ПРИМЕНЕНИЕ IDHP В ПОЛУЧЕНИИ ЛЕКАРСТВЕННОГО СРЕДСТВА ИЛИ МЕДИЦИНСКОГО ПРОДУКТА ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ КОРОНАРНОГО АТЕРОСКЛЕРОЗА Российский патент 2020 года по МПК A61K31/216 A61P9/00 A61P7/02 

[0001] В настоящей заявке испрашивается приоритет по китайской заявке на патент № 201610876752.3, озаглавленной "ПРИМЕНЕНИЕ IDHP В ПОЛУЧЕНИИ ЛЕКАРСТВЕННОГО СРЕДСТВА ИЛИ МЕДИЦИНСКОГО ПРОДУКТА ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ КОРОНАРНОГО АТЕРОСКЛЕРОЗА", поданной в SIPO 8 октября 2016 г., и полное содержание которой включено в настоящую заявку посредством ссылки.

Область техники, к которой относится изобретение

[0002] Настоящее раскрытие относится к новому применению β-(3,4-дигидроксифенил)-α-гидроксиизопропилпропионата (IDHP), в частности, к применению IDPH для изготовления лекарственного средства или лечебного питания для профилактики и лечения заболеваний, связанных с атеросклерозом коронарных артерий.

Предпосылки создания изобретения

[0003] β-(3,4-Дигидроксифенил)-α-гидроксиизопропилпропионат (IDHP) представляет собой активное соединение, отобранное из большого количества метаболитов и серий их модификаций в процессе исследования пилюль Danshen, таблеток Guanxin Danshen, напитка Danshen и других рецептурах соединения Даньшэнь и пары трав Jun-Shi с использованием ВЭЖХ-МС, ГХ-МС, ГХ-FTIR(инфракрасная спектроскопия на основе преобразования Фурье), МС, ЯМР и других технических методов метаболомики. IDHP также можно синтезировать.

Сущность изобретения

[0004] Авторы изобретения исследовали роль IDHP в ингибировании агрегации тромбоцитов, стимуляции ангиогенеза и т.д., что обеспечило ценную теоретическую основу для разработки новых лекарственных средств и продуктов лечебного питания для профилактики и лечения заболеваний, связанных с коронарным атеросклерозом.

[0005] Атеросклероз коронарных артерий представляет собой тип заболевания, вызываемого накоплением бляшек внутри коронарной артерии, что вызывает стеноз или закупорку просвета сосудов, что приводит к ишемии, гипоксии или некрозу. Распространенным заболеванием, связанным с атеросклерозом коронарных сосудов, является ишемическая болезнь сердца, инсульт и инфаркт миокарда (ИМ). Основной патогенез ишемической болезни сердца тесно связан с нестабильной коронарной атеросклеротической бляшкой и образованием тромбоза. Агрегация тромбоцитов является важным фактором, приводящим к тромбозу, поэтому антитромбоцитарная терапия играет важную роль в профилактике и лечении ишемической болезни сердца. Инсульт относится к заболеванию высокого риска, при котором у пациента с цереброваскулярным заболеванием различные факторы будут вызывать стеноз, окклюзию или разрыв церебральной артерии, что приводит к острой дисфункции мозгового кровообращения и клинически проявляется как преходящая или постоянная дисфункция головного мозга. Антитромбоцитарная терапия играет важную роль в первичной и вторичной профилактике инсульта и в настоящее время признана одним из трех основных методов лечения (хирургическое вмешательство, антикоагуляция и меры, направленные против агрегации тромбоцитов). Кроме того, возникновение и лечение заболеваний, связанных с атеросклерозом коронарных артерий тесно связаны с ангиогенезом. Патологическая неоваскуляризация часто происходит в атеросклеротических бляшках, что может способствовать развитию атеросклеротических поражений и даже вызвать кровоизлияние в бляшку и разрыв бляшки и связанные с этим осложнения. Плотность неоваскуляризации вокруг места образования инфаркта при ишемическом инсульте напрямую связана с выживаемостью пациентов с ишемическим инсультом, и стимулирование ангиогенеза после ишемического инсульта способствует сохранению области "ишемической полутени". Ангиогенез также является ключевым процессом в коронарной реперфузии и репарации ишемически поврежденного миокарда. Кроме того, проангиогенез играет значительную роль после выздоровления от инфаркта миокарда. Исследования авторов изобретения показывают, что IDHP может значительно ингибировать ADP или коллаген-индуцированную агрегацию тромбоцитов человека, и в то же время IDHP может значительно стимулировать ангиогенез в первичных эндотелиальных клетках пупочной вены человека (HUVEC). Этот результат указывает на то, что IDHP можно использовать для получения лекарственных средств для профилактики и лечения заболеваний, связанных с атеросклерозом коронарных артерий.

