НОВЫЙ ПЕПТИД, ИМЕЮЩИЙ 4 СВЯЗАННЫХ CTL-ЭПИТОПА Российский патент 2017 года по МПК C07K14/82 C07K19/00 C12N5/783 A61K39/00 A61P35/00 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к новому пептиду, который полезен в качестве ракового антигенного пептида. Более конкретно, настоящее изобретение относится к новому раковому антигенному пептиду, имеющему 4 связанных пептида, способных к индукции CTL-ответов, ограниченных HLA-A, и к фармацевтической композиции, в которой он используется.

Уровень техники

Рак является ведущей причиной смерти в Японии. Около 350 000 пациентов умирают каждый год от рака, и в настоящее время рак по-прежнему представляет собой тяжелое заболевание. Принятыми на сегодняшний день подходами к лечению рака являются хирургическая резекция, химиотерапия и лучевая терапия. Однако такие стратегии лечения являются проблематичными с точки зрения, например, рецидивов заболевания, снижения качества жизни, а также отсутствия вариантов лечения в случае поздних стадий рака, которые не могут быть вылечены с использованием стратегий, описанных выше.

Иммунотерапия рака (противораковые вакцины) является долгожданной новой терапевтической методикой, а клинические исследования противораковых пептидных вакцин повсеместно были начаты в 1990 году, когда стали идентифицировать эпитопные пептиды в опухолевых антигенах человека. По результатам анализа клинических исследований, проведенных путем введения пептида, одного или в комбинации с другими агентами, уровень ответа однако составлял всего лишь 2,7% на 1000 или более случаев (Rosenberg SA et al., Nature Med., 2004, 10 (9): 909-15). Таким образом были выявлены трудности в практическом применении этого подхода.

При этом в Японии уже в течение длительного периода времени продолжаются клинические исследования, включающие использование конкретных пептидных вакцин против рака, а достижения таких исследований постепенно публикуются. В последние годы с целью улучшения результатов была предпринята попытка использования стратегии введения нескольких раковых пептидов вместо одного типа ракового пептида. Например, заранее исследовали тип HLA и специфические иммунные реакции у пациента с целью проведения персонализированного лечения рака с использованием пептидных вакцин, включающего в себя выбор нескольких соответствующих пептидов для введения, и были проверены их безопасность и противоопухолевое действие. Посредством введения персонализированных пептидных вакцин по отдельности или в комбинации с противораковыми препаратами, в частности, были достигнуты превосходные клинические эффекты и безопасность в случаях опухоли головного мозга, рака шейки матки, рака предстательной железы и рака поджелудочной железы Клеточный иммунитет, опосредуемый эпитоп-специфичными цитотоксическими Т-лимфоцитами (далее сокращенно именуемыми «CTL»), которые считаются основными эффекторными клетками при лечении рака с использованием пептидных вакцин, является HLA-ограниченным. Соответственно, была предпринята попытка создания противораковых пептидных вакцин, избирательно направленных на пациентов с определенным типом HLA, в частности с HLA-A2 или HLA-A24, из-за большого числа пациентов с данными типами HLA.

Однако японцы с двумя такими типами HLA составляют примерно 40% и 60%, соответственно (Sette, A. et al., Immunogenetics, 1999, 50 (3-4): 201-12). К сожалению, пациенты с другими типами HLA не могут получить выгоды от таких пептидных противораковых вакцин. Кроме того, начало лечения будет отложено из-за выполнения HLA-типирования до начала лечения, и это приведет к увеличению нагрузки на пациентов. Соответственно, желательно проведение исследований и создание пептидных противораковых вакцин, которые можно использовать у всех раковых пациентов без HLA-типирования.

В отношении лечения рака с использованием пептидных вакцин, кроме активации CTL как одного из составляющих клеточного иммунитета, известно, что с выживаемостью связана индукция синтеза иммуноглобулинов, известная как гуморальный иммунитет (Noguchi, M. et al., Cancer Biol. Ther., 2011, 10 (12):1266-79).

Краткое изложение сущности изобретения

Цели, которые должны быть достигнуты с помощью изобретения

Целью настоящего изобретения является создание ракового антигенного пептида, который может быть введен в качестве противораковой пептидной вакцины широкому кругу раковых пациентов и который может вызывать сильный гуморальный ответ, независимо от типов HLA у пациентов.

Средства достижения целей

Авторы настоящего изобретения получили пептид, содержащий от 4 связанных CTL-эпитопа, путем связывания через линкеры 4 пептидов, выбранных из числа CTL-эпитопных пептидов, которые, как сообщалось, способны индуцировать CTL-ответ, ограниченный супертипом HLA-A2, HLA-A24, HLA-A26 или HLA-A3, или множество CTL-ответов, ограниченных HLA-A. Авторы настоящего изобретения провели направленное исследование подобного пептида, имеющего 4 связанных CTL-эпитопа, для достижения вышеуказанных целей. В результате они обнаружили, что пептид, имеющий 4 связанных CTL-эпитопа, состоящих из определенных 13 видов пептидов, выбранных из числа CTL-эпитопных пептидов, полученных из известных молекул опухолевых антигенов, могут быть введены широкому кругу раковых пациентов без необходимости типирования HLA и независимо от HLA-типа пациентов. Они также обнаружили, что введение такого пептида, имеющего 4 связанных CTL-эпитопа, может вызвать сильный гуморальный ответ в дополнение к индукции CTL, специфичных к CTL-эпитопным пептидам, составляющим такой пептид. Это привело к завершению настоящего изобретения.

Более конкретно, настоящее изобретение имеет следующие признаки.

[1] пептид, имеющий 4 связанных эпитопа, где 4 эпитопных пептида выбраны, необязательно, с дублированием, из группы, состоящей из CTL-эпитопных пептидов: пептида, приведенного в SEQ ID NO:1 (PEP1); пептида, приведенного в SEQ ID NO:2 (PEP2); пептида, приведенного в SEQ ID NO:4 (PEP4); пептида, приведенного в SEQ ID NO:5 (PEP5); пептида, приведенного в SEQ ID NO:6 (PEP6); пептида, приведенного в SEQ ID NO:7 (PEP7); пептида, приведенного в SEQ ID NO:8 (PEP8); пептида, приведенного в SEQ ID NO:9 (PEP9); пептида, приведенного в SEQ ID NO:10 (PEP10); пептида, приведенного в SEQ ID NO:13 (PEP13); пептида, приведенного в SEQ ID NO:15 (PEP15); пептида, приведенного в SEQ ID NO:17 (PEP17); и пептида, приведенного в SEQ ID NO:18 (PEP18), связанных с помощью линкеров, причем пептид, имеющий 4 связанных эпитопа, необязательно, содержит другие пептидные последовательности, состоящие из гидрофильных аминокислот, и пептид, имеющий 4 связанных эпитопа, имеет один или несколько признаков, выбранных из признаков (1)-(5) ниже:

(1) пептид содержит PEP2 на С-конце (за исключением пептида, содержащего PEP7 и PEP8 на N-конце, последовательно расположенных в таком порядке с N-конца через линкер);

(2) пептид содержит PEP4 на С-конце;

(3) пептид содержит PEP10 на С-конце;

(4) пептид содержит PEP6 и PEP5 на С-конце, последовательно расположенных в таком порядке с N-конца через линкер; и

(5) пептид содержит PEP5, PEP6, PEP9 и PEP18.

[2] Пептид, имеющий 4 связанных эпитопа по п.[1], который содержит 4 недублированных пептида, выбранных из PEP1, PEP2, PEP4, PEP5, PEP6, PEP7, PEP8, PEP9, PEP10, PEP13, PEP15, PEP17 и PEP18.

[3] Пептид, имеющий 4 связанных эпитопа по п.[1] или [2], имеющий любой один из признаков, выбранных из признаков (1)-(5) ниже:

(1) пептид содержит 3 CTL-эпитопных пептида, выбранных из PEP1, PEP7, PEP8 и PEP13, а PEP2 расположен на С-конце пептида (за исключением пептида, содержащего PEP7 и PEP8 на N-конце, последовательно расположенных в таком порядке с N-конца через линкер);

(2) пептид содержит 3 CTL-эпитопных пептида, PEP5, PEP6 и PEP9, а РЕР4 расположен на С-конце пептида;

(3) пептид содержит 3 CTL-эпитопных пептида, выбранных из PEP1, PEP13, PEP15, PEP17 и PEP18, а PEP10 расположен на С-конце пептида;

(4) пептид содержит 2 CTL-эпитопных пептида, PEP1 и PEP7, а PEP6 и PEP5 последовательно расположены на C-конце в таком порядке с N-конца через линкер; и

(5) пептид содержит 3 CTL-эпитопных пептида, PEP5, PEP6 и PEP18, а PEP9 расположен на С-конце пептида.

[4] Пептид, имеющий 4 связанных эпитопа по любому из пп.[1]-[3], который содержит последовательность, выбранную из нижеследующих последовательностей, в которых «-(L)-» представляет собой линкер:

- PEP5-(L)-PEP6-(L)-PEP9-(L)-PEP4;

- PEP9-(L)-PEP5-(L)-PEP6-(L)-PEP4;

- PEP6-(L)-PEP5-(L)-PEP9-(L)-PEP4;

- PEP6-(L)-PEP9-(L)-PEP5-(L)-PEP4;

- PEP9-(L)-PEP6-(L)-PEP5-(L)-PEP4;

- PEP5-(L)-PEP9-(L)-PEP6-(L)-PEP4;

- PEP1-(L)-PEP7-(L)-PEP8-(L)-PEP2;

- PEP1-(L)-PEP8-(L)-PEP7-(L)-PEP2;

- PEP7-(L)-PEP1-(L)-PEP8-(L)-PEP2;

- PEP8-(L)-PEP7-(L)-PEP1-(L)-PEP2;

- PEP8-(L)-PEP1-(L)-PEP7-(L)-PEP2;

- PEP7-(L)-PEP13-(L)-PEP8-(L)-PEP2;

- PEP8-(L)-PEP13-(L)-PEP7-(L)-PEP2;

- PEP13-(L)-PEP7-(L)-PEP8-(L)-PEP2;

- PEP8-(L)-PEP7-(L)-PEP13-(L)-PEP2;

- PEP13-(L)-PEP8-(L)-PEP7-(L)-PEP2;

- PEP13-(L)-PEP15-(L)-PEP18-(L)-PEP10;

- PEP13-(L)-PEP18-(L)-PEP15-(L)-PEP10;

- PEP15-(L)-PEP13-(L)-PEP18-(L)-PEP10;

- PEP15-(L)-PEP18-(L)-PEP13-(L)-PEP10;

- PEP18-(L)-PEP13-(L)-PEP15-(L)-PEP10;

- PEP18-(L)-PEP15-(L)-PEP13-(L)-PEP10;

- PEP1-(L)-PEP15-(L)-PEP18-(L)-PEP10;

- PEP1-(L)-PEP18-(L)-PEP15-(L)-PEP10;

- PEP15-(L)-PEP1-(L)-PEP18-(L)-PEP10;

- PEP15-(L)-PEP18-(L)-PEP1-(L)-PEP10;

- PEP18-(L)-PEP1-(L)-PEP15-(L)-PEP10;

- PEP18-(L)-PEP15-(L)-PEP1-(L)-PEP10;

- PEP15-(L)-PEP17-(L)-PEP13-(L)-PEP10;

- PEP15-(L)-PEP13-(L)-PEP17-(L)-PEP10;

- PEP17-(L)-PEP15-(L)-PEP13-(L)-PEP10;

- PEP17-(L)-PEP13-(L)-PEP15-(L)-PEP10;

- PEP13-(L)-PEP17-(L)-PEP15-(L)-PEP10;

- PEP13-(L)-PEP15-(L)-PEP17-(L)-PEP10;

- PEP6-(L)-PEP18-(L)-PEP5-(L)-PEP9;

- PEP6-(L)-PEP5-(L)-PEP18-(L)-PEP9;

- PEP1-(L)-PEP7-(L)-PEP6-(L)-PEP5; и

- PEP7-(L)-PEP1-(L)-PEP6-(L)-PEP5.

[5] Пептид, имеющий 4 связанных эпитопа по любому из пп.[1]-[4], где линкер представляет собой аминокислотный линкер.

[6] Пептид, имеющий 4 связанных эпитопа по любому из пп.[1]-[5], в котором аминокислотный линкер представляет собой аргининовый димер или аргининовый тример, состоящий из двух или трех остатков аргинина, связанных друг с другом.

[7] Пептид, имеющий 4 связанных эпитопа по любому из пп.[1]-[6], где другая пептидная последовательность, состоящая из гидрофильных аминокислот связана с N-концом.

[8] Пептид, имеющий 4 связанных эпитопа по любому из пп.[1]-[7], в котором другая пептидная последовательность, состоящая из гидрофильных аминокислот, состоит из аргининового тримера или аргининового тетрамера, состоящего из трех или четырех остатков аргинина, связанных друг с другом.

[9] Пептид, имеющий 4 связанных эпитопа по любому из пп.[1]-[8], который состоит из аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:65 или SEQ ID NO:66.

