СТАБИЛИЗИРОВАННЫЙ КАРДИОЛИПИНОВЫЙ АНТИГЕН ДЛЯ РЕАКЦИИ МИКРОПРЕЦИПИТАЦИИ ПРИ ДИАГНОСТИКЕ СИФИЛИСА И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ Российский патент 2017 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к медицине и касается диагностических реагентов для клинической лабораторной диагностики сифилитической инфекции.

В соответствии с действующими Национальными стандартами и клиническими рекомендациями при обследовании населения с целью выявления больных сифилисом, а также при установлении клинической формы этого заболевания и оценке динамики гуморального иммунитета после проведенной антибактериальной терапии в учреждениях здравоохранения большинства стран мира широко применяются лабораторные тесты, оценивающие качественное и полуколичественное содержание антител к кардиолипиновому антигену (в крови у больных сифилисом или в ликворе у больных нейросифилисом).

Приоритет в разработке кардиолипинового антигена (Аг Кл), используемого в современных иммунохимических лабораторных исследованиях, принадлежит шведской исследовательнице Margaret С. Pangborn (1941) [1], несколько позже оригинальная методика получения этого антигена для реакции микропреципитации (РМП) была предложена в СССР профессором Л.С. Резниковой (1951) [2]. Кроме этого в Лабораториях по изучению венерических заболеваний (Venereal Diseases Research Laboratories) американского Центра по контролю заболеваемости (Center Diseases Control - CDC) также была создана оригинальная пропись этого реагента и особая методика проведения лабораторного исследования - VDRL тест [3, 4].

По своей сути современные иммунохимические исследования с Аг Кл являются нетрепонемными тестами, так как применяемый антиген по своему происхождению не имеют прямого отношения к возбудителю сифилиса (Treponema pallidum). При разработке состава Аг Кл отдельные его компоненты первоначально получали из сырьевых материалов животного происхождения: водных, водно-спиртовых, ацетоновых или эфирных экстрактов ткани сердечной мышцы крупного рогатого скота и из куриных яиц. Позднее в качестве антигена для лабораторных целей стали применять сложную пропись очищенных липоидных субстанций производственного выпуска: кардиолипин - 0,033%, лецитин - 0,27% и холестерин - 0,9%, растворенных в абсолютизированном этиловом спирте.

При определении содержания гуморальных антител в иммунохимических реакциях (РМП и VDRL) кардиолипиновый антиген применяют в виде рабочей эмульсии Аг Кл; для ее получении перед началом исследования в клинических лабораториях медицинских учреждений кардиолипиновый антиген переводят из спиртового раствора в водную фазу (10% раствор холина хлорида на основе 0,89-0,9% раствора натрия хлорида). Смесь липоидов в водной среде представлена в мелкодиспергированном эмульгированном состоянии, даже при кратковременном хранении в спокойном состоянии эмульсия расслаивается с образованием осадка белого цвета и бесцветной надосадочной жидкости [5, 6].

Технология приготовления рабочей эмульсии Аг Кл, которая является наиболее близким по осуществлению аналогом (прототипом), включает несколько этапов:

- смешивание спиртового концентрата кардиолипинового антигена с равным объемом физиологического раствора с целью «высаливания» активных компонентов антигена и созревание смеси;

- осаждение кардиолипинового антигена при мягком центрифугировании;

- удаление надосадочной жидкости;

- ресуспендирование кардиолипинового антигена путем осторожного размывания осадка 10% раствором холина хлорида, приготовленным на основе 0,9% раствора натрия хлорида (при наличии - с добавлением 0,01% раствора метриолята до конечной концентрации 1:10000).

