Питательная среда для выделения чумного микроба Советский патент 1992 года по МПК C12Q1/04 

Изобретение относится к медицинской микробиологии и биотехнологии и может быть использовано для выделения всех известных подвидов чумного микроба при эпизоотблогическом обследовании природных очагов. ji

Широко известны питательные среды для еУделенйя чумного микроба: Туман- ского и агар Хоттингера, содержащие в своем составе питательные основы (мяса, крови, казеина). Эти среды готовят на дистиллированной воде с солевыми компонентами, затем кипятят, фильтруют и стерилизуют.

Известна сухая питательная среда для культивирования чумного микроба, используемая для выделения возбудителя чумы при обследовании природных очагов, содержащая ферментативный гидролизат казеина, ферментативный гидролизат кормовых дрожжей, натрий хлористый, натрий фосфорнокислый двузамещенный, натрий пиросернистокислый (метабисульфит натрия), агар и дистиллированную воду.

Недостаток известной среды заключается ртом, что среда требует добавки генцианвиолета ex tempore при исследовании эктопаразитов и трупного материала. При выделении тиаминзавюмых штаммов чума« а XI

ся

««&

го

ного микроба в среду после стерилизации добавляют ex tempore витамин Вь

Недостатком способа изготовления известной среды является то, что среду из сухого порошка изготавливают только в спе- циализированных лабораториях, так как агаровые студни стерилизуют в автоклавах, разливают в стеклянную тару и доставляют для работы в эпидотряды автотранспортом, где расходуют в течение 1-3 мес. Хранение готовой среды в течение 1-3 мес при температуре от 1 до 39°С резко снижает се качество.

Целью изобретения является повышение ростовых свойств среды и ее селектив- ности в отношении R-форм чумного микроба всех подвидов

Эта цель достигается тем, что питательная среда для выделения чумного микроба, содержащая ггйтательные ос новы, агар, ми- нерэльные соли и дистиллированную воду, в качестве питательных основ содержит гид- ролизаты казеина и кормовых дрожжей, дополнительно содержит танин, глюкозу, натрий лимоннокислый и генцианвиолет, в качестве минеральных солей - калий фосфорнокислый однозамещенный, натрий фосфорнокислый дйузамещенный, аммоний молибденовокислый при следующем количественном соотношении компонен- тов,г/л:

Гидрализат казеина (порошок)11,0-13,0

Гидролизат кормовых дрожжей (поро- шок) 1,1-1,3 Глюкоза 1,4-1,6 Натрий лимоннокислый 0,9-1,1 Танин 0,019-0,021 Калий фосфорнокислый однозамещенный 2,4-2,6 Натрий фосфорно- , кислый двузамещен- ный 7,4-7,6 Аммоний молибденовокислый 0,4-0,6 Агар 14.0-16,0 Генцианвиолет 0,0024-0,0026 Дистиллированная вода 1 л В среде, взятой за прототип ростовые свойства обеспечивают компоненты, входящие в ферментативные гидролизаты казеи- на и дрожжей, которых недостаточно для роста всех известных подвидов чумного микроба.

В предлагаемой среде сухой гидролиэат казеина является питательной основой сухой гидролизат кормовых дрожжей содержит комплекс витаминов, необходимых для роста чумного микроба, глюкоза и натрий лимоннокислый являются источниками углерода для построения клетки, калий фосфорнокислый однозамещенный, натрий фосфорнокислый двузамещенный и молибденовокислый аммоний являются осмотическими стабилизаторами, оказывающими буферное действие и поддерживающими на необходимом уровне рН среды, танин и кристаллический фиолетовый подавляют постороннюю микрофлору. Такая рецептура среды с минимальным, максимальным и средним содержанием компонентов обеспечивает прорастание на среде всех известных подвидов чумного микроба из малых посевных доз (10 м к) в типичной R-форме. Питательную среду готовят смешением сухих компонентов с применением приема тритурации для введения танина и генциан- виол ета

Пример 1, Смешивают сухие компоненты, г

Гидролизат казеина (порошок)11,0

Гидролизат кормовых дрожжей (порошок)1,1 Глюкоза1,4 Натрий лимоннокислый 0,9 Танин 0,019 Калий фосфорнокислый однозамещенный 2,4 Натрий фосфорнокислый двузамещенный 7,4 Аммоний молибденовокислый 0,4 Агар 14,0 Генцианвиолет 0,0024 Полученную навеску среды растворяют в 1 л дистиллированной воды, тщательно размешивают, нагревают на медленном огне до полного расплавления, кипятят 3-5 мин, охлаждают до 45-50°С Готовую среду разливают в стерильные чашки Петри.

Пример 2. Для приготовления 1 л питательной среды смешивают сухие компоненты, г

Гидролизат казеина (порошок)13,0

Гидролизат кормовых дрожжей (порошок)1,3 Глюкоза1,6 Натрий лимоннокислый1,1

Танин0,021

Калий фосфорнокислый однозаме- щенный2,6

Натрий фосфорнокислый двузамеще- нный7,6

Аммоний молибде- новокислый0,6

Агар16,0

Генцианвиолет0,0026

Среду готовят, как в примере 1. Пример 3. Смешивают сухие компоненты, г:

Гидролизат казеина (порошок)12,0

Гидролизат кормо- вых дрожжей (порошок) 1,2 Глюкоза1,5 Натрий лимоннокислый1,0 Танин. I о,02 .Калий фосфорнокислый од незамещенный 2,5 Натрий фосфорнокислый двузамеще- нный 7,5 Аммоний молибдено- вокислый 0,5 Агар 15,0 Генцианвиолет 0..0025 Среду готовят, как в примере 1. Ростовые свойства предлагаемой среды с минимальным, максимальным и средним количеством компонентов оценивают путем посева 10- и 100 микробных клеток двухсуточной агаровой культуры возбудителя чумы разных подвидов, а также посева органов животных, зараженных вирулентными штаммами чумного микроба и суспензий инфицированных блох, через 24-48 ч инкубации при 28°С. В качестве контрольных сред используют среду Туманского и казеиново-дрожжевой питательный агар для культивирования чумного микроба.