[10] CTL, полученный путем стимуляции лимфоцитов периферической крови с использованием пептида, содержащего 4 связанных эпитопа по любому из пп.[1]-[9].

[11] Фармацевтическая композиция, содержащая в качестве действующего ингредиента пептид, имеющий 4 связанных эпитопа по любому из пп.[1]-[9}, или CTL по п.[10].

[12] Фармацевтическая композиция, содержащая два или несколько пептидов, выбранных из числа пептидов, имеющих 4 связанных эпитопа по любому из пп.[1]-[9].

[13] Фармацевтическая композиция по п.[11] или [12], которая представляет собой иммунотерапевтический агент.

[14] Способ лечения рака, включающий введение раковому пациенту пептида, содержащего 4 связанных эпитопа по любому из пп.[1]-[9], CTL по п.[10] или фармацевтическую композицию по любому из пп.[11]-[13].

Это описание включает часть или все содержание, раскрытые в описаниях и/или чертежах патентных заявок Японии № 2013-218524 и 2014-155132, которые являются приоритетными документами настоящей заявки.

Эффекты изобретения

В настоящем изобретении предложен раковый антигенный пептид, который может быть введен широкому кругу раковых пациентов в качестве пептидной вакцины против рака, и который может индуцировать сильный гуморальный ответ, независимо от HLA-типа пациентов.

Пептид, имеющий 4 связанных CTL-эпитопа по настоящему изобретению, может быть введен широкому кругу раковых пациентов без необходимости типирования HLA. Примеры таких пациентов включают в себя HLA-A2-положительных пациентов, HLA-A24-положительных пациентов, HLA-A26-положительных пациентов и HLA-A3 супертип-положительных пациентов. Пептид, как описано выше, может быть использован для лечения и/или профилактики рака или заболеваний, им вызванных, у таких пациентов. Кроме того, экспрессия опухолевых антигенов, составляющих пептид, имеющий 4 связанных CTL-эпитопа по настоящему изобретению, наблюдается во множестве типов раков. Таким образом, пептид, имеющий 4 связанных CTL-эпитопа по настоящему изобретению, может быть использован в качестве фармацевтической композиции (и, более конкретно, в качестве иммунотерапевтического агента) для лечения и/или профилактики различных видов рака. Посредством введения пептида, имеющего 4 связанных CTL-эпитопа по настоящему изобретению, дополнительно можно индуцировать специфичные к CTL-эпитопному пептиду CTL и синтез иммуноглобулинов в более сильной степени по сравнению с введением смеси эквивалентного количества CTL-эпитопных пептидов, и можно более эффективно активировать противоопухолевый иммунитет.

Краткое описание чертежей

На фиг. 1-1 показаны результаты ВЭЖХ для пептидов, имеющих 4 связанных эпитопа, полученных в примере 1 (TPV06, TPV10, TPV12, TPV21, TPV26, TPV30, TPV35,TPV37, TPV39, TPV40, TPV41, TPV43 и TPV45).

Фиг. 1-2 является продолжением фиг. 1-1.

Фиг. 1-3 является продолжением фиг. 1-2.

Фиг. 1-4 является продолжением фиг. 1-3.

Фиг. 1-5 является продолжением фиг. 1-4.

Фиг. 1-6 является продолжением фиг. 1-5.

Фиг. 1-7 является продолжением фиг. 1-6.

На фиг. 2-1 показаны результаты масс-спектрометрии (MS) для пептидов, имеющих 4 связанных эпитопа, полученных в примере 1 (TPV39, TPV40, TPV41, TPV43 и TPV45).

Фиг. 2-2 является продолжением фиг. 2-1.

Фиг. 2-3 является продолжением фиг. 2-2.

На фиг. 3-1 показаны результаты индукции эпитоп-специфичных CTL в мышах, которым был введен пептид, имеющий 4 связанных эпитопы (*: неисследованные). На фиг. 3-1 дополнительно показаны результаты оценки, достигнутые расщеплением пептида, имеющего 4 связанных эпитопа, человеческими иммунопротеасомами и изучением расщепления С-конца идентифицированных эпитопных пептидов PEP2 или PEP10.

Фиг. 3-2 является продолжением фиг. 3-1.

Фиг. 3-3 является продолжением фиг. 3-2.

На фиг. 3-4 показаны результаты индукции эпитоп-специфичных CTL в мышах, которым были введены пептид, имеющий 4 связанных эпитопа, содержащий пептидную последовательность остатков аргинина на N-конце, или пептид, имеющий 4 связанных эпитопа, содержащий аргининовый тример в качестве пептид-пептидного линкера (*: неисследованные). На фиг. 3-4 дополнительно показаны результаты оценки, достигнутые расщеплением пептида, имеющего 4 связанных эпитопа, человеческими иммунопротеасомами и изучением расщепления С-конца идентифицированных эпитопных пептидов PEP2 или PEP10.

На фиг. 4-1 показаны результаты анализа титра эпитоп-специфичных IgG антител в сыворотке мышиных моделей, которым вводили пептид, имеющий 4 связанных эпитопа.

Фиг. 4-2 является продолжением фиг. 4-1.

На фиг. 4-3 приведены результаты анализа титра эпитоп-специфичных IgG антител в сыворотке мышиных моделей, которым вводили пептид, имеющий 4 связанных эпитопа, содержащий пептидную последовательность остатков аргинина на N-конце, или пептид, имеющий 4 связанных эпитопа, содержащий аргининовый тример в качестве пептид-пептидного линкера.

Варианты осуществления изобретения

Далее настоящее изобретение будет описано более подробно.

1. Пептид, имеющий 4 связанных CTL-эпитопа

В настоящем изобретении термин «пептид, имеющий 4 связанных CTL-эпитопа» означает 4 пептида, выбранных из числа CTL-эпитопных пептидов, полученных из одной и/или разных молекул опухолевых антигенов, линейно связанных через линкеры в качестве единой молекулы.

«CTL-эпитопный пептид, полученный из молекул опухолевых антигенов» представляет собой пептид, получаемый в результате деградации опухолевых антигенов внутри опухолевых клеток, и он связан с молекулой HLA I класса и представлен на клеточной поверхности. Таким образом, он распознается опухоль-специфичными CTL, и/или он может индуцировать и/или активировать опухоль-специфичные CTL. «Индукция опухоль-специфических CTL» относится к дифференцировке и/или пролиферации CTL, которые специфично распознают CTL-эпитопные пептиды, полученные из молекул опухолевых антигенов in vitro or in vivo. Кроме того, «активация опухоль-специфичных CTL» относится к продукции интерферона-γ (IFN-γ) и/или проявлению цитотоксической активности путем высвобождения цитотоксических веществ или аналогичных соединений, когда CTL распознает антиген, представленный молекулой HLA I класса. «CTL-эпитопный пептид, полученный из молекулы опухолевого антигена» в контексте данного изобретения иногда называют «CTL-эпитопным пептидом».

В качестве CTL-эпитопных пептидов, полученных из молекул опухолевых антигенов, известны приведенные ниже:

PEP1: KLVERLGAA (SEQ ID NO:1 [WO 200l/0l1044]);

PEP2: ASLDSDPWV (SEQ ID NO:2 [WO 2002/010369]);

PEP3: ALVEFEDVL (SEQ ID NO:3 [WO 2002/010369]);

PEP4: LLQAEAPRL (SEQ ID NO:4 [WO 2000/12701]);

PEP5: DYSARWNEI (SEQ ID NO:5 [JP H11-318455 A (1999)]);

PEP6: VYDYNCHVDL (SEQ ID NO:6 [WO 2000/12701]);

PEP7: LYAWEPSFL (SEQ ID NO:7 [JP 2000-000270 A]);

PEP8: DYLRSVLEDF (SEQ ID NO:8 [WO 2001/011044]);

PEP9: QIRPIFSNR (SEQ ID NO:9 [WO 2008/007711]);

PEP10: ILEQSGEWWK (SEQ ID NO:10 [WO 2009/022652]);

PEP11: VIQNLERGYR (SEQ ID NO:11 [WO 2009/022652]);

PEP12: KLKHYGPGWV (SEQ ID NO:12 [WO 1999/067288]);

PEP13: RLQEWCSVI (SEQ ID NO:13 [WO 2002/010369]);

PEP14: ILGELREKV (SEQ ID NO:14 [WO 2002/010369]);

PEP15: DYVREHKDNI (SEQ ID NO:15 [WO 2005/071075]);

PEP16: HYTNASDGL (SEQ ID NO:16 [WO 2001/011044]);

PEP17: NYSVRYRPGL (SEQ ID NO:17 [JP 2000-000270 A]);

PEP18: RYLTQETNKV (SEQ ID NO:18 [JP 2007-145715 A]); and

PEP19: TFDYLRSVL (SEQ ID NO:19 [WO 2001/011044]).

PEP1, PEP2, PEP3, PEP4, PEP5, PEP8, PEP10, PEP12, PEP13, PEP14 и PEP15 ограничены HLA-A2, и CTL тогда могут быть индуцированы и/или активированы. PEP2, PEP5, PEP6, PEP7, PEP8, PEP12, PEP13, PEP15, PEP16, PEP17, PEP18 и PEP19 ограничены HLA-A24, и CTL тогда могут быть индуцированы и/или активированы. PEP1, PEP2, PEP4, PEP5, PEP6, PEP9, PEP10, PEP11, PEP12, PEP13, PEP15 и PEP16 ограничены супертипом HLA-A3, и CTL тогда могут быть индуцированы и/или активированы. Дополнительно, PEP2 и PEP6 ограничены HLA-A26, и CTL затем могут быть индуцированы и/или активированы. Экспрессия генов, кодирующих такие CTL-эпитопные пептиды, наблюдается в множестве типов раков (Yang, D. et al., Cancer Res., 1999, 59: 4056-63; Harashima, N. et al., Eur. J. Immunol., 2001, 31 (2), 323-32).

Различные типы пептидов, имеющих 4 связанных CTL-эпитопа, которые получены путем линейного связывания 4 типов CTL-эпитопных пептидов, выбранных из конкретных 13 видов CTL-эпитопных пептидов, описанных выше, с помощью линкеров в виде единой молекулы могут служить в качестве «пептидов, имеющих 4 связанных CTL-эпитопа» по настоящему изобретению. Три из больше CTL, специфичных к соответствующим CTL-эпитопным пептидам, могут быть индуцированы и/или активированы. Пептиды, которые невозможно напрямую оценить в отношении индукции CTL, специфичных к эпитопному пептиду (а именно, PEP2 и PEP10), могут быть подвергнуты расщеплению иммунопротеасомами (пример 3), для того чтобы определить возникновение индукции CTL, специфичных к эпитопному пептиду. В общем, антигенные белки, которые находятся в антиген-представляющих клетках, как известно, расщепляются с помощью протеасом или иммунопротеасом, и такая процедура, как известно, необходима антигенным белкам для опосредованного HLA представления антигенов (например, Rock K.L., York, I.A., Goldberg, A.L., Nat. Immunol., 2004, 5(7): 670-677). Необходимо, чтобы CTL-эпитопные пептиды расщеплялись в соответствующих участках, что позволяет таким эпитопным пептидам связываться с карманами в HLA. Необходимо, чтобы С-концевые аминокислоты CTL-эпитопных пептидов определялись в результате расщепления протеасомами или иммунопротеасомами (Rock K.L., York, I.A., Goldberg, A.L., Nat. Immunol., 2004, 5(7): 670-677). Предполагается, что при введении человеку пептидов, имеющих 4 связанных эпитопа, CTL-эпитопные пептиды будут представляться дендритными клетками. Исходя из такого предположения, картина расщепления пептидов, имеющих 4 связанных эпитопа, была проанализирована in vitro с использованием иммунопротеасом, экспрессируемых в дендритных клетках на высоком уровне. Когда CTL-эпитопные пептиды появляются в результате расщепления иммунопротеасомами, можно определить, что индуцируются CTL, специфичные к таким эпитопным пептидам.

В настоящем описании выбраны 4 типа CTL-эпитопных пептидов выбранных из конкретных 13 видов CTL-эпитопных пептидов, необязательно дублировано, из пептида, приведенного в SEQ ID NO:1 (PEP1), пептида, приведенного в SEQ ID NO:2 (PEP2), пептида, приведенного SEQ ID NO:4 (PEP4), пептида, приведенного SEQ ID NO:5 (PEP5), пептида, приведенного SEQ ID NO: 6 (PEP6), пептида, приведенного SEQ ID NO:7 (PEP7), пептида, приведенного SEQ ID NO:8 (PEP8), пептида, приведенного SEQ ID NO:9 (PEP9), пептида, приведенного в SEQ ID NO:10 (PEP10), пептида, приведенного SEQ ID NO:13 (PEP13), пептида, приведенного SEQ ID NO:15 (PEP15), пептида, приведенного в SEQ ID NO:17 (PEP17), и пептида, приведенного в SEQ ID NO:18 (PEP18).