При этом свежеприготовленная в разных лабораториях рабочая эмульсия Аг Кл может существенно различаться по своей специфической активности в РМП, что зависит от особенностей ее приготовления (использование разных вариантов получения 0,9% раствора натрия хлорида, точность соблюдения лабораторными специалистами инструкции по приготовлению реагента). Свежеприготовленная рабочая эмульсия Аг Кл сохраняет свою специфическую активность и пригодна для использования в РМП только в течение 7 дней, а при добавлении мертиолята (1:10000) - 14 дней; в эти сроки реагент должен сохраняться при температуре +4-8°C в посуде темного стекла или иным способом должна обеспечиваться его защита от нагревания и прямого воздействия солнечного света, которые снижают активность суспензии Аг Кл [6].

Другим вариантом обеспечения возможности длительного сохранения активности кардиолипинового антигена (вариант VDRL) является внесение в свежеприготовленный реагент 1,0% спиртового раствора бензойной кислоты до конечной концентрации 0,01% [3].

Технической задачей изобретения является разработка раствора стабилизированного кардиолипинового антигена и способа получения готовой к применению суспензии кардиолипинового антигена с длительным сроком годности и контролируемым уровнем его специфической активности в реакции микропреципитации (РМП).

Эта задача достигается за счет изменения состава водной фазы и технологии приготовления рабочей суспензии Аг Кл, а также включения в ее состав стабилизирующих и консервирующих добавок. В качестве водной используется фосфатный буфер стандартной прописи.

Новый состав и технология получения рабочей суспензии Аг Кл предполагает дробное поэтапное внесение спиртовых растворов липидов, входящих в состав Аг Кл, в фосфатный буферный раствор с добавлением в качестве стабилизатора этилен-дитетрамина ацетата (ЭДТА) и консерванта мертиолята (тимеросала) при постоянном активном перемешивании всего объема изготавливаемой серии реагента.

Состав готовой к применению суспензии кардиолипинового антигена отличается от прототипа сохранением всего количества этилового спирта (в прототипе подавляющая его часть удалялась после центрифугирования в составе супернатанта), использованием буферного раствора вместо физиологического раствора и добавлением стабилизатора ЭДТА и консерванта мертиолята (тимеросала).

Техническими результатами группы изобретений является

- законченный цикл получения готовой к применению суспензии кардиолипинового антигена на производственном предприятии,

- контроль качества и обеспечение длительной специфической активности приготовленного реагента в реакции микропреципитации при диагностике сифилиса с исключением этапа лабораторного приготовления рабочей эмульсии Аг Кл.

Также преимуществами предлагаемого способа получения суспензии Аг Кл заключается в:

- замене лабораторного кустарного процесса получения рабочей эмульсии Аг Кл производственным, контроль осуществления которого на всех этапах централизованно осуществляется специалистами-технологами ОБТК предприятия и средствами автоматического слежения; обеспечении стабильности и сохранении специфических свойств готового реагента Аг Кл путем внесения в его состав стабилизирующих и консервирующих добавок и фасовке готового продукта во флаконы темного стекла;

- обеспечении выпускающего и текущего контроля качества специфической активности полученного реагента в РМП сотрудниками ОБТК предприятия на всех этапах производства и при хранении музейных образцов в период срока годности набора реагентов;

- экономии затрат рабочего времени специалистами лабораторной медицины за счет исключения этапа приготовления рабочей суспензии реагента Аг Кл при проведении лабораторного исследования методом РМП;

- переводе РМП в разряд лабораторных исследований, которые позволяют оперативно обеспечивать обследование пациентов.

Таким образом, нами разработан стабилизированный кардиолипиновый антиген, содержащий кардиолипин, лецитин, холестерин, спирт этиловый абсолютированный, ЭДТА динатриевая соль, натрий фосфорнокислый 2-замещенный, калий фосфорнокислый 1-замещенный, холин-хлорид, тимеросал (мертиолят), воду очищенную при следующем количественном соотношении ингредиентов, мас %:

кардиолипин 0,0029-0,0033 лецитин 0,021-0,027 холестерин 0,069-0,090 спирт этиловый абсолютированный 6,03-7,83 ЭДТА динатриевая соль 0,32-0,42 натрий фосфорнокислый 2-замещенный 0,086-0,11 калий фосфорнокислый 1-замещенный 0,094-0,12 холин-хлорид 6,92-9,00 тимеросал (мертиолят) 0,069-0,090 вода очищенная остальное

