СПОСОБЫ И ПРИМЕНЕНИЯ ИНГИБИТОРОВ ПРОПРОТЕИНОВОЙ КОНВЕРТАЗЫ СУБТИЛИЗИН КЕКСИН ТИПА 9(PCSK9) Российский патент 2017 года по МПК A61K39/395 A61K31/4745 A61K31/7088 A61K38/17 A61P29/00 

Родственные заявки

Настоящая заявка испрашивает приоритет по предварительной заявке на патент США 61/648, 319, поданной 17 мая 2012.

Область техники

Настоящее изобретение относится к области ингибиторов пропротеиновой конвертазы субтилизин кексин типа 9 (PCSK9), для использования в улучшении состояния при или терапии воспалительной реакции на инфекцию и для лечения связанных с ней осложнений. В частности, изобретение относится к терапии воспалительной реакции на инфекцию и связанных с ней осложнений.

Уровень техники

Пропротейновая конвертаза субтилизин кексин типа 9 (PCSK9) является членом семейства пропротеиновых конвертаз, относящихся к протеазам, которые предположительно вовлечены в регуляцию обмена липидов. Мутации PCSK9 с прекращением функции (LOF) ассоциированы с уменьшением уровня холестерина липопротеинов низкой плотности (LDL-C). Аналогично, мутации PCSK9 с приобретением функции (GOF) ассоциированы с увеличением уровня холестерина липопротеинов низкой плотности (LDL-C). Повышенные уровни LDL-C плазмы являются фактором риска для развития атеросклероза и ассоциированных ишемических сердечно-сосудистых заболеваний (CVD), таких как инфаркт миокарда и инсульт. LDL-C плазмы связывается LDL рецептором (LDLR) и, связанный комплекс LDL-C/LDLR подвергается эндоцитозу. LDL-C подвергается лизосомальной деградации, в то время как LDLR далее возвращается на плазматическую мембрану, где он может связывать новые молекулы LDL. Связывание LDL-C с помощью LDLR, последующая деградация LDL-C и возвращение рецептора на плазматическую мембрану в некоторой степени длительный процесс. Однако PCSK9 ускоряет деградацию LDLR и, таким образом, препятствует возвращению рецептора на мембрану²². В результате, PCSK9 является мишенью для терапий, понижающих уровень LDL-C.

Статины уменьшают уровень холестерина посредством ингибирования фермента HMG-CoA редуктазы. HMG-CoA редуктаза играет важную роль в образовании холестерина в печени. Сообщалось, что статиновая терапия уменьшает частоту возникновения пневмонии¹ и уменьшает смертность от внутрибольничной пневмонии². Так же сообщалось, что HDL обладает защитным действием при сепсисе³. Однако, подтверждения защитного действия HDL не безусловны⁴. Например, продолжение предгоспитализационной статиновой терапии не улучшает исходов у пациентов, госпитализированных с сепсисом⁵, и активное увеличение уровней HDL плазмы, с использованием ингибиторов транспортного белка холестериновых эфиров (СЕТР), таких как торцетрапиб, приводило впоследствии к излишним смертям от сепсиса⁶. На данный момент не было проведено решающих рандомизированных контролируемых испытаний статинов при сепсисе. Таким образом, по-видимому, существует клинически значимое взаимодействие между обменом липидов и воспалительными путями, однако, имеющиеся явно противоречивые наблюдения указывают, что наше понимание проблемы недостаточно.

Механизмы, вовлеченные во взаимодействие между обменом липидов и септической воспалительной реакцией, также неясны. Богатые триглицеридами липопротеины вносят свой вклад, связываясь с фрагментами липополисахарида (LPS) и липотейхоевой кислоты (LTA) грамположительных и грамотрицательных патогенов, соответственно, которые далее интернализируются с помощью LDL рецептора и выводятся печенью, таким образом, потенциально уменьшая активацию макрофагов ^7-10. Некоторые экспрессируемые макрофагами рецепторы, модулирующие воспалительную реакцию, включая PPAR и LXR, активируются холестерином¹¹. Описано, что HDL усиливает ответы человеческих моноцитов на LPS с помощью подавления ингибиторной активности высоких концентраций LPS-связывающего белка (LBP), где аполипопротеин А-II, по-видимому, является активным компонентом¹². Статины оказывают многочисленные эффекты, которые могут вызывать иммуномодуляцию, включая уменьшение уровней С-реактивных белков¹³, уменьшение активации NF-κВ¹⁴ и усиление ответов эндотелиальных e-NOS, таким образом, уменьшая адгезию лейкоцитов в капиллярном кровообразении¹⁵ и рекрутирование лейкоцитов к месту инфекции¹⁶. Статины также ингибируют изопренилирование белков, включая фарнезилирование, что аннулирует проапоптические эффекты сепсиса на селезеночные лимфоциты¹⁷.

Описано, что мыши, нокаутные по LDL рецептору, защищены от летальной эндотоксемии и тяжелых грамотрицательных инфекций¹⁸. Однако были сделаны потенциально противоречивые наблюдения, где мыши, дефицитные по LDL рецептору, были описаны как более подверженные сепсису, вызываемому лигированием и пункцией слепой кишки (CLP) по сравнению с мышами идентичного генетического происхождения¹⁹. У мышей, нокаутных по LDL рецептору, были изменены некоторые воспалительные медиаторы. Перед CLP, у мышей, нокаутных по LDL рецептору, были повышены уровни сывороточного амилоидного белка А, липополисахарид-связывающего белка (LBP) и растворимого CD14 (sCD14). После CLP, у мышей, нокаутных по LDL рецептору, сильнее увеличивался уровень IL-1β по сравнению с контролем. В экспериментальных моделях мышиного сепсиса статиновая терапия²⁰ и терапия аполипопротеин A-1-мимикрирующим белком²¹, по-видимому, являются эффективными.

В итоге, было показано, что пути обмена липидов взаимодействуют с воспалительной реакцией, возможно, с клинически важными последствиями. Однако точные механизмы этих эффектов и влияют ли они на исход пациентов остается неизвестным.

Ингибиторы пропротеиновой конвертазы субтилизин кексин типа 9 (PCSK9) были в основном предложены для терапии гиперхолестеринемии и ассоциированного атеросклероза. Однако ингибиторы/сайленсеры PCSK9 так же были предложены для использования в терапиях раковых метастазов.

Сущность изобретения

Настоящая заявка отчасти основана на открытии, что уменьшение активности пропротеиновой конвертазы субтилизин кексин типа 9 (PCSK9) уменьшает воспалительную реакцию и улучшает физиологические последствия у субъектов - мышей и людей, имеющих воспалительную реакцию на инфекцию. В частности, у субъектов, на которых проводилось испытание, имелась одна или более воспалительная реакция на инфекцию из нижеперечисленных: сепсис, септицемия, пневмония, септический шок, синдром системной воспалительной реакции (SIRS), синдром острой дыхательной недостаточности (ARDS), синдром острого повреждения легких, инфекционная болезнь, панкреатит, бактериемия, перитонит, абсцесс брюшной полости, кишечная инфекция, оппортунистическая инфекция, ВИЧ/СПИД, эндокардит, бронхоэктазия, хронический бронхит, менингит, септический артрит, инфекция мочевых путей, пиелонефрит, некротизирующий фасцит, стрептококковая инфекция группы А, энтерококковая инфекция, грамположительный сепсис, грамотрицательный сепсис, сепсис с негативными культурами, грибковый сепсис, менингококкемия, эпиглоттит, инфекция, вызванная Е. coli 0157:Н7, газовая гангрена, синдром токсического шока, микобактериальный туберкулез, пневмоцистная пневмония, воспаление органов таза, легионелла-инфекция, инфекция, вызванная гриппом А, инфекция, вызванная вирусом Эпштейна-Барра или энцефалит. Также было обнаружено, что ингибирование PCSK9 приводило к снижению частоты почечной недостаточности, почечной дисфункции, дыхательной недостаточности, дыхательной дисфункции или синдрома острого повреждения легких в субъектах - людях. В частности, ингибирование PCSK9 может приводить к снижению частоты почечной недостаточности, почечной дисфункции, дыхательной недостаточности, дыхательной дисфункции или синдрома острого повреждения легких в субъектах - людях, которые находятся в состоянии сепсиса и септического шока.

В соответствии с первым аспектом изобретения, предлагается способ терапии воспалительной реакции на инфекцию, способ включает в себя: введение ингибитора пропротеиновой конвертазы субтилизин кексин типа 9 (PCSK9) нуждающемуся в этом субъекту.

В соответствии с другим аспектом изобретения, предлагается фармацевтическая композиция для терапии воспалительной реакции на инфекцию, включающая ингибитор PCSK9 и фармацевтически приемлемый носитель.

В соответствии с другим аспектом изобретения, предлагается ингибитор PCSK9 для терапии воспалительной реакции на инфекцию.

В соответствии с другим аспектом изобретения, предлагается использование ингибитора PCSK9 для терапии воспалительной реакции на инфекцию.

В соответствии с другим аспектом изобретения, предлагается использование фармацевтической композиции, содержащей в своем составе ингибитор PCSK9 и фармацевтически приемлемый носитель для терапии воспалительной реакции на инфекцию.

В соответствии с другим аспектом изобретения, предлагается использование ингибитора PCSK9 для получения лекарственного средства для терапии воспалительной реакции на инфекцию.

В соответствии с другим аспектом изобретения, предлагается коммерческая упаковка, включающая (а) ингибитор PCSK9; и (b) инструкцию по применению такового для терапии воспалительной реакции на инфекцию.

В соответствии с другим аспектом изобретения, предлагается коммерческая упаковка, включающая (а) фармацевтическую композицию, содержащую в своем составе ингибитор PCSK9 и фармацевтически приемлемый носитель; и (b) инструкцию по применению такового для терапии воспалительной реакции на инфекцию.

