Способ введения диэлектрического микроконтейнера в клетку млекопитающего с использованием фемто-пикосекундных импульсов лазерного излучения Российский патент 2017 года по МПК C12N13/00 C12N5/07 C12N15/87 

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способам введения сферических диэлектрических микроконтейнеров, несущих определенный генетический материал, такой как ДНК или РНК, в клетки млекопитающих (в том числе в эмбрионы).

Известен (RU, патент 2079554, опубл. 20.05.1997) способ введения биологического материала в живую клетку потоком газа под давлением, включающий предварительное культивирование клеток и внедрение биологического материала, связанного с частицами носителя, в клетки. Связывание биологического материала осуществляют посредством фиксирования его в объеме несущей среды от 0,5 микролитра до 1000 микролитров, несущие частицы имеют диаметр в пределах от 0,1 микрона до 100 микрон, в предпочтительном варианте от 0,5 микрона до 5 микрон. В общем случае, несущие частицы имеют плотность в области от 1 г/см³ до 25 г/см³, в предпочтительном варианте от 10 г/см³ до 25 г/см³.

Известный способ не может обеспечить доставку одного микроконтейнера с генетическим материалом в конкретную клетку с заданной координатой. Возможна только случайная доставка.

Известен также (RU, патент 2510826, опубл. 10.04.2014) способ введения siRNA в клетки фотохимической интернализацией. Известный способ включает контактирование указанной клетки, в том числе и млекопитающих, с молекулой siRNA, носителем и фотосенсибилизирующим веществом и облучение клетки излучением с длиной волны, эффективной для активации фотосенсибилизирующего вещества. Носитель содержит катионный полиамин, выбранный из липополиамина в нелипосомальном составе, разветвленного полиэтиленимина, полимера бетациклодекстринамина, молекулы дендримера РАМАМ и катионного пептида, выбранного из полиаргинина или сополимеры L-или D-аргинина. Способ используют для ингибирования экспрессии гена-мишени, получения клетки или популяции клеток, содержащей молекулы siRNA, а также для лечения или профилактики заболевания, в случае которого может быть полезным подавление одного или нескольких генов, в том числе для лечения злокачественной опухоли.

Известный способ не может обеспечить доставку одного микроконтейнера с генетическим материалом в конкретную клетку с заданной координатой. Возможна только случайная доставка.

Наиболее близким аналогом разработанного способа можно признать Terakawa М et al. Dielretric microshere mediated transfection using a femtosecond laser. Optics Letters, 2011, v. 36, N 15, p. 2877-2879. Согласно известному способу на свободно плавающие микроконтейнеры воздействуют фемто-пикосекундными импульсами лазерного излучения, при этом микроконтейнеры перемещаются в произвольном направлении, случайным образом соприкасаясь с клетками млекопитающих, т.е. клетки случайным образом «засевают» микроконтейнерами.

Известный способ не может обеспечить доставку одного микроконтейнера с генетическим материалом в конкретную клетку с заданной координатой. Возможна только случайная доставка.

Техническая задача, решаемая посредством разработанного способа, состоит в расширении ассортимента методов трансфекции.

Технический результат, достигаемый при реализации разработанного способа, состоит в достижении возможности доставки единичного микроконтейнера в конкретную клетку с заданной координатой.

Для достижения указанного технического результата предложено использовать разработанный способ введения диэлектрических микроконтейнеров в клетки млекопитающих с использованием фемто-пикосекундных импульсов лазерного излучения.

Согласно разработанному способу диэлектрическую микросферу приводили в соприкосновение с клеточной мембраной и облучали цугами фемтосекундных импульсов титан-сапфирового лазера с длиной волны 780 нм, длительностью 30 фс, частотой повторения 1 кГц и энергией порядка 100 нДж, фемтосекундные импульсы фокусировались диэлектрической микросферой в области ближнего поля вблизи диэлектрической микросферы и производили локальное разрезание клеточной мембраны, затем методом оптического захвата с использованием сфокусированного лазерного излучения с длиной волны 830 нм диэлектрическую микросферу сквозь полученный разрез вводили внутрь клетки.

При реализации способа используют диэлектрический микроконтейнер, который может содержать генетический материал или любое физиологически активное вещество.

Обычно, но не обязательно, используют диэлектрический микроконтейнер сферической формы диаметром около 1 мкм.

Для создания оптической ловушки лазерное излучение предпочтительно фокусируют с использованием микроскопа.

В дальнейшем разработанный способ будет раскрыт с использованием примера реализации.

В рассматриваемом примере использованы диэлектрические микроконтейнеры - микросферы полистирола (Spherotech, Cat. No. АР-10-10). В качестве генетически активного вещества использовали плазмид pEFGFP. Вектор был получен на основе коммерчески доступного вектора pcEGFPCl (Invitro gen, США), несущего ген устойчивости к селективному антибиотику неомицину. Последовательность промотора фактора элонгации PEF1A была получена из вектора pBudCE4.1 с использованием рестрикции по сайтам NheI/XhoI и клонирована по липким концам в промежуточный вектор pSPT18. Конечный вектор рестрицирован BgIII/HindIII, при этом был вырезан фрагмент промотора Р CMV. Далее pSPT18 была рестрицирована по BamHI/HindIII, а фрагмент Р EF1A клонирован в вектор pcEGFPCl по сайтам BgIII/HindIII. Введение генетической информации в микросферу осуществили путем адсорбции генетически активного вещества на поверхности диэлектрических микросфер. Раствор плазмида и диэлектрических микросфер был перемешан в шейкере. Затем раствор был помещен на 4 часа в CO₂ инкубатор для адсорбции плазмида на поверхности диэлектрических микросфер. Затем раствор был центрифугирован для разделения покрытых плазмидом диэлектрических микросфер и несвязанного плазмида, оставшегося в растворе.

