение двух концентрационных детекторов, а именно одного в смесительном контуре или смесительной камере, а второго - после хроматографической колонки, позволяет проверять целостность хроматографической системы посредством сравнения показаний второго концентрационного детектора с показаниями первого концентрационного детектора. В связи с применением подобной схемы расположения с целью проверки эффективности хроматографической системы, как указано выше, разница между сигналами двух детекторов может быть вызвана возникшей в системе или колонке проблемой. Если два сигнала отличаются (с учетом поправки на время, требующееся на прохождение первого концентрационного детектора и прохождение второго концентрационного детектора), можно сделать вывод, что целостность системы нарушена.

Еще одним аспектом изобретения является применение отношения сигналов, формирующееся из сигнала первого концентрационного детектора и сигнала второго концентрационного детектора, с целью контроля работы хроматографической системы.

Если сигналы двух концентрационных детекторов отличаются друг от друга, тогда можно внести коррективы в работу хроматографической системы. Ее можно отрегулировать после или до хроматографического разделения, а также во время разделения, которое происходит в настоящий момент, т.е. в режиме реального времени. Регулировать можно соотношение элюента в смесительном контуре или смесительной камере, степень открытия клапана на линии к пузырьковой ловушке, степень открытия клапана у перманентно открытого отверстия пузырьковой ловушки, скорость сброса из смесительного контура в хроматографическую колонку или объемный поток в направлении к хроматографической колонке.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения концентрационный детектор представляет собой ультрафиолетовый детектор (УФ-детектор), инфракрасный детектор (ИК-детектор), pH-детектор или детектор по проводимости, предпочтительно, УФ-детектор или ИК-детектор.

Подробное описание изобретения

В настоящей заявке описывается хроматографическая система, отличающаяся тем, что позволяет проводить/проводит непрерывную дегазацию во время формирования градиента, при этом градиент формируется в смесительном контуре, при этом система включает в себя пузырьковую ловушку, отличающуюся наличием регулируемого клапана у наивысшей точки, при этом непрерывная дегазация достигается посредством взаимодействия между открытием отверстия регулируемого клапана пузырьковой ловушки и скоростью закачки основного насоса. Наличие клапана в пузырьковой ловушке обеспечивает соответствие количества элюента, которое может поступить в пузырьковую ловушку, количеству элюента, прокачиваемому, т.е. перегоняемому в колонку, основным насосом, т.е. удаляемому из смесительного контура.

Кроме того, можно удалить избыток извлекаемого из смесительного контура элюента в пузырьковой ловушке через клапан пузырьковой ловушки. В данном режиме работы можно использовать многомасштабную хроматографическую систему, т.е. система может работать с колонками различных диаметров и размеров, т.е. ниже проектной производительности хроматографической системы. Это важно потому, что в целом крупные препаративные хроматографические системы разрабатываются и конструируются для работы с одной колонкой, т.е. колонкой определенного размера и диаметра. Кроме того, можно реализовать идентичные градиенты при различном расходе, что также позволяет использовать хроматографические колонки различных размеров/диаметров в пределах одной препаративной/крупной хроматографической системы.

Наличие регулируемого клапана у наивысшей точки пузырьковой ловушки или на трубке, отходящей от пузырьковой ловушки, позволяет достигать разных значений давления внутри пузырьковой ловушки абсолютно независимо от давления в смесительном контуре.

Таким образом, вышеуказанная пузырьковая ловушка определяет конкретную, независимую систему, позволяя работать с разработанной крупной хроматографической системой с описанной гибкостью.

В смешанных элюентах смесительного контура систем ВЭЖХ присутствует большое количество растворенных газов. Вследствие необходимости в повышении давления, там возможно выделение лишь небольшого количества газа.

В известных системах ВЭЖХ используется работающая под давлением пузырьковая ловушка, где давление сравнимо с давлением в смесительном контуре. Поэтому в подобного вида пузырьковых ловушках присутствует выделение лишь очень небольшого количества газа. Также, в тех случаях, когда процесс проходит в малогабаритной системе, где расход низкий (см. схемы на Фиг. 17 и 19), то вследствие медленной или низкой скорости входящего потока смешиваемость в пузырьковой ловушке становится плохой.

Раскрытая в данном документе пузырьковая ловушка, работающая не под давлением (переполняемая), и отделенная от смесительного контура регулируемым отсечным устройством, например, клапаном, способствует выделению большего количества газов, растворенных в элюенте. Более того, можно сбрасывать избыток градиентной смеси. Благодаря быстрому входящему потоку (см. схему на Фиг. 18) смешиваемость очень хорошая.

С помощью описываемой здесь системы ВЭЖХ можно проверять качество переноса градиентов, сформировавшихся в смесительном контуре, на колонку. Таким образом можно обнаружить изменения в запрограммированном градиенте, которые происходят, например, вследствие интерферирующих факторов или неблагоприятных условий в системе ВЭЖХ (см. Фиг. 15, 23, 24, 25 и 26).

Также с помощью описываемой здесь системы ВЭЖХ можно определять качество колонок ВЭЖХ, используемых до и во время этапов технологического процесса, т.к. можно обойтись без расчета того количества тарелок, после применения которого колонки должны пройти процедуру регенерации, которая представляет собой настолько большую нагрузку для колонок, что они могут выйти из строя и стать непригодными для дальнейшего использования (см. Фиг. 6, 7, 8, 9, 10, 27, 28, 29).

