ЛЕПТОСПИРЫ С ПОВЫШЕННОЙ АНТИГЕННОЙ МАССОЙ Российский патент 2019 года по МПК C12N1/20 A61K39/02 

Настоящее изобретение, в целом, относится к области бактериологии и бактериальных вакцин. В частности, данное изобретение относится к способу увеличения антигенной массы Leptospira, к Leptospira, получаемым этим способом, и вакцинам и применениям таких Leptospira.

Бактерия, относящаяся к спирохетам рода Leptospira, принадлежит к семейству Leptospiraceae и типу Spirochaetes. Leptospira являются грамотрицательными аэробными подвижными бактериями удлиненной тонкой спиралевидной формы. Патогенные Leptospira обнаруживаются по всему миру у многих типов животных, как и у человека; млекопитающие, такие как грызуны, дикие животные, сельскохозяйственные животные и собаки представляют собой их природный резервуар. Бактерии вызывают заболевание, именуемое лептоспирозом или болезнью Васильева-Вейля (желтушный лептоспироз). Оно развивается, когда Leptospira после инфицирования и транспорта через кровоток проникает во внутренние органы и вызывает проявление умеренных или жестких симптомов, вплоть до смертности, и имеет острую или хроническую природу. Такая вариабельность является причиной того, что болезнь часто неправильно диагностируется. Главными симптомами являются: лихорадка, тошнота и желтуха в результате воспаления кровеносных сосудов, приводящего к нарушениям в почках, печени или легких или сердечно-сосудистому заболеванию. Leptospira обычно переживает в почечном или генитальном тракте хозяина и таким образом вызывает распространение в популяции, которое может приводить к возникновению зооноза, тогда как люди инфицируются при контакте с мочой животных или загрязненной поверхностью воды. Для обзора см.: P. Levett, 2001 (Clin. Micr. Rev., vol. 14, p. 296). Leptospira достаточно устойчивы в природе и могут переживать в течение месяцев в водных условиях и при температурах окружающей среды.

Классификация Leptospira может оказаться дезориентирующей в связи с тем, что используются различные ее системы: в течение многих лет классификация основывалась на серологической дифференциации, тогда как все патогенные Leptospira обозначаются как серологические варианты (серовары) вида Leptospira interrogans (sensu lato). В этой системе серовары различаются по серологическому тестированию основного бактериального иммуногена - липополисахарида (LPS) - на их внешней мембране. В настоящее время описано более чем 200 сероваров, которые объединяются в 25 серогрупп.

Однако в иной плоскости по отношению к классификации по серотипированию существует система генотипирования на так называемые геномные виды, основанная на молекулярно-биологических признаках. В частности, один из геномных видов Leptospira может содержать несколько сероваров и наоборот. В данном случае будет использована серологическая классификация на серовары.

Некоторые серовары Leptospira инфицируют только специфический вид-хозяин, но большинство сероваров имеют широкий диапазон хозяев. Например: серовар Hardjo L interrogans (sensu lato) связан с инфицированием коров, а у свиней чаще всего причиной инфекции являются серовары Tarassovi, Pomona и Bratislava. Однако такие серовары, как Canicola, Icterohaemorrhagiae, Bratislava и Grippotyphosa, могут инфицировать свиней, собак и людей.

Обнаружение лептоспирозной инфекции хозяина возможно разнообразными путями. Общепринятым стандартным способом является серологическое детектирование специфических антител в сыворотке хозяина с помощью так называемой реакции микроагглютинации (MAT). В этой реакции серийные разбавления сыворотки пациента инкубируются с живыми Leptospira специфического серовара. Если специфические антитела присутствуют в сыворотке, они агглютинируют с тестируемыми бактериями, что может быть обнаружено, например, темнопольной микроскопией. Реакция высокоспецифична, и MAT также имеет решающее значение для серологической классификации выделенных Leptospira. Альтернативным тестом является Elisa (твердофазный иммуноферментный анализ) или PCR (полимеразная цепная реакция).

Лечение лептоспироза может проводиться терапевтически путем введения антибиотиков. Однако поскольку болезнь часто неправильно диагностируется, профилактика путем вакцинации является предпочтительной. Несколько типов вакцин против Leptospira для животных или людей исследуются, но в настоящее время только ветеринарные вакцины коммерчески широкодоступны. Видами животных, которые обычно вакцинируются, являются свиньи, крупный рогатый скот и собаки. Вакцинация затем служит и для предупреждения заболевания организма-хозяина и для уменьшения зоонозного распространения.

Существующие вакцины против лептоспироза основываются на суспензии инактивированных целых бактериальных клеток, так называемом бактерине (убитой бактериальной вакцине) из линии соответствующего серовара. Эти вакцины индуцируют эффективный иммунитет гуморального типа, в результате чего наиболее иммунопротективные антитела способны агглютинировать и таким образом нейтрализовать Leptospira. Бактериальным иммунодоминантным антигеном является LPS, а конкретно - эпитопы на олигосахаридных остатках LPS. Индуцированный иммунитет главным образом является сероварспецифическим с некоторым перекрестным иммунитетом к родственным сероварам, например, принадлежащим той же серогруппе. Примером вакцины против лептоспироза является Leptavoid® H (фирма MSD Animal Health) для коров, содержащий бактерин из штамма L. interrogans (sensu lato) серовара Hardjo.

Однако в большинстве реальных ситуаций наблюдается заболеваемость Leptospira из более чем одной серогруппы, поэтому многие коммерческие вакцины против лептоспироза представляют собой комбинированные вакцины, которые предоставляют широкую защиту. Примером вакцины для собак является Nobivac® Lepto4 (фирма Merck Animal Health), которая содержит штаммы каждой из серогрупп L interrogans (sensu lato): Canicola, Grippotyphosa, Icterohaemorrhagiae и Pomona. Также вакцины против лептоспироза часто являются комбинированными с соединениями из других бактериальных или вирусных вакцин.

В настоящее время Leptospira обычно размножается в культурах in vitro для исследовательских или диагностических целей, но главным образом для производства вакцин. Способы и процедуры для размножения Leptospira in vitro известны в течение более 50 лет, и в них имеются ингредиенты, критичные для их сравнительно простой культуральной среды. В 1960-х гг. было установлено, что Leptospira для питания и формирования клеток (для размножения in vitro) требуются жирные кислоты с длинными цепями. Также эти длинноцепочечные жирные кислоты используются как единственный источник энергии и углерода, поскольку отсутствует (определимое) потребление белков или углеводов из культуральной среды. Следовательно, эти жирные кислоты должны доставляться культуральной средой, поскольку Leptospira не способны ни синтезировать длинноцепочечные жирные кислоты de novo, ни нарастить короткоцепочечные жирные кислоты. Эти знания помогли разработать частично определенную синтетическую культуральную среду для Leptospira (Johnson & Gary 1963; Stalheim & Wilson 1964), в которой ранее использовавшиеся до 10% объем/объем цельной (кроличьей) сыворотки заменено на комбинацию фракций альбумина и определенные источники жирных кислот. Она была далее разработана в синтетическую среду, которая по сей день используется как стандартная культуральная среда для маломасштабной или промышленной пролиферации Leptospira in vitro: среда EMJH, разработанная Ellinghausen и McCullough (1965, Am. J. of Vet. Res., vol. 26, p. 45), и модифицированная Johnson и Harris (1967, J. of Bacteriol., vol. 94, p. 27).

Среда EMJH содержит помимо необходимых витаминов, солей и минеральных веществ, также 0,125% объем/объем полисорбата 80 и 1% вес./объем бычьего сывороточного альбумина (BSA) (Faine, S., 1994, p. 312, in: Leptospira and Leptospiros, ed. S. Faine, Boca Raton, FL, USA, CRC Press).

Полисорбат 80, который лучше всего известен по одному из его коммерческих названий - Tween® 80 (фирма ICI Americas, Inc.), представляет собой полиоксиэтилен (20) сорбитан моноолеат (CAS nr. 9005-65-6). Полисорбат 80 является неионным поверхностно-активным веществом, которое широко используется как эмульгатор и растворитель в фармацевтике, косметике и пищевом производстве (E 433). В среде EMJH, однако, он служит источником длинноцепочечных жирных кислот для бактерий, поскольку он легко растворим в воде и имеет сравнительно низкую токсичность для бактерий. Основным компонентом около 70% объем/объем полисорбата 80 является олеиновая кислота (C18:1), но некоторые другие жирные кислоты также присутствуют: в основном пальмитиновая кислота (C16:0) и пальмитинолеиновая кислота (C16:1), хотя это зависит от партии и производителя.

В этом отношении обозначение жирных кислот, таких как олеиновая кислота, как «C18:1», находится в соответствии с нотацией C:D, которая является хорошо известным стандартным сокращением, которое описывает жирную кислоту по ее основной характеристике - числу атомов углерода в ацильной цепи (для олеиновой кислоты - 18) и числу двойных (ненасыщенных) связей (для олеиновой кислоты - 1).

Поскольку Leptospira in vitro не потребляет белка, основной функцией альбуминового компонента EMJH считается детоксикация жирных кислот в культуральной среде, предоставляемых полисорбатом 80 путем обратимого образования их комплексов, при сохранении их биологической доступности.

Сывороточный альбумин, помимо обеспечения осмотического давления, является важным транспортным белком в крови для различных соединений, таких как белки, липиды, витамины, малые молекулы и т. д.

Липиды, связанные с сывороточным альбумином, содержат ди- и триглицериды и эфиры холестерина и фосфолипидов, но большинство их (>90%) присутствует в форме свободных жирных кислот, где «свободные» означает «неэстерифицированные» или «не связанные ковалентно». Из этих свободных жирных кислот, связанных с альбумином, более чем 90% представляют собой жирные кислоты с цепями среднего размера и длинноцепочечные в диапазоне C14-C20, главным образом: миристиновая кислота (C14:0), пальмитиновая кислота (C16:0), пальмитинолеиновая кислота (C16:1), стеариновая кислота (C18:0), олеиновая кислота (C18:1), линолевая кислота (C18:2) и арахидоновая кислота (C20:4).

Альбумины обратимо связывают эти жирные кислоты на нескольких сайтах связывания с различной аффинностью. То, какого типа и сколько жирной кислоты связано с образцом альбумина от донора, имеет широкую физиологическую вариативность и зависит от химических признаков жирной кислоты, таких как длина цепи и уровень ненасыщенности, но также от биологических признаков донора альбумина, таких как вид, порода и пол, так же как состояние по питанию и активности.

Для коммерческих BSA количество и тип связанных жирных кислот зависит от протокола производства, использованного производителем, и варьирует от партии к партии (продукта).

Классические препараты альбумина были получены с помощью фракционирования холодным этанолом (Cohn et al., 1946, J. of the Amer. Chem. Soc, vol. 68, p. 459) с получением так называемого продукта Коновской фракции V альбумина.

С тех пор широкое разнообразие типов и качества сывороточного альбумина для использования, например, в биохимии и культуре тканей стало коммерчески доступно. Широкий обзор вариабельности сывороточного альбумина был выполнен Janatova (1974, J. of Medicine, vol. 5, p. 149).

Хотя в экспериментальных условиях более чем 10 молекул жирных кислот могли связываться с одной молекулой альбумина (Spector& Hoak, 1969, Anal. Biochem., vol. 32, p. 297), физиологически альбумин может нести между около 0,3 и 3 моль жирной кислоты на моль альбумина (Hennig & Watkins, 1989, Am. J. of Clin. Nutr., vol. 49, p. 301).

Коммерческие сывороточные альбумины с низким содержанием жирных кислот, т. е. ниже, чем 0,1 моль жирной кислоты/моль альбумина, также доступны; так альбуминовые продукты были делипидизированы с помощью одной из множества доступных технологий, таких как экстракция органическим растворителем и/или адсорбция на угле. Однако чтобы получить очень низкий уровень нагрузки липидами, требуются агрессивные способы экстракции при очень низких значениях pH, которые могут приводить к денатурации альбумина.

Большие количества сывороточных альбуминов для использования в биологических процессах промышленного масштаба, коммерчески легкодоступны только от коров как побочный продукт мясной промышленности.

Из различных видов BSA, подходящих для использования в клеточной пролиферации in vitro, некоторые рекомендуются для использования со специфическими типами клеток. Одним из примеров является BovoLep® BSA (фирма Bovogen, Австралия), который рекомендуется для запуска роста Leptospira в культуре; это - стандартный BSA, который обогащен множеством растительных жирных кислот.

Полная культуральная среда EMJH также обеспечивает всеми жирными кислотами, которые известны как критичные для пролиферации Leptospira в культуре: пальмитиновой кислотой (C16:0), стеариновой кислотой (C18:0) и олеиновой кислотой (C18:1) (Johnson & Gary, 1963, см. выше).

Эта среда EMJH позволяет пролиферацию большинства соответствующих сероваров L. interrogans (sensu lato). Обычные условия пролиферации Leptospira в промышленном масштабе - это 28-30°C при контроле pО₂ и pH в стандартном ферментерном сосуде с перемешивателем. Тем не менее, Leptospira пролиферирует сравнительно медленно: сообщается о времени генерации между 12 и 24 часами в зависимости от вирулентности и уровня адаптации к условиям пролиферации in vitro. В результате, чтобы достигнуть процесса пролиферации большого количества биомассы, требуется сравнительно длительное время, обычно 4-7 дней, в зависимости от плотности инокуляции, и это требует нескольких предварительных культур для приготовления достаточного количества инокулята. Это обусловливает большую нагрузку на ферментерные мощности производителя. Также это длительное время культивирования налагает большой риск развития загрязнения, например, бактериями, дрожжами или грибками, которые имеют значительно меньшую длительность времени удвоения.

Следовательно, существует необходимость в улучшении способов производства антигенов Leptospira в культуре in vitro.

Литература в данной области описывает некоторые усилия по улучшению пролиферации Leptospira в культуре in vitro. В некоторых модификациях среды EMJH возвращено введение сыворотки или добавлен дополнительный полисорбат и/или гидролизат. Однако такая обогащенная среда EMJH обычно не используется в пролиферации Leptospira in vitro в промышленном масштабе, но используется для диагностики, обычно в полутвердой среде, для детектирования и пролиферации даже малых количеств наиболее существенных штаммов Leptospira из клинических образцов.

Обычно Leptospira размножается in vitro для изготовления инактивированной вакцины против лептоспироза. После фазы пролиферации последующий технологический процесс начинается, в целом, с инактивации конечного продукта культуры для получения бактерина. Это может быть выполнено несколькими путями, обычно путем химической инактивации, такой как формалином, тимеросалом, β-пропиолактоном (BPL) или β-этаноламином (BEA). Следующая стадия часто представляет собой концентрирование и очистку инактивированной культуры, например центрифугированием или фильтрацией. Образовавшийся препарат антигена затем преобразуется в вакцину.

В обычной практике получение формы инактивированной вакцины против лептоспироза основывается на биомассе, посредством которой одна доза для животного содержит определенное количество клеток, обычно около 10⁹ клеток/доза конкретного серовара. Однако такое количество клеток не может быть достигнуто в форме конечного продукта, поскольку (химическая) инактивация повреждает бактериальные клетки. Поэтому количество клеток определяется конечной культурой перед инактивацией путем пересчета всех интактных клеток (живых и мертвых). Исходя из этого числа, рассчитывали, какое количество доз/мл может быть выделено в финальном продукте после приготовления формы. В качестве контроля качества при реализации продукта на рынке проверяется иммунологическая эффективность (то есть оценка эффективности) конечной вакцины. В настоящее время органами государственного регулирования и контроля требуемая проверка эффективности партии (препарата) представляет собой исследование in vivo, содержащее вакцинацию и стимуляцию антигеном у хомяков (например, European Pharmacopeia monograph 0447 для вакцины против лептоспироза собак).

Известен тест in vitro для оценки эффективности вакцины против лептоспироза (Ruby et al., 1992, Biologicals, vol. 20, p. 259). Он основывается на определении количества антигенной массы конечной вакцины по серологическому исследованию, с использованием сероварспецифических антител и стандартов. Хотя корреляция между антигенной массой бактерина Leptospira и иммунологической эффективностью хорошо известна, форма вакцины против лептоспироза по-прежнему основывается на соотношении биомассы к дозе.