В настоящем изобретении, пептид, имеющий аминокислотную последовательность, имеющую замену, вставку, удаление и/или добавление одной или нескольких аминокислот в аминокислотной последовательности PEP1, PEP2, PEP4, PEP5, PEP6, PEP7, PEP8, PEP9, PEP10, PEP13, PEP15, PEP17 или PEP18, и имеющий способность к индукции CTL и способность к индукции синтеза иммуноглобулинов, равную или более высокие, чем у исходного пептида, может быть использован в качестве «CTL-эпитопного пептида». Термин «несколько», используемый в данном описании, относится к числам от 1 до 3 и, предпочтительно, к числу 1 или 2. Примером такого пептида является пептид, полученный путем замены аминокислот, обладающих свойствами, аналогичными свойствам исходной аминокислоты (то есть пептид, полученный консервативной аминокислотной заменой).

Пептид, имеющий 4 связанных CTL-эпитопа по настоящему изобретению включает в себя 4 эпитопных пептида, которые выбраны, необязательно дублировано, из PEP1, PEP2, PEP4, PEP5, PEP6, PEP7, PEP8, PEP9, PEP10, PEP13, PEP15, PEP17 и PEP18, линейно связанных через линкеры.

Может использоваться любой линкер, при условии, что он расщепляется при введении в организм пептида, имеющего 4 связанных CTL-эпитопа, а связанные CTL-эпитопные пептиды могут быть отделены друг от друга. Примеры включают сложноэфирную связь, связь через простой эфир, амидную связь, связь через сахарную цепь, полиэтиленгликолевый линкер и аминокислотный линкер. Примеры аминокислотных последовательностей, используемых в качестве аминокислотных линкеров, включают аргининовый димер, аргининовый тример, аргининовый тетрамер, лизиновый димер, лизиновый тример, лизиновый тетрамер, глициновый димер, глициновый тример, глициновый тетрамер, глициновый пентамер, глициновый гексамер, аланин-аланин-тирозин (AAY), изолейцин-лейцин-аланин (АМП) и аргинин-валин-лизин-аргинин (RVKR), причем аргининовый димер или тример являются предпочтительными.

CTL-эпитопные пептиды, которые будут выбраны, и их расположение могут быть определены путем введения пептида, имеющего 4 связанных эпитопа, полученного путем синтеза эпитопов в заданных комбинациях и в заданном порядке, мышам, несущим трансгенный HLA-A человека, и путем оценки возникновения индукции CTL, специфичных к CTL-эпитопным пептидам, in vivo.

Предпочтительно, чтобы пептид, имеющий 4 связанных эпитопа по настоящему изобретению, имел один или несколько признаков, выбранных из признаков (1)-(5) ниже:

(1) пептид содержит PEP2 на С-конце (за исключением пептида, содержащего PEP7 и PEP8 на N-конце, последовательно расположенных в таком порядке с N-конца через линкер);

(2) пептид содержит PEP4 на С-конце;

(3) пептид содержит PEP10 на С-конце;

(4) пептид содержит PEP6 и PEP5 на С-конце, последовательно расположенных в таком порядке с N-конца через линкер; и

(5) пептид содержит PEP5, PEP6, PEP9 и PEP18.

Более предпочтительно, чтобы пептид, имеющий 4 связанных эпитопа по настоящему изобретению, имел признак, выбранный из признаков (1)-(5) ниже:

(1) пептид содержит 3 CTL-эпитопных пептида, выбранных из PEP1, PEP7, PEP8 и PEP13, а PEP2 расположен на С-конце пептида (за исключением пептида, содержащего PEP7 и PEP8 на N-конце, последовательно расположенных в таком порядке с N-конца через линкер);

(2) пептид содержит 3 CTL-эпитопных пептида, PEP5, PEP6 и PEP9, а РЕР4 расположен на С-конце пептида;

(3) пептид содержит 3 CTL-эпитопных пептида, выбранных из PEP1, PEP13, PEP15, PEP17 и PEP18, а PEP10 расположен на С-конце пептида;

(4) пептид содержит 2 CTL-эпитопных пептида, PEP1 и PEP7, а PEP6 и PEP5 последовательно расположены на C-конце в таком порядке с N-конца через линкер; и

(5) пептид содержит 3 CTL-эпитопных пептида, PEP5, PEP6 и PEP18, а PEP9 расположен на С-конце пептида.

Кроме того, предпочтительно, чтобы пептид, имеющий 4 связанных эпитопа по настоящему изобретению, содержал или состоял из последовательности, выбранной из нижеследующих последовательностей, в которых «-(L)-» представляет собой линкер:

- PEP5-(L)-PEP6-(L)-PEP9-(L)-PEP4 (TPV01);

- PEP9-(L)-PEP5-(L)-PEP6-(L)-PEP4 (TPV02);

- PEP6-(L)-PEP5-(L)-PEP9-(L)-PEP4 (TPV03);

- PEP6-(L)-PEP9-(L)-PEP5-(L)-PEP4 (TPV04);

- PEP9-(L)-PEP6-(L)-PEP5-(L)-PEP4 (TPV05);

- PEP5-(L)-PEP9-(L)-PEP6-(L)-PEP4 (TPV06);

- PEP1-(L)-PEP7-(L)-PEP8-(L)-PEP2 (TPV07);

- PEP1-(L)-PEP8-(L)-PEP7-(L)-PEP2 (TPV08);

- PEP7-(L)-PEP1-(L)-PEP8-(L)-PEP2 (TPV09);

- PEP8-(L)-PEP7-(L)-PEP1-(L)-PEP2 (TPV10);

- PEP8-(L)-PEP1-(L)-PEP7-(L)-PEP2 (TPV11);

- PEP7-(L)-PEP13-(L)-PEP8-(L)-PEP2 (TPV12);

- PEP8-(L)-PEP13-(L)-PEP7-(L)-PEP2 (TPV13);

- PEP13-(L)-PEP7-(L)-PEP8-(L)-PEP2 (TPV14);

- PEP8-(L)-PEP7-(L)-PEP13-(L)-PEP2 (TPV15);

- PEP13-(L)-PEP8-(L)-PEP7-(L)-PEP2 (TPV16);

- PEP13-(L)-PEP15-(L)-PEP18-(L)-PEP10 (TPV17);

- PEP13-(L)-PEP18-(L)-PEP15-(L)-PEP10 (TPV18);

- PEP15-(L)-PEP13-(L)-PEP18-(L)-PEP10 (TPV19);

- PEP15-(L)-PEP18-(L)-PEP13-(L)-PEP10 (TPV20);

- PEP18-(L)-PEP13-(L)-PEP15-(L)-PEP10 (TPV21);

- PEP18-(L)-PEP15-(L)-PEP13-(L)-PEP10 (TPV22);

- PEP1-(L)-PEP15-(L)-PEP18-(L)-PEP10 (TPV23);

- PEP1-(L)-PEP18-(L)-PEP15-(L)-PEP10 (TPV24);

- PEP15-(L)-PEP1-(L)-PEP18-(L)-PEP10 (TPV25);

- PEP15-(L)-PEP18-(L)-PEP1-(L)-PEP10 (TPV26);

- PEP18-(L)-PEP1-(L)-PEP15-(L)-PEP10 (TPV27);

- PEP18-(L)-PEP15-(L)-PEP1-(L)-PEP10 (TPV28);

- PEP15-(L)-PEP17-(L)-PEP13-(L)-PEP10 (TPV29);

- PEP15-(L)-PEP13-(L)-PEP17-(L)-PEP10 (TPV30);

- PEP17-(L)-PEP15-(L)-PEP13-(L)-PEP10 (TPV31);

- PEP17-(L)-PEP13-(L)-PEP15-(L)-PEP10 (TPV32);

- PEP13-(L)-PEP17-(L)-PEP15-(L)-PEP10 (TPV33);

- PEP13-(L)-PEP15-(L)-PEP17-(L)-PEP10 (TPV34);

- PEP6-(L)-PEP18-(L)-PEP5-(L)-PEP9 (TPV35);

- PEP6-(L)-PEP5-(L)-PEP18-(L)-PEP9 (TPV36);

- PEP1-(L)-PEP7-(L)-PEP6-(L)-PEP5 (TPV37); и

- PEP7-(L)-PEP1-(L)-PEP6-(L)-PEP5 (TPV38).

Пептид, имеющий 4 связанных CTL-эпитопа по настоящему изобретению, может дополнительно содержать пептидную последовательность, состоящий из гидрофильных аминокислот. Такая пептидная последовательность может быть добавлена на N-конце и/или С-конце пептида, имеющего 4 связанных CTL-эпитопа, и, предпочтительно, добавлена на N-конце. Такая пептидная последовательность состоит из 1-15, предпочтительно, из 2-10 и, более предпочтительно, из 3-5 гидрофильных аминокислот, выбранных из группы, состоящей из аргинина, гистидина, лизина, треонина, тирозина, серина, аспарагина, глутамина, аспарагиновой кислоты и глутаминовой кислоты. Например, аргининовый тример (РРР) или аргининовый тетрамер (RRRR) могут быть использованы в качестве такой пептидной последовательности. Примеры пептидов, имеющих 4 связанных CTL-эпитопа, содержащие такие добавленные к ним пептидные последовательности включают RRR-TPV06, RRRR-TPV06, TPV06-RRR, TPV06-RRRR, RRR-TPV10, RRRR-TPV10, TPV10-RRR, TPV10-RRRR, RRR-TPV12, RRRR-TPV12, TPV12-RRR, TPV12-RRRR, RRR-TPV21, RRRR-TPV21, TPV21-RRR, TPV21-RRRR, RRR-TPV26, RRRR-TPV26, TPV26-RRR, TPV26-RRRR, RRR-TPV30, RRRR-TPV30, TPV30-RRR, TPV30-RRRR, KKK-TPV06, KKKK-TPV06, TPV06-KKK, TPV06-KKKK, KKK-TPV10, KKKK-TPV10, TPV10-KKK, TPV10-KKKK, KKK-TPV12, KKKK-TPV12, TPV12-KKK, TPV12-KKKK, KKK-TPV21, KKKK-TPV21, TPV21-KKK, TPV21-KKKK, KKK-TPV26, KKKK-TPV26, TPV26-KKK, TPV26-KKKK, KKK-TPV30, KKKK-TPV30, TPV30-KKK, TPV30-KKKK, HHH-TPV06, HHHH-TPV06, TPV06-HHH, TPV06-HHHH, HHH-TPV10, HHHH-TPV10, TPV10-HHH, TPV10-HHHH, HHH-TPV12, HHHH-TPV12, TPV12-HHH, TPV12-HHHH, HHH-TPV21, HHHH-TPV21, TPV21-HHH, TPV21-HHHH, HHH-TPV26, HHHH-TPV26, TPV26-HHH, TPV26-HHHH, HHH-TPV30, HHHH-TPV30, TPV30-HHH, TPV30-HHHH, RRKK-TPV12, RKRK-TPV12, RHRH-TPV12, RRHH-TPV12, KKHH-TPV12, and KHKH-TPV12, with KKK-TPV06, KKKK-TPV06, KKK-TPV10, KKKK-TPV10, KKK-TPV12, KKKK-TPV12, KKK-TPV21, KKKK-TPV21, KKK-TPV26, KKKK-TPV26, KKK-TPV30, KKKK-TPV30, HHH-TPV06, HHHH-TPV06, HHH-TPV10, HHHH-TPV10, HHH-TPV12, HHHH-TPV12, HHH-TPV21, HHHH-TPV21, HHH-TPV26, HHHH-TPV26, HHH-TPV30, HHHH-TPV30, RRKK-TPV12, RKRK-TPV12, RHRH-TPV12, RRHH-TPV12, KKHH-TPV12, причем KHKH-TPV12 является предпочтительной, а RRR-TPV06, RRRR-TPV06, RRR-TPV10, RRRR-TPV10, RRR-TPV12, RRRR-TPV12, TRRR-TPV21, RRRR-TPV21, RRR-TPV26, RRRR-TPV26, RRR-TPV30, и RRRR-TPV30 являются более предпочтительными. Пептид, содержащий такую пептидную последовательность, как известно, лучше растворяется в водном растворителе (Abdelkrim Alileche et al., Peptides 38, 2012, 302-311; JP 2006-188507 A). После добавления такой пептидной последовательности к пептиду, имеющему 4 связанных CTL-эпитопа по настоящему изобретению, степень растворимости пептида, имеющего 4 связанных CTL-эпитопа, в водном растворителе может быть увеличина.

В случае пептида, имеющего 4 связанных эпитопа по настоящему изобретению, CTL, специфичные к CTL-эпитопным пептидам, могут индуцироваться и/или активироваться по меньшей мере к трем типам и, предпочтительно, к четырем типам CTL-эпитопных пептидов из 4 связанных типов CTL-эпитопных пептидов. Кроме того, может индуцироваться продукция иммуноглобулина, специфичного к каждому CTL-эпитопному пептиду. В настоящем изобретении термин «иммуноглобулины» относится к IgG, IgM, IgA или IgD.

Пептид, имеющий 4 связанных эпитопа по настоящему изобретению, может представлять собой кислотно-аддитивную соль или основно-аддитивную соль. Примерами кислот, которые обычно используются для образования кислотно-аддитивных солей, включают органические кислоты, такие как соляная кислота, бромистоводородная кислота, йодистоводородная кислота, щавелевая кислота, п-бромфенилсульфоновая кислота, карбоновая кислота, янтарная кислота, лимонная кислота, бензойная кислота, уксусная кислота и трифторуксусная кислота. Примеры основно-аддитивных солей включают соли, полученные с неорганическими основаниями, такими как гидроксид аммония, гидроксид щелочного металла, гидроксид карбонат и бикарбонат щелочноземельного металла.

