Способ определения степени раздражающего действия дезинфекционных средств на кожу человека Российский патент 2019 года по МПК C12Q1/00 

Изобретение относится к области дезинфектологии и может быть использовано для оценки токсичности дезинфекционных средств (ДС), частности, степени их раздражающего воздействия на кожу человека

Известен способ определения коррозийного действия химических средств на кожу человека in vitro (Международный документ «OECD TG 430 Rat TER skin corrosivity test» 2000 г.), при котором исследуемое химическое (дезинфекционное) средство наносят на кожу убитых крыс и по результатам ответной реакции выносят суждение о наличии или отсутствии коррозийного действия на кожу человека. Исследования, проводимые по данному методу, не позволяют определить степень раздражающего воздействия, кроме того, они противоречат принципам гуманности, т.к. при их проведении животные гибнут.

Известен способ определения коррозийного действия химического средства на кожу человека in vitro (Международный документ OECD TG 435 «Vitro Membrane Barrier Test Method for Skin Corrosion» 2006 г.). Метод испытания мембранного барьера in vitro позволяет идентифицировать коррозионные химические вещества и смеси (относя их к категориям разрешенных/неразрешенных) в соответствии со временем их проникновения через искусственный (синтетический высокомолекулярный био-барьер) мембранный барьер. Недостатком известного метода является отсутствие возможности определения степени раздражающего воздействия веществ на кожу человека.

Наиболее близким к изобретению является способ определения раздражающего воздействия дезинфекционного средства (ДС) на кожу человека (ГОСТ 32634-2014), заключающийся в том, что исследуемое вещество наносят на искусственную трехмерную модель человеческой кожи, состоящую, как минимум, из реконструированного эпидермиса с функциональным роговым слоем. Коррозийные (сильно выраженные раздражающие) свойства ДС анализируют по их возможности влиять на жизнеспособность клеток (устанавливаемую с помощью МТТ - теста) за определенное время. При проведении исследований кожу помещают в среду с МТТ реактивом соответствующей концентрации, выдерживают в течение 3-х часов, после чего измеряют оптическую плотность растворенного формазана при длине волны 540-595 нм, сравнивают ее с контрольной и по результатам сравнения выносят суждение о наличии или отсутствии разъедающих свойств исследуемого ДС.

Недостатком известного способа является низкая точность результатов исследований, обусловленная отсутствием возможности определения степени раздражающего действия ДС на кожу человека.

Техническим результатом, которого можно достичь при осуществлении изобретения является повышение точности исследований.

Технический результат достигается тем, что согласно способу определения степени раздражающего действия дезинфекционных средств на кожу человека, заключающемуся в том, что культуру постоянных трансформированных клеток нормальной ткани глаза человека Chang conjunctiva рассевают на 96-луночную панель по 100 мкл в каждую лунку в концентрации 1×10⁵ клеток/мл в питательной среде Игла-МЕМ с 10% эмбриональной телячьей сывороткой (ЭТС), после чего панель инкубируют в термостате в атмосфере 5% СО₂ при температуре 37°С в течение 24 часов, после инкубации культуральную среду (КС) во всех лунках меняют на среду, содержащую 2% ЭТС по 100 мкл в каждую лунку, затем образцы дезинфекционных средств (ДС) раститровывают непосредственно в лунках с монослоем клеток Chang conjunctiva методом двукратных серийных разведений в трех повторах на точку, оставляя три контрольные лунки свободными от дезинфекционных средств, из каждой из первых трех лунок с монослоем клеток, содержащих 100 мкл культуральной среды и 100 мкл образца ДС, после перемешивания отбирают по 100 мкл смеси и переносят их в каждую из трех следующих по порядку лунок, из которых, в свою очередь, смесь переносят в следующие лунки, последовательно повторяя данное действие до заполнения всех лунок панели, после чего панель помещают в термостат, инкубируют в атмосфере 5% СО₂ при температуре 37°С в течение 24 часов, затем культуральную среду из всех лунок, включая контрольные, удаляют и добавляют в каждую лунку по 100 мкл среды ИГЛА-MEM с 20 мкл реактива МТТ с концентрацией 5 мг/л, после 4-х часового инкубирования в термостате в атмосфере 5% СО₂ при температуре 37°С среду с реактивом МТТ удаляют и вносят по 100 мкл диметилсульфоксида (ДМСО) для растворения восстановленного клетками формазана, после 5 минутной выдержки измеряют оптическую плотность раствора формазана во всех лунках на спектрофотометре при длине волны 545 нм, после чего сравнивают оптическую плотность (ОП) растворов, полученных после культивирования с образцами ДС с оптической плотностью растворов в контрольных лунках (ОПк) и по величине минимального нетоксического разведения (МНР), выявленной при равенстве ОП и ОПк, выносят суждение о степени раздражающего действия ДС на кожу человека: при МНР≤1:20000 - отсутствие, при МНР от 1:21000 до 1:50000 - слабое, при МНР от 1:51000 до 1:150000 - умеренное, при МНР >150000 - выраженное.

