Способ изготовления биотрансплантата, биотрансплантат для устранения рецессий десны и восстановления утраченного десной объема, способ устранения рецессий десны и восстановления утраченного десной объема Российский патент 2019 года по МПК A61C8/00 

Изобретение относится к медицине, а именно к стоматологии, и касается лекарственных средств для восстановления мягких тканей пародонта и способов их получения.

Сегодня "золотым стандартом" для закрытия рецессий десны является использование соединительно-тканного трансплантата (СТТ) в сочетании с одной из методик муко-гингивальной хирургии (коронально-смещенный или латерально-смещенный лоскут). Однако использование данных методик может сопровождаться такими симптомами, как боль в зоне забора трансплантата и в зоне операции, воспаление, кровотечение, возможным некрозом лоскута, инфицированием донорской зоны, нанесением дополнительной травмы пациенту в месте забора трансплантата и довольно длительным периодом реабилитации [1].

В связи с этим в настоящее время многие исследовательские группы занимаются активным поиском методов для закрытия рецессий десны, которые бы не уступали СТТ в применении и клинической эффективности и при этом не сопровождались вышеперечисленными побочными эффектами.

Особый интерес представляют методы регенеративной медицины, где успехи тканевой инженерии и результаты изучения стволовых/дифференцированных клеток дают основания для разработки новых подходов к восстановлению объемов прикрепленной десны, основная задача которых - замещение или восстановление утраченных тканей посредством трансплантации полученных в условиях in vitro клеток, в частности фибробластов слизистой оболочки ротовой полости [2-6]. Ряд исследователей для реконструкции мягких тканей пародонта предложили использовать фибробласты слизистой оболочки полости рта человека, иммобилизованные на различных носителях, например, на коллагеновой мембране [7-11]. Основным недостатком использования таких носителей при реконструктивных операциях на пародонте являются выраженная их "усадка", низкие адаптивные свойства (вследствие их чужеродного происхождения), длительный период заживления и невыраженный клинический результат.

В последние годы большой интерес у клиницистов вызывает использование в хирургической стоматологии, пародонтологии и имплантации аутологичных матриксов, полученных, например, на основе препаратов PRP (плазмы крови, обогащенной тромбоцитами), к тому же, содержащиеся в PRP факторы роста и цитокины обладают выраженными репаративными свойствами [12, 13]. Так результаты, полученные хирургами-стоматологами, пародонтологами и челюстно-лицевыми хирургами с использованием таких препаратов демонстрируют выраженный клинический эффект при восстановлении мягких и твердых тканей пародонта [14-16].

Одним из таких продуктов является получаемый из плазмы крови пациента PRF (Pure Platelet-Rich Fibrin - обогащенный тромбоцитами фибрин), представляющий собой плотную фибриновую сеть, обогащенную тромбоцитами и лейкоцитами [17]. PRF, благодаря особенностям структуры, обеспечивает не только длительное высвобождение факторов роста (VEGF, IGF1, PDGF - АВ) и цитокинов (IL-1b), но и обеспечивает выраженную миграцию клеток [18] и остеоинтеграцию, что клинически проявляется более быстрым заживлением прооперированных твердых и мягких тканей и снижением послеоперационного дискомфорта [16, 19]. Показана также высокая биосовместимость PRF с тканями пациента, поскольку получают его из аутогенного биоматериала - крови пациента без использования антикоагулянтов [20].

В литературе представлены данные, демонстрирующие положительный эффект препаратов PRP, включая PRF, на фибробласты слизистой оболочки полости рта человека, проявляющийся в активации миграции и пролиферации этих клеток, а также увеличении ими синтеза коллагена [20, 21].

Полученные данные дают основание заключить, что использование препаратов PRP и фибробластов слизистой оболочки ротовой полости человека будет клинически эффективным для восполнения утраченных объемов мягких тканей и устранения рецессий десны.

Фибробласты слизистой оболочки ротовой полости (ФС) - это клетки мезенхимального происхождения, представляющие основной клеточный компонент соединительнотканной пластинки десны, обеспечивающий ее гомеостаз, морфофункциональную организацию и реализуют ее физиологический и репаративный потенциал [22-25]. В культуре фибробласты активно продуцируют проколлаген, проэластин, гликозаминогликаны, факторы роста и другие компоненты внеклеточного матрикса [23-25]. После трансплантации культивированных фибробластов в соединительную ткань данная их активность сохраняется [6, 24].

Аутологичные ФС (аутоФС) не вступают в конфликт с собственной иммунной системой, не вызывают аллергических и других побочных реакций. Хороший клинический эффект от применения аутоФС обусловлен их высокой терапевтической активностью: продукцией компонентов внеклеточного матрикса, включая коллаген, эластин, факторы роста и цитокины, ускорением процессов ангиогенеза, пролиферацией эндотелиоцитов каппиляров и, соответственно, усилением регенерации поврежденных тканей пародонта [23, 25, 26].

Известен способ коррекции дефектов мягких тканей посредством применения аутологичных фибробластов кожи с различными формами коллагена и гликозаминогликанов (Патент США №6878383, МПК А61А 13/00) [27].

Недостатками данного изобретения являются:

1) Использование в качестве носителя чужеродных коллагена и гликозаминогликанов, поперечно-сшитых с помощью глютаральдегида. При биодеградации данного биоматериала может высвобождаться мономерный глютаральдегид в ткани и жидкости организма, что может оказывать цитотоксическое действие на фибробласты и вызывать развитие непредвиденных побочных эффектов [28];

2) Использование в качестве клеточного компонента фибробластов кожи.

Показано, что фибробласты сохраняют свой специфический паттерн экспрессии генов НОХ - «топографический код», определяющий тканевую специфичность функций клеток и их взаимодействие с другими клетками [29]. Так, сравнительный анализ фибробластов слизистой оболочки полости рта, в частности, десны (Фд) и фибробластов кожи (Фк) лица человека, включающий анализ профилей экспрессии генов, выявил, что эти два типа фибробластов имеют заметные различия [29, 30]. Между ними существует значительная разница в экспрессии 278 генов (всего было проанализировано 5284 гена), связанных, преимущественно, с ВКМ (внеклеточный матрикс), оксидоредуктазами, факторами роста/цитокинами [31]. Также были обнаружены (in vitro и in vivo) различия в количестве секретируемых клетками компонентов ВКМ (эластина, коллагена I, III и V типов, фибронектина, периостина, остеопонтина, гиалуронана, белков, обогащенных цистеином 1, тромбоспондинов, сульфатированных гликозаминогликанов, гепарина, хондроитина, дерматана и кератансульфата, малых обогащенных лейцином протеогликанов и тенасцинов) [32, 33].

