Способ оценки площади эукариотических клеток, адгезированных на непрозрачных поверхностях Российский патент 2019 года по МПК C12N5/00 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к методикам измерения площади адгезированных клеток.

Адгезия и пролиферация эукариотических клеток отличается крайне высокой чувствительностью к внешним условиям культивирования, составу культурной среды, поверхностным свойствам материалов и другим параметрам.

Площадь клеток, адгезированных на поверхности, является часто используемым показателем биосовместимости материала, который предполагается использовать для изготовления имплантатов (зубных протезов, суставных протезов и т.п.). Данный показатель характеризует способность клеток фиксироваться на поверхности материала и прочность связи с ним. Низкий уровень адгезии клеток на поверхности имплантированного материала после операции может привести к формированию фиброзной капсулы вокруг имплантата, резорбции окружающей костной ткани и его отторжению.

Для проведения экспериментов по оценке уровня адгезии in vitro используют первичные или перевиваемые клеточные культуры, чаще всего фибробласты, МСК (мезенхимальные стволовые клетки), остеобласты и их производные. Также нередко оценивается уровень адгезии клеток крови, чаще всего моноцитов.

Для изготовления имплантатов чаще всего используют титан и его сплавы. Непрозрачность материала делает невозможным изучение клеток на поверхности в проходящем свете. Для визуализации клеток с целью подсчета их площади чаще всего используют метод флуоресцентной микроскопии, требующий предварительного окрашивания клеток с использованием флуоресцентных красителей.

Известен метод окрашивания клеток для подсчета их площади с использованием флуоресцирующих красителей, конъюгированных с флуорофором (Rao М., Zaidel-Bar R. Formin-mediated actin polymerization at cell-cell junctions stabilizes E-cadherin and maintains monolayer integrity during wound repair - Полимеризация актина с участием формина в межклеточных контактах стабилизирует Е-кадерин и поддерживает целостность монослоя при заживлении раны // Mol. Biol. Cell September 15, 2016 vol. 27 no. 18 2844-2856). Зафиксированные клетки обрабатывают 0.2% Triton Х-100 в течение 3 мин. Окрашивание фаллоидином, конъюгированным с Alexa Fluor (Life Technologies), выполняют при комнатной температуре в течение 30 мин в темноте. Площадь окрашенных клеток оценивают с помощью флуоресцентного микроскопа с использованием алгоритма MATLAB.

Известен также метод окрашивания фиксированных формальдегидом клеток с использованием фаллоидина, конъюгированного с FITC или Alexa Fluor 488 (https://www. thermofisher.com/ru/ru/home/references/protocols/cell-and-tissue-analysis/microscopy-protocol/actin-staining-protocol.html), производитель ThermoFisher Scientific. Слайд с зафиксированными клетками обрабатывают 0,1% Triton Х-100 в течение 3-5 мин, отмывают два или более раза фосфатным буфером. Клетки окрашивают раствором фаллоидин-флуорофор в течение 20 мин при комнатной температуре, после чего отмывают два или более раза фосфатным буфером. Окрашенные клетки пригодны для оценки их площади с использованием флуоресцентного микроскопа.

Недостатком обоих методик является необходимость использования для окрашивания клеток дорогостоящего конъюгата фаллоидин-флуорофор. Кроме того, эти методики позволяют окрашивать только клетки, имеющие сформированный актиновый цитоскелет, и не подходят для окрашивания клеток без цитоскелета, т.е. точность оценки недостаточна высока.

Наиболее близким способом к заявляемому является способ подсчета площади клеток клеток с использованием флуоресцирующих красителей, конъюгированных с флуорофором. (Li S., Chow Т., Chu J. Engineering microdent structures of bone implant surfaces to enhance osteogenic activity in MSCs - Создание микрозубчатых структур на поверхности костных имплантов для увеличение остеогенной активности МСК // Biochemistry and Biophysics Reports 9 (2017) 100-105).

1) Клетки фиксируют стандартным методом с использованием глутарового альдегида и этанола или формальдегида, например 4% параформальдегидом в течение 15 мин.

2) Зафиксированные клетки обрабатывают 0,5% Triton-X100 в течение 10 мин.

3) Для окраски актиновых филаментов фиксированные клетки обрабатывают 6,6 мкМ раствором Alexa Fluor 546-фаллоидин в разведении 1:100 и инкубируют в течение 45 мин. при комнатной температуре в темноте.

4) Ядра фиксированных клеток окрашивают 300 мкМ раствором DAPI в разведении 1:1000.

