Бис-(4,5-оксиметил-2-метил-3-окси)пиридиниевая соль 2-нитрокси-бутан-1,4-диовой кислоты и способ его получения Российский патент 2020 года по МПК C07D213/18 C07D213/89 A61K31/444 A61P9/00 

Изобретение относится к новому физиологически активному соединению формулы (1), а именно бис-(4,5-оксиметил-2-метил-3-окси)пиридиниевая соль 2-нитрокси-бутан-1,4-диовой кислоты и способу его получения. Соединение 1 может быть использовано в фармакологии и косметологии как перспективное ранозаживляющее и антиаксидантное средство. Кроме того, изобретение относится к способу получения заявляемого соединения формулы (1).

Известны нитроксисукцинаты различных производных пиридина - нитроксисукцинат 2,4,6-триметил-3-оксипиридина (патент РФ №2250210). Данное соединение получено путем нитрования яблочной кислоты смесью серной и азотной кислот с последующим отделением нитрояблочной кислоты, обработкой ее 2,4,6-триметил-3-оксипиридином и выделением целевого продукта. Способ обладает недостаточной эффективностью из-за ограниченности сырьевой базы реагентов, в частности, 2,4,6-триметил-3-оксипиридина.

Наиболее близким техническим решением является изобретение по патенту РФ №2394815, которое описывает нитроксисукцинат2-этил-6-метил-3-оксипиридина (варианты использования) и способ его получения. Согласно этому изобретению нитроксисукцинат 2-этил-6-метил-3-оксипиридина может быть использован в качестве противоишимического, или противостессорного, или противогипоксического средства, или гепатопротектора, а также средства для лечения глазных кровоизлияний. Способ получения нитроксисукцинат 2-этил-6-метил-3-оксипиридина заключается в нитровании яблочной кислоты серно-азотной смесью, выделении нитрояблочной кислоты и ее обработки алкилоксипиридином, причем в качестве алкилоксипиридина используют 2-этил-6-метил-3-оксипиридин, а процесс ведут в среде низшего алифатического спирта, например, метанола или этанола при повышенной температуре, например, при температуре кипения метанола или этанола.

Известное техническое решение было разработано в лабораторных условиях и не позволяло проводить синтез производных нитроксисукцинатов в крупномасштабном производстве.

Задачей предлагаемого технического решения является разработка приемлемого подхода к крупномасштабному производству физиологически активного соединения, являющегося одновременно донором NO и дополнительным источником витамина В6, перспективного антиоксидантного и ранозаживляющего средства.

Поставленная задача решается новым химическим соединением бис (4,5-оксиметил-2-метил-3-окси)пиридиниевая соль 2-нитрокси-бутан-1,4-диовой кислоты и способом его получения.

Конкретно задача решается бис (4,5-оксиметил-2-метил-3-окси)пиридиниевая соль 2-нитрокси-бутан-1,4-диовой кислоты формулы 1

в качестве антиоксидантного и ранозаживляющего средства.

Также задача решается способом получения соединения по формуле (1), включающим нитрование яблочной кислоты, в котором процесс проводят в три стадии, при этом на 1 стадии проводят синтез 2-нитрояблочной кислоты путем нитрования твердой яблочной кислоты 100%-й азотной кислотой при охлаждении до образования суспензии, в которую затем добавляют дихлорэтан с последующим охлаждением реакционной смеси; на второй стадии проводят обработку в этаноле гидрохлоридной формы пиридоксина гидрокарбонатом натрия для выделения свободной формы витамина В6 при перемешивании при температуре 25-30°С полученный раствор 4,5-оксиметил-2-метил-3-оксипиридина отфильтровывают от неорганического осадка; на третьей стадии к раствору 4,5-оксиметил-2-метил-3-оксипиридина (0.005-0.11 моль), небольшими порциями прибавляют 2-нитрояблочную кислоту (0.002-0.055 моль), затем реакционную массу выдерживают при перемешивании до образования осадка целевого продукта.

Заявляемое соединение бис (4,5-оксиметил-2-метил-3-окси)пиридиниевая соль 2-нитрокси-бутан-1,4-диовой кислоты представляет собой структуру, состоящую из двух частей молекулы 4,5-оксиметил-2-метил-3-оксипиридина (основания витамина В-6) и одной части молекулы нитроксисукцината - вещества донора NO), (формула 1).