Смесительный контур описываемой здесь препаративной системы ВЭЖХ, где происходит формирование градиента, спроектирован для работы с максимальными объемами с целью обеспечить требуемое количество смешанного элюента в соответствии с объемным потоком в пузырьковой ловушке, расположенной после смесительного контура. Требуемый объемный поток подается к колонке основным насосом, а остаток выводится из системы через открытую пузырьковую ловушку, которая уже не интегрируется в смесительный контур (см. Фиг. 20, 21 и 22).

Обнаружили, что при подобном подходе градиент всегда формируется при идентичных условиях и переносится на колонки в том же качестве. Количество неиспользованного элюента, удаляемого из системы через пузырьковую ловушку, варьируется в зависимости от размера колонки и объемного расхода элюента. Чем они меньше, тем больше количество удаляемого элюента, а чем они больше, тем количество удаляемого элюента меньше. Градиент колонок в каждом случае одинаков, и при идентичных условиях процесса можно использовать колонки разных размеров. Это способствует повышению качества и надежности процесса (см. Фиг. 3, 11, 12, 14, 20, 21 и 22).

Также обнаружили, что использование дополнительного (второго) ИК-измерителя после хроматографической колонки позволяет переносить градиент на колонку любого размера и систему любой конструкции. ИК-сигнал, поступивший с линии измерения после колонки, является главным параметром, по которому происходит программирование системы до того момента, пока результат измерений, сделанных после колонки, не будет соответствовать требуемому результату (целевому значению) (см. Фиг. 15).

Интенсивная дегазация элюента достигается благодаря открытой пузырьковой ловушке. Подобная интенсивная дегазация, которая теперь может происходить в пузырьковой ловушке, отделенной от смесительного контура, дополняется улучшенной смешиваемостью поступающей жидкости. Подобным образом из смесительного контура можно непрерывно удалять большие количества растворенного газа. Это уменьшает интерференцию ИК-сигнала и приводит к улучшенному и более воспроизводимому формированию градиента на хроматографической колонке. Количество газа, удаленного из системы, также больше не нагружает расположенные следом колонки ВЭЖХ, что существенно увеличивает надежность данного этапа процесса (см. Фиг. 2, 3, 4 и 14).

Установка дополнительного ИК-измерителя позволяет непрерывно или с требуемой частотой мониторить качество градиента колонок. Неполадки в системе тотчас же обнаруживаются и немедленно исправляются.

Качество используемых колонок можно непрерывно мониторить при помощи ИК-измерений после хроматографической колонки. Мониторить можно, например, посредством сравнивания градиентов до и после колонки. Неравномерная или поврежденная насадка колонки, или поврежденное колоночное оборудование искажают градиент, перемещающийся по колонке, т.к. жидкость всегда течет по пути наименьшего сопротивления, например, по трещинам колонки. Если сравнить оба градиента, то можно увидеть, есть ли какие-либо отличия. В случае, когда градиенты отличаются друг от друга, тем самым указывая на то, что колонка повреждена, колонку можно немедленно исключить из процесса или подвергнуть отдельной испытательной процедуре или ремонтным работам, т.е. уже до того, как начнут происходить потери проб. К данной процедуре можно также прибегать во время регенераций колонки, которые проводятся после испытаний колонок. Как следствие, качество колонки можно оценить непосредственно до процесса разделения, при этом по мере необходимости можно прибегать к соответствующим своевременным мерам (см. Фиг. 6, 7, 8, 9, 10, 27, 28, 29).

Использование дополнительного ИК-измерителя позволяет (в добавок к непрерывному мониторингу перемещения градиента по колонке) применять в фазе равновесия, после регенерации колонки или непосредственно до введения пробы и оценки формы пика, сформировавшегося после того, как проба выйдет из колонки, короткий импульс в виде небольшого количества растворителя (предпочтительно буферный раствор В). Раствор можно добавлять до ввода каждой пробы, и это не требует последующей регенерации колонки. Многократный непрерывный мониторинг качества колонки можно проводить при помощи дополнительного ИК-измерения после хроматографической колонки в сочетании с ИК-измерением до хроматографической колонки, улучшая таким образом качество и надежность этапа ВЭЖХ (см. Фиг. 9 и 10).

Второй ИК-детектор, расположенный после хроматографической колонки, дополнительно позволяет выполнять дегазацию и может функционировать в режиме многоразмерности, т.к. это нужно для оптимизации требуемой для системы конструкции (например, объем и конфигурация пузырьковой ловушки) и оптимальной регулировки соответствующих компонентов (например, насоса или клапанов смесительного контура). После того, как система оптимально настроена, можно постоянно проводить непрерывный мониторинг и, при необходимости, немедленно вносить коррективы (см. Фиг. 23, 24, 25 и 26).

В настоящей заявке раскрыта новая конструкция системы ВЭЖХ, где пузырьковая ловушка отделена от смесительного контура. Отделение пузырьковой ловушки от смесительного контура посредством регулируемого клапана и благодаря ее открытой конфигурации, т.е. с возможностью удалять поступающий газ и поступающий элюент, т.е. с возможностью переполнения пузырьковой ловушки, является усовершенствованным способом решения проблемы дегазации элюентов до того, как они достигнут колонки (см. Фиг. 18).

