Способ получения экзополисахарида бактерий Xanthobacter xylophilus Российский патент 2018 года по МПК C12P19/04 C12N1/20 C08B37/00 

Изобретение относится к экспериментальной биологии, медицине и ветеринарии. Может быть использовано для получения различных биологически-активных веществ углеводной природы.

В современной микробиологии остается важной задача поиска новых микроорганизмов-продуцентов экзополисахаридов (ЭПС) с уникальными свойствами. Бактериальные ЭПС обладают широким спектром физико-химических, биологических и функционально-технологических свойств, они находят применение в ветеринарии, медицине, фармацевтической, пищевой, химической, нефтедобывающей и других отраслях народного хозяйства.

Особый интерес у исследователей представляют ЭПС малоизученных бактерий, таких как диссипотрофы. Эти микроорганизмы относятся к олиготрофам и обитают в ультрапресных условиях в Северных болотах России и участвуют в конечной стадии разложения древесины - сложного лигноцеллюлозного комплекса - и использует простые соединения, в частности сукцинат, оксалат, ксилозу и ряд других (Зайчикова М.В. Диссипотрофные бактерии ксилотрофного сообщества в пресноводных экосистемах / дис.: канд. биол. наук / М. В. Зайчикова. – Москва, 2011. – 113 с.).

ЭПС бактерий-диссипотрофов X.xylophilus Z-0055 не изучены. В литературе практически не содержится сведений об их выделении и свойствах. Имеется работа, в которой описываются химические свойства ЭПС Xanthobacter sp. (ATCC 53272), который состоит из галактозы и маннозы в соотношении 3:1 и имеет в своем составе кислые группировки (O'Neill M.A. Structural analysis of an acidic polysaccharide secreted by Xanthobacter sp. (ATCC 53272) / M.A. O'Neill, A.G. Darvill, P. Albersheim // Carbohydrate Research. – 1990. – V. 206. – P. 289-296).

Эти бактерии относятся к семейству Xanthobacteraceae, порядка Rhizobiales, класса Alphaproteobacteria. Клетки бактерий имеют овальную форму, размером 0.4×0.7 мкм. Микроорганизмы не образуют капсулы, не способны к движению. Размножаются неравномерным делением. По Граму окрашиваются отрицательно. Являются облигатными аэробами. X.xylophilus не используют С1-соединения, моно- и дисахариды, аминокислоты. Источниками углерода и энергии для них являются органические кислоты: ацетат, глюконат, малат, сукцинат, цитрат, оксалат, а также ксилан и ксилоза. Не растут хемолитоавтотрофно. Являются олиготрофами. Оптимальная концентрация субстрата в среде – 0,25 г/л. Для роста необходим дрожжевой экстракт (0,05 г/л). Являются умеренно ацидофильными микроорганизмами (оптимум для роста составляет рН 5,0 – 5,5) (Xanthobacter xylophilus sp. nov. – представитель ксилотрофного мико-бактериального сообщества ультрапресных вод / М. В. Зайчикова [и др.] // Микробиология. – 2010. – Т. 79, № 1. – 89-95 с.).

Для выделения ЭПС культуру X.xylophilus Z-0055 выращивали на жидких ультрапресных минеральных средах с сукцинатом (0,1%) в качестве субстрата (Зайчикова М.В. Диссипотрофные бактерии ксилотрофного сообщества в пресноводных экосистемах / дис.: канд. биол. наук / М. В. Зайчикова. – Москва, 2011. – 113 с.; Cohen-Bazire G. Kinetic studies of pigment synthesis by non-sulphur purple bacteria / G. Cohen-Bazire, W.R. Sistrom, R.Y. Stanier // Journal of Comparative Physiology. – 1957. – V. 49. – Р. 25 - 68).

Среда МС: на 1 л: 1 мл основы АТСС; 1 г сукцината; 0,1 г дрожжевого экстракта; 1 мкл витаминов, рН 5,5-5,6.

Основа АТСС: модифицированные соли Хартнера, MgSO₄·7H₂O – 29,7 г; CaCl₂·2H₂O – 3,34 г, NH₄MoO₄ – 9,25 г, FeSO₄·7H₂O – 99,0 мг; раствор микроэлементов – 50,0 мл; H₂O – 1000 мл.

Раствор микроэлементов: ЭДТА – 0,25 г; ZnSO₄ – 1,1 г; FeSO₄·7H₂O – 0,5 г; MnSO₄·H₂O – 0,15 г; CuSO₄·5H₂O – 0,04 г; CoCl₂·6H₂O – 20,8 г.

Витамины: биотин – 20 мг, фолиевая кислота – 20 мг, тиамин – 25 мг, пантотен – 25 мг, В₁₂ – 1 мг, рибофлавин – 25 мг, никотинамид – 25 мг, n-аминобензойная кислота – 25 мг, бензоатная кислота – 25мг, пиридоксин – 20 мг, этанол (70%) – 100 мл.