5) Образцы визуализируют с помощью флуоресцентного микроскопа.

6) Площадь окрашенных клеток оценивают с помощью программы ImageJ.

Данный способ применим для оценки площади лишь отдельных участков клетки и более дорогостоящий.

Задачей изобретения является усовершенствование методики оценки площади эукариотических клеток, адгезированных на непрозрачных поверхностях.

Технический результат, который будет достигнут от использования заявляемого способа, заключается в повышении точности оценки за счет увеличения площади окрашенных клеток и снижении стоимости.

Технический результат достигается тем, что в способе оценки площади эукариотических клеток, адгезированных на непрозрачных поверхностях, включающем фиксацию клеток с использованием глутарового альдегида и этанола или формальдегида, окрашивание клеток с использованием флуоресцирующих красителей, флуоресцентную микроскопию образцов и фотографирование полученных изображений и подсчет площади клеток с помощью программ анализа изображений, окрашивание клеток после их фиксации производят 0,3% водным раствором пиразолонового желтого с инкубацией при комнатной температуре в течение 20-30 мин.

Из анализа научно-технической и патентной литературы окрашивания клеток после их фиксации раствором пиразолонового желтого, повышающего точность оценки площади и значительного снижения себестоимости метода, не выявлено, что позволяет сделать вывод о соответствии заявляемого технического решения критериям «новизна» и «изобретательский уровень».

Изобретение осуществляется следующим образом.

Подсчет площади клеток включает следующие этапы:

1) Фиксацию клеток осуществляют стандартным методом с использованием глутарового альдегида и этанола или формальдегида.

2) Окрашивание цитоплазмы зафиксированных клеток производят пиразолоновым желтым (этап модифицирован). На поверхность с окрашиваемыми клетками наносят водный 0,3% раствор пиразолонового желтого и инкубируют в течение 20-30 мин. при комнатной температуре. Затем удаляют раствор пиразолонового желтого и клетки 3 раза отмывают PBS. (Предварительная обработка Triton-X100 в этом случае не требуется).

3) Окрашивание ядер клеток проводят красителем DAPI, который связывается с ДНК. Окрашивание ядер клеток DAPI необходимо для контроля того, что окрашенные пиразолоновым желтым (или конъюгатом флуорофор-фаллоидин по прототипу) объекты действительно являются клетками. Окрашивание DAPI выполняют в соответствии с протоколом https://www.thermofisher.com/ru/ru/home/refences/protocols/cell-and-tissue-analysis/protocols/dapi-imaging-protocol.html. На поверхность с окрашиваемыми клетками наносят 300 нМ раствора DAPI в PBS на 5 мин при комнатной температуре в отсутствие прямого света. Раствор DAPI удаляют, клетки 3 раза отмывают PBS.

4) Флуоресцентная микроскопия образцов, фотографирование полученных изображений в требуемых позициях. Фотографирование на каждой позиции проводится в 2 каналах флуоресценции: FITC для визуализации окрашенных пиразолоновым желтым клеток и DAP I для визуализации окрашенных DAPI ядер клеток. Окрашенные пиразолоным желтым клетки будут флуоресцировать зеленым светом, окрашенные DAPI ядра - синим светом.

5) Подсчет площади клеток с помощью программ анализа изображений осуществляется стандартным методом с использованием программы ImageJ или иной аналогичной программы.

Сравнительные данные заявляемого способа со способом по прототипу приведены в таблице.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к оценке площади эукариотических клеток, адгезированных на непрозрачных поверхностях. Способ включает фиксацию клеток с использованием глутарового альдегида и этанола или формальдегида, окрашивание клеток 0,3% водным раствором пиразолонового желтого с инкубацией при комнатной температуре в течение 20-30 мин. Затем осуществляют флуоресцентную микроскопию образцов, фотографирование полученных изображений и подсчет площади клеток с помощью программ анализа изображений. Изобретение позволяет повысить точность оценки за счет более контрастного окрашивания контура клеток. 1 табл.

Способ оценки площади эукариотических клеток, адгезированных на непрозрачных поверхностях, включающий фиксацию клеток с использованием глутарового альдегида и этанола или формальдегида, окрашивание клеток с использованием флуоресцирующих красителей, флуоресцентную микроскопию образцов и фотографирование полученных изображений, подсчет площади клеток с помощью программ анализа изображений, отличающийся тем, что окрашивание клеток после их фиксации производят 0,3% водным раствором пиразолонового желтого с инкубацией при комнатной температуре в течение 20-30 мин.