На предлагаемой среде и контрольных средах испытаны штаммы чумного микроба: ЕВ, И-2377, выделенный в Горно-Алтайском природном очаге и Р-1680, выделенный в Армянском нагорном очаге. Для инфицирования биопробных животных и блох использованы штаммы: И-3226, выделенный в Тувинском природном очаге, И-3160, выделенный в Сайлюгемском очаге и И-2422, вы- деленный в Северо-западной части Монгольского Алтая.

Результаты роста чумного микроба на предлагаемой среде приведены в табл. 1 и

2, из которых следует, что предлагаемая среда обладает достаточной чувствительностью, количество выросших клеток на предлагаемой и контрольной средах одинаково 5 Однако на предлагаемой среде морфология колоний типичная в R-форме с кружевной зсной и бугристым центром для штаммси чумного микроба из Забайкальского, Тувинского, Горно-Алтайского и Закавказского 10 природных очагов, в то время как на контрольной среде морфология колоний чумного микроба атипичная (кружевная зона отсутствует, колонии плоские), и рост штаммов Закавказского очага чумы отсутствует. 15 Бактериологические исследование органов павших животных и суспензий блох (табл, 3), инфицированных вирулентными штаммами чумного микроба, свидетельствует о том, что на предлагаемой среде через 0 24 ч инкубации при 28°С формируются колонии, имеющие все признаки, типичные для чумного микроба. Среду можно применять для исследования полевого материала при эпизоотологическом обследовании различ- 5 ных природных очагов чумы, в то время как при использовании прототипа невозможно выделить чумной микроб в Закавказском нагорном очаге (табл. 2).

Проведено испытание предлагае- 0 мой среды в полевых условиях: МНР, в Забайкальском, Тувинском природных очагах. Исследовано 2116 грызунов и млекопитающих, 19610 эктопаразитов, при этом выделено 47 штаммов чумного микроба. 5 Предлагаемая среда стандартна, не нуждается в фильтрации, стерилизации, добавке extempore витамина Вт, генцианвио- лета, и поэтому в отличие от прототипа среду можно готовить в неспециализиро- 0 ванных лабораториях полевых формирова- ний. Приготовление среды способом смешения сухих компонентов позволяет сократить длительность, технологического цикла в сравнении с прототипом на 40 ч. 5

Формула изобретения Питательная среда для выделения чумного микроба, содержащая ферментативный гидролизат казеина, ферментативный 0 гидролизат кормовых дрожжей, фосфорнокислый однозамещенный калий, фосфорнокислый двузамещенный натрий,стимулятор роста, агар и дистиллированную воду, о т - л и чающаяся тем, что, с целью повыше- 5 ния ростовых свойств среды и ее селективности в отношении R-форм чумного микроба всех подвидов, она дополнительно содержит глюкозу, лимоннокислый натрий, танин, генцманвиолет, в качестве стимулятора роста - молибденовокислый аммоний при еледующем количественном соотношенпонентов, г/л:

Ферментативный гидролизат казеина (по сухой массе)11-13 Ферментативный гидролизат кормовых дрожжей (по сухой массе)1,1-1,3 Глюкоза1,4-1,6 Лимоннокислый натрий 0,9-1,1

0

Танин

Однозамещенный фосфорнокислый калий

Фосфорнокислый двузамещенный натрий

Молибденовокислый аммоний Генцианвиолет Агар

Дистиллированная вода

0,019-0,021

2,4-2,6

7,4-7,6

0.4-0.6 0,0024-0.0026 14-16

1л

Использование: медицинская микробиология и эпидемиология, а именно выделение всех известных подвидов чумного микроба при эпизоотологическом обследовании природных очагов. Сущность изобретения: питательную среду для выделения чумного микроба, содержащую, г/л: гидро- лизат казеина 11,0-13.0; гидролизат кормовых дрожжей 1.1-1,3; фосфорнокислый однозямещенный калий 2,4-2,6, фосфорнокислый двуззмещенный натрий 7,4-7,6; мо- либденовокислый аммоний 0,4-0,6; глюкоза 1,4-1,6; лимоннокислый натрий 0,9-1,1; танин 0,019-0,021- генцианвиолет 0,0024- 0,0026 и агар (порошок) 14,0-16,0, готовят смешением сухих компонентов с применением приема тритурации для введения танина и генцианвиолета. Сконструированная среда позволяет выделять все известные подвиды чумного микроба в R-форме при эпизоотологическом обследовании природных очагов. 3 табл. СО

Таблица 1

Результаты роста чумного микроба на предлагаемой среде с минимальным, максимальным и средним количеством компонентов

91751211

Т а б л и 4 a 2

Результаты роста штаммов чумного микроба, выделенных из различных очагов чумы на предлагаемой среде и контрольной

Таблица 3

Результаты бактериологического испытания предлагаемой среды в полевых условиях в

сравнении с контрольной

10