Последствие того, что изготовление вакцины против бактерина Leptospira основывается на биомассе, состоит в том, что доза такой вакцины содержит количество белка и других бактериальных компонентов, которые мало что вносят в иммунизацию, как это делает LPS, но, напротив, могут приводить к неблагоприятным локальным и системным реакциям на вакцинацию. Эта проблема усложняется в случае вакцин, которые содержат комбинацию нескольких антигенов лептоспироза. В попытке повысить безопасность вакцины против лептоспироза в основном в последующем процессе применяется дополнительная стадия очистки. Угроза неблагоприятных побочных реакций на вакцинацию также является основной причиной того, что к настоящему времени в целом недоступна вакцина против лептоспироза людей, основанная на бактерине.

Чтобы преодолеть возможные реакции на вакцинацию, некоторые (исследовательские) группы пытались уменьшить нагрузку непротективных и происходящих из среды компонентов вакцины в (комбинированной) вакцине против лептоспироза путем применения подобранной среды для культуры Leptospira с пониженным содержание белка или даже безбелковой. Однако эти среды должны были все же обеспечивать важные длинноцепочечные жирные кислоты, которые требуются для поддержания пролиферации Leptospira. Это требует решения проблемы токсичности, присущей этим жирным кислотам, поскольку они больше не могут быть детоксицированы большим количеством белка, который доставляется сывороткой или BSA. Один из подходов состоит в детоксикации самого полисорбата, например, путем ионообмена или экстракции поливинилпирролидоном или углем (Bey & Johnson, 1978, Inf. & Imm., vol. 19, p. 562). Альтернативный подход описан в WO 2006/113601, где токсичность жирных кислот ограничена путем добавления безбелковой культуральной среды с полисорбатом повторяющимися малыми количествами - так называемый процесс культуры с подпиткой, основанный на повышении биомассы при контролируемом субмаксимальном темпе роста. До настоящего времени отсутствует коммерчески доступная вакцина против лептоспироза, основанная на безбелковой культуре Leptospira, а общепринятые вакцины все еще опираются на последующую очистку.

Тем не менее, ни в одном из исследований предшествующего уровня техники не сообщалось о каких-либо эффектах изменений в культуральной среде или в условиях пролиферации на антигенную массу и (или) иммуногенность полученных Leptospira. Следовательно, все это, по сути, представляет собой альтернативные способы продукции биомассы Leptospira.

Следовательно, задачей данного изобретения является предоставление улучшений в производстве антигенной массы Leptospira и предоставление улучшенных вакцин, получаемых из нее.

Удивительно, но было обнаружено, что эта задача может быть решена, а недостатки предшествующего уровня техники преодолены путем добавления в культуру Leptospira специфической длинноцепочечной ненасыщенной жирной кислоты - полиненасыщенной C18 жирной кислоты. Это приводит к быстрому и сильному увеличению антигенной массы, которое превосходит любое повышение биомассы до трехкратного.

Это открытие дало дорогу множеству полезных применений, таких как производство Leptospira с повышенной антигенной массой, что может быть использовано для производства улучшенных вакцин против лептоспироза. Поскольку обнаружено, что повышение количества антигена превосходит повышение биомассы, следовательно, имеется чистое повышение количества антигена на установленное количество бактериальных клеток, если сравнивать культуры Leptospira с добавлениями и без добавлений.

Leptospira, которая имеет такую повышенную антигенную массу, может быть использована для приготовления вакцин, которые имеют такое же содержание антигенов, как вакцины предшествующего уровня техники, но с уменьшенным количеством других компонентов бактериального и культурального происхождения. Это благоприятно для последующей обработки и в отношении уровня побочных эффектов вакцинации. В качестве альтернативы вакцины с повышенной антигенной массой могут быть теперь применены с тем же уровнем неспецифических компонентов, что и ранее. Помимо пользы для безопасности вакцинируемых, специалистам в данной области техники ясно, что все эти улучшения также в высокой степени полезны в экономическом отношении.

Далее культуры Leptospira с добавлением полиненасыщенной C18 жирной кислоты в настоящее время достигают уровня антигенной массы на несколько дней раньше, чем характерно для предшествующего уровня техники. Следовательно, такие культуры могут теперь производиться быстрее, более экономично и с меньшей вероятностью загрязнения, поскольку время культивирования теперь существенно сокращено. В качестве альтернативы, если культуре Leptospira с добавлением полиненасыщенной C18 жирной кислоты позволить пролиферировать до максимальной биомассы, как ранее, могут быть получены значительно увеличенные количества антигена.

Данное изобретение делает возможным улучшение существующей культуральной среды для пролиферации Leptospira и производства антигена и рационального дизайна оптимальной (полу)синтетической среды.

Для добавления в культуру Leptospira полиненасыщенной C18 жирной кислоты могут быть использованы соединения и (или) композиции, которые представляют собой либо чистую полиненасыщенную C18 жирную кислоту, либо относительно обогащены ею, экономичным примером чего являются растительные масла.

В дополнение, поскольку у Leptospira процессы продукции биомассы и генерации антигена LPS, вероятно, в значительной степени изолированы, ныне возможна независимая организация процессов, причем на первоначальной стадии продуцируется большое количество биомассы Leptospira, а на отдельной, более поздней стадии Leptospira индуцируется к продукции антигена LPS путем добавления к ним полиненасыщенной C18 жирной кислоты. Разделение этих двух стадий затем позволяет раздельно оптимизировать оба процесса из-за их различающихся соответствующих параметров, таких как длительность инкубации, температура инкубации и т. д. Это также дает несколько логистических и планировочных преимуществ, например, позволяющих хранение, получение и очистку антигена на промежуточных стадиях.

Все это было совершенно неожиданно, поскольку в предшествующем уровне техники полиненасыщенные C18 жирные кислоты мало связывались с условиями пролиферации Leptospira: Stern et al. (1969, Eur. J. of Biochem., vol. 8, p. 101) описали, что Leptospira включает линолевую кислоту (C18:2) из культуральной среды в липиды своей клеточной мембраны. Johnson et al. (1970, Inf. & Imm., vol. 2, p. 286) сообщили, что линолевая кислота была одной из множества жирных кислот, которые присутствовали в BSA, который использовался для пролиферации в культурах Leptospira, но не указали конкретные количества. Каких-либо публикаций о линоленовой кислоте (C18:3) в связи с культурой Leptospira мало, и все они бесполезны. Следовательно, нет источников в предшествующем уровне техники, которые показывают, что полиненасыщенная C18 жирная кислота имеет какое-то специальное значение для Leptospira, за исключением ее потенциальной токсичности. Линолевая или линоленовая кислоты никогда не упоминались или не предполагались как имеющие специальное значение для генерации антигена Leptospira, особенно антигена LPS.

Напротив, в предшествующем уровне в данной области техники имелся консенсус относительно того, что подходящими для Leptospira жирными кислотами являются пальмитиновая, стеариновая и олеиновая кислоты, и что все они в избытке предоставляются стандартной культуральной средой за счет полисорбата 80. Таким путем Leptospira с «адекватным» количеством антигена LPS производилась в течение многих лет, и не было попыток описать или предложить улучшение количества антигена LPS на единицу биомассы Leptospira. Также отсутствовал и стимул сделать это, поскольку вакцины против лептоспироза формировались исходя из биомассы, следовательно, максимизация количества клеток Leptospira в культуре, а не антигенная масса, всегда была главной целью в данной области.

Неизвестно, ни почему Leptospira требует полиненасыщенных C18 жирных кислот для продукции их антигена LPS, ни каким путем полиненасыщенная C18 жирная кислота используется в генерации (части) молекул LPS Leptospira.

Хотя авторы изобретения не желают быть связанными какой-либо теорией или моделью, которые должны объяснять эти наблюдения, авторы изобретения предполагают, что в Leptospira биологические процессы направлены на пролиферацию бактерий, а те, которые направлены на генерацию LPS, могут быть связаны частично с отдельными ферментативными системами, требующими иных питательных веществ. Все это - не принимая во внимание тот факт, что добавление полиненасыщенной C18 жирной кислоты может также индуцировать некоторое увеличение биомассы.

Авторы данного изобретения далее предполагают, что стандартная среда культуры Leptospira, используемая в настоящее время, такая как EMJH, содержит лишь субоптимальное количество полиненасыщенных C18 жирных кислот для эффективной генерации антигена Leptospira; это не зависит от того факта, что такие среды предоставляют избыток жирных кислот, которые требуются на формирование биомассы Leptospira. Следовательно, в культуральной среде Leptospira в соответствии с предшествующим уровнем техники полиненасыщенная C18 жирная кислота быстро истощается, после чего продукция антигена останавливается задолго до того, как будет достигнуто максимальное количество клеток. Это означает, что до сих пор использовалась только часть способности Leptospira продуцировать антиген LPS.

Следовательно, один из объектов данного изобретения предоставляет способ увеличения антигенной массы культуры Leptospira, способ включает стадию добавления в упомянутую культуру Leptospira полиненасыщенной C18 жирной кислоты.

«Антигенная масса» согласно данному изобретению представляет собой количество антигена LPS на фиксированном количестве клеток Leptospira, которое может быть определено серологическим исследованием, таком как Elisa. В данном документе это выражено как специфическая антигенная масса: количество иммунодоминантных протективных антигенных эпитопов на LPS фиксированного количества клеток Leptospira и представленная как количество серологических единиц лептоспирозного антигена LPS на 1×10⁹ клеток Leptospira.

Клетки Leptospira просчитывали в соответствии с обычными процедурами перед инактивацией, считая все целые клетки, живые и мертвые, которые в рамках данного изобретения понимают как «биомассу».

Следовательно, для данного изобретения антигенная масса культуры Leptospira увеличивается, если количество антигена на клетку Leptospira повышается в результате применения способа по данному изобретению.

В этом состоит противоположность целям способов предшествующего уровня техники в производстве антигенов Leptospira путем пролиферации Leptospira; они были сфокусированы на увеличении биомассы Leptospira, а не на увеличении количества антигена (в расчете) на клетку. Следовательно, если биомасса увеличивается, а количество антигена - нет, это приводит к снижению соотношения количества антигена на единицу биомассы.

Термин «антигенная масса» известен в данной области техники и обычно определяется с использованием серологического исследования, такого как Elisa, с использованием антител, которые специфичны для изменения антигена, в данном случае - LPS Leptospira. Количество антигена, детектированное в образце, затем выражается в числе условных единиц, в результате эти единицы определяются относительно количества антигена в стандартном образце, который, например, принят как содержащий 1000 единиц. Следовательно, абсолютное значение величины количества антигена является условным, поскольку зависит от конкретного примененного теста, примененных антител и эталонного образца. Существенна, однако, относительная разница между величинами для образцов, протестированных при одинаковых условиях по отношению к одному и тому же эталонному образцу. Это может быть, например, выражено как разница измеренных количеств антигена (например, 250 против 500 единиц антигена/мл) или может быть с удобством выражено в процентах. Такая разница между двумя образцами в процентах также применяется, если два одинаковых образца анализируются с разными антителами или по сравнению с разными (но адекватными) эталонными образцами.

Предпочтительным исследованием для определения количества антигена для использования по данному изобретению является Elisa, который использует антитела, специфичные для антигена LPS конкретной серогруппы или серовара Leptospira. Такие антитела могут агглютинировать Leptospira в MAT. Предпочтительно антитела являются моноклональными антителами, а образец должен иметь достаточно высокий титр, чтобы позволить использование разбавлений.

Протоколы и материалы для проведения исследования антигенной массы Leptospira хорошо известны специалистам в данной области техники уже давно и, в целом, доступны, описаны и детально пояснены примерами в данном документе. Например, национальные центры биологических ресурсов, такие как ATCC (Manassas, VA, США) или CNCM (Institut Pasteur, Париж, Франция), могут предоставить бактерии Leptospira большинства сероваров, предоставить клеточные линии мышиной гибридомы, экспрессирующие специфический серовар и агглютинирующие моноклональные антитела или их гибридомы, см. Schoone et al. (1989, J. of Gen. Microbiol., vol. 135, p. 73).

В качестве альтернативы такие материалы могут быть произведены по стандартной методике с помощью стандартных технологий: бактерии могут быть получены от инфицированных людей или животных (применяя соответствующие меры биологической безопасности) и охарактеризованы с помощью обычных технологий; антиген может быть получен путем пролиферации Leptospira с использованием обычных технологий; также сероварспецифические антитела могут быть получены путем иммунизации экспериментальных животных, а способы получения моноклональных антител хорошо известны. Специалисты в данной области техники легко определят специфичность и титр таких антител, например, выполняя хорошо известный MAT.

Также несколько правительственных организаций и международных организаций предоставляют эталонные образцы бактерий Leptospira, антигенов и специфических антител, например, для исследования развития. Например, Королевский Тропический Институт (the Royal Tropical Institute, Амстердам, Нидерланды), который является центром эталонов по Leptospira для Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), Всемирной организации по продовольствию (ФАО) и Международного эпизоотического бюро (OIE). Также Министерство сельского хозяйства США (USDA, Ames, IA, США) предоставляет стандартные эталонные бактерины большинства сероваров Leptospira, поддерживает заинтересованные стороны протоколами и материалами для наладки и выполнения ELISA количества (потентности) антигена.

В ином случае к развитию и (или) стандартной наладке исследования количества антигена Leptospira может быть привлечена одна из многих (коммерческих) организаций по диагностическому сервису.

По данному изобретению «повышение антигенной массы» достигается способом по данному изобретению, если более высокая антигенная масса обнаруживается в культуре Leptospira, в которую добавили полиненасыщенную C18 жирную кислоту по сравнению с антигенной массой такой же или сходной культуры Leptospira, в которую не добавляли полиненасыщенную C18 жирную кислоту при всех прочих равных условиях. Увеличение антигенной массы на 20% уже может быть детектировано со статистической достоверностью с использованием стандартных технологий, известных специалистам в данной области техники.

Следовательно, в предпочтительном варианте осуществления способа по данному изобретению, увеличение антигенной массы культуры Leptospira составляет, по меньшей мере, 20% по сравнению с антигенной массой сходной культуры Leptospira, в которую не добавляли полиненасыщенную C18 жирную кислоту.

Более предпочтительно, чтобы увеличение антигенной массы составляло, по меньшей мере, 25, 28, 30, 35, 40, 45, 50, 63, 77, 90, 100, 121, 150, 175, 184 или, по меньшей мере, 200% в порядке предпочтительности.

Для данного изобретения «сходная культура Leptospira» обозначает культуру Leptospira, которая в биологических терминах в высокой степени сравнима с культурой Leptospira, с которой ее сравнивают. Например, это может относиться к использованию культуры Leptospira из одного и того же изолята, штамма или серогруппы для проведения сравнения.

Примеры увеличения антигенной массы на единицу биомассы (по сравнению со сходной культурой без добавления) для различных серогрупп Leptospira, которые наблюдались авторами данного изобретения относительно сходных, но без добавления, культур, после применения способа по данному изобретению показывают: для Icterohaemorrhagiae - увеличение на 164%, для Sejroe (серовар Hardjo) - на 184%, для Grippotyphosa - на 63%, для Tarassovi - на 141%, для Pomona - на 73%, для Canicola - на 118% и для Australis (серовар Bratislava) - на 62%. Детали приведены в примерах и на чертежах. Различия эффекта могут быть специфичными для серогрупп Leptospira или могут быть связаны с характеристиками специфического материала штамма, который был использован из этого серовара. Тем не менее, все эти увеличения экономически оправданы в высокой степени.

Полезно в пределах обычных навыков специалистов в данной области техники оптимизировать увеличение антигенной массы, образующееся вследствие добавления полиненасыщенной C18 жирной кислоты, в соответствии со способом по данному изобретению, например, путем адаптации условий культуры, добавления или используемой Leptospira.

Эта информация в настоящее время позволяет дальнейшую оптимизацию культур Leptospira из разных серогрупп путем добавления конкретной полиненасыщенной C18 жирной кислоты, чтобы получить максимальное относительное увеличение соотношения антигенная масса/биомасса такой серогруппы, типа или штамма Leptospira.

