Генотерапевтический ДНК-вектор на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущий целевой ген, выбранный из группы генов IL11, LIF, DICER, HOXA10, WT1, для повышения уровня экспрессии этих целевых генов, способ его получения и применения, штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-IL11, или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-LIF, или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-DICER, или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-HOXA10, или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-WT1, несущий генотерапевтический ДНК-вектор, способ его получения, способ производства в промышленных масштабах генотерапевтического ДНК-вектора Российский патент 2020 года по МПК C12N15/00 C12N15/12 C12N1/21 

Область техники

Изобретение относится к генной инженерии и может быть использовано в биотехнологии, медицине и сельском хозяйстве для создания препаратов генной терапии.

Уровень техники

Генная терапия - это современный медицинский подход, направленный на лечение наследственных и приобретенных заболеваний путем введения нового генетического материала в клетки пациента с целью компенсации или подавления функции мутантного гена и/или исправления генетического дефекта. Конечным продуктом экспрессии гена может являться молекула РНК или белка. Однако осуществление большей части физиологических процессов в организме связано с функциональной активностью белковых молекул, тогда как молекулы РНК являются либо промежуточным продуктом в синтезе белков, либо осуществляют регуляторные функции. Таким образом целью генной терапии является, в большинстве случаев, введение в организм генов, обеспечивающих транскрипцию и последующую трансляцию белковых молекул, кодируемых этими генами. В рамках описания настоящего изобретения под экспрессией гена подразумевается продукция белковой молекулы, аминокислотная последовательность которой кодируется этим геном.

Гены IL11, LIF, НОХА10, DICER и WT1, входящие в группу генов, играют ключевую роль в ряде процессов в организме человека и животных. Показана связь низких/недостаточных концентраций этих белков с различными заболеваниями человека, которая, в ряде случаев, подтверждена нарушениями в нормальной экспрессии генов, кодирующих эти белки. Таким образом, геннотерапевтическое повышение экспрессии гена, выбранного из группы генов IL11, LIF, НОХА10, DICER и WT1, обладает потенциалом для коррекции различных состояний человека и животных.

Интерлейкин-11 (IL11) - многофункциональный цитокин, вырабатывается преимущественно клетками стромы (фибробластами) костного мозга и лимфоидных органов, стимулирует пролиферацию ранних стволовых клеток и дифференцированных клеток-предшественников из разных источников, включая кровь и костный мозг. IL11 вызывает выраженную стимуляцию тромбоцитопоэза путем индукции пролиферации, дифференцировки и созревания мегакариоцитов. Действуя на клетки костного мозга и клетки печени эмбрионов, IL11 совместно с другими цитокинами может стимулировать различные стадии эритропоэза.

Также IL11 является провоспалительным интерлейкином, поскольку регулирует функции Т- и В-лимфоцитов, принимает участие в индукции активности ряда киллерных клеток, является аутокринным фактором для пролиферации мегакариоцитов. Подобно IL-1 и IL-6 принимает участие в индукции синтеза белков острой фазы.

Существует положительная корреляция между уровнем IL11 в промывочных водах матки, собранных в период ожидаемой имплантации, и реакцией женщин на стимуляцию яичников при подготовке к ЭКО. Данный факт свидетельствует, что низкий уровень интерлейкина-11 может быть причиной снижения вероятности имплантации эмбриона (Молекулярный биология, 2011, том 45, №1, с. 44-55).

Пониженные концентрации IL11 также наблюдаются в семенной жидкости при мужском бесплодии, при этом концентрация IL11 положительно коррелирует с подвижностью сперматозоидов и их жизнеспособностью (Qian L. Decreased interleukin-11 levels in the semen of infertile males. Cytokine. 2018 Aug; 108:57-59).

При анализе концентраций IL11 у пациентов с язвенным колитом (аутоиммунное заболевание из группы ВЗК) было обнаружено, что тяжелые формы язвенного колита характеризуются пониженной концентрацией IL11 в тканях кишечника (Sabzevary-Ghahfarokhi М et al. // BMC Immunol. 2018 Jun 18; 19(1):17).