Ингибитором PCSK9 может быть антитело или его антигенсвязывающий домен. Ингибитором PCSK9 может быть моноклональное антитело или его антигенсвязывающий домен. Ингибитором PCSK9 может быть: AMG145; 1D05-IgG2; SAR236553/REGN727 (Alirocumab); RN-316; LGT209; или RG7652. Ингибитором PCSK9 может быть пептидомиметик. Ингибитором PCSK9 может быть миметик EGFA домена, EGF-A пептид, основанные на фибронектине белки с каркасным доменом или вариант, нейтрализующий PCSK9. Ингибитором PCSK9 может быть антисмысловой олигонуклеотид. Ингибитором PCSK9 может быть BMS-PCSK9Rx. Ингибитором PCSK9 может быть РНКи молекула. Ингибитором PCSK9 может быть LNA ASO или ALN-PCS. Ингибитором PCSK9 может быть любой ингибитор PCSK9, известный специалисту в данной области техники.

Субъект может быть человеком. Воспалительная реакция на инфекцию может быть одной или более из следующих: сепсис, септицемия, пневмония, септический шок, синдром системной воспалительной реакции (SIRS), синдром острой дыхательной недостаточности (ARDS), синдром острого повреждения легких, инфекционная болезнь, панкреатит, бактериемия, перитонит, абсцесс брюшной полости, кишечная инфекция, оппортунистическая инфекция, ВИЧ/СПИД, эндокардит, бронхоэктазия, хронический бронхит, менингит, септический артрит, инфекция мочевых путей, пиелонефрит, некротизирующий фасцит, стрептококковая инфекция группы А, энтерококковая инфекция, грамположительный сепсис, грамотрицательный сепсис, сепсис с негативными культурами, грибковый сепсис, менингококкемия, эпиглоттит, инфекция, вызванная Е. coli 0157:Н7, газовая гангрена, синдром токсического шока, микобактериальный туберкулез, пневмоцистная пневмония, воспаление органов таза, инфекция легионеллой, инфекция, вызванная гриппом А, инфекция, вызванная вирусом Эпштейна-Барра или энцефалит. У субъекта может быть септический шок. У субъекта может быть сепсис.

В соответствии с другим аспектом изобретения, предлагается способ терапии или предотвращения почечной недостаточности, почечной дисфункции, дыхательной недостаточности, дыхательной дисфункции или синдрома острого повреждения легких, включающий: введение ингибитора пропротеиновой конвертазы субтилизин кексинового типа 9 (PCSK9) нуждающемуся в этом субъекту.

У субъекта может быть воспалительная реакция на инфекцию. Ингибитор PCSK9 может быть отобран из одного или более следующих: антитело или его антигенсвязывающий домен; пептидомиметик; антисмысловой олигонуклеотид; РНКи молекула. Ингибитором PCSK9 может быть моноклональное антитело или его антигенсвязывающий домен. Ингибитором PCSK9 может быть: AMG145; 1D05-IgG2; SAR236553/REGN727 (Alirocumab); RN-316; LGT209; или RG7652. Ингибитором PCSK9 может быть миметик EGFA домена, EGF-A пептид, основанные на фибронектине белки с каркасным доменом или вариант, нейтрализующий PCSK9. Ингибитором PCSK9 может быть BMS-PCSK9RX. Ингибитором PCSK9 может быть LNA ASO или ALN-PCS. Субъектом может быть человек. Воспалительной реакцией на инфекцию может быть одна или более из следующих: сепсис, септицемия, пневмония, септический шок, синдром системной воспалительной реакции (SIRS), синдром острой дыхательной недостаточности (ARDS), синдром острого повреждения легких, инфекционная болезнь, панкреатит, бактериемия, перитонит, абсцесс брюшной полости, кишечная инфекция, оппортунистическая инфекция, ВИЧ/СПИЛ, эндокардит, бронхоэктазия, хронический бронхит, менингит, септический артрит, инфекция мочевых путей, пиелонефрит, некротизирующий фасцит, стрептококковая инфекция группы А, энтерококковая инфекция, грамположительный сепсис, грамотрицательный сепсис, сепсис с негативными культурами, грибковый сепсис, менингококкемия, эпиглоттит, инфекция, вызванная Е. coli 0157:Н7, газовая гангрена, синдром токсического шока, микобактериальный туберкулез, пневмоцистная пневмония, воспаление органов таза, легионелла-инфекция, инфекция, вызванная гриппом А, инфекция, вызванная вирусом Эпштейна-Барра, или энцефалит.

Также специалист в данной области техники должен учитывать, что субъект так же может быть оценен, для определения, несет ли он одну или более PCSK9 GOF или LOF аллель, как описанные в настоящем документе, что может повлиять на то, насколько экстренно субъекту будет назначен ингибитор PCSK9. Например, для субъекта, имеющего одну или более GOF аллель PCSK9, можно считать оправданным более раннее и более агрессивное лечение, чем для субъекта, имеющего LOF аллель PCSK9 аллель. Например, субъект, имеющий rs644000 G аллель (LOF), будет находиться под меньшим риском неблагоприятного исхода по сравнению с субъектом, имеющим rs644000 А аллель (GOF). Соответственно, субъект, имеющий rs644000 А аллель (GOF) или любую другую PCSK9 GOF аллель может быть подвергнут терапии ингибитором PCSK9 ранее, чем субъект, имеющий rs644000 G аллель (LOF) или любую другую PCSK9 LOF аллель. Однако результаты, представленные в настоящем документе, показывают, что оба субъекта, имеющие и GOF, и LOF аллель PCSK9, могли бы получить пользу от ингибирования PCSK9, если у субъекта есть воспалительная реакция на инфекцию.

Краткое описание графического материала

В графическом материале, который иллюстрирует варианты выполнения изобретения:

на фиг. 1 показано сравнение (А) индекса активности, (В) температуры тела ('С), (С) среднего артериального давления (мм рт. ст.) и фракции выброса (%) фенотипов между мышами линии-предшественника (C57BL/6 - дикий тип) и PCSK9-нокаутными мышами (PCSK9-/-), после введения LPS;

на фиг. 2 показаны кривые выживания для SPH и VASST субъектов по rs644000 генотипу;

на фиг. 3 показана таблица гаплотипов группы VASST, разрешенных с использованием PHASE²⁸, и показаны гаплотипы с МАР≥0.5%, где минорные аллель каждого SNP оттенены, где из 1324 суммарно наблюдаемых гаплотипов, LOF аллель наблюдалась 442 раза в 309 гаплотипах и 83.5% этих LOF аллелей содержались в гаплотипах, которые также содержали rs644000 минорную аллель (гаплотипы 6-9) и только 15.5% LOF аллелей содержались в гаплотипах с rs644000 мажорной аллелью (гаплотипы 3 и 4), что означает, что минорная аллель является маркером наиболее распространенного PCSK9 LOF генетического варианта (гаплотипы 8 и 9 содержали 2 LOF аллели, в отличие от PCSK9 GOF варианта, обнаруженного в гаплотипе, содержавшем rs644000 мажорную аллель (гаплотип 2));

на фиг. 4А показаны LOF KM кривые выживания VASST субъектов, где наличие хотя бы одной PCSK9 LOF аллели уменьшало смертность в течение 28 дней (LOFall=1, верхняя линия, n суммарно=306 с 89 смертями, 29.1% 28-дневная смертность) по сравнению с субъектами без LOF аллели (нижняя линия, n суммарно=326 со 129 смертями, 39.6% 28-дневная смертность) (р=0.0037 по логарифмическому ранговому критерию);

на фиг. 4 В показаны GOF KM кривые выживания VASST субъектов, где наличие хотя бы одной PCSK9 GOF аллели (GOFall=1, нижняя линия, n суммарно=57 с 25 смертями, 43.9% смертность на 28 день) увеличивало смертность в течение 28 дней по сравнению с субъектами, имеющими хотя бы одну PCSK9 LOF аллель, но ни одной GOF аллели (верхняя линия, n суммарно=293 с 83 смертями, 28.3% смертность на 28 день) (р=0.011 по логарифмическому ранговому критерию); и

на фиг. 5 показаны LOF КМ кривые выживания VASST субъектов, гетерозиготных по rs644000 для решения вопроса о том, была ли минорная аллель rs644000 (или другая SNP в высоко неравновесном сцеплении) способной к функции SNP, напрямую приводившей к улучшенному исходу или, альтернативно, rs644000 просто маркировала преобладание LOF аллели, проверяли эффект LOF аллели в rs644000 гетерозиготах (n=478), и rs644000 гетерозиготные субъекты VASST, имеющие как минимум одну PCSK9 LOF аллель (LOF=1, верхняя линия, n суммарно=253 с 73 смертями, 71.1% выживание на 28 день), имели уменьшенную 28-дневную смертность по сравнению с субъектами без LOF аллели (нижняя линия, n суммарно=225 с 85 смертями, 62.2% выживание на 28 день) (р=0.029 по логарифмическому ранговому критерию).

Подробное описание изобретения

В настоящем документе описаны различные альтернативные варианты выполнения и примеры. Эти варианты выполнения и примеры являются иллюстративными и не должны толковаться как ограничивающие объем изобретения.

Ввиду взаимодействия обмена липидов и воспалительных путей, в настоящей заявке было исследовано, изменяет ли PCSK9 системную воспалительную реакцию на инъекцию LPS у мыши. Было обнаружено, что PCSK9-нокаутные мыши имели уменьшенную воспалительную реакцию на LPS и были защищены от побочных аспектов физиологического фенотипа острой воспалительной реакции, по сравнению с контрольными мышами-предшественниками. Чтобы определить, может ли данное наблюдение иметь клинически значимые последствия, исследователи изучали генетический полиморфизм PCSK9 при сепсисе у человека. Генетические варианты PCSK9 были хорошо охарактеризованы, так что было возможно разбирать и сортировать некоторые распространенные варианты в известные варианты с прекращением функции (LOF) и сравнивать их с известными вариантами с приобретением функции (GOF). Варианты PCSK9 были генотипированы в двух группах субъектов с острым сепсисом и септическим шоком. В соответствии с результатами по LPS на мышах, люди, имеющие септический шок и несущие LOF варианты PCSK9, имели пониженный ответ воспалительных цитокинов и пониженную смертность, а у GOF вариантов были противоположные эффекты.