Соответственно, наблюдаются и значительные различия между создаваемыми Фд и Фк нишами в ВКМ, которые играют ключевую роль в реализации их функций [34]. При этом показано, что Фд обладают высокой способностью к редукции воспаления, значительно превосходя в этом процессе Фк [35, 36]. Фд, по сравнению с Фк, продуцируют больше остеопротегерина (остеокластингибирующего фактора) и меньше остеокластогенных факторов, что, соответственно, приводит к ослаблению остеокластогенных процессов, способствующих резорбции костной ткани [37]. Фд продуцируют большие количества матричных металлопротеиназ, регулирующих активность воспалительных медиаторов и их ингибиторов [38]. По сравнению с Фк Фд менее чувствительны к профиброгенному действию фактора роста TGF-β1, стимулирующему развитие фиброза и образование рубцов [25, 30, 39]. В отличие от Фк Фд «запрограммированы» на быстрое завершение воспалительного процесса и ремоделирование ВКМ, сопровождаемое неоангиогенезом, что способствует быстрому заживлению ран без образования рубцов. По-видимому, эта способность Фд объясняется особенностями их происхождения [25, 32, 40, 41].

Исследования показали, что при трансплантации в десну фибробласты слизистой оболочки полости рта индуцируют образование эпителия кератинизированной десны, идентичного эпителию этой ткани в норме [32, 42]. Они обладают высоким потенциалом для стимуляции развития эпителия и регуляции экспрессии цитокератинов в эпителиальных клетках [43], при этом оказывая значительное влияние не только на эпителиальный морфогенез, но и на структуру эпителиальной ткани. В частности, результаты экспериментов по рекомбинации тканей и клеток подтверждают, что формирование фенотипов эпителия слизистой оболочки ротовой полости напрямую зависит от расположенной под ним соединительной ткани и составляющих ее фибробластов [32].

Сравнительное исследование Фд с Фк (которые часто используют для заживления кожных ран различного генеза) продемонстрировало, что эти два типа фибробластов практически не отличаются друг от друга по способности сокращать коллаген и фибриновый гель in vitro (это общепринятый метод для изучения функциональной активности фибробластов) [33]. Однако отмечена более высокая способность Фд к миграции и внедрению в трехмерный коллагеновый матрикс за счет быстрой и интенсивной секреции ими PDGF (тромбоцитарный фактор роста), стимулирующего миграцию [44]. Благодаря этому Фд быстро «заселяют» образующуюся в процессе заживления раны грануляционную ткань. Выраженная способность Фд к сокращению и разрушению фибриновых волокон на ранних стадиях заживления, за счет повышенной экспрессии активатора плазминогена [45], позволяет, по всей видимости, этим клеткам быстро перестраивать ВКМ, тем самым ускоряя репаративные процессы в ране [46].

Учитывая имеющиеся данные фибробласты слизистой оболочки ротовой полости (ФС) активно используют в доклинических и клинических исследованиях для восстановления дефектов мягких тканей как ротовой полости, так и вне ее.

Так, получен хороший клинический результат при использовании аутологичных ФС (аутоФС) в стоматологической практике для устранения рецессий десны и увеличения ее плотности при тонком биотипе десны у человека, где эти клетки вводили в десну посредством инъекций клеточной суспензии [6]. Prato G. (2003) представили результаты пилотного исследования на 6 пациентах с тонким биотипом десны, в котором в десну пациента вводили аутоФд в комбинации с гиалуроновой кислоты в качестве носителя. Результаты продемонстрировали заметное увеличение толщины десны [47].

Эффективным оказалось применение аутоФд для коррекции рубцов голосовых связок, проведенных на пяти пациентах Chhetri D. с коллегами (2011) [48].

АутоФд были использованы также для восстановления сосудистой стенки при аневризме сонной артерии у кроликов. При трансплантации Фд в стенки артерии наблюдали значительное уменьшение размеров дефекта, в то время как в контроле (использовали культуральную среду или Фк) дефект продолжал увеличиваться. При этом выявлено достаточно длительное присутствие трансплантированных клеток в поврежденной ткани [36].

Linard С. с соавт. (2015) показали, что трансплантация Фд человека в кожу иммунодефицитных мышей с целью лечения радиационных ран, вызванных посредством локального облучения кожи, наблюдается быстрое образование полностью восстановленного плотного эпидермиса, кожных придатков и волосяных фолликулов. Отмечено, что трансплантированные Фд значительно снижали вызванный облучением воспалительный процесс [49].

Представленные данные послужили основанием для выбора в качестве клеточного материала аутологичных фибробластов слизистой оболочки полости рта (аутоФС) в настоящем изобретении.

Список рисунков:

Рис. 1 Фибробластподобные клетки слизистой оболочки полости рта. Фазово-контрастная микроскопия ×200.

Рис. 2. Иммунофенотип фибробластов слизистой оболочки полости рта человека Рис. 3 Тест на КОКф- колониеобразующие единицы фибробластов. ЭКОф определяют по формуле: отношение количества образовавшихся колоний к количеству эксплантированных клеток ×100%. Средняя величина ЭКОф для ФС составила:47-55%.

Рис. 4. PRF - мембрана

Рис. 5. PRF - мембрана с интегрированными в нее фибробластами

Рис. 6. Определение жизнеспособности фибробластов слизистой оболочки полости рта. Детекция GFP в живых ФС человека, введенных в PRF - мембрану (флуоресцентная микроскопия).

Рис. 7. Клинический пример №1 (А). Применение только PRF-мембраны для закрытия рецессий десны (а, б, в).

Рис. 7. А, а) до лечения

Рис. 7. А, б) через 14 дней после операции

Рис. 7. А, в) через 3 месяца после операции

Рис. 8. Клинический пример №1. Б. Хирургическое вмешательство в области рецессий десны с применением PRF-мембраны + аутоФС (а, б, в).

Рис. 8. Б, а) до лечения

Рис. 8. Б, б) через 12 дней после операции

Рис. 8. Б, в) через 3 мес после операции

Рис. 9. Клинический пример №2.

Рис. 9, б) Биотрансплантат, представляющий собой PRF-мембрану (полученную с помощью центрифуги Scilogex, USA (РУ №РЗН 2015/3442) с интегрированными в нее аутоФС пациентки.