Отличительной особенностью данного изобретения является то, что в качестве тест - объекта выбраны культуры постоянных

трансформированных клеток нормальной ткани глаза человека Chang conjunctiva, которые по результатам проведенных исследований показали себя наилучшими индикаторами воздействия ДС на кожу человека при исследованиях in vitro. Кроме того, только при использовании ранее выявленной зависимости степени раздражающего действия на кожу человека ДС от величины его МНР, обеспечена возможность достижения технического результата.

Известно использование Chang conjunctiva в качестве тест - объекта для выявления цитотоксических и иммунологических эффектов под влиянием химических соединений и лекарственных препаратов с применением МТТ-теста. Однако в проанализированных патентных источниках информации не обнаружено сведений о применении клеток Chang conjunctiva для оценки степени кожно-раздражающего действия ДС на человека с помощью МТТ - теста с использованием ранее выявленной зависимости степени раздражающего действия на кожу человека ДС от величины его МНР, на основании чего можно сделать вывод о соответствии данного решения критериям охраноспособности.

Способ осуществляют следующим образом.

В основе данного способа лежит реакция восстановления желтой соли тетразолия митохондриальными дегидрогеназами живых клеток до пурпурных кристаллов формазана, которые нерастворимы в водной клеточной среде. Кристаллы формазана растворяют в диметилсульфоксиде (ДСМО) и определяют оптическую плотность (ОП) полученного раствора колометрически.

Для реализации способа исследуемое дезинфекционное средство наносят на сформированный монослой клеток Chang conjunctiva (тест-объект) и с помощью МТТ - теста проводят цитологические исследования, на основании которых выносят суждение о степени воздействия ДС на кожу человека. Культуру постоянных трансформированных клеток нормальной ткани глаза человека Chang conjunctiva рассевают с помощью автоматической пипетки Eppendorf на 96-луночную панель по 100 мкл в каждую лунку в концентрации 1×10⁵ клеток/мл в питательной среде Игла-МЕМ с 10% эмбриональной телячьей сывороткой (ЭТС). Для формирования монослоя клеток панель инкубируют в термостате в атмосфере 5% СО₂ при температуре 37°С в течение 24 часов. После инкубации культуральную среду во всех лунках меняют на среду, содержащую 2% ЭТС по 100 мкл в каждую лунку. Затем образцы дезинфекционных средств раститровывают непосредственно в лунках с клетками Chang conjunctiva методом двукратных серийных разведений в трех повторах на точку, оставляя три контрольные лунки свободными от ДС. Из каждой из первых трех лунок с монослоем клеток, содержащих 100 мкл культуральной среды и 100 мкл образца ДС после перемешивания отбирают по 100 мкл смеси и переносят их в каждую из трех следующих по порядку лунок. Из них, в свою очередь, смесь переносят в следующие лунки, последовательно повторяя данное действия до заполнения всех лунок панели. Панель помещают в термостат, инкубируют в атмосфере 5% СО₂ при температуре 37°С в течение 24 часов. После инкубирования культуральную среду из лунок удаляют и добавляют в каждую лунку (включая контрольные) по 100 мкл среды ИГЛА-MEM с 20 мкл реактива МТТ (соль тетразолия) в концентрации 5 мг/л. После 4-х часового инкубирования в термостате в атмосфере 5% СО₂ при температуре 37°С среду с реактивом МТТ удаляют и вносят по 100 мкл диметилсульфоксида (ДМСО) для растворения восстановленного клетками формазана. После 5 минутной выдержки измеряют оптическую плотность раствора формазана в каждой из лунок на спектрофотометре при длине волны 545 нм, после чего сравнивают оптическую плотность (ОП) растворов, полученных после культивирования с образцами ДС с оптической плотностью растворов контрольных лунок (ОПк). При равенстве ОП и ОПк по величине соответствующего минимального нетоксического разведения (МНР) выносят суждение о степени раздражающего действия ДС на кожу человека: при МНР≤1:20000 - отсутствие, от 1:21000 до 1:50000 - слабое, от 1:51000 до 1:150000 - умеренное, >150000 - выраженное.

При каждом исследовании достоверным считают различие средних величин в опыте и контроле по критерию Стьюдента при уровне статической значимости р<0,05.

Если одной 96-луночной панели недостаточно для определения величины минимального нетоксического разведения ДС, то исследования проводят аналогичным образом в следующей панели до окончательного определения его значения.

Шкала зависимости степени выраженности раздражающего действия ДС от величины его МНР получена в результате испытаний на кроликах, реакция кожи которых наиболее точно коррелирует с реакцией кожи человека.