"Пропротеиновая конвертаза субтилизин кексин типа 9" или "PCSK9", как используется в настоящем документе, относится к важному белку, участвующему в метаболизме LDL холестерина (LDL-C). PCSK9 играет важную роль в деградации LDL рецептора (LDLR). В LDL метаболизме the LDLR связывает LDL из кровотока и интернализирует LDL в окаймленные клатрином ямки для лизосомальной деградации. После интернализирования LDL, LDLR далее возвращается обратно на плазматическую мембрану, где он может связывать новые молекулы LDL. Этот процесс постоянно повторяется. Однако деградация LDLR с помощью PCSK9 предотвращает возвращение LDLR на мембрану и, таким образом, уменьшает LDL клиренс из крови. Соответственно, PCSK9 является важной мишенью ингибирования для стимулирования понижения LDL-C и, таким образом, терапевтической мишенью для терапии гиперхолестеринемии и ассоциированных сердечно-сосудистых заболеваний. Кристаллическая структура PCSK9 была описана в PCT/US2008/056316. Также, РСТ/IB2004/001686 описывает мутации в гене PCSK9 человека, ассоциированные с гиперхолестеринемией. PCSK9 является частью пути метаболизма LDL-C.

Ген PCSK9 кодирует пропротеин, который был также назван which Narc 1, протеиназа, родственная протеиназе K³⁸. PCSK9 синтезируется как 74 КДа пропротеин, который претерпевает расщепление в эндоплазматическом ретикулюме, приводящее к секретированию ~14 КДа фрагмента и ~60 КДа фрагмента, удерживаемых вместе нековалентными связями^39,40. Дальнейшее автокаталитическое расщепление ~14 КДа фрагмента приводит пропротеин в активное состояние. Активный PCSK9 белок, циркулирующий в плазме, связывает LDL рецептор и, после интернализирования, предотвращает возвращение рецептора обратно на клеточную поверхность и ускоряет деградацию рецептора в лизосоме^41,42. Ингибирование PCSK9 приводит к пониженным уровням LDL холестерина у людей⁴³.

"Ингибитор пропротеиновой конвертазы субтилизин/кексин типа 9" или "ингибитор PCSK9", как используется в настоящем документе, должно относиться к любой молекуле, которая способна к понижению нормальной активности PCSK9 в организме субъекта сразу или через некоторое время после введения ингибитора. Такими ингибиторами могут быть антитела (включая моноклональные антитела), другие пептиды (например, миметик EGFA домена и EGF-A пептид, основанные на фибронектине белки с каркасным доменом, или вариант, нейтрализующий PCSK9 (например, с Pro/Cat доменом)). Альтернативно, ингибитором PCSK9 может быть молекула нуклеиновой кислоты (например, интерферирующая РНК (РНКи), малая интерферирующая РНК (siRNA), меродуплексная РНК (mdRNA), антисмысловой олигонуклеотид запертой нуклеиновой кислоты (LNA) и т.д.). Также ингибитором PCSK9 может быть малая молекула-ингибитор PCSK9.

'РНКи', как используется в настоящем документе, должна включать способы сайленсинга генов, известные в данной области техники, включая способы посттрансляционного сайленсинга генов (PTGS). Они могут включать, но не ограничены одним или более из следующих: микро-РНК (miRNA); малая интерферирующая (siRNA); короткая шпилечная РНК (shRNA); первичная микро-РНК (pri-miRNA); ассиметричная интерферирующие РНК (aiRNA); малая внутренне-сегментированная РНК (sisiRNA); меродуплексная РНК (mdRNA); РНК-ДНК химерный дуплекс; межцарственная РНК (tkRNA); tRNA-shRNA; тандемная siRNA (tsiRNA); тандемная шпилечная РНК (thRNA); pri-miRNA-мимический кластер; и транскрипционный сайленсинг генов (TGS).

"Моноклональное антитело" или "Mab", как используется в настоящем документе, должно относиться к антителу из, по существу гомогенной популяции антител (то есть к такой, где отдельные антитела идентичны друг другу, с возможным исключением для некоторых встречающихся в природе мутаций). MAbs высоко специфичны, будучи направленными против одного антигенного сайта и часто направлены против одной антигенной детерминанты.

"Гуманизированное" антитело, как используется в настоящем документе, должно относиться к формам нечеловеческих (например, мышиных) антител, которые являются химерными иммуноглобулинами, иммуноглобулиновыми цепями или фрагментами антител (такие as Fv, Fab, Fab', F(ab')2 или другими антиген-связывающими подпоследовательностями антител), которые содержат минимальную последовательность, извлеченную из нечеловеческого иммуноглобулина. Многие гуманизированные антитела являются человеческими иммуноглобулинами (реципиентное антитело), в которых остатки гипервариабельного участка (CDR) реципиента заменены на остатки CDR не человека, а другого вида (донорное антитело), такого как мышь, крыса или кролик, имеющие желаемую специфичность, сродство и активность.

Ингибиторы PCSK9

Приводимые в качестве примера ингибиторы PCSK9 описаны ниже.

Моноклональные антитела

Моноклональные антитела (MAbs), специфически связывающиеся с PCSK9, способны ингибировать активность PCSK9. В некоторых примерах, MAbs связываются рядом с каталитическим доменом, который взаимодействует с рецептором липопротеинов низкой плотности, рецептор (LDLR), приводя к ингибированию каталитической активности PCSK9 по отношению к LDLR. Некоторое количество таких MAbs находятся на стадии клинических исследований (например, AMG145 (Amgen), 1D05-IgG2 (Merck & Co.), и SAR236553/REGN727/Alirocumab (Aventis/Regeneron)). Похожим образом, другие MAbs, нацеленные против PCSK9, также находятся в разработке (например, RN-316 (Pfizer); LGT209 (Novartis); RG7652 (Roche/Genentech)). Некоторое количество антител-ингибиторов PCSK9 и их фрагментов описаны в следующей патентной литературе:

PCSK9-опосредованная активность в отношении расположенных на поверхности клетки LDLRs была обращена с использованием антител, распознающих эпитопы на PCSK9. В частности, в тех случаях, когда эпитопы ассоциированы с каталитическим доменом. Внутривенное введение моноклонального антитела Amgen (AMG145), специфичного к каталитическому домену PCSK9, приводило к значительному уменьшение уровней LDL-C в циркуляции уже через 8 часов после инъекции приматам, которые не являются человеком. Моноклональное антитело Merck & Co.'s (lD05-IgG2) структурно имитирует EGFA домен LDLR. Одиночная инъекция D05-IgG2 так же оказалась антагонизирующей функции PCSK9 в приматах, которые не являются человеком, приводя к уменьшению уровней LDL-C плазмы на значение до 50%. Pfizer-Rinat и Sanofi-Aventis/Regeneron так же имеют моноклональные антитела (RN316 и SAR236553/REGN727, соответственно), которые так же находятся на стадии клинических исследований.

Пептиды

Были разработаны пептиды, которые имитируют EGFA домен LDLR, которые связываются с PCSK9 с ингибированием PCSK9. Похожим образом, были разработаны EGF-A пептиды, основанные на фибронектине белки с каркасным доменом, которые связывают PCSK9, и вариант, нейтрализующий PCSK9s (например, с Pro/Cat доменом), и было показано, что все они ингибируют PCSK9 активность.

Некоторое количество пептидов-ингибиторов PCSK9 описаны в следующей патентной литературе:

Олигонуклеотиды

Антисмысловой олигонуклеотид к PCSK9 производства Isis Pharmaceuticals/Bristol-Myers Squibb (BMS-PCSK9Rx) был показан как увеличивающий экспрессию LDLR и уменьшающий суммарные уровни холестерина в циркуляции мышей.

Схожим образом, запертая нуклеиновая кислота производства Santaris Pharma (LNA ASO) уменьшала уровни PCSK9 mRNA у мышей. LNA ASO, комплементарная человеческой и мышиной мРНК PCSK9 (номера доступа NM174936 и NM153565), является химерным олигонуклеотидом длиной в 13 нуклеотидов со следующей последовательностью: GTctgtggaaGCG (заглавные - LNA, прописные - ДНК) и фосфоротиоатными связями между нуклеотидами.

Alnylam Pharmaceuticals показали положительные результаты клинических исследованиях siRNA (ALN-PCS) для ингибирования PCSK9. siRNA встраивали в липидные наночастицы для уменьшения токсичности и внутривенно вводили крысам, мышам и обезьянам, что приводило к уменьшению уровней LDL-C после введения.

Некоторое" количество олигонуклеотидов-ингибиторов PCSK9 описаны в следующей патентной литературе

Малые молекулы

Serometrix сообщали о малой молекуле-ингибиторе PCSK9 (SX-PCSK9)⁵³. Схожим образом, берберин был описан в качестве примера, который может быть использован как ингибитор PCSK9.

Системное воспаление

"Воспалительная реакция на инфекцию", как используется в настоящем документе, может быть одной или более из следующих: сепсис, септицемия, пневмония, септический шок, синдром системной воспалительной реакции (SIRS), синдром острой дыхательной недостаточности (ARDS), синдром острого повреждения легких, инфекционная болезнь, панкреатит, бактериемия, перитонит, абсцесс брюшной полости, кишечная инфекция, оппортунистическая инфекция, ВИЧ/СПИД, эндокардит, бронхоэктазия, хронический бронхит, менингит, септический артрит, инфекция мочевых путей, пиелонефрит, некротизирующий фасцит, стрептококковая инфекция группы А, энтерококковая инфекция, грамположительный сепсис, грамотрицательный сепсис, сепсис с негативными культурами, грибковый сепсис, менингококкемия, эпиглоттит, инфекция, вызванная Е. coli 0157:Н7, газовая гангрена, синдром токсического шока, микобактериальный туберкулез, пневмоцистная пневмония, воспаление органов таза, легионелла-инфекция, инфекция, вызванная гриппом А, инфекция, вызванная вирусом Эпштейна-Барра, или энцефалит.