Освобождение элюентов от газообразного содержимого приводит к двум существенным улучшениям:

- качество хроматографической колонки повышается за счет сокращения или даже прекращения дегазации на колонке;

- качество сформировавшихся в смесительном контуре градиентов улучшается за счет того, что никакие пузырьки газа не могут повлиять на ИК-сигнал.

Эти преимущества можно и дальше улучшить посредством второго сравнительного ИК-измерения после хроматографической колонки.

Наличие переполняемой пузырьковой ловушки улучшает формирование градиента и дегазацию. Этого можно достигнуть, например, посредством

- визуально заметной дегазации в пузырьковой ловушке и удаления пузырьков из системы;

- улучшенного процесса формирования градиента в смесительном контуре (сигнал первого ИК-измерителя).

В связи с тем, что пузырьковая ловушка является переполняемой, второе ИК-измерение после хроматографической колонки может позволить или позволяет

- проверить переносимость сформированных в смесительном контуре градиентов на колонку; данная функция не зависит от режима работы смесительного контура или конструкции системы;

- оптимизировать градиенты при работе с разными объемами.

Дополнительные функции по сравнительному ИК-измерению, а именно, проверка качества системы и колонки (независимо друг от друга), не зависят от переполняемой пузырьковой ловушки.

Отделение пузырьковой ловушки от смесительного контура позволяет большему объему проходить через пузырьковую ловушку и выходить из нее, чем тот, который перекачивается основным насосом в колонку. В данном случае пузырьковая ловушка переполняется и выпускает не только газы, но и небольшое количество смешанного элюента. Данный режим работы необходим, например, в случае с очень резкими или сложными градиентами, которые требуют быстрого прохода через пузырьковую ловушку, чтобы помимо прочего эффективно удалять образовавшиеся газы. Это приводит к формированию градиентов согласно запрограммированному и/или более стабильному и качественно улучшившемуся направлению градиентов. Переполнение пузырьковой ловушки можно использовать для переноса градиентов без существенной корректировки (1:1) в случае увеличения или уменьшения размеров системы или для улучшения качества градиента в целом.

Данный технический аспект в принципе не зависит от второго ИК-измерения после хроматографической колонки. Корректировки и надежность системы можно и дальше улучшить посредством второго сравнительного ИК-измерения после хроматографической колонки.

На Фиг. 1 представлена хроматограмма хроматографической колонки диаметром 10 см, где изображено неправильное направление градиента разделения. Это приводит к отклонениям в ходе процесса. Данный сигнал был получен при ИК-измерении в смесительном контуре.

Слева на Фиг. 13 представлены три динамики изменения градиента колонки ВЭЖХ диаметром 15 см и три динамики изменения градиента колонки ВЭЖХ диаметром 10 см справа, полученные при работе со стандартной системой. Невоспроизводимые и меняющиеся динамики изменения градиентов и степени открытия клапана для ацетонитрила очевидны в обоих случаях. Данные сигналы были получены при ИК-измерении в смесительном контуре, т.е. до колонки.

На Фиг. 2 представлена хроматограмма хроматографической колонки диаметром 10 см, на которой изображена динамика изменения градиента отделения после открытия и переполнения пузырьковой ловушки. Данная динамика изменения хорошая и воспроизводимая. Данный сигнал был получен при ИК-измерении в смесительном контуре.

На Фиг. 5 представлена хроматограмма хроматографической колонки диаметром 10 см, на которой изображена динамика изменения пика градиента неправильной регенерации. Пики градиента неострые. Данный сигнал был получен при ИК-измерении в смесительном контуре.

На Фиг. 4 представлена хроматограмма хроматографической колонки диаметром 10 см, на которой изображена динамика изменения градиента регенерации после открытия и переполнения пузырьковой ловушки. Пики градиента четкие и воспроизводимые. Данный сигнал был получен при ИК-измерении исключительно в смесительном контуре.

Более того, эффект очень эффективной дегазации достигается посредством открытия пузырьковой ловушки в результате резкого снижения давления.

Следующие примеры и цифры приведены с целью проиллюстрировать суть изобретения. Охраняемый объем изобретения определяется прилагающейся формулой изобретения. Очевидно, что в раскрываемые здесь способы могут быть внесены корректировки, не меняющие суть изобретения.

На Фиг. 1 представлена хроматограмма хроматографической колонки ВЭЖХ диаметром 10 см, на которой изображена динамика изменения градиента неполного разделения. Вследствие колебаний это приводит к отклонениям в ходе процесса. Данный сигнал был получен при ИК-измерении в смесительном контуре, т.е. до колонки.

На Фиг. 2 представлена хроматограмма хроматографической колонки ВЭЖХ диаметром 10 см, на которой изображена динамика изменения градиента разделения после открытия и переполнения пузырьковой ловушки. Данная динамика изменения воспроизводима и не меняется. Данный сигнал был получен при ИК-измерении в смесительном контуре, т.е. до колонки.