Рис. 9. а) до лечения

Рис. 9. в) сразу после операции

Рис. 9. г) через 12 дней после операции

Рис. 9. д) через месяц после операции

Рис. 9. е) через 3 месяца после операции

Рис. 9. ж) через 6 месяцев после операции

Рис. 10. б). Биотрансплантаты, представляющие собой PRF-мембраны (полученные с помощью центрифуги Scilogex, USA (РУ №РЗН 2015/3442) с интегрированными в них аутоФС пациента.

Рис. 10. а) до лечения

Рис. 10. в) сразу после операции

Рис. 10. г) через 12 дней после операции

Рис. 10. д) через месяц после операции

Рис. 10. е) через 3 месяца после операции

Рис. 10. ж) через 6 месяцев после операции

Рис. 11. а) до лечения

Рис. 11. б) через 12 дней после операции

Рис. 11. в) через месяц после операции

Рис. 11. г) через 3 месяца после операции

Рис. 11. д) через 6 месяцев после операции

Задачей, на решение которой направлено предлагаемое изобретение, является создание эффективного биотрансплантата, который может служить альтернативой СТТ, полноценно восстанавливая дефекты мягких тканей пародонта, в частности, рецессии десны и увеличения ее объема, способа его получения и способа лечения пародонта.

Для решения поставленной задачи предлагается разработанная технология изготовления биотрансплантата, предусматривающая получение PRF (обогащенный тромбоцитами фибрин) в виде мембраны из венозной крови пациента и интегрирование в нее аутологичных (собственных) фибробластов, выделенных из слизистой оболочки ротовой полости пациента.

Для получения аутоФС производят забор биоптата слизистой оболочки в области неба. Для этого у пациентов (при отсутствии противопоказаний, включающих наличие инфекционных и онкологических заболеваний, аутоиммунных заболеваний соединительной ткани, острых и в стадии обострения хронических заболеваний пародонта проводят биопсию слизистой оболочки в области неба на уровне 6-7-х зубов под местным обезболиванием посредством Sol.Ultracaini DC.

Затем из полученного биоптата в специализированной лаборатории производят выделение аутоФС с помощью стандартного метода [50] с небольшими модификациями. Для этого биоптат сначала выдерживают в питательной среде ДМЕМ (ПанЭко), содержащей антибиотики (пенициллин 100 ед./мл, стрептомицин 100 мкг/мл, гентамицин 200 мкг/мл) и антимикотик амфотерицин в 25 мкг/мл в течение 6-8 часов. Затем биоптат переносят в среду ДМЕМ, содержащую 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС, ПанЭко), 40 мкг/мл гентамицина и 400-500 мкг/мл коллагеназы II типа. Инкубацию биоптата с коллагеназой проводят при 37°С в течение 12-16 часов. Затем полученную клеточную взвесь центрифугируют в фосфатно-солевом буфере (раствор Хенкса, Биолот) при 300g 8 минут. Полученный клеточный осадок ресуспендируют в среде для культивирования - ДМЕМ, 10-20% ЭТС (или сыворотку пуповинной крови человека, или аутологичную сыворотку крови пациента), 40 мкг/мл гентамицина и эксплантируют в культуральные флаконы Т-25 (Nunc). Флаконы помещают в CO₂-инкубатор (37°С, 5% СО₂) и культивируют в течение 1-3 недель до получения первичной культуры. (Для культивирования аутоФС можно использовать также бессывороточную полную ростовую среду для культивирования фибробластов (Fibroblast Basal Medium, BioWhittaker Inc., USA, или иные аналогичные бессывороточные среды для культивирования фибробластподобных клеток). Перед использованием ЭТС проводят тестирование лота ЭТС на эффективность колониеобразования (ЭКОф) и отбирают лоты только с высокой ЭКОф).

Затем клетки снимают с поверхности культурального флакона раствором трипсина -ЭДТА и переносят в новый T-75(Nunc) культуральный флакон с питательной средой (ДМЕМ, 10-15% ЭТС). Клетки инкубируют в течение недели в СО₂ инкубаторе (37°С, 5% СО₂). Каждые 48-72 часа производят смену питательной среды. По мере роста и достижения субконфлюэнтного слоя клетки снимают с поверхности культурального флакона раствором трипсина - ЭДТА(ПанЭко) и переносят в новый культуральный флакон большей площади (Т-150 или T-175(Nunc), или фабрики T-500(Nunc) с тройным дном). При достижении субконфлюэнтного монослоя питательную среду с 10-20% ЭТС заменяют на среду без сыворотки или на среду с 10% аутологичной сывороткой пациента и инкубируют не менее 18 часов при 37°С. Инкубация клеток на среде, не содержащей сыворотки, позволит избавиться от чужеродных белков, содержащихся в ЭТС. Затем клетки снимают с поверхности культурального флакона с помощью раствора трипсин - ЭДТА, трехкратно отмывают путем центрифугирования в 0,9% растворе хлорида натрия и суспендируют в 0,9% растворе хлорида натрия для инъекций. Полученный клеточный препарат представляет собой суспензию аутоФС в физиологическом растворе в концентрации 5,.- или 10,- или 20×10⁶ клеток/мл.

Полученную суспензию аутоФС интегрируют в фармацевтически приемлемый биосовместимый биодеградируемый носитель - аутологичную PRF-мембрану.

Количество биотрансплантатов зависит от количества дефектов десен индивидуально для каждого пациента.

Часть полученных после 1-го пассажа аутоФС пациента подвергают криоконсервированию в среде для криозаморозки (50% ДМЕМ, 40% ЭТС, 10% ДМСО) в концентрации 1,5×10⁶ мл, где в жидком азоте они могут храниться бессрочно. Это позволяет создать для каждого пациента индивидуальный мастер-банк, который в дальнейшем при необходимости можно использовать для создания биотрансплантата с целью восстановления тканей пародонта.

Используемый клеточный материал проходит обязательное тестирование на исключение вирусной и бактериальной инфекции, также осуществляется и кариотипирование клеток.

Все процедуры по получению клеточных биотрансплантатов проводят в условиях GMP, GTP, GLP.