Следовательно, в предпочтительных вариантах осуществления способа по данному изобретению:

- для серогруппы Icterohaemorrhagiae культуры Leptospira полиненасыщенная C18 жирная кислота представляет собой линоленовую кислоту (C18:3), а предпочтительно - α-линоленовую кислоту (αC18:3),

- для серогруппы Canicola культуры Leptospira полиненасыщенная C18 жирная кислота представляет собой линоленовую кислоту (C18:3),

- для серогруппы Pomona культуры Leptospira полиненасыщенная C18 жирная кислота представляет собой γ-линоленовую кислоту (γC18:3) и (или)

- для серогруппы Sejroe (серовар Hardjo) культуры Leptospira полиненасыщенная C18 жирная кислота представляет собой линолевую кислоту (C18:2),

то есть жирная кислота может быть также предоставлена в культуру Leptospira в форме производного жирной кислоты или в форме соединения или композиции, сравнительно обогащенной жирной кислотой, как определено в данном документе.

В принципе какая-либо полиненасыщенная C18 жирная кислота, как определено выше, может быть использована в способе по данному изобретению и обеспечить в целом такой же эффект. Даже более того: авторы данного изобретения обнаружили, что различные типы полиненасыщенных C18 жирных кислот могут также быть внесены в культуру при соединенном добавлении, в результате чего их эффекты на увеличение антигенной массы оказываются суммирующимися.

Это проиллюстрировано в данном документе, например, для Leptospira серогруппы Icterohaemorrhagiae, где добавление комбинации по 50 мкг/мл каждой из линолевой кислоты и α-линоленовой кислоты дает увеличение антигенной массы, которое очень близко к среднеарифметическому отдельных относительных увеличений антигенной массы от добавлений в культуры (в одном и том же эксперименте) 100 мкг/мл каждой из линолевой кислоты или α-линоленовой кислоты.

Соединенное добавление полиненасыщенных C18 жирных кислот в способе по данному изобретению может представлять собой добавление смеси жирных кислот (или их производных, или соединений или композиций относительно обогащенных такими жирными кислотами), или раздельными добавлениями, либо одновременными, либо разделенными во времени.

Следовательно, в варианте осуществления полиненасыщенная C18 жирная кислота добавляется в культуру Leptospira путем использования композиции, которая естественным образом содержит более чем одну полиненасыщенную C18 жирную кислоту. Примерами являются растительные (зерновые) масла, например, рапсовое или льняное масло, которые относительно богаты и C18:2, и α-C18:3, или конопляное масло, которое относительно богато C18:2, α-C18:3 и γ-C18:3.

«Leptospira» обозначает, в целом, бактерии из таксономического рода бактерий спирохет такого названия. Они включают в себя также Leptospira, которые являются подразделениями (этого рода) какого-либо вида, например, такие как подвид, штамм, изолят, генотип, серотип, серовар, серогруппа, вариант или подтип и подобное. Такие Leptospira обладают общими характерными признаками членов их таксономических семейств, таких как геномные, физические, электронно-микроскопические и биохимические характеристики, так же как и биологические характеристики, такие как физиологические, иммунологические, или патогенное поведение. Помимо серологической классификации другие определения могут быть основаны на нуклеотидной последовательности или исследовании ПЦР (полимеразной цепной реакции), как это известно в данной области техники.

Специалистам в данной области техники ясно, что род бактерий, являющийся предметом данного изобретения, пока именуется Leptospira, но эта таксономическая классификация может быть изменена по мере того, как новые знания приведут к ее переклассификации в новую или другую таксономическую группу. Однако поскольку это не изменяет микроорганизма или его характеристических признаков, о которых идет речь, а лишь его научное наименование или классификацию, такой переклассифицированный организм остается в сфере данного изобретения.

Предпочтительной Leptospira для использования по данному изобретению является Leptospira, которая патогенна для одного или более вида животных или человека; более предпочтительной является, по меньшей мере, одна серогруппа, выбранная из L. interrogans (sensu laid) Canicola, Icterohaemorrhagiae, Australis, Grippotyphosa, Pomona, Tarassovi, Sejroe и Autumnalis.

Даже более предпочтительным является, по меньшей мере, один серовар, выбранный из L. interrogans (sensu lato) Canicola, Portland-vere, Icterohaemorrhagiae, Copenhageni, Bratislava, Australis, Grippotyphosa, Dadas, Pomona, Tarassovi, Gatuni, Hardjo, Saxkoebing и Autumnalis.

Термин «культура» по данному изобретению - это композиция, содержащая бактерии Leptospira. Бактерии в культуре Leptospira по данному изобретению могут находиться при разных плотностях или условиях: интактные или нет, живые или мертвые, (частично) разрушенные или инактивированные и т. д. Бактерии могут находиться в какой-либо фазе клеточного цикла, такой как пролиферация, стадия покоя или спящие клетки. Культура может быть пролиферирующей культурой, в которую Leptospira внесена недавно, в ранней, средней, поздней экспоненциальной или логарифмической фазе. Или же культура может быть статической или стационарной культурой, где Leptospira находится в лаг-фазе или в культуре, из которой собирают бактерии, или в культуре для хранения.

Композиция, содержащая бактерии Leptospira, может быть жидкой, твердой или полутвердой, замороженной или замороженной и высушенной. Композиция может быть культуральной средой или средой для хранения и может содержать стабилизатор или другую фармакологически приемлемую добавку или носитель. Помимо прочего такая культура содержит клеточную суспензию.

В предпочтительном варианте осуществления культура для использования в способе по данному изобретению находится в жидкой форме, поскольку это облегчает захват Leptospira полиненасыщенной C18 жирной кислоты.

По данному изобретению термин «содержащий» (как и вариации, такие как «содержать», «содержит» и «содержащий»), как он используется в данном документе, обозначает все элементы и какие-либо возможные комбинации, мыслимые по данному изобретению, которые охвачены или включают в себя в разделах текста, параграфах, заявке и т. д., в которых этот термин используется, даже если такие элементы или их комбинации не упоминаются особо, и не означает исключения каких-либо таких элементов или их комбинаций. Следовательно, какие-либо такие разделы текста, пункты, формулы и т. д. также могут относиться к одному или более вариантам осуществления, в которых термин «содержащий» (или его варианты) замещен такими терминами, как «состоит из», «состоящий из» или «в основном состоящий из».

Для данного изобретения термин «дополняющий» имеет обычное значение: добавление для покрытия недостатка или для пополнения или увеличения чего-либо (из American heritage dictionary, ed. Houghton Miflin Co., Бостон, США).

Пути, которыми проводится добавление полиненасыщенной C18 жирной кислоты по способу по данному изобретению, в принципе не ограничены, если только может быть достигнут эффект упомянутого способа: относительное увеличение антигенной массы. Таким образом, по способу по данному изобретению добавление полиненасыщенной C18 жирной кислоты может быть выполнено путем добавления в существующую культуру Leptospira либо однократно, либо повторно, либо непрерывно. В качестве альтернативы добавление в культуру Leptospira по способу по данному изобретению может быть выполнено путем внесения определенной концентрации полиненасыщенной C18 жирной кислоты в момент образования культуры Leptospira по данному изобретению. Например, путем внесения определенной концентрации полиненасыщенной C18 жирной кислоты в культуральную среду, в которую культура Leptospira инокулируется и в которой она пролиферирует, или в среду для отмывки, хранения или инкубации, в которой культура Leptospira содержится или обрабатывается.

Также добавление полиненасыщенной C18 жирной кислоты может происходить в различных временных точках жизненного цикла Leptospira, как в ранней, средней или поздней стадии активной пролиферации культуры или в хранящийся образец, при этом при разных плотностях бактериальных клеток.

Полиненасыщенная C18 жирная кислота может существовать в различных формах и может быть добавлена различными путями. Дополнительные возможности вариаций и оптимизации этих условий описаны и приведены в примерах данного документа и находятся в пределах обычных возможностей специалистов в данной области техники.

В предпочтительном варианте осуществления добавление по способу по данному изобретению выполняется путем добавления полиненасыщенной C18 жирной кислоты в пролиферирующую культуру Leptospira и путем градуального добавления во времени.

По данному изобретению «полиненасыщенная C18 жирная кислота» обозначает химическое соединение, которое представляет собой жирную кислоту или ее производное, но также полиненасыщенную C18 жирную кислоту в смеси или комплексе, или в соединении или композиции, которые относительно обогащены полиненасыщенной C18 жирной кислотой. Соединение или композиция «относительно обогащены» полиненасыщенной C18 жирной кислотой, если они содержат полиненасыщенную C18 жирную кислоту в количестве, по меньшей мере, около 5% общего количества жирных кислот. Предпочтительно, по меньшей мере, около 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50% общего количества жирных кислот в порядке предпочтительности.

Определение содержания жирной кислоты, так же как и дифференциация на относительные количества индивидуальных жирных кислот, обычно может быть выполнено специалистами в данной области техники, например, путем экстракции или газовой хроматографии. Примеры соединений и композиций, которые относительно обогащены полиненасыщенной C18 жирной кислотой, для использования по способу по данному изобретению описаны ниже.

Термин «полиненасыщенная C18 жирная кислота» используется в его обычном значении, относящемся к жирной кислоте с углеводородной цепью, содержащей 18 атомов углерода (С), и чья углеводородная цепь содержит более чем одну двойную (ненасыщенную) связь.

В данной области техники известны конъюгированные полиненасыщенные C18 жирные кислоты, которые продуцируются (следовательно, не потребляются) бактериями, такими как Lactobacilli в рубце жвачных.

В предпочтительном варианте осуществления полиненасыщенная C18 жирная кислота для использования по данному изобретению является неконъюгированной.

В другом предпочтительном варианте осуществления полиненасыщенная C18 жирная кислота для использования по данному изобретению представляет собой метиленразделенный полиен, не разветвленный и (или) не связанный с циклоалкановым кольцом.

В еще одном предпочтительном варианте осуществления полиненасыщенная C18 жирная кислота для использования по данному изобретению представляет собой ω3 или ω6 полиненасыщенную C18 жирную кислоту.

В еще одном предпочтительном варианте осуществления полиненасыщенная C18 жирная кислота для использования по данному изобретению представляет собой одну или более кислоту, выбранную из группы, состоящей из C18:2, C18:3 и C18:4.

В наиболее предпочтительном варианте осуществления полиненасыщенная C18 жирная кислота для использования по данному изобретению представляет собой одну или более кислоту, выбранную из группы, состоящей из: линолевой кислоты, α-линоленовой кислоты, γ-линоленовой кислоты или стеаридоновой кислоты.

«Линолевая кислота» представляет собой C18:2, n-6, δ 9,12 жирную кислоту с научным наименованием: 9, 12-октадекадиеновая кислота и CAS № 60-33-3. Предпочтительно обе ее двойные связи присутствуют в цис-форме.

Линоленовая кислота представляет собой C18:3 жирную кислоту с двумя изомерными формами: α-линоленовая кислота и γ-линоленовая кислота.

«α-линоленовая кислота» представляет собой C18:3, n-3, δ 9, 12, 15 жирную кислоту с научным наименованием: 9, 12, 15-октадекатриеновая кислота и CAS № 463-40-1. Предпочтительно все ее двойные связи присутствуют в цис-форме.

«γ-линоленовая кислота» представляет собой C18:3, n-6, δ 6, 9, 12 жирную кислоту с научным наименованием: 6, 9, 12-октадекатриеновая кислота и CAS № 506-26-3. Предпочтительно все ее двойные связи присутствуют в цис-форме.

«Стеаридоновая кислота» представляет собой C18:4, n-3, δ 6, 9, 12, 15 жирную кислоту с научным наименованием 6, 9, 12, 15-октадекатетраеновая кислота и CAS № 20290-75-9. Стеаридоновая кислота также известна как мороктовая кислота. Предпочтительно все ее двойные связи присутствуют в цис-форме.

Полиненасыщенная C18 жирная кислота может быть природного или синтетического происхождения и может быть выделена или присутствовать в какой-то степени чистоты. Также полиненасыщенная C18 жирная кислота может быть связана, присоединена или эстерифицирована с другими химическими группами. Все эти формы допустимы, если полиненасыщенная C18 жирная кислота биологически доступна для культуры Leptospira, и может быть достигнут эффект способа по данному изобретению. Предпочтительно полиненасыщенная C18 жирная кислота имеет форму, которая не слишком токсична для культуры Leptospira и которая может быть использована в контексте условий водной культуры.

Специалисты в данной области техники могут легко определить, может ли полиненасыщенная C18 жирная кислота, производное или соединение или композиция, содержащая полиненасыщенную C18 жирную кислоту, быть использована в способе по данному изобретению, или она слишком токсична или непригодна по деталям и примерам, приведенным в данном документе. Это достигается, например, путем тестирования такой жирной кислоты, производного, соединения или композиции в ферментациях Leptospira лабораторного масштаба и определения количества антигена LPS Leptospira в определенном количестве клеток и сравнения этого с количеством антигена в клетках схожей культуры Leptospira, в которую не добавляли соединения или композиции, содержащих полиненасыщенную C18 жирную кислоту.

Примеры полиненасыщенных C18 жирных кислот, производных, соединений и композиций для использования по данному изобретению представляют собой: полиненасыщенную C18 жирную кислоту, доступную с различной степенью чистоты от всех основных поставщиков биохимических препаратов. Также полиненасыщенная C18 жирная кислота может быть связана или образовывать комплекс с молекулой-носителем, такой как белок или белковый комплекс (например, сыворотка или альбумин, фермент (ацил-CoA) или эстерифицированный с глицерином или холестерином, или как липопротеин, фосфолипид (связанный с фосфатом), или гликолипид или липополисахарид (связанный с углеводным остатком). Также полиненасыщенная C18 жирная кислота может присутствовать как минорный кислотный компонент композиции других жирных кислот. В качестве альтернативы полиненасыщенная C18 жирная кислота может присутствовать в соединении или композиции, относительно обогащенной полиненасыщенной C18 жирной кислотой, такой как растительное (из семян) масло.

Поскольку жирная кислота обычно плохо растворима в водной среде, полиненасыщенная C18 жирная кислота или производное, или соединение, или композиция, относительно обогащенная полиненасыщенной C18 жирной кислотой, могут быть выполнены в виде препарата, который облегчает его добавление в культуру Leptospira, так чтобы сделать их биодоступными или поддерживать их в этом состоянии. Например, полиненасыщенная C18 жирная кислота может быть физически диспергирована или химически эмульгирована или смешана с растворителем. Она может быть соединена с носителем, таким как целлюлоза, циклодекстрин или холестерин, или с использованием BSA или сыворотки, как описано выше; в качестве альтернативы полиненасыщенная C18 жирная кислота может быть перенесена через адсорбент в виде микрочастиц, такой как, например, Celite® или Amberlite® (фирма Spector & Hoak, см. выше).

Предпочтительным путем добавления в культуру Leptospira полиненасыщенной C18 жирной кислоты по способу по данному изобретению является добавление к культуре BSA, устроенного так, чтобы содержать большое количество полиненасыщенной C18 жирной кислоты.

Следовательно, в предпочтительном варианте осуществления способа по данному изобретению полиненасыщенная C18 жирная кислота добавляется в форме комплекса с BSA.

Полиненасыщенная C18 жирная кислота может быть загружена на BSA простой совместной инкубацией, пока BSA не насытится полиненасыщенной C18 жирной кислотой. Связывание жирной кислоты с BSA температурно- и pH-зависимо, как это известно в данной области техники и описано, например, в: Spector & Hoak (см. выше), и Ashbrook et al. (1975, J. of Biol. Chem., vol. 250, p. 2333). Уровень загрузки полиненасыщенной C18 жирной кислоты на BSA может быть легко проанализирован с помощью газовой хроматографии, как описано ниже. Сколько полиненасыщенной C18 жирной кислоты может быть захвачено BSA, зависит от типа и качества BSA, так же как и от количества жирной кислоты, которая уже связалась. Если желательна максимальная загрузка полиненасыщенной C18 жирной кислоты, BSA может быть сначала делипидирована путем экстракции, а затем перезагружена исключительно полиненасыщенной C18 жирной кислотой. BSA, который нагружен (дополнительной) полиненасыщенной C18 жирной кислотой, может быть использован в культурах Leptospira вместо или в дополнение к BSA или сыворотке, которые уже используются в культуральной среде.