По результатам клинического исследования II фазы терапия рекомбинантным белком IL11, получение которого осуществляли в бактериальных штаммах-продуцентах, продемонстрировала эффективность у пациентов с болезнью Виллебранда-Диана и гемофилией А (оба этих заболевания являются наследственными нарушениями свертываемости крови) (Ragni MV et al. // Thromb Haemost. 2013 Feb; 109(2):248-54).

В настоящее время в клинической практике для терапии тромбоцитопении, индуцированной химиотерапией, используется препарат, содержащий рекомбинантный белок IL11 (Oprelvekin), получаемый в бактериальных штаммах-продуцентах. Также проводятся исследования по эффективности этого препарата при тромбоцитопении, индуцированной другими факторами.

Кроме использования рекомбинантного белка IL11, также известна экспериментальная работа, с применением генотерапевтического подхода. Была создана генноинженерная конструкция, состоящая из гена IL11 и гена IL11R, которая обеспечивала экспрессию химерного белка, состоящего из цитокина IL11 и его рецептора. Как способ доставки этой конструкции использовался подход с применением «клеточных вакцин», который подразумевает введение в организм эукариотических клеток, несущих данную генетическую конструкцию. Терапия данной клеточной вакциной, экспрессирующей химерный белок IL11 -IL11R, продемонстрировала терапевтический эффект на экспериментальной мышиной модели рака простаты (Mackiewicz J et al. // Contemp Oncol (Pozn). 2015; 19(3):187-94).

Фактор, ингибирующий лейкемию (LIF) - гликопротеин, выполняющий следующие функции в организме человека: поддержка роста и ингибирование дифференциации нормальных эмбриональных стволовых клеток, стимуляция продукции белков острой фазы гепатоцитами; воздействие на свойство интерлейкина 3 усиливать мегакариоцитарную дифференцировку миелоидных клеток-предшественников и стимулировать костную резорбцию и формирование кости; при развитии нервной системы индукция и усиление синтеза нейропептидов и ацетилхолина в симпатической нервной системе, является нейротрофическим фактором выживания, влияет на гемопоэз, энергетический метаболизм.

LIF - один из ключевых паракринных маркеров имплантации, имеющий важное значение во время аппозиции и адгезии бластоцисты. Концентрация LIF в смывах из полости матки и образцах ткани эндометрия ниже у пациенток с бесплодием неясного генеза, а также у больных с безуспешными попытками ЭКО по сравнению с фертильными женщинами (Dimitriadis Е et al. // Hum. Reprod. 2005; 11 (6): 613-30). При этом у женщин с бесплодием с выраженной экспрессией гена LIF в середине лютеиновой фазы шансы на достижение беременности были в 6,4 раза выше, чем у пациенток со сниженной экспрессией гена LIF (Serafini Р et al. // Int J Gynecol Obstet 2008; 102: 23-7).

Также было показано, что экспериментальное блокирование LIF способно потенциировать инфекцию, вызванную респираторным синтициальным вирусом, что говорит о протективной роли LIF при некоторых инфекционных заболеваниях (Foronjy RF et al. // ВМС Immunol. 2014 Oct 3; 15:41).

Показана роль недостаточной экспрессии LIF в патогенезе ряда аутоиммунных нейродегенеративных заболеваний. Для поиска малых молекул, способных стимулировать продукцию LIF, в целях разработки препаратов для лечения аутоиммунных нейродегенеративных заболеваний, была проведена скрининговая работа, однако из 1,7 млн. веществ только небольшое количество образцов оказалось перспективными для дальнейших исследований, что свидетельствует о том, что подходы к восполнению или компенсации недостатка этого белка ограничены (Vela L et al. // J Biomol Screen. 2016 Jun; 21(5):437-45).

С использованием экспериментальной мышиной модели рассеянного склероза было показано, что генная терапия рекомбинантным лентивирусным вектором, экспрессирующим LIF, может обеспечивать защиту мышей от развития симптомов рассеянного склероза, при этом терапевтический эффект значительно более выражен по сравнению с введением рекомбинантного белка LIF (Slaets Hetal. // MolTher 2010; 18: 684-691). Таким образом, именно генотерапевтический подход может представлять наибольший интерес для дальнейшей разработки в этой области.