Кроме того, нами разработан способ получения стабилизированного кардиолипинового антигена, включающий приготовление буферного раствора с последовательным добавлением друг к другу ЭДТА динатриевой соли, натрия фосфорнокислого 2-замещенного, калия фосфорнокислого 1-замещенного, холин-хлорида, тимеросала (мертиолята), воды очищенной, далее получившийся раствор перемешивают и фильтруют, после чего приготавливают спиртовой раствор липидов, для этого смешивают кардиолипин, лецитин, холестерин и спирт этиловый абсолютированный, затем осуществляют смешение буферного раствора и спиртового раствора.

Группа изобретений в частных случаях осуществления поясняется следующими примерами.

Пример приготовления стабилизированного Аг Кл осуществляют следующим образом.

1. Приготовление буферного раствора.

1.1. Сделать на электронных весах навески необходимых реактивов. Для приготовления 10 л буферного раствора:

ЭДТА динатриевая соль 46,5 г Натрий фосфорнокислый 2-замещенный 14,2 г Калий фосфорнокислый 1-замещенный 13,6 г Холин-хлорид 1000 г Тимеросал (мертиолят) 10 г Вода очищенная до 10000 мл

1.2. Последовательно перенести навески в чистую промаркированную емкость и добавить до необходимого объема воды очищенной.

1.3. Включить магнитную мешалку и тщательно перемешать приготовленный раствор до полного растворения солей.

При необходимости довести pH приготовленного буферного раствора до 6,9±0,2 путем добавления 0,1 моль/л раствора гидроокиси натрия.

1.4. Провести фильтрацию буферного раствора с помощью перистальтического насоса через фильтр мембранный ФМАЦ-0,45 в чистую маркированную емкость. Допускается хранение при температуре 2- 8°C.

2. Приготовление спиртового раствора липидов

2.1. Сделать навески липидов исходя из следующего расчета:

Кардиолипин 0,33 г Лецитин 2,7 г Холестерин 9,0 г Спирт этиловый абсолютированный до 1000 мл

2.2. Перенести навеску кардиолипина в чистую сухую мерную колбу и добавить немного спирта этилового абсолютированного, затем добавить навеску лецитина в ту же мерную колбу и вновь добавить немного спирта, внести навеску холестерина и довести общий объем до метки 1000 мл.

2.3. Перемешивать содержимое на магнитной мешалке не менее одного часа до полного растворения компонентов. Емкость с раствором плотно укупорить. Наклеить этикетки утвержденного образца.

Раствор выдержать при комнатной температуре не менее 15 часов.

3. Приготовление взвеси стабилизированного Аг Кл

3.1. В чистую сухую емкость вносят 1 часть общего объема буфера и частями при непрерывном перемешивании добавляют приготовленный спиртовой раствор липидов (приготовление взвеси стабилизированного Аг Кл осуществляют из расчета: на 1 часть раствора липидов - 9 частей буферного раствора).

3.2. Перемешивают в течение 10-15 минут и добавляют оставшийся буфер; взвесь перемешать еще в течение 30 минут.

3.3. Емкость плотно укупоривают. Наклеивают этикетки утвержденного образца. Взвесь стабилизированного Аг Кл выдерживают в холодной комнате при температуре 2-8°C не менее 24 часов (допускается хранение в течение 1 месяца).

4. Контроль качества и специфической активности взвеси стабилизированного Аг Кл.

4.1. Контроль осуществляют с использованием проверенной серии Набора реагентов «Сифилис - АгКл-РМП» и охарактеризованных образцjd положительных и отрицательных сывороток (содержащих и не содержащих антитела к кардиолипиновому антигену).

4.2. При получении нормированных результатов контроля приготовленную серию взвеси стабилизированного Аг Кл передают на розлив с маршрутной картой за подписью ответственного микробиолога.