Авторы данного изобретения обнаружили, что эффективное добавление по способу по данному изобретению было возможно с использованием BSA, который построен так, чтобы содержать полиненасыщенную C18 жирную кислоту в количестве, по меньшей мере, около 10% вес./вес. от его жирных кислот.

Следовательно, предпочтительной композицией для добавления полиненасыщенной C18 жирной кислоты по способу по данному изобретению является препарат BSA, содержащий полиненасыщенную C18 жирную кислоту в количестве, по меньшей мере, около 10% вес./вес. свободных жирных кислот, предпочтительно содержащий, по меньшей мере, 12, 15, 18, 20, 21, 23, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 75, 80, 90, 95 или 99% вес./вес. свободных жирных кислот в виде полиненасыщенной C18 жирной кислоты в порядке предпочтительности.

Специалисты в данной области техники оценят, что когда в культуру Leptospira добавляют полиненасыщенную C18 жирную кислоту по способу по данному изобретению с помощью препарата BSA, это может увеличить белковую нагрузку культуры и, таким образом, количество продуцируемой ею вакцины. Это может иметь эффект на уровень побочных эффектов вакцинации. Такая культура может, следовательно, требовать стадии очистки, чтобы удалить избыток белков. Однако поскольку такая очистка все равно часто проводится, поэтому добавление полиненасыщенной C18 жирной кислоты в комплексе с BSA или сывороткой является высокоэффективным путем увеличения антигенной массы культуры Leptospira.

Полиненасыщенная C18 жирная кислота (ее препарат) может быть добавлена в культуру Leptospira по способу по данному изобретению различными путями, например, импульсно или более постепенно в течение времени. Импульсное добавление, например, означает добавление всей полиненасыщенной C18 жирной кислоты в течение около 1 часа, и это наиболее подходящий путь в случае, если культура является статичной. Для пролиферирующих культур Leptospira наиболее походящим добавлением является постепенное добавление, которое означает добавление всей полиненасыщенной C18 жирной кислоты в период времени между около 1 до около 6 часов. Подпитываемое добавление в пролиферирующую культуру означает подачу полиненасыщенной C18 жирной кислоты (ее препарата), происходящую в течение большей части культивирования.

В предпочтительном варианте осуществления способа по данному изобретению в пролиферирующую культуру Leptospira добавление происходит постепенно или в режиме подпитки.

Количество полиненасыщенной C18 жирной кислоты, которое добавляется в культуру Leptospira, чтобы достигнуть относительного увеличения антигенной массы по способу по данному изобретению, в принципе, ограничено только тем, что возможно с практической, экономической и биологической точек зрения. Например, практические соображения состоят в том, что сосуд ферментирования с пролиферирующей культурой не должен открываться много раз для внесения добавок, поскольку это может негативно повлиять на безопасность работы и его стерильность. С другой стороны, когда культура, в которую нужно внести добавку, не является активно пролиферирующей, такая как конечная культура или культура хранения, существует намного меньший риск загрязнения активно пролиферирующей культуры. К экономическим соображениям относятся, например, материальные затраты на добавление больших количеств чистой полиненасыщенной C18 жирной кислоты или специального продукта, соединенного с полиненасыщенной C18 жирной кислотой.

Биологические соображения состоят в том, что свободные жирные кислоты могут быть токсичными для живых клеток, хотя это и не так актуально для статической культуры. Следовательно, когда добавляются большие количества полиненасыщенной C18 жирной кислоты в пролиферирующую культуру за короткий промежуток времени, должны быть предприняты меры, чтобы смягчить или предупредить токсичность жирной кислоты для Leptospira, например, путем введения полиненасыщенной C18 жирной кислоты в комплексе для уменьшения токсичности, как описано выше. В качестве альтернативы полиненасыщенная C18 жирная кислота может быть добавлена во времени постепенно.

Еще один параметр, который учитывается, - это условия каждого конкретного случая: количество, статус и тип Leptospira, так же как и среда инкубации, температура, pH и т. д. Вместе с деталями и примерами данного документа варьирование и оптимизация количества и пути, которым добавляется полиненасыщенная C18 жирная кислота в культуру Leptospira в контексте способа по данному изобретению, находятся в пределах возможностей специалистов в данной области техники.

Вероятно, Leptospira в культуре потребляет полиненасыщенную C18 жирную кислоту, насколько это возможно. См., например, фиг. 2, 3 и 13, 14, которые иллюстрируют то, что линолевая кислота и линоленовая кислота очень быстро потребляются и преобразуются в антигенную массу в отличие от пальмитиновой кислоты и олеиновой кислоты. Это означает, что общее количество антигенной массы, генерирующейся в такой культуре, обусловлено суммарным общим количеством полиненасыщенной C18 жирной кислоты, которая была доступна для культуры в ходе инкубации. По данному изобретению показатель количества полиненасыщенной C18 жирной кислоты, которую добавили в культуру, следовательно, относится к общему количеству полиненасыщенной C18 жирной кислоты, которая была доступна в ходе пролиферации или инкубации культуры Leptospira, как если бы вся полиненасыщенная C18 жирная кислота была доступна в единичный момент времени. Оно выражено как концентрация, основанная на общем объеме культуры. Это не зависит от формы или объема смеси, в которой содержится полиненасыщенная C18 жирная кислота, и включает в себя добавления, сделанные всеми компонентами среды.

Следовательно, специалистам в данной области техники ясно, что часто невозможно точно определить эту общую концентрацию полиненасыщенной C18 жирной кислоты, внесенной в культуру Leptospira. С одной стороны, поскольку это суммарное количество внесенной полиненасыщенной C18 жирной кислоты за промежуток времени и от разных компонентов. С другой стороны, поскольку культура Leptospira уже захватила и переработала часть ее еще до взятия образца.

Например, авторы данного изобретения продемонстрировали, что существенное увеличение антигенной массы могло быть получено при добавлении в культуру Leptospira по способу по данному изобретению линолевой кислоты, если на мл культуры были доступны 25 мкг линолевой кислоты, по сравнению с культурой, в которой было доступно только около 5 мкг/мл.

То же самое относится к линоленовой кислоте, хотя стандартная культуральная среда EMJH содержит незначительные количества C18:3. Следовательно, в принципе добавление какого-либо количества C18:3 в культуру Leptospira уже полезна для ее соотношения антигенная масса/биомасса. На практике количество C18:3, которое может быть добавлено, начинается с около 5 мкг/мл.

При больших количествах доступной полиненасыщенной C18 жирной кислоты антигенная масса продолжает нарастать. При наивысшем проверенном уровне доступности выше 300 мкг/мл полиненасыщенной C18 жирной кислоты в культуре Leptospira может быть обнаружена некоторая токсичность для некоторых сероваров. Однако этот эффект наблюдался, когда для добавления использовали препарат чистой полиненасыщенной C18 жирной кислоты, и он может быть преодолен путем соответствующей детоксикации полиненасыщенной C18 жирной кислоты в комплексе, как описано выше.

Следовательно, в варианте осуществления данное изобретение предоставляет способ увеличения антигенной массы культуры Leptospira, способ включает стадию инкубации упомянутой культуры Leptospira в условиях, в которых, по меньшей мере, 15 мкг/мл линолевой кислоты и (или), по меньшей мере, 5 мкг/мл линоленовой кислоты делались доступны для упомянутой культуры.

Как описано ниже, добавление различных полиненасыщенных C18 жирных кислот, как определено выше, может также быть объединено, что дает суммирующийся эффект на культуру Leptospira. Следовательно, общее количество полиненасыщенных C18 жирных кислот, которые доступны для культуры Leptospira, может, таким образом, быть основано на сумме количеств разных полиненасыщенных C18 жирных кислот, которые были соединены.

Следовательно, в предпочтительном варианте осуществления способа по данному изобретению способ включает стадию инкубации культуры Leptospira в условиях, в которых, по меньшей мере, 15 мкг полиненасыщенной C18 жирной кислоты/мл были доступны для упомянутой культуры. Более предпочтительно, по меньшей мере, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 32, 35, 37, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или, по меньшей мере, 100 мкг полиненасыщенной C18 жирной кислоты/мл были доступны для упомянутой культуры в порядке предпочтительности.

В еще одном предпочтительном варианте осуществления способа по данному изобретению способ включает стадию инкубации культуры Leptospira в условиях, в которых между около 15 и 1000 мкг полиненасыщенной C18 жирной кислоты/мл было доступно для упомянутой культуры. Более предпочтительно между около 20 и 500 мкг/мл, между около 20 и 300 мкг/мл или между около 25 и 250 мкг полиненасыщенной C18 жирной кислоты/мл были доступны для упомянутой культуры в порядке предпочтительности.

В варианте осуществления данное изобретение предоставляет способ увеличения антигенной массы культуры Leptospira, способ включает стадию добавления в упомянутую культуру Leptospira полиненасыщенной C18 жирной кислоты в условиях, в которых, по меньшей мере, 15 мкг полиненасыщенной C18 жирной кислоты/мл были доступны для упомянутой культуры; в которой Leptospira представляет собой, по меньшей мере, одну серогруппу, выбранную из L. interrogans (sensu lato) Canicola, Icterohaemorrhagiae, Australis, Grippotyphosa, Pomona, Tarassovi, Sejroe и Autumnalis и в которой увеличение антигенной массы упомянутой культуры Leptospira составляет, по меньшей мере, 20% по сравнению с антигенной массой схожей культуры Leptospira, в которую не добавляли полиненасыщенную C18 жирную кислоту.

Еще один объект данного изобретения предоставляет культуру Leptospira, которую можно получить по способу по данному изобретению, в котором упомянутая культура Leptospira имеет увеличенную антигенную массу.

Такая культура Leptospira по данному изобретению отличается от культуры Leptospira предшествующего уровня техники тем, что культура Leptospira имеет антигенную массу, которая существенно увеличена в результате добавления полиненасыщенной C18 жирной кислоты по способу по данному изобретению. Увеличенная антигенная масса легко обнаружима и количественно оценивается, как описано: увеличение антигенной массы на 20% или более является достоверным и обнаружимым, как описано выше.

Увеличение антигенной массы является относительным к антигенной массе схожей культуры Leptospira в сходных условиях, но без добавления полиненасыщенной C18 жирной кислоты по способу по данному изобретению, как описано выше.

Следовательно, культура Leptospira по данному изобретению характеризуется тем, что антигенная масса упомянутой культуры Leptospira увеличена, по меньшей мере, на 20% по сравнению с антигенной массой схожей культуры Leptospira, в которую не добавляли полиненасыщенную C18 жирную кислоту.

Более предпочтительно культура Leptospira по данному изобретению характеризуется тем, что антигенная масса упомянутой культуры Leptospira увеличена, по меньшей мере, на 22, 24, 25, 28, 30, 35, 40, 45, 50, 63, 77, 90, 100, 121, 150, 175, 184 или, по меньшей мере, на 200% в порядке предпочтительности по сравнению с антигенной массой схожей культуры Leptospira, в которую не добавляли полиненасыщенную C18 жирную кислоту.

Культура Leptospira по данному изобретению может быть получена способом по данному изобретению, как это описано, например, путем добавления в пролиферирующую или стационарную культуру Leptospira или продукцию культуры полиненасыщенной C18 жирной кислоты, ее производного или соединения или композиции, которые относительно обогащены полиненасыщенной C18 жирной кислотой. Это имеет несколько полезных применений, среди которых вакцины против лептоспироза.

Еще один объект данного изобретения относится к культуре Leptospira по данному изобретению или изготовлению упомянутой культуры для использования в вакцине против лептоспироза.

Предпочтительно культура Leptospira для использования в вакцине против лептоспироза по данному изобретению существует в форме инактивированной культуры Leptospira по данному изобретению.

По данному изобретению «изготовление» культуры Leptospira по данному изобретению может быть фрагментом такой культуры, например, экстрактом, разрушенным ультразвуком или фильтратом или фрагментами клеток из культуры Leptospira по данному изобретению, такими как часть наружной оболочки, содержащей LPS, очищенный LPS или часть упомянутого LPS.

Следовательно, еще один объект данного изобретения предоставляет вакцину против лептоспироза, содержащую культуру Leptospira по данному изобретению или препарат упомянутой культуры.

«Вакцина» по данному изобретению представляет собой фармацевтическую композицию, содержащую иммунологически эффективное количество (препарата) культуры Leptospira по данному изобретению и фармацевтически приемлемый носитель. Вакцина индуцирует эффективный иммунный ответ против лептоспироза.

«Фармацевтически приемлемый носитель» предназначен способствовать эффективному введению фармацевтически активного соединения без того, чтобы вызвать (жестокие) побочные эффекты на здоровье объектов, которым оно вводится. Фармацевтически приемлемым носителем может быть, например, стерильная вода или стерильный физиологический раствор. В более сложных формах носитель может быть, например, буфером, который содержит дополнительные добавки, такие как стабилизаторы или консервирующие вещества.

Происходящий из лептоспир компонент вакцины против лептоспироза по данному изобретению индуцирует в мишени - человеке или животном - иммунный ответ, который помогает предотвратить, ослабить или уменьшить инфекцию Leptospira или интенсивность клинических признаков лептоспироза, вызванного инфицированием Leptospira. Это может быть результатом уменьшения колонизации или уменьшения зараженности Leptospira, приводящих к уменьшению числа или суровости повреждений и эффектов, вызванных Leptospira, или реакции мишени на них. В дополнение это уменьшает экскрецию Leptospira (с мочой) и, таким образом, распространение во внешней среде, что уменьшает риск зоонозной инфекции.

Состав иммунологически эффективного количества вакцины против лептоспироза по данному изобретению зависит от желаемого эффекта и специфических характеристик используемой вакцины, а также мишени, к которой она применяется. Для вакцины против лептоспироза, основанной на бактерине, которая действует в основном путем гуморального иммунного ответа, известна корреляция между определенной антигенной массой и иммунопротективной силой вакцины в отношении мишени. Следовательно, определение эффективного количества находится вполне в пределах знаний обычного практика, например, путем контроля иммунологического ответа на вакцинацию или проверки иммунности при инфицировании, например, путем контроля клинических признаков заболевания у мишени, серологических параметров или путем повторного выделения патогена и сравнения его с ответами, наблюдаемыми на невакцинированных животных.

В предпочтительном варианте осуществления вакцина по данному изобретению дополнительно содержит стабилизатор, например, чтобы защитить уязвимые для деградации компоненты, и (или) чтобы увеличить срок длительности хранения вакцины. В целом, такие стабилизаторы представляют собой большие молекулы с высоким молекулярным весом, такие как липиды, углеводы или белки; например, молочный порошок, желатин, сывороточный альбумин, сорбитол, трегалоза, спермидин, декстран или поливинилпирролидон и буферы, такие как фосфаты щелочных металлов.

Предпочтительно стабилизаторы представляют собой свободные соединения животного происхождения или даже химически определенные, как описано в WO 2006/094974.

Также могут быть добавлены консервирующие вещества, такие как тимеросал, фенольные соединения и (или) гентамицин.

Общие технологии и процедуры вакцинологии хорошо известны в данной области техники и описаны, например, в правительственных постановлениях, таких как Фармакопея, и в известных учебниках, таких как: «Veterinary vaccinology» (P. Pastoret et al. ed., 1997, Elsevier, Amsterdam, ISBN: 0444819681), и: «Remington: the science and practice of pharmacy» (2000, Lippincot, USA, ISBN: 683306472).

Объектами-мишенями вакцины по данному изобретению могут быть люди или широкое разнообразие животных, которые восприимчивы к инфицированию Leptospira. Предпочтительными мишенями являются одна или более, выбранная из людей, собак, свиней, коров, лошадей, коз, овец и оленей. В принципе, мишенью могут быть здоровые или больные, позитивные или негативные на присутствие Leptospira или антител против Leptospira. Также мишень может быть в любом возрасте, в котором допустима вакцинация. Однако, очевидно, что лучше вакцинировать здоровые неинфицированные мишени и вакцинировать, как можно раньше, чтобы предупредить какую-либо полевую инфекцию.