На Фиг. 3 представлены наложенные друг на друга градиенты хроматографических колонок ВЭЖХ диаметром 10 см и 15 см после открытия и переполнения пузырьковой ловушки в смесительном контуре. Обе динамики изменения сравнимы, воспроизводимы и имеют некоторые колебания (или, по меньшей мере, частично свободны от колебаний). Данный сигнал был получен при ИК-измерении в смесительном контуре, т.е. до колонки.

На Фиг. 4 представлена хроматограмма хроматографической колонки ВЭЖХ диаметром 10 см, на которой изображена динамика изменения градиента регенерации после открытия и переполнения пузырьковой ловушки, как раскрыто в настоящем изобретении. Пики градиента воспроизводимы. Данный сигнал был получен при ИК-измерении в смесительном контуре, т.е. до колонки.

На Фиг. 5 представлена хроматограмма хроматографической колонки диаметром 10 см, на которой изображена динамика изменения градиента неправильной регенерации. Пики градиента нечеткие. Данная хроматограмма была получена при работе с системой ВЭЖХ не в соответствии с условиями настоящего изобретения. Данный сигнал был получен при ИК-измерении в смесительном контуре, т.е. до колонки.

На Фиг. 6 представлена хроматограмма регенерации исправной колонки ВЭЖХ диаметром 15 см. Пики всех трех градиентов не искажены и вполне сравнимы, что указывает на отсутствие повреждений в насадке колонки. Впоследствии это подтвердилось стандартным способом проверки. Данный сигнал был получен при помощи ИК-измерителя, расположенного после основного насоса и после колонки.

На Фиг. 7 представлена хроматограмма регенерации неисправной колонки ВЭЖХ диаметром 15 см. Четко видно искажение возрастающего профиля пика первого градиента, возникшее из-за трещины в насадке колонки. Также по ИК-сигналу видно искажение пика второго градиента. Выявленная таким образом неисправность колонки затем подтвердилась стандартным способом проверки качества насадки колонки посредством определения количества тарелок и изучения матрицы колонки. Данный сигнал был получен при помощи ИК-измерителя, расположенного после основного насоса и после колонки.

На Фиг. 8 представлена хроматограмма регенерации неисправной колонки ВЭЖХ диаметром 30 см. В данном случае видно искажение градиентных пиков, что указывает на неисправность колонки. Неисправность колонки подтвердилась посредством стандартного способа проверки и изучения матрицы колонки. Данный сигнал был получен при помощи ИК-измерителя, расположенного после основного насоса и после колонки.

На Фиг. 9 представлен ИК-сигнал импульса растворителя до введения растворителя в колонку ВЭЖХ. Видны резкие и недеформированные профили данного пика. Данный сигнал был получен при помощи ИК-измерителя, расположенного после основного насоса и после колонки.

На Фиг. 10 представлен пик растворителя (см. также идеальный пик на Фиг. 9) после того, как растворитель прошел через поврежденную насадку колонки. Наглядно видно искажение двух профилей пика, возникшее из-за дефектов в насадке колонки. Ненадлежащее качество насадки подтвердилось стандартным способом проверки. Данный сигнал был получен при помощи ИК-измерителя, расположенного после основного насоса и после колонки.

Слева на Фиг. 11 представлены три динамики изменения градиента колонки ВЭЖХ диаметром 10 см, полученные при работе с системой, которую не модифицировали в соответствии с условиями настоящего изобретения. Четко видны колебания в степени открытия клапана для ацетонитрила, в некоторых случаях значительная, а также, как следствие, колебания градиента. Две градиентных динамики справа были получены при работе с системой, конфигурацию которой изменили согласно условиям настоящего изобретения, т.е. оснастили отдельной переполняемой пузырьковой ловушкой. Сами воспроизводимые градиентные динамики и степени открытия клапана для ацетонитрила видны четко, без явных колебаний. Данные сигналы были получены при ИК-измерении исключительно в смесительном контуре.

Слева на Фиг. 12 представлены три динамики изменения градиента колонки ВЭЖХ диаметром 15 см, полученные при работе со стандартными системами. В данном случае видно, что колебания степени открытия клапана для ацетонитрила, в некоторых случаях значительные, а также, как следствие, градиентные колебания меньше, чем при работе с колонкой диаметром 10 см. Две динамики изменения градиента справа были получены при работе с системой, конфигурацию которой изменили согласно условиям настоящего изобретения, т.е. оснастили отдельной переполняемой пузырьковой ловушкой. Сами воспроизводимые динамики изменения градиента и степени открытия клапана для ацетонитрила видны четко, без явных колебаний. Данные сигналы были получены при ИК-измерении в смесительном контуре, т.е. до колонки.

Слева на Фиг. 13 представлены полученные при работе со стандартной системой три динамики изменения градиента колонки ВЭЖХ диаметром 15 см и три динамики изменения градиента колонки ВЭЖХ диаметром 10 см справа. По обеим колонкам четко видны невоспроизводимые и различающиеся динамики изменения градиентов и степени открытия клапана ацетонитрила. Данные сигналы были получены при ИК-измерении в смесительном контуре, т.е. до колонки.