5. Розлив взвеси стабилизированного Аг Кл в первичную упаковку.

5.1. Взвесь стабилизированного Аг Кл разливают с помощью дозатора в предварительно подготовленные флаконы из темного стекла вместимостью 5 мл по 5,0±0,05 мл; в процессе розлива контролируют точность дозирования.

5.2. Флаконы укупоривают крышками.

5.3. На флаконы наклеивают этикетки и передают их на участок комплектации наборов.

Эффективность разработанного способа иллюстрируются примерами выпуска опытно-экспериментальных серий реагента стабилизированного Аг Кл и проведения исследований его специфической активности в натурных испытаниях с целью определения возможного срока годности.

Пример 1:

В лаборатории перспективных разработок ЗАО «ЭКОлаб» в период с 27 по 31 января 2010 г. были приготовлены 3 опытно-экспериментальные серии нового разработанного реагента «стабилизированный Аг Кл для РМП» в соответствии с последовательностью действий и количественными показателями, описанныvb выше. А 31 января 2010 г. на основе 3 производственных серий набора реагентов «Сифилис АгКл-РМП» (производства ЗАО «ЭКОлаб», г. Электрогорск Московской обл.) были приготовлены 3 лабораторные серии рабочей суспензии кардиолипинового антигена.

Проведена серия сравнительных испытаний специфической активности приготовленных вариантов Аг Кл с использованием панели охарактеризованных стандартных образцов (ОСО) предприятия - контрольных сывороток крови, полученных от пациентов со вторичным сифилисом (n=3) и от здоровых доноров крови (n=2).

Исследования в РМП выполнялись 2 разными специалистами. При этом показано полное совпадение результатов определения антител к кардиолипину в реакции микропреципитации и оценки их полуколичественного содержания при исследовании серии 2-кратных разведений образцов (титрования антител).

Результаты примера подтверждали тождественную активность в РМП образцов рабочей суспензии кардиолипинового антигена, приготовленных по способу, описанному в инструкции по применению компонентов набора реагентов «Сифилис АгКл-РМП», и по вновь разработанному способу.

Пример 2:

Специфическую активность 3 опытно-экспериментальных серий готового к применению жидкого реагента Аг Кл (приготовленных, как описано в примере 1, в лаборатории перспективных разработок ЗАО «ЭКОлаб» с 27 по 31 января 2010 г.) оценивали в РМП при их длительном хранении.

Флаконы с готовым к применению Кл Аг сохраняли в условиях бытового холодильника при температуре 4-8°C на протяжении 1,75-1,8 лет. Исследование специфической активности проверяли в РМП через каждые 10-14 дней разными лабораторными специалистами. Исследованию в РМП подвергали образцы панели ОСО предприятия (полученных от пациентов со вторичным сифилисом и содержавших антикардиолипиновые антитела (n=3) и от здоровых доноров крови (n=2), не содержавших указанные антитела).

Сопоставление полученных данных позволило установить, что специфическая активность 2-х серий реагентов за 1,5-летний период времени их сохранения не претерпела изменений, а в 1 серии через 14 месяцев понизилась на одну степень разведения (с титра 1:8 до титра 1:4), что в соответствии с существующими требованиями к воспроизводимости результатов исследования в РМП не является ошибкой полуколичественного измерения этим методом.

Таким образом, приведенные примеры 1 и 2 демонстрируют:

- возможность успешного воспроизведения технологии получения готовой к применению суспензии кардиолипинового антигена по новому предлагаемому способу и его специфической активности для реакции микропреципитации (подтверждено в сравнительных испытаниях с реагентом, приготовленным по способу-прототипу);

- возможность длительного сохранения специфической активности готовой к использованию суспензии кардиолипинового антигена для РМП, приготовленной по предлагаемому способу, при условии соблюдения рекомендуемых условий хранения: обеспечения температуры плюс 4…8°C и первичной упаковки в стеклянные флаконы темного цвета с завинчивающейся крышкой (что явилось обоснованием выбора сроков годности реагента); - достоверность полученных результатов подтверждается результатами исследований в РМП, которые выполнялись в течение длительного периода времени разными специалистами лабораторной медицины.