Вакцина по данному изобретению может служить эффективной примирующей вакцинацией, за которой затем может следовать усиливающая вторичная вакцинация.

Вакцина по данному изобретению может равным образом быть использована как профилактическое и как терапевтическое лечение, поскольку она влияет и на возникновение, и на развитие инфекции Leptospira или клинических признаков заболевания.

Схема применения вакцины по данному изобретению к мишеням может быть однодозовой или многодозовой, которая может быть дана одномоментно или последовательно, способом, совместимым с дозировкой и формой, и в таком количестве, которое является иммунологически эффективным.

Идеально, если протокол введения вакцины по данному изобретению включен в существующие расписания вакцинаций другими вакцинами, которые могут потребоваться мишени.

Вакцина по данному изобретению предпочтительно применяется как разовая годичная доза.

Вакцина по данному изобретению может содержать количество Leptospira из культуры по данному изобретению или ее препарат, соответствующий между 1×10⁶ и 1×10¹⁰ бактериальных клеток на дозу, предпочтительно между 1×10⁷ и 5×10⁹ на дозу.

Вакцины по данному изобретению могут быть введены в объеме, который соответствует мишени, и могут составлять между около 0,1 и 10 мл по объему. Предпочтительно одна доза составляет между около 0,25 и 3 мл.

Вакцина по данному изобретению может быть введена мишени способами, известными в данной области техники. Например, как парентеральное введение каким-либо путем инъекции в или через кожу: например, внутримышечно, внутривенно, интраперитонеально, внутрикожно, под слизистую или подкожно. Альтернативными пригодными путями внесения являются местное нанесение, ингаляция или пищевой путь.

Предпочтительным путем внесения является внутримышечная или подкожная инъекция. Ясно, что оптимальный путь внесения зависит от конкретной формы используемой вакцины и конкретных характеристик мишени.

Вполне в силах специалистов в данной области техники далее оптимизировать вакцину по данному изобретению. В целом, это означает тонкую подстройку эффективности вакцины, так чтобы это дало значительную иммунную защиту. Это может быть выполнено путем подбора дозы вакцины или использования вакцины в иной форме или технологии изготовления лекарственных средств или подбором других составных частей вакцины (например, стабилизатора или адъюванта) или введением разными путями.

Вакцина может дополнительно содержать другие соединения, такие как адъювант, дополнительный антиген, цитокин и т. д. В качестве альтернативы вакцина по данному изобретению может быть предпочтительно соединена с фармацевтическим компонентом, например, антибиотиком, гормоном или противовоспалительным лекарством.

В предпочтительном варианте осуществления вакцина по данному изобретению характеризуется тем, что содержит адъювант.

«Адъювант» представляет собой известный ингредиент вакцины, который, в целом, представляет собой вещество, которое стимулирует иммунный ответ мишени неспецифическим образом. В данной области техники известно множество различных адъювантов. Примерами адъювантов являются полный и неполный адъювант Фрейнда, витамин Е, композиции алюминия, неионные блок-полимеры и полиамины, такие как декстрансульфат, Carbopol® и пиран.

Кроме того, такие пептиды, как мурамилдипептиды, диметилглицин, тафцин, часто используются как адъювант, а минеральное масло, например, Bayol™ или Markol™, Montanide™ или легкое парафиновое масло, растительные масла или комбинации продуктов, такие как ISA™ от Seppic™, или DiluvacForte™ могут быть применены с пользой. Эмульсии могут быть водными в масле (w/o), масляные в воде (o/w), вода в масле в воде (w/o/w), двойная масляная эмульсия (DOE) и т. д.

Предпочтительными адъювантами для вакцины по данному изобретению являются гидрат окиси алюминия или сапонин, такой как Quil A® или Q-vac®. Сапониновый компонент и вакцина могут быть объединены в ISCOM® (EP 109942, EP 180564, EP 242380).

Само собой разумеется, что другие пути применения адъювантов, добавления веществ-носителей или разбавителей, эмульгаторов или стабилизаторов вакцины также находятся в сфере данного изобретения.

Вакцина по данному изобретению может быть предпочтительно соединена с другим антигеном в комбинированную вакцину.

Следовательно, в более предпочтительном варианте осуществления вакцина по данному изобретению характеризуется тем, что она содержит дополнительный иммуноактивный компонент.

«Дополнительный иммуноактивный компонент» может представлять собой антиген, иммуноусиливающее вещество и (или) вакцину или может содержать адъювант. Дополнительный иммуноактивный компонент, когда он в форме антигена, может состоять из каких-либо антигенных компонентов, существенных для человека или ветеринарии. Предпочтительно дополнительный иммуноактивный компонент основывается на или происходит из другого микроорганизма, который является патогенными для мишени. Он может содержать, например, биологическую или синтетическую молекулу, такую как белок, углевод, липополисахарид, нуклеиновая кислота, кодирующая белковый антиген. Также клетка-хозяин, содержащая такую нуклеиновую кислоту, или живой рекомбинантный микроорганизм-носитель, содержащий такую нуклеиновую кислоту, могут быть вариантом доставки нуклеиновой кислоты или дополнительного иммуноактивного компонента. В качестве альтернативы они могут содержать фракционированный или убитый микроорганизм, такой как паразит, бактерия или вирус.

Дополнительный иммуноактивный компонент (компоненты) могут также быть иммуноусиливающим веществом, например, хемокином или иммуностимулирующей нуклеиновой кислотой, например, мотивом CpG. В качестве альтернативы вакцина по данному изобретению может сама быть добавлена в вакцину.

Предпочтительность использования комбинированной вакцины по данному изобретению состоит не только в индукции иммунного ответа против Leptospira, но также и против других патогенов мишени, при том что требуется только одно общение с мишенью для проведения вакцинации, что в результате уменьшает дискомфорт для мишени, как и затраты времени и труда.

Примерами таких дополнительных иммуноактивных компонентов являются в принципе все вирусные, бактериальные и паразитические патогены, пригодные для вакцинации мишени, которая также является мишенью вакцины против лептоспироза по данному изобретению.

Например, для свиней: свиной цирковирус, вирус репродуктивно-респираторный синдрома свиней, вирус псевдобешенства, свиной парвовирус, вирус классической чумы свиней, Mycoplasma hyopneumoniae, Lawsonia intracellularis, E. coli, Streptococcus spec., Salmonella spec., Clostridia spec., Actinobacillus pleuropneumoniae, Pasteurella spec., Haemophilus spec., Erysipelothrix spec., Bordetella spec. и т. д.

Для крупного рогатого скота: Neospora spec., Dictyocaulus spec., Cryptosporidium spec., Ostertagia spec., ротавирус коров, вирус вирусной диареи крупного рогатого скота, коронавирус крупного рогатого скота, вирус инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота (герпес-вирус крупного рогатого скота), парамиксовирус крупного рогатого скота, вирус парагриппа крупного рогатого скота, респираторно-синцитиальный вирус крупного рогатого скота, вирус бешенства, вирус синего языка овец, Pasteurella haemolytica, E. coli, Salmonella spec., Staphylococcus spec., Mycobacterium spec., Brucella spec., Clostridia spec., Mannheimia spec., Haemophilus spec., Fusobacterium spec. и т. д.

Для овец и коз: Toxoplasma gondii, вирус чумы мелких жвачных животных, вирус синего языка овец, вирус Schmallenberg, Mycobacterium spec., Brucella spec., Clostridia spec., Coxiella spec., E. coli, Chlamydia spec., Clostridia spec.*, Pasteurella spec., Mannheimia spec. и т. д.

Для собак или кошек: Ehrlichia canis, комплекс Leishmania donovani, Neospora caninum, парвовирус собак, вирус чумки собак, аденовирус собак типа 1 или 2, вирус гепатита собак, коронавирус собак, вирус парагриппа собак, вирус бешенства, feline калицивирус кошек, герпес-вирус кошек, вирус панлейкопении кошек, Clostridium spec., Hepatozoon spec., Borrelia burgdorferi, Bordetella bronchiseptica, Chlamydia spec. и виды Babesia или Theileria.

Для человека: Plasmodium, Leishmania, Toxoplasma, вирус ветряной оспы, ВИЧ (вирус иммунодефицита человека), вирус папилломы человека, вирус кори, вирус эпидемического паротита, вирус краснухи, вирус бешенства, полиовирус, ротавирус, респираторно-синцитиальный вирус, виды вируса гепатита, вирус гриппа, Haemophilus spec., Streptococcus spec., Corynebacterium spec., Bordetella spec., Neisseria spec. и Clostridium spec.

В альтернативном варианте осуществления комбинированная вакцина по данному изобретению может с пользой соединять Leptospira из более чем одной серогруппы L. interrogans, например, для мишеней-собак: L. interrogans (sensu lato) серогрупп Canicola и Icterohaemorrhagiae или L interrogans (sensu lato) серогрупп Canicola, Icterohaemorrhagiae, Australis и Grippotyphosa. Из них одна или более могут быть (происходить из) культуры Leptospira по данному изобретению; предпочтительно все, происходящие из культур Leptospira по данному изобретению.

В еще одном предпочтительном варианте осуществления комбинированной вакцины по данному изобретению комбинированная вакцина содержит (помимо дополнительного иммуноактивного компонента) одну или более Leptospira, которые соответствуют более чем одной серогруппе L. interrogans. Например, для мишени-свиньи комбинированная вакцина может содержать: L interrogans (sensu lato) серогруппы Canicola, Icterohaemorrhagiae, Australis, Grippotyphosa, Pomona и Tarassovi, как и Erysipelothrix rhusiopathiae и свиной парвовирус. В этой комбинации одна или более Leptospira может быть культурой Leptospira по данному изобретению, предпочтительно все культуры Leptospira по данному изобретению.

По практическим причинам и причинам, связанным с контролем процесса, полезно продуцировать каждый из антигенов Leptospira для такой комбинированной вакцины в отдельных культурах по данному изобретению. Это так, поскольку каждая из культур может тогда продуцироваться при оптимальных для нее условиях. Затем готовят отдельные антигены вакцины, и только потом разные антигены Leptospira объединяются.

Еще один объект данного изобретения относится к использованию культуры Leptospira по данному изобретению или препарата упомянутой культуры Leptospira для производства вакцины против лептоспироза.

«Производство» вакцины по данному изобретению выполняется средствами, хорошо известными специалистам в данной области техники. Такое производство, в целом, включает стадии смешивания и приготовления формы культуры Leptospira по данному изобретению или ее препарата с фармацевтически приемлемыми вспомогательными веществами, за чем следует разделение на порции в контейнерах соответствующего размера. Разные стадии процесса производства требуют контроля с помощью адекватных тестов качества и количества антигенов; микробиологических проверок на стерильность и отсутствие посторонних веществ и, наконец, in vitro или in vivo экспериментов, чтобы определить эффективность вакцины и ее безопасность. Все это известно специалистам в данной области техники.

Вакцина по данному изобретению может быть произведена в форме, которая подходит для введения мишеням, человеку или животному, и которая соответствует желательному пути введения и желаемому эффекту.

Хорошо известными формами вакцины являются, например, жидкая, гель, мазь, порошок, таблетка или капсула в зависимости от желательного способа введения мишени. Предпочтительно вакцина по данному изобретению готовится в форме инъекционной жидкости, такой как суспензия, раствор, взвесь или эмульсия. Обычно такие вакцины готовятся стерильными.

Один из вариантов осуществления вакцины по данному изобретению основывается на культуре Leptospira по данному изобретению, которая инактивирована. Такая инактивированная вакцина, основанная на бактерине, теперь может быть произведена по данному изобретению с помощью хорошо известных технологий.

Следовательно, еще один объект данного изобретения предоставляет способ продукции вакцины против лептоспироза, упомянутый способ включает стадии:

a. пролиферации культуры Leptospira в системе in vitro,

b. добавление в упомянутой культуре Leptospira полиненасыщенной C18 жирной кислоты,

c. инактивации и сбора упомянутой культуры Leptospira с добавлением, и

d. смешивания инактивированной культуры Leptospira с фармацевтически приемлемым носителем.

Способ выполняется по известным процедурам для пролиферации, инактивации и приготовления форм вакцины против лептоспироза. Сбор (продукции культуры) также проводится, как и при предшествующем уровне техники, за исключением того, что теперь больше вариантов выбора момента времени для сбора, чем при предшествующем уровне техники: если требуется антигенная масса, как при предшествующем уровне техники, сбор можно проводить раньше, чем при нем.

В качестве альтернативы, если желательна максимальная антигенная масса, культуре сначала позволяют пролиферировать до ее максимальной биомассы, как делалось ранее, но теперь продуцируется значительно большее количество антигена, если в культуру добавили полиненасыщенную C18 жирную кислоту по способу по данному изобретению.

Термин «пролиферирующая» имеет обычное значение - создание возможности и индукции бактерий Leptospira на прохождение ряда циклов клеточного деления. Пролиферация по данному изобретению включает в себя значение сходного термина, показывающего увеличение числа клеток и размера клеток, такого как «растущий», «культивируемый» или «амплифицируемый». Фазе пролиферации предшествует инокуляция, а ей, в свою очередь, может предшествовать отбор штамма, предварительное кондиционирование и (или) предварительная пролиферация.

«Система in vitro» представляет собой известный путь обеспечить пролиферацию бактерий Leptospira вне организма человека или животного, в контролируемых искусственных условиях. Обычно для этого используется хемостат или ферментер и (полу)определенная культуральная среда. Обычно контролируется и регулируется, когда требуется, несколько критических параметров ферментации, и это даже может быть автоматизировано. Технологии, материалы и оборудование для системы in vitro пролиферации бактериальных клеток любого масштаба хорошо известны и легкодоступны от многих коммерческих поставщиков медико-биологической промышленности.

В предпочтительном варианте осуществления способа продукции вакцины по данному изобретению введена промежуточная стадия, которая позволяет процессу не быть непрерывным. Промежуточная стадия введена между стадиями пролиферации и добавления и относится к сбору, хранению и (или) очистке культуры Leptospira, которая пролиферировала на первой стадии.

Следовательно, в предпочтительном варианте осуществления способ продукции вакцины против лептоспироза по данному изобретению содержит между первой и второй стадиями дополнительную стадию, содержащую сбор, хранение и (или) очистку культуры Leptospira.

Эта промежуточная стадия позволяет отдельное проведение и оптимизацию фаз пролиферации и добавления по способу по данному изобретению. Промежуточная стадия выполняется путем, который поддерживает жизнеспособность или биохимическую целостность культуры Leptospira, таким образом, который позволяет ее эффективное использование на следующих стадиях способа. Например, сбор (культуры) может быть проведен, например, путем центрифугирования или диафильтрации. В результате сбора Leptospira может оказаться в более концентрированной форме. Хранение может быть выполнено при температуре между около 2 и около 30°C в водной среде. Очистка может содержать обновление или замену среды пролиферации, например, чтобы предоставить оптимальные условия для последующих стадий. Каждая из этих манипуляций может быть выполнена отдельно, совместно или последовательно и в любом логическом порядке.

По способу по данному изобретению в культуру Leptospira добавляют полиненасыщенную C18 жирную кислоту. Однако полиненасыщенная C18 жирная кислота в виде ультрачистого химического вещества может быть слишком дорога для крупномасштабного использования в производстве низкорентабельного продукта, такого как используется в некоторых ветеринарных вакцинах. Следовательно, полиненасыщенная C18 жирная кислота для использования по этим способам может быть добавлена в различных формах и с различной чистотой, так же как и ее производное или соединение или композиция, которая относительно обогащена полиненасыщенной C18 жирной кислотой, как было определено выше.

Следовательно, еще один объект данного изобретения относится к использованию соединения или композиции, которые относительно обогащены полиненасыщенной C18 жирной кислотой по способу по данному изобретению.

Специалисты в данной области техники могут протестировать и отобрать соединения и композиции, которые сравнительно обогащены полиненасыщенной C18 жирной кислотой, и оптимизировать их использование по способу по данному изобретению.

