Область техники
[0001]
Настоящее изобретение относится к агенту для адъювантной терапии опухолей, включающей применение пептида, имеющего 4 связанных эпитопа CTL, содержащих 4 пептида, способных индуцировать HLA-A-рестриктированные CTL-ответы.
Уровень техники
[0002]
Раковые заболевания являются основной причиной смертности в Японии. Ежегодно от рака умирает около 350000 пациентов, и в настоящее время рак по-прежнему остается тяжелым заболеванием. Принятые подходы к лечению рака включают хирургическую резекцию, противораковую лекарственную терапию, лучевую терапию и иммунотерапию рака. При радикальном хирургическом лечении, при котором удаляются все раковые клетки, благоприятного исхода можно ожидать в случае ранней стадии ракового заболевания с низкой степенью прогрессирования. В противоположность этому, эффекты радикального хирургического лечения рака с высокой степенью прогрессирования ограничены, а частота местного рецидива и метастазирования достаточно высока. Хотя местные рецидивы и метастазирование могут быть вызваны различными факторами, возможными причинами являются: маленькие раковые клетки, не наблюдаемые визуально, могут остаться неудаленными хирургическим путем, или некоторые раковые клетки, возможно, уже пошли по пути гематогенного метастазирования или лимфогенного метастазирования, а микрокарциномы могли уже начать расти в других органах.
[0003]
В частности, в случае метастатического рецидива считается, что раковые клетки распространились по всему телу, и поэтому очень трудно полностью удалить раковые клетки хирургическим путем. В качестве терапевтических методов лечения метастатического рака, соответственно, используются различные методы химиотерапии, лучевой терапии, а в последние годы и иммунотерапии. Такие терапевтические методы имеют механизмы действия по уничтожению раковых клеток на молекулярном и клеточном уровне. В принципе, соответственно, можно полностью элиминировать раковые клетки, распространившиеся по всему организму. Однако во многих случаях все терапевтические методы становятся неэффективными и могут привести к смерти, что является основной проблемой при лечении раковых заболеваний. Соответственно, разработка нового терапевтического метода лечения рецидивирующего и метастатического рака имеет решающее значение для подавления развития ракового заболевания.
[0004]
С другой стороны, предотвращение метастазирования, приводящего к тяжелому исходу, может повысить вероятность успеха радикального хирургического лечения, а результат лечения для онкологического больного может быть значительно улучшен. Терапия, которая проводится для предотвращения рецидива рака или метастазирования путем уничтожения раковых клеток, визуально не наблюдаемых при хирургическом вмешательстве, или мельчайших метастатических раковых клеток, называется адъювантной терапией.
[0005]
В Японии, например, использование комбинированного препарата тегафур-гимерацил-отерацил калия показано в качестве метода адъювантной терапии при раке желудка на стадии II (исключая T1), IIIA или IIIB после хирургического вмешательства, и риск смерти для группы пациентов, получавших комбинированный препарат тегафур-гимерацил-отарацил калия, ниже на 32% относительно группы пациентов только после хирургического вмешательства (непатентный документ 1). Для лечения онкологических заболеваний, таких как рак легких, рак молочной железы, рак толстой кишки, рак матки и злокачественная меланома, также проводится адъювантная терапия. Однако, как описано выше, во многих случаях не удается предотвратить рецидив или метастазирование с помощью адъювантной терапии. Соответственно, желательна разработка нового агента для адъювантной терапии с целью улучшения результатов лечения.
[0006]
В последние годы в дополнение к послеоперационной химиотерапии в качестве адъювантной терапии проводятся клинические испытания, в которых в качестве адъювантной терапии используется противораковая иммунотерапия. Механизм действия противораковой иммунотерапии по уничтожению раковых клеток обусловлен, например, за счет индукции, трансплантации или активации иммунных клеток, которые могут непосредственно повреждать раковые клетки, таких как цитотоксические Т-лимфоциты (CTL) или естественные клетки-киллеры (NK). Таким образом, иммунотерапия рака может оказывать противоопухолевое действие на не наблюдаемые визуально микрокарциномы или раковые клетки во всем организме, как и при химиотерапии.
[0007]
Один из способов противораковой иммунотерапии, а именно, терапии с использованием противораковой пептидной вакцины, считали новым методом терапии рака в течение длительного периода времени. При лечении рака с использованием пептидных вакцин Т-клеточные рецепторы (TCR) на эпитоп-специфичном цитотоксическом Т-лимфоците (CTL) распознают главный комплекс гистосовместимости (MHC), который представляет антигенный пептид на поверхности раковой клетки, и CTL повреждает раковые клетки. За счет чего осуществляет терапевтическое действие.
[0008]
MHC человека называют лейкоцитарными антигенами человека (HLA), и известны различные типы HLA. Таким образом, была предпринята попытка разработки противораковой пептидной вакцины, нацеленной на конкретный тип HLA. Однако типы HLA, на которые нацелены противораковые вакцины, ограничены, и, к сожалению, противораковая пептидная вакцина не приносит пользы пациенту с нецелевым типом HLA. Кроме того, необходимость HLA-типирования перед началом лечения задерживает начало лечения и увеличивает нагрузку на пациента. Таким образом, необходимы исследования и разработка противораковой пептидной вакцины, применимой у всех онкологических больных без необходимости HLA-типирования.
[0009]
В качестве решения проблемы, описанной выше, был опубликован пептид, имеющий 4 связанных эпитопа CTL, включающий различные пептиды эпитопов CTL, лигированные друг с другом, которые могут индуцировать ответы CTL на один или несколько типов HLA, выбранных из супертипов HLA-A2, HLA-A24, HLA-A26 и HLA-A3 (патентный документ 1).
[0010]
Однако не было продемонстрировано, будет ли пептид, имеющий 4 связанных эпитопа CTL, действовать в качестве адъювантной терапии.
Литература предшествующего уровня техники
Патентная литература
[0011]
Патентная литература 1: WO 2015/060235.
[0012]
Непатентная литература
Непатентная литература 1: N. Engl. J. Med., 357: 1810-20, 2007.
Краткое изложение сущности изобретения
Цели, которые должны быть достигнуты изобретением
[0013]
Настоящее изобретение относится к агенту для адъювантной терапии опухолей, который оказывает заметное ингибирующее действие на метастазирование и рецидив опухоли и имеет мало побочных эффектов.
Средства для достижения целей
[0014]
Автор настоящего изобретения вводил пептид, имеющий 4 связанных эпитопа CTL, животным моделям метастазирования и рецидива опухоли и исследовал ингибирующее действие на метастазирование и рецидив опухоли. В результате автор настоящего изобретения обнаружил, что количество метастатических узлов в легких можно уменьшить в значительной степени без каких-либо серьезных побочных эффектов.
[0015]
В частности, настоящее изобретение относится к пп.[1]-[11], описанным ниже.
[1] Агент для адъювантной терапии опухолей, содержащий в качестве действующего ингредиента пептид, имеющий 4 связанных эпитопа CTL, содержащих 4 эпитопных пептида CTL, связанных через линкеры, где пептид, имеющий 4 связанных эпитопа CTL, содержит эпитопный пептид «PEP5», представленный в SEQ ID NO: 5, и 3 эпитопных пептида, выбранных из группы, состоящей из эпитопного пептида «PEP1», представленного в SEQ ID NO: 1, эпитопного пептида «PEP2», представленного в SEQ ID NO: 2, эпитопного пептида «PEP4», представленного в SEQ ID NO: 4, эпитопного пептида «PEP6», представленного в SEQ ID NO: 6, эпитопного пептида «PEP7», представленного в SEQ ID NO: 7, эпитопного пептида «PEP8», представленного в SEQ ID NO: 8, эпитопного пептида «PEP9», представленного в SEQ ID NO: 9, эпитопного пептида «PEP10», представленного в SEQ ID NO: 10, эпитопного пептида «PEP13», представленного в SEQ ID NO: 13, эпитопного пептида «РЕР15», представленного в SEQ ID NO: 15, эпитопного пептида «РЕР17», представленного в SEQ ID NO: 17, и эпитопного пептида «РЕР18», представленного в SEQ ID NO: 18, связанных через линкеры, где пептид, имеющий 4 связанных эпитопа CTL, может дополнительно содержать пептидную последовательность, состоящую из гидрофильных аминокислот, и где пептид, имеющий 4 связанных эпитопа CTL, имеет любой один признак, выбранный из признаков (1)-(3) ниже:
(1) пептид содержит PEP2 на С-конце (за исключением пептида, содержащего PEP7 и PEP8 на N-конце, последовательно расположенных в таком порядке от N-конца через линкер);
(2) пептид содержит PEP4 на С-конце; и
(3) пептид содержит PEP10 на С-конце.