Для характеризации полученных клеток исследуют их морфологию с помощью фазово-контрастной микроскопии (Фиг. 1), определяют иммунофенотип, анализируя клетки на проточном цитометре FACS Canto™ II с программным обеспечением «FACSDiva™» (Becton Dickinson, США) с использованием мышиных моноклональных антител фирмы BD Pharmingen™ (США) к маркерам гемопоэтических (CD34, CD45), мезенхимальных (CD73, CD90, CD105) и эпителиальных клеток (панцитокератины 14, 15, 16 и 19) (Фиг. 2), выполняют тест на КОКф (колониеобразующие единицы фибробластов) (Фиг. 3) и определяют эффективность колониеобразования (ЭКОф), проводят специфическое окрашивание клеток на F - актин и Westem-blott анализуют клеточные лизаты на экспрессию коллагена I типа. Экспрессию специфических маркеров фибробластов - коллагена I, III типа, эластина, виментина - определяют посредством иммунофлуоресцентного анализа с использованием первичных моноклональных антител и вторичных антивидовых антител, меченых родамином при помощи микроскопа Axioplan™ 200 с камерой Axiocam™ HRm и программного обеспечения AxioVision™ (Carl Zeiss, Германия).

Для получения PRF-мембраны, входящей в состав биотрансплантата, у пациента из локтевой вены берут 10 мл крови, затем посредством специализированной центрифуги (например, Scilogex, USA (РУ №РЗН 2015/3442) согласно предложенной производителем инструкции получают PRF в виде сгустка, из которого путем помещения его под пресс (бокс для формирования мембраны, входит в коммерческий комплект) получают PRF-мембрану (рис. 4).

Для изготовления биотрансплантата в полученную PRF-мембрану вводят суспензию аутоФС в концентрации 20 (или 5-, или 10-, или 15) х10⁶ клеток/мл с помощью иглы (30G 13 мм). Для этого иглу вводят в толщу мембраны на всю длину, после чего линейно-ретроградным способом вводят суспензию аутоФС (на каждый вкол: 50-100 мкл суспензии), затем иглу извлекают и делают новый вкол параллельно предыдущему на расстоянии от него 0,2-03 мл и так до тех пор, пока не будет введена вся клеточная суспензия(рис. 5).

Фибробласты - субстратзависимые клетки, обладающие высокой адгезией к субстрату [6, 22, 24]. Жизнеспособность интегрированных в PRF-мембрану (в частности, A-PRF-мембрану, полученную с помощью центрифуги Scilogex, USA (РУ №РЗН 2015/3442) аутоФС была изучена нами с помощью флуоресцентного анализа с использованием флуоресцентного белка GFP (Green Fluorescent Protein). Для этого ФС пациента перед введением в PRF-мембрану метили GFP с помощью специализированной генно-инженерной конструкции. Затем меченые ФС вводили (как описано выше) в PRF-мембрану, полученную из крови пациента. Полученный биотрансплантат инкубировали при комнатной температуре в течение часа, после чего с помощью микротома готовили тотальный срез данного биотрансплантата и выполняли флуоресцентный анализ.

Результаты проведенного исследования продемонстрировали наличие в исследуемом срезе биотрансплантата значительного количества флуоресцентного белка, что свидетельствует о присутствии в данном биотрансплантате жизнеспособных ФС (рис. 6). Полученные данные позволяют заключить, что аутоФС полноценно интегрируются в PRF-мембрану и сохраняют свою жизнеспособность.

Использование в биотрансплантате в качестве носителя PRF-мембраны - биодеградируемого и биосовместимого [20] с тканями пациента носителя - позволяет оптимизировать доставку аутоФС в место дефекта мягких тканей пародонта, а также - оставаться локализованными в месте дефекта ткани и обеспечить продукцию физиологически необходимого содержания компонентов ВКМ. После трансплантации аутофФС (также как и аутофибробласты кожи) полноценно приживаются в ткани [6, 24] и, продуцируя компоненты ВКМ, эффективно восполняют дефекты данной ткани [6, 24-26].

Хирургическое вмешательство на пародонте осуществляют по следующему алгоритму. В области рецессии десны производят модифицированный внутрибороздковый разрез. Затем формируют расщепленный слизисто-надкостничный лоскут, после чего подготавливают поверхность корня, используя для этого пародонтологические кюреты и проводят деэпителизацию межзубных сосочков.

Полученный биотрансплантат, состоящий из PRF-мембраны с интегрированными в нее аутоФС пациента, фиксируют с помощью нерезорбируемых нитей Pro-len 6,0 к межзубным сосочкам десны, закрывая оголенную поверхность корней зубов. После этого проводят мобилизацию лоскута и фиксируют его в межзубных промежутках, полностью закрывая привнесенный биотрансплантат. Для ушивания раны используют нерезорбируемые нити Pro-len 6,0 и 7,0. В области переходной складки накладывают "якорные" швы. Швы снимают через 12-14 дней.

Предлагаемый в изобретении биотрансплантат обладает консистенцией, удобной для оперативного вмешательства и наряду с выраженным клиническим эффектом обеспечивает малую травматичность, быструю реабилитацию пациента и простоту в обращении.

Предложенные в изобретении способ получения, способ применения биотрансплантата и наличие индивидуального мастербанка аутоФС пациента позволяет проводить хирургическое вмешательство у пациента неоднократно в зависимости от количества и размеров дефекта(-ов) без повторного забора биоматериала мягких тканей ротовой полости.

Для получения PRF применяют центрифуги различных производителей (Scilogex, USA (РУ №РЗН 2015/3442), Regen- PRP-Centri, Switzerland (РУ №ФСЗ 2012/13228) (см. Клинические примеры), и получаемые затем PRF-мембраны различаются между собой по плотности фибриновой сети. Так, PRF-мембрана, полученная с помощью Scilogex (USA) - наиболее плотная, благодаря чему и самая удобная для врача при использовании ее в биотрансплантате при выполнении процедур.

Следует отметить, что различия в плотности мембран при этом не влияли на течение послеоперационного периода и на выраженность клинического эффекта. Таким образом, при получении биотрансплантата можно использовать PRF-мембрану от любого производителя.

Главным преимуществом предлагаемого изобретения (по сравнению со всеми другими существующими в настоящее время в этом направлении методами) является: использование только аутологичных компонентов, полученных из тканей пациента, что исключает риск развития отторжения биотрансплантата или каких-либо других иммунных реакций; низкая травматичность как забора биоптата ткани, так и хирургического вмешательства; послеоперационный период не сопровождается дискомфортом для пациента и протекает без отеков, синяков и боли.