Эмбрионы для экспериментов получали от суперовулированных самок мышей линии C57BL/6, спаренных с самцами линии СВА. Суперовуляцию проводили по стандартной схеме с использованием гонадотропина сыворотки жеребых кобыл (PMSG, Intervet) и человеческого хорионического гонадотропина (hCG, Intervet). Животных умерщвляли путем дислокации шейных позвонков. Эмбрионы мыши получали путем промывания яйцевода мыши средой PBS, затем собирали эмбрионы с использованием капилляра и переносили их в среду М2. Биологические образцы после воздействия культивировали в CO₂ инкубаторе с концентрацией углекислого газа 5% при температуре 37°С в четырехлуночных пластиковых чашках "Nunclon" (Nunc).

Для проведения экспериментов эмбрионы выделяли из яйцеводов суперовулированных самок на стадии 2-х бластомеров, которые культивировали in vitro до стадии 8 клеток (морула).

В данной работе в мультиплексном лазерном манипуляторе использовали инвертированный оптический микроскоп (Olympus 1X71). В поле микроскопа через объектив с высокой числовой апертурой заводили лазерное излучение от двух лазеров. Использовали объективы ЛОМО МФЛЮАР100×/1.3 или Olympus LCAchN40x/0.55Ph2.

Диэлектрическую микросферу удерживали и перемещали с использованием оптической ловушки, сформированной непрерывным излучением лазерного диода с длиной волны 830 нм, сфокусированным объективом микроскопа (40х, числовая апертура 0,75). Диэлектрическую микросферу приводили в соприкосновение с клеточной мембраной и облучали цугами фемтосекундных импульсов титан-сапфирового лазера с длиной волны 780 нм, длительностью 30 фс, частотой повторения 1 кГц и энергией порядка 100 нДж. Фемтосекундные импульсы фокусировались диэлектрической микросферой в области ближнего поля вблизи диэлектрической микросферы и производили локальное разрезание клеточной мембраны. Затем методом оптического захвата диэлектрическую микросферу, обладающую генетической информацией, сквозь полученный разрез вводили внутрь. Перемещение предметного столика осуществляли либо "вручную", либо с использованием позиционных пьезодвигателей, причем, в последнем случае, обеспечивалась точность перемещений, равная десяти нанометрам. Визуальный контроль осуществляли с использованием видеокамеры (Sony ExwaveHAD). Далее эмбрионы культивировали в четырехлуночных планшетах в среде Ml6 до стадии бластоцисты.

Таким образом, из приведенных примеров видно, что предлагаемый способ позволяет воздействием лазерного облучения проводить успешное введение микроконтейнера с генетической информацией внутрь мышиного эмбриона. Культивирование invitro полученных экспериментальных эмбрионов до стадии бластоцисты (вплоть до вылупляющихся и вылупившихся бластоцист) подтверждает их жизнеспособность.

Кроме того, дополнительным преимуществом разработанного способа следует признать высокую скорость проведения операции - операция занимает не более 2 мин без оптимизации отдельных стадий по времени, причем время операции может быть существенно сокращено за счет оптимизации.

Приведенный пример доказывает достижение указанного технического результата.

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для введения сферического диэлектрического микроконтейнера, несущего определенный генетический материал, такой как ДНК или РНК, в клетки млекопитающих. Создают оптическую ловушку для микроконтейнера с использованием сфокусированного лазерного излучения с длиной волны 830 нм. Осуществляют приведение микроконтейнера в соприкосновение с клеточной мембраной путем облучении его цугами импульсов лазерного излучения с длиной волны 780 нм с последующим разрезанием клеточной мембраны сфокусированными лазерными импульсами и контролируемым вводом с использованием оптической ловушки микроконтейнера в клетку. Изобретение позволяет доставить микроконтейнер, несущий генетический материал, в заданную координату клетки млекопитающего с высокой точностью. 3 з.п. ф-лы.

1. Способ введения диэлектрического микроконтейнера в клетку млекопитающих с использованием фемто-пикосекундных импульсов лазерного излучения, отличающийся тем, что в качестве микроконтейнера используют диэлектрическую микросферу, которую приводят в соприкосновение с клеточной мембраной и облучают цугами фемтосекундных импульсов титан-сапфирового лазера с длиной волны 780 нм, длительностью 30 фс, частотой повторения 1 кГц и энергией порядка 100 нДж, фемтосекундные импульсы фокусируют диэлектрической микросферой в области ближнего поля вблизи диэлектрической микросферы и производят локальное разрезание клеточной мембраны, затем методом оптического захвата с использованием сфокусированного лазерного излучения с длиной волны 830 нм диэлектрическую микросферу сквозь полученный разрез вводят внутрь клетки.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что используют диэлектрический микроконтейнер, содержащий генетический материал.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что используют диэлектрический микроконтейнер, содержащий физиологически активное вещество.

4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что используют диэлектрический микроконтейнер сферической формы диаметром около 1 мкм.