Слева на Фиг. 14 представлены две динамики изменения градиента колонки ВЭЖХ диаметром 15 см и две динамики изменения градиента колонки ВЭЖХ диаметром 10 см справа, полученные при работе с системой, соответствующей условиям настоящего изобретения, т.е. оборудованной переполненной пузырьковой ловушкой, отделенной от смесительного контура. По обеим колонкам четко видны воспроизводимые и почти идентичные динамики изменения градиента и степени открытия клапана ацетонитрила. Данные сигналы были получены при ИК-измерении в смесительном контуре, т.е. до колонки.

На Фиг. 15 представлены две динамики изменения градиента, зафиксированные на системе ВЭЖХ Äkta. Сигнал ÄКТА сформировался при передаче данных о производительности градиентного насоса, который использовали при программировании системы. Данные программирования ИК-измерений препаративной системы ВЭЖХ, существенно отличающейся от системы ВЭЖХ Äkta в плане конструкции и размеров, использовались как основа для программирования системы ВЭЖХ Äkta, где данные ИК-измерений запрограммировать нельзя. Обе динамики изменения градиента системы ВЭЖХ Äkta, в одном случае - данные о производительности градиентного насоса и в другом случае - фактические показатели ИК-измерений после смесительной камеры, были графически отмечены на диаграмме с учетом общей исходной точки. Видно существенное различие двух динамик изменения градиента, хотя согласно запрограммированному динамики должны быть идентичными. Данная диаграмма показывает, что перенос градиента между системами различных конструкций и размеров напрямую невозможен без отклонений, если не использовать или не учитывать дополнительные ИК-сигналы после смесительных контуров или смесительных камер.

На Фиг. 16 представлены наложенные друг на друга хроматограммы, полученные при работе с системой ВЭЖХ Äkta. Четко видны два пика различной ширины и формы. Данные пики сформировались при двух по-разному запрограммированных градиентах до и после учета фактических показателей ИК-измерения после смесительной камеры системы. Большее совпадение и лучшая возможность переноса динамик процесса отделения технологической системы и системы ВЭЖХ Äkta были достигнуты после корректировки Äkta-градиента (подгонки к производственной системе).

На Фиг. 17 схематично представлена стандартная препаративная система ВЭЖХ, оборудованная работающей под давлением пузырьковой ловушкой. Между пузырьковой ловушкой и смесительным контуром нет какого-либо отсечного устройства (клапана). Нет возможности разделить поток в пузырьковой ловушке или дегазировать элюенты. Также невозможно получить идентичные градиенты в колонках различных размеров. Скорость циркуляции в смесительном контуре постоянна. Данная система имеет один ИК-измеритель, расположенный в смесительном контуре. Как следствие, невозможно проверить качество колонки и градиента в режиме реального времени.

На Фиг. 18 схематично представлена препаративная система ВЭЖХ, модифицированная в соответствии с условиями настоящего изобретения, т.е. оборудованная пузырьковой ловушкой, которая отделена от смесительного контура и работает не под давлением, или может работать под гораздо более низким делением, чем та, которая расположена в смесительном контуре. Между пузырьковой ловушкой и смесительным контуром находится регулируемое отсечное устройство (например, клапан). Регулируемое отсечное устройство (например, клапан) можно по выбору установить на верхней линии выхода из пузырьковой ловушки. В пузырьковой ловушке может происходить разделение потока, а также дегазация элюентов. Также есть возможность получить идентичные градиенты в колонках различных размеров. Скорость циркуляции в смесительном контуре можно по-разному регулировать. Данная система имеет два ИК-измерителя, один из которых расположен в смесительном контуре, а другой - после основного насоса. Есть возможность проверить качество колонки и градиента онлайн в режиме байпаса колонки.

На Фиг. 19 схематично представлена стандартная препаративная система ВЭЖХ, имеющая пузырьковую ловушку, которая работает под давлением и интегрирована в смесительный контур. Между пузырьковой ловушкой и смесительным контуром нет какого-либо отсечного устройства. Нет возможности ни разделить поток в пузырьковой ловушке ни дегазировать элюенты. Также невозможно получить идентичные градиенты в колонках различных размеров. Скорость циркуляции в смесительном контуре постоянна. Данная система имеет лишь один ИК-измеритель, расположенный в смесительном контуре. Проверить качество колонки и градиента в режиме реального времени невозможно.

На Фиг. 20 представлен пример препаративной системы ВЭЖХ, модифицированной согласно условиям настоящего изобретения, т.е. оборудованной пузырьковой ловушкой, которая отделена от смесительного контура и может работать не под давлением. Между пузырьковой ловушкой и смесительным контуром находится регулируемое отсечное устройство (например, клапан). Данная система является примером системы наибольшего размера. Таким образом, в пузырьковой ловушке происходит только дегазация элюентов. В разделении потока необходимости нет, но при желании такая возможность есть. Скорость циркуляции в смесительном контуре можно по-разному регулировать. Данная система имеет два ИК-измерителя, один из которых расположен в смесительном контуре, а другой - после основного насоса. Соответственно, есть возможность проверить качество колонки и градиента в режиме реального времени.