2. Получение пептида, имеющего 4 связанных CTL-эпитопа

Пептид, имеющий 4 связанных CTL-эпитопа по настоящему изобретению, может быть получен с помощью обычных методик, например, пептидного синтеза, например, жидкофазного синтеза или твердофазного синтеза, или пептидного синтеза, включающего использование автоматизированного пептидного синтезатора (Kelley et al., Genetics Engineering Principles and Methods, Setlow, J. K. eds., Plenum Press NY., 1990, Vol. 12, pp. 1-19; Stewart et al., Solid-Phase Peptide Synthesis, 1989, W. H. Freeman Co.; Houghten, Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 1985, 82: p. 5132, "Shin Seikagaku Jikken Kouza (New Biochemical Experiment) 1, Protein IV, 1992, the Japanese Biochemical Society (ed.), Tokyo Kagaku Doujin). Пептидный синтез осуществляют путем получения аминокислот, в которых функциональные группы кроме α-аминогрупп и α-карбоксильных групп, которые будут связываться в аминокислотах, являются защищенными, и путем образования пептидных связей между α-аминогруппами и α-карбоксильными группами в аминокислотах. Обычно, карбоксильная группа аминокислотного остатка, расположенная на С-конце пептида связана с твердой фазой с помощью соответствующего спейсера или линкера. Защитную группу на аминоконце дипептида, полученного выше, селективно удаляют, и пептидная связь образуется между аминоконцом и α-карбоксильной группой следующего аминокислотного остатка. Эту процедуру продолжают, получая пептид с защищенными боковыми группами, и все защитные группы удаляют и отделяют от твердой фазы в конце синтеза. Типы защитных групп, способы их защиты и способы связывания пептида подробно описаны в документах, указанных выше.

В качестве альтернативы, пептид может быть получен с помощью генетической рекомбинации, фагового дисплея или другими методами с использованием нуклеиновой кислоты, кодирующей пептид, содержащий 4 связанных эпитопа по настоящему изобретению.

Методика генетический рекомбинации включает встраивание ДНК, кодирующей пептид, содержащий 4 связанных эпитопа по настоящему изобретению в соответствующий экспрессионный вектор, введение вектора в соответствующие клетки-хозяева, культивирование клеток и выделение целевых пептидов из клеток или внеклеточной жидкости. Примеры векторов включают в себя, но не ограничиваются ими, плазмиду, фаг, космиду, фагмиду и вирусные векторы. Векторы вводят в клетки-хозяева, такие как бактериальные клетки-хозяева (например, E. coli и Bacillus subtilis), дрожжевые клетки, клетки насекомых, клетки животных (например, клетки млекопитающих) и клетки растений. Трансформация или трансфекция в такие клетки осуществляется с помощью, например, фосфатнокальциевого способа, электропорации, липофекции, способа с использованием пушки для обстрела частицами или способа с использованием ПЭГ. Трансформированные клетки культивируют в соответствии с традиционной технологией культивирования организма-хозяина. Для того, чтобы облегчить выделение пептида по настоящему изобретению, предпочтительно, чтобы пептид, генерируемый с помощью экспрессии, секретировался во внеклеточное пространство. С этой целью, с 5'-концевой стороной ДНК, кодирующей целевой пептид, связывают ДНК, кодирующую пептидную последовательность, которая позволяет секрецию пептида из клеток. В альтернативном варианте можно выделить целевой пептид, накапливающийся в клетках. В таком случае, клетки физически или химически разрушают, и целевой пептид выделяют с помощью методики очистки белка.

Полученный таким образом пептид может быть выделен или очищен с помощью обычной методики, например, хроматографических методов, таких как гель-фильтрационная хроматография, ионообменная колоночная хроматография, аффинная хроматография, обращеннофазовая колоночная хроматография или ВЭЖХ, фракционирование с сульфатом аммония, ультрафильтрация или иммуноадсорбция.

3. Цитотоксические Т-лимфоциты

С использованием пептида, имеющего 4 связанных эпитопа по настоящему изобретению, in vitro и/или ex vivo могут быть получены специфичные к CTL-эпитопным пептидам CTL, которые повреждают раковые клетки. Способ индукции CTL с использованием CTL-пептидного эпитопа in vitro и/или ex vivo известен (например, JP 2006-14637 А), и такой метод может быть использован в настоящем изобретении. Например, адгезионные клетки из мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС), полученных от здоровых индивидуумов или раковых пациентов, культивируют в присутствии цитокинов, таких как GM-CSF или IL-4, с тем, чтобы индуцировать дендритные клетки (DC). После того, как дендритные клетки обрабатываются пептидом, имеющим 4 связанных эпитопа по настоящему изобретению, их подвергают действию рентгеновского излучения, чтобы получить антиген-представляющие клетки (стимуляторы). При невозможности использования DC, мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC), полученные от здоровых лиц или тех же раковых пациентов, можно обработать пептидом, имеющим 4 связанных эпитопа по настоящему изобретению, облучить их рентгеновским излучением, и можно использовать полученные в результате клетки. После чего, добавляют мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC), полученные от здоровых лиц, или мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС), полученные от раковых пациентов, или лимфоциты из соответствующих лимфатических узлов (т.е. респондеры), а затем культивируют в присутствии цитокинов, таких как IL-2, IL-4, или IL-7. После этого, антигенпредставляющие клетки, полученные с помощью обработки, описанной выше, снова стимулируют добавлением пептида, имеющего 4 связанных эпитопа по настоящему изобретению, и дополнительно культивируют в присутствии цитокинов, таких как IL-2.

Любая среда, в которой Т-лимфоциты могут выжить, может использоваться в качестве клеточной культуральной среды, используемой для индукции CTL. Например, может быть использована среда, полученная путем добавления различных цитокинов (например, IL-2) и фетальной телячьей сыворотки (FCS) в среду RHAMα (среда LAK, описанная в Kawai, K., Sasaki, T., Saijo-Kurita, K., Akaza, H., Koiso, K., and Ohno, T., Cancer Immunol. Immunother., 35, 225-229, 1992), среду AIMV (GIBCO BRL, Life Technologies, INC.) или среду RPMI 1640.

Культивирование может быть проведено при условиях, хорошо известных в данной области. Например, при температуре культивирования, составляющей от 33°C до 41°C, и предпочтительно 37°C. В качестве газовой фазы может быть использован инертный газ, содержащий воздух или кислород в соответствующей концентрации и двуокись углерода в соответствующей концентрации (например, 5% CO₂) для подведения рН среды до 7,4. Культивирование предпочтительно проводить в течение 4-10 дней и, более предпочтительно, в течение 7-8 дней. Некоторые CTL, индуцированные посредством такого культивирования, являются специфичными к CTL-эпитопным пептидам для каждого из по меньшей мере трех типов и, предпочтительно, четырех типов CTL-эпитопных пептидов, из четырех типов CTL-эпитопных пептидов, составляющих пептид, содержащий 4 связанных эпитопа, и, таким образом, они могут специфично повреждать раковые клетки.

4. Фармацевтическая композиция

Пептид, имеющий 4 связанных эпитопа по настоящему изобретению, может быть использован в качестве действующего ингредиента фармацевтической композиции, используемой для иммунотерапии рака.

Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может содержать в качестве действующего ингредиента(ов), один или несколько пептидов, имеющих 4 связанных эпитопа. За счет включения множество пептидов, имеющих 4 связанных эпитопа, можно ожидать более сильных эффектов. Кроме того, полученная фармацевтическая композиция может являться более универсальной, так что ее можно вводить в качестве противораковой пептидной вакцины более широкому кругу раковых пациентов, независимо от их HLA-типа.

Обнаружено, что гены, кодирующие PEP1, PEP2, PEP4, PEP5, PEP6, PEP7, PEP8, PEP9, PEP10, PEP13, PEP15, PEP17 и PEP18, включенные в пептид, имеющий 4 связанных эпитопа по настоящему изобретению, экспрессируются во множестве типы солидных раков и раковых заболеваний крови. Примеры солидных раков включают опухоль головного мозга, рак легкого, рак молочной железы, рак щитовидной железы, рак шейки матки, рак тела матки, рак яичников, рак пищевода, рак желудка, опухоль стромы желудочно-кишечного тракта (GIST), рак поджелудочной железы, рак толстой кишки, рак прямой кишки, рак анального канала, рак почки, рак печени, рак желчных путей, рак головы и шеи, рак мочевого пузыря, рак предстательной железы, злокачественную меланому, рак кожи, рак языка, остеосаркому, хондросаркому, фибросаркому, липосаркому, ангиосаркому, рабдомиосаркому и лейомиосаркому. Примеры рака крови включают лейкемию, злокачественную лимфому и миелому. Таким образом, пептид, имеющий 4 связанных эпитопа по настоящему изобретению, является полезным для лечения и/или предупреждения таких видов рака. Термин «лечение и/или предупреждение рака», используемый в данном описании, относится к предупреждению развития/рецидива рака, подавлению прогрессирования/обострения рака или к улучшению состояния при раковом заболевании.

Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может содержать фармацевтически приемлемые материалы, такие как различные традиционные органические или неорганические носители. Примеры фармацевтических носителей, которые могут быть использованы, включают стабилизаторы, антибактериальные вещества, буферы, изотонические агенты, хелатирующие агенты, регуляторы рН, поверхностно-активные вещества, наполнители, загустители, связующие вещества, увлажнители, способствующие распадаемости вещества, поверхностно-активные вещества, смазывающие вещества, смягчающие вещества, разбавители и вспомогательные вещества, которые, как правило, используются в соответствии с формой введения соответствующих фармацевтических препаратов. Фармацевтические препараты, предпочтительно, получают в виде составов, дополненных такими носителями в соответствии с обычными методами.

Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может содержать адъювант, который, как известно, используется во время введения вакцины. Примеры адъювантов включают в себя полный адъювант Фрейнда (CFA), неполный адъювант Фрейнда (IFA), квасцы, липид А, монофосфориллипид А, бактериальные препараты, такие как БЦЖ (Bacillus-Calmette-Guerrin), нуклеиновые кислоты, такие как CpG-ДНК и дцРНК, препараты бактериальных компонентов, такие как туберкулин, природные полимеры, такие как гемоцианин морского блюдечка и дрожжевой маннан, мурамил-трипептид, мурамил-дипептид или производное любого из них, квасцы, неионные блок-сополимеры, и цитокины, такие как интерлейкин-2 (IL-2), гранулоцит-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF), интерферон-α (IFN-α), и интерферон-β (IFN-β). Эти адъюванты могут быть использованы по отдельности или в комбинации из двух или нескольких из них. Адъюванты могут вводиться одновременно с фармацевтической композицией по настоящему изобретению в виде смеси или эмульсии.

В дополнение к пептиду, имеющему 4 связанных эпитопа, фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может содержать один или несколько из известных CTL-эпитопных пептидов, полученных из молекул опухолевых антигенов, содержащий их пептид или пептид, содержащий CTL-эпитопные пептиды, связанные друг с другом (в дальнейшем называемые «известными CTL-пептидными эпитопами, полученными из молекул опухолевых антигенов»). Примеры известных CTL-эпитопных пептидов, полученных из молекул опухолевых антигенов включают, но не ограничиваются ими, WT-1 p126-134, модифицированный (M236Y) WT-1 p235-243, NY-ESO-1 p157-165, модифицированный (T210M) gp100 p209-217, сурвивин-2B p80-88, Her-2/neu p63-71, VEGFR2 p169-177, MART-1 p26-35, глипикан-3 p298-306 и SPARC p143-151. В этом случае пептид, имеющий 4 связанных эпитопа по настоящему изобретению и известные CTL-эпитопные пептиды, полученные из молекул опухолевых антигенов, может быть получен в виде моноагентного препарата. В качестве альтернативы, препарат, содержащий в качестве действующего ингредиента пептид, имеющий 4 связанных эпитопа по настоящему изобретению, может быть отделен от препарата, содержащего в качестве действующего ингредиента, известные CTL-эпитопные пептиды, полученные из молекул опухолевых антигенов.

Лекарственная форма фармацевтической композиции по настоящему изобретению может быть выбрана в соответствии с формой введения. Типичные примеры лекарственных форм включают, но не ограничиваются ими, жидкие препараты, эмульсии, липосомные препараты, липидные эмульсии, комплексы с включением в циклодекстрин, суспензии, мази, кремы, агенты для введения через кожу, агенты для введения через слизистую оболочку, таблетки, пилюли, капсулы, порошки, порошковые лекарственные соединения, гранулы, мелкие зерна и сиропы. В соответствии с путем введения, такие лекарственные формы дополнительно подразделяются, например, на пероральные препараты, парентеральные препараты, трансназальные препараты, трансвагинальные препараты, суппозитории, подъязычные препараты, средства для ингаляции, глазные капли или ушные капли, и такие препараты могут быть смешаны, сформованы или получены по обычным методикам. Кроме применения в виде жидких препаратов, такой препарат может быть лиофилизован для получения фармацевтического препарата, который можно хранить. При использовании такого фармацевтического препарата его можно растворить при помощи, например, буфера, содержащего воду и физиологический раствор, таким образом, чтобы подвести его концентрацию до соответствующего уровня.

Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может включать в качестве действующего ингредиента CTL, индуцированные in vitro и/или ex vivo с использованием пептида, имеющего 4 связанных эпитопа по настоящему изобретению. Такая фармацевтическая композиция предпочтительно имеет форму парентерального агента.

5. Способ лечения

Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению, может быть введена широкому кругу раковых пациентов, таких как пациенты, которые имеют типы HLA, выбранные из группы, состоящей из HLA-A2, HLA-A24, HLA-A26 и HLA-A3 супертипа, и лечение может быть начато без проведения HLA-типирования до начала лечения.

При введении раковому пациенту фармацевтической композиции по настоящему изобретению могут индуцироваться и/или активироваться CTL, специфичные по меньшей мере к трем и, предпочтительно, к четырем типам CTL-эпитопных пептидов, составляющих пептид, имеющий 4 связанных эпитопа, в качестве действующего ингредиента фармацевтической композиции. Кроме того, может индуцироваться синтез иммуноглобулинов, специфичных к соответствующим CTL-эпитопным пептидам. Уровень индукции синтеза иммуноглобулинов при введении пептида, имеющего 4 связанных эпитопа в качестве действующего ингредиента, значительно превышает уровень индукции синтеза иммуноглобулинов, наблюдаемый при введении смеси CTL-эпитопных пептидов, которые содержатся в пептиде, имеющем 4 связаных эпитопа, но которые не связаны друг с другом. Таким образом, пептид, имеющий 4 связанных эпитопа по настоящему изобретению, может эффективно лечить и/или предупреждать рак у ракового пациента.

Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению, может быть введена посредством, например, перорального введения, внутривенного введения, внутриартериального введения, внутримышечного введения, подкожного введения, внутрикожного введения, подъязычного введения, внутрибрюшинного введения, ректального введения, чрескожного введения, введения через слизистые, трансназального введения, трансвагинального введения, трансокулярного введения или аспирации. Когда препараты, содержащие в качестве действующих ингредиентов множество пептидов, имеющих 4 связанных эпитопа, или известных CTL-эпитопных пептидов, полученных из молекул опухолевых антигенов, получают в виде отдельных фармацевтических композиций, такие фармацевтические композиции могут быть введены одновременно или неодновременно одним или разными путями.

Дозировка фармацевтической композиции по настоящему изобретению, могут быть соответствующим образом скорректирована в соответствии с такими факторами, как состояние/тяжесть ракового заболевания, подлежащего лечению, возраст пациента или вес тела пациента. Например, фармацевтическую композицию, содержащую пептид, имеющий 4 связанных эпитопа, в количестве от 0,0001 мг до 1000 мг, предпочтительно, от 0,001 мг до 100 мг и, еще более предпочтительно, от 0,01 мг до 50 мг, можно повторно вводить один раз в каждые несколько дней, несколько недель или несколько месяцев. Когда фармацевтическая композиция по настоящему изобретению содержит в качестве действующих ингредиентов, CTL, индуцированные in vitro и/или ex vivo с использованием пептида, имеющего 4 связанных эпитопа по настоящему изобретению, предпочтительно вводить от 2×10⁶ до 2×10⁸ CTL на кг массы тела каждый день с интервалами от 1 до 2 недель.

Фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно вводить раковому пациенту в комбинации с фармацевтическими продуктами, которые обычно используются для химиотерапии рака. Примерами таких фармацевтических продуктов включают в себя: алкилирующие агенты, такие как циклофосфамид, темозоломид и бендамустин; антиметаболиты, такие как тегафур-урацил, тегафур-гимерацил-отерацил калия, метотрексат, гемцитабин; содержащие платину препараты, такие как цисплатин и оксалиплатин; содержащие растительные алкалоиды препараты, такие как иринотекан, эрибулин, паклитаксел, доцетаксел и винкристин; канцеростатические антибиотики, такие как доксорубицин, блеомицин и актиномицин D; молекулярно-направленные препараты, такие как иматиниб, сунитиниб, гефитиниб, сорафениб, эверолимус, трастузумаб, бевацизумаб, ритуксимаб, цетуксимаб, панитумумаб и могамулизумаб; гормональные терапевтические агенты, такие как бикалутамид, эстрамустин и экземестан; и иммуностимулирующие агенты, такие как лентинан, пицибанил и крестин. Такие фармацевтические продукты могут быть введены одновременно или неодновременно с фармацевтической композицией по настоящему изобретению одним или разными путями.

Далее настоящее изобретение будет описано более подробно в примерах, хотя настоящее изобретение не ограничивается данными примерами.

Примеры

Пример 1: синтез и очистка пептидов

CTL-эпитопные пептиды и пептиды, имеющие 4 связанных эпитопа, были синтезированы с использованием коммерчески доступного пептидного синтезатора (Prelude, Protein Technologies, Inc.) способом твердофазного синтеза (Fmoc). В частности, на смолу Alko-PEG сорбировали аминокислоты с защищенными активными группами, затем впрыскивали деблокирующий раствор для удаления защитных групп, затем вводили аминокислоты с защищенными активными группами и оставляли для прохождения реакции между ними, чтобы синтезировать дипептид. Путем повторения такой процедуры были синтезированы пептиды, содержащие последовательности, представляющие интерес. Пептидные защитные группы удаляли путем проведения реакции в растворе для снятия защитных групп, содержащем 2,5% триизопропилсилана, 2,5% воды и 95% трифторуксусной кислоты в течение 2 часов. После добавления холодного эфира к полученному фильтрату пептиды получали в виде осадка. Полученные различные синтетические пептиды очищали с использованием колонки YMC-Pack Pro C18 (YMC Co., Ltd.) и ВЭЖХ-системы (Gilson) с использованием 0,1%-го водного раствора TFA и ацетонитрила в качестве подвижной фазы. После окончания процесса очистки, чистоту и молекулярную массу пептидов анализировали с помощью систем LC-MS (система Waters Acquity UPLC, Micromass ZQ). Пептиды лиофилизировали, хранили при пониженной температуре в темноте, а затем использовали в примерах, описанных ниже. В таблицах с 1-1 по 1-8 приведены масс-спектрометрические данные пептидов, имеющих 4 связанных эпитопа (TPV01-TPV45). На фиг. с 1-1 по 1-7 приведены данные жидкостной хроматографии для TPV06, TPV10, TPV12, TPV21, TPV26, TPV30, TPV35, TPV37, TPV39, TPV40, TPV41, TPV43 и TPV45. На фиг. с 2-1 по 2-3 приведены масс-спектрометрические данные для TPV39, TPV40, TPV41, TPV43 и TPV45.

Таблица 1-1
Масс-спектрометрические данные Пептид Молекулярный вес Расчетный Измеренный TPV01 5417,1 4H⁺ ион 1355,5 4H⁺ ион 1355,8 5H⁺ ион 1084,4 5H⁺ ион 1084,9 6H⁺ ион 903,8 6H⁺ ион 904,1 7H⁺ ион 774,9 7H⁺ ион НО 8H⁺ ион 678,1 8H⁺ ион 678,3 TPV02 4H⁺ ион 1355,5 4H⁺ ион 1355,5 5H⁺ ион 1084,4 5H⁺ ион 1084,3 6H⁺ ион 903,8 6H⁺ ион 904,1 7H⁺ ион 774,9 7H⁺ ион 775,2 8H⁺ ион 678,1 8H⁺ ион НО TPV03 4H⁺ ион 1355,5 4H⁺ ион 1355,9 5H⁺ ион 1084,4 5H⁺ ион 1084,7 6H⁺ ион 903,8 6H⁺ ион 904,2 7H⁺ ион 774,9 7H⁺ ион 775,2 8H⁺ ион 678,1 8H⁺ ион 678,2 TPV04 4H⁺ ион 1355,5 4H⁺ ион 1355,6 5H⁺ ион 1084,4 5H⁺ ион 1084,5 6H⁺ ион 903,8 6H⁺ ион 904,2 7H⁺ ион 774,9 7H⁺ ион 775,0 8H⁺ ион 678,1 8H⁺ ион 678,8 TPV05 4H⁺ ион 1355,5 4H⁺ ион 1355,7 5H⁺ ион 1084,4 5H⁺ ион 1084,7 6H⁺ ион 903,8 6H⁺ ион 904,2 7H⁺ ион 774,9 7H⁺ ион 775,1 8H⁺ ион 678,1 8H⁺ ион 678,4 TPV06 4H⁺ ион 1355,5 4H⁺ ион 1354,4 5H⁺ ион 1084,4 5H⁺ ион 1084,2 6H⁺ ион 903,8 6H⁺ ион 903,5 7H⁺ ион 774,9 7H⁺ ион 774,6 8H⁺ ион 678,1 8H⁺ ион НО

Таблица 1-2 TPV07 5209,9 4H⁺ ион 1303,5 4H⁺ ион 1304,3 5H⁺ ион 1043,0 5H⁺ ион 1043,3 6H⁺ ион 869,3 6H⁺ ион 869,8 7H⁺ ион 745,3 7H⁺ ион 745,7 8H⁺ ион 652,2 8H⁺ ион 652,5 TPV08 4H⁺ ион 1303,5 4H⁺ ион 1303,8 5H⁺ ион 1043,0 5H⁺ ион 1043,5 6H⁺ ион 869,3 6H⁺ ион 870,2 7H⁺ ион 745,3 7H⁺ ион 745,2 8H⁺ ион 652,2 8H⁺ ион 649,5 TPV09 4H⁺ ион 1303,5 4H⁺ ион 1304,1 5H⁺ ион 1043,0 5H⁺ ион 1043,5 6H⁺ ион 869,3 6H⁺ ион 869,8 7H⁺ ион 745,3 7H⁺ ион 745,5 8H⁺ ион 652,2 8H⁺ ион 652,7 TPV10 4H⁺ ион 1303,5 4H⁺ ион 1304,0 5H⁺ ион 1043,0 5H⁺ ион 1043,4 6H⁺ ион 869,3 6H⁺ ион 869,6 7H⁺ ион 745,3 7H⁺ ион 745,7 8H⁺ ион 652,2 8H⁺ ион 670,7 TPV11 4H⁺ ион 1303,5 4H⁺ ион 1304,1 5H⁺ ион 1043,0 5H⁺ ион 1043,4 6H⁺ ион 869,3 6H⁺ ион 869,7 7H⁺ ион 745,3 7H⁺ ион 745,6 8H⁺ ион 652,2 8H⁺ ион 652,6

Таблица 1-3 TPV12 5387,1 4H⁺ ион 1347,8 4H⁺ ион 1347,6 5H⁺ ион 1087,4 5H⁺ ион 1078,1 6H⁺ ион 898,9 6H⁺ ион 898,7 7H⁺ ион 770,6 7H⁺ ион 770,2 8H⁺ ион 674,4 8H⁺ ион НО TPV13 4H⁺ ион 1347,8 4H⁺ ион 1348,5 5H⁺ ион 1087,4 5H⁺ ион 1079,1 6H⁺ ион 898,9 6H⁺ ион 899,3 7H⁺ ион 770,6 7H⁺ ион 771,6 8H⁺ ион 674,4 8H⁺ ион 674,1 TPV14 4H⁺ ион 1347,8 4H⁺ ион 1348,5 5H⁺ ион 1087,4 5H⁺ ион 1079,1 6H⁺ ион 898,9 6H⁺ ион 899,5 7H⁺ ион 770,6 7H⁺ ион 770,9 8H⁺ ион 674,4 8H⁺ ион 674,7 TPV15 4H⁺ ион 1347,8 4H⁺ ион 1349,1 5H⁺ ион 1087,4 5H⁺ ион 1079,0 6H⁺ ион 898,9 6H⁺ ион 899,3 7H⁺ ион 770,6 7H⁺ ион 771,2 8H⁺ ион 674,4 8H⁺ ион 677,0 TPV16 4H⁺ ион 1347,8 4H⁺ ион 1348,6 5H⁺ ион 1087,4 5H⁺ ион 1079,8 6H⁺ ион 898,9 6H⁺ ион 899,7 7H⁺ ион 770,6 7H⁺ ион НО 8H⁺ ион 674,4 8H⁺ ион НО