Ген DICER кодирует белок рибонуклеазу III типа, которая является необходимым компонентом процессинга малых некодирующих РНК, а также вовлекается в процессинг некоторых вирусных РНК. Малые некодирующие РНК участвуют в регуляции экспрессии ряда генов в ходе таких физиологических процессов как гонадогенез, эмбриогенез, старение, канцерогенез.

Наследственная мутация, приводящая к экспрессии только части белка DICER, лишенного ряда функциональных доменов вызывает одноименный DICER-синдром и характерна для ряда эпителиальных опухолей. Другие типы мутаций могут быть также ассоциированы с опухолями. Так, например, сдвиг рамки считывания гена, ассоциирован со злокачественной опухолью гипофиза - пинеобластомой (Kawahara Y // Congenit Anom (Kyoto). 2014 Feb; 54(1):12-21).

DICER также необходим для нормального процесса гонадогенеза. Отсутствие экспрессии гена DICER у мышей вызывает подавление выработки гонадотропинов и, как следствие, бесплодие. Также показано, что тканеспецифичные дефекты в экспрессии DICER могут приводить к различным фенотипическим проявлениям патологий, так или иначе связанных с нарушением репродуктивной функции. Например, делеция гена DICER в клетках Сертоли приводит к отсутствию иммунологической привилегии мужских гамет в процессе сперматогенеза (Kim Getal. // Int. J. Dev. Biol. 2010; 54, 867-875).

Ген HOXA10 относится к группе гомеобоксных генов. Ген НОХА10 кодирует белок-транскрипционный фактор, который регулирует работу ряда генов в процессе морфогенеза и дифференциации.

Патологии, предположительно связанные с мутацией этого гена и недостаточностью его функции, включают криптохидизм, хордому мозжечка и некоторые другие опухоли. Однако наибольший интерес вызывает связь НОХА10 с репродуктивной функцией, что обусловлено тем, что одним из основных паттернов экспрессии этого гена во взрослом организме являются ткани эндометрия.

Известно, что у женщин с нарушением фертильности наблюдается сниженная экспрессия гена НОХА10 (Taylor HS. // Semin Reprod Med 2000; 18: 81-89).

Показано, что мыши, лишенные экспрессии НОХА10, характеризуются нормальным процессом овуляции, однако имплантации оплодотворенных яйцеклеток при этом не происходит. При этом использование генотерапевтического подхода, заключающегося в введении мышам плазмиды, экспрессирующей ген НОХА10, приводит к значительному увеличению фертильности (Bagot CN, Troy PJ, Taylor HS. // Gene Ther. 2000; 7:1378-84).

Ген WT1 кодирует белок-транскрипционный фактор. Основные органы и ткани, в которых отмечается экспрессия этого гена, включают эндометрий, почки, яичники, семенники, селезенку и плаценту. Активность этого гена необходима для развития мочеполовой системы млекопитающих. Мутантная форма гена WT1 ассоциирована с нефробластомой, мезаталиомой, аниридией и рядом тяжелых синдромов, характеризующихся патологией мочеполовой системы.

Мутация гена WT1, приводящая к снижению функциональной активности белка, обнаруживается у женщин с синдромом преждевременного истощения яичников (Wang Н et al. // Sci Rep. 2015 Sep 11; 5:13983). Также известны мутации этого гена, коррелирующие с азооспермией и олигоспремией у человека (Seabra CM et al. // J Urol. 2015 May; 193(5):1709-15).

У мышей, гетерозиготных по мутации гена WT1, наблюдается субфертильность. В in vitro экспериментах с использованием клеток яичников, полученных от этих мышей, трансфекция вектором, экспрессирующим ген WT1, приводила к нормализации активности зависимого гена Prss29. Однако дальнейших экспериментов in vivo с данным вектором в качестве генной терапии для повышения фертильности не проводилось (Nathan A et al. // Human Molecular Genetics. 2017; 26(9):1694-1705).