По клинической эффективности и стабильности полученного результата применение биотрансплантата (PRF-мембрана + аутоФС) не только не уступает "золотому стандарту" - СТТ, но и имеет ряд преимуществ: более быстрое заживление тканей в послеоперационном периоде (минимальные болевые ощущения, отсутствие отеков и гематом), что позволяет снимать швы на 2 дня раньше (12-14 день vs 10-12 день); средний процент закрытия рецессий - 95%, а закрытие рецессий I и II класса по Миллеру - 100%; происходит формирование прикрепленных тканей по границе эмалево-цементного соединения, в то время как при использовании СТТ может наблюдаться чрезмерное перекрытие данной границы; формирование равномерных по толщине и цвету тканей, в то время как при использовании СТТ наблюдается неравномерный контур тканей.

Предлагаемое изобретение может быть использовано при:

- закрытии генерализованных рецессий десны, когда недостаточно объема тканей для забора СТТ с неба (например, когда в области жевательных зубов на верхней челюсти установлены имплантаты);

- тонком фенотипе тканей пародонта, когда для закрытия рецессий не представляется возможным провести забор СТТ с неба из-за недостаточной толщины тканей в этой области;

- травмировании прикрепленных тканей в области оголенных корней зубов у пациентов, имеющих пародонтит в стадии ремиссии, так как у данной группы пациентов нет достаточного для забора трансплантата количества соединительной ткани на небе;

- аугментации мягких тканей перед ортодонтическим лечением у пациентов молодого возраста (16-20 лет), которые имеют тонкий фенотип пародонта и выраженную проминенцию корней;

- формировании прикрепленных тканей и пластики рецессий десны у пациентов, имеющих высокую аллергологическую настороженность, особенно к белкам инородного происхождения.

Сравнительный анализ клинической эффективности использования PRF-мембраны (Клинический пример №1, А) и PRF-мембраны + аутоФС (биотрансплантата) (Клинический пример №1, Б) выявил значительное преимущество биотрансплантата, которое заключается в более быстром сроке заживления после хирургического вмешательства и полном закрытии рецессий десны, в то время как при использовании только PRF - заживление происходит медленнее, с более выраженными клиническими проявлениями (боль, отек) и наблюдается незначительное увеличение толщины тканей с минимальным закрытием рецессий десны (1-2 мм).

Полученные данные позволили сделать заключение о преимущественном применении PRF-мембраны + аутоФС по сравнению с использованием только PRF-мембраны для закрытия рецессий десны. По всей видимости привнесенные в зону дефекта десны аутоФС, продуцируя коллаген и другие компоненты ВКМ, способствуют восстановлению утраченного объема десны, что в свою очередь приводит к закрытию рецессий, а PRF-мембрана служит для аутоФС оптимальным носителем.

Клинический пример №1 (А, Б).

А. Применение PRF-мембраны для закрытия рецессий десны (Рис. 7, А (а, б, в)).

Пациент Б., 49 лет. Диагноз: Генерализованные рецессии в области зубов верхней челюсти I-II класса по Миллеру.

Пациенту было выполнено хирургическое вмешательство в области рецессий десны (15-14) с применением PRF-мембраны, полученной с помощью Scilogex, USA (РУ №РЗН 2015/3442) (методика описана выше, рис. 4).

Клинический результат: в течение первых 3-х дней пациент отмечал дискомфорт, сопровождающийся отеком и болью; швы были сняты через 14 дней после хирургического вмешательства, через 3 мес после операции отмечено незначительное увеличение объема десны и незначительное закрытие рецессий (не более, чем на 1-2 мм).

Б. Применение PRF-мембраны + аутоФС для закрытия рецессий десны (рис. 8, Б (а, б, )).

Пациентка А., 42 г. Диагноз - Генерализованные рецессии в области зубов нижней челюсти I-II по Миллеру.

Пациентке было выполнено хирургическое вмешательство в области рецессий десны в аналогичной А. зоне с применением PRF-мембраны (Scilogex, USA (РУ №РЗН 2015/3442)) + аутоФС (методика описана выше, рис. 5).

Клинический результат: послеоперационный период дискомфортом не сопровождался, незначительный отек отмечен только в течение первых суток после хирургического вмешательства; швы были сняты через 12 дней после хирургического вмешательства, через 3 мес после операции выявлено полное закрытие рецессий десны.

Клинический пример №2.

Пациентка А., 42 г. обратилась с жалобами на оголение корней зубов 3.4-3.7, повышенную чувствительность при приеме холодной жидкости и чистке зубов. Объективно: 3.4-3.7 - генерализованные рецессии II-III класса по Миллеру от 2 до 5 мм. Тонкий биотип пародонта. Диагноз: Генерализованные рецессии в области 3.4-3.7 зубов I-III класса по Миллеру, тонкий биотип пародонта (рис. 9 б)).

Ранее у пациентки уже дважды был проведен на небе забор тканей и рентгенологическая картина показывала недостаточный для забора объем тканей на небе. Пациентке было предложено провести пластику рецессий десны с использованием биотрансплантата, содержащего PRF-мембрану, полученную с помощью центрифуги Scilogex, USA (РУ №РЗН 2015/3442) с аутоФС.

Для этого в области неба (2 сектор, уровень 2.6 зуба) был проведен забор биоптата размером 4 мм².

Из полученного биоптата были выделены аутоФС и через месяц доставлены в клинику в виде суспензии, содержащей 20×10⁶ /мл физиологического раствора.

Из локтевой вены пациентки была взята кровь в объеме 10 мл, из которой с помощью центрифуги Scilogex, USA (РУ №РЗН 2015/3442) получена PRF-мембрана.

На основании полученных биоматериалов пациентки был приготовлен биотрансплантат. В сформированную PRF-мембрану посредством нескольких вколов ввели 1 мл суспензии, содержащей 20×10⁶ аутоФС. Для этого иглу вводили в толщу мембраны на всю длину иглы, после чего линейно-ретроградным способом вводили суспензию аутоФС (на каждый вкол - 50-100 мкл клеточной суспензии), затем иглу извлекали и делали новый вкол параллельно предыдущему на расстоянии от него 0,2-03 мл и так до тех пор, пока не была введена вся клеточная суспензия (рис. 9 а)).

Под инфильтрационной анестезией Sol. Ultracaini DS 1,7-2 карпулы пациентке был выполнен модифицированный внутрибороздковый разрез в области 3.4-3.7 зубов, затем было произведено расщепление слизисто-надкостничного лоскута, после чего с помощью пародонтологических кюрет была проведена обработка поверхности корня и деэпителизация межзубных сосочков.

Полученный биотрансплантат был зафиксирован на подготовленную поверхность корня с помощью нерезорбируемых нитей Pro-len 6,0. После мобилизации лоскут был зафиксирован швами Pro-len 6,0: 7,0. В области переходной складки наложены "якорные" швы (рис. 9 в)).