[2] Агент для адъювантной терапии опухолей по п.[1], где эпитопные пептиды, включенные в пептид, имеющий 4 связанных эпитопа CTL, представляют собой РЕР5, РЕР6, РЕР9 и один эпитопный пептид, выбранный из группы, состоящей из РЕР2, РЕР4, и PEP10, и где C-конец пептида, имеющего 4 связанных эпитопа CTL, представляет собой PEP2, PEP4 или PEP10.
[3] Агент для адъювантной терапии опухолей по п.[1] или [2], где пептид, имеющий 4 связанных эпитопа CTL, состоит из последовательности, выбранной из последовательностей, указанных ниже:
PEP5-(L)-PEP9-(L)-PEP6-(L)-PEP4;
PEP5-(L)-PEP9-(L)-PEP6-(L)-PEP2; и
PEP5-(L)-PEP9-(L)-PEP6-(L)-PEP10,
где «-(L)-» представляет собой линкер.
[4] Агент для адъювантной терапии опухолей по любому из пп.[1]-[3], где пептид, имеющий 4 связанных эпитопа CTL, состоит из последовательности, указанной ниже:
PEP5-(L)-PEP9-(L)-PEP6-(L)-PEP4,
где «-(L)-» представляет собой линкер.
[5] Агент для адъювантной терапии опухолей по любому из пп.[1]-[4], где линкер представляет собой аминокислотный линкер.
[6] Агент для адъювантной терапии опухолей по п.[5], где аминокислотный линкер представляет собой аргининовый димер или аргининовый тример, состоящий из 2 или 3 остатков аргинина, связанных друг с другом.
[7] Агент для адъювантной терапии опухолей по любому из пп.[1]-[6], где пептидная последовательность, состоящая из гидрофильных аминокислот, связана с N-концом и состоит из аргининового тримера или аргининового тетрамера, состоящего из 3 или 4 остатков аргинина, связанных друг с другом.
[8] Агент для адъювантной терапии опухолей по любому из пп.[1]-[7], где пептид, имеющий 4 связанных эпитопа CTL, состоит из SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25 или SEQ ID NO: 26.
[9] Агент для адъювантной терапии опухолей по любому из пп.[1]-[8], где пептид, имеющий 4 связанных эпитопа CTL, состоит из SEQ ID NO: 24.
[10] Агент для ингибирования метастазирования опухоли, содержащий в качестве действующего ингредиента пептид, имеющий 4 связанных эпитопа CTL, содержащих 4 пептидных эпитопа CTL, связанных через линкеры, где пептид, содержащий 4 связанных эпитопа CTL, содержит эпитопный пептид «PEP5», представленный в SEQ ID NO: 5 и 3 эпитопных пептида, выбранных из группы, состоящей из эпитопного пептида «PEP1», представленного в SEQ ID NO: 1, эпитопного пептида «PEP2», представленного в SEQ ID NO: 2, эпитопного пептида «PEP4», представленного в SEQ ID NO: 4, эпитопного пептида «PEP6», представленного в SEQ ID NO: 6, эпитопного пептида «PEP7», представленного в SEQ ID NO: 7, эпитопного пептида «PEP8», представленного в SEQ ID NO: 8, эпитопного пептида «PEP9», представленного в SEQ ID NO: 9, эпитопного пептида «PEP10», представленного в SEQ ID NO: 10, эпитопного пептида «PEP13», представленного в SEQ ID NO: 13, эпитопного пептида «РЕР15», представленного в SEQ ID NO: 15, эпитопного пептида «РЕР17», представленного в SEQ ID NO: 17, и эпитопного пептида «РЕР18», представленного в SEQ ID NO: 18, связанных через линкеры, где пептид, имеющий 4 связанных эпитопа CTL, может дополнительно содержать пептидную последовательность, состоящую из гидрофильных аминокислот, и где пептид, имеющий 4 связанных эпитопа CTL, имеет любой один признак, выбранный из признаков (1)-(3) ниже:
(1) пептид содержит PEP2 на С-конце (за исключением пептида, содержащего PEP7 и PEP8 на N-конце, последовательно расположенных в таком порядке от N-конца через линкер);
(2) пептид содержит PEP4 на С-конце; и
(3) пептид содержит PEP10 на С-конце.
[11] Агент для ингибирования рецидива опухоли, содержащий в качестве действующего ингредиента пептид, имеющий 4 связанных эпитопа CTL, содержащих 4 эпитопных пептида CTL, связанных через линкеры, где пептид, имеющий 4 связанных эпитопа CTL, содержит эпитопный пептид «PEP5», представленный в SEQ ID NO: 5 и 3 эпитопных пептида, выбранных из группы, состоящей из эпитопного пептида «PEP1», представленного в SEQ ID NO: 1, эпитопного пептида «PEP2», представленного в SEQ ID NO: 2, эпитопного пептида «PEP4», представленного в SEQ ID NO: 4, эпитопного пептида «PEP6», представленного в SEQ ID NO: 6, эпитопного пептида «PEP7», представленного в SEQ ID NO: 7, эпитопного пептида «PEP8», представленного в SEQ ID NO: 8, эпитопного пептида «PEP9», представленного в SEQ ID NO: 9, эпитопного пептида «PEP10», представленного в SEQ ID NO: 10, эпитопного пептида «PEP13», представленного в SEQ ID NO: 13, эпитопного пептида «РЕР15», представленного в SEQ ID NO: 15, эпитопного пептида «РЕР17», представленного в SEQ ID NO: 17, и эпитопного пептида «РЕР18», представленного в SEQ ID NO: 18, связанных через линкеры, где пептид, имеющий 4 связанных эпитопа CTL, может дополнительно содержать пептидную последовательность, состоящую из гидрофильных аминокислот, и где пептид, имеющий 4 связанных эпитопа CTL, имеет любой один признак, выбранный из признаков (1)-(3) ниже:
(1) пептид содержит PEP2 на С-конце (за исключением пептида, содержащего PEP7 и PEP8 на N-конце, последовательно расположенных в таком порядке от N-конца через линкер);
(2) пептид содержит PEP4 на С-конце; и
(3) пептид содержит PEP10 на С-конце.
[0016]
Настоящее изобретение также относится к следующим вариантам осуществления:
- Пептид, имеющий 4 связанных эпитопа CTL по пп.[1]-[11], который используется в адъювантной терапии опухолей.
- Пептид, имеющий 4 связанных эпитопа CTL, состоящий из SEQ ID NO: 24, который используется в адъювантной терапии опухолей.
- Пептид, имеющий 4 связанных эпитопа CTL по пп.[1]-[11], который используется для ингибирования метастазирования опухоли.
- Пептид, имеющий 4 связанных эпитопа CTL, состоящий из SEQ ID NO: 24, который используется для ингибирования метастазирования опухоли.
- Пептид, имеющий 4 связанных эпитопа CTL по пп.[1]-[11], который используется для ингибирования рецидива опухоли.
- Пептид, имеющий 4 связанных эпитопа CTL, состоящий из SEQ ID NO: 24, который используется для ингибирования рецидива опухоли.
- Фармацевтическая композиция, используемая для адъювантной терапии опухолей, которая содержит пептид, имеющий 4 связанных эпитопа CTL по пп.[1]-[11].
- Фармацевтическая композиция, используемая для адъювантной терапии опухолей, которая содержит пептид, имеющий 4 связанных эпитопа CTL, состоящий из SEQ ID NO: 24.
- Фармацевтическая композиция, используемая для ингибирования метастазирования опухоли, которая содержит пептид, имеющий 4 связанных эпитопа CTL по пп.[1]-[11].
- Фармацевтическая композиция, используемая для ингибирования метастазирования опухоли, которая содержит пептид, имеющий 4 связанных эпитопа CTL, состоящий из SEQ ID NO: 24.
- Фармацевтическая композиция, используемая для ингибирования рецидива опухоли, которая содержит пептид, имеющий 4 связанных эпитопа CTL по пп.[1]-[11].
- Фармацевтическая композиция, используемая для ингибирования рецидива опухоли, которая содержит пептид, имеющий 4 связанных эпитопа CTL, состоящий из SEQ ID NO: 24.
- Способ адъювантной терапии опухолей, который включает в себя стадию введения пациенту пептида, имеющего 4 связанных эпитопа CTL по пп.[1]-[11], в количестве, эффективном для лечения рецидива и/или метастазирования опухоли.
- Способ ингибирования метастазирования опухоли, который включает стадию введения пациенту пептида, имеющего 4 связанных эпитопа CTL по пп.[1]-[11], в количестве, эффективном для лечения метастазирования опухоли.
Способ ингибирования рецидива опухоли, который включает стадию введения пациенту пептида, имеющего 4 связанных эпитопа CTL по пп.[1]-[11], в количестве, эффективном для лечения рецидива опухоли.
Это описание включает в себя часть или все содержание, раскрытое в описании и/или чертежах заявки на патент Японии №2019-236947, которая является приоритетным документом настоящей заявки.