За основу способа выделения был взят способ CerningJ. (Cerning J. Polysaccharides exocellulaires produits par les bactéries lactiques / J. Cerning, I.H. Roissart, F.M. Luquet // Bactéries Lactiques, Grenoble, France. – 1994. – P. 309 - 329). Модификация этого метода впервые используется для выделения ЭПС X.xylophilus Z-0055.

Технической задачей изобретения является выделение ЭПС X.xylophilus Z-0055 из культуральной жидкости после выращивания микроорганизмов.

Поставленная задача решается в способе получения экзополисахарида бактерий X.xylophilus Z-0055, заключающемся в выделении экзополисахаридов из культуральной жидкости этих бактерий, при котором культуральную жидкость упаривают на роторном испарителе, после чего центрифугируют при 10 000 g и осаждают 3 объемами 96% этанола, отстаивают в течение 12 ч при температуре 4 °С. Затем центрифугируют при 2500 g, суспендируют полученный осадок в 96% этаноле, центрифугируют при 2500 g, высушивают на воздухе. После чего растворяют осадок в дистиллированной воде, центрифугируют при 2500 g, осадок повторно растворяют в дистиллированной воде, осаждают 3 объемами этанола, после чего полученный ЭПС растворяют в воде и лиофильно высушивают.

Предлагаемый способ осуществляется следующим образом.

Бактерии X.xylophilus Z-0055 выращивали при температуре 31°С на среде МС в колбах по 100 мл среды при встряхивании на «Шейкер-инкубаторе ES-20» (Литва). Посевным материалом служит культура, выращенная на том же субстрате и отобранная в логарифмической фазе роста в объеме 5 мл. Рост бактерий контролировали по оптической плотности (длина волны – 425 нм). Измерения проводили на cпектрофотометре «Cary 100 Scan» (Varian, США). Метод выделения ЭПС состоял из следующих этапов. Сначала культуральную жидкость упаривали на роторном испарителе. Затем центрифугировали при 10 000 g и осаждали 3 объемами 96% этанола, отстаивали в течение 12 ч при температуре 4°С. Затем центрифугировали при 2500 g, суспендировали полученный осадок в 96% этаноле, центрифугировали при 2500 g, высушивали на воздухе. После чего растворяли осадок в дистиллированной воде, центрифугировали при 2500 g, осадок повторно растворяли в дистиллированной воде, осаждали 3 объемами этанола, после чего полученный ЭПС растворяли в воде и лиофильно высушивали.

Полученный ЭПС представлял собой порошок белого цвета, не имеющий запаха, не содержащий белка, нуклеиновых кислот и клеток продуцента. ЭПС X.xylophilus Z-0055 был условно назван нами ксилофилан.

В результате проведенных исследований нами был выделен ЭПС из диссипотрофных бактерий X.xylophilus Z-0055. Заявляемый способ получения ЭПС X.xylophilus Z-0055 впервые используется для этих бактерий.

Техническим результатом заявляемого изобретения является получение экзополисахаридов из культуральной жидкости X.xylophilus Z-0055 после выращивания микроорганизмов, которые могут быть использованы для получения различных биологически активных веществ углеводной природы.

Изобретение относится к области биохимии. Предложен способ получения экзополисахарида (ЭПС) бактерий Xanthobacter xylophilus Z-0055. Способ заключается в выделении экзополисахаридов из культуральной жидкости диссипотрофных бактерий X.xylophilus Z-0055. При выделении культуральную жидкость упаривают на роторном испарителе, центрифугируют при 10 000 g, осаждают тремя объемами этанола, отстаивают в течение 12 ч при температуре 4°С, центрифугируют при 2500 g, суспендируют полученный осадок в этаноле, центрифугируют при 2500 g и высушивают на воздухе. После растворяют осадок в дистиллированной воде, центрифугируют при 2500 g, осадок повторно растворяют в дистиллированной воде, осаждают тремя объемами этанола и полученный ЭПС растворяют в воде, лиофильно высушивают. Изобретение обеспечивает получение экзополисахаридов из культуральной жидкости X.xylophilus Z-0055 после выращивания микроорганизмов.

Способ получения экзополисахарида бактерий Xanthobacter xylophilus Z-0055, заключающийся в выделении экзополисахаридов из культуральной жидкости диссипотрофных бактерий X.xylophilus Z-0055, при котором культуральную жидкость упаривают на роторном испарителе, после чего центрифугируют при 10 000 g и осаждают 3 объемами 96% этанола, отстаивают в течение 12 ч при температуре 4°С, затем центрифугируют при 2500 g, суспендируют полученный осадок в 96% этаноле, центрифугируют при 2500 g, высушивают на воздухе, после чего растворяют осадок в дистиллированной воде, центрифугируют при 2500 g, осадок повторно растворяют в дистиллированной воде, осаждают 3 объемами этанола, после чего полученный ЭПС растворяют в воде и лиофильно высушивают.