"Осложнения, ассоциированные с воспалительной реакцией на инфекцию" могут быть следующими: почечная недостаточность; почечная дисфункция; дыхательная недостаточность; дыхательная дисфункция; или синдром острого повреждения легких. Ингибитор PCSK9 может быть использован для терапии или предупреждения, или уменьшения интенсивности любых осложнений, ассоциированных с воспалительной реакцией на инфекцию, например, почечной недостаточности; почечной дисфункции; дыхательной недостаточности; дыхательной дисфункции; или синдрома острого повреждения легких.

"Терапия", как используется в настоящем документе, должна включать терапию или предотвращение, или уменьшения интенсивности заболевания, или патологического состояния, или симптома.

"Синдром системной воспалительной реакции" или "SIRS", как используется в настоящем документе, определяется как включающий как и септическую (то есть сепсис или септический шок), так и несептическую системную воспалительную реакция (то есть послеоперационную). "SIRS" далее определяется, в соответствии с рекомендациями АССР (American College of Chest Physicians), как наличие двух или более из А) температура >38°C или <36°C, В) частота сердечных сокращений >90 ударов в минуту, С) частота дыхательных движений >20 вдохов в минуту, и D) уровень лейкоцитов в крови >12,000 мм³ или <4,000 мм³.

"Сепсис" определяется как наличие как минимум двух критериев "SIRS" и известного или подозреваемого источника заражения. Септический шок определялся как сепсис плюс одна новая органная недостаточность по Брюссельскому критерию, плюс необходимость сосудосуживающей терапии.

Префикс "rs" обозначает SNP в базе данных, который может быть найден в NCBI SNP база данных. Номера "rs" являются NCBI|rsSNP идентификаторной формой.

Материалы и методы

Мыши

Все эксперименты на животных были одобрены комитетом по этике отношений к животным Университета Британской Колумбии и согласованы с рекомендациями NIH и руководства по содержанию и использованию лабораторных животных.

Самцы C57BL/6 (контрольная линия предшественников) и PCSK9-нокаутные мыши (B6:129S6-Pcsk9tmlJdh/J), масса тела 25-30 граммов, в возрасте 10-14 недель получали от Jackson Labs™. По сравнению с контрольной линией предшественников, PCSK9-нокаутные мыши имели пониженные концентрации холестерина в плазме с практически недетектируемыми концентрациями LDL холестерина. О других заметных отклонениях фенотипа не сообщалось.

Липополисахарид-индуцированное системное воспаление

Уровень активности, температуру тела, артериальное давление и сердечную деятельность (эхокардиография) здоровых мышей определяли на исходном уровне (время 0), как описано ниже. Далее, мышам проводили внутрибрюшную инъекцию LPS (20 мг/кг, Е. coli линия 01 II: В4, Sigma™, St. Louis, МО). Эта дозировка была определена из предшествующих экспериментов, в линии-предшественнике (C57BL/6) мышей, LPS 20 мг/кг, доставляемая внутрибрюшинно, была наименьшей дозировкой, которая являлась летальной в течение 12 часов во всех случаях²⁴. Далее, уровень активности и температура измерялись каждый час в течение шести часов. На шестом часу артериальное давление измеряли с помощью инвазивной артериальной катетеризации и заново определяли сердечную деятельность (эхокардиографией).

Физиологическая оценка мышей

Индекс активности: за мышами наблюдали в течение 2 минут для определения положения тела и активности. 0 (норма) отражает, что не было моментов со съеженным положением тела и у мыши были спонтанные быстрые движения, вперемежку с кормлением и потреблением жидкости. 1 (легкое) - нерегулярные короткие промежутки времени (5-20 секунд) со съеженным положением тела, которое спонтанно возвращалось к нормальному с продолжающимися спонтанными быстрыми движениями, вперемежку с кормлением и потреблением жидкости. 2 (легкое-умеренное) - более долгие промежутки времени (>20 секунд) со съеженным положением тела, которое спонтанно возвращалось к нормальному с продолжающимися спонтанными быстрыми движениями, вперемежку с кормлением и потреблением жидкости. 3 (умеренно-тяжелое) - практически постоянно в съеженном положении тела с движениями только при воздействии сильного внешнего раздражителя. 4 (тяжелое) - постоянно в съеженном положении тела без движений. Были использованы интервалы значений 0.5, когда мышь демонстрировала два различных уровня в течение периода одного осмотра.

Температура: температуру измеряли каждый час с использованием инфракрасного термометра (IR-101 La Crosse Technology, La Crosse USA), который держали на расстоянии 2-3 мм от живота.

Артериальное давление: на исходном уровне (время 0) среднее артериальное давление определяли с использованием неинвазивной хвостовой манжеты (CODA 2™, Kent Scientific, Torrington, USA). Через шесть часов после инъекции LPS, мышей анестезировали с использованием вдыхаемого изофлурана (1-3%). После небольшой лапаратомии, брюшную аорту пунктировали с использованием иглы 27 калибра, а потом вводили в аорту Французский микроманометр-катетер номер 2 (Mikro-tip SPR-838™, Millar Instruments Inc., Houston, TX). Среднее артериальное давление определяли с использованием программного обеспечения (PVAN 2.9™, Millar Instruments Inc.).

Эхокардиография: мышей легко анестезировали с использованием вдыхаемого изофлурана (1-3%) и помещали на согревающее покрытие. Эхокардиограммы в М режиме (ECHO) нацеливали с помощью 2D эх, полученных с использованием Vevo 770 ECHO (Visualsonics™, Toronto, ON, Canada), работающего на частоте 120 Гц. Были получены двумерные эхокардиографические снимки левой парастернальной левого желудочка. Положение и угол эхо-преобразователя поддерживались направлением луча неподалеку от верхнего конца передней створки митрального клапана и поддержанием внутренних анатомических ориентиров в постоянном положении. Все измерения получали от записей в М режиме в конце выдыхания. Внутренние размеры левого желудочка определяли в конце диастолы (определяли как начало QRS комплекса в отведении II одновременно получаемой электрокардиограммы) и в конце систолы (определяли как наименьшие внутренние размеры желудочка).

Множественный цитокиновый тест: плазму разводили в 0-50 раз для того, чтобы убедиться в том, что все измерения лежат в пределе тестового интервала, и вносили по 50 мкл в лунку микропланшета в двух повторах для LUM000 микропланшета mouse base kit (R&D Systems™, Minneapolis, MN), и далее следовали протоколу по инструкции производителя. Каждый образец измеряли в повторе. Микропланшеты анализировали с помощью Luminex100™ с сопутствующим программным обеспечением 1.7 (Luminex Corporation™, Austin, ТХ). Цитокины были отобраны для отображения раннего воспаления (TNFα), неспецифичный воспалительный маркер (IL-6), противовоспалительный маркер (IL-10), и типичные представители СС хемокинов (JE как мышиный гомолог человеческого МСР-1) и СХС хемокинов (MIP-2 и КС, которые являются мышиными гомологами человеческого IL-8).

Изучение генетических ассоциаций человека

Группа с депривациями госпиталя Св. Павла(SPH). Всех пациентов, которые были госпитализированы в ICU в госпитале Св. Павла в Ванкувере, Канада между июлем 2000 г. и январем 2004 г., скринировали и из них 601 субъект был классифицирован как имеющий септический шок и имеющий доступную ДНК. Септический шок определялся как наличие двух или более диагностических показателей синдрома системной воспалительной реакции, доказанной или подозреваемой инфекции, новой недостаточности как минимум одного органа и гипотензии, несмотря на адекватную регидратацию²⁵. Двенадцать субъектов были исключены, т.к. они были включены в VASST группу (см. ниже), что оставило 589 субъектов для дальнейших исследований. Критерии включения и клиническое фенотипирование описаны в другом месте²⁶. Наблюдательный совет института в госпитале Св. Павла и Университет Британской Колумбии одобрили исследование.

Также каждый из субъектов, наблюдаемых в исследовании, имел воспалительную реакцию на инфекцию. Соответственно, каждый из субъектов имел одно или более из следующего: сепсис, септицемия, пневмония, септический шок, синдром системной воспалительной реакции (SIRS), синдром острой дыхательной недостаточности (ARDS), синдром острого повреждения легких, инфекционная болезнь, панкреатит, бактериемия, перитонит, абсцесс брюшной полости, кишечная инфекция, оппортунистическая инфекция, ВИЧ/СПИД, эндокардит, бронхоэктазия, хронический бронхит, менингит, септический артрит, инфекция мочевых путей, пиелонефрит, некротизирующий фасцит, стрептококковая инфекция группы А, энтерококковая инфекция, грамположительный сепсис, грамотрицательный сепсис, сепсис с негативными культурами, грибковый сепсис, менингококкемия, эпиглоттит, инфекция, вызванная Е. coli 0157:Н7, газовая гангрена, синдром токсического шока, микобактериальный туберкулез, пневмоцистная пневмония, воспаление органов таза, легионелла-инфекция, инфекция, вызванная гриппом А, инфекция, вызванная вирусом Эпштейна-Барра или энцефалит.

Валидационная группа по исследованию вазопрессин и септического шока (VASST). VASST была многоцентровым, рандомизированный, двойным слепым, контролируемым исследованием, оценивавшим эффективность вазопрессина по сравнению с норэпинефрином в 779 субъектах, которые имели септический шок, как определено выше²⁵, и сосудосуживающей инфузии не менее 5 мкг/мин норэпинефрина или эквивалент²⁷. Критерии включения и клиническое фенотипирование описаны в другом месте²⁷. ДНК была доступна от 616 субъектов. Исследовательские советы по вопросам этики всех участвующих организаций одобрили это исследование, и было получено письменное информированное согласие от всех субъектов или от их уполномоченных представителей. Исследовательский совет по вопросам этики в координирующем центре (Университет Британской Колумбии) одобрил проведение генетических исследований.