Способ получения заявляемого соединения состоит в следующем. Первая стадия синтеза осуществляется согласно схеме 1 с использованием 100% азотной кислоты в качестве нитрующего реагента. Примечательно, что разработанный способ нитрования ранее не был использован для получения нитрояблочной кислоты. Кроме того, не описан ранее и реализованный способ выделения целевой кислоты из реакционной смеси - высаживание из реакционной смеси путем добавления дихлорэтана.

Вторая стадия представлена на схеме 2. Как видно из приведенной схемы, выделение пиридоксина из его гидрохлоридной формы проводится обработкой этанольной суспензии гидрокарбонатом натрия.

Наконец третья стадия, представленная схемой 3, заключается в синтезе заявляемого соединения бис-(4,5-оксиметил-2-метил-3-окси)пиридиниевой соли 2-нитрокси-бутан-1,4-диовой кислоты (формулы 1).

В ходе проведенных исследований была выявлена исключительная важность степени чистоты используемого пиридоксина, поскольку присутствующие в виде примесей продукты его разложения значительно снижают выход заключительной стадии образования соединения (1). Обнаружено, что для обеспечения максимального выхода целевого продукта необходимо проводить реакцию при комнатной температуре и с использованием только свежевыделенного (из гидрохлоридной формы) пиридоксина. Наиболее оптимальный подход к проведению заключительной стадии получения соединения (3) заключается в использовании этанольного раствора пиридоксина, получаемого непосредственно в процессе обработки его гидрохлоридной формы (стадия 2).

Сущность данного изобретения характеризуется следующими примерами.

Пример 1. Получение нитрояблочной кислоты.

К 30 г 100% азотной кислоты при 18°С в течении 10-20 мин добавляли 10 г яблочной кислоты. Полученный гомогенный раствор перемешивали в течение 4-х часов. Продукт выделяли путем добавления к реакционной смеси 80 мл дихлорэтана с последующим охлаждением до -10°С (смесь выдерживалась при этой температуре в течение 12 часов). Полученный осадок отфильтровали, промывали дихлорэтаном и сушили в вакууме. Получено 12 г белого кристаллического вещества - нитрояблочной кислоты. Выход 90%. Температура плавления 133-135°С (с разл.).

Элементный анализ. Найдено, %: С 26,68; Н 2,93; N 7,97. Брутто формула C₄H₅NO₇. Вычислено, %: С 26,83; Н 2,81; N 7,82; О 62,54. ИК- спектр (см^-1): 1732; 1722; 1654; 1444; 1385;1336; 1273;1249; 1205; 1053; 907; 844; 751; 673. ЯМР ¹Н (ДМСО-d6): 2.87 (дд, СН), 3.0 (дд, СН), 5.62 (дд, CHONO₂), 13,30 (уш.с, НООС).

Пример 2. Выделения свободной формы пиридоксина, витамина В6.

4,11 г пиридоксина гидрохлорида суспендируют в 40 мл этанола. К полученной смеси добавляют 1.68 г мелко растертого гидрокарбоната натрия. Реакционную смесь перемешивали 2 часа при температуре 25-30°С. Образовавшийся осадок отделяют. Фильтрат, содержащий свободный пиридоксин используют в реакции с нитрояблочной кислотой.

Пример 3. Получение бис-(4,5-оксиметил-2-метил-3-окси)пиридиниевой соли 2-нитрокси-бутан-1,4-диовой кислоты.

К этанольному раствору, содержащему 0.8 г 4,5-оксиметил-2-метил-3-оксипиридина (0.005 моль) прибавляют порционно 0.42 г 2-нитрояблочной кислоты (0.002 моль). Реакционную смесь перемешивают до начала образования осадка, после чего большую часть (75%) растворителя отгоняют при пониженном давлении. К полученной суспензии добавляют три объема этилацетата. Осадок отфильтровывается, промывается смесью этилацетат: метанол (85:15), сушится в вакууме. Выход 1.16 г (95%). т.пл. 110-112 ПС (с разложением). Элементный анализ. Найдено, %: С 46,92; Н 5,395; N 7,80. Брутто формула C₈H₁₂NO₃⋅C₈H₁₂NO₃⋅C₄H₃NO₇. Вычислено, %: С 46,42; Н 5,26; N 8,12; О 40,2. ИК- спектр (см^-1): 1622; 1590; 1544; 1382; 1343; 1275; 1090; 1032; 904; 861; 743.