После операции пациентке были даны стандартные рекомендации по послеоперационному уходу за ротовой полостью.

На 4-й день был проведен клинический осмотр, во время которого не было отмечено отеков и гематом. Со слов пациентки - в постоперационный период она не испытывала никакого дискомфорта и боли.

На 12-й день были сняты швы (рис. 9 г)). Клинически было выявлено увеличение толщины десны и закрытие рецессий в области 3.4-3.7 зубов. Данная клиническая картина наблюдалась и через 1, и через 3, и через 6 мес наблюдений (рис. 9 д, е, ж)).

Осложнений и нежелательных явлений выявлено не было на всем сроке наблюдений.

Клинический пример №3.

Пациентка М., 41 г. обратилась с жалобами на оголение корней 11-21-22-23-24 зубов, повышенную чувствительность при приеме холодной жидкости и чистке зубов. Объективно: 11-24 - генерализованные рецессии I класса по Миллеру от 1 до 3 мм. Толстый биотип пародонта. Диагноз: Генерализованные рецессии в области 11-24 зубов I класса по Миллеру (Рис. 10, б)).

У пациентки в позиции 25-27 установлены имплантаты, поэтому в донорской зоне нет возможности произвести забор трансплантата. В связи с этим пациентке было предложено провести пластику рецессий с использованием биотрансплантатов, содержащих PRF-мембрану, полученную с помощью центрифуги Scilogex, USA (РУ №РЗН 2015/3442) с аутоФС.

Для этого в области неба (2 сектор, уровень 2.6 зуба) был проведен забор биоптата размером 4 мм².

Из полученного биоптата были выделены аутоФС и через месяц доставлены в клинику в виде суспензии, содержащей 20×10⁶ /мл физиологического раствора.

Из локтевой вены пациентки была взята кровь в объеме 32 мл (4 пробирки по 9 мл), из которой с помощью центрифуги (Scilogex, USA, (РУ №РЗН 2015/3442,) получены 4 PRF-мембраны.

На основании полученных биоматериалов пациентки приготовили биотрансплантаты. В сформированные PRF-мембраны посредством нескольких вколов ввели 1 мл суспензии, содержащей 20×10⁶ аутоФС. Для этого иглу вводили в толщу мембраны на всю длину иглы, после чего линейно-ретроградным способом вводили суспензию аутоФС (на каждый вкол - 50-100 мкл клеточной суспензии), затем иглу извлекали и делали новый вкол параллельно предыдущему на расстоянии от него 0,2-03мл и так до тех пор, пока не была введена вся клеточная суспензия (рис 10 а).

Под инфильтрационной анестезией Sol. Ultracaini DS 1,7-2 карпулы пациентке был выполнен модифицированный внутрибороздковый разрез в области 11-21-24 зубов, затем было произведено расщепление слизисто- надкостничного лоскута, после чего с помощью пародонтологических кюрет была проведена обработка поверхности корня и деэпителизация межзубных сосочков.

Полученные биотрансплантаты были зафиксированы на подготовленную поверхность корня с помощью швов в межзубных промежутках. После мобилизации лоскуты были зафиксированы нитями Pro-len 6,0: 7,0. В области переходной складки наложены "якорные" швы (рис. 10 в).

После операции пациентке были даны стандартные рекомендации по послеоперационному уходу за ротовой полостью.

На 2-й день после операции у пациентки появился незначительный отек верхней губы, который сохранялся в течение 2-х суток, болевые ощущения были минимальными.

На 4-й день был проведен клинический осмотр, не было отмечено отеков и гематом.

На 12-й день были сняты швы (рис. 10 г)). Клинически было выявлено закрытие рецессий десны в области 11-21-24 зубов. Такая же клиническая картина наблюдалась и через 1, и через 3, и через 6 мес наблюдений (рис. 10 д, е, ж).

Осложнений и нежелательных явлений выявлено не было на всем сроке наблюдений.

Клинический пример №4:

Пациентка М., 44 г. обратилась с жалобами на оголение корней 13-23 зубов, повышенную чувствительность при приеме холодных напитков и чистке зубов. Объективно: 13-23 - генерализованные рецессии I-III класса по Миллеру от 2 до 4 мм. Толстый биотип пародонта.

Диагноз: Генерализованные рецессии в области 13-23 зубов I-III класса по Миллеру (рис. 11 а).

У пациентки в области неба ранее был произведен забор СТТ, поэтому в донорской зоне недостаточно тканей для забора трансплантата. В связи с этим пациентке было предложено провести пластику рецессий с использованием биотрансплантатов, содержащих PRF-мембрану, полученную с помощью центрифуги Regen- PRP-Centri, Switzerland (РУ №ФСЗ 2012/13228) с аутоФС.

Для этого в области неба (2 сектор, уровень 2.6 зуба) был проведен забор биоптата размером 4 мм.

Из полученного биоптата были выделены аутоФС и через месяц доставлены в клинику в виде суспензии, содержащей 20×10⁶ /мл физиологического раствора.

Из локтевой вены пациентки была взята кровь в объеме 32 мл (4 пробирки по 9 мл), из которой с помощью Regen- PRP-Centri, Switzerland (РУ №ФСЗ 2012/13228) получены 4 PRF-мембраны.

На основании полученных биоматериалов пациентки приготовили биотрансплантаты. В сформированные PRF-мембраны посредством нескольких вколов ввели 1 мл суспензии, содержащей 20×10⁶ аутоФС. Для этого иглу вводили в толщу мембраны на всю длину иглы, после чего линейно-ретроградным способом вводили суспензию аутоФС (на каждый вкол - 50-100 мкл клеточной суспензии), затем иглу извлекали и делали новый вкол параллельно предыдущему на расстоянии от него 0,2-03 мл и так до тех пор, пока не была введена вся клеточная суспензия.

Под инфильтрационной анестезией Sol. Ultracaini DS 1,7-2 карпулы пациентке был выполнен модифицированный внутрибороздковый разрез в области 13-23 зубов, затем было произведено расщепление слизисто-надкостничного лоскута, после чего с помощью пародонтологических кюрет была проведена обработка поверхности корня и деэпителизация межзубных сосочков.

Полученные биотрансплантаты были зафиксированы на подготовленную поверхность корня с помощью швов в межзубных промежутках. После мобилизации лоскуты были зафиксированы нитями Pro-len 6,0: 7,0. В области переходной складки наложены "якорные" швы (рис. 11 б).