Генотипирование и выбор SNP: ДНК выделяли из лейкоцитной пленки отобранных проб крови с использованием QIAamp DNA™ maxi набора (Qiagen™, Mississauga, ON, Canada) (SPH группа) или QIAamp DNA Blood Midi Набор™ (Qiagen™) (VASST группа). Генотипирование маркерного SNP проводили с помощью Illumina Golden Gate™ теста (Illumina Inc., San Diego, CA). Чтобы выбрать начальные маркерные SNP в PCSK9 для генотипирования исследователи сначала разделяли гаплотипы с использованием PHASE²⁸, примененного к массивному генотипированию PCSK9 в CEU, предоставленное SeattleSNPs. Акт кроссинговера заметен приблизительно в центре гена, в результате чего требуется большое количество маркерных SNP для разрешения всех возможных гаплотипов. Для упрощения генотипирования, ограничивали выбор маркерных SNP тремя парами оснований, расположенных на 3'-конце гена, и еще одной парой оснований в 5'- стороне от акта кроссинговера. Задавали вес выбранным маркерным SNP внутри каждой пары оснований с помощью вероятности успешного исхода генотипирования, предоставленной Illumina для Golden Gate™ теста. Соответственно, PCSK9 маркерные SNP, генотипированные в обеих группах септическиго шока, были rs644000, rs2479408, rs2479409 и rs572512. Впоследствии, дополнительные известные SNP с прекращением функции (LOF) (rs11591147 R46L, rs11583680 A53V, rs562556 V474I) и известный SNP с приобретением функции (GOF) (rs505151 G670E) были генотипированы в группе VASST как часть генотипирования всего генома с использованием Illumina Human lM-Duo™ платформы для генотипирования (Illumina Inc.).

Первичные и вторичные исходы: первичным исходом была 28-дневная смертность. Вторичные исходы включают измерения органной недостаточности, которые рассчитывали как дни в живых в отсутствии недостаточности ²⁹. Оценивали сердечно-сосудистую, дыхательную, почечную, общую гематологическую, печеночную и неврологическую недостаточность, равно как необходимость в сосудосуживающей терапии, искусственной вентиляции легких и заместительной почечной терапии. Мы также оценивали системную воспалительную реакцию с помощью измерения уровней цитокинов плазмы в 278 субъектах из группы VASST на исходном уровне и через 24 часа после включения в VASST.

Измерения цитокинов: человеческие мультиплексные тесты (EMD Millipore™) использовались в соответствии с рекомендациями производителя с модификациями, описанными ниже. Вкратце, образцы смешивали с магнитными бусинами, связанными с антителом, в 96-луночном планшете и инкубировали в течение ночи при 4°С с встряхиванием. Планшеты дважды промывали промывным буфером в устройстве для отмывки Biotek ELx405™. После инкубации в течение одного часа при комнатной температуре с биотинилированным идентифицирующим антителом, добавляли стрептавидин-РЕ на 30 минут с встряхиванием. Планшеты промывали, как описано выше, и добавляли в лунки PBS для считывания на Luminex 200™ (Illumina Inc.) с нижней граничной оценкой в 100 бусин на образец на цитокин. Каждый образец измеряли в повторе. Для соответствия измерениям мышиных цитокинов, отбирали цитокины для отображения раннего воспаления (TNFα), неспецифичный воспалительный маркер (IL-6), противовоспалительный маркер (IL-10) и типичные представители СС хемокинов (МСР-1) и СХС хемокинов (IL-8).

Статистический анализ: использовали дисперсионный анализ повторных изменений для определения различий в уровнях активности, температуры и фракции выброса между PCSK9-нокаутными мышами и контрольной линией предшественников во времени. Использовали двухвыборочный t-критерий для независимых выборок для определения различий в среднем артериальном давлении, т.к. эта переменная измерялась с использованием двух различных приборов на исходном уровне и через 6 часов после введения LPS.

Для человеческого септического шока в основном анализе использовали логистическую регрессию для определения риска смертности в зависимости от PCSK9 генотипа, включающую ковариантность возраста, пола, европеоидную расу и хирургический против медицинского первичного диагноз в статистическую модель. Мы определяли различия в концентрациях цитокинов от генотипа с использованием дисперсионного анализа повторных изменений. Одномерные анализы проводили с помощью проверки на соответствие критерию хи-квадрат для качественных данных и, для непрерывных данных, с помощью критерия либо Крускала-Уоллиса или однофакторного дисперсионного анализа. Популяции исследовали на соответствие закону Харди-Вайнберга с помощью проверки на соответствие критерию хи-квадрат. Все критерии были двусторонне ограниченными. Различия считались значимыми, если Р<0.05. Все тесты проводились с использованием R (версия 2.8.1, www.R-project.org) и SPSS™ version 16.0 (SPSS Inc, Chicago, IL) пакета статистического программного обеспечения.

ПРИМЕРЫ

ПРИМЕР 1: PCSK9-нокаутные мыши имеют сниженный ответ на LPS

Через шесть часов после LPS инъекции все 10 C57BL/6 мышей из контрольной линии предшественников демонстрировали постоянное съеженное положение тела и не передвигались, несмотря на сильные внешние раздражители (индекс активности 4/4). В то же время PCSK9-нокаутные мыши имели средний индекс активности of 2.40±0.90 (р<0.05 против С57 мышей), соответствующий максимум 20-30 секундам съеженного положения тела, которое спонтанно обращалось в нормальное с возобновляющимися спонтанными быстрыми движениями вперемежку с кормлением и потреблением жидкости (фиг. 1А). Сравнение средних значений для каждой группы показывает статистически значимый эффект (* р<0.05) в течение с 3 по 6 часов, когда обычно индекс активности более 3.5 отражает терминальное состояние.

Контрольная линия предшественников мышей (C57BL/6) демонстрировала прогрессирующую потерю температуры тела в течение шести часов после введения LPS, такую, что 6 из 10 мышей имели температуру тела <32°С, и среднее групповое значение температуры через шесть часов было 30.5±2.8°С (фиг. 1B), тогда как ни у одной из 10 PCSK9-норкаутных мышей температура не упала ниже 32°С и среднее групповое значение температуры было 35.2±1.8°С (р<0.05 PCSK9 нокаут против контрольной линии предшественников). Сравнение средних групповых значений демонстрирует статистически значимый эффект (р<0.05) в течение часов 5 и 6, когда обычно поддерживаемая температура менее 32°С отражает терминальное состояние.

LPS вызывал острое понижение среднего артериального давление и левой желудочковой фракции выброса (LVEF) в течение часов в C57BL/6 контрольной линии мышей предшественников^24,30. Как показано в таблице 1А и на фиг. 1С, в контрольной линии мышей предшественников среднее артериальное давление уменьшалось от 120±5 мм рт.ст .до 63±11 мм рт.ст. через шесть часов после введения LPS. PCSK9-нокаутные мыши имели схожее среднее артериальное давление на исходном уровне во время 0 (110±6 мм рт. ст.), но демонстрировала гораздо более слабое уменьшение среднего артериального давления через 6 часов после введения LPS (75±15 мм рт.ст.) по сравнению с контрольной линией мышей предшественников (Р<0.05) (таблица 1А). Похожие результаты были получены, когда сравнивали фракции выброса (EF) (%) (см. фиг. 1D).

По сравнению с результатами LPS-обработанных LDLR-/- мышей, так же обработанных либо физиологическим раствором, либо берберином, были выявлены минимальные различия между мышами, обработанными физиологическим раствором или берберином (таблица 1 В). Эти данные не противоречат гипотезе о том, что преимущество, полученное от ингибирования PCSK9, является результатом увеличенной доступности LDLR и, как следствие, уменьшения LDL плазмы.

Как определено трансторакальной эхокардиографией, левая желудочковая фракция выброса значительно уменьшилась по сравнению с исходным уровнем (57±6.2%) через шесть часов после введения LPS (32±4.9%, р<0.05) в контрольной линии предшественников мыши. Напротив, у PCSK9-нокаутных мышей левая желудочковая фракция выброса была схожа с контрольной линией мышей предшественников на исходном уровне (54±6.8%), но гораздо слабее уменьшалась через шесть часов после введения LPS (44±8.8%, р<0.05 по сравнению с контрольной линией мышей предшественников).

PCSK9-нокаутные мыши имели сниженный ответ воспалительных цитокинов на LPS

В соответствии с наблюдениями за воспалительным фенотипом, PCSK9-нокаутные мыши так же демонстрировали пониженный ответ воспалительных цитокинов, определяемых в плазме через 6 часов после инфузии LPS (таблица 2). Более конкретно у PCSK9-нокаутных мышей была статистически более низкая медианная концентрация JE в плазме, примерно 25000±11000 пг/мл по сравнению с контрольной линией мышей предшественников(37000±9200 пг/мл) через 6 часов после введения LPS (Р<0.05). МIР-2 также была уменьшена у PCSK9-нокаутных мышей с медианной концентрацией 54000±13000 против 63000±6500 пг/мл в контрольной линии предшественников (Р<0.05). Не наблюдалось отличий в MFI между обработанных PCSK9-нокаутными мышами и контрольной линией предшественниковз в отношении JE и MIP-2 у мышей, обработанных физиологическим раствором (таблица 2).