Эффекты изобретения
[0017]
Адъювантная терапия опухолей по настоящему изобретению обеспечивает противораковую терапию, которая оказывает ингибирующее действие на метастазирование и рецидив опухоли, подавляя при этом развитие побочных эффектов. Как следствие, продолжительность жизни онкологического больного может быть увеличена.
Краткое описание чертежей
[0018]
На фиг.1 показана ВЭЖХ-хроматограмма пептида, имеющего 4 связанных эпитопа CTL, TPV07.
На фиг.2 показана ВЭЖХ-хроматограмма пептида, имеющего 4 связанных эпитопа CTL, TPV08.
На фиг.3 показан масс-спектр пептида, имеющего 4 связанных эпитопа CTL, TPV07.
На фиг.4 показан масс-спектр пептида, имеющего 4 связанных эпитопа CTL, TPV08.
На фиг.5 показано влияние TPV06 на ингибирование количества метастатических узлов в легких в мышиных моделях с внутривенной трансплантацией клеток B16F10.A24/SART293-101.
Варианты осуществления изобретения
[0019]
Настоящее изобретение относится к агенту для адъювантной терапии опухолей, содержащему в качестве действующего ингредиента пептид, имеющий 4 связанных эпитопа CTL. Настоящее изобретение также относится к агенту для ингибирования метастазирования опухоли, содержащему в качестве действующего ингредиента пептид, имеющий 4 связанных эпитопа CTL. Настоящее изобретение также относится к агенту для ингибирования рецидива опухоли, содержащему в качестве действующего ингредиента пептид, имеющий 4 связанных эпитопа CTL.
[0020]
Термин «пептид, имеющий 4 связанных эпитопа CTL», используемый в настоящем изобретении, относится к пептиду, содержащему 4 пептида, выбранных из пептидных эпитопов CTL, полученных из одинаковых и/или разных молекул опухолевых антигенов, которые линейно связанны друг с другом через линкеры, образуя одну молекулу.
[0021]
Примеры известных пептидных эпитопов CTL, полученных из молекул опухолевых антигенов, включают следующие пептиды:
KLVERLGAA (SEQ ID NO: 1; именуется в настоящем документе «PEP1», например, WO 2001/011044);
ASLDSDPWV (SEQ ID NO: 2; именуется в настоящем документе «PEP2», например, WO 2002/010369);
ALVEFEDVL (SEQ ID NO: 3; именуется в настоящем документе «PEP3», например, WO 2002/010369);
LLQAEAPRL (SEQ ID NO: 4; именуется в настоящем документе «PEP4», например, WO 2000/12701);
DYSARWNEI (SEQ ID NO: 5; именуется в настоящем документе «PEP5», например, JP H11-318455 A);
VYDYNCHVDL (SEQ ID NO: 6; именуется в настоящем документе «PEP6», например, WO 2000/12701);
LYAWEPSFL (SEQ ID NO: 7; именуется в настоящем документе «PEP7», например, JP 2003-000270 A);
DYLRSVLEDF (SEQ ID NO: 8; именуется в настоящем документе «PEP8», например, WO 2001/011044);
QIRPIFSNR (SEQ ID NO: 9; именуется в настоящем документе «PEP9», например, WO 2008/007711);
ILEQSGEWWK (SEQ ID NO: 10; именуется в настоящем документе «PEP10», например, WO 2009/022652);
VIQNLERGYR (SEQ ID NO: 11; именуется в настоящем документе «PEP11», например, WO 2009/022652);
KLKHYGPGWV (SEQ ID NO: 12; именуется в настоящем документе «PEP12», например, WO 1999/067288);
RLQEWCSVI (SEQ ID NO: 13; именуется в настоящем документе «PEP13», например, WO 2002/010369);
ILGELREKV (SEQ ID NO: 14; именуется в настоящем документе «PEP14», например, WO 2002/010369);
DYVREHKDNI (SEQ ID NO: 15; именуется в настоящем документе «PEP15», например, WO 2005/071075);
HYTNASDGL (SEQ ID NO: 16; именуется в настоящем документе «PEP16», например, WO 2001/011044);
NYSVRYRPGL (SEQ ID NO: 17; именуется в настоящем документе «PEP17», например, JP 2003-000270 A); и
RYLTQETNKV (SEQ ID NO: 18; именуется в настоящем документе «PEP18», например, WO 2005/116056).
[0022]
В таблице 1 представлена информация о белках, из которых происходят пептидные эпитопы CTL от PEP1 до PEP18. Известно, что эти белки экспрессируются на высоком уровне в опухолевой ткани.
[0023]
[0024]
Пептид, имеющий 4 связанных эпитопа CTL по настоящему изобретению, содержит 4 типа пептидных эпитопов CTL, выбранных из конкретных 13 типов пептидных эпитопов CTL: пептида «PEP1», представленного в SEQ ID NO: 1, пептида «PEP2», представленного в SEQ ID NO: 2, пептида «PEP4», представленного в SEQ ID NO: 4, пептида «PEP5», представленного в SEQ ID NO: 5, пептида «PEP6», представленного в SEQ ID NO: 6, пептида «PEP7», представленного в SEQ ID NO: 7, пептида «PEP8», представленного в SEQ ID NO: 8, пептида «PEP9», представленного в SEQ ID NO: 9, пептида «PEP10», представленного в SEQ ID NO: 10, пептида «PEP13», представленного в SEQ ID NO: 13, пептида «PEP15», представленного в SEQ ID NO: 15, пептида «PEP17», представленного в SEQ ID NO: 17, и пептида «PEP18», представленного в SEQ ID NO: 18, линейно связанных через линкеры. Пептид, имеющий 4 связанных эпитопа CTL, может индуцировать и/или активировать три или более CTL, специфичных к соответствующим пептидным эпитопам CTL. Пептиды не могут быть напрямую оценены относительно специфичной к эпитопному пептиду индукции CTL. Возникновение специфичной к эпитопному пептиду индукции CTL можно определить с помощью эксперимента по расщеплению с иммунопротеасомами (например, WO 2015/060235).
[0025]
В настоящем изобретении пептид, имеющий 4 связанных эпитопа CTL, содержит:
пептид «PEP5», представленный в SEQ ID NO: 5, и
3 пептида, выбранных из группы, состоящей из пептида «PEP1», представленного в SEQ ID NO: 1, пептида «PEP2», представленного в SEQ ID NO: 2, пептида «PEP4», представленного в SEQ ID NO: 4, пептида «PEP6», представленного в SEQ ID NO: 6, пептида «PEP7», представленного в SEQ ID NO: 7, пептида «PEP8», представленного в SEQ ID NO: 8, пептида «PEP9», представленного в SEQ ID NO: 9, пептида «PEP10», представленного в SEQ ID NO: 10, пептида «PEP13», представленного в SEQ ID NO: 13, пептида «PEP15», представленного в SEQ ID NO: 15, пептида «PEP17», представленного в SEQ ID NO: 17, и пептида «PEP18», представленного в SEQ ID NO: 18, связанных через линкеры.
[0026]
В настоящем изобретении пептид, имеющий аминокислотную последовательность, имеющую замену, вставку, делецию и/или добавление одной или множества аминокислот в аминокислотной последовательности PEP1, PEP2, PEP4, PEP5, PEP6, PEP7, PEP8, PEP9, PEP10, PEP13, PEP15, PEP17 или PEP18, и обладающий способностью индуцировать CTL и/или способностью индуцировать продукцию иммуноглобулина, которая эквивалентна или более высокая, чем у исходного пептида, можно использовать в качестве «пептидного эпитопа CTL». Термин «множество», используемый в настоящем документе, относится к 2 или 3 и предпочтительно - к 2. Примером такого пептида является пептид, полученный заменой аминокислотами, имеющими свойства, аналогичные свойствам исходных аминокислот (т.е. пептид, полученный с помощью консервативной аминокислотной замены).