[0006] Авторы изобретения обнаружили, что IDHP может значительно ингибировать ADP или коллаген-индуцированную агрегацию тромбоцитов человека, что становится основой для использования IDHP в разработке лекарственных средств против агрегации тромбоцитов.

[0007] Авторы изобретения обнаружили, что IDHP может значительно стимулировать ангиогенез в первичных эндотелиальных клетках пупочной вены человека (HUVEC), и IDHP также может значительно способствовать росту межсегментарных сосудов и хвостовых продольных кровеносных сосудов данио-рерио, это указывает на то, что IDHP можно использовать для получения лекарственных средств для стимуляции ангиогенеза.

[0008] IDHP может значительно ингибировать агрегацию тромбоцитов и стимулировать ангиогенез у человека, улучшать циркуляцию крови, и, таким образом, его можно использовать для лечения сосудистой деменции.

[0009] При помощи испытаний на острую и хроническую токсичность и экспериментов с гемолизом на мышах авторы изобретения обнаружили, что безопасность IDHP относительно высока. В сочетании с вышеуказанными данными активности, IDHP можно использовать для разработки продуктов лечебного питания для профилактики и лечения атеросклероза коронарных артерий, агрегации тромбоцитов, стимуляции ангиогенеза и профилактики и лечения сосудистой деменции.

[0010] Авторы изобретения обнаружили, что IDHP является веществом человеческого происхождения. При приеме IDHP можно поддерживать гомеостаз организма, чтобы достичь цели профилактики и лечения заболеваний, связанных с коронарным атеросклерозом и сосудистой деменцией.

Краткое описание чертежей

[0011] Фиг. 1 показывает эффект различных концентраций IDHP на пролиферацию эндотелиальных клеток пупочной вены человека;

[0012] Фиг. 2 показывает эффект различных концентраций IDHP на миграцию эндотелиальных клеток пупочной вены человека;

[0013] Фиг. 3 показывает эффект различных концентраций IDHP на образование трубочек эндотелиальных клеток пупочной вены человека;

[0014] Фиг. 4 показывает эффект IDHP на рост межсегментарных сосудов данио-рерио, где: A, PTK 787; B, 0,01 мкМ IDHP; C, 0,1 мкМ IDHP; D, 1,0 мкМ IDHP; E, 10,0 мкМ IDHP; F, 10 нм VEGF;

[0015] Фиг. 5 показывает результат роста межсегментарных сосудов, стимулируемого IDHP, у данио-рерио;

[0016] Фиг. 6 показывает эффект IDHP на ADP и коллаген- индуцируемую нормальную агрегацию тромбоцитов у человека (n=16);

[0017] Фиг. 7 показывает идентификацию IDHP при помощи масс-спектра;

[0018] Фиг. 8 показывает идентификацию IDHP жидкостной хроматографией.

Подробное описание изобретения

[0019] Структура соединения IDHP по настоящему изобретению показана в следующей формуле, и способ его получения может быть отнесен к CN 200410026205,3, но не ограничивается этим описанием в литературе.

[0020] Продукты лечебного питания, указанные в настоящем раскрытии, могут представлять собой мягкую капсулу, капельную пилюлю, эмульсию, таблетку, спрей и т.д.