Пример 2: генотип pcsk9 ассоциирован со смертностью у людей

С использованием четырех отобранных маркерных для гаплотипов SNP, было обнаружено, что генотип PCSK9 у людей был значительно ассоциирован со смертностью (таблица 3). Никаких устойчивых и значимых различий характеристик в этих двух группах, которые могли бы исказить этот результат, на исходном уровне не было обнаружено (таблица 4). В частности, минорная G аллель rs644000 A/G была сильно ассоциирована с пониженной смертностью в течение 28 дней как в SPH группе (р<0.0045), так и в VASST группе (0.0044) (таблица 5 и фиг. 2). В соответствии с этим наблюдением, также было обнаружено, что G аллель rs644000 была ассоциирована с пониженной недостаточностью сердечно-сосудистой, дыхательной, почечной и печеночной органных систем и склонностью к более выраженной неврологической и общей гематологической недостаточности (как отображено пониженным количеством дней в живых и без органной недостаточности в таблице 6). Также была обнаружена значительно увеличенная потребность в использовании сосудосуживающей терапии, искусственной вентиляции легких и заместительной почечной терапии (таблица 6). Результаты, представленные в таблице 6, показывают, что дыхательная недостаточность происходила у субъектов с острой инфекцией и коррелировала с rs644000 генотипом.

Человеческие варианты PCSK9 с прекращением функции и с приобретением функции

Человеческий ген PCSK9 хорошо охарактеризован и некоторые относительно распространенные миссенс-варианты³¹ (частота минорной аллели [MAF]≥0.5%) и большое количество малораспространенных миссенс и нонсенс-вариантов³², ассоциированных с понижением уровней LDL, были идентифицированы^32-34 как индикаторы прекращения функции (LOF) PCSK9 (фиг. 3). Взаимосвязь между уровнями LDL и генотипом PCSK9 так же была идентифицированы с использованием объективного GWAS подхода³⁵. Один относительно распространенный миссенс-вариант³⁶ и большое количество малораспространенных миссенс-вариантов^{31, 37}были найдены ассоциированными с увеличенными уровнями LDL и, основываясь на этой, рассматриваются вариантами с приобретением функции (GOF) (фиг. 3). Соответственно, генотипировали относительно распространенные PCSK9 LOF варианты (МАР≥0.5%, rs11591147 R46L, rs11583680 A53V, rs562556 V474I) и относительно распространенный PCSK9 GOF вариант (rs505151 G670E) в VASST группа.

Было обнаружено, что LOF аллели rs11591147, rs11583680 и rs562556 все преимущественно изолированы от минорной G аллели использованного маркерного SNP rs644000 (фиг. 3). Из суммарно 1324 обнаруженных гаплотипов, LOF аллель была обнаружена 442 раза в составе 309 гаплотипов. 83.5% этих LOF аллелей содержались в составе гаплотипов, также содержащих rs644000 минорную G аллель. Только 15.5% LOF аллелей содержались в составе rs644000 мажорной А аллели гаплотипов. Таким образом, минорная аллель rs644000 является маркером наиболее распространенных PCSK9 LOF генетических вариантов. Наоборот, относительно распространенный GOF вариант был преимущественно изолирован от мажорной А аллели rs644000 (фиг. 3). 95.2% этих GOF аллелей содержались в составе гаплотипов, также содержащих rs644000 мажорную А аллель. Только 4,8% этих GOF аллелей содержались в составе rs644000 минорной G аллели гаплотипов. Таким образом, в целом, минорная аллель rs644000 преимущественно ассоциирована с LOF аллелью и мажорная аллель rs644000 преимущественно ассоциирована с GOF аллелью известных относительно распространенных генетических вариантов PCSK9. Чтобы понять, является ли PCSK9 rs644000 высоко ассоциированной с исходом субъекта, т.к. она или SNP в высоко неравновесном сцеплении (LD) с ней является функциональным SNP или, наоборот, являются ли ассоциированные LOF и GOF варианты наиболее вероятными функциональными SNP, LOF и GOF варианты для начала изучали по отдельности.

Было обнаружено, что субъекты из VASST, имеющие по меньшей мере один PCSK9 LOF аллель, имели пониженную смертность в течение 28 дней (29.1% 28-дневная смертность, фиг. 4А) по сравнению с субъектами, не имеющими LOF аллель (39.6% 28-дневная смертность, фиг. 4А) (р=0.0037 по логарифмическому ранговому критерию). С использованием логистической регрессии для идентификация и сглаживания потенциально значимых ковариаций, было обнаружено, что наличие хотя бы одной PCSK9 LOF аллели остается статистически значимым (Р<0.009) (таблица 7).

Количество гаплотипов, содержащих GOF вариант (n=59+3 редких=62 на фиг. 3), было меньше, чем количество гаплотипов, содержащих по меньшей мере один из трех LOF вариантов (суммарное n=108+136+54+6+5 редких=309 на фиг. 3). Следовательно, не ожидалось, что будет обнаружен статистически значимый эффект GOF варианта, однако была заинтересованность в определении того, являются GOF эффекты прямо противоположными LOF эффектам. В самом деле, было обнаружено, что субъекты в VASST, имеющие GOF вариант, имели прямо противоположные эффекты, по сравнению с LOF вариантами; имели повышенную смертность в течение 28 дней (43.9% 28-дневная смертность, фиг. 4B) по сравнению с субъектами с LOF вариантом (28.3% 28-дневная смертность, фиг. 4В) (р=0.011 по логарифмическому ранговому критерию). Логистическая регрессия, сглаживающая потенциально значимые ковариации, так же идентифицировала повышенную смертность у субъектов, имеющих PCSK9 GOF вариант (р=0.031) (таблица 7).

Для дальнейшего различения между первичными эффектами rs644000 (или SNP в LD) и первичными эффектами LOF вариантов, было заключено, что если первичный эффект обусловлен rs644000 и не обусловлен LOF вариантами, тогда анализ, отбирающий только гетерозиготы по rs644000 (таким образом, сохраняющий генетическое окружение rs644000 постоянным), исключил бы LOF эффекты. Однако было обнаружено, что LOF варианты сохранили статистически значимый эффект по уменьшению смертности даже в этих отобранных субъектах (фиг. 5). Эти rs644000 гетерозиготные субъекты в VASST, имеющие по крайне мере одну PCSK9 LOF аллель, имели уменьшенную смертность (28.9% 28-дневная смертность) по сравнению с субъектами, не имеющими LOF аллель (37.8% 28-дневная смертность) (р=0.029 по логарифмическому ранговому критерию). Таким образом, из этого следует, что эффект смертности, вероятнее всего характерен для LOF вариантов (и GOF вариантов, а не связан с первичным эффектом rs644000. Наиболее вероятно, rs644000 просто являлся маркером преобладания LOF вариантов, ассоциированных с минорной G аллелью rs644000, и GOF варианта, практически исключительно ассоциированного с мажорной А аллелью of rs644000.

PCSK9-нокаутные мыши, при сравнении с контролями генетического окружения, были защищены от побочных эффектов введения LPS, которое является важной доклинической моделью системной воспалительной реакции, имеющей отношение к сепсису и септическому шоку. PCSK9-нокаутные мыши продемонстрировали эффективную аугментацию побочных эффектов LPS на активность и температуру тела, так же как и на побочные LPS-индуцируемые сердечно-сосудистые фенотипы гипотензии и уменьшенной левой желудочковой фракция выброса. PCSK9-нокаутные мыши так же продемонстрировали снижение в ответе воспалительных цитокинов плазмы на введение LPS. Нокаутирование PCSK9 зарекомендовало себя как защищающее от важных и распространенных побочных эффектов LPS. Так же, чтобы определить, являлся ли вклад PCSK9 значимым у субъектов - людей, был применен подход маркерных SNP, где хорошо охарактеризованные генетические варианты с прекращением функции (LOF) и с приобретением функции (GOF) PCSK9 были использованы схожим образом с PCSK9-нокаутными мышами. В настоящем документе показано, что генотип PCSK9 маркерного SNP, rs644000, был высоко ассоциирован с 28-дневной смертностью в группе септического шока SPH и этот результат воспроизвелся в группе септического шока VASST. В настоящем документе также показано, что LOF миссенс-варианты были ассоциированы с уменьшенной 28-дневной смертностью, тогда как GOF миссенс-варианты были ассоциированы с увеличенной 28-дневной смертностью. Все три довольно распространенных LOF варианта (MAF≥0.5%) были, по большей части, обнаружены в составе гаплотипов, маркированных минорной аллелью rs644000, и довольно распространенный GOF вариант был так же практически эксклюзивно обнаружен в составе гаплотипов, маркированных мажорной аллелью rs644000, что, наиболее вероятно, объясняет сильную ассоциацию минорной G аллели of rs644000 с уменьшенной 28-дневной смертностью. Также, было обнаружено, что концентрации воспалительных цитокинов и хемокинов плазмы были повышены у субъектов, имеющих GOF варианты, по сравнению с теми, которые имели LOF варианты. Эти результаты по септическому шоку у человека хорошо согласуются с мышиной моделью системного воспаления, указывая на то, что уменьшенная PCSK9 активность приводит к сниженному ответу воспалительных цитокинов и увеличенному выживанию. Эти результаты поддерживают вывод о том, что уменьшение активности PCSK9 уменьшает воспалительную реакцию и улучшает физиологические последствия у мышей после введения LPS и так же увеличивает выживание и уменьшает почечную недостаточность или почечную дисфункцию у субъектов - людей, с острым сепсисом и септическим шоком.

LOF и GOF мутации PCSK9

Многие мутации в гене PCSK9 уже были хорошо описаны³¹ и их функциональные эффекты охарактеризованы^40,44. LOF мутации приводят к уменьшенному удалению LDL рецептора и, в результате этого, уменьшению концентраций LDL холестерина плазмы. Предположительно, LOF мутации могли бы схожим образом влиять на другие рецепторы, регулируемые PCSK9, включая рецептор липопротеинов очень низкой плотности, - ApoER2 и CD81. Было обнаружено три довольно распространенных (MAF>0.5%) LOF варианта. Миссенс-вариант rs11591147 приводит к замене R46L, которая неизменно ассоциирована с низкими уровнями LDL холестерин и, следовательно, является LOF вариантом^{31, 32, 45}. Этот вариант приводит к улучшенным исходам субъекта при атеросклеротических заболеваниях⁴⁶. Похожим образом, rs11583680 A53V является распространенным и описан как LOF вариант³¹. Миссенс-вариант rs562556 приводит к V474I замене, что является причиной пониженного уровня суммарного холестерина и LDL холестерина⁴⁷. Наоборот, GOF варианты приводят к уменьшенному количеству LDL рецепторов на клеточной поверхности гепатоцитов и, в результате, увеличенным уровням LDL холестерина плазмы, с сопутствующим увеличением атеросклероза и сердечно-сосудистых заболеваний⁴⁸. Некоторые генетические варианты PCSK9 могут приводить к LOF или GOF, влияя на сродство, с которым PCSK9 связывается с LDL рецептором, с некоторыми вариантами, демонстрирующими многократное увеличение в сродстве по сравнению с PCSK9 дикого типа⁴⁰. Другие генетические варианты могут влиять на деградацию белка PCSK9, как увеличивая, так и уменьшая время полужизни PCSK9⁴⁹.