[0027]
Является ли представляющий интерес пептид «пептидом, обладающим способностью индуцировать CTL и/или способностью индуцировать продукцию иммуноглобулина, которая эквивалентна или более высокая, чем таковая у исходного пептида», можно определить в соответствии, например, со способом, раскрытым в WO 2015/060235. Согласно способу, раскрытому в WO 2015/060235, способность индуцировать CTL оценивается с использованием в качестве индикатора количества клеток, продуцирующих IFN-γ, в лунках, содержащих: клетки, полученные от мыши, которой заранее был введен тестируемый пептид, имеющий аминокислотную последовательность, полученную с помощью замены, вставки, делеции и/или добавления одной или множества аминокислот из исходной последовательности; антигенпредставляющие клетки, полученные от мыши той же линии, и тестируемый пептид. Когда результат оценки эквивалентен или превышает значение Δ исходного пептида (положительный: 10≤Δ<100; умеренно положительный: 100≤Δ<200; строго положительный: 200≤Δ), то представляющий интерес пептид может быть описан, как имеющий способность индуцировать CTL на эквивалентном или более высоком уровне, чем исходный пептид. Когда исходный пептид оценивается как «положительный», и пептид, имеющий аминокислотную последовательность, полученную с помощью замены, вставки, делеции и/или добавления одной или множества аминокислот из исходной последовательности, также оценивается как «положительный», способность индуцировать CTL считается эквивалентной. Способность индуцировать продукцию иммуноглобулинов оценивают с использованием в качестве индикатора титр антител IgG, специфичных к CTL-эпитопу, в сыворотке мыши, которой вводили тестируемый пептид. Когда увеличение титра полученных антител IgG (кратность) эквивалентно или выше увеличения у исходного пептида (2<кратность<10, 10≤кратность<100, 100≤кратность), то представляющий интерес пептид может быть описан, как имеющий способность индуцировать продукцию иммуноглобулина на эквивалентном или более высоком уровне, чем исходный пептид. Когда результат измерения для исходного пептида находится в диапазоне «2<кратность<10», и результат измерения пептида, имеющего аминокислотную последовательность, полученную с помощью замены, вставки, делеции и/или добавления одной или множества аминокислот из исходной последовательности, также находится в диапазоне «2<кратность<10», способность индуцировать продукцию иммуноглобулинов считается эквивалентной.
[0028]
В настоящем изобретении можно использовать любой линкер при условии, что он расщепляется при введении пептида, имеющего 4 связанных эпитопа CTL, в организм, и что связанные пептидные эпитопы CTL могут быть отделены друг от друга. Их примеры включают сложноэфирную связь, эфирную связь, амидную связь, сахарную цепь, полиэтиленгликольный линкер и аминокислотный линкер. Примеры аминокислотных последовательностей, используемых в качестве аминокислотных линкеров, включают димер аргинина (RR), тример аргинина (RRR), тетрамер аргинина (RRRR), димер лизина (KK), тример лизина (KKK), тетрамер лизина (KKKK), димер глицина (GG), тример глицина (GGG), тетрамер глицина (GGGG), пентамер глицина (GGGGG), гексамер глицина (GGGGGG), аланин-аланин-тирозин (AAY), изолейцин-лейцин-аланин (ILA) и аргинин-валин-лизин-аргинин (RVKR), причем димер (RR) или тример (RRR) аргинина являются предпочтительными, а димер аргинина (RR) более предпочтительным. Линкеры, используемые для пептида из связанных эпитопов известны в данной области, и специалист в данной области может использовать адекватно выбранный линкер.
[0029]
В пептиде, имеющем 4 связанных эпитопа CTL по настоящему изобретению, пептидные эпитопы CTL, которые необходимо выбрать, и их расположение можно определить путем введения пептида, имеющего 4 связанных эпитопа CTL, синтезированных в данных комбинациях и в заданном порядке эпитопов, трансгенным мышам, экспрессирующим HLA-А-рецепторы человека, и оценки возникновения специфичной к эпитопному пептиду индукции CTL in vivo. Возникновение специфичной к эпитопному пептиду индукции CTL in vivo можно оценить, например, в соответствии со способом, раскрытым в WO 2015/060235. В соответствии с таким способом можно выбрать по меньшей мере 3, и предпочтительно 4 типа пептидных эпитопов CTL, для которых наблюдалась индукция CTL, специфичная для соответствующих пептидных эпитопов CTL, и можно определить их расположение.
[0030]
Пептид, имеющий 4 связанных эпитопа CTL по настоящему изобретению, предпочтительно имеет признак, выбранный из признаков (1)-(3) ниже:
(1) пептид содержит PEP2 на С-конце (за исключением пептида, содержащего PEP7 и PEP8 на N-конце, последовательно расположенных в таком порядке от N-конца через линкер);
(2) пептид содержит PEP4 на С-конце; и
(3) пептид содержит PEP10 на С-конце.
[0031]
Соответственно, пептид, имеющий 4 связанных эпитопа CTL по настоящему изобретению, предпочтительно содержит пептид «PEP5», представленный в SEQ ID NO: 5, и 3 эпитопных пептида, выбранных из группы, состоящей из пептида «PEP1», представленного в SEQ ID NO: 1, пептида «PEP2», представленного в SEQ ID NO: 2, пептида «PEP4», представленного в SEQ ID NO: 4, пептида «PEP6», представленного в SEQ ID NO: 6, пептида «PEP7», представленного в SEQ ID NO: 7, пептида «PEP8», представленного в SEQ ID NO: 8, пептида «PEP9», представленного в SEQ ID NO: 9, пептида «PEP10», представленного в SEQ ID NO: 10, пептида «PEP13», представленного в SEQ ID NO: 13, пептида «РЕР15», представленного в SEQ ID NO: 15, и пептида «РЕР18», представленного в SEQ ID NO: 18, связанных через линкеры, и имеет любой один признак, выбранный из признаков (1)-(3) ниже:
(1) пептид содержит PEP2 на С-конце (за исключением пептида, содержащего PEP7 и PEP8 на N-конце, последовательно расположенных в таком порядке от N-конца через линкер);
(2) пептид содержит PEP4 на С-конце; и
(3) пептид содержит PEP10 на С-конце.
[0032]
Более предпочтительно, пептид, имеющий 4 связанных эпитопа CTL по настоящему изобретению, содержит пептид «РЕР5», представленный в SEQ ID NO: 5, пептид «РЕР6», представленный в SEQ ID NO: 6, пептид «РЕР9», представленный в SEQ ID NO: 9, и один пептид, выбранный из группы, состоящей из пептида «PEP2», представленного в SEQ ID NO: 2, пептида «PEP4», представленного в SEQ ID NO: 4, и пептида «PEP10», представленного в SEQ ID NO: 10, связанных через линкеры, и содержит PEP2, PEP4 или PEP10 на С-конце.
[0033]
Более предпочтительно, пептид, имеющий 4 связанных эпитопа CTL по настоящему изобретению, состоит из последовательности, выбранной из следующих последовательностей, где «-(L)-» представляет собой линкер:
PEP5-(L)-PEP6-(L)-PEP9-(L)-PEP4;
PEP9-(L)-PEP5-(L)-PEP6-(L)-PEP4;
PEP6-(L)-PEP5-(L)-PEP9-(L)-PEP4;
PEP6-(L)-PEP9-(L)-PEP5-(L)-PEP4;
PEP9-(L)-PEP6-(L)-PEP5-(L)-PEP4;
PEP5-(L)-PEP9-(L)-PEP6-(L)-PEP4;
PEP5-(L)-PEP9-(L)-PEP6-(L)-PEP2; и
PEP5-(L)-PEP9-(L)-PEP6-(L)-PEP10.
[0034]
Более предпочтительно, пептид, имеющий 4 связанных эпитопа CTL по настоящему изобретению, состоит из последовательности, выбранной из следующих последовательностей, где «-(L)-» представляет собой линкер:
PEP5-(L)-PEP9-(L)-PEP6-(L)-PEP4;
PEP5-(L)-PEP9-(L)-PEP6-(L)-PEP2; и
PEP5-(L)-PEP9-(L)-PEP6-(L)-PEP10.
[0035]
Более предпочтительно, пептид, имеющий 4 связанных эпитопа CTL по настоящему изобретению, состоит из последовательности, выбранной из следующих, где линкер представляет собой аргининовый димер:
PEP5-RR-PEP9-RR-PEP6-RR-PEP4 (SEQ ID NO: 24, именуется в настоящем документе «TPV06»);
PEP5-RR-PEP9-RR-PEP6-RR-PEP2 (SEQ ID NO: 25, именуется в настоящем документе «TPV07»); и
PEP5-RR-PEP9-RR-PEP6-RR-PEP10 (SEQ ID NO: 26, именуется в настоящем документе «TPV08»).
Более предпочтительно, пептид, имеющий 4 связанных эпитопа CTL по настоящему изобретению, представляет собой пептид TPV06, представленный в SEQ ID NO: 24.
[0036]
В одном аспекте настоящего изобретения пептид, имеющий 4 связанных эпитопа CTL, предпочтительно представляет собой пептид, имеющий последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 19-28, приведенных в таблице 2 ниже.
[0037]
[0038]
Более предпочтительно, пептид, имеющий 4 связанных эпитопа CTL, представляет собой пептид, указанный ниже, который выбирают из пептидов, приведенных в таблице 2:
-TPV01 (SEQ ID NO: 19);
-TPV02 (SEQ ID NO: 20);
-TPV03 (SEQ ID NO: 21);
-TPV04 (SEQ ID NO: 22);
-TPV05 (SEQ ID NO: 23); или
-TPV06 (SEQ ID NO: 24).
