Средство, стимулирующее функции мезенхимальных клеток-предшественников in vitro Российский патент 2019 года по МПК A61K31/52 

Изобретение относится к медицине, конкретно к фармакологии и клеточным технологиям, и может быть использовано в регенеративной медицине.

На сегодняшний день известны различные средства, стимулирующие функции мезенхимальных клеток-предшественников в условиях in vitro. При этом предполагается возможность использования данных веществ с целью стимуляции эндогенных стволовых клеток и регенерации тканей при их введении в организм. Наиболее эффективными в данном отношении и хорошо изученными средствами среди них являются раннедействующие ростовые факторы (цитокины), в первую очередь, гепаринсвязывающие белки семейства факторов роста фибробластов (FGF - fibroblast growth factor) [1-3].

Недостатком ростовых факторов является их иммуногенность и единственно возможный - парентеральный путь введения данного средства (ограниченность способа применения), определяемые белковой природой данных соединений. Кроме того, все ростовые факторы являются плейотропными и полифункциональными регуляторами физиологических функций, что изначально предопределяет низкую избирательность их действия и высокую частоту развития побочных эффектов [4, 5].

Задачей, решаемой данным изобретением, является расширение арсенала средств, стимулирующих функции мезенхимальных клеток-предшественников.

Поставленная задача достигается применением в качестве средства, стимулирующего функции мезенхимальных клеток-предшественников, 7-(2-гидроксиэтил)теофиллина.

Новым в предлагаемом изобретении является использование в качестве средства, стимулирующего функции мезенхимальных клеток-предшественников 7-(2-гидроксиэтил)теофиллина.

Реализация любых клеточных функции (дифференцировка, пролиферация, старение, опухолевая трансформация, синтез гуморальных регуляторов и др.) обеспечивается с участием сложноорганизованной системы внутриклеточных сигнальных путей, передающих внешние сигналы внутрь клетки к специфическим цитоплазматическим и ядерным мишеням, а в конечном итоге - к ее генетическому аппарату. При этом в качестве мессенджеров выступают различные белки - сигнальные молекулы. Таким образом, функционирование клеточных элементов, поддержание гомеостаза в норме и при патологических состояниях, во многом, определяется активностью и экспрессией данных молекул [6].

В НИИФиРМ им. Е.Д. Гольдберга Томского НИМЦ предложена «Стратегия фармакологической регуляции внутриклеточной сигнальной трансдукции в регенераторно-компетентных клетках», предполагающая использование в качестве мишеней фармакологического воздействия отдельных внутриклеточных сигнальных молекул, участвующих в регуляции функций родоначальных клеток и элементов микроокружения тканей, опосредованно определяющих течение репаративных процессов [7].

В настоящее время известна важная роль сигнальной молекулы цАМФ (циклический аденозинмонофосфат, сАМР) [6] в регуляции функций различных клеток. При этом существуют вещества - метилксантины, обладающие способностью ингибировать фермент фосфодиэстеразу цАМФ, который расщепляет данный циклический нуклеозид. Метилксантины - группа органических соединений, которая включает в себя, в том числе производные теофиллина. Известно, что данные соединения, увеличивая содержание в тканях цАМФ вызывают: уменьшение сократительной активности гладкой мускулатуры бронхов, кровеносных сосудов (главным образом сосудов мозга, кожи и почек), оказывают периферическое вазодилатирующее действие, стабилизируют мембрану тучных клеток, тормозят высвобождение медиаторов аллергических реакций, оказывают стимулирующее влияние на деятельность сердца, тормозит агрегацию тромбоцитов, улучшаю реологические свойства крови и другие эффекты в отношении различных клеток и тканей [8].

При этом возможность использования ингибиторов фосфодиэстеразы - производных теофиллина, в том числе 7-(2-гидроксиэтил)теофиллина [8], с целью стимуляции функций мезенхимальных клеток-предшественников не известна. Эксперимент показал непредсказуемые результаты.

Факт применения 7-(2-гидроксиэтил)теофиллина с достижением нового технического результата, заключающегося в эффективной стимуляции функций мезенхимальных клеток-предшественников, для специалиста является не очевидным.

Заявляемые существенные признаки проявили в совокупности новые свойства, не вытекающие явным образом из уровня техники в данной области. Предлагаемое изобретение может быть использовано в экспериментальной биологии и медицине с выходом в практическое здравоохранение. Идентичной совокупности признаков при исследовании уровня техники по патентной и научно-медицинской литературе не обнаружено.

Исходя из вышеизложенного, следует считать заявляемое техническое решение соответствующим критериям: «Новизна», «Изобретательский уровень», «Промышленная применимость».

Эксперименты были проведены на культуре клеток костного мозга 12 мышей линии C57BI/6JY. Животные получены из питомника отдела экспериментального биомедицинского моделирования НИИФиРМ им. Е.Д. Гольдберга Томского НИМЦ.

Исследования проводили в соответствии с правилами лабораторной практики (GLP), «Методическими рекомендации по изучению специфической активности средств для регенеративной медицины» Руководства по проведению доклинических исследований новых лекарственных средств (Москва, 2013) [9].