Пример 1: IDHP промотирует ангиогенез культивируемых эндотелиальных клеток пупочной вены человека (HUVEC) in vitro

1.1 Детекция пролиферации эндотелиальных клеток пупочной вены человека, стимулируемой IDHP - метод CCK-8

[0021] Эндотелиальные клетки пупочной вены человека высевали в 96-луночный планшет с плотностью примерно 2500 клеток/лунка. Затем клетки культивировали в течение 24 часов, среду меняли на свежую среду, содержащую лекарственное средство, 100 мкл/лунка, и клетки продолжали культивировать в течение 48 часов. За 2 часа до окончания обработки лекарственным средством в культуральную среду в темноте добавляли реагент CCK-8, 10 мкл на лунку. Культивирование продолжали в течение 2 часов, а затем определяли поглощение при 450 нм при помощи микропланшет-ридера для расчета процента пролиферации клеток. Результат показан на Фиг. 1. По сравнению с нулевой контрольной группой, IDHP значительно стимулировал пролиферацию эндотелиальных клеток сосудов при концентрации от 10^-9 до 10^-7 M (P < 0,01).

1.2 Детекция миграции эндотелиальных клеток пупочной вены человека (HUVEC), стимулируемой IDHP - метод нанесения царапин

[0022] Эндотелиальные клетки высевали на покровное стекло, предварительно покрытое желатином, в 24-луночном планшете с плотностью примерно 10⁵ клеток/лунка. Затем клетки, прикрепившиеся к покровному стеклу и достигшие конфлюенции, помещали в бессывороточную среду на 4 часа. Использовали изготовленный на месте инструмент, чтобы сделать царапину на покровном стекле с клетками. Покровное стекло дважды промывали PBS и добавляли среду, содержащую лекарственное средство, 600 мкл/лунка. Контрольную группу немедленно фиксировали ледяным метанолом в точке времени ноль; остальные клетки культивировали в течение 16 часов и затем фиксировали ледяным метанолом. Изображения получали под микроскопом и подвергали статистическому анализу. Результат (Фиг. 2) показывает, что IDHP может стимулировать миграцию эндотелиальных клеток пупочной вены человека (HUVEC) дозозависимым образом в диапазоне концентраций от 10^-10 до 10^-7 M.

1.3 Детекция образования трубочек эндотелиальных клеток пупочной вены человека (HUVEC), стимулируемого IDHP - метод с использованием матригеля

[0023] Наконечники для пипеток и 96-луночный планшет предварительно охлаждали при -20°C. Матригель помещали на лед и расплавляли и затем добавляли в предварительно охлажденный 96-луночный планшет (60 мкл/лунка). Избегали образования пузырьков воздуха. Планшет помещали на лед на 5 минут для выравнивания матригеля и затем помещали в инкубатор для клеточных культур на 30 минут для затвердевания. Эндотелиальные клетки добавляли в лунки (5×10⁴ клеток/лунка), содержащие гель матригель, и добавляли свежую среду, содержащую различные концентрации лекарственного средства, инкубировали при 37°C в течение 8 часов. Планшет наблюдали под микроскопом, 5 областей наблюдения выбирали в положениях 0, 3, 6, 9 часов и центре каждой лунки, наблюдали количество трубочек и целостность трубчатой структуры и получали изображения. Результат показывает, что, по сравнению с контрольной группой Ctrl, IDHP значительно стимулировал образование трубочек первичных эндотелиальных клеток пупочной вены человека (HUVEC), указывая на то, что IDHP обладает активностью стимуляции ангиогенеза in vitro.

Пример 2 IDHP промотирует ангиогенез у трансгенных данио-рерио

[0024] Трансгенных Tg (VEGFR2:GFP) данио-рерио культивировали в стандартных условиях освещения 14 часов света/10 часов темноты при 28°C. Здоровых и зрелых рыбок данио-рерио помещали в контейнер для разведения в соотношении самок и самцов 1/1 или 1/2 для спаривания. Оплодотворенные яйцеклетки получали в 9-10 часов следующего дня. Оплодотворенные яйцеклетки стерилизовали и промывали, затем переносили в среду для культивирования эмбрионов данио-рерио и культивировали при 28°C.

[0025] Раствор лекарственного средства добавляли в 24-луночный культуральный планшет и через 24 часа после оплодотворения эмбрионы осторожно переносили в лунки, 8-10 на лунку, и культуральную среду добавляли до общего объема 2 мл, чтобы убедиться, что конечная концентрация DMSO в среде не превышала 1%. После 24-часовой обработки лекарственным средством эмбрионы наблюдали под флуоресцентным микроскопом, подсчитывали общее количество межсегментарных сосудов (ISV) в туловище и хвосте, и рассчитывали относительную скорость генерации ISV в каждой группе введения. Дисперсионный анализ между группами выполняли с использованием программного обеспечения SPSS.