ЯМР ¹Н (ДМСО-d6): 2.38 (с. СН₃); 2.85-2.96 (дд, СН); 3.2-4.4 (уш. с. -ОН); 4.53 (с, СН₂ОН); 4.74 (с, СН₂ОН); 5.57 (дд, CHONO₂); 7,93 (с. Н_аром).

Пример 4. Получение бис-(4,5-оксиметил-2-метил-3-окси)пиридиниевой соли 2-нитрокси-бутан-1,4-диовой кислоты.

К этанольному раствору, содержащему 18.7 г 4,5-оксиметил-2-метил-3-оксипиридина (0.11 моль) прибавляют порционно 9.9 г 2-нитрояблочной кислоты (0.055 моль). Реакционную смесь перемешивают до начала образования осадка, после чего большую часть (75%) растворителя отгоняют при пониженном давлении. К полученной суспензии добавляют три объема этилацетата. Осадок отфильтровывается, промывается смесью этилацетат: метанол (85: 15), сушится в вакууме. Выход 21.94 г (76.7%). т.пл. 110-112°С (с разложением). Элементный анализ. Найдено, %: С 46,92; Н 5,395; N 7,80. Брутто формула C₈H₁₂NO₃⋅C₈H₁₂NO₃⋅C₄H₃NO₇. Вычислено, %: С 46,42; Н 5,26; N 8,12; О 40,2. ИК- спектр (см^-1): 1622; 1590; 1544; 1382; 1343; 1275; 1090; 1032; 904; 861; 743.

ЯМР ¹Н (ДМСО-d6): 2.38 (с. СН₃); 2.85-2.96 (дд, СН); 3.2-4.4 (уш. с. -ОН); 4.53 (с, СН₂ОН); 4.74 (с, СН₂ОН); 5.57 (дд, CHONO₂); 7,93 (с. Н_аром).

Пример 5. Получение бис-(4,5-оксиметил-2-метил-3-окси)пиридиниевой соли 2-нитрокси-бутан- 1,4-диовой кислоты.

К этанольному раствору, содержащему 1.08 г 4,5-оксиметил-2-метил-3-оксипиридина (0.006 моль) прибавляют порционно 0.54 г 2-нитрояблочной кислоты (0.003 моль). Реакционную смесь перемешивают до начала образования осадка, после чего большую часть (75%) растворителя отгоняют при пониженном давлении. К полученной суспензии добавляют три объема этилацетата. Осадок отфильтровывается, промывается смесью этилацетат: метанол (85:15), сушится в вакууме. Выход 1.54 г (92.6%). т.пл. 110-112°С (с разложением). Элементный анализ. Найдено, %: С 46,92; Н 5,395; N 7,80. Брутто формула C₈H₁₂NO₃⋅C₈H₁₂NO₃⋅C₄H₃NO₇. Вычислено, %: С 46,42; Н 5,26; N 8,12; О 40,2. ИК- спектр (см^-1): 1622; 1590; 1544; 1382; 1343; 1275; 1090; 1032; 904; 861; 743.

ЯМР ¹Н (ДМСО-d6): 2.38 (с. СН₃); 2.85-2.96 (дд, СН); 3.2-4.4 (уш. с. -ОН); 4.53 (с, СН₂ОН); 4.74 (с, СН₂ОН); 5.57 (дд, CHONO₂); 7,93 (с. Н_аром).

Таким образом предлагаемый способ получения соединения формулы 1 позволяет решить задачу получения ранее неизвестного соединения бис(4,5-оксиметил-2-метил-3-окси) пиридиниевую соль 2-нитрокси-бутан-1,4-диовой кислоты, в экономически выгодных промышленных масштабах. Заявляемая технология позволяет получить абсолютно чистый целевой продукт.