После операции пациентке были даны стандартные рекомендации по послеоперационному уходу за ротовой полостью.

На 2-й день после операции у пациентки появился незначительный отек верхней губы, который сохранялся в течение 2-х суток, болевые ощущения были минимальными.

На 4-й день был проведен клинический осмотр, не было отмечено отеков и гематом.

На 12-й день были сняты швы. Клинически выявлено закрытие рецессий десны в области 13-23 зубов (рис. 11 в). Такая же клиническая картина наблюдалась и через 1, и через 3, и через 6 мес наблюдений (рис. 11 г, д).

Осложнений и нежелательных явлений выявлено не было на всем сроке наблюдений.

Литература

1. -De La Fuente AM., -Fresco R., Marichalar- X. Complications of harvesting a connective tissue graft from the palate. A retrospective study and description of a new technique. J Clin Exp Dent. 2017; Dec 1; 9(12):e1439-e1445. doi: 10.4317/jced.54337

2. McGuire M and Scheyer E.T. A randomized, double-blind, placebo controlled study to determine the safety and efficacy of cultured and expanded autologous fibroblast injections for the treatment of interdental papillary insufficiency associated with papilla priming procedure. J Periodontol. 2007; 78:4-17.

3. Иорданишвили A.К., Смолянинов А.Б., Жаров E.B. Роль клеточных технологий в стоматологии и челюстно-лицевой хирургии. АГ-ингфо. 2006; 4:8-11.

4. Saczko J., Dominiak М., Kulbacka J. A simple and established method of tissue culture of human gingival fibroblasts for gingival augmentation. Folia Histochem Cytobiol. 2008:46(1): 117-9.

5. Грудянов А.И., Зорин В.Л., Зорина А.И., и др. Клеточные технологии в пародонтологии. Стоматология 2009; (1):71-3.

6. Кулаков А.А., Грудянов А.И., Степанова И.И., и др. Применение аутологичных фибробластов слизистой оболочки рта человека для устранения рецессий десны. Стоматолгия., 2007., стр. 52-6

7. Pini-Prato GP, Rotundo R, Magnani С, Soranzo С. Tissue engineering technology for gingival augmentation procedures: a case report. Int J Periodontics Restorative Dent. 2000; 20:552-59.

8. Pini-Prato G, Rotundo R, Magnani C, Soranzo C, Muzzi L, Cairo F. An autologous cell yaluronic acid graft technique for gingival augmentation: a case series. J Periodontol 2003; 74:262-7.

9. McGuire MK, Scheyer ET, Nunn ME, Lavin PT. A pilot study to evaluate a tissue-engineered bilayered cell therapy as an alternative to tissue from the palate. J Periodontol. 2008; 79:1847-56.

10. Milinkovic et al. Clinical application of autologous fibroblast cell culture in gingival recession treatment. J Periodontal Res. 2015; 50(3):363-70.

11. et al. Efficacy of collagen membrane seeded with autologous gingival fibroblasts in gingival recession treatment: a randomized, controlled pilot study. J Periodontol. 2013; 84(10): 1416-24.

12. Marx R. Platelet - rich plasma: evidence to support its use. J. Oral Maxillofac. Surg. 2004; 62: 489-96

13. Ehrenfest D.M., Bielecki Т., Mishra A. et. al. In search of a consensus terminology in the field of platelet concentrates for surgical use: platelet-rich plasma (PRP), platelet-rich fibrin (PRF), fibrin gel polymerization and leukocytes. Curr Pharm Biotechnol. 2012; 13(7): 1131-7.

14. Aroca S., Keglevich Т., Barbieri B. et al. Clinical evaluation of a modified coronally advanced flap alone or in combination with a platelet-rich fibrin membrane for the treatment of adjacent multiple gingival recessions: a 6-month study. J Periodontol. 2009; 80(2):244-52.

15. Cortellini S., Castro A., Temmerman A. et al. L-PRF block for bone augmentation procedure: a proof-of-concept study. J Clin Periodontol. 2018; …??

16. Castro A., Meschi N., Temmerman A. et al. Regenerative potential of leucocyte- and platelet-rich fibrin. Part B: sinus floor elevation, alveolar ridge preservation and implant therapy. A systematic review. J Clin Periodontol. 2017; 44(2):225-34.

17. Ehrenfest D.M., Andia I., Zumstein M.A. et al. Classification of platelet concentrates (Platelet-Rich Plasma-PRP, Platelet-Rich Fibrin-PRF) for topical and infiltrative use in orthopedic and sports medicine: current consensus, clinical implications and perspectives. Muscle, Ligaments and Tendons Journal 2014; 4(1): 3-9.

18. Schar M., Diaz-Romero J., Kohl S. et al. Platelet-rich concentrates differentially release growth factors and induce cell migration in vitro. Clin Orthop Relat Res. 2015; 473: 1635-430.

19. Marenzi G., Riccitiello F., Tia M. et al. Influence of Leukocyte- and Platelet-Rich Fibrin (L-PRF) in the Healing of Simple Postextraction Sockets: A Split-Mouth Study. BioMed Research International 2015; 1-6. http://dx.doi.org/l0.1155/2015/369273.

20. Fujioka-Kobayashi M., Miron R., Hernandez M. et al. Optimized Platelet-Rich Fibrin With the Low-Speed Concept: Growth Factor Release, Biocompatibility, and Cellular Response. Journal of Periodontology 2016; DOI:10.1902/jop.2016.160443

21. Fan W., Yang M., Zhang C. et al. Effects of Choukroun's platelet-rich fibrin on human gingival fibroblasts proliferation, migration and type I collagen secretion. Zhonghua Kou Qiang Yi Xue Za Zhi. 2013; 48(2):72-6.

22. Sorrel M., Caplan A.I. Fibroblasts - a diverse population at the center of it all. International Review of Cell and Molecular biology 2009; 276: 161-214.

23. Stephens P. and Genever P. Non-epithelial oral mucosal progenitor cell populations. Oral Diseases 2007; 13:1-10.

24. Zorin V., Zorina A., Cherkasov V. et al. Clinical-instrumental and morphological evaluation of the effect of autologous dermal fibroblasts administration. J Tissue Eng Regen Med. 2014. doi: 10.1002/term.;

25. L., Larjava H., Fournier B. Distinct phenotype and therapeutic potential of gingival fibroblasts. Cytotherapy 2014; 16:1171-86.

26. McGuire M.C. and Nunn M.E. Evalution of the safety and efficacy of periodontal applications of a living tissue - engineereg human fibroblast-darived dermal substitute. Comparison to the gingival autograft% a randomized controlled pilot study. J.Periodontal. 2005; 76 (6): 867-80.