[0026] Результат показывает, что IDHP при концентрациях 0,01, 0,1 и 1,0 мкМ, соответственно, значительно стимулировал рост межсегментарных сосудов и хвостовых продольных кровеносных сосудов у рыбок данио-рерио (Фиг. 4) при значительном увеличении общего количества и длины кровеносных сосудов (Таблица 1). В соответствии с формулой: относительная скорость генерации (%)=(общая длина кровеносных сосудов в группе лечения лекарственным средством - общая длина кровеносных сосудов в контрольной группе PTK787) ÷ общее кровяное давление нормальной контрольной группы ×100, вычисляли относительную скорость генерации, и результат показал дозозависимый эффект от лечения лекарственным средством (Фиг. 5).

Таблица 1
Промотирующий эффект IDHP на рост ISV данио-рерио Название Концентрация Длина кровеносных сосудов (мкм) Количество кровеносных сосудов DMSO 0,1% 785,1 ± 49,5 28,9 ± 3,8 PTK787 0,1 мкг/мл 36,4 ± 14,2 3,6 ± 1,3 VEGF 10 нг/мл 420,0 ± 54,2 29,3 ± 3,3 IDHP 0,01 мкМ 287,4 ± 18,8*** 25,0 ± 8,6*** 0,1 мкМ 359,2 ± 58,2*** 26,1 ± 3,3*** 1,0 мкМ 447,6 ± 19,5*** 34,4 ± 7,0*** Примечание: *** представляет p<0,001 по сравнению с контролем

Пример 3 IDHP ингибирует нормальную агрегацию тромбоцитов человека, индуцированную ADP и коллагеном

[0027] Образцы цельной крови здоровых добровольцев собирали в пробирки с антикоагулянтом и центрифугировали при 800 g в течение 5 минут при комнатной температуре. Светло-желтый супернатант представлял собой обогащенную тромбоцитами плазму (PRP); оставшийся раствор далее центрифугировали при 4000 g в течение 10 минут при комнатной температуре, и полученный супернатант представлял собой обедненную тромбоцитами плазму (PPP).

[0028] PRP доводили до 3×10⁵ тромбоцитов/мкл при помощи PPP, 300 мкл полученной PRP добавляли к 30 мкл PBS или различных концентраций IDHP и инкубировали при 37°C в течение 3 минут в аппарате для коагуляции крови. Для инициирования реакции агрегации тромбоцитов добавляли коллаген или ADP при конечной концентрации 3 мкмоль/л. Ингибирующее действие IDHP и клопидогрела на агрегацию тромбоцитов определяли турбидиметрией. Результат на Фиг. 6 показывает, что клопидогрел значительно ингибировал ADP-индуцированную агрегацию тромбоцитов в измеренном диапазоне концентраций (p < 0,001); по сравнению с группами которым вводили только ADP или только коллагеном (Ctrl), IDHP соответственно и значительно ингибируют ADP- или коллаген-индуцированную агрегацию тромбоцитов, и ингибирующий эффект на коллаген-индуцированную агрегацию тромбоцитов был более значительным(P < 0,001).

Пример 4 Токсикологическое исследование IDHP

4.1 Испытание на острую токсичность у мышей с быстрым введением

[0029] Использовали шестьдесят мышей, половина самцов и половина самок, и их случайным образом разделяли на 6 групп. IDHP формулировали в шести концентрациях с использованием физиологического раствора: 3,145%, 2,68%, 2,4%, 2%, 1,875% и 1,6%. Интервал между концентрациями составлял 1:0,9. После того как животные голодали в течение 12 часов, каждую группу подвергали внутривенному введению, объем составлял 20 мл/кг, и введение завершали в течение 5 секунд для каждого животного. Дозы для шести групп составляли 629 мг/кг, 530 мг/кг, 480 мг/кг, 400 мг/кг, 375 мг/кг, и 320 мг/кг, соответственно. После внутривенного введения у животного отмечали затруднение дыхания, учащенное сердцебиение, подергивания и конвульсии, за которыми следовали замедление движений и лежание на земле. Признаки отравления усиливались с увеличением дозы; мертвые животные в основном умерали в течение 1 минуты после введения, а выжившие животные возвращались к норме через 10 минут. Мертвых мышей подвергали вскрытию, наблюдали невооруженным глазом, не было никаких нарушений в жизненно важных органах, таких как сердце, печень, селезенка, легкие, почки, мозг, желудок или кишечник, LD₅₀ измеряли по методу Блисса, и значение составляло 424 ± 58 мг/кг, 95% доверительный интервал составлял от 370 до 486 мг/кг, как показано в Таблице 2.