[0039]
В настоящем изобретении можно использовать 2 или несколько типов пептидов, имеющих 4 связанных эпитопа CTL. Например, 2, 3, 4 или большее число типов пептидов, имеющих 4 связанных эпитопа CTL, можно использовать по отдельности или смешанными. 3 типа пептидов, имеющих 4 связанных эпитопа CTL, предпочтительно использовать смешанными. Если по меньшей мере один пептид, имеющий 4 связанных эпитопа CTL по настоящему изобретению, включен в 2 или большее число типов пептидов, имеющих 4 связанных эпитопа CTL, которые будут использоваться, другими пептидами могут быть пептиды, имеющие 4 связанных эпитопа CTL по настоящему изобретению, или пептиды, имеющие 4 связанных эпитопа CTL, описанные, например, в WO 2015/060235. Предпочтительно, чтобы пептид, приведенный в SEQ ID NO: 24, использовался в комбинации с одним или несколькими пептидами, имеющими 4 связанных эпитопа CTL, описанными в WO 2015/060235, более предпочтительно, чтобы пептид, приведенный в SEQ ID NO: NO: 24 использовался в комбинации с 2 типами пептидов, содержащих 4 связанных эпитопа CTL, описанными в WO 2015/060235, и также предпочтительно, чтобы пептид, приведенный в SEQ ID NO: 24, пептид, приведенный в SEQ ID NO: 29 (TPV011: PEP15-RR-PEP18-RR-PEP1-RR-PEP10), и пептид, приведенный в SEQ ID NO: 30 (TPV012: RRRR-PEP7-RR-PEP13-RR-PEP8-RR-PEP2) использовались смешанными.
[0040]
Пептид, имеющий 4 связанных эпитопа CTL по настоящему изобретению, может дополнительно иметь пептидную последовательность, состоящую из гидрофильных аминокислот. Такая пептидная последовательность, состоящая из гидрофильных аминокислот, может быть добавлена на N-конце и/или C-конце пептида, имеющего 4 связанных эпитопа CTL, и предпочтительно ее добавляют на N-конце. Такая пептидная последовательность может содержать от 1 до 15, предпочтительно - от 2 до 10, и более предпочтительно - от 3 до 5 гидрофильных аминокислот, выбранных из группы, состоящей из аргинина, гистидина, лизина, треонина, тирозина, серина, аспарагина, глутамина, аспарагиновой кислоты и глутаминовой кислоты. Примеры пептидных последовательностей, которые можно использовать, включают тример аргинина (RRR) и тетрамер аргинина (RRRR). Примеры пептидов, содержащих 4 связанных эпитопа CTL, содержащих описанные выше пептидные последовательности, добавленные к ним, включают RRR-TPV06, RRRR-TPV06, TPV06-RRR, TPV06-RRRR, RRR-TPV07, RRRR-TPV07, TPV07-RRR, TPV07-RRRR, RRR-TPV08, RRRR-TPV08, TPV08-RRR, TPV08-RRRR, KKK-TPV06, KKKK-TPV06, TPV06-KKK, TPV06-KKKK, KKK-TPV07, KKKK-TPV07, TPV07-KKK, TPV07-KKKK, KKK-TPV08, KKKK-TPV08, TPV08-KKK, TPV08-KKKK, HHH-TPV06, HHHH-TPV06, TPV06-HHH, TPV06-HHHH, HHH-TPV07, HHHH-TPV07, TPV07-HHH, TPV07-HHHH, HHH-TPV08, HHHH-TPV08, TPV08-HHH, TPV08-HHHH, RRKK-TPV06, RKRK-TPV06, RHRH-TPV06, RRHH-TPV06, KKHH-TPV06 и KHKH-TPV06. Предпочтительные примеры включают RRR-TPV06, RRRR-TPV06, RRR-TPV07, RRRR-TPV07, RRR-TPV08, RRRR-TPV08, KKK-TPV06, KKKK-TPV06, KKK-TPV07, KKKK-TPV07, KKK-TPV08, KKKK-TPV08, HHH-TPV06, HHHH-TPV06, HHH-TPV07, HHHH-TPV07, HHH-TPV08, HHHH-TPV08, RRKK-TPV06, RKRK-TPV06, RHRH-TPV06, RRHH-TPV06, KKHH-TPV06 и KHKH-TPV06. Более предпочтительные примеры включают RRR-TPV06 (TPV09), RRRR-TPV06 (TPV10), RRR-TPV07, RRRR-TPV07, RRR-TPV08 и RRRR-TPV08. Наиболее предпочтительные примеры включают RRR-TPV06 (TPV09) и RRRR-TPV06 (TPV10).
[0041]
Известно, что пептид, содержащий пептидную последовательность, состоящую из гидрофильных аминокислот, обладает улучшенной растворимостью в водном растворителе (Peptides 38, 302-311, 2012; JP 2006-188507 A). При добавлении такой пептидной последовательности к пептиду, имеющему 4 связанных эпитопа CTL по настоящему изобретению, можно улучшить степень растворимости пептида, имеющего 4 связанных эпитопа CTL, в водном растворителе.
[0042]
«Пептид, имеющий 4 связанных эпитопа CTL, который может дополнительно содержать пептидную последовательность, состоящую из гидрофильных аминокислот» по настоящему изобретению, предпочтительно представляет собой пептид, имеющий 4 связанных эпитопа CTL, который может содержать пептидную последовательность, состоящую из гидрофильных аминокислот на N-конце, более предпочтительно представляет собой пептид, имеющий 4 связанных эпитопа CTL, который может содержать пептидную последовательность, состоящую из 3-5 гидрофильных аминокислот, выбранных из группы, состоящей из аргинина, гистидина и лизина на N-конце, более предпочтительно представляет собой пептид, имеющий 4 связанных эпитопа CTL, который может содержать тример аргинина (RRR) или тетрамер аргинина (RRRR) на N-конце, и еще более предпочтительно - пептид, имеющий 4 связанных эпитопа CTL, который не содержит пептидную последовательность, состоящую из гидрофильных аминокислот.
[0043]
Пептид, имеющий 4 связанных эпитопа CTL по настоящему изобретению, может быть синтезирован, например, в соответствии со способом, раскрытым в WO 2015/060235.
[0044]
В настоящем изобретении «адъювантная терапия» представляет собой способ лечения или ингибирования рецидива и/или метастазирования опухоли после операции. Адъювантная терапия по настоящему изобретению включает стадию введения пептида, имеющего 4 связанных эпитопа CTL по настоящему изобретению, пациенту после резекции опухоли.
Хотя настоящее изобретение не ограничено конкретным типом пациентов, благоприятные эффекты, в частности, могут быть достигнуты у человека.
[0045]
Рекомендуемая доза пептида, имеющего 4 связанных эпитопа CTL по настоящему изобретению, для человека предпочтительно находится в диапазоне от 3 до 9 мг/пациента/день на один пептид, имеющий 4 связанных эпитопа CTL.
[0046]
Используемый в настоящем документе термин «рекомендуемая доза» относится к дозе, которую можно безопасно применять без возникновения каких-либо тяжелых побочных эффектов, и которая может оказывать максимальное терапевтическое действие, определенное на основе клинических испытаний и т.п. В частности, «рекомендуемая доза» представляет собой дозу, одобренную, рекомендованную и советуемую общественными организациями или учреждениями, такими как Агентство по фармацевтике и медицинскому оборудованию (PMDA), Япония, Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (FDA), США, или Европейская комиссия по лекарственным средствам (EMA), и описана, например, в информации о продукте, опросной форме или руководстве по лечению. «Рекомендуемая доза» предпочтительно представляет собой дозу, одобренную любым из PMDA, FDA или EMA.
[0047]
Схема введения агента для адъювантной терапии опухолей, агента для ингибирования метастазирования опухоли и агента для ингибирования рецидива опухоли по настоящему изобретению может быть адекватно определена в соответствии с типом опухоли, стадией заболевания и другими условиями.
Введение пептида, имеющего 4 связанных эпитопа CTL, предпочтительно должно включать цикл общей продолжительностью 21 день, в котором введение один раз в неделю повторяется 3 раза (один раз в день в День 1, День 8 и День 15). После третьего цикла введение предпочтительно должно включать цикл общей продолжительностью 21 день, в котором за введением лекарственного средства в 1-й день следует перерыв в течение 20 дней (однократное введение в течение 3 недель).
[0048]
Частота введения пептида, имеющего 4 связанных эпитопа CTL по настоящему изобретению, в сутки может быть адекватно определена в соответствии с типом рака, стадией заболевания и другими условиями. Пептид, имеющий 4 связанных эпитопа CTL, предпочтительно вводят один раз в сутки.
[0049]
Опухоли-мишени, подлежащие лечению у пациента, которому вводят эмульсионный состав по настоящему изобретению, особо не ограничены при условии, что противоопухолевые эффекты могут проявляться при адъювантной терапии опухолей. Опухоли-мишени предпочтительно представляют собой опухоли, в отношении которых пептиды, имеющие 4 связанных эпитопа CTL, оказывают противоопухолевое действие при адъювантной терапии опухолей, и более предпочтительно представляют собой Lck-, WHSC2-, SART2-, SART3-, MRP3-, UBE2V-, EGFR- или PTHrP-положительные злокачественные опухоли, и более предпочтительно - SART2-положительные злокачественные опухоли.