27. Патент США №6878383, МПК A61A 13/00

28. Степанова И.И. Применение фибробластов в стоматологии и имплантологии. Клеточные технологии в биологии и медицине 2007; 3: 165-8.

29. Chang Н., Chi J., Dudoit S. et al. Diversity, topographic differentiation, and positional memory in human fibroblasts. Proc Natl Acad Sci USA. 2009; 99: 12877-82.

30. Guo F., Carter D., Mukhopadhyay A., Leask A. Gingival fibroblasts display reduced adhesion and spreading on extracellular matrix: a possible basis for scarless tissue repair? PLoS One. 2011;6:270-97.

31. Ebisawa K., Kato R., Okada M. et al. Gingival and dermal fibroblasts: their similarities and differences revealed from gene expression. J Biosci Bioeng. 2011; 111:255-8.

32. Fournier В., Larjava H., L. Gingiva as a source of stem cells with therapeutic potential. Stem Cells Dev. 2013; 22: 3157-3177.

33. Lorimier S., Hornebeck W., Godeau G. et al. Morphometric studies of collagen and fibrin lattices contracted by human gingival fibroblasts; comparison with dermal fibroblasts. J Dent Res. 1998; 77:1717-29.

34. Brizzi M., Tarone G., Defilippi P. Extracellular matrix, integrins, and growth factors as tailors of the stem cell niche. Curr Opin Cell Biol. 2012; 24:645-51.

35. Gogly В., Naveau A., Fournier B. et al. Preservation of rabbit aorta elastin from degradation by gingival fibroblasts in an ex vivo model. Arterioscler Thromb Vase Biol. 2007; 27:1984-90.

36. Durand E., Fournier В., Couty L. et al. Endoluminal gingival fibroblast transfer reduces the size of rabbit carotid aneurisms via elastin repair. Arterioscler Thromb Vase Biol. 2010; 32:1892-901.

37. L., Larjava H., Koivisto L. Granulation tissue formation and remodeling. Endodontic Topics 2012; 24:94-129.

38. Dufour A., Overall C. Missing the target: matrix metalloproteinase antitargets in inflammation and cancer. Trends Pharmacol Sci. 2013; 34:233-42.

39. Cappellesso-Fleury S., Puissant-Lubrano В., Apoil P. et al. Human fibroblasts share immunosuppressive properties with bone marrow mesenchymal stem cells. J Clin Immunol. 2010; 30:607-19.

40. Fawzy El-Sayed K. and C. Gingival Mesenchymal Stem/Progenitor Cells: A Unique Tissue Engineering Gem. Stem Cells International 2016; Article ID 7154327, 1-16.

41. Xu X., Chen C, Akiyama K. et al. Gingivae Contain Neural-crest- and Mesoderm-derived Mesenchymal Stem Cells. J Dent Res. 2013; 92(9):825-32.

42. Kobayashi K., Suzuki Т., Nomoto Y. et al. Potential of heterotopic fibroblasts as autologous transplanted cells for tracheal epithelial regeneration. Tissue Eng. 2007; 13:2175-84.

43. Karring Т., Lang N., Loe H. The role of gingival connective tissue in determining epithelial differentiation. J Periodont Res. 1975; 10:1 -11.

44. Mah W, Jiang G, Olver D. et al. Human gingival fibroblasts display a non-fibrotic phenotype distinct from skin fibroblasts in three-dimensional cultures. PloS One. 2014; 9:907-15.

45. Parsonage G., Filer A., Haworth O. et al. A stromal address code defined by fibroblasts. Trends Immunol. 2005; 26:150-6.120.

46. Hakkinen, L., Uitto, V.J., and Larjava, H. Cell biology of gingival wound healing. Periodontol. 2000; 24:127- 52.

47. Prato G., Rotundo R., Magnani C. et al. An autologous cell hyaluronic acid graft technique for gingival augmentation: a case series. J Periodontol. 2003; 74:262e7.

48. Chhetri D., Berke G. Injection of cultured autologous fibroblasts for human vocal fold scars. Laryngoscope 2011; 121:785-92.

49. Linard C., Tissedre F., Busson E. et al. Therapeutic Potential of Gingival Fibroblasts for Cutaneous Radiation Syndrome: Comparison to Bone Marrow-Mesenchymal Stem Cell Grafts. STEM CELLS AND DEVELOPMENT. 2015; 1-12. Inc. DOI: 10.1089/.

50. Freshney J. A Culture of Animal Cells., Freshney J. 3rd edition, Wiley Liss Inc., New York, 1994.

Изобретение относится к медицине, а именно к стоматологии. Изготавливают биотрансплантат, предусматривающий введение аутологичных фибробластов, выделенных из слизистой оболочки ротовой полости пациента в PRF-мембрану. При этом вводят суспензию аутологичных фибробластов в концентрации 20×10⁶ клеток/мл. Для этого иглу вводят в толщу мембраны на всю длину, после чего линейно-ретроградным способом вводят 1 мл суспензии аутофибробластов, на каждый вкол: 50-100 мкл суспензии. Затем иглу извлекают и делают новый вкол параллельно предыдущему на расстоянии от него 0,2-0,3 мм и так до тех пор, пока не будет введена вся клеточная суспензия. Полученный биотрансплантат вводят хирургическим путем в пораженную часть десны. Способ позволяет полноценно восстановить дефекты мягких тканей пародонта, в частности рецессию десны, и увеличить ее объем. 2. з.п. ф-лы, 4 пр., 31 ил.

1. Способ изготовления биотрансплантата, предусматривающий введение аутологичных фибробластов, выделенных из слизистой оболочки ротовой полости пациента в PRF-мембрану, при этом вводят суспензию аутологичных фибробластов в концентрации 20×10⁶ клеток/мл, для этого иглу вводят в толщу мембраны на всю длину, после чего линейно-ретроградным способом вводят 1 мл суспензии аутофибробластов, на каждый вкол: 50-100 мкл суспензии, затем иглу извлекают и делают новый вкол параллельно предыдущему на расстоянии от него 0,2-0,3 мм и так до тех пор, пока не будет введена вся клеточная суспензия.

2. Биотрансплантат для устранения рецессий десны и восстановления утраченного десной объема, полученный способом по п. 1.

3. Способ лечения тканей пародонта, предусматривающий введение биотрансплантата, полученного способом по п. 1 хирургическим путем в пораженную часть десны.