PCSK9 в воспалении и инфекции

PCSK9 приводит к позитивной регуляции генов, вовлеченных в биосинтез стеролов и к угнетающей регуляции генов, реагирующих на стресс, и специфических воспалительных путей⁵⁰. PCSK9 обладает проапоптическими эффектами⁵¹. Концентрации PCSK увеличены у субъектов, имеющих пародонтные инфекции; в одном исследовании, концентрации PCSK9 у субъектов с периодонтитом были значительно выше, чем у здоровых контрольных субъектов⁵². Labonte и коллеги обнаружили антивирусный эффект циркулирующего PCSK9 печеночного происхождения на вирус гепатита С в клетках и показали, что PCSK9 оказывает угнетающую регуляцию на уровень экспрессии печеночного CD81 у мышей in vivo. Было показано, что клетки, экспрессирующие PCSK9, резистентны к инфицированию вирусом гепатита С. Также добавление очищенного PCSK9 к кондиционированной среде клеточной культуры препятствовало инфицированию вирусом гепатита С дозозависимым образом.

Результаты по септическому шоку у людей во многом согласуются с мышиной моделью системного воспаления. Следовательно, заключается, что уменьшенная PCSK9 активность приводит к аугментации побочных последствий системного воспаления, включая побочные сердечно-сосудистые эффекты (гипотензия, уменьшенная левая желудочковая фракция выброса у мышей; сердечно-сосудистая органная недостаточность и необходимость в применении сосудистых препаратов у людей), побочные общие фенотипы (активность и температура тела у мышей; полиорганная недостаточность у людей), аугментация ответа воспалительных цитокинов (аналогичный паттерн у мышей и людей) и уменьшение смертности (суррогатные конечные точки смертности у мышей, 28-дневная смертность у людей). В разработке находится некоторое количество ингибиторов PCSK9 для терапии расстройств липидного обмена, но никакие из них не нацелены на сепсис или септический шок, или другие родственные воспалительные состояния. Уменьшение активности PCSK9 с использованием ингибирования PCSK9 могло бы улучшить исходы от сепсиса, септического шока, и многих других воспалительных реакций на инфекцию, или снизить/предупредить терапию, или предотвратить почечную недостаточность; почечную дисфункцию; дыхательную недостаточность; дыхательную дисфункцию; или синдром острого повреждения легких у людей.

Несмотря на то что в настоящем документе раскрыты различные варианты выполнения изобретения, многие адаптации и модификации могут быть выполнены в пределах изобретения, в соответствии с общеизвестным уровнем техники специалистам в данной области техники. Такие модификации включают замещение известными эквивалентами любых особенностей изобретения для того, чтобы достичь того же результата по большей части тем же путем. Области числовых значений включают значения, задающие области. Выражение "содержащий в своем составе" используется в настоящем документе в качестве неограничивающего термина, в значительной степени как эквивалент фразе "включающий, но не ограниченный " и слово "содержащий" имеет соответствующее значение. Единичные формы используются в настоящем документе, как включающие в себя отсылки к множественным формам, если из контекста однозначно не следует обратного. Таким образом, например, отсылка "предмет" включает более чем один такой предмет. Цитирование ссылок в настоящем документе не является признанием того, что такие ссылки являются предшествующим уровнем техники по отношению к варианту выполнения настоящего изобретения. Любые приоритетные документ(ы) и все публикации, включающие, но не ограниченные патентами и заявками на патенты, цитируемые в настоящем описании изобретения, включены в настоящий документ в качестве ссылок, как если бы каждая отдельная публикация была специально и отдельно указана, как включенная в настоящий документ в качестве ссылки и как полностью изложенная в настоящем документе. Настоящее изобретение включает все варианты выполнения и вариации, главным образом, как описанные выше в настоящем документе и со ссылкой на примеры и графические материалы.

ССЫЛКИ

1. Novack V, Macfadyen J, Malhotra A, et al. The effect of rosuvastatin on incident pneumonia: Results from the jupiter trial. CMAJ. 2012; 184:E367-372.

2. Rothberg MB, Bigelow C, Pekow PS, Lindenauer PK. Association between statins given in hospital and mortality in pneumonia patients. J Gen Intern Med. 2012; 27:280-286.

3. Grion CM, Cardoso LT, Perazolo TF, et al. Lipoproteins and cetp levels as risk factors for severe sepsis in hospitalized patients. Eur J Clin Invest. 2010; 40:330-338.

4. Chalmers JD, Short PM, Mandal P, Akram AR, Hill AT. Statins in community acquired pneumonia: Evidence from experimental and clinical studies. Respir Med. 2010; 104:1081-1091.

5. Kruger PS, Harward ML, Jones MA, et al. Continuation of statin therapy in patients with presumed infection: A randomized controlled trial. Am J Respir Crit Care Med. 2011; 183:774-781.

6. Barter PJ, Caulfield M, Eriksson M, et al. Effects of torcetrapib in patients at high risk for coronary events. N Engl J Med. 2007; 357:2109-2122.

7. Harris HW, Grunfeld C, Feingold KR, et al. Chylomicrons alter the fate of endotoxin, decreasing tumor necrosis factor release and preventing death. J Clin Invest. 1993; 91:1028-1034.

8. Read ТЕ, Harris HW, Grunfeld C, et al. The protective effect of serum lipoproteins against bacterial lipopolysaccharide. Eur Heart J. 1993; 14 Suppl K:125-129.

9. Read TE, Grunfeld C, Kumwenda ZL, et al. Triglyceride-rich lipoproteins prevent septic death in rats. J Exp Med. 1995; 182:267-272.

10. Harris HW, Rockey DC, Chau P. Chylomicrons alter the hepatic distribution and cellular response to endotoxin in rats. Hepatology. 1998; 27:1341-1348.

11. de Lima-Salgado TM, Cruz LM, Souza HP. Lipid-activated nuclear receptors and sepsis. Endocr Metab Immune Disord Drug Targets. 2010; 10:258-265.

12. Thompson PA, Berbee JF, Rensen PC, Kitchens RL. Apolipoprotein a-ii augments monocyte responses to lps by suppressing the inhibitory activity of lps-binding protein. Innate Immun. 2008; 14:365-374.

13. Abe M, Maruyama N, Okada K, Matsumoto S, Matsumoto K, Soma M. Effects of lipid-lowering therapy with rosuvastatin on kidney function and oxidative stress in patients with diabetic nephropathy. J Atheroscler Thromb. 2011; 18:1018-1028.

14. Fraunberger P, Grone E, Grone HJ, Walli AK. Simvastatin reduces endotoxin-induced nuclear factor kappab activation and mortality in guinea pigs despite lowering circulating low-density lipoprotein cholesterol. Shock. 2009; 32:159-163.

15. McGown CC, Brown NJ, Hellewell PG, Reilly CS, Brookes ZL. Beneficial microvascular and anti-inflammatory effects of pravastatin during sepsis involve nitric oxide synthase iii. Br J Anaesth. 2010; 104:183-190.

16. Winkler F, Angele B, Pfister HW, Koedel U. Simvastatin attenuates leukocyte recruitment in experimental bacterial meningitis. Int Immunopharmacol. 2009; 9:371-374.

17. Yang W, Yamada M, Tamura Y, et al. Farnesyltransferase inhibitor fti-277 reduces mortality of septic mice along with improved bacterial clearance. J Pharmacol Exp Ther. 2011; 339:832-841.

18. Netea MG, Demacker PN, Kullberg В J, et al. Low-density lipoprotein receptor-deficient mice are protected against lethal endotoxemia and severe gram-negative infections. J Clin Invest. 1996; 97:1366-1372.

19. Lanza-Jacoby S, Miller S, Jacob S, et al. Hyperlipoproteinemic low-density lipoprotein receptor-deficient mice are more susceptible to sepsis than corresponding wild-type mice. J Endotoxin Res. 2003; 9:341-347.

20. Rosch JW, Boyd AR, Hinojosa E, et al. Statins protect against fulminant pneumococcal infection and cytolysin toxicity in a mouse model of sickle cell disease. J Clin Invest. 2010; 120:627-635.

21. Zhang Z, Datta G, Zhang Y, et al. Apolipoprotein a-i mimetic peptide treatment inhibits inflammatory responses and improves survival in septic rats. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2009; 297:H866-873.

22. Steinberg D, Witztum JL. Inhibition of pcsk9: A powerful weapon for achieving ideal ldl cholesterol levels. Proc Natl Acad Sci USA. 2009; 106:9546-9547.

23. Rashid S, Curtis DE, Garuti R, Anderson NN, Bashmakov Y, Ho YK, Hammer RE, Moon YA, Horton JD. Decreased plasma cholesterol and hypersensitivity to statins in mice lacking pcsk9. Proc Natl Acad Sci USA. 2005; 102:5374-5379.

24. Boyd JH, Mathur S, Wang Y, Bateman RM, Walley KR. Toll-like receptor stimulation in cardiomyoctes decreases contractility and initiates an nf-kappab dependent inflammatory response. Cardiovasc Res. 2006; 72:384-393.

25. American college of chest physicians/society of critical care medicine consensus conference: Definitions for sepsis and organ failure and guidelines for the use of innovative therapies in sepsis. Crit Care Med. 1992; 20:864-874.