[0050]
Конкретные примеры опухолей-мишеней, подлежащих лечению с использованием эмульсионного состава по настоящему изобретению, включают опухоль мозга, рак головы и шеи, рак пищеварительной системы (например, рак пищевода, рак желудка, рак двенадцатиперстной кишки, рак печени, рак желчных протоков. (например, рак желчного пузыря и рак желчных протоков), рак поджелудочной железы, рак тонкого кишечника, рак толстого кишечника (например, колоректальный рак, рак толстой кишки и рак прямой кишки) и стромальная опухоль желудочно-кишечного тракта), рак легких (например, немелкоклеточный рак легких и мелкоклеточный рак легких), рак груди, рак яичников, рак матки (например, рак шейки матки и рак тела матки), рак почек, уротелиальный рак (например, рак мочевого пузыря, рак почечной лоханки и мочеточника), рак простаты, рак кожи и рак с неизвестной первичной формой. Рак включает первичный рак и рак, метастазирующий в другие органы (например, в печень). С точки зрения противоопухолевого действия предпочтительными мишенями являются рак головы и шеи, рак пищеварительной системы, рак легких, рак почек, уротелиальный рак и рак кожи, более предпочтительными мишенями являются рак пищеварительной системы, рак легких, уротелиальный рак и рак кожи, и особенно предпочтительными мишенями являются рак легких и уротелиальный рак.
[0051]
Лекарственные формы агента для адъювантной терапии опухолей, агента для ингибирования метастазирования опухоли и агента для ингибирования рецидива опухоли по настоящему изобретению конкретно не ограничены и могут быть адекватно выбраны в соответствии с целью лечения. Конкретные примеры включают пероральные препараты (например, таблетки, таблетки в оболочке, порошки, гранулы, капсулы и жидкие препараты), инъекции, суппозитории, пластыри и мази, причем инъекции являются предпочтительными.
[0052]
Агент для адъювантной терапии опухолей, агент для ингибирования метастазирования опухоли и агент для ингибирования рецидива опухоли по настоящему изобретению можно изготовить с использованием фармацевтически приемлемого носителя в соответствии с общепринятой методикой. Примеры фармацевтических носителей включают различные типы носителей, которые обычно используются для лекарственных средств, такие как вспомогательное вещество, связующее вещество, дезинтегратор, смазывающее вещество, разбавитель, солюбилизатор, суспендирующий агент, изотонический агент, модификатор pH, буфер, стабилизатор, краситель, корригент и ароматизатор.
[0053]
Пептид, имеющий 4 связанных CTL-эпитопа, в качестве действующего ингредиента агента для адъювантной терапии, агента для ингибирования метастазирования опухоли и агента для ингибирования рецидива опухоли по настоящему изобретению может селективно и специфично обеспечивать нацеливание на клетки, экспрессирующие включенный в него эпитоп. По сравнению с противораковыми агентами, используемыми в качестве агента для адъювантной терапии, агента для ингибирования метастазирования опухоли и агента для ингибирования рецидива опухоли в обычных методиках, соответственно, агент для адъювантной терапии, агент для ингибирования метастазирования опухоли и агент для ингибирования рецидива опухоли по настоящему изобретению могут эффективно использоваться без возникновения тяжелых побочных эффектов, таким образом снимая стресс, воздействующий на пациента.
[0054]
Противораковые эффекты часто верифицируются с использованием животных моделей. Обычно в качестве показателя используют рост трансплантированных опухолей или выживаемость животных, которым были трансплантированы опухоли. Напротив, эффекты агента для адъювантной терапии, агента для ингибирования метастазирования опухоли и агента для ингибирования рецидива опухоли более предпочтительно верифицировать путем изучения эффектов, оказываемых на метастазирование, а не на уменьшение опухолей, которые были трансплантированы животным моделям. Соответственно, эффекты агента для адъювантной терапии опухолей, агента для ингибирования метастазирования опухоли и агента для ингибирования рецидива опухоли по настоящему изобретению могут быть проверены с использованием, например, моделей животных, у которых опухоли развиваются в участках, отличных от места трансплантации опухоли; т.е. на животных моделях, у которых развиваются метастазы.
[0055]
Кроме того, пептид, имеющий 4 связанных эпитопа CTL, в качестве действующего ингредиента агента для адъювантной терапии, агента для ингибирования метастазирования опухоли и агента для ингибирования рецидива опухоли по настоящему изобретению обладает способностью индуцировать HLA-A-рестриктированные CTL-ответы. Соответственно, животные модели, используемые для проверки эффектов, должны экспрессировать молекулы HLA-A.
[0056]
Примером животной модели является, но не ограничивается этим, неиммунодефицитное животное, имеющее нок-ин гена HLA-A. Неиммунодефицитное животное, отличное от человека, имеющее нок-ин гена HLA-A, не ограничено, если оно имеет участки α1 и α2 HLA-A человека. Примером такого предпочтительно используемого животного является мышь с нок-ин гена HLA-A24 человека (мышь B2mtm2(HLA-A24/H-2Db/B2M)Tai, описанная в WO 2015/056774 и J. Immunol.: 198, 516-527, 2017.
Примеры
[0057]
Далее настоящее изобретение описано более подробно со ссылкой на примеры, хотя настоящее изобретение не ограничивается этими примерами. Специалист в данной области сможет осуществить различные модификации в рамках технического объема настоящего изобретения.
[0058]
Пример 1: Синтез и очистка пептидов
Пептиды, имеющие 4 связанных эпитопа TPV07 и TPV08, были синтезированы с использованием автоматического синтезатора пептидов Prelude (Protein Technologies, Inc.) методом твердофазного Fmoc-синтеза. В частности, аминокислоту, содержащую α-аминогруппу, защищенную Fmoc-группой (9-флуоренилметилоксикарбонильной группой), и функциональную группу боковой цепи, защищенную общей защитной группой, иммобилизовали на смоле Wang-ChemMatrix в 1-(мезитилен-2-сульфонил)-3-нитро-1,2,4-триазоле/N-метилимидазоле/дихлорметане, что давало присоединение С-концевой аминокислоты к смоле. Смолу обрабатывали деблокирующим раствором (20% пиперидин/N, N-диметилформамид (DMF)) для удаления Fmoc-группы, и к ней добавляли аминокислоту, содержащую α-аминогруппу, защищенную группой Fmoc, и функциональную группу боковой цепи, защищенную общей защитной группой, в 1-[бис(диметиламино)метилен]-5-хлор-1H-бензотриазолия-3-оксид гексафторфосфате (HCTU)/N-метилморфолине (NMM)/DMF для синтеза дипептида. Снятие Fmoc-защиты с помощью деблокирующего раствора и присоединение аминокислот в HCTU/NMM/DMF повторяли для синтеза пептидов, каждый из которых содержал представляющую интерес последовательность. После завершения синтеза защищенного пептида на смоле, к защищенному пептиду на смоле добавляли раствор для снятия защиты (2,5% триизопропилсилана, 2,5% воды, 2,5% 1,2-этандитиола, 92,5% трифторуксусной кислоты), и реакционную смесь оставляли на 4 часа для удаления защитной группы боковой цепи пептида и отщепления свободного пептида от смолы. Смолу удаляли фильтрованием, фильтрат добавляли к холодному эфиру и выделяли пептиды в виде осадка. Синтезированные пептиды очищали на колонке Proteonavi (Shiseido) с использованием системы растворителей из водного раствора 0,1% TFA и ацетонитрила. Чистоту конечной формы очищенных пептидов проверяли с использованием колонки CAPCELL PAK UG120 (Shiseido) и системы ВЭЖХ (Hitachi). После определения молекулярной массы с помощью ESI-MS (Synapt HDMS, WATERS) пептиды лиофилизировали, хранили при низкой температуре в темноте и затем использовали в описанных ниже примерах.
[0059]
В таблице 3 показаны молекулярные массы TPV07 и TPV08, измеренные с помощью масс-спектрального (MS) анализа. На фиг.1-4 показаны ВЭЖХ-хроматограммы и данные MS для TPV07 и TPV08.
[0060]
[0061]
TPV01-TPV06 и TPV09-TPV12 могут быть синтезированы, например, в соответствии со способом, описанным в WO 2015/060235, или способом, применяемым для TPV07 и TPV08. Все пептиды имели чистоту 90% и выше.
[0062]
Пример 2: Влияние TPV06 на модели метастазирования в легких клеток B16F10.A24/SART293-101
Мышей B2mtm2(HLA-A24/H-2Db/B2M)Tai в возрасте 11 недель (J. Immunol.: 198, 516-527, 2017) случайным образом разделяли на группы, каждая из которых состояла из 10 мышей. День распределения по группам был обозначен как День 0.