На Фиг. 21 представлен пример препаративной системы ВЭЖХ, модифицированной согласно условиям настоящего изобретения, т.е. оборудованной пузырьковой ловушкой, которая отделена от смесительного контура и может работать не под давлением. Между пузырьковой ловушкой и смесительным контуром находится регулируемое отсечное устройство (например, клапан). В данном случае реализуется промежуточный вариант проведения процесса, что означает, что в пузырьковой ловушке происходит и дегазация элюентов и разделение потока. Разделение потока обеспечивает идентичность градиента градиенту колонки наибольшего размера (см. Фиг. 21). В совокупности объем потока, движущегося по направлению к колонке, и потока, выходящегося из системы через пузырьковую ловушку, идентичен объему потока в колонке наибольшего размера. Скорость циркуляции в смесительном контуре можно по-разному регулировать. Данная система имеет два ИК-измерителя, один из которых расположен в смесительном контуре, а другой - после основного насоса. Соответственно, есть возможность проверить качество колонки и градиента в режиме реального времени.

На Фиг. 22 представлен пример препаративной системы ВЭЖХ, модифицированной согласно условиям настоящего изобретения, т.е. оборудованной пузырьковой ловушкой, которая отделена от смесительного контура и может работать не под давлением. Между пузырьковой ловушкой и смесительным контуром находится регулируемое отсечное устройство (например, клапан). В данном случае реализуется вариант проведения процесса в системе наименьшего размера, что означает, что в пузырьковой ловушке происходит и дегазация элюентов и разделение потока. Разделение потока обеспечивает идентичность градиента градиенту колонки наибольшего и среднего размеров. В совокупности объем потока, движущегося по направлению к колонке, и потока, выходящегося из системы через пузырьковую ловушку, идентичен объему потока в колонке наибольшего размера. Скорость циркуляции в смесительном контуре можно по-разному регулировать. Данная система имеет два ИК-измерителя, один из которых расположен в смесительном контуре, а другой - после основного насоса. Соответственно, есть возможность проверить качество колонки и градиента в режиме реального времени.

На Фиг. 23 представлена процедура оптимизации динамики изменения градиента, где в качестве примера используется препаративная система ВЭЖХ, модифицированная согласно условиям настоящего изобретения, т.е. оборудованная пузырьковой ловушкой, которая отделена от смесительного контура и может работать не под давлением. Между пузырьковой ловушкой и смесительным контуром находится регулируемое отсечное устройство (например, клапан). Скорость циркуляции в смесительном контуре можно по-разному регулировать. Данная система имеет два ИК-измерителя, один из которых расположен в смесительном контуре, а другой - после основного насоса. Соответственно, есть возможность проверить качество колонки и градиента в режиме реального времени. Данная диаграмма иллюстрирует, что первый этап оптимизации градиента представляет собой правильную регулировку всех требуемых параметров в смесительном контуре и зоне подачи буферного раствора. Параметры успешно отрегулированы, когда данные ИК-измерения в смесительном контуре отражают оптимальное целевое положение градиента на данной позиции. В данном случае следует помимо прочего отрегулировать следующие параметры: наложение давления буферных емкостей и оптимальную скорость циркуляции в смесительном контуре.

На Фиг. 24 представлен пример процедуры оптимизации динамики изменения градиента с использованием препаративной системы ВЭЖХ, модифицированной согласно условиям настоящего изобретения, т.е. оборудованной пузырьковой ловушкой, которая отделена от смесительного контура и может работать не под давлением. Между пузырьковой ловушкой и смесительным контуром находится регулируемое отсечное устройство (например, клапан). Скорость циркуляции в смесительном контуре можно по-разному регулировать. Данная система имеет два ИК-измерителя, один из которых расположен в смесительном контуре, а другой - после основного насоса. Соответственно, есть возможность проверить качество колонки и градиента в режиме реального времени. Данная диаграмма иллюстрирует, что второй этап оптимизации градиента представляет собой согласование данных со вторым ИК-измерителем, расположенным дальше, после того, как из основного насоса системы выйдет правильный объем потока. В данном случае очевидны существенные различия между двумя градиентами, которые следует устранить соответствующими исправительными мерами.

На Фиг. 25 представлен пример процедуры оптимизации динамики изменения градиента с использованием препаративной системы ВЭЖХ, модифицированной согласно условиям настоящего изобретения, т.е. оборудованной пузырьковой ловушкой, которая отделена от смесительного контура и может работать не под давлением. Между пузырьковой ловушкой и смесительным контуром находится регулируемое отсечное устройство (например, клапан). Скорость циркуляции в смесительном контуре можно по-разному регулировать. Данная система имеет два ИК-измерителя, один из которых расположен в смесительном контуре, а другой - после основного насоса. Соответственно, есть возможность проверить качество колонки и градиента в режиме реального времени. Данная диаграмма иллюстрирует, что следующий этап оптимизации градиента включает следующие меры: регулировку количества потока, взятого из смесительного контура, например, через регулируемый клапан, который находится между пузырьковой ловушкой и смесительным контуром, до оптимального, регулировку количества потока, которое выходит из системы через пузырьковую ловушку в ее наивысшей точке, до оптимального, а также общую проверку всех компонентов системы.