Таблица 2
LD₅₀ для IDHP, измеренная по методу Блисса Доза
мг/кг Логарифмичская доза Количество животных Смертность (%) Пробит-анализ Пробит-регрессия Ошибка
(×10^-6) 629 2,798 10 100 6,96 7,24 2,13 530 2,724 10 100 6,96 6,26 2,53 480 2,681 10 50 5,00 5,7 2,77 400 2,602 10 40 4,75 4,66 3,19 375 2,574 10 40 4,75 4,3 3,34 320 2,505 10 0 3,04 3,4 3,72

Базовая смертность: 0%

Индекс значимости: G=0,1760; X50=-0,3722; Sx=0,0158; G относительно мал, значение опускали

Проверка неоднородности: Chi2=6,90; Chi2,05=9,64; Sb=2,7993; Отсутствие неоднородности

Формула уравнения регрессии: Y(пробит)=9,8687+13,0795×log(D); r=0,8716

LD₅₀₌424,4 ± 39,7 (мг/кг)

Коррекция неоднородности Феллера: Sx=0,0229; Sb=3,6778

LD₅₀=424,4 ± 57,9 (мг/кг)

95% доверительный интервал составлял от 370,4 до 486,2 мг/кг.

4.2 Тест на острую токсичность у мышей при медленном введении

[0030] После помещения в лабораторию на 1 день, отбирали испытуемых мышей с определенной массой тела и случайным образом разделяли на группы в соответствии с массой тела и полом, по 10 для каждой группы, половина самцов и половина самок. В соответствии с результатом предварительного измерения, абсолютная летальная доза составила 2,4 г/кг. Введение осуществляли в хвостовую вену, дозу для мышей рассчитывали в соответствии с массой тела. Дозы составляли 2,4 г/кг, 2,2 г/кг, 2,0 г/кг и 1,8 г/кг соответственно, и рассчитывали скорость доставки лекарственного средства. Введение завершали в течение 10 минут. Реакции мышей наблюдали после введения, и смерть мышей регистрировали в течение 14 дней.

[0031] Основными токсическими реакциями после внутривенного введения были центральное торможение, дыхательная недостаточность и т.д. Бóльшая часть смертей происходила во время введения. Никаких аномальных изменений в анатомии обнаружено не было. После 14 дней наблюдения вычисляли уровень смертности мышей. LD₅₀ измеряли по методу Блисса, и значение составляло 2,048 г/кг ± 0,085 г/кг, 95% доверительный интервал составлял от 1,965 до 2,135 г/кг, результат показан в Таблице 3:

Таблица 3
LD₅₀ для IDHP, измеренное по методу Блисса у мышей при введении через хвостовую вену Группа Количество мышей Доза (d) г/кг Количество смертей (n) Смертность (%) 1 11 2,4 10 100 2 10 2,2 8 80 3 10 2,0 3 30 4 10 1,8 1 10

4.3 Анализ гемолиза

[0032] Артериальную кровь домашнего кролика собирали, удаляли фибрин, эритроциты промывали физиологическим раствором и затем смешивали с 2%-ным физиологическим раствором эритроцитов. Тест проводили в соответствии с Таблицей 4, четыре параллельных лабораторных пробирки в каждой группе.