Очень экономичным источником полиненасыщенной C18 жирной кислоты для использования по способу по данному изобретению являются растительные масла, поскольку известно, что некоторые из этих масел содержат высокий уровень полиненасыщенной C18 жирной кислоты, экономичны по цене и доступны по качеству и чистоте, которые приемлемы для использования по способам по данному изобретению.

Следовательно, в предпочтительном варианте осуществления использования по данному изобретению соединение или композиция, которые относительно обогащены полиненасыщенной C18 жирной кислотой, представляют собой растительное масло.

«Растительное масло» представляет собой масло, происходящее из частей растений, чаще всего из плодов и семян, таких как ягоды, горох, бобы, зерно и орехи; в качестве альтернативы - из листьев, стеблей, цветов, цветочных почек, корней или корнеплодов. Растительное масло может быть выделено из его растительного источника путем прессования, экстракции и т. д.; способы получения и очистки растительных масел известны с древних времен.

Примеры растительных масел, которые относительно обогащены линолевой кислотой, приведены в таблице 1. Значения даны в % вес./вес. общего содержания жирной кислоты и являются приблизительными средними арифметическими, которые могут варьировать и зависят от различий растений и от использованного процесса экстракции. Источник: U. S. Department of Agriculture, National Nutrient Database for Standard Reference, release 24, September 2011.

Таблица 1
Приблизительное содержание (в % вес./вес от суммарной жирной кислоты) линолевой кислоты в растительных маслах Сафлоровое масло (1)(2) 78% Ореховое масло 51% Масло из виноградных косточек 73% Кунжутное масло 45% Маковое масло 70% Масло из рисовых отрубей 39% Подсолнечное масло (1)(2) 68% Фисташковое масло 33% Конопляное масло (1) 60% Арахисовое масло 32% Кукурузное масло 59% Миндальное масло 23% Масло из проростков пшеницы 55% Рапсовое масло (3) 21% Хлопковое масло 54% Льняное масло (4) 15% Соевое масло 51% Оливковое масло 10% (1) В этих тривиальных названиях масел семена не упоминаются, хотя масла получают из семян.
(2) Это не касается варианта этого масла с высоким содержанием масляной кислоты.
(3) Вариант рапсового масла представляет собой Canola® oil, которое имеет уменьшенное содержание эруковой кислоты.
(4) Льняное масло также известно как масло из льняного семени.

Также несколько более экзотичных непищевых растительных масел (из семян) относительно богаты линолевой кислотой; например, масла из семян пираканта - 70% вес./вес. от суммарных жирных кислот, магония (орегонский виноград) - 52% и сарсапареля - 51% (S. Ozgul-Yucel 2005, J. A. O. C. S, vol. 82, p. 893).

Хорошо известными источниками α-линоленовой кислоты являются масла из семян: Чии белой (шалфея испанского), плодов киви, периллы многолетней, льна, конопли, брусники, масличного нуга, гевеи, рыжика, портулака, облепихи и рапсового семени.

Хорошо известны источники γ-линоленовой кислоты - масла из семян: энотеры, бурачника, черной смородины, сафлоры и конопли.

Хорошо известными источниками стеаридоновой кислоты являются масла из семян: конопли, черной смородины, воробейника полевого и эхиума (синяка).

Следовательно, по данному изобретению предпочтительно растительное масло, имеющее, по меньшей мере, 25% вес./вес. полиненасыщенной C18 жирной кислоты от суммарных жирных кислот, более предпочтительно растительное масло, имеющее, по меньшей мере, 30, 40, 50, 60, 70 или даже, по меньшей мере, 75% вес./вес. полиненасыщенной C18 жирной кислоты от суммарных жирных кислот в порядке предпочтительности.

Культура Leptospira по данному изобретению может с пользой быть применена также в диагностических способах. Примерами является использование в диагностическом тесте для детектирования специфического антитела или антигена в тестовом образце Leptospira. Например, препарат из культуры Leptospira по данному изобретению может быть покрытием на планшете или носителе или может быть использован как антигенная ловушка. В качестве альтернативы препарат может быть использован как стандартный эталонный антиген с высокой антигенной массой.

Данное изобретение далее будет описано со ссылками на нижеследующие неограничивающие примеры.

Примеры

1. Основные материалы и способы

1.1. Пролиферация Leptospira

1.1.1 Бактериальные штаммы, среды и предварительная пролиферация

Рабочий штамм L. interrogans инокулировали в среду EMJH и инкубировали при 29°C в течение 3-5 дней. Если требовалось, могло быть проведено до 5 последовательных предкультуральных пассажей, после чего предкультуры оценивались визуально на достаточность пролиферации (густоту) как критерий для переноса в следующий пассаж.

NB: Соответствующие меры биобезопасности и предосторожности должны применяться при работе с живыми Leptospira.

1.1.2 Основная ферментация

Все эксперименты выполнялись в 0,5, 2 или 20 л рабочих объемах, в управляемых компьютером ферментерах (фирма Sartorius), которые заполнялись 0,5, 1 или 10 л стерильно профильтрованной средой EMJH соответственно. Стандартная среда EMJH содержала 1% вес./объем BSA и 0,125% вес./объем полисорбата 80. pH среды в начале составлял 7,4±0,1. Ферментер инокулировали 5% объем/объем предкультуры серогруппы Icterohaemorrhagiae (пассаж 5), создавая плотность инокуляции 2-4×10⁷ клеток/мл в 0-й день. Конечный выход биомассы Leptospira обычно составлял около 1-2×10⁹ клеток/мл на 5-й или 6-й день инкубации, когда ферментация прекращалась.

В ходе всех экспериментов по ферментации температура контролировалась при около 29°C. Среда аэрировалась через свободное пространство над продуктом, а концентрация растворенного кислорода (pО₂) контролировалась автоматическими изменениями скорости перемешивания, чтобы поддержать установленную концентрацию pО₂. Температура, pH и концентрация pО₂** наблюдались в реальном времени, но pH и образование пены не контролировались.

В сравнительных экспериментах до 4 ферментеров, стартовавших одновременно с одинаковой средой и инокулятом Leptospira, работали параллельно. Один из ферментеров обычно при этом содержал только стандартную среду EMJH и служил для сравнения, тогда как в остальные делались различные добавления полиненасыщенной C18 жирной кислоты.

1.1.3 Добавление линолевой кислоты

Проводили добавление либо чистой линолевой кислоты (фирма Sigma Aldrich, чистота >99%) в виде 10% объем/объем маточного раствора в абсолютном этаноле (фирма JT Baker). В качестве альтернативы линолевая кислота добавлялась с помощью BSA, который создавали с высоким уровнем линолевой кислоты (BSA с высокой LA). Этот BSA с высокой LA использовался либо для замещения стандартного BSA в среде EMJH, либо в дополнение к BSA в среде EMJH, в каковом случае он добавлялся как 25% вес./объем маточный раствор в стерильной воде. Добавки BSA с высокой LA или чистая линолевая кислота в этаноле подавались в ферментер в течение 4 часов по 0,1-0,2 мл/час, пока культура в ферментере не достигала желаемого общего количества линолевой кислоты. Тестировались различные суммарные доступные уровни линолевой кислоты между около 5 и 425 мкг/мл в суммарном объеме. Добавки проводились в ферментерные культуры Leptospira при различных плотностях клеток, т. е. в ранней, средней и конечной стадиях культуры. Типичная плотность клеток в средней фазе составляла около 5×10⁸ клеток/мл, что достигалось в течение 2-го дня основной инкубации. После добавления линолевой кислоты из маточного раствора чистой линолевой кислоты в этаноле иногда отмечалось небольшое снижение pH, которое корректировалось добавление некоторого количества NaOH.

1.1.4 Отбор проб и автономные анализы

Ежедневно образцы по 5 мл отбирали асептически непосредственно из ферментера для анализа суммарного количества клеток (в счетной камере Петрова-Хауссера); антигенной массы (по Elisa количества антигена); инактивированных клеток и профилю типа жирной кислоты и относительных количеств (с помощью газовой хроматографии) в культуральной среде.

Образцы инактивировались с использованием 0,1 или 0,2% объем/объем β-пропиолактона (BPL) при 29°C в течение 16-24 часов. Инактивированные Leptospira тестировали на антиген с помощью Elisa в течение 24 часов.

1.2. Elisa антигена

Антигенная масса антигена LPS Leptospira определяли с помощью Elisa антигена, который основан на наборе серогруппа- или сероварспецифических агглютинирующих мышиных моноклональных антител (moabs), которые были получены из WHO/FAO/OIE и Национального партнерского центра эталонов и исследований лептоспироза, Департамент биомедицинских исследований, Королевский тропический институт, Амстердам, Нидерланды. Использованные moabs перечислены в таблице 2. В качестве литературной ссылки см.: R. A. Hartskeerl et al., (International course on laboratory methods for the diagnosis of Leptospirosis, 4th Edition, 1 April 2004. Royal Tropical Institute, Amsterdam).

Elisa был организован как исследование способом антигенной ловушки, причем одни и те же moab использовались и для напыления, и для детектирования.

Таблица 2
Moabs, использованные для Elisa антигена L. interrogans (sensu lato) Серогруппа Серовар moab Canicola Portland-vere F152C11 Icterohaemorrhagiae Copenhageni F12C3 Australis Bratislava F81C3 Grippotyphosa Dadas F71C9 Pomona Pomona F43C9 Tarassovi Gatuni F151C8 Sejroe Hardjo F22C6

1.2.1 Изготовление моноклональных антител для напыления

Moabs для использования в Elisa антигена могут происходить из асцитов или из клеточной культуры. Оба типа очищали перед использованием стандартным нехроматографическим способом. Кратко: альбумин и другие белки, не являющиеся иммуноглобулинами (IgG), осаждали каприловой кислотой. Затем фракцию IgG осаждали сульфатом аммония. Таким способом было возможно выделить более чем 80% IgG с чистотой, равной IgG, очищенным ионообменной хроматографией.

В качестве альтернативы moabs могли быть очищены на хроматографических колонках с G-белком.

1.2.2 Изготовление конъюгированных моноклональных антител

Для Elisa антигена готовили конъюгаты пероксидазы хрена (HRP) с IgG из moabs с использованием стандартных процедур. В принципе, реакция вовлекала окисление периодатом углеводных остатков фермента HRP с образованием альдегидных групп, которые затем реагировали со свободными аминогруппами молекул моноклональных IgG.

1.2.3 Изготовление эталонных стандартов количества антигена

Эталонный стандарт изготавливали для каждого штамма Leptospira, который тестировали с помощью Elisa антигена. Стандарт представляет собой партию моновалентного антигена Leptospira из инактивированных клеток. Его готовили с использованием обычных технологий, в основном пролиферируя специфический штамм Leptospira в среде EMJH, как описано выше, и инактивацией, как описано ранее. Затем стандарт концентрировали и (или) разбавляли в растворе фосфатного буфера до содержания около 1×10⁹ клеток/мл. Условное количество единиц антигена закреплялось за образцом, например 1000 единиц/мл. Когда стандарт требовал пополнения, новый препарат того же самого стандарта сравнивали и титровали параллельно со старым стандартом несколько раз перед тем, как заменить старый.

1.3. Анализ жирной кислоты

Композиции жирной кислоты и ее количества тестировали в образцах клеток Leptospira, компонентах культуральной среды и в полных образцах культуральной среды EMJH в соответствии с известными процедурами. Экстракцию жирных кислот выполняли, как опубликовано Bligh & Dyer (1959, Can. J. of Biochem. Physiol., vol. 37, p. 911) и Morrison & Smith (1964, J. of Lipid Res., vol. 5, p. 600). Вкратце: тестировали образец 0,5 мл, содержащий либо чистую полную культуральную среду, либо образец, разбавленный в воде: клетки Leptospira (между 1×10⁹ и 1×10¹⁰ на 0,5 мл; клетки инактивированы BPL) или образец 1% вес./объем BSA. Эти 0,5 мл экстрагировали с помощью 1 мл метанола и 2 мл хлороформа путем перемешивания в течение 3 минут. Добавляли еще 0,5 мл воды, перемешивали в течение 30 сек, и образец центрифугировали в течение 10 мин при 1000xg при 2-8°C. 2 мл хлороформенной (нижней) фазы переносили в стеклянный флакон, и хлороформ высушивали под потоком газа N₂. Высушенные липиды повторно растворяли в 0,6 мл BF3 в метаноле и нагревали в течение 15 мин при 95°C, что метилировало жирные кислоты. Затем добавляли 0,3 мл воды и 0,3 мл гексана, перемешивали встряхиванием, после чего гексан (верхняя фаза) переносили в стандартный газовый хроматограф для анализа профиля и относительных количеств жирных кислот в экстракте. В качестве внутреннего стандарта использовали образец жирной кислоты C21:0 (генэйкозановая кислота) с известной концентрацией. Обычно образцы измеряли в дуплетах, и образцы готовили и измеряли в контейнерах из стекла.

2. Сравнение условий пролиферации с предшествующим уровнем техники

В качестве сравнительного примера анализировали формирование антигенной массы в культуре Leptospira с подпиткой при стандартных условиях предшествующего уровня техники (таким образом, без добавлений). Leptospira серогруппы Icterohaemorrhagiae культивировали в стандартной среде EMJH, в которой присутствовал полисорбат 80 (фирма Croda) и стандартный коммерческий BSA (фирма Millipore). После нескольких циклов предпролиферации в основном ферментере культуру инокулировали и содержали в течение 5 или 6 дней. Для Leptospira серогруппы Icterohaemorrhagiae антигенная масса, полученная при таких условиях пролиферации, составляла обычно между 500 и 700 единиц антигена (для серогруппы Icterohaemorrhagiae) на 1×10⁹ клеток, как среднее за 3-5 дней, когда культура становилась стационарной.

Когда тестировалась партия антигена Leptospira во внутрилабораторном исследовании иммуногенности in vitro, не удалось достичь требуемого минимального уровня иммуногенности.

Эта проблема не была решена и при использовании в среде EMJH коммерческого BSA, который специально рекомендован для культуры Leptospira: BovoLep® BSA (фирма Bovogen, Австралия). Он был протестирован после BovoStar®, который являлся стандартным BSA для всех применений от того же производителя, и после BSA (фирма Millipore), который использовался ранее. Результаты представлены в таблице 3. «na» означает недоступен.

Интересно, что BovoLep® увеличивает биомассу Leptospira, как это и рекламируется, но не имеет существенного эффекта на ее антигенную массу. Это служит типичным примером классического подхода к пролиферации Leptospira по сегодняшний день: вниманию к уровню биомассы.

Таблица 3
Результат использования различных ингредиентов BSA в среде EMJH Условия ферментера Суммарная концентрация C18:2 мкг/мл Число клеток на 3-й день Ag U/10⁹ клеток/мл
на 3-й день BSA, Millipore 5 1,6×10⁹ 525 BSA, BovoStar® na 1,6×10⁹ 533 BSA, BovoLep® na 1,8×10⁹ 498

3. Эффект полиненасыщенной C18 жирной кислоты

3.1. Линолевая кислота

Только когда больше линолевой кислоты (C18:2) было сделано доступно для культуры Leptospira, антигенная масса увеличилась.

Было обнаружено, что стандартная среда EMJH, как она тестировалась и описана выше, предоставляет около 5 мкг/мл линолевой кислоты (см. таблицу 3). Главным образом они происходили из 0,125% полисорбата 80, поскольку 1% стандартного BSA предоставлял меньше, чем 1 мкг/мл линолевой кислоты, что близко к пределу детектирования анализа с помощью газовой хроматографии.

В связи с этим Полисорбат 80, как это определено в Фармакопее, может содержать максимально 18% линолевой кислоты от его жирных кислот. Однако на практике было обнаружено, что он несет намного меньше, обычно - менее чем 1,5%. По одному типу полисорбата 80 (тип: растительный уровень, фирмы Croda, Франция) авторы данного изобретения сравнили содержание линолевой кислоты из 48 партий в течение нескольких лет и обнаружили, что среднее количество линолевой кислоты составляет около 0,3% вес./вес. от суммарных жирных кислот. Исходя из того, что полисорбат 80 состоит в основном из жирных кислот, тогда 0,125% объем/объем полисорбата 80, который используется в среде EMJH, предоставляет культуре около 4 мкг/мл линолевой кислоты.