На Фиг. 26 представлен пример процедуры оптимизации динамики изменения градиента и ее постоянного мониторинга с использованием препаративной системы ВЭЖХ, модифицированной согласно условиям настоящего изобретения, т.е. оборудованной пузырьковой ловушкой, которая отделена от смесительного контура и может работать не под давлением. Между пузырьковой ловушкой и смесительным контуром находится регулируемое отсечное устройство (например, клапан). Скорость циркуляции в смесительном контуре можно по-разному регулировать. Данная система имеет два ИК-измерителя, один из которых расположен в смесительном контуре, а другой - после основного насоса. Соответственно, есть возможность проверить качество колонки и градиента в режиме реального времени. Данная диаграмма иллюстрирует, что после того, как все параметры системы успешно заданы, оба градиента, в смесительном контуре и после основного насоса, идентичны. После этого процесс подгонки завершен и можно на постоянной основе использовать полученные значения для программирования системы. С этого момента и впоследствии качество градиента непрерывно мониторится в режиме байпаса колонки посредством дополнительного ИК-измерения. С этой целью тестовые прогоны системы без использования колонки или в режиме байпаса колонки проводят через регулярные интервалы. Это обеспечивает отсутствие негативного влияния на используемые колонки ВЭЖХ. Отклонения быстро обнаруживаются и могут быть устранены.

На Фиг. 27 представлен пример процедуры проверки качества используемых колонок ВЭЖХ с применением системы ВЭЖХ, имеющей второй ИК-измеритель, располагающийся после основного насоса. Данное дополнительное ИК-измерение можно проводить на соответствующей линии байпаса, либо до либо после колонки. Первое ИК-измерение проводится до основного насоса. Соответственно, есть возможность проверить качество колонки и градиента в режиме реального времени. Данная диаграмма иллюстрирует, что первый этап проверки качества колонки - это определить влияющую на качество колонки динамику изменения градиента после колонки. Значимость градиента или контролируемой динамики изменения для колонки можно привести на примере чрезмерных колебаний давления, которые происходят во время перемещения градиента по колонке. Другими факторами, оказывающими влияние, являются выброс газа, который может произойти из-за состава буферного раствора в матрице колонки, и температурные колебания. Также было обнаружено, что градиенты, имеющие части с особо крутым наклоном, лучше всего подходят для оценки качества насадки колонки ВЭЖХ. Как правило, регенерация колонки до разделения продукта является критическим этапом. В то же время есть риск, что неисправности колонки, которые могли возникнуть во время регенерации, останутся невыявленными до процесса отделения, что может иметь очень негативные для него последствия.

На Фиг. 28 представлен пример процедуры проверки качества используемых колонок ВЭЖХ с применением системы ВЭЖХ, имеющей второй ИК-измеритель, располагающийся после основного насоса. Данное дополнительное ИК-измерение можно проводить на соответствующей линии байпаса, либо до либо после колонки. Первое ИК-измерение проводится перед основным насосом. Соответственно, есть возможность проверить качество колонки и градиента в режиме реального времени. Данная диаграмма иллюстрирует как в процессе сопоставления обоих градиентов (до колонки и после колонки) можно получить указание на неисправность колонки. Данное указание дают различия между динамиками обоих градиентов. Следующие условия являются необходимыми для подобного вывода:

- Динамика изменения градиента до колонки обычная, т.е. градиентная система функционирует исправно и правильный градиент переносят на колонку. См. вышеописанную процедуру (Фиг. 23-26).

- В случае возникновения сомнений в первую очередь следует проверить систему.

- Если никакие факторы, влияющие на работу системы, не являются причиной. нарушений в динамике изменения градиента после колонки, причину следует искать в дефектной насадке. Наибольший ущерб колонкам ВЭЖХ наносят трещины, образование которых вызвано высокими показателями давления, общими для всех процесов. Нагрузка на насадку колонки огромна, т.к. материал постоянно сжимается и разжимается. После образования трещины (обычно в области стенки колонки) происходит неравномерное распределение колоночной насадки и неравномерное поступление потока в колонку. Это обусловлено тем, что жидкости всегда текут по пути наименьшего сопротивления. В колонке, где образовались трещины, поврежденные области колоночной насадки предпочтительно перфузируют, т.к. таким образом жидкость может вытечь из колонки наикратчайшим путем и снять напряжение. Такое поведение обнаруживается благодаря ИК-детектору, установленному после колонки, в частности в случае быстрого изменения состава буферного раствора. Если, в случае изменения состава буферного раствора до колонки, изменение сигнала после колонки обнаруживается быстрее, чем задержка, вызванная так называемым «мертвым» объемом колонки, то это знак того, что насадка колонки дефектная. Более того, динамика изменения градиента, зафиксированная после повреждения колонки, обычно невоспроизводима и нерегулярна, т.к. условия в поврежденной насадочной колонке ВЭЖХ очень изменчивы и скорость, при которой происходит повреждение, велика.

На Фиг. 29 представлен пример процедуры проверки качества используемых колонок ВЭЖХ. Данная проверка осуществляется посредством определения так называемого числа теоретических тарелок (НЕТР). В ходе данной проверки генерируется и оценивается один или больше УФ-пиков. Перед следующим вводом пробы следует убедиться, что УФ-активные субстанции, используемые для проведения проверки, полностью удалены, чтобы не ухудшить качество пробы. Соответственно, регенерацию следует проводить обычно после данной проверки, которая, как уже показано на Фиг. 27 и 28, представляет собой особую нагрузку на колонку. Нередко, что и сам способ проведения проверки оказывает высокую нагрузку на колонку. Пока колонка не пройдет регенерацию, вводить пробу и проводить последующее отделение нельзя.

