Средство, обладающее апоптозиндуцирующей активностью Российский патент 2019 года по МПК A61K31/4409 A61K31/341 A61P35/00 C07D213/16 C07D307/62 

Изобретение относится к области фармакологии и медицинской химии, конкретно к комплексному соединению аскорбиновой и изоникотиновой кислот.

Ввиду особой биологической значимости апоптоза разработка препаратов, позволяющих направленно воздействовать на этот процесс, представляет большую важность для медицины и биологии. Индукторы апоптоза используются как в медицине в качестве лекарственных средств, обладающих апоптозиндуцирующей (противоопухолевой) активностью, так и в исследовательских целях при работе с клеточными культурами.

К настоящему времени известен ряд соединений, влияющих на апоптоз [1-4].

Недостатком данных средств является их низкая эффективность, высокая токсичность, сложный процесс получения.

Задачей заявленного изобретения является расширение арсенала высокоэффективных фармакологических апоптозиндуцирующих средств.

Поставленную задачу решают путем применения в качестве апоптозиндуцирующего средства аддукта аскорбиновой С₆Н₈О₆ (H₂Asc) и изоникотиновой C₆H₅NO₂ (HIsonic) кислот.

Новым в предлагаемом изобретении является применение аддукта аскорбиновой C₆H₈O₆ (H₂Asc) и изоникотиновой C₆H₅NO₂ (HIsonic) кислот в качестве апоптозиндуцирующего средства.

Производное пиридина - пиридин-4-карбоновая или изоникотиновая кислота проявляет антивитаминные свойства, ингибируют окислительно-восстановительные реакции, происходящие в дыхательной цепи.

Изоникотиновая кислота лежит в основе химиотерапевтических средств противотуберкулезного действия. Гидразид изоникотиновой кислоты, используемый для профилактики и лечения туберкулеза, обладает определенной биологической активностью, способной вызывать изменение показателей обмена веществ и структурно-функционального состояния органов и систем. Оротат гидразида изоникотиновой кислоты проявляет антимикобактериальную и иммунотропную активность [5].

Известно также, что цитотоксическое действие некоторых противоопухолевых средств усиливается in vitro и in vivo в присутствии аскорбиновой кислоты [6].

Факт применения комплексного соединения с достижением нового технического результата, заключающегося в апоптозиндуцирующем действии в отношении мононуклеарных клеток крови человека, не является очевидным для специалиста.

Новые свойства не вытекают явным образом из уровня техники в данной области.

В проанализированной патентной и научно-медицинской литературе описание апоптозиндуцирующего действия аддукта аскорбиновой С₆Н₈О₆ (H₂Asc) и изоникотиновой C₆H₅NO₂ (HIsonic) кислот не обнаружено.

Предлагаемое изобретение может быть использовано в медицинских и исследовательских целях, а также при работе с клеточными культурами.

Исходя из вышеизложенного, следует считать заявляемое техническое решение соответствующим условиям патентоспособности: «Новизна», «Изобретательский уровень», «Промышленная применимость».

Изобретение будет понятно из следующего описания и приложенной к нему фигуре 1.

На фигуре 1. изображено количество мононуклеарных клеток в культуре крови. Белые столбики обозначают количество живых клеток, серые столбики - количество клеток в апоптозе, черные столбики - количество некротических клеток. По оси абсцисс: 1 - контроль, 2 - соединение (1) в концентрации 0,05 мкг/мл, 3 - соединение (1) в концентрации 0,1 мкг/мл, 4 -соединение (1) в концентрации 0,2 мкг/мл, 5 - соединение (1) в концентрации 0,3 мкг/мл. По оси ординат количество клеток, выраженное в процентах (%).

Синтез комплексного соединения изоникотиновой кислоты и аскорбиновой (1) осуществляют в этаноле при комнатной температуре и мольном соотношении исходных компонентов 1:2 (Hisonic: H₂Asc). Выделенный осадок аддукта промывают этанолом и сушат на воздухе, состав получаемого соединения соответствует формуле C₆H₅NO₂⋅C₆H₈O₆, выход около 65%. Полученное соединение идентифицируют методами элементного анализа, ИК-спектроскопии (отнесение полос сделано на основании совпадения экспериментальных спектров и спектров, рассчитанных методом DFT (B3LYP 6-311+G(d,p)), ЭСП (электронный спектр поглощения в УФ-области), STA (синхронный термический анализ). Контроль состава синтезированных продуктов осуществляют определением содержания аскорбиновой кислоты в аддукте перманганатометрическим методом (эмпирический титр рабочего раствора KMnO₄ устанавливают по аскорбиновой кислоте в 2 N растворе H₂SO₄; точность определения ± 1,5%).

Токсичность соединения (1) в остром опыте определена на 24 мышах линии BALB/c при однократном введении водного раствора соединения в желудок широком спектре доз (от 5000 до 10000 мг/кг веса). Наблюдения велись в течение 14 суток. При этом не обнаружено видимых признаков интоксикации и гибели подопытных животных. Согласно ГОСТ 12.1.007-76 соединение (1) при введении в желудок является малотоксичным соединением

Апоптозиндуцирующая активность соединения (1) определялась флуоресцентным методом. Метод заключается в определении фосфатидилсерина на поверхности клетки при связывании с меченным аннексином V, который обладает высоким сродством к фосфатидилсерину [7].

В качестве референтных препаратов для оценки апоптозиндуцирующей активности использовали изоникотиновую и аскорбиновую кислоту по схеме, аналогичной соединению (1).