BSA устроен так, чтобы содержать увеличенное количество линолевой кислоты. Использование этого BSA с высоким LA при 1% вес./объем в среде EMJH предоставляет около 21 мкг/мл линолевой кислоты в культуру Leptospira; вместе с вкладом полисорбата такая культуральная среда предоставляет 25 мкг/мл линолевой кислоты ферментерной культуре Leptospira. Это увеличение количества доступной линолевой кислоты сильно повышает генерацию антигена Leptospira до антигенной массы 1636 Ag U/1×10⁹ клеток (среднее за 3-й - 5-й дни).

Таким образом, авторы данного изобретения продемонстрировали ценность своего открытия: антигенная масса культуры Leptospira может быть увеличена на 124%, если в культуру Leptospira было добавлено 25 вместо 5 мкг/мл линолевой кислоты.

Фиг. 1 и 2 изображают результаты анализов ежедневных образцов из пролиферирующей культуры Leptospira с добавлением линолевой кислоты, с использованием BSA с высоким LA в среде EMJH. На фиг. 1 биомасса (левая вертикальная ось) показывала постоянное увеличение в течение шести дней пролиферации. Количество антигена (правая вертикальная ось) достигало намного более высокого уровня, чем тот, который мог быть достигнут при использовании стандартного BSA в культуральной среде. Тем не менее, антигенная масса сильно не увеличивалась после 3-го дня. Фиг. 2 показывает причину, заключенную в профиле жирной кислоты в среде из этой культуры, которая ясно демонстрирует важность линолевой кислоты в этом контексте; результаты приведены в % вес./вес. суммарных жирных кислот. Отметьте, что уровень C16:0 (пальмитиновая кислота), C18:0 (стеариновая кислота) и C18:1 (масляная кислота) относится к левой вертикальной оси, тогда как уровень C18:2 (линолевая кислота) относится к правой вертикальной оси.

Фиг. 2 показывает существенно не изменившиеся количества C16:0, C18:0 и C18:1 жирных кислот в культуральной среде в ходе культивирования, при том что C18:1 из полисорбата 80 образует основную массу суммарного количества жирных кислот. Однако уровень C18:2 показывает резкое падение в течение первых трех дней, который оказывается ниже предела детектирования (<0,3%) на 3-й - 5-й день. Исчерпание линолевой кислоты совпадает с уменьшением роста генерации антигена, как показано на фиг. 1.

3.2. Линоленовая кислота

Ни одна из изоформ линоленовой кислоты (C18:3), α- или γ-, не могла быть обнаружена выше предела детектирования газовой хроматографии (около 0,6 мкг/мл жирной кислоты) в партиях BSA или полисорбата 80. Следовательно, стандартная полная культуральная среда EMJH не содержит каких-либо существенных количеств C18:3. В результате, в экспериментах, в которых тестировали добавление в культуру Leptospira линоленовой кислоты, практически вся линоленовая кислота, которая была доступна для культуры, происходила из линоленовой кислоты, которая была внесена в культуру путем отдельного добавления.

4. Дальнейшее добавление линолевой кислоты в культуру Leptospira

Если линолевую кислоту (C18:2) продолжали добавлять, антигенная масса могла продолжать увеличиваться.

В схожей культуре, как описано выше, линолевую кислоту добавляли в середине экспоненциальной фазы на 2-й день вместе с чистой линолевой кислотой, разбавленной в этаноле. Было добавлено такое количество линолевой кислоты, которое предоставило 100 мкг/мл линолевой кислоты в культуру. Как показывает профиль жирной кислоты на фиг. 3, после быстрого начального снижения и явственного пика после добавления на 2-й день, уровень линолевой кислоты снова постоянно снижался при продолжении культивирования. Уровни C16:0 и C18:1 жирных кислот исследовали как внутренние стандарты, но они в основном, как и ожидалось, оставались неизменными.

Антигенная масса, продуцированная в этом эксперименте на Leptospira из серогруппы Icterohaemorrhagiae, составила 1767 антигенных единиц (Ag. U)/1×10⁹ клеток (среднее за 3-й - 5-й дни).

5. Сравнительные культуры с различными условиями добавления

В более усложненных экспериментах по такой же схеме, как в предыдущих примерах, сравнительные ферментерные культуры Leptospira серогруппы Icterohaemorrhagiae запускались одновременно, причем сравнивали различные условия добавления линолевой кислоты (C18:2). Чтобы подчеркнуть эффект добавления линолевой кислоты, в среде EMJH использовали стандартный BSA. В некоторых ферментерах линолевую кислоту добавляли в середине экспоненциальной фазы либо в чистой форме в этаноле или в виде комплекса с BSA путем добавления раствора BSA с высоким LA.

Количества добавленной линолевой кислоты составляли 50, 75 и 150 мкг/мл. Таблица 4 приводит суммарное количество линолевой кислоты, которая доступна культурам.

Из всех ферментеров ежедневно отбирали и анализировали образцы клеток и среды. Результаты представлены на фиг. 4 и 5 и в таблице 4 ниже. Величины антигенной массы основываются на средних за 3-й - 5-й дни культурах. Также относительное увеличение антигенной массы при различных вариантах добавления выражено в процентах относительно культуры без добавления и со стандартным BSA. Термин «без добавления» означает культуру, содержащую стандартный BSA в EMJH.

Таблица 4
Эффект различных вариантов добавления линолевой кислоты на антигенную массу Leptospira Антигенная масса, среднее за 3-й-4-й дни Условия ферментера Суммарная концентрация C18:2, мкг/мл Антигенные единицы/10⁹ клеток/мл Относительная антигенная масса (%) Без добавления, стандартный BSA 5 729 100 Добавление чистой C18:2, 75 80 1450 199 Добавление чистой C18:2, 150 155 1550 213 Добавление BSA с высоким LA, 50 55 1612 221

Как ясно из таблицы 4 и из соответствующих графиков на фиг. 4 (биомасса) и 5 (количество антигена), имеет место быстрое и существенное увеличение антигенной массы Leptospira, когда в культуру добавляли линолевую кислоту, которое не наблюдается в культуре без добавления. Некоторое увеличение биомассы наблюдается при добавлении линолевой кислоты, но увеличение антигенной массы существенно ее превосходит. Увеличение антигенной массы было несколько больше, когда в культуру добавляли 150 мкг/мл, по сравнению с добавлением 75 мкг/мл. Однако не было большой разницы между добавлением линолевой кислоты в чистом виде или как комплекса с BSA. Возможно, это вариант соотношения между увеличением антигенной массы и некоторой токсичности.

Другие полезные эффекты могут быть вынесены из фиг. 5: увеличение антигенной массы может быть теперь достигнуто намного быстрее путем добавления линолевой кислоты. Например, фиг. 5 показывает, что при добавлении линолевой кислоты высокая антигенная масса может быть достигнута в течение часов после добавления.

Также, когда сравнивали достигнутый максимальный уровень антигенной массы, было очевидно, что в культурах с добавлением за тот же срок, что и раньше, достигалось значительное увеличение количества антигенной массы.

6. Подтверждение эффекта добавления линолевой кислоты в Leptospira различных серогрупп

В следующем исследовании было подтверждено, что увеличение антигенной массы после добавления линолевой кислоты (C18:2) является общим феноменом у Leptospira. В нескольких экспериментах культуры штаммов Leptospira из нескольких серогрупп пролиферировали в ферментерах по схеме, схожей с предшествующей и при схожем добавлении: в среду EMJH либо со стандартным BSA, либо с BSA с высоким LA; в некоторые культуры добавляли еще 100 мкг/мл линолевой кислоты из чистой линолевой кислоты в этаноле. Результаты анализов биомассы и количества антигена представлены на фиг. 6-7 (Sejroe) и 8-9 (Grippotyphosa) и суммированы в таблице 5.

Для Leptospira из серогруппы Sejroe (серовар Hardjo) добавление 100 мкг/мл линолевой кислоты из BSA с высоким LA в культуральную среду приводило к увеличению антигенной массы на впечатляющие 184%. Некоторое увеличение биомассы наблюдалось после добавления, но увеличение количества антигена было намного больше. Ферментер работал в течение 6 дней, и результаты этих экспериментов усредняли по 5-м и 6-м дням культивирования.

Для серогруппы Grippotyphosa данные усредняли по 4-му и 5-му дням культивирования. Наблюдалось увеличение на 63% антигенной массы в результате добавления линолевой кислоты.

Сходным образом для серогруппы Australis (серовар Bratislava) наблюдалось увеличение антигенной массы на 45%; здесь для добавления использовалась среда с BSA с низким LA.

Таблица 5
Подтверждение эффекта добавления линолевой кислоты на антигенную массу Leptospira из различных серогрупп Антигенная масса, среднее за 2 дня Серогруппа Условия ферментера Суммарная концентрация C18:2 мкг/мл Антигенных единиц (AgU)/10⁹ клеток/мл Относительная антигенная масса (%) Sejroe Без добавления 5 -- -- BSA с высоким LA 25 287 100 Добавление чистой C18:2, 100 125 814 284 Grippotyphosa Без добавления 5 -- -- BSA с высоким LA 25 5074 100 Добавление чистой C18:2, 100 125 8286 163 Australis Без добавления 5 8862 100 BSA с высоким LA 25 -- -- Добавление чистой C18:2, 100 105 12822 145

6.1. Добавление в Leptospira серогруппы Tarassovi

При добавлении, сходном с описанным выше в примере 6, тестировали эффект добавления различных количеств C18:2 жирной кислоты на биомассу и антигенную массу культуры Leptospira серогруппы Tarassovi в среде EMJH со стандартным BSA. Результаты представлены на фиг. 11 и 12.

Тогда как добавление 300 мкг/мл C18:2 оказывалось токсичным для культуры, добавление 100 или 200 мкг/мл C18:2 вызывало сильное увеличение антигенной массы на единицу биомассы: на 67% и 99% соответственно по сравнению с эталонной культурой без добавления.

7. Максимальный уровень добавления

В одном из исследований изучали максимальный уровень добавления линолевой кислоты (C18:2): Leptospira из серогруппы Icterohaemorrhagiae культивировалась в EMJH с BSA с высоким LA и с добавлением дополнительно 100, 200 или 400 мкг/мл линолевой кислоты из чистой линолевой кислоты в этаноле. Из результата ясно, что добавление 400 мкг/мл вызывало токсичность для бактерий, поскольку число клеток быстро уменьшалось после добавления. Поэтому этот эксперимент был повторен добавлением сходного высокого уровня линолевой кислоты, но теперь линолевой кислоты в комплексе с BSA, который был насыщен линолевой кислотой. Наблюдался такой же стимуляторный эффект в группе с добавлением 100 мкг/мл, как ранее, тогда как в группе 200 мкг/мл получено несколько меньшее увеличение антигенной массы по сравнению с группой, где добавляли 100 мкг/мл.

Следовательно, при этих условиях добавление чистой линолевой кислоты выглядит оптимальным, когда между 25 и 250 мкг/мл линолевой кислоты делаются доступными для культуры Leptospira.

8. Временные точки добавления

В дальнейших экспериментах определяли значение временных точек для добавления в культуру Leptospira. При использовании Leptospira серогруппы Icterohaemorrhagiae тестировали временные точки добавления в ранней, средней и поздней экспоненциальной фазе. В среду EMJH со стандартным BSA добавляли 100 мкг/мл чистой линолевой кислоты в этаноле. Суммарное количество линолевой кислоты, которое было доступно для культур, составило поэтому 105 мкг/мл.

Результаты представлены в таблице 6 и на фиг. 10. Как показывает фиг. 10, резкое увеличение антигенной массы может быть индуцировано во всех фазах культуры Leptospira, с очень быстрым подъемом уже на 2-м, 4-м и 8-м часах после добавления. При таких величинах времен увеличение является главным образом результатом биохимических процессов и в меньшей степени - пролиферации.

Тот факт, что количество продуцированного антигена, вероятно, ниже, когда добавление производится позже, происходит из слабоположительного эффекта на биомассу, который имеет добавление линолевой кислоты. Это выравнивается, если антигенная масса выражается в расчете на стандартное количество клеток, см. таблицу 6.

Таблица 6
Эффект добавления линолевой кислоты в разные фазы пролиферации культуры Leptospira Антигенная масса, среднее за 4-й - 5-й дни Условия ферментера Суммарная концентрация C18:2, мкг/мл Антигенные единицы/10⁹ клеток/мл Относительная антигенная масса (%) Без добавления, BSA с низким LA 5 789 100 1×10⁸ клеток/мл, 100 105 1783 226 5×10⁸ клеток/мл, 100 105 1564 198 9×10⁸ клеток/мл, 100 105 1656 210

Тесты добавления в других временных точках: после сбора, после отмывки и после концентрации продолжаются. Инкубация культур в конечной фазе может потребовать обновления среды; тем не менее, рассчитывают, что добавление в культуру конечной фазы наиболее предпочтительно, поскольку на этой стадии количество клеток велико, и они способны формировать антигенную массу. Кроме того, на этой стадии наименее существенна остаточная токсичность добавленной линолевой кислоты, которая могла бы влиять на способность клеток к пролиферации, поскольку она более не требуется.

9. Определение улучшенной иммунопотентности вакцины, изготовленной из культуры Leptospira с добавлением

Культура Leptospira, в которую добавлена линолевая кислота, продуцировалась, как описано выше. Она преобразовывалась в форму инактивированной вакцины против лептоспироза с добавлением адъюванта, как это известно в данной области техники, и тестировалась в экспериментах in vivo, как предписано в статьях Фармакопеи. Эффекты серологического ответа, защита от сенсибилизации и уровень побочных реакций на вакцинацию контролируются.

Поскольку для вакцины против лептоспироза корреляция между антигенной массой и иммунопротективной способностью известна, можно предсказать с определенностью, что бактериновые вакцины, имеющие более высокую антигенную массу, чем ранее, также индуцируют более высокий уровень иммунопротекции.

Сходным образом, поскольку белковая нагрузка бактериновые вакцины против Leptospira очевидным образом находится в причинной связи с побочными эффектами вакцинации, также может быть предсказано, что бактериновые вакцины против Leptospira, имеющие меньше белка, но равную антигенную массу с предшествующей, будут индуцировать меньше побочных эффектов, но равную или, вероятно, лучшую иммунизацию.

10. Добавление в культуру Leptospira линоленовой кислоты

Добавление в культуру Leptospira линоленовой кислоты (C18;3), либо α-, либо γ-, выполняли в основном, как описано выше для добавления линолевой кислоты (C18:2). Результаты также в основном сравнимы, за исключением случаев, когда конкретная Leptospira проявляла конкретное преимущество в отношении одной из форм полиненасыщенной C18 жирной кислоты перед другими.

Антигенная масса на единицу биомассы была также рассчитана сходным образом за дни, когда культура Leptospira стационарна; обычно - это дни 3-4-5-й после инокуляции по мере необходимости и для некоторых серогрупп - это были дни 4-5-6-й после инокуляции. Как и ранее, средняя оценка антигенной массы с помощью Elisa рассчитывалась на 1×10⁹ клеток (перед инактивацией). Относительное увеличение антигенной массы рассчитывали относительно эталонной культуры, которая не получала добавлений. Средняя антигенная масса/1×10⁹ клеток эталонной культуры устанавливалась при росте 0%.

Во всех экспериментах с добавлением в культуру Leptospira C18:3 EMJH готовили с использованием стандартного BSA (фирма Milipore) и полисорбата 80 (фирма Croda). Как описано, такая среда EMJH сама по себе содержала незначительные количества C18:3.

И α-, и γ-C18:3 приобретались как чистые химикаты (>98%). Незадолго до использования для добавления их разбавляли в чистом этаноле до 10% или 20% объем/объем, в зависимости от количества C18:3, которое надо добавить в культуру. Это разбавление в этаноле добавляли в культуру Leptospira путем внесения в виде 5 доз за период 4 часа.