Таким образом предшествующий уровень техники свидетельствует о том, что мутации в генах IL11, LIF, DICER, НОХА10, WT1, или недостаточная экспрессия белков, кодируемых этими генами, связаны с развитием спектра заболеваний, включающих в себя, но не ограничивающихся, бесплодием, аутоиммунными заболеваниями, наследственными и приобретенными патологическими состояниями крови, онкологическими, инфекционными заболеваниями и другими состояниями. Этим обусловлено объединение генов IL11, LIF, DICER, НОХА10, WT1 в рамках данного патента в группу генов. Генетические конструкции, обеспечивающие экспрессию белков, кодируемых генами IL11, LIF, DICER, НОХА10, WT1, входящими в группу генов, в составе того или иного вектора для генной терапии, могут быть использованы для разработки лекарственных препаратов для терапии различных заболеваний, включающих в себя, но не ограничивающихся, бесплодием, аутоиммунными заболеваниями, наследственными и приобретенными патологическими состояниями крови, онкологическими, инфекционными заболеваниями и другими состояниями.

Более того, приведенные данные свидетельствуют о том, что недостаточная экспрессия белков, кодируемых генами IL11, LIF, DICER, НОХА10, WT1, входящими в группу генов, связана не только с патологическими состояниями, но и с предрасположенность к их развитию. Также приведенные данные свидетельствуют о том, что недостаточная экспрессия данных белков может не проявляться в явном виде в форме патологии, которая может быть однозначно описана в рамках существующих стандартов клинической практики (например, с применением кода МКБ), однако при этом вызывать состояния, которые неблагоприятны для человека и животных и связанны с ухудшением качества жизни.

Анализ подходов для повышения экспрессии целевых генов подразумевает возможность использования различных генотерапевтических векторов.

Генотерапевтические векторы разделяют на вирусные, клеточные и ДНК-векторы (Guideline on the quality, non-clinical and clinical aspects of gene therapy medicinal Products EMA/CAT/80183/2014). В последнее время в генной терапии все большее внимание уделяется разработке невирусных систем доставки генетического материала, среди которых лидируют плазмидные векторы. Плазмидные векторы лишены недостатков, присущих клеточным и вирусным векторам. В клетке-мишени они существуют в эписомальной форме, не интегрируют в геном, производство их достаточно дешево, отсутствие иммунного ответа и побочных реакций на введение плазмидного вектора делают их удобным инструментом генной терапии и генетической профилактики (ДНК-вакцины) (Li L, Petrovsky N. // Expert Rev Vaccines. 2016; 15(3):313-29).

Тем не менее, ограничениями для использования плазмидных векторов для генной терапии являются: 1) наличие генов устойчивости к антибиотикам для наработки в бактериальных штаммах, 2) наличие различных регуляторных элементов, представленных последовательностями вирусных геномов 3) размер терапевтического плазмидного вектора, определяющий эффективность проникновения вектора в клетку-мишень.

Известно, что Европейское агентство по лекарственным средствам считает необходимым избегать введения маркеров антибиотикорезистентности в разрабатываемые плазмидные векторы для генной терапии (Reflection paper on design modifications of gene therapy medicinal products during development / 14 December 2011 EMA/CAT/GTWP/44236/2009 Committee for advanced therapies). Данная рекомендация связана, в первую очередь, с потенциальной опасностью проникновения ДНК-вектора или горизонтального переноса генов антибиотикорезистентности в клетки бактерий, представленных в организме в составе нормальной или оппортунистической микрофлоры. Помимо этого, наличие генов антибиотикорезистентности значительно увеличивает размер ДНК-вектора, что приводит к снижению эффективности его проникновения в эукариотические клетки.

Необходимо отметить, что гены антибиотикорезистентности также вносят принципиальный вклад в способ получения ДНК-векторов. В случае наличия генов антибиотикорезистентности штаммы для наработки ДНК-векторов обычно культивируются в среде, содержащей селективный антибиотик, что создает риск наличия следовых количеств антибиотика в недостаточно очищенных препаратах ДНК-векторов. Таким образом, получение ДНК-векторов для генной терапии, в которых отсутствуют гены антибиотикорезистентности, связано с получением штаммов, обладающих такой отличительной особенностью как способность к стабильной амплификации целевых ДНК-векторов в среде без содержания антибиотиков.