Примеры

Пример 1

Различия в динамике изменения градиента в системах ВЭЖХ разных конструкций и размеров

Градиент системы ВЭЖХ Äkta контролируется исключительно заданным объемом подачи насосов, но фактическая динамика изменения градиента не учитывается. Также не учитывается влияние объемной усадки.

Процесс в более крупной производственной системе включает регулирование состава буферного раствора посредством ИК-детектора и, как следствие, измерение и регулирование фактического состава буферного раствора (градиента).

Буферный раствор проходит непосредственно от смесительной камеры к ИК-детектору через ячейку для измерения проводимости, при этом в обход обычных кольцевых клапанов. Чтобы расходные условия были сопоставимы, необходимо увеличить расход до 60 мл/мин в силу большого поперечного линейного сечения. Состав буферных растворов А и В идентичен в обеих хроматографиях.

Использовали тот же градиент, что и в предыдущей программе отделения, а данные в это же время фиксировались ИК-детектором. Значения обоих градиентов Äkta-хроматографии (объемы подачи градиентных насосов) и фактически измеренный после смесительной камеры системы Äkta ИК-сигнал графически отмечены на диаграмме формата Excel (Фиг. 15) с учетом общей исходной точки. Разница между двумя градиентами определена и программа откорректирована с учетом этого значения (Фиг. 16) (см. также описание к указанным фигурам).

Старый градиент системы Äkta был круче на первом этапе, а именно, в той части, где уже началось элюирование. Как результат, ширина пика меньше, если сравнивать с новым градиентом. Показатели выхода продукта в системе Äkta были выше, чем показатели препаративной системы, что указывает на различия в ходе протекания процесса отделения и его результате.

Теперь, благодаря оптимизации градиентов с помощью последующего второго ИК-измерения, перенос градиентов между производственной системой и системой Äkta проходит лучше (см. также описание к Фиг. 15 и 16).

Пример 2

Количество элюента, сброшенное через пузырьковую ловушку, отделенную от смесительного контура

Использование переполняемой пузырьковой ловушки позволяет удалять из системы избыток элюента наряду с выбрасываемыми через нее газами. В силу того, что размер системы соответствует максимальному размеру колонки, которую будут эксплуатировать, объем удаляемого избытка зависит от применяемого расхода и, таким образом, диаметра используемой колонки.

При использовании колонки диаметром 30 см расход составляет 162 л/ч. Переполняемая пузырьковая ловушка наполняется полностью. Из системы нужно удалить лишь газ и небольшое количество избыточного элюента (Фиг. 20).

При использовании колонки диаметром 15 см расход составляет 40,5 л/ч. Переполняемая пузырьковая ловушка наполняется полностью. Из системы нужно удалить газ и 121,5 л избыточного элюента (Фиг. 21).

При использовании колонки диаметром 10 см расход составляет 18 л/ч. Переполняемая пузырьковая ловушка наполняется полностью. Из системы нужно удалить газ и 154 л избыточного элюента (Фиг. 22).

На Фиг. 3 представлены наложенные друг на друга градиенты хроматографических колонок диаметром 10 см и 15 см после открытия и переполнения пузырьковой ловушки в смесительном контуре. Обе кривые абсолютно сопоставимы.

Настоящее изобретение относится к препаративной хроматографической колоночной системе. Хроматографическая система состоит из смесительного контура или смесительной камеры, пузырьковой ловушки. Также хроматографическая система содержит концентрационный детектор и один или более насосов. При этом пузырьковая ловушка в своей наивысшей точке имеет перманентно открытое отверстие. Техническим результатом является обеспечение возможности проводить непрерывную дегазацию во время формирования градиента. 8 з.п. ф-лы, 29 ил.

1. Хроматографическая система, состоящая из смесительного контура или смесительной камеры, пузырьковой ловушки, концентрационного детектора и одного или более насосов, и отличающаяся тем, что пузырьковая ловушка в своей наивысшей точке имеет перманентно открытое отверстие.

2. Хроматографическая система по п. 1, отличающаяся тем, что пузырьковая ловушка расположена за пределами или после смесительного контура или смесительной камеры.

3. Хроматографическая система по п. 1 или 2, отличающаяся тем, что поступающий в пузырьковую ловушку поток регулируется.

4. Хроматографическая система по п. 3, отличающаяся тем, что регулирование производится при помощи клапана.

5. Хроматографическая система по п. 1, отличающаяся тем, что пузырьковая ловушка расположена в пределах смесительного контура или смесительной камеры.

6. Хроматографическая система по п. 1, отличающаяся тем, что объемный расход через перманентно открытое отверстие можно регулировать.

7. Хроматографическая система по п. 6, отличающаяся тем, что регулирование производится при помощи клапана.

8. Хроматографическая система по п. 1, отличающаяся тем, что первый прибор для измерения объемного расхода расположен после перманентно открытого отверстия, а второй прибор для измерения объемного расхода расположен после колонки.

9. Хроматографическая система по п. 1, отличающаяся тем, что включает в себя второй концентрационный детектор, расположенный после насоса.