Экспериментальное исследование биологической активности бис(4,5-оксиметил-2-метил-3-окси) пиридиниевую соль 2-нитрокси-бутан-1,4-диовой кислоты в качестве антиоксиданта и ранозаживляющего средства проводили в экспериментах in vitro и in v/vo, что видно на примерах 6-8

Пример 6. Изучение антиоксидантной активности бис(4,5-оксиметил-2-метил-3-окси) пиридиниевой соли 2-нитрокси-бутан-1,4-диовой кислоты проводили с использованием флуоресцентного красителя 2',7'-дихлородигидрофлуоресцеина диацетата (H2DCFDA), который показывает внутриклеточное содержание активных форм кислорода АФК, на культуре клеток эпителия почки африканской зеленой мартышки (Vero) в присутствии индуктора образования АФК терт-бутилгидропероксида (t-BuOOH).

Выявлено, что культивирование клеток Vero в присутствии бис-(4,5-оксиметил-2-метил-3-окси)пиридиниевой соли 2-нитрокси-бутан-1,4-диовой кислоты в концентрации 10 мкМ в условиях индуцированного окислительного стресса сопровождается существенным снижением внутриклеточного накопления АФК (приблизительно на 40%).

Пример 7. Изучение антиоксидантной активности бис(4,5-оксиметил-2-метил-3-окси) пиридиниевой соли 2-нитрокси-бутан-1,4-диовой кислоты проводили по степени ингибирования накопления малонового диальдегида (МДА), образующиеся при перекисном окислении липидов при инициации ионами Fe²⁺ в гомогенате мозга крыс.

Показано, что бис(4,5-оксиметил-2-метил-3-окси) пиридиниевая соль 2-нитрокси-бутан-1,4-диовой кислоты в концентрации 30 мкМ проявляет выраженные антиоксидантные свойства (количество регистрируемого МДА составляет 62,43±5,92% от контроля).

Пример 8. Оценку влияния на течение раневого процесса при заживлении линейной кожной раны на 60 крысах самцах линии Вистар при моделировании линейной кожной раны.

Показано, что применение бис(4,5-оксиметил-2-метил-3-окси) пиридиниевой соли 2-нитрокси-бутан-1,4-диовой кислоты приводит к активации регенераторных свойств кожной ткани. Отсутствие гранулем и гнойного воспалительного процесса свидетельствует о заживлении раны путем первичного натяжения.

Таким образом, соединение бис-(4,5-оксиметил-2-метил-3-окси)пиридиниевой соли 2-нитрокси-бутан-1,4-диовой кислоты обладает ярко выраженными антиоксидантными свойствами, а также обладает высокой ранозаживляющей способностью и может быть использовано для создания косметических и лекарственных средств на его основе.

Способ получения соединения формулы 1 позволяет решить задачу получения ранее неизвестного соединения бис(4,5-оксиметил-2-метил-3-окси) пиридиниевую соль 2-нитрокси-бутан-1,4-диовой кислоты, в экономически выгодных промышленных масштабах. Заявляемая технология позволяет получить абсолютно чистый целевой продукт.

Изобретение относится к новому физиологически активному соединению формулы (1), а именно бис (4,5-оксиметил-2-метил-3-окси)пиридиниевая соль 2-нитрокси-бутан-1,4-диовой кислоты и способу его получения.

Соединение 1 может быть использовано в косметологии и фармакологии как перспективное антиоксидантное и ранозаживляющее средство. 2 н.п. ф-лы, 8 пр.

1. Бис-(4,5-оксиметил-2-метил-3-окси)пиридиниевая соль 2-нитрокси-бутан-1,4-диовой кислоты формулы 1

в качестве ранозаживляющего и антиаксидантного средства.

2. Способ получения соединения по формуле (1), включающий нитрование яблочной кислоты, отличающийся тем, что процесс проводят в три стадии, при этом на 1 стадии проводят синтез 2-нитрояблочной кислоты путем нитрования твердой яблочной кислоты 100%-й азотной кислотой при охлаждении до образования суспензии, в которую затем добавляют дихлорэтан с последующим охлаждением реакционной смеси; на второй стадии проводят обработку в этаноле гидрохлоридной формы пиридоксина гидрокарбонатом натрия для выделения свободной формы витамина В6 при перемешивании при температуре 25-30°С полученный раствор 4,5-оксиметил-2-метил-3-оксипиридина отфильтровывают от неорганического осадка; на третьей стадии к раствору 4,5-оксиметил-2-метил-3-оксипиридина (0.005-0.11 моль), небольшими порциями прибавляют 2-нитрояблочную кислоту (0.002-0.055 моль), затем реакционную массу выдерживают при перемешивании до образования осадка целевого продукта.