Таблица 1-4 TPV17 5831,6 4H⁺ ион 1458,9 4H⁺ ион НО 5H⁺ ион 1167,3 5H⁺ ион 1168,1 6H⁺ ион 972,9 6H⁺ ион 973,9 7H⁺ ион 834,1 7H⁺ ион 834,3 8H⁺ ион 730,0 8H⁺ ион 730,3 TPV18 4H⁺ ион 1458,9 4H⁺ ион НО 5H⁺ ион 1167,3 5H⁺ ион 1168,3 6H⁺ ион 972,9 6H⁺ ион 973,3 7H⁺ ион 834,1 7H⁺ ион НО 8H⁺ ион 730,0 8H⁺ ион 722,6 TPV19 4H⁺ ион 1458,9 4H⁺ ион НО 5H⁺ ион 1167,3 5H⁺ ион 1167,8 6H⁺ ион 972,9 6H⁺ ион 973,4 7H⁺ ион 834,1 7H⁺ ион 834,4 8H⁺ ион 730,0 8H⁺ ион 730,3 TPV20 4H⁺ ион 1458,9 4H⁺ ион НО 5H⁺ ион 1167,3 5H⁺ ион 1167,9 6H⁺ ион 972,9 6H⁺ ион 973,1 7H⁺ ион 834,1 7H⁺ ион 834,2 8H⁺ ион 730,0 8H⁺ ион 730,2 TPV21 4H⁺ ион 1458,9 4H⁺ ион - 5H⁺ ион 1167,3 5H⁺ ион 1167,8 6H⁺ ион 972,9 6H⁺ ион 973,3 7H⁺ ион 834,1 7H⁺ ион 834,4 8H⁺ ион 730,0 8H⁺ ион 730,3 TPV22 4H⁺ ион 1458,9 4H⁺ ион НО 5H⁺ ион 1167,3 5H⁺ ион 1168,0 6H⁺ ион 972,9 6H⁺ ион 965,4 7H⁺ ион 834,1 7H⁺ ион НО 8H⁺ ион 730,0 8H⁺ ион 719,4

Таблица 1-5 TPV23 5654,4 4H⁺ ион 1414,6 4H⁺ ион НО 5H⁺ ион 1131,9 5H⁺ ион 1132,7 6H⁺ ион 943,4 6H⁺ ион 944,0 7H⁺ ион 808,8 7H⁺ ион 809,2 8H⁺ ион 707,8 8H⁺ ион 708,8 TPV24 4H⁺ ион 1414,6 4H⁺ ион НО 5H⁺ ион 1131,9 5H⁺ ион 1132,5 6H⁺ ион 943,4 6H⁺ ион 944,8 7H⁺ ион 808,8 7H⁺ ион 809,4 8H⁺ ион 707,8 8H⁺ ион НО TPV25 4H⁺ ион 1414,6 4H⁺ ион НО 5H⁺ ион 1131,9 5H⁺ ион 1132,5 6H⁺ ион 943,4 6H⁺ ион 944,2 7H⁺ ион 808,8 7H⁺ ион 809,2 8H⁺ ион 707,8 8H⁺ ион 708,2 TPV26 4H⁺ ион 1414,6 4H⁺ ион НО 5H⁺ ион 1131,9 5H⁺ ион 1131,6 6H⁺ ион 943,4 6H⁺ ион 943,5 7H⁺ ион 808,8 7H⁺ ион 808,6 8H⁺ ион 707,8 8H⁺ ион 707,7 TPV27 4H⁺ ион 1414,6 4H⁺ ион НО 5H⁺ ион 1131,9 5H⁺ ион 1132,5 6H⁺ ион 943,4 6H⁺ ион 944,3 7H⁺ ион 808,8 7H⁺ ион 809,4 8H⁺ ион 707,8 8H⁺ ион 708,4 TPV28 4H⁺ ион 1414,6 4H⁺ ион НО 5H⁺ ион 1131,9 5H⁺ ион 1133,1 6H⁺ ион 943,4 6H⁺ ион 939,1 7H⁺ ион 808,8 7H⁺ ион НО 8H⁺ ион 707,8 8H⁺ ион НО

Таблица 1-6 TPV29 5804,6 4H⁺ ион 1452,2 4H⁺ ион НО 5H⁺ ион 1161,9 5H⁺ ион 1163,0 6H⁺ ион 968,4 6H⁺ ион 969,1 7H⁺ ион 830,2 7H⁺ ион 837,0 8H⁺ ион 726,6 8H⁺ ион НО TPV30 4H⁺ ион 1452,2 4H⁺ ион НО 5H⁺ ион 1161,9 5H⁺ ион 1164,0 6H⁺ ион 968,4 6H⁺ ион 968,9 7H⁺ ион 830,2 7H⁺ ион 825,3 8H⁺ ион 726,6 8H⁺ ион НО TPV31 4H⁺ ион 1452,2 4H⁺ ион НО 5H⁺ ион 1161,9 5H⁺ ион 1163,6 6H⁺ ион 968,4 6H⁺ ион 969,1 7H⁺ ион 830,2 7H⁺ ион 830,7 8H⁺ ион 726,6 8H⁺ ион НО TPV32 4H⁺ ион 1452,2 4H⁺ ион НО 5H⁺ ион 1161,9 5H⁺ ион 1163,0 6H⁺ ион 968,4 6H⁺ ион 969,2 7H⁺ ион 830,2 7H⁺ ион 830,5 8H⁺ ион 726,6 8H⁺ ион 727,0 TPV33 4H⁺ ион 1452,2 4H⁺ ион НО 5H⁺ ион 1161,9 5H⁺ ион 1162,7 6H⁺ ион 968,4 6H⁺ ион 969,1 7H⁺ ион 830,2 7H⁺ ион 830,7 8H⁺ ион 726,6 8H⁺ ион 727,2 TPV34 4H⁺ ион 1452,2 4H⁺ ион НО 5H⁺ ион 1161,9 5H⁺ ион 1171,8 6H⁺ ион 968,4 6H⁺ ион 969,5 7H⁺ ион 830,2 7H⁺ ион НО 8H⁺ ион 726,6 8H⁺ ион 726,8

Таблица 1-7 TPV35 5658,3 4H⁺ ион 1415,6 4H⁺ ион НО 5H⁺ ион 1132,7 5H⁺ ион 1133,3 6H⁺ ион 944,1 6H⁺ ион НО 7H⁺ ион 809,3 7H⁺ ион 808,6 8H⁺ ион 708,3 8H⁺ ион НО TPV36 4H⁺ ион 1415,6 4H⁺ ион НО 5H⁺ ион 1132,7 5H⁺ ион 1133,1 6H⁺ ион 944,1 6H⁺ ион 944,3 7H⁺ ион 809,3 7H⁺ ион 810,0 8H⁺ ион 708,3 8H⁺ ион 708,6 TPV37 5358 4H⁺ ион 1340,5 4H⁺ ион 1340,8 5H⁺ ион 1072,6 5H⁺ ион 1072,7 6H⁺ ион 894,0 6H⁺ ион НО 7H⁺ ион 766,4 7H⁺ ион 766,4 8H⁺ ион 670,8 8H⁺ ион 671,0 TPV38 4H⁺ ион 1340,5 4H⁺ ион 1340,7 5H⁺ ион 1072,6 5H⁺ ион 1072,9 6H⁺ ион 894,0 6H⁺ ион 894,1 7H⁺ ион 766,4 7H⁺ ион 766,9 8H⁺ ион 670,8 8H⁺ ион 670,7 TPV39 5855,6 4H⁺ ион 1464,9 4H⁺ ион 1465,7 5H⁺ ион 1172,1 5H⁺ ион 1172,8 6H⁺ ион 976,9 6H⁺ ион 977,5 7H⁺ ион 837,5 7H⁺ ион 838,0 8H⁺ ион 733,0 8H⁺ ион 733,4 TPV40 6011,8 4H⁺ ион 1504,0 4H⁺ ион 1504,7 5H⁺ ион 1203,4 5H⁺ ион 1204,0 6H⁺ ион 1003,0 6H⁺ ион 1003,5 7H⁺ ион 859,8 7H⁺ ион 860,3 8H⁺ ион 752,5 8H⁺ ион 752,8 TPV41 5855,6 4H⁺ ион 1464,9 4H⁺ ион 1465,4 5H⁺ ион 1172,1 5H⁺ ион 1172,6 6H⁺ ион 976,9 6H⁺ ион 977,3 7H⁺ ион 837,5 7H⁺ ион 837,8 8H⁺ ион 733,0 8H⁺ ион 733,2

Таблица 1-8 TPV42 5885,7 4H⁺ ион 1472,4 4H⁺ ион 1473,2 5H⁺ ион 1178,1 5H⁺ ион 1178,8 6H⁺ ион 982,0 6H⁺ ион 982,5 7H⁺ ион 841,8 7H⁺ ион 842,3 8H⁺ ион 736,7 8H⁺ ион 737,1 TPV43 6041,9 4H⁺ ион 1511,5 4H⁺ ион НО 5H⁺ ион 1209,4 5H⁺ ион 1210,0 6H⁺ ион 1008,0 6H⁺ ион 1008,6 7H⁺ ион 864,1 7H⁺ ион 864,6 8H⁺ ион 756,2 8H⁺ ион 756,6 TPV44 6123 4H⁺ ион 1531,8 4H⁺ ион 1532,5 5H⁺ ион 1225,6 5H⁺ ион 1226,3 6H⁺ ион 1021,5 6H⁺ ион 1022,1 7H⁺ ион 875,7 7H⁺ ион 876,2 8H⁺ ион 766,4 8H⁺ ион 768,8 TPV45 6279,2 4H⁺ ион 1570,8 4H⁺ ион 1571,5 5H⁺ ион 1256,8 5H⁺ ион 1257,5 6H⁺ ион 1047,5 6H⁺ ион 1048,1 7H⁺ ион 898,0 7H⁺ ион 898,5 8H⁺ ион 785,9 8H⁺ ион 786,3 «НО» означает «не определено».

В таблице 2 приведены аминокислотные последовательности синтезированных CTL-пептидоных эпитопов, а в таблицах 3 и 4 приведены аминокислотные последовательности пептидов, имеющих 4 связанных эпитопа. Пептиды, содержащие 4 связанных эпитопа, представленные в таблице 4, были получены каждый из TPV12, TPV06 и TPV26, приведенных в таблице 3, путем добавления пептидной последовательности, состоящей из остатков аргинина на N-конец и с использованием аргининового тримера в качестве линкера между пептидами.

WT1 (SEQ ID NO:20) был синтезирован в качестве контрольного пептида, который связывается с HLA-A2, и HER2 (SEQ ID NO:21) был синтезирован в качестве контрольного пептида, который связывается с HLA-A24.

Таблица 2
CTL-эпитопные пептиды Пептид Исходная молекула Аминокислотная последовательность SEQ ID NO: PEP1 Lck-246 KLVERLGAA SEQ ID NO:1 PEP2 WHSC2-103 ASLDSDPWV SEQ ID NO:2 PEP4 SART3-302 LLQAEAPRL SEQ ID NO:4 PEP5 SART2-93 DYSARWNEI SEQ ID NO:5 PEP6 SART3-109 VYDYNCHVDL SEQ ID NO:6 PEP7 MRP3-503 LYAWEPSFL SEQ ID NO:7 PEP8 Lck-488 DYLRSVLEDF SEQ ID NO:8 PEP9 SART3-734 QIRPIFSNR SEQ ID NO:9 PEP10 Lck-90 ILEQSGEWWK SEQ ID NO:10 PEP13 UBE2V-43 RLQEWCSVI SEQ ID NO:13 PEP15 EGFR-800 DYVREHKDNI SEQ ID NO:15 PEP17 MRP3-1293 NYSVRYRPGL SEQ ID NO:17 PEP18 PTH-102 RYLTQETNKV SEQ ID NO:18 WT1 WT1-126 RMFPNAPYL SEQ ID NO:20 Her2 Her2-63 TYLPTNASL SEQ ID NO:21