Пример 1

Для оценки стимуляции функций мезенхимальных клеток-предшественников в условиях in vitro изучали колониеобразующую способность прилипающих клеток костного мозга [9]. Для этого суспензию костномозговых клеток в концентрации 2,5×10⁵ клеток/мл., полученную в стерильных условиях (боксе, оборудованном ламинаром), инкубировали в течение 45 мин в среде RPMI-1640 ("Sigma", США), содержащей 10% ЭТС («Sigma», США), в 90 мм пластиковых чашках Петри («Corning», США) диаметром 35 мм в течение 40-50 мин при 37°С, 5% СО₂ и 100% влажности. После этого проводили смену культуральной среды с удалением неприлипших клеток и инкубировали в течение 7 суток в полной культуральной среде Complete MesenCult Medium (mouse)(«Stemcell technologies)), Канада) с добавлением 7-(2-гидроксиэтил)теофиллина (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd., Япония) в концентрации 100 мкМ (микромоль), при 37°С, 5% СО₂ и 100% влажности. По окончании инкубации проводили подсчет фибробластных колоний КОЕ-Ф, содержащих в своем составе как коммитированные стромальные мезенхимальные клетки-предшественники, так и мультипотентные мезенхимальные стволовые клетки [7], с помощью инвертированного микроскопа «AxioObserver A1.» (Carl Zeiss, Германия).

Для оценки эффективности стимуляции функций клеток-предшественников с помощью 7-(2-гидроксиэтил)теофиллина уровень выхода КОЕ-Ф сравнивали с аналогичным при внесении в среду 20 нг/мл основного фактора роста фибробластов (ФРФ, Fibroblast Growth Factor-Basic, «Sigma», США). Рабочая концентрация ФРФ in vitro была определена в предварительных экспериментах как максимально эффективная.

В ходе эксперимента показано, что внесение 7-(2-гидроксиэтил)теофиллин в культуру прилипающих миелокариоцитов костного мозга приводило к значительному возрастанию числа фибробластных колоний (КОЕ-Ф) по сравнению с культурой без добавления специфических стимуляторов функций клеток-предшественников. При этом стимуляция выхода КОЕ-Ф с помощью заявляемого средства соотвествовала таковой при использовании вещества сравнения - ФРФ (табл.).

Таким образом, ингибитор фосфодиэстеразы цАМФ 7-(2-гидроксиэтил)теофиллин обладает выраженной способностью стимулировать функции мезенхимальных клеток-предшественников клеток костного мозга.

* - отмечена достоверность различий с показателями контроля при p<0,05

Цитируемая литература:

1) Metcalf D. Hemopoietic growth factors. 1. // The Lancet. - 1989. - Vol. 15. - P. 825-827.

2) Система цитокинов. Теоретические и клинические аспекты. Сборник трудов. / Под редакцией академика РАМН В.А. Козлова и д.м.н. С.В. Сенникова. - Новосибирск: «Наука» 2004. - стр. 324.

3) Ornitz D.M., Itoh N. Fibroblast growth factors // Genome Biol. 2001; Vol. 2, N3. P. 1-12.

4) Anderson J.A. Allergic reactions to drugs and biologic agents // JAMA. - 1992 - Vol. 268. - p. 2845-2857.

5) Дыгай A.M., Артамонов A.B., Бекарев A.A., Жданов B.B., Зюзьков Г.Н., Мадонов П.Г., Удут В.В. Нанотехнологии в фармакологии. - М.: Издательство РАМН, 2011. - 136 с.

6) Mavers М., Ruderman Е.М., Perlman Н. Intracellular signal pathways: poten-tial for therapies. Curr Rheumatol. Rep., 2009, 11(5): 378-385.

7) Зюзьков Г.Н., Удут Е.В., Мирошниченко Л.А. и др. Специфическая роль JАK/STAT3-сигналинга в регуляции функций мезенхимных прогениторных клеток // Бюл. эксперим. биол. и медицины, 2017. - №9. - С. 294-297.

8) Меджиева О.А. Лекарственные препараты в России. Справочник Видаль 2017 Издательство: Видаль Рус 1240 с.

9) Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н., Жданов В.В. и др. Методические рекомендации по изучению специфической активности средств для регенеративной медицины // Руководство по проведению доклинических исследований новых лекарственных средств / Под ред. А.Н. Миронова. - М.: Гриф и К, 2013. - С.776-787 (944 с.).

Изобретение относится к медицине, а именно к фармакологии, и может быть использовано в клеточных технологиях. Применяют 7-(2-гидроксиэтил)теофиллин в качестве средства, стимулирующего колониеобразующую способность мезенхимальных клеток-предшественников. Использование данного изобретения позволяет в условиях in vitro стимулировать колониеобразующую способность мезенхимальных клеток-предшественников, увеличивать число фибробластных колоний, содержащих в своем составе как коммитированные стромальные мезенхимальные клетки-предшественники, так и мультипотентные мезенхимальные стволовые клетки. 1 табл., 1 пр.

Применение 7-(2-гидроксиэтил)теофиллина в качестве средства, стимулирующего колониеобразующую способность мезенхимальных клеток-предшественников.