Кроме того, Европейское Медицинское Агентство рекомендует избегать наличия в составе терапевтических плазмидных векторов регуляторных элементов для повышения экспрессии целевых генов (промоторов, энхансеров, посттрансляционных регуляторных элементов), являющихся нуклеотидными последовательностями геномов различных вирусов (Draft Guideline on the quality, nonclinical and clinical aspects of gene therapy medicinal products, http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/Scientific_guideline/2015/05/WC500187020.pdf). Данные последовательности, хотя и могут увеличивать уровень экспрессии целевого трансгена, однако создают риск рекомбинации с генетическим материалом вирусов дикого типа и интеграции в геном эукариотической клетки. Более того, целесообразность гиперэкспрессии того или иного гена в целях терапии остается нерешенным вопросом.

Также, существенным моментом является размер терапевтического вектора. Известно, что современные плазмидные векторы зачастую перегружены нефункциональными участками, серьезно увеличивающими размер вектора (Mairhofer J, Grabherr R. // Mol Biotechnol. 2008. 39(2):97-104). Например, ген устойчивости к ампициллину в векторах серии pBR322, как правило, состоит из не менее чем 1000 п.н., что составляет более 20% от размера самого вектора. При этом наблюдается обратная зависимость между размером вектора и его способностью проникать в эукариотические клетки - ДНК-векторы с небольшим размером эффективней проникаю в клетки человека и животных. Так, например, в серии экспериментов по трансфекции клеток HELA ДНК-векторами с размером от 383 до 4548 п.н. было показано, что разница в эффективности проникновения может достигать двух порядков (отличаться в 100 раз) (Hornstein BD et al. // PLoS ONE. 2016; 11(12):e0167537).

Таким образом при выборе ДНК-вектора в целях безопасности и наибольшей эффективности следует отдавать предпочтение тем конструкциям, в которых не содержатся гены устойчивости к антибиотикам, последовательности вирусного происхождения и размер которых позволяет эффективно проникать в эукариотические клетки. Штамм для получения такого ДНК-вектора в количествах, достаточных для целей генной терапии, должен обеспечивать возможность стабильной амплификации ДНК-вектора с использованием питательных сред, не содержащих антибиотики.

Примером использования рекомбинантных ДНК-векторов для генной терапии является способ получения рекомбинантного вектора для генетической иммунизации по патенту US 9550998 В2. Плазмидный вектор представляет собой суперскученный плазмидный ДНК-вектор и предназначен для экспрессии клонированных генов в клетках животных и человека. Вектор состоит из ориджина репликации, регуляторных элементов, включающих промотор и энхансер цитомегаловируса человека, регуляторные элементы из Т-лимфотропного вируса человека.

Накопление вектора проводят в специальном штамме E. coli без использования антибиотиков за счет антисенс-комплементации гена sacB, введенного в штамм посредством бактериофага. Недостатком данного изобретения является наличие в составе ДНК-вектора регуляторных элементов, представляющих собой последовательности вирусных геномов.

Прототипами настоящего изобретения в части использования генов IL11, LIF, DICER, НОХА10, WT1 для повышения уровня экспрессии этих целевых генов методом генной терапии являются следующие примеры.

Известна заявка WO 1996018372 А2, в которой говорится о применении белка интерлейкина 11 и полинуклеотидов, кодирующих этот белок в терапии инсультов и нейропатии, а также для выявления соединений-агонистов (лигандов), полезных при терапии. В частности, в заявке говорится о полинуклеотиде, который кодирует белок интерлейкина-11, для изготовления лекарственного средства для лечения инсульта или невропатии, а также - для генной терапии. Такая генная терапия включает введение полинуклеотидной последовательности гена IL11 в соматические клетки методами генной инженерии для замены дефектного гена IL11, или для повышения производства белка интерлейкина-11 при таком заболевании, как инсульт. Недостатком данного изобретения являются неопределенные требования к безопасности и технологичности используемого вектора.