Таким образом, использование культуры постоянных трансформированных клеток нормальной ткани глаза человека Chang conjunctiva в качестве тест - объекта МТТ - теста с помощью ранее выявленной зависимости степени раздражающего действия на кожу человека ДС от величины его минимального нетоксического разведения, обеспечило возможность повышения точности исследований, т.е. достижения технического результата.

Способ может найти широкое применение при производстве дезинфекционных средств, для оценки степени их токсичности, в частности, степени их раздражающего воздействия на кожу человека.

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ определения степени раздражающего действия дезинфекционных средств на кожу человека, заключающийся в том, что культуру клеток Chang conjunctiva рассеивают на 96-луночную панель по 100 мкл в каждую лунку в концентрации 1×10⁵ клеток/мл в питательной среде Игла-MEM с 10% эмбриональной телячьей сывороткой (ЭТС). Для формирования монослоя клеток панель инкубируют в термостате в атмосфере 5% СО₂ при температуре 37°С в течение 24 часов. После инкубации культуральную среду меняют на среду, содержащую 2% ЭТС по 100 мкл в каждую лунку. Затем образцы дезинфекционных средств (ДС) раститровывают непосредственно в лунках с клетками Chang conjunctiva методом двукратных серийных разведений в трех повторах на точку, оставляя три контрольные лунки с монослоем клеток свободными от внесения ДС. Панель помещают в термостат, инкубируют в атмосфере 5% СО₂ при температуре 37°С в течение 24 часов. После инкубирования КС из лунок удаляют и добавляют в каждую лунку по 100 мкл среды ИГЛА-МЕМ с 20 мкл реактива МТТ в концентрации 5 мг/л. После 4-х часового инкубирования в термостате в атмосфере 5% СО₂ при температуре 37°С среду с реактивом МТТ удаляют и вносят по 100 мкл ДМСО для растворения восстановленного клетками формазана. После 5 минутной выдержки измеряют оптическую плотность раствора формазана в каждой из лунок на спектрофотометре при длине волны 545 нм, после чего сравнивают оптическую плотность (ОП) растворов, полученных после культивирования, с образцами ДС с оптической плотностью растворов контрольных лунок (ОПк). При равенстве ОП и ОПк по величине соответствующего минимального нетоксического разведения выносят суждение о степени раздражающего действия ДС на кожу человека: отсутствие, слабое, умеренное или выраженное. Изобретение обеспечило возможность повышения точности исследований.

Способ определения степени раздражающего действия дезинфекционных средств на кожу человека, заключающийся в том, что культуру постоянных трансформированных клеток нормальной ткани глаза человека Chang conjunctiva рассевают на 96-луночную панель по 100 мкл в каждую лунку в концентрации 1×10⁵ клеток/мл в питательной среде Игла-МЕМ с 10% эмбриональной телячьей сывороткой (ЭТС), после чего панель инкубируют в термостате в атмосфере 5% СО₂ при температуре 37°C в течение 24 часов, после инкубации культуральную среду (КС) во всех лунках меняют на среду, содержащую 2% ЭТС по 100 мкл в каждую лунку, затем образцы дезинфекционных средств (ДС) раститровывают непосредственно в лунках с монослоем клеток Chang conjunctiva методом двукратных серийных разведений в трех повторах на точку, оставляя три контрольные лунки свободными от дезинфекционных средств, из каждой из первых трех лунок с монослоем клеток, содержащих 100 мкл культуральной среды и 100 мкл образца ДС, после перемешивания отбирают по 100 мкл смеси и переносят их в каждую из трех следующих по порядку лунок, из которых, в свою очередь, смесь переносят в следующие лунки, последовательно повторяя данное действие до заполнения всех лунок панели, после чего панель помещают в термостат, инкубируют в атмосфере 5% СО₂ при температуре 37°C в течение 24 часов, затем культуральную среду из всех лунок, включая контрольные, удаляют и добавляют в каждую лунку по 100 мкл среды ИГЛА-MEM с 20 мкл реактива МТТ с концентрацией 5 мг/л, после 4-х часового инкубирования в термостате в атмосфере 5% СО₂ при температуре 37°C среду с реактивом МТТ удаляют и вносят по 100 мкл диметилсульфоксида (ДМСО) для растворения восстановленного клетками формазана, после 5 минутной выдержки измеряют оптическую плотность раствора формазана во всех лунках на спектрофотометре при длине волны 545 нм, после чего сравнивают оптическую плотность (ОП) растворов, полученных после культивирования, с образцами ДС с оптической плотностью растворов в контрольных лунках (ОПк) и по величине минимального нетоксического разведения (МНР), выявленной при равенстве ОП и ОПк, выносят суждение о степени раздражающего действия ДС на кожу человека: при МНР ≤1:20000 - отсутствие, при МНР от 1:21000 до 1:50000 - слабое, при МНР от 1:51000 до 1:150000 - умеренное, при МНР >150000 - выраженное.