Таблица 3
Пептиды, имеющие 4 связанных эпитопа Пептид Аминокислотная последовательность SEQ ID NO: TPV01 PEP5-RR-PEP6-RR-PEP9-RR-PEP4 SEQ ID NO:22 TPV02 PEP9-RR-PEP5-RR-PEP6-RR-PEP4 SEQ ID NO:23 TPV03 PEP6-RR-PEP5-RR-PEP9-RR-PEP4 SEQ ID NO:24 TPV04 PEP6-RR-PEP9-RR-PEP5-RR-PEP4 SEQ ID NO:25 TPV05 PEP9-RR-PEP6-RR-PEP5-RR-PEP4 SEQ ID NO:26 TPV06 PEP5-RR-PEP9-RR-PEP6-RR-PEP4 SEQ ID NO:27 TPV07 PEP1-RR-PEP7-RR-PEP8-RR-PEP2 SEQ ID NO:28 TPV08 PEP1-RR-PEP8-RR-PEP7-RR-PEP2 SEQ ID NO:29 TPV09 PEP7-RR-PEP1-RR-PEP8-RR-PEP2 SEQ ID NO:30 TPV10 PEP8-RR-PEP7-RR-PEP1-RR-PEP2 SEQ ID NO:31 TPV11 PEP8-RR-PEP1-RR-PEP7-RR-PEP2 SEQ ID NO:32 TPV12 PEP7-RR-PEP13-RR-PEP8-RR-PEP2 SEQ ID NO:33 TPV13 PEP8-RR-PEP13-RR-PEP7-RR-PEP2 SEQ ID NO:34 TPV14 PEP13-RR-PEP7-RR-PEP8-RR-PEP2 SEQ ID NO:35 TPV15 PEP8-RR-PEP7-RR-PEP13-RR-PEP2 SEQ ID NO:36 TPV16 PEP13-RR-PEP8-RR-PEP7-RR-PEP2 SEQ ID NO:37 TPV17 PEP13-RR-PEP15-RR-PEP18-RR-PEP10 SEQ ID NO:38 TPV18 PEP13-RR-PEP18-RR-PEP15-RR-PEP10 SEQ ID NO:39 TPV19 PEP15-RR-PEP13-RR-PEP18-RR-PEP10 SEQ ID NO:40 TPV20 PEP15-RR-PEP18-RR-PEP13-RR-PEP10 SEQ ID NO:41 TPV21 PEP18-RR-PEP13-RR-PEP15-RR-PEP10 SEQ ID NO:42 TPV22 PEP18-RR-PEP15-RR-PEP13-RR-PEP10 SEQ ID NO:43 TPV23 PEP1-RR-PEP15-RR-PEP18-RR-PEP10 SEQ ID NO:44 TPV24 PEP1-RR-PEP18-RR-PEP15-RR-PEP10 SEQ ID NO:45 TPV25 PEP15-RR-PEP1-RR-PEP18-RR-PEP10 SEQ ID NO:46 TPV26 PEP15-RR-PEP18-RR-PEP1-RR-PEP10 SEQ ID NO:47 TPV27 PEP18-RR-PEP1-RR-PEP15-RR-PEP10 SEQ ID NO:48 TPV28 PEP18-RR-PEP15-RR-PEP1-RR-PEP10 SEQ ID NO:49 TPV29 PEP15-RR-PEP17-RR-PEP13-RR-PEP10 SEQ ID NO:50 TPV30 PEP15-RR-PEP13-RR-PEP17-RR-PEP10 SEQ ID NO:51 TPV31 PEP17-RR-PEP15-RR-PEP13-RR-PEP10 SEQ ID NO:52 TPV32 PEP17-RR-PEP13-RR-PEP15-RR-PEP10 SEQ ID NO:53 TPV33 PEP13-RR-PEP17-RR-PEP15-RR-PEP10 SEQ ID NO:54 TPV34 PEP13-RR-PEP15-RR-PEP17-RR-PEP10 SEQ ID NO:55 TPV35 PEP6-RR-PEP18-RR-PEP5-RR-PEP9 SEQ ID NO:56 TPV36 PEP6-RR-PEP5-RR-PEP18-RR-PEP9 SEQ ID NO:57 TPV37 PEP1-RR-PEP7-RR-PEP6-RR-PEP5 SEQ ID NO:58 TPV38 PEP7-RR-PEP1-RR-PEP6-RR-PEP5 SEQ ID NO:59 «-RR-»- представляет аргининовый димер. Таблица 4 Пептид Аминокислотная последовательность SEQ ID NO: TPV39 RRR-PEP7-RR-PEP13-RR-PEP8-RR-PEP2 SEQ ID NO:60 TPV40 RRRR-PEP7-RR-PEP13-RR-PEP8-RR-PEP2 SEQ ID NO:61 TPV41 PEP7-RRR-PEP13-RRR-PEP8-RRR-PEP2 SEQ ID NO:62 TPV42 RRR-PEP5-RR-PEP9-RR-PEP6-RR-PEP4 SEQ ID NO:63 TPV43 RRRR-PEP5-RR-PEP9-RR-PEP6-RR-PEP4 SEQ ID NO:64 TPV44 RRR-PEP15-RR-PEP18-RR-PEP1-RR-PEP10 SEQ ID NO:65 TPV45 RRRR-PEP15-RR-PEP18-RR-PEP1-RR-PEP10 SEQ ID NO:66 «-RR-»- представляет аргининовый димер.
«-RRR-»- представляет аргининовый тример.

«RRR-» и «RRRR-» представляют собой пептидные последовательности, добавленные с N-конца, которые содержат 3 остатка аргинина и 4 остатка аргинина, соответственно.

Пример 2: индукция CTL, специфичных к эпитопным пептидам, в мышиной модели и детекция CTL с помощью ELISPOT

Пептиды, имеющие 4 связанных эпитопа, растворяли в дистиллированной воде (Otsuka Pharmaceutical Factory Inc.) до концентрации 2 мг/мл или 4 мг/мл, и полученный в результате раствор заливали в шприц B Braun Injekt. После заливки равного количества неполного адъюванта Фрейнда (IFA) в другой шприц, эти шприцы соединяли друг с другом с помощью соединителя для шприцев GP, и раствор пептидов, имеющих 4 связанных эпитопа, тщательно смешивали с IFA для приготовления эмульсии. Эмульсию в количестве 100 мкл еженедельно вводили мышам в непосредственной близости от основания хвоста (HLA-А2.1-трансгенным и HLA-A24-трансгенным мышам (Taconic)), и всего эмульсию вводили дважды. Паховые лимфатические узлы получали от мышей через 1 неделю после последнего введения. Суспензию клеток из лимфатического узла разводили до 5×10⁶ клеток/мл в полной питательной среде (RPMI-1640, 10% инактивированной нагреванием FBS, 100 Ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и 50 мкМ 2-меркаптоэтанол), добавляли целевой CTL-эпитопный пептид (конечная концентрация: 10 мкг/мл), рекомбинантный мышиный IL-15 (конечная концентрация: 100 нг/мл) и рекомбинантный мышиный IL-21 (конечная концентрация 100 нг/мл), эти клетки высевали на 24-луночный планшет в количестве 1 мл/лунку и культивировали в инкубаторе при 37°C, 5% СО₂ в течение 8 дней. После этого клетки собирали и высевали на планшет с иммобилизованными анти-IFN-γ антителами, включенный в набор Murine IFN-γ ELISpot (GEN-Probe) в количестве 1×10⁵ клеток/лунку. После чего спленоциты, полученные из селезенки сингенных мышей после облучения 30 Гр, высевали на той же планшет в количестве 1×10⁵ клеток/лунку в качестве антигенпредставляющих клеток, добавляли целевой CTL-эпитопный пептид или пептид отрицательного контроля (конечная концентрация: 10 мкг/мл) и инкубировали в термостате при 37°C, 5% СО₂ в течение ночи. На следующий день, пятна, указывающие на наличие IFN-γ-продуцирующих клеток, окрашивали в соответствии с инструкциями изготовителя. Количество пятен с IFN-γ-продуцирующими клетками количественно оценивали с использованием анализатора ELISPOT (Immunospot S6, Cellular Technology Ltd.). Индукцию CTL, специфичных к CTL-эпитопному пептиду, оценивали как положительную, когда количество пятен с IFN-γ-продуцирующими клетками в лунках, в которые были добавлены целевые CTL-эпитопные пептиды было значительно выше, чем наблюдаемое в лунках, в которые были добавлены пептиды отрицательного контроля (t-тест Стьюдента, р<0,05). В качестве пептида отрицательного контроля использовали WT1 или HER2. Для того, чтобы визуализировать уровень индукции CTL, результаты нижеследующего уравнения были обозначены как «Δ» (среднее число пятен с IFN-γ-продуцирующими клетками в лунках с добавленным целевым CTL-эпитопными пептидами)-(среднее число пятен с IFN-γ-продуцирующими клетками в лунках с добавленными пептидами отрицательного контроля). Результаты представлены как положительные в случае 10≤Δ<100; средне положительные в случае 100≤Δ<200; и сильно положительные в случае 200≤Δ.

На фиг. с 3-1 по 3-4 показаны результаты оценки индукции CTL, специфичных к CTL-эпитопным пептидам. Когда пептид, имеющий 4 связанных эпитопа по настоящему изобретению, имеет один или несколько признаков, выбранных из признаков с <1> по <3> ниже (как показано на фиг. с 3-1 по 3-4), индуцируются по меньшей мере 3 типа CTL из 4 типов связанных CTL-эпитопных пептидов.

<1> пептид содержит PEP4 на С-конце.

<2> пептид содержит PEP6 и PEP5 на С-конце, последовательно расположенные в таком порядке с N-конца и соединенные линкером.

<3> Пептид содержит PEP5, PEP6, PEP9 и PEP18.

Когда пептидную последовательность, состоящую из остатков аргинина, дополнительно добавляли на N-конец, или когда пептид-пептидный линкер являлся аргининовым тримером, как это показано на фиг. 3-4, CTL индуцировались на достаточном уровне, как описано выше.

В случае пептидов, имеющих 4 связанных эпитопа, порядок связывания которых показан в CPV01-CPV16, индукция CTL однако не наблюдалась для трех или большего числа пептидов, как показано на фиг. с 3-1 по 3-3.

В частности, даже если пептиды, имеющие 4 связанных эпитопа CTL, состояли из 4 типов эпитопных пептидов, выбранных из конкретных 13 типов эпитопных пептидов (PEP1, PEP2, PEP4, PEP5, PEP6, PEP7, PEP8, PEP9, PEP10, PEP13, PEP15, PEP17 и PEP18) (а именно, представляли собой CPV14, CPV15 и CPV16), индукция CTL не наблюдалась для трех или большего числа пептидов в пептидах, имеющих 4 связанных CTL-эпитопа.

Пример 3: прогнозирование мест расщепления в пептидах иммунопротеасомами 20S человека (i20S)

Расщепленные образцы пептидов, имеющих 4 связанных эпитопа, были получены способом, описанным ниже. Более конкретно, пептиды, имеющие 4 связанных эпитопа, разводили до 66,7 мкг/мл реакционным буфером (20 мМ HEPES-KOH, рН 7,8, 2 мМ MgAc₂, 2 мМ дитиотреитол), и полученную смесь разделяли по реакционным пробиркам в количестве 300 мкл на пробирку. Иммунопротеасомы 20S человека (R&D Systems) добавляли в пробирки в количестве 2 мкг на пробирку, смеси перемешивали, и их затем инкубировали при встряхивании и 37°C в течение 1, 2 или 4 часов. После этого добавляли уксусную кислоту в количестве 30 мкл на пробирку для прекращения ферментативной реакции, и образцы сразу лиофилизировали в морозильной камере при -80°C.

Затем полученные образцы расщепления пептидов, имеющих 4 связанных эпитопа, наносили на LC/MS-MS-системы (системы Acquity UPLC, Waters; Synapt G2 HDMS, Waters) для выполнения исчерпывающего анализа молекулярных масс пептидных фрагментов. Образцы были проанализированы с использованием аналитического программного обеспечения (MassLynx, Ver. 4.1, SCN712, Waters), и были идентифицированы пептидные фрагменты. Пептиды, имеющие 4 связанных эпитопа, оценивали как расщепляемые при получении любого пептида, в котором расщеплялся эпитопный пептид, пептида, содержаего остатки аргинина, добавленные на N-конце эпитопного пептида, или пептида, содержащего аргининовый димер, добавленный на N-конце эпитопного пептида, в результате расщепления иммунопротеасомами.

Результаты анализа, проведенного с использованием иммунопротеасом, приведенные на фиг. с 3-1 по 3-4, показывают, что два типа CTL-эпитопных пептидов, PEP2 и PEP10, должны быть расположены максимально близко к С-концу пептида, имеющего 4 связанных эпитопа, для того чтобы являться С-концевыми аминокислотами CTL-эпитопных пептидов, представляющих интерес. Соответственно, предпочтительно, чтобы PEP2 или PEP10 были связаны с С-концом пептида, имеющего 4 связанных эпитопа по настоящему изобретению.

Пример 4: получение шариков с иммобилизованными CTL-эпитопными пептидами

Пептиды иммобилизовали на микросферах xMAP Multi-Analyte COOH (Luminex Corporation, далее именуемых «шариками») способом, описанным ниже. Шарики промывали MES-буфером (0,1 М MES-NaOH, рН 7,0), и супернатант удаляли центрифугированием. Этот процесс промывки повторяли дважды, и шарики затем ресуспендировали в 75 мкл MES-буфера. Раствор CTL-эпитопного пептида (100 мкл, 1 мг/мл) и 5 мкл 10 мг/мл EDC (1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида) добавляли к суспензии шариков с последующим тщательным перемешиванием. После этого реакцию проводили при 30°C в темноте в течение ночи. На следующий день после удаления надосадочной жидкости путем центрифугирования добавляли 125 мкл 1 М Трис-HCl, и инкубацию проводили при 30°C в темноте в течение 30 минут. После повторного удаления надосадочной жидкости шарики дважды промывали промывочным буфером (PBS(-), 0,05% Tween 20) и ресуспендировали в Immunoblock (DS Pharma Biomedical Co., Ltd.). Таким образом, была выполнена иммобилизация CTL-эпитопного пептида.

Пример 5: измерение титра антител IgG, специфичных к CTL-эпитопу

Пептиды, имеющие 4 связанных эпитопа по настоящему изобретению, растворяли в дистиллированной воде (Otsuka Pharmaceutical Factory Inc.) до 2 мг/мл, и полученным в результате раствором наполняли шприц B Braun Injekt. После наполнения равным количеством IFA другого шприца, их соединяли друг с другом с помощью соединителя для шприцев GP, и раствор пептидов, имеющих 4 связанных эпитопа, тщательно смешивали с IFA для приготовления эмульсии. Эмульсию в количестве 100 мкл еженедельно вводили в непосредственной близости от основания хвоста мышам CBF1 (C57BL/6×Balb/c F1), и всего эмульсию вводили трижды. Для получения образцов сыворотки кровь собирали у мышей через 1 неделю после последнего введения пептида. В качестве контрольных образцов, приготавливали эмульсии с использованием смеси из 4-х типов пептидов, выбранных из PEP1, PEP2, PEP4, PEP5, PEP6, PEP7, PEP8, PEP9, PEP10, PEP13, PEP15 и PEP18 (1 мг/мл каждого), и полученные эмульсии вводили в соответствии с тем же графиком, что и для пептида, имеющего 4 связанных эпитопа (группа, которой вводили смесь).