Таблица 4 Группа Контрольная группа Группа IDHP (10^-3 моль/л) 2 4 6 8 10 Раствор IDHP (мл) / 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 Физиологический раствор (мл) 2,5 2,4 2,3 2,2 2,1 2,0 2% раствор эритроцитов (мл) 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5

[0033] После вышеуказанной процедуры пробирки помещали в водяную баню при 37±0,5°С, одну пробирку из каждой группы отбирали через 0,5, 1, 2 и 3 часа соответственно, центрифугировали при 3000 об/мин в течение 15 минут. Наблюдали гемолиз эритроцитов, в это же время морфологию эритроцитов наблюдали под световым микроскопом.

[0034] Результат теста показывает, что эритроциты были интактными, выраженного гемолиза не было, что свидетельствует о том, что IDHP не обладает эффектом гемолиза.

Пример 5: Эндогенное исследование IDHP

[0035] Катализируемый липазой синтез IDHP из изопропанола и Даншенсу.

[0036] Что касается конкретного осуществления, ссылаются, но не ограничиваясь этим, на следующее решение:

[0037] Даншенсу (5,0 мг, 0,025 ммоль), изопропанол (0,3 мг, 0,005 ммоль), воду (1,5 мл) и липазу (5 мг) закрывали, помещали в шейкер (220 об/мин) и инкубировали при 37°C в течение 24 часов. Отбирали 100 мкл реакционного раствора, добавляли 100 мкл этилацетата и встряхивали в течение 20 секунд. Органическую фазу подвергали жидкостной хроматографии и масс-спектрометрии. Масс-спектрометрические данные ([M-1]=239,0965) показаны на Фиг. 7; данные жидкостной хроматографии показаны на Фиг. 8.

[0038] Условия жидкостной хроматографии были следующими: метанол:0,2% водный раствор муравьиной кислоты=3:7; скорость потока: 0,6 мл/мин; хроматографическая колонка: C18 (zorbax), 250 мм, 5 мкм, 4,6 мм (внутренний диаметр); температура колонки: 25°С.

[0039] Вместе с предыдущими исследованиями авторов изобретения, в которых было обнаружено, что Даншенсу является веществом, происходящим из организма человека, также липаза широко присутствует в тканях животных, растений и микроорганизмов (таких как плесень, бактерии), содержащих жиры, а организм человека содержит изопропанол, предполагая, что IDHP является эндогенным веществом человеческого организма.

Пример 6: Эмульсия IDHP

[0040] Формула эмульсии представляла собой следующую: IDHP 10,0 г, витамин E 3,0 г, рафинированная соя 200,0 г, олеиновая кислота 15,0 г, очищенный белок лецитин 25,0 г, вода для инъекций около 900 мл, глицерин 2,0 г.

Пример 7: Капельная пилюля IDHP

[0041] IDHP: 10,4 г, крахмал: 6,3 г, натрий карбоксиметилкрахмал: 1,8 г, полиэтиленгликоль (молекулярная масса 6000): 26,5 г. В процессе получения прописанное количество IDHP и полиэтиленгликоля 6000 нагревали до 80°C для расплавления, а затем добавляли крахмал и натрий карбоксиметилкрахмал, хорошо перемешивали, добавляли по каплям в жидкий парафиновый охладитель (от 1 до 5°С) для получения 1000 пилюль, 45 мг на пилюлю. Следы масла на поверхности удаляли с получением конечного продукта.

[0042] Настоящее изобретение было подробно описано выше, включая его предпочтительные варианты осуществления. Однако следует понимать, что, принимая во внимание то, что раскрыто в настоящем изобретении, специалист в данной области техники может внести изменения и/или улучшения в настоящее изобретение в пределах сущности и объема изобретения, которые также входят в объем настоящего изобретения.

Группа изобретений относится к медицине и фармации. Предложено применение изопропил β-(3,4-дигидроксифенил)-α-гидроксипропионата (IDHP) для ингибирования агрегации тромбоцитов и применение IDHP для стимулирования ангиогенеза. Технический результат состоит в реализации заявленных назначений. Изобретения могут стать основой для применения IDHP в разработке лекарственных средств против агрегации тромбоцитов и для стимуляции ангиогенеза. 2 н.п. ф-лы, 8 ил., 4 табл., 7 пр.

1. Применение β-(3,4-дигидроксифенил)-α-гидроксиизопропилпропионата (IDHP) для ингибирования агрегации тромбоцитов.

2. Применение IDHP для стимулирования ангиогенеза.