10.1. Потребление линоленовой кислоты культурой Leptospira

Параллельно с тем, что описано для C18:2 в примере 4 и на фиг. 1-3, изучали потребление C18:3 с добавлением и без. Результаты для культуры Leptospira серогруппы Icterohaemorrhagiae в среде EMJH представлены на фиг. 13 и 14. Стандартное увеличение биомассы этих культур было сходно с таковым, представленным на фиг. 1.

Фиг. 13 представляет профиль относительных количеств основных жирных кислот в культуре без добавления C16:0 и C18:1, они представлены относительно левой вертикальной оси и остаются относительно постоянными, даже когда культура растет. Количества C18:2 и C18:3 представлены относительно правой вертикальной оси: на 3-й день уровень C18:2 уже был исчерпан, а уровень C18:3-α постоянно снижался и исчерпывался с 5-го дня и далее.

Фиг. 14 представляет сходный профиль, но культуры, в которые было сделано добавление 200 мкг/мл α-C18:3 на 3-й день после инокуляции. На этом чертеже все относительные количества жирной кислоты представлены, основываясь на левой вертикальной оси. Как можно видеть, добавление α-C18:3 приводит к ясно детектируемому уровню C18:3 в точке взятия пробы через 3,3 дня. На следующие дни это количество постепенно потреблялось и снова исчерпывалось на 5-й день. Соответствующее увеличение антигенной массы показано на фиг. 16, 18 и 20.

10.2. Эффект добавления различных количеств C18:3

По сравнению с описанным для C18:2 в примере 5 и на фиг. 4 и 5, в культуру Leptospira серогруппы Icterohaemorrhagiae в среде EMJH добавляли разные количества C18:3 - либо α-линоленовой кислоты (α-C18:3), либо γ-линоленовой кислоты (γ-C18:3). Результаты представлены на фиг. 15-20.

Как явствует из всех этих результатов, добавление линоленовой кислоты индуцирует в культуре Leptospira увеличение антигенной массы, которое сильно превосходит увеличение биомассы, давая чистое увеличение антигенной массы на единицу биомассы.

Фиг. 15 и 16 демонстрируют эффекты на биомассу и антигенную массу добавления 100, 200, 300 или 400 мкг/мл α-C18:3. Ясно, что добавление 300 или 400 мкг/мл производило токсические эффекты на культуру. Для других количеств - 100 мкг/мл α-C18:3 давали немного большее увеличение антигенной массы - 122%, более 200 мкг/мл α-C18:3-81%.

Фиг. 17 и 18 показывают эффекты на биомассу и на антигенную массу добавления 200, 300 или 400 мкг/мл γ-C18:3. Очевидно, что γ-C18:3 лучше переносилась культурой Icterohaemorrhagiae, чем α-C18:3, поскольку только в количестве 400 мкг/мл проявлялась токсичность.

Добавление 200 мкг/мл γ-C18:3 давало немного меньшее увеличение антигенной массы, чем добавление 300 мкг/мл γ-C18:3-114% против 153%.

Фиг. 19 и 20 показывают сравнение эффектов равных количеств α- и γ-C18:3 на биомассу и антигенную массу культуры Leptospira серогруппы Icterohaemorrhagiae в среде EMJH. Добавление 100 мкг/мл α-C18:3 индуцировало большее увеличение относительной антигенной массы, чем 100 мкг/мл γ-C18:3-122% против 170%.

Это показывает преимущество серогруппы Icterohaemorrhagiae Leptospira для α-изомера C18:3.

10.3. Эффект добавления C18:3 к другим серогруппам Leptospira

Сравнивая с тем, что было описано для C18:2 в примере 6 и на фиг. 6-9 и 11-12, эффект добавления линоленовой кислоты на антигенную массу также проверяли на других, нежели Icterohaemorrhagiae, серогруппах Leptospira. В частности, культуры серогрупп Australis (серовар Bratislava), Tarassovi, Grippotyphosa, Pomona или Canicola тестировали с помощью добавления 100 или 200 мкг/мл α-C18:3 или 100 мкг/мл γ-C18:3. Результаты представлены на фиг. 21-32 и в таблицах 7 и 8.

Таблица 7
Эффект добавления C18:3 в культуры Leptospira из различных серогрупп Относительное увеличение антигенной массы (%) Серогруппа 100 мкг/мл α-C18:3 200 мкг/мл α-C18:3 100
мкг/мл γ-C18:3 Фигуры Australis (серовар Bratislava) 40 62 15 21 и 22 Tarassovi 59 141 51 23 и 24 Grippotyphosa 60 63 57 25 и 26 Pomona 0 0 73 27 и 28

Было отмечено, что Leptospira серогрупп Australis, Tarassovi и Grippotyphosa в целом не имеют строгого предпочтения в отношении какого-либо изомера C18:3. Однако серогруппа Pomona имеет строгое предпочтение, а именно к γ-C18:3; генерация ее антигенной массы была даже меньше, чем в эталонной культуре при добавлении α-C18:3.

Leptospira серогруппы Canicola (штамм WS 280503) тестировали с несколькими количествами α- или γ-C18:3, поскольку оказалось, что Canicola требует (соответственно может перенести) большие количества жирной кислоты, прежде чем проявит относительное увеличение антигенной массы. Результаты представлены на фиг. 29-32 и в таблице 8.

Таблица 8
Эффект добавления C18:3 в культуры Leptospira серогруппы Canicola Серогруппа Canicola Относительное увеличение антигенной массы (%) Фигуры 200 мкг/мл α-C18:3 107 29 и 30 300 мкг/мл α-C18:3 112 400 мкг/мл α-C18:3 118 200 мкг/мл γ-C18:3 98 31 и 32 300 мкг/мл γ-C18:3 83

10.4. Максимальные уровни добавления C18:3

В сравнении с тем, что описано для C18:2 в примере 7, эффект добавленного количества C18:3 на практике выглядит ограниченным из-за своей цитотоксичности для Leptospira. Хотя серогруппа Canicola, по-видимому, толерантна к несколько более высоким уровням добавления C18:, большинство остальных серогрупп демонстрирует цитотоксичность, начиная с 200 мкг/мл C18:3 и выше. Ясная разница в цитотоксичности между α- и γ-изомерами C18:3 не наблюдается.

10.5. Временные точки добавления C18:3

В сравнении с тем, что описано для C18:2 в примере 8 и на фиг. 10, эффект добавления в культуру Leptospira серогруппы Icterohaemorrhagiae в среде EMJH тестировали с α- или γ-C18:3 в различные временные точки культуры. Результаты представлены на фиг. 33-36.

Фиг. 33 и 34 показывают результаты добавления α-C18:3 при 1, 5 или 8×10⁸ клеток/мл. Наблюдавшееся относительное увеличение антигенной массы составило 163, 164 и 140% соответственно.

Фиг. 35 и 36 показывают результаты добавления γ-C18:3 при 2, 5 или 8×10⁸ клеток/мл. Наблюдавшееся относительное увеличение антигенной массы составило 71, 81 и 162% соответственно.

Следовательно, эффект времени добавления C18:3 как функции концентрации клеток в момент добавления, по-видимому, не является критичным. Хотя добавление α-C18:3 давало наибольшее увеличение антигенной массы, когда давалось при нижесредней концентрации клеток, тогда как γ-C18:3 давала наибольшее увеличение, когда давалась при высокой концентрации клеток.

10.6. Соединенное добавление различных полиненасыщенных C18 жирных кислот.

Удивительно, однако, наблюдалось, что полиненасыщенные C18 жирные кислоты могут также быть соединены при добавлении и вызвать суммирующийся эффект. Это проверяли на культуре Leptospira серогруппы Icterohaemorrhagiae в среде EMJH, куда добавляли либо 100 мкг/мл C18:2 с 100 мкг/мл α-C18:3, либо комбинацию 50 мкг/мл C18:2 и 50 мкг/мл α-C18:3. Комбинацию жирных кислот предоставляли в культуру путем добавления двух жирных кислот как отдельных 10% разбавлений в этаноле, практически одновременно в 5 внесениях в течение 4 часов.

Полученное увеличение относительной антигенной массы составило 77%, 144% и 118% соответственно. Результаты показаны на фиг. 37 и 38.

Удивительно, что увеличение антигенной массы, полученное путем добавления комбинации C18:2 и C18:3, давало уровень относительного увеличения антигенной массы (118%), который был очень близок к среднеарифметическому (111%) относительных увеличений от добавлений по отдельности.

Подписи к чертежам

Фиг. 1:

Результаты Elisa биомассы и антигена во времени на культуре Leptospira из серогруппы Icterohaemorrhagiae в среде EMJH, содержащей BSA с высоким LA, в которую не делалось дополнительных добавлений.

Фиг. 2:

Результаты анализов профиля жирной кислоты в культуральной среде культуры, представленной на фиг. 1.

Фиг. 3:

Профиль жирной кислоты культуральной среды культуры Leptospira серогруппы Icterohaemorrhagiae в EMJH с BSA с высоким LA, в результате чего культура получила добавление 100 мкг/мл линолевой кислоты при плотности клеток 5×10⁸ клеток/мл на 2-й день.

Фиг. 4 и 5:

Соответственные результаты измерений количеств биомассы и антигена, образовавшихся их различных культур Leptospira серогруппы Icterohaemorrhagiae, пролиферировавших в среде EMJH со стандартным BSA; в культуры либо не делалось добавлений - как в эталонные культуры, либо добавляли линолевую кислоту: в одну из них - 75 мкг/мл линолевой кислоты из чистой линолевой кислоты в этаноле; в одну - 150 мкг/мл, также из чистой линолевой кислоты в этаноле, и в одну - 50 мкг/мл линолевой кислоты как комплекса BSA и линолевой кислоты.

Фиг. 6 и 7:

Соответственные результаты измерений количеств биомассы и антигена, образовавшихся из различных культур Leptospira серогруппы Sejroe (серовар Hardjo), пролиферировавших в среде EMJH со стандартным BSA; в культуры либо не делалось добавлений - как в эталонные культуры, либо добавляли 100 мкг/мл линолевой кислоты из чистой линолевой кислоты в этаноле.

Фиг. 8 и 9:

Соответственные результаты измерений количеств биомассы и антигена, образовавшихся их различных культур Leptospira серогруппы Grippotyphosa, пролиферировавших в среде EMJH с BSA с высоким LA; в культуры либо не делалось добавлений - как в эталонные культуры, либо добавляли 100 мкг/мл линолевой кислоты из чистой линолевой кислоты в этаноле.

Фиг. 10:

Эффект увеличения антигенной массы, когда в культуру Leptospira делали добавления на разных стадиях пролиферации. Leptospira из серогруппы Icterohaemorrhagiae культивировались в стандартной среде EMJH, и делалось добавление 100 мкг/мл линолевой кислоты на ранней, средней и поздней стадиях. Первоначальный отбор проб проводился на 2-й, 4-й и 8-й часы после добавления.

Фиг. 11 и 12:

Эффекты добавления различных количеств линолевой кислоты на биомассу и антигенную массу культуры Leptospira серогруппы Tarassovi в стандартной среде EMJH.

Фиг. 13 и 14:

Профиль относительных количеств жирной кислоты в культуре Leptospira серогруппы Icterohaemorrhagiae в среде EMJH за более длительное время.

Фиг. 13: культура без добавления; NB: уровни C18:2 и C18:3 представлены относительно правой вертикальной оси.

Фиг. 14: культура с добавлением 200 мкг/мл α-C18:3.

Фиг. 15-20:

Эффекты добавления различных количеств α- или γ-C18:3 на биомассу и на антигенную массу культур Leptospira серогруппы Icterohaemorrhagiae в среде EMJH.

Фиг. 21-32:

Эффекты добавления различных количеств α- или γ-C18:3 на биомассу и на антигенную массу культур Leptospira из различных серогрупп в среде EMJH.

Фиг. 21 и 22: культура Leptospira серогруппа Australis (серовар Bratislava),

Фиг. 23 и 24: культура Leptospira серогруппа Tarassovi,

Фиг. 25 и 26: культура Leptospira серогруппа Grippotyphosa,

Фиг. 27 и 28: культура Leptospira серогруппа Pomona,

Фиг. 29-32: культура Leptospira серогруппа Canicola.

Фиг. 33-36:

Эффекты добавления в культуру Leptospira серогруппы Icterohaemorrhagiae в среде EMJH α- или γ-C18:3 в различные временные точки культуры.

Фиг. 37 и 38:

Сравнение эффекта раздельного и соединенного добавления различных полиненасыщенных C18 жирных кислот на биомассу и на антигенную массу культуры Leptospira серогруппы Icterohaemorrhagiae в среде EMJH.

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способу повышения антигенной массы культуры Leptospira interrogans, включающему стадию добавления в культуру Leptospira interrogans полиненасыщенной C18 жирной кислоты, представляющей собой одну или более выбранных из группы, состоящей из линолевой кислоты, α-линоленовой кислоты и γ-линоленовой кислоты. Кроме того, раскрыт препарат для получения вакцины против лептоспироза, его применение для производства вакцины против лептоспироза, вакцина против лептоспироза и способ ее получения. Также раскрыто применение соединения или композиции, которая обогащена полиненасыщенной С18 жирной кислотой. Изобретение позволяет повышать антигенную массу культуры Leptospira interrogans по меньшей мере на 20% и использовать культуру Leptospira interrogans с повышенной антигенной массой для производства вакцины против лептоспироза. 6 н. и 2 з.п. ф-лы, 8 табл., 38 ил., 10 пр.

1. Способ повышения антигенной массы культуры Leptospira interrogans, включающий стадию добавления в упомянутую культуру Leptospira полиненасыщенной C18 жирной кислоты, причем полиненасыщенная C18 жирная кислота представляет собой одну или более выбранных из группы, состоящей из линолевой кислоты, α-линоленовой кислоты и γ-линоленовой кислоты, и причем по меньшей мере 15 мкг полиненасыщенной C18 жирной кислоты/мл доступны в упомянутой культуре, и причем антигенная масса указанной культуры Leptospira повышается по меньшей мере на 20% по сравнению с антигенной массой схожей культуры Leptospira, которая не была дополнена, как описано.

2. Препарат для получения вакцины против лептоспироза, содержащий культуру Leptospira interrogans в эффективном количестве и культуральную среду EMJH, причем упомянутая культура Leptospira interrogans дополнена С18 жирной кислотой, выбранной из группы, состоящей из линолевой кислоты, α-линоленовой кислоты и γ-линоленовой кислоты.

3. Вакцина против лептоспироза, содержащая эффективное количество препарата по п. 2.

4. Применение препарата по п. 2 для производства вакцины против лептоспироза.

5. Способ получения вакцины против лептоспироза, включающий стадии:

a) пролиферации культуры Leptospira interrogans в системе in vitro,

b) добавления в упомянутую культуру Leptospira полиненасыщенной C18 жирной кислоты, причем полиненасыщенная C18 жирная кислота представляет собой одну или более выбранных из группы, состоящей из линолевой кислоты, α-линоленовой кислоты и γ-линоленовой кислоты, и причем по меньшей мере 15 мкг полиненасыщенной C18 жирной кислоты/мл доступны в упомянутой культуре, и причем антигенная масса указанной культуры Leptospira повышается по меньшей мере на 20% по сравнению с антигенной массой схожей культуры Leptospira, которая не была дополнена, как описано,

c) инактивации и сбора упомянутой культуры Leptospira, в которую внесено добавление, и

d) смешивания инактивированной культуры Leptospira с фармацевтически приемлемым носителем.

6. Способ по п. 5, в котором между стадиями a) и b) имеется дополнительная стадия, включающая сбор, хранение и/или очистку культуры Leptospira interrogans.

7. Применение соединения или композиции, которая относительно обогащена полиненасыщенной C18 жирной кислотой, в способе по любому из пп. 1, 5 или 6, причем указанное соединение или композиция содержит полиненасыщенную C18 жирную кислоту, причем полиненасыщенная C18 жирная кислота представляет собой одну или более выбранных из группы, состоящей из линолевой кислоты, α-линоленовой кислоты и γ-линоленовой кислоты, в количестве по меньшей мере приблизительно 5% от общего количества жирных кислот.

8. Применение по п. 7, в котором соединение или композиция, в которой сравнительное обогащение полиненасыщенной C18 жирной кислотой происходит за счет растительного масла.