Пример 1. Способ получения заявляемого соединения

К сухой смеси 0,307 г изоникотиновой и 0,880 г аскорбиновой кислот добавляют 20 мл этанола. При постоянном перемешивании по мере испарения растворителя, реакционная смесь приобретает желтую окраску и загустевает, после чего ее переносят на бумажный фильтр, промывают небольшими порциями этанола, затем осадок аддукта сушат на воздухе. Выход продукта 65%, содержание аскорбиновой кислоты в его составе 59,70% против 58,86% (теор.), рассчитанных для C₆H₅NO₂⋅С₆Н₈О₆, t_пл. 186,9°С (с разл.).

Для соединения C₆H₅NO₂⋅C₆H₈O₆:

найдено, %: С 47,3; Н 4,4; N 5,3.

вычислено, %: С 48,12; Н 4,34; N 4,68.

ИК спектр (эксп.), ν, см^-1: 563 (δ.С(2)O-Н и С(4)-СООН); 694, 759, 773 (δ. лактонового и пиридинового колец); 862 (δ. С(4)-СООН); 1035, 1121, 1158, 1247 (γ. аскорбиновой и никотиновой кислот); 1388, 1446 (δ.С(2)O-Н и ОСО-Н); 1626, 1663, 1734 (v.C=O, C=C); 3306, 3406 (v.O-H).

ИК спектр (расчет.), ν, см^-1: 569 (δ.С(2)O-Н и С(4)-СООН); 691, 759, 773 (δ. лактонового и пиридинового колец); 870 (δ. С(4)-СООН); 1041, 1139, 1155, 1237 (γ. аскорбиновой и никотиновой кислот); 1375, 1449 (δ.С(2)O-Н и ОСО-Н); 1723, 1750, 1806 (v.C=O, C=C); 3341, 3439 (v.O-H).

УФ-спектр Hisonic (тв.): λ_max 236, 284, 295.

УФ-спектр H₂Asc (тв.): λ_max 243, 256, 265.

УФ-спектр аддукта Hisonic H₂Asc (тв.): λ_max 240, 242, 245, 258, 277, 308, 333.

Пример 2. Изучение острой токсичности соединения (1) Острую токсичность соединения (1) исследовали на беспородных белых мышах с массой 19,0±2,0 г. Группе животных однократно в желудок через зонд вводили соединение (1) в дозах 5000, 7500 и 10000 мг/кг. Контрольные животные получали дистиллированную воду. Наблюдения за животными вели в течение двух недель. Отсутствие гибели животных свидетельствует о низкой токсичности соединения (1) в соответствии с ГОСТ 12.1.007-76. Дозы, вызывающие 50% гибель мышей, для изоникотиновой кислоты и аскорбиновой кислоты больше 5000 мг/кг, малотоксичные соединения (4-й класс опасности).

Пример 3. Изучение апоптозиндуцирующей активности

Апоптозиндуцирующая активность соединения (1) определялась флуоресцентным методом [7].

Мононуклеары периферической крови здоровых доноров, выделенные на градиенте фиколла, суспендируют в среде RPMI 1640 в концентрации 4⋅10⁴ клеток/мл. Раствор аддукта аскорбиновой и изоникотиновой кислот (точная навеска 50 мг, растворенная в 10 мл дистиллированной воды) добавляют в культуру мононуклеарных клеток крови из расчета на требуемую конечную концентрацию аддукта - 0,05 мкг/мл, 0,1 мкг/мл, 0,2 мкг/мл, 0,3 мкг/мл. Указанные дозы были определены в предварительных экспериментах в качестве наиболее эффективных. Далее культуру клеток с исследуемым соединением инкубируют в течение 24 часов при 37°С в среде 5% углекислого газа. Уровень апоптоза фиксируют на проточном цитометре по степени включения меченого красителя апоптотическими клетками.

Результаты определения сравнения уровня апоптоза представлены в табл.1 в процентах апоптотических клеток после 24 часов инкубации лимфоцитов с заявленной композицией и референтными веществами. Для сравнения выбрана минимальная доза, с которой проявлялась выраженная апоптозиндуцирующая активность соединения (1).

Источники информации:

1. Патент RU 2296578.

2. Патент RU 2441873.

3. Патент RU 2456001.

4. Патент RU 2630303.

5. Патент RU 2044728.

6. Результаты фазы клинических испытаний каталитической системы «терафтал + аскорбиновая кислота». / Л.В. Манзюк [и др.] // Российский биотерапевтический журнал. 2005. №1. Т. 4. С. 105-107.

7. Kaplan, A. Cytotoxic, anti-proliferative and apoptotic effects of silver nitrate against H-ras transformed 5RP7. / A. Kaplan, G. Akalin Ciftci, H.M. Kutlu // Cytotechnology. 2016. Volume 68(5):1727-1735.

Изобретение относится к применению аддукта изоникотиновой и аскорбиновой кислот формулы C₆H₅NO₂·C₆H₈O₆ в качестве средства, обладающего апоптозиндуцирующей активностью. Технический результат - выявлена новая активность аддукта изоникотиновой и аскорбиновой кислот, может найти свое применение в медицине в качестве индуктора апоптоза в медицинских и исследовательских целях, а также при работе с клеточными культурами. 1 табл., 1 ил., 3 пр.

Применение аддукта изоникотиновой и аскорбиновой кислот формулы C₆H₅NO₂·C₆H₈O₆

в качестве средства, обладающего апоптозиндуцирующей активностью.