Список источников информации

1. Pangborn М.С. Cardiolipin and its application in a chemically purified antigen for the serodiagnosis of syphilis. // Proc NY State Assoc Public Health Lab. 1946; 26(1): 26-9.

2. Резникова Л.С. Кардиолипиновые антигены в серодиагностике сифилиса. // Советская медицина, 1953; 1: 40-42.

3. Serologic tests for syphilis: 1959 Manual. Public Health Service Publication No 411. // United States Government Printing Office, Washington, 1959.

4. Larsen S.A., Pope V., Johnson R.E., Kennedy E.J. [Eds]. Manual of tests for syphilis. 9 ^-th Ed. // Washington: DC, 1998.

5. Приказ Министерства здравоохранения Российской Федерации №87 от 26 марта 2001 года «О совершенствовании серологической диагностики сифилиса» (Приложение №1. «Постановка отборочных и диагностических тестов на сифилис»).

6. Приказ Председателя Комитета контроля медицинской и фармацевтической деятельности МЗ РК от 27 июня 2011 года №350 (Инструкциия по применению изделия медицинского назначения для потребителя).

Группа изобретений относится к медицине и касается диагностических реагентов для клинической лабораторной диагностики сифилитической инфекции. Заявлены стабилизированный кардиолипиновый антиген и способ его получения. Кардиолипиновый антиген получен способом, включающим приготовление буферного раствора с последовательным добавлением друг к другу ЭДТА динатриевой соли, натрия фосфорнокислого 2-замещенного, калия фосфорнокислого 1-замещенного, холин-хлорида, тимеросала (мертиолята), воды очищенной, далее получившийся раствор перемешивают и фильтруют, после чего приготавливают спиртовой раствор липидов, для этого смешивают кардиолипин, лецитин, холестерин и спирт этиловый абсолютированный, затем осуществляют смешение буферного раствора и спиртового раствора. Техническими результатами группы изобретений является:

- законченный цикл получения готовой к применению суспензии кардиолипинового антигена на производственном предприятии,

- контроль качества и обеспечение длительной специфической активности приготовленного реагента в реакции микропреципитации при диагностике сифилиса с исключением этапа лабораторного приготовления рабочей эмульсии Аг Кл. 2 н.п. ф-лы, 2 пр.

1. Стабилизированный кардиолипиновый антиген, содержащий кардиолипин, лецитин, холестерин, спирт этиловый абсолютированный, ЭДТА динатриевая соль, натрий фосфорнокислый 2-замещенный, калий фосфорнокислый 1-замещенный, холин-хлорид, тимеросал (мертиолят), воду очищенную при следующем количественном соотношении ингредиентов, мас %:

кардиолипин 0,0029-0,0033 лецитин 0,021-0,027 холестерин 0,069-0,090 спирт этиловый абсолютированный 6,03-7,83 ЭДТА динатриевая соль 0,32-0,42 натрий фосфорнокислый 2-замещенный 0,086-0,11 калий фосфорнокислый 1-замещенный 0,094-0,12 холин-хлорид 6,92-9,00 тимеросал (мертиолят) 0,069-0,090 вода очищенная остальное

2. Способ получения стабилизированного кардиолипинового антигена, включающий приготовление буферного раствора с последовательным добавлением друг к другу ЭДТА динатриевой соли, натрия фосфорнокислого 2-замещенного, калия фосфорнокислого 1-замещенного, холин-хлорида, тимеросала (мертиолята), воды очищенной, далее получившийся раствор перемешивают и фильтруют, после чего приготавливают спиртовой раствор липидов, для этого смешивают кардиолипин, лецитин, холестерин и спирт этиловый абсолютированный, затем осуществляют смешение буферного раствора и спиртового раствора.