Известна заявка WO 2001094605 A3, в которой раскрыты способы применения полинуклеотидов, кодирующих цитокин или рецептор цитокина, при получении трансформированных клеток-хозяев и трансгенных животных. В частности, описано использование векторных композиций на основе рекомбинантного аденоассоциированного вируса, содержащих полинуклеотидные последовательности, которые экспрессируют один или несколько цитокинов млекопитающих или полипептиды рецептора цитокина в клетке млекопитающего или человека. Заявленный вектор может содержать участок нуклеиновой кислоты, который кодирует цитокин, выбранный из группы, состоящей из интерлейкина, лептина, фактора, ингибирующего лейкемию (LIF), и нейротрофического фактора. Также раскрыты способы лечения и облегчения симптомов различных состояний и расстройств, которые связаны с дефицитом цитокина или полипептида рецептора цитокина у млекопитающего или человека. Недостатком данного изобретения являются неопределенные требования к безопасности и технологичности используемого вектора.

Известен патент US 007732417 В2, в котором раскрыт способ ингибирования экспрессии целевого гена с использованием РНК интерференции, при этом вектор, экспрессирующий белок DICER, может дополнительно потенциировать ингибирование экспрессии целевого гена. Последовательность короткой некодирующей РНК вводится в эукариотические клетки и при физиологических условиях комплементарно взаимодействует с нуклеотидной последовательностью целевого гена, тем самым подавляя его экспрессию в клетках эукариот или в организме в целом. При этом одним из способов реализации данного метода является использование рекомбинантного вектора, содержащего и обеспечивающего экспрессию гена DICER в клетках млекопитающих, в которые вводятся короткие некодирующие РНК для обеспечения их корректного процессинга. Недостатком данного изобретения является использование вектора, экспрессирующего ген DICER в качестве способа повышения эффективности действия коротких некодирующих РНК, ингибирующих целевые гены. При этом использование вектора, экспрессирующего ген DICER, не является самостоятельным генотерапевтическим подходом. Также недостатком данного изобретения являются неопределенные требования к безопасности и технологичности используемого вектора.

Известен патент CN 104531763 А, в котором раскрыт метод получения трансгенных свиней путем гиперэкспрессии гена НОХА10. Вектор рс31-Н0ХА10, экспрессирующий ген Н0ХА10, используют для получения клеток со стабильной гиперэкспрессией НОХА10, затем ядра этих клеток трансплантируют в ооциты свиней и используют полученные ооциты для имплантации животным. Недостатком данного изобретения является опосредованный способ доставки генетического материала в организм животных, требующий проведения трансплантации ядер клеток, а также имплантации ооцитов. Другим недостатком данного изобретения является ограниченность применения получением трансгенных свиней, а также направленность на гиперэкспрессию гена, а не компенсацию недостаточности его функции.

Известна заявка US 20150328298 А1, в которой раскрыт способ генетической иммунизации путем введения в организм плазмидного или вирусного вектора, экспрессирующего белок WT1. Данное изобретение направлено на экспрессию в организме белка WT1, который вызывает формирование иммунного ответа, при этом адаптивный иммунный ответ направлен не только на белок, экспрессируемый генотерапевтическим вектором, но и на эндогенный белок WT1, экспрессия которого повышена в ряде опухолей. Таким образом методом генетической иммунизации с использованием генотерапевтического вектора, экспрессирующего белок WT1, формируется противоопухолевый иммунитет. Недостатком данного изобретения является ограниченность применения изобретения как способа терапии определенного типа опухолей, также недостатком данного изобретения являются неопределенные требования к безопасности и технологичности используемого вектора. Также недостатком данного изобретения является его направленность на создание нефизиологических концентраций белка WT1 для активации иммунной реакции организма, а не на нормализацию количества и функции данного белка.

Раскрытие изобретения

Задачей изобретения является конструирование генотерапевтических ДНК-векторов для повышения уровня экспрессии группы генов IL11, LIF, DICER, НОХА10, WT1 в организме человека и животных, сочетающих в себе следующие свойства:

I) Эффективность генотерапевтического ДНК-вектора для повышения уровня экспрессии целевых генов в эукариотических клетках.