26. Walley KR, Russell JA. Protein с -1641 aa is associated with decreased survival and more organ dysfunction in severe sepsis. Crit Care Med. 2007; 35:12-17.

27. Russell JA, Walley KR, Singer J, et al. Vasopressin versus norepinephrine infusion in patients with septic shock. NEngl J Med. 2008; 358:877-887.

28. Stephens M, Donnelly P. A comparison of bayesian methods for haplotype reconstruction from population genotype data. Am J Hum Genet. 2003; 73:1162-1169.

29. Manocha S, Russell JA, Sutherland AM, Wattanathum A, Walley KR. Fibrinogen-beta gene haplotype is associated with mortality in sepsis. J Infect. 2007; 54:572-577.

30. Boyd JH, Kan B, Roberts H, Wang Y, Walley KR. S100a8 and sl00a9 mediate endotoxin-induced cardiomyocyte dysfunction via the receptor for advanced glycation end products. CircRes. 2008; 102:1239-1246.

31. Kotowski DC, Pertsemlidis A, Luke A, et al. A spectrum of pcsk9 alleles contributes to plasma levels of low-density lipoprotein cholesterol. Am J Hum Genet. 2006; 78:410-422.

32. Cohen JC, Boerwinkle E, Mosley TH, Jr., Hobbs HH. Sequence variations in pcsk9, low ldl, and protection against coronary heart disease. N Engl J Med. 2006;354:1264-1272.

33. Talmud PJ, Drenos F, Shah S, et al. Gene-centric association signals for lipids and apolipoproteins identified via the humancvd beadchip. Am J Hum Genet. 2009; 85:628-642.

34. Musunuru K, Lettre G, Young T, et al. Candidate gene association resource (care): Design, methods, and proof of concept. Circ Cardiovasc Genet. 2010; 3:267-275.

35. Kathiresan S, Voight BF, Purcell S, et al. Genome-wide association of early-onset myocardial infarction with single nucleotide polymorphisms and copy number variants. Nat Genet. 2009;41:334-341.

36. Abifadel M, Varret M, Rabes JP, et al. Mutations in pcsk9 cause autosomal dominant hypercholesterolemia. Nat Genet. 2003; 34:154-156.

37. Blesa S, Vernia S, Garcia-Garcia AB, et al. A new pcsk9 gene promoter variant affects gene expression and causes autosomal dominant hypercholesterolemia. J Clin Endocrinol Metab. 2008; 93:3577-3583.

38. Naureckiene S, Ma L, Sreekumar K, et al. Functional characterization of narc 1, a novel proteinase related to proteinase k. Arch Biochem Biophys. 2003; 420:55-67.

39. Benjannet S, Rhainds D, Essalmani R, et al. Narc-l/pcsk9 and its natural mutants: Zymogen cleavage and effects on the low density lipoprotein (ldl) receptor and ldl cholesterol. J Biol Chem. 2004; 279:48865-48875.

40. Cunningham D, Danley DE, Geoghegan KF, et al. Structural and biophysical studies of pcsk9 and its- mutants linked to familial hypercholesterolemia. Nat Struct Mol Biol. 2007;14:413-419.

41. Qian YW, Schmidt RJ, Zhang Y, et al. Secreted pcsk9 downregulates low density lipoprotein receptor through receptor-mediated endocytosis. J Lipid Res. 2007; 48:1488-1498.

42. Zhang DW, Lagace TA, Garuti R, et al. Binding of proprotein convertase subtlisin/kexin type 9 to epidermal growth factor-like repeat a of low density lipoprotein receptor decreases receptor recycling and increases degradation. J Biol Chem. 2007; 282:18602-18612.

43. Stein EA, Mellis S, Yancopoulos GD, et al. Effect of a monoclonal antibody to pcsk9 on ldl cholesterol. N Engl J Med. 2012; 366:1108-1118.

44. Fisher TS, Lo Surdo P, Pandit S, et al. Effects of ph and low density lipoprotein (ldl) on pcsk9-dependent ldl receptor regulation. J Biol Chem. 2007; 282:20502-20512.

45. Scartezini M, Hubbart C, Whittall RA, et al. The pcsk9 gene r461 variant is associated with lower plasma lipid levels and cardiovascular risk in healthy u.K. Men. Clin Sci (bond). 2007; 113:435-441.

46. Kathiresan S. A pcsk9 missense variant associated with a reduced risk of early-onset myocardial infarction. N Engl J Med. 2008; 358:2299-2300.

47. Shioji K, Mannami T, Kokubo Y, et al. Genetic variants in pcsk9 affect the cholesterol level in japanese. J Hum Genet. 2004; 49:109-114.

48. Horton JD, Cohen JC, Hobbs HH. Molecular biology of pcsk9: Its role in ldl metabolism. Trends Biochem Sci. 2007; 32:71-77.

49. Benjannet S, Rhainds D, Hamelin J, Nassoury N, Seidah NG. The proprotein convertase (pc) pcsk9 is inactivated by furin and/or pc5/6a: Functional consequences of natural mutations and post-translational modifications. J Biol Chem. 2006; 281:30561-30572.

50. Ranheim T, Mattingsdal M, Lindvall JM, et al. Genome-wide expression analysis of cells expressing gain of function mutant d374y-pcsk9. J Cell Physiol. 2008; 217:459-467.

51. Bingham B, Shen R, Komis S, et al. Proapoptotic effects of narc 1 (=pcsk9), the gene encoding a novel serine proteinase. Cytometry A. 2006; 69:1123-1131.

52. Miyazawa H, Honda T, Miyauchi S, et al. Increased serum pcsk9 concentrations are associated with periodontal infection but do not correlate with ldl cholesterol concentration. Clin Chim Acta. 2012; 413:154-159.

53. Lambert G, Sjouke B, Choque B, Kastelein JJ, Hovingh GK. The PCSK9 decade. J Lipid Res. 2012; 53(12):2515-24.

Группа изобретений относится к медицине и может быть использована для лечения сепсиса или септического шока. Для этого проводят введение ингибитора пропротеиновой конвертазы субтилизин кексин 9 (PCSK9) нуждающемуся в этом субъекту, где ингибитором PCSK9 является антитело или его антигенсвязывающий фрагмент. Также предложено применение PCSK9 для изготовления лекарственного средства для лечения сепсиса или септического шока. Фармацевтическая композиция и коммерческая упаковка, содержащие ингибитор PCSK9. Группа изобретений обеспечивает возможность лечения пациента с сепсисом или септическим шоком в дозах, подходящих для интенсивной терапии. 7 н. и 15 з.п. ф-лы, 5 ил., 7 табл.

1. Способ лечения сепсиса или септического шока,

включающий: введение ингибитора пропротеиновой конвертазы субтилизин кексин 9 (PCSK9) нуждающемуся в этом субъекту, где ингибитором PCSK9 является антитело или его антигенсвязывающий фрагмент.

2. Способ по п. 1, где ингибитором PCSK9 является моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент.

3. Способ по п. 1, где ингибитором PCSK9 является: AMG145; lD05-IgG2; SAR236553/REGN727 (Alirocumab); RN-316; LGT209; или RG7652.

4. Способ по п. 1, где у субъекта есть септический шок.

5. Способ по п. 1, где у субъекта есть сепсис.

6. Способ по п. 1, где субъектом является человек.

7. Фармацевтическая композиция для лечения сепсиса или септического шока, содержащая ингибитор PCSK9 и фармацевтически приемлемый носитель, где ингибитором PCSK9 является антитело или его антигенсвязывающий фрагмент.

8. Фармацевтическая композиция по п. 7, где ингибитором PCSK9 является моноклональное антитело или его антигенсвязывающий домен.

9. Фармацевтическая композиция по п. 7, где ингибитором PCSK9 является: AMG145; 1D05-IgG2; SAR236553/REGN727 (Alirocumab); RN-316; LGT209; или RG7652.

10. Фармацевтическая композиция по п. 7, где субъектом является человек.

11. Применение ингибитора пропротеиновой конвертазы субтилизин кексин типа 9 (PCSK9) для лечения сепсиса или септического шока, где ингибитором PCSK9 является антитело или его антигенсвязывающий фрагмент.

12. Применение по п. 11, где ингибитором PCSK9 является моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент.

13. Применение по п. 11, где ингибитором PCSK9 является: AMG145; 1D05-IgG2; SAR236553/REGN727 (Alirocumab); RN-316; LGT209; или RG7652.

14. Применение по п. 11, где субъектом является человек.

15. Применение ингибитора PCSK9 для лечения сепсиса или септического шока, где ингибитором PCSK9 является антитело или его антигенсвязывающий фрагмент.

16. Применение фармацевтической композиции, содержащей в своем составе ингибитор PCSK9 и фармацевтически приемлемый носитель, для лечения сепсиса или септического шока, где ингибитором PCSK9 является антитело или его антигенсвязывающий фрагмент.

17. Применение ингибитора PCSK9 при получении лекарственного средства для лечения сепсиса или септического шока, где ингибитором PCSK9 является антитело или его антигенсвязывающий фрагмент.

18. Применение по п. 15, 16 или 17, где ингибитором PCSK9 является моноклональное антитело или его антигенсвязывающий домен.

19. Применение по п. 15, 16 или 17, где ингибитором PCSK9 является: AMG145; 1D05-IgG2; SAR236553/REGN727 (Alirocumab); RN-316; LGT209; или RG7652.

20. Коммерческая упаковка, содержащая (а) ингибитор PCSK9; и (b) инструкцию по его применению для лечения сепсиса или септического шока, где ингибитором PCSK9 является антитело или его антигенсвязывающий фрагмент.

21. Коммерческая упаковка по п. 20, где ингибитором PCSK9 является моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент.

22. Коммерческая упаковка по п. 20, где ингибитором PCSK9 является: AMG145; 1D05-IgG2; SAR236553/REGN727 (Alirocumab); RN-316; LGT209; или RG7652.