[0063]
Клетки B16F10.A24/SART293-101 (PLoS One: 13, e0199249, 2018) культивировали с использованием модифицированной Дульбекко среды Игла (Sigma-Aldrich), содержащей 10% FBS. Клетки B16F10.A24/SART293-101 растили в инкубаторе при 37°С в присутствии 5% СО2, пассируя два раза в неделю в соотношении 1:25-1:40.
[0064]
В день разделения мышей по группам (День 0) суспензию клеток B16F10.A24/SART293-101, приготовленную с использованием D-PBS (FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation), трансплантировали в хвостовые вены мышей в количестве 1×106 клеток/0,1 мл.
[0065]
Обнаружено, что в мышиных моделях наблюдается легочное метастазирование трансплантированных в кровь опухолевых клеток. Соответственно, такие мышиные модели можно рассматривать как имитацию механизма рецидива опухолей, вызванного метастазированием рака, у людей. Таким образом, путем проверки эффектов на таких моделях можно проверить ингибирующие эффекты на метастазирование и рецидив опухоли.
[0066]
Пептид, имеющий 4 связанных эпитопа TPV06 (SEQ ID NO: 24), растворяли в дистиллированной воде (Otsuka Pharmaceutical Factory Inc.) для приготовления раствора пептидов с концентрацией 6 мг/мл, полученным раствором заполняли шприц B Braun Injekt (B. Braun Aesculap). После заполнения другого шприца эквивалентным количеством Montanide ISA 51 VG (SEPPIC) эти шприцы соединяли друг с другом с помощью соединителя, и раствор пептида тщательно перемешивали с Montanide ISA 51 VG для приготовления эмульсии. В качестве контрольного образца дистиллированную воду смешивали с эквивалентным количеством Montanide ISA 51 VG для приготовления эмульсии. Эмульсии вводили еженедельно подкожно в количестве 100 мкл в область основания хвоста мышей B2mtm2(HLA-A24/H-2Db/B2M)Tai, и всего препарат вводили 3 раза (в День 1, 8 и 15).
[0067]
Легкие удаляли через 28 дней после трансплантации клеток B16F10.A24/SART293-101 (на 28-й день) и визуально подсчитывали количество метастатических узлов в легких.
[0068]
Как показано на фиг.5, количество метастатических узлов в легких было значительно снижено в группе введения TPV06 по сравнению с контрольной группой (p=0,0014, критерий Стьюдента).
[0069]
Результаты демонстрируют, что введение TPV06 может в значительной степени ингибировать метастазирование и рецидив экспрессирующих SART293-101 опухолевых клеток. Таким образом, пептид, имеющий 4 связанных эпитопа CTL, применим для лечения метастазирования и рецидива опухоли.
[0070]
В общем известно, что антиген-специфичные CTL специфично распознают, активируют и убивают клетки, представляющие пептидные эпитопы CTL из ракового антигена, через молекулы HLA на клеточной поверхности (Janeway's Immunobiology, 7-е издание). Соответственно, если клетки-мишени экспрессируют раковые антигены, на которые нацелен пептид, имеющий 4 связанных эпитопа CTL, то пептид, имеющий 4 связанных эпитопа CTL, может оказывать противоопухолевое действие. Пептид, имеющий 4 связанных эпитопа CTL, может оказывать ингибирующее действие на метастазирование и рецидив опухоли (терапевтические эффекты), если клетки экспрессируют раковые антигены, на которые нацеливает пептид, имеющий 4 связанных эпитопа CTL. Таким образом, типы опухолей-мишеней, подлежащих лечению, не ограничены.
Все публикации, патенты и заявки на патенты, цитируемые в настоящем документе, полностью включены в него посредством ссылки.
--->
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110>TAIHO PHARMACEUTICAL CO., LTD.
<120>Агент для адъювантной терапии
<130>PH-8678-PCT
<150>JP 2019-236947
<151>2019-12-26
<160>30
<170>PatentIn version 3.5
<210>1
<211>9
<212>Белок
<213>Homo sapiens
<400>1
Lys Leu Val Glu Arg Leu Gly Ala Ala
1 5
<210>2
<211>9
<212>Белок
<213>Homo sapiens
<400>2
Ala Ser Leu Asp Ser Asp Pro Trp Val
1 5
<210>3
<211>9
<212>Белок
<213>Homo sapiens
<400>3
Ala Leu Val Glu Phe Glu Asp Val Leu
1 5
<210>4
<211>9
<212>Белок
<213>Homo sapiens
<400>4
Leu Leu Gln Ala Glu Ala Pro Arg Leu
1 5
<210>5
<211>9
<212>Белок
<213>Homo sapiens
<400>5
Asp Tyr Ser Ala Arg Trp Asn Glu Ile
1 5
<210>6
<211>10
<212>Белок
<213>Homo sapiens
<400>6
Val Tyr Asp Tyr Asn Cys His Val Asp Leu
1 5 10
<210>7
<211>9
<212>Белок
<213>Homo sapiens
<400>7
Leu Tyr Ala Trp Glu Pro Ser Phe Leu
1 5
<210>8
<211>10
<212>Белок
<213>Homo sapiens
<400>8
Asp Tyr Leu Arg Ser Val Leu Glu Asp Phe
1 5 10
<210>9
<211>9
<212>Белок
<213>Homo sapiens
<400>9
Gln Ile Arg Pro Ile Phe Ser Asn Arg
1 5
<210>10
<211>10
<212>Белок
<213>Homo sapiens
<400>10
Ile Leu Glu Gln Ser Gly Glu Trp Trp Lys
1 5 10
<210>11
<211>10
<212>Белок
<213>Homo sapiens
<400>11
Val Ile Gln Asn Leu Glu Arg Gly Tyr Arg
1 5 10
<210>12
<211>10
<212>Белок
<213>Homo sapiens
<400>12
Lys Leu Lys His Tyr Gly Pro Gly Trp Val
1 5 10
<210>13
<211>9
<212>Белок
<213>Homo sapiens
<400>13
Arg Leu Gln Glu Trp Cys Ser Val Ile
1 5
<210>14
<211>9
<212>Белок
<213>Homo sapiens
<400>14
Ile Leu Gly Glu Leu Arg Glu Lys Val
1 5
<210>15
<211>10
<212>Белок
<213>Homo sapiens
<400>15
Asp Tyr Val Arg Glu His Lys Asp Asn Ile
1 5 10
<210>16
<211>9
<212>Белок
<213>Homo sapiens
<400>16
His Tyr Thr Asn Ala Ser Asp Gly Leu
1 5
<210>17
<211>10
<212>Белок
<213>Homo sapiens
<400>17
Asn Tyr Ser Val Arg Tyr Arg Pro Gly Leu
1 5 10
<210>18
<211>10
<212>Белок
<213>Homo sapiens
<400>18
Arg Tyr Leu Thr Gln Glu Thr Asn Lys Val
1 5 10
<210>19
<211>43
<212>Белок
<213>Искусственная последовательность
<220>
<223>Синтетический пептид
<400>19
Asp Tyr Ser Ala Arg Trp Asn Glu Ile Arg Arg Val Tyr Asp Tyr Asn
1 5 10 15
Cys His Val Asp Leu Arg Arg Gln Ile Arg Pro Ile Phe Ser Asn Arg
20 25 30
Arg Arg Leu Leu Gln Ala Glu Ala Pro Arg Leu
35 40
<210>20
<211>43
<212>Белок
<213>Искусственная последовательность
<220>
<223>Синтетический пептид
<400>20
Gln Ile Arg Pro Ile Phe Ser Asn Arg Arg Arg Asp Tyr Ser Ala Arg
1 5 10 15
Trp Asn Glu Ile Arg Arg Val Tyr Asp Tyr Asn Cys His Val Asp Leu
20 25 30
Arg Arg Leu Leu Gln Ala Glu Ala Pro Arg Leu
35 40
<210>21
<211>43
<212>Белок
<213>Искусственная последовательность
<220>
<223>Синтетический пептид
<400>21
Val Tyr Asp Tyr Asn Cys His Val Asp Leu Arg Arg Asp Tyr Ser Ala
1 5 10 15
Arg Trp Asn Glu Ile Arg Arg Gln Ile Arg Pro Ile Phe Ser Asn Arg
20 25 30
Arg Arg Leu Leu Gln Ala Glu Ala Pro Arg Leu
35 40
<210>22
<211>43
<212>Белок
<213>Искусственная последовательность
<220>
<223>Синтетический пептид
<400>22
Val Tyr Asp Tyr Asn Cys His Val Asp Leu Arg Arg Gln Ile Arg Pro
1 5 10 15
Ile Phe Ser Asn Arg Arg Arg Asp Tyr Ser Ala Arg Trp Asn Glu Ile
20 25 30
Arg Arg Leu Leu Gln Ala Glu Ala Pro Arg Leu
35 40
<210>23
<211>43
<212>Белок
<213>Искусственная последовательность