Шарики с иммобилизованными CTL-эпитопными пептидами, разбавленные Immunoblock, разделяли по лункам 96-луночного фильтрационного планшета. Разделенные шарики промывали промывочным буфером, и далее в каждую лунку добавляли по 100 мкл образцов мышиной сыворотки, разведенной в 200 раз Immunoblock. Планшет инкубировали в течение 90 мин при 30°C и перемешивании 600 об./мин. После трех промывок планшета промывочным буфером в каждую лунку добавляли по 100 мкл биотинилированного антитела против мышиных IgG (H+L) (Vector Laboratories), разведенного в 500 раз Immunoblock, и планшет инкубировали в течение 60 минут при 30°C и перемешивании 600 об./мин. После трех промывок планшета промывочным буфером в каждую лунку добавляли по 100 мкл стрептавидин-R-фикоэритринового конъюгата (Invitrogen), разведенного в 500 раз Immunoblock, и планшет инкубировали в течение 30 минут при 30°C и перемешивании 600 об./мин. После трех промывок планшета промывочным буфером в каждую лунку добавляли по 100 мкл промывочного буфера для ресуспендирования шариков, и среднюю интенсивность флуоресценции фикоэритрина, который специфично связывался с соответствующими шариками, измеряли с помощью Bio-Plex Suspension Array System (Bio-Rad).

Результаты измерения титра IgG-антител, специфичных к CTL-эпитопам, приведены на фиг. с 4-1 по 4-3. На фиг. с 4-1 по 4-3 показан уровень продукции IgG-антител, специфичных к CTL-эпитопам, по сравнению с отрицательной контрольной группой (далее сокращенно указываемой как «IFA-группа») мышей. Результаты, полученные для IFA-группы, которой вводили эмульсию, приготовленную путем смешивания эквивалентных количеств IFA и дистиллированной воды (Otsuka Pharmaceutical Factory Inc.), сравнивали с результатами, полученными в соответствии с такой же схемой лечения, что и для смеси CTL-эпитопных пептидов или пептида, имеющего 4 связанных эпитопа.

Как показано на фиг. с 4-1 по 4-3, индукция синтеза IgG-антител, специфичных к CTL-эпитопам, была слабой, и частота этой индукции была низкой в группе, которой вводили смесь. В отличие от этого, при введении пептида, имеющего 4 связанных эпитопа, часто наблюдалось сильная индукция синтеза IgG-антител, специфичных к CTL-эпитопам. Кроме того, было найдено, что степень продукции IgG была значительно выше (например, в диапазоне от нескольких десятков раз до нескольких сот раз больше, чем наблюдаемая в IFA-группе) в зависимости от типа вводимого пептида, имеющего 4 связанных эпитопа.

Эти результаты показывают, что введение пептида, имеющего 4 связанных эпитопа, может сильнее активировать противоопухолевый иммунитет, чем введение смеси CTL-эпитопных пептидов, составляющих пептид, содержащий 4 связанных эпитопа.

Для ракового пациента, который получал лечение пептидной противораковой вакциной, как индукция синтеза IgG, специфичных к CTL-эпитопному пептиду, так и индукция CTL, специфичных к эпитопному пептиду, являются эффективными для продления жизни. Соответственно, эффекты продления жизни, достигаемые с помощью настоящего изобретения, превосходят достигаемые путем лечения рака с использованием пептидных вакцин, содержащих известные CTL-эпитопные пептиды или их смеси. Поэтому, пептид, имеющий 4 связанных эпитопа по настоящему изобретению, может соответственно использоваться в качестве терапевтического и/или профилактического агента для лечения рака или заболеваний, вызываемых раком, и в качестве пептидных противораковых вакцин, которые могут обеспечить превосходные результаты лечения по сравнению с лечением рака с использованием пептидных вакцин, содержащих известные CTL-эпитопные пептиды или их смеси.

Все публикации, патенты и патентные заявки, процитированные в данном описании, включены в него путем ссылки во всей полноте.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к иммунологии, и может быть использовано в медицине для индуцирования противоопухолевого иммунитета против экспрессирующего Lck, WHSC2, SART2, SART3, UBE2V, EGFR, PTHrP или MRP3 рака. Получают пептид из 4 эпитопов CTL раковых антигенов, соединенных через аминокислотные линкеры. Полученный пептид используют для стимуляции лимфоцитов периферической крови с целью получения комбинации CTL, специфичных к раковому антигену. Изобретение позволяет получить пептидную вакцину для лечения рака у широкого ряда раковых пациентов без необходимости HLA-типирования и независимо от типов HLA у пациентов. 6 н. и 5 з.п. ф-лы, 17 ил., 4 табл., 5 пр.

1. Раковый антигенный пептид, имеющий 4 связанных эпитопных пептида, где 4 эпитопных пептида представляют собой 4 недублированных пептида, выбранных из группы, состоящей из CTL-эпитопных пептидов: пептида, приведенного в SEQ ID NO:1 (PEP1); пептида, приведенного в SEQ ID NO:2 (PEP2); пептида, приведенного в SEQ ID NO:4 (PEP4); пептида, приведенного в SEQ ID NO:5 (PEP5); пептида, приведенного в SEQ ID NO:6 (PEP6); пептида, приведенного в SEQ ID NO:7 (PEP7); пептида, приведенного в SEQ ID NO:8 (PEP8); пептида, приведенного в SEQ ID NO:9 (PEP9); пептида, приведенного в SEQ ID NO:10 (PEP10); пептида, приведенного в SEQ ID NO:13 (PEP13); пептида, приведенного в SEQ ID NO:15 (PEP15); пептида, приведенного в SEQ ID NO:17 (PEP17); и пептида, приведенного в SEQ ID NO:18 (PEP18), и связанных через аминокислотный линкер, где пептид, имеющий 4 связанных эпитопа, необязательно, содержит другие пептидные последовательности, состоящие из гидрофильных аминокислот, и где пептид, имеющий 4 связанных эпитопа, содержит PEP4 на С-конце.

2. Раковый антигенный пептид, имеющий 4 связанных эпитопных пептида, где 4 эпитопных пептида выбраны независимо из группы, состоящей из CTL-эпитопных пептидов: пептид, как показано в SEQ ID NO: 1 (PEP1); пептид, как показано в SEQ ID NO: 2 (PEP2); пептид, как показано в SEQ ID NO: 4 (PEP4); пептид, как показано в SEQ ID NO: 5 (PEP5); пептид, как показано в SEQ ID NO: 6 (PEP6); пептид, как показано в SEQ ID NO: 7 (PEP7); пептид, как показано в SEQ ID NO: 8 (PEP8); пептид, как показано в SEQ ID NO: 9 (PEP9); пептид, как показано в SEQ ID NO: 10 (PEP10); пептид, как показано в SEQ ID NO: 13 (PEP13); пептид, как показано в SEQ ID NO: 15 (PEP15); пептид, как показано в SEQ ID NO: 17 (PEP17); и пептид, как показано в SEQ ID NO: 18 (PEP18), и связаны через аминокислотных линкер, где пептид, имеющий 4 линкерных эпитопа, необязательно содержит другие пептидные последовательности, состоящие из гидрофильных аминокислот, и где пептид, имеющий 4 связанных эпитопа, содержит последовательность, выбранную из следующих последовательностей, в которых «-(L)-» представляет собой линкер:

- PEP5-(L)-PEP6-(L)-PEP9-(L)-PEP4; - PEP9-(L)-PEP5-(L)-PEP6-(L)-PEP4; - PEP6-(L)-PEP5-(L)-PEP9-(L)-PEP4; - PEP6-(L)-PEP9-(L)-PEP5-(L)-PEP4; - PEP9-(L)-PEP6-(L)-PEP5-(L)-PEP4; - PEP5-(L)-PEP9-(L)-PEP6-(L)-PEP4; - PEP1-(L)-PEP7-(L)-PEP8-(L)-PEP2; - PEP1-(L)-PEP8-(L)-PEP7-(L)-PEP2; - PEP7-(L)-PEP1-(L)-PEP8-(L)-PEP2; - PEP8-(L)-PEP7-(L)-PEP1-(L)-PEP2; - PEP8-(L)-PEP1-(L)-PEP7-(L)-PEP2; - PEP7-(L)-PEP13-(L)-PEP8-(L)-PEP2; - PEP8-(L)-PEP13-(L)-PEP7-(L)-PEP2; - PEP13-(L)-PEP7-(L)-PEP8-(L)-PEP2; - PEP8-(L)-PEP7-(L)-PEP13-(L)-PEP2; - PEP13-(L)-PEP8-(L)-PEP7-(L)-PEP2; - PEP13-(L)-PEP15-(L)-PEP18-(L)-PEP10; - PEP13-(L)-PEP18-(L)-PEP15-(L)-PEP10; - PEP15-(L)-PEP13-(L)-PEP18-(L)-PEP10; - PEP15-(L)-PEP18-(L)-PEP13-(L)-PEP10; - PEP18-(L)-PEP13-(L)-PEP15-(L)-PEP10; - PEP18-(L)-PEP15-(L)-PEP13-(L)-PEP10; - PEP1-(L)-PEP15-(L)-PEP18-(L)-PEP10; - PEP1-(L)-PEP18-(L)-PEP15-(L)-PEP10; - PEP15-(L)-PEP1-(L)-PEP18-(L)-PEP10; - PEP15-(L)-PEP18-(L)-PEP1-(L)-PEP10; - PEP18-(L)-PEP1-(L)-PEP15-(L)-PEP10; - PEP18-(L)-PEP15-(L)-PEP1-(L)-PEP10; - PEP15-(L)-PEP17-(L)-PEP13-(L)-PEP10; - PEP15-(L)-PEP13-(L)-PEP17-(L)-PEP10; - PEP17-(L)-PEP15-(L)-PEP13-(L)-PEP10; - PEP17-(L)-PEP13-(L)-PEP15-(L)-PEP10; - PEP13-(L)-PEP17-(L)-PEP15-(L)-PEP10; - PEP13-(L)-PEP15-(L)-PEP17-(L)-PEP10; - PEP6-(L)-PEP18-(L)-PEP5-(L)-PEP9; - PEP6-(L)-PEP5-(L)-PEP18-(L)-PEP9; - PEP1-(L)-PEP7-(L)-PEP6-(L)-PEP5; и - PEP7-(L)-PEP1-(L)-PEP6-(L)-PEP5.

3. Раковый антигенный пептид, имеющий 4 связанных эпитопных пептида, по п. 1, где раковый антигенный пептид содержит 3 CTL-эпитопных пептида, PEP5, PEP6 и PEP9, а где РЕР4 расположен на С-конце пептида.

4. Раковый антигенный пептид, имеющий 4 связанных эпитопных пептида, по п.1 или 2, в котором аминокислотный линкер представляет собой аргининовый димер или аргининовый тример, состоящий из двух или трех остатков аргинина, связанных друг с другом.

5. Раковый антигенный пептид, имеющий 4 связанных эпитопных пептида, по п.1 или 2, где другая пептидная последовательность, состоящая из гидрофильных аминокислот, связана с N-концом.

6. Раковый антигенный пептид, имеющий 4 связанных эпитопных пептида, по п.2, в котором другая пептидная последовательность, состоящая из гидрофильных аминокислот, состоит из аргининового тримера или аргининового тетрамера, состоящего из трех или четырех остатков аргинина, связанных друг с другом.

7. Раковый антигенный пептид, имеющий 4 связанных эпитопных пептида, по п.2, который состоит из аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:65 или SEQ ID NO:66.

8. Комбинация раковых антиген-специфичных CTL, полученных путем стимуляции лимфоцитов периферической крови с использованием ракового антигенного пептида, содержащего 4 связанных эпитопных пептида, по п.1 или 2.

9. Фармацевтическая композиция для иммунотерапии рака, содержащая в качестве действующего ингредиента раковый антигенный пептид, имеющий 4 связанных эпитопных пептида, по п. 1 или 2 или комбинацию по п. 8, где рак экспрессирует Lck, WHSC2, SART2, SART3, MRP3, UBE2V, EGFR или PTHrP.

10. Фармацевтическая композиция для иммунотерапии рака, содержащая два или более пептидов, выбранных из раковых антигенных пептидов, имеющих 4 связанных эпитопных пептидов, по п.1 или 2, где рак экспрессирует Lck, WHSC2, SART2, SART3, MRP3, UBE2V, EGFR или PTHrP.

11. Способ лечения ракового пациента, у которого рак экспрессирует Lck, WHSC2, SART2, SART3, MRP3, UBE2V, EGFR или PTHrP, включающий введение ракового антигенного пептида, содержащего 4 связанных эпитопных пептида, по п.1 или 2, комбинации по п.8 или фармацевтической композиции по п.9 раковому пациенту.