II) Возможность безопасного применения для генетической терапии человека и животных за счет отсутствия в составе генотерапевтического ДНК-вектора регуляторных элементов, представляющих собой нуклеотидные последовательности вирусных геномов.

III) Возможность безопасного применения для генетической терапии человека и животных за счет отсутствия в составе генотерапевтического ДНК-вектора генов антибиотикорезистентности.

IV) Технологичность получения и возможность наработки генотерапевтического ДНК-вектора в промышленных масштабах.

Пункты II и III предусмотрены в данном техническом решении в соответствии с рекомендациями государственных регуляторов к лекарственным средствам для генной терапии, в частности, Европейского Агентства по лекарственным средствам касательно отказа от введения маркеров антибиотикорезистентности в разрабатываемые плазмидные векторы для генной терапии (Reflection paper on design modifications of gene therapy medicinal products during development / 14 December 2011, EMA/CAT/GTWP/44236/2009 Committee for advanced therapies) и касательно отказа от введения в разрабатываемые плазмидные векторы для генной терапии элементов вирусных геномов (Guideline on the quality, non-clinical and clinical aspects of gene therapy medicinal products / 23 March 2015, EMA/CAT/80183/2014, Committee for Advanced Therapies).

Задачей изобретения также является конструирование штаммов, несущих эти генотерапевтические ДНК-вектора, для наработки и производства в промышленных масштабах генотерапевтических ДНК-векторов.

Поставленая задача решается за счет того, что создан генотерапевтический ДНК-вектор на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущий целевой ген, выбранный из группы генов IL11, LIF, DICER, НОХА10, WT1, для повышения уровня экспрессии этого целевого гена в организме человека и животных, при этом генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-IL11, или VTvaf17-LIF, или VTvaf17-DICER, или VTvaf17-НОХА10, или VTvaf17-WT1 имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID №1 или SEQ ID №2 или SEQ ID №3 или SEQ ID №4 или SEQ ID №5, соответственно. При этом каждый из созданных генотерапевтических ДНК-векторов: VTvaf17-IL11, или VTvaf17-LIF, или VTvaf17-DICER, или VTvaf17-НОХА10, или VTvaf17-WT1 за счет ограниченного размера векторной части VTvaf17, не превышающей 3200 п.н., обладает способностью эффективно проникать в клетки и экспрессировать клонированный в него целевой ген, выбранный из группы генов IL11, LIF, DICER, НОХА10, WT1 соответственно. В составе генотерапевтического ДНК-вектора отсутствуют нуклеотидные последовательности вирусного происхождения и отсутствуют гены антибиотикорезистентности, обеспечивая возможность его безопасного применения для генетической терапии человека и животных.

Создан также способ получения генотерапевтического ДНК-вектора на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущего целевой ген, выбранный из группы генов: ген IL11, ген LIF, ген DICER, ген НОХА10, ген WT1, который заключается в том, что каждый из генотерапевтических ДНК-векторов: VTvaf17-IL11, или VTvaf17-LIF, или VTvaf17-DICER, или VTvaf17-НОХА10, или VTvaf17-WT1 получают следующим образом: кодирующую часть целевого гена из группы IL11, или LIF, или DICER, или НОХА10, или WT1 клонируют в ДНК-вектор VTvaf17 и получают генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-IL11, SEQ ID №1, или VTvaf17-LIF, SEQ ID №2, или VTvaf17-DICER, SEQ ID №3, или VTvaf17-HOXA10, SEQ ID №4, или VTvaf17-WT1, SEQ ID №5 соответственно.

Способ применения созданного генотерапевтического ДНК-вектора на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущего целевой ген, выбранный из группы генов: ген IL11, ген LIF, ген DICER, ген НОХА10, ген WT1, для повышения уровня экспрессии этих целевых генов, заключается во введении выбранного генотерапевтического ДНК-вектора или нескольких выбранных генотерапевтических ДНК-векторов в клетки, органы и ткани человека или животного, и/или во введении в органы и ткани человека или животного аутологичных клеток человека или животного, трансфицированных выбранным генотерапевтическим ДНК-вектором или несколькими выбранными генотерапевтическими ДНК-векторами, или в сочетании обозначенных способов.