<220>
<223>Синтетический пептид
<400>23
Gln Ile Arg Pro Ile Phe Ser Asn Arg Arg Arg Val Tyr Asp Tyr Asn
1 5 10 15
Cys His Val Asp Leu Arg Arg Asp Tyr Ser Ala Arg Trp Asn Glu Ile
20 25 30
Arg Arg Leu Leu Gln Ala Glu Ala Pro Arg Leu
35 40
<210>24
<211>43
<212>Белок
<213>Искусственная последовательность
<220>
<223>Синтетический пептид
<400>24
Asp Tyr Ser Ala Arg Trp Asn Glu Ile Arg Arg Gln Ile Arg Pro Ile
1 5 10 15
Phe Ser Asn Arg Arg Arg Val Tyr Asp Tyr Asn Cys His Val Asp Leu
20 25 30
Arg Arg Leu Leu Gln Ala Glu Ala Pro Arg Leu
35 40
<210>25
<211>43
<212>Белок
<213>Искусственная последовательность
<220>
<223>Синтетический пептид
<400>25
Asp Tyr Ser Ala Arg Trp Asn Glu Ile Arg Arg Gln Ile Arg Pro Ile
1 5 10 15
Phe Ser Asn Arg Arg Arg Val Tyr Asp Tyr Asn Cys His Val Asp Leu
20 25 30
Arg Arg Ala Ser Leu Asp Ser Asp Pro Trp Val
35 40
<210>26
<211>44
<212>Белок
<213>Искусственная последовательность
<220>
<223>Синтетический пептид
<400>26
Asp Tyr Ser Ala Arg Trp Asn Glu Ile Arg Arg Gln Ile Arg Pro Ile
1 5 10 15
Phe Ser Asn Arg Arg Arg Val Tyr Asp Tyr Asn Cys His Val Asp Leu
20 25 30
Arg Arg Ile Leu Glu Gln Ser Gly Glu Trp Trp Lys
35 40
<210>27
<211>46
<212>Белок
<213>Искусственная последовательность
<220>
<223>Синтетический пептид
<400>27
Arg Arg Arg Asp Tyr Ser Ala Arg Trp Asn Glu Ile Arg Arg Gln Ile
1 5 10 15
Arg Pro Ile Phe Ser Asn Arg Arg Arg Val Tyr Asp Tyr Asn Cys His
20 25 30
Val Asp Leu Arg Arg Leu Leu Gln Ala Glu Ala Pro Arg Leu
35 40 45
<210>28
<211>47
<212>Белок
<213>Искусственная последовательность
<220>
<223>Синтетический пептид
<400>28
Arg Arg Arg Arg Asp Tyr Ser Ala Arg Trp Asn Glu Ile Arg Arg Gln
1 5 10 15
Ile Arg Pro Ile Phe Ser Asn Arg Arg Arg Val Tyr Asp Tyr Asn Cys
20 25 30
His Val Asp Leu Arg Arg Leu Leu Gln Ala Glu Ala Pro Arg Leu
35 40 45
<210>29
<211>45
<212>Белок
<213>Искусственная последовательность
<220>
<223>Синтетический пептид
<400>29
Asp Tyr Val Arg Glu His Lys Asp Asn Ile Arg Arg Arg Tyr Leu Thr
1 5 10 15
Gln Glu Thr Asn Lys Val Arg Arg Lys Leu Val Glu Arg Leu Gly Ala
20 25 30
Ala Arg Arg Ile Leu Glu Gln Ser Gly Glu Trp Trp Lys
35 40 45
<210>30
<211>47
<212>Белок
<213>Искусственная последовательность
<220>
<223>Синтетический пептид
<400>30
Arg Arg Arg Arg Leu Tyr Ala Trp Glu Pro Ser Phe Leu Arg Arg Arg
1 5 10 15
Leu Gln Glu Trp Cys Ser Val Ile Arg Arg Asp Tyr Leu Arg Ser Val
20 25 30
Leu Glu Asp Phe Arg Arg Ala Ser Leu Asp Ser Asp Pro Trp Val
35 40 45
<---
Изобретение относится к применению агента для адъювантной терапии для лечения SART2-положительной злокачественной опухоли, который оказывает заметное ингибирующее действие на метастазирование и рецидив опухоли, при этом вызывая мало побочных эффектов. Агент для адъювантной терапии содержит в качестве действующего ингредиента пептид, имеющий 4 связанных эпитопа CTL. 2 н. и 10 з.п. ф-лы, 5 ил., 3 табл., 1 пр.
1. Применение агента для адъювантной терапии для лечения SART2-положительной злокачественной опухоли, содержащего в качестве действующего ингредиента один или более пептидов, имеющих 4 связанных эпитопа CTL, содержащих 4 эпитопных пептида CTL, связанных через линкеры, где один из пептидов, имеющих 4 связанных эпитопа CTL, представляет собой пептид, имеющий 4 связанных эпитопа CTL, в котором эпитопный пептид «PEP4», представленный в SEQ ID NO: 4, эпитопный пептид «PEP5», представленный в SEQ ID NO: 5, эпитопный пептид «PEP6», представленный в SEQ ID NO: 6, и эпитопный пептид «PEP9», представленный в SEQ ID NO: 9, связаны через линкеры таким образом, что эпитопный пептид «PEP4» присутствует на С-конце, где пептид, имеющий 4 связанных эпитопа CTL, может дополнительно содержать пептидную последовательность, состоящую из гидрофильных аминокислот.
2. Применение по п.1, где один из пептидов, имеющих 4 связанных эпитопа CTL, состоит из последовательности, указанной ниже:
PEP5-(L)-PEP9-(L)-PEP6-(L)-PEP4,
где «-(L)-» представляет собой линкер.
3. Применение по любому из пп.1, 2, где линкер представляет собой аминокислотный линкер.
4. Применение по п.3, где аминокислотный линкер представляет собой аргининовый димер или аргининовый тример, состоящий из 2 или 3 остатков аргинина, связанных друг с другом.
5. Применение по п.1, где пептидная последовательность, состоящая из гидрофильных аминокислот, связана с N-концом и состоит из аргининового тримера или аргининового тетрамера, состоящего из 3 или 4 остатков аргинина, связанных друг с другом.
6. Применение по п.1, содержащее пептид, имеющий 4 связанных эпитопа CTL, представленный в SEQ ID NO: 24.
7. Способ лечения SART2-положительной злокачественной опухоли в качестве адъювантной терапии, включающий введение эффективного количества агента для адъювантной терапии опухолей, содержащего в качестве действующего ингредиента один или более пептидов, имеющих 4 связанных эпитопа CTL, содержащих 4 эпитопных пептида CTL, связанных через линкеры, где один из пептидов, имеющих 4 связанных эпитопа CTL, представляет собой пептид, имеющий 4 связанных эпитопа CTL, в котором эпитопный пептид «PEP4», представленный в SEQ ID NO: 4, эпитопный пептид «PEP5», представленный в SEQ ID NO: 5, эпитопный пептид «PEP6», представленный в SEQ ID NO: 6, и эпитопный пептид «PEP9», представленный в SEQ ID NO: 9, связаны через линкеры таким образом, что эпитопный пептид «PEP4» присутствует на С-конце, где пептид, имеющий 4 связанных эпитопа CTL, может дополнительно содержать пептидную последовательность, состоящую из гидрофильных аминокислот.
8. Способ по п.7, где один из пептидов, имеющих 4 связанных эпитопа CTL, состоит из последовательности, указанной ниже:
PEP5-(L)-PEP9-(L)-PEP6-(L)-PEP4,
где «-(L)-» представляет собой линкер.
9. Способ по п.7 или 8, где линкер представляет собой аминокислотный линкер.
10. Способ по п.9, где аминокислотный линкер представляет собой аргининовый димер или аргининовый тример, состоящий из 2 или 3 остатков аргинина, связанных друг с другом.
11. Способ по п.7, где пептидная последовательность, состоящая из гидрофильных аминокислот, связана с N-концом и состоит из аргининового тримера или аргининового тетрамера, состоящего из 3 или 4 остатков аргинина, связанных друг с другом.
12. Способ по п.7, содержащий пептид, имеющий 4 связанных эпитопа CTL, представленный в SEQ ID NO: 24.
| НОВЫЙ ПЕПТИД, ИМЕЮЩИЙ 4 СВЯЗАННЫХ CTL-ЭПИТОПА | 2014 |
|
RU2636549C1 |
| WO 2014136814 A1, 12.09.2014 | |||
| СПОСОБ РАСЩЕПЛЕНИЯ РАЦЕМАТОВ ТРАМАДОЛА | 1997 |
|
RU2192407C2 |
| Способ изготовления полых изделий из высокотемпературных сверхпроводящих материалов типа Y @ В @ С @ О @ | 1990 |
|
SU1767541A1 |