Способ получения штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-IL11, или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-LIF, или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-DICER, или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-HOXA10, или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-WT1 заключается в электропорации компетентных клеток штамма Escherichia coli SCS110-AF созданным генотерапевтическим ДНК-вектором и последующей селекцией стабильных клонов штамма с использованием селективной среды.

Заявлен штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-IL11, или штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-LIF, или штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-DICER, или штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-HOXA10, или штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-WT1, несущий генотерапевтический ДНК-вектор для его наработки с возможностью культивирования штамма без использования антибиотиков.

Способ производства в промышленных масштабах генотерапевтического ДНК-вектора заключается в масштабировании бактериальной культуры штамма до количеств, необходимых для наращивания бактериальной биомассы в промышленном ферментере, после чего биомассу используют для выделения фракции, содержащей целевой ДНК-продукт - генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-IL11 или VTvaf17-LIF или VTvaf17-DICER или VTvaf17-HOXA10 или VTvaf17-WT1 многостадийно фильтруют и очищают хроматографическими методами.

Краткое описание чертежей

На фиг. 1

приведена схема генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущего целевой ген, выбранный из группы генов IL11, LIF, DICER, НОХА10, WT1, который представляет собой кольцевую двуцепочечную молекулу ДНК, способную к автономной репликации в клетках бактерии Escherichia coli.

На фиг. 1 приведены схемы, соответствующие:

1А - генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-IL11,

1В - генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-LIF,

1С - генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-DICER,

1D - генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-НОХА10,

1Е - генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-WT1.

На схемах отмечены следующие структурные элементы вектора:

EF1a - промоторная область гена человеческого фактора элонгации EF1A с собственным энхансером, содержащимся в первом интроне гена. Служит для обеспечения высокого уровня транскрипции рекомбинантного гена в большинстве тканей человека;

Рамка считывания целевого гена, соответствующая кодирующей части гена IL11 (фиг. 1А), или LIF (фиг. 1В), или DICER (фиг. 1С), или НОХА10 (фиг. 1D), или WT1 (фиг. 1Е) соответственно;

hGH-TA - терминатор транскрипции и сайт полиаденилирования гена фактора роста человека;

ori - ориджин репликации, служащий для автономной репликации с однонуклеотидной заменой для повышения копийности плазмиды в клетках большинства штаммов Escherichia coli;

RNA-out - регуляторный элемент PHK-out транспозона Tn 10, обеспечивающий возможность положительной селекции без использования антибиотиков при использовании штамма EshcerichiacoliSCS 110.

Отмечены уникальные сайты рестрикции.

На фиг. 2

показаны графики накопления ампликонов кДНК целевого гена, а именно, гена IL11, в первичной культуре клеток эндометрия матки человека до их трансфекции и через 48 часов после трансфекции этих клеток генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-IL11c целью оценки способности проникать в эукариотические клетки и функциональной активности, то есть экспрессии целевого гена на уровне мРНК.

На фиг. 2 отмечены кривые накопления ампликонов в ходе реакции, соответствующие:

1 - кДНК гена IL11в первичной культуре клеток эндометрия матки человека до трансфекции ДНК-вектором VTvaf17-IL11;

2 - кДНК гена IL11в первичной культуре клеток эндометрия матки человека после трансфекции ДНК-вектором VTvaf17-IL11;

3 - кДНК гена В2М в первичной культуре клеток эндометрия матки человека до трансфекции ДНК-вектором VTvaf17-IL11;

4 - кДНК гена В2М в первичной культуре клеток эндометрия матки человека после трансфекции ДНК-вектором VTvaf17-IL11.

В качестве референтного гена использовали ген В2М (Бета-2-микроглобулин) приведенный в базе данных GenBank под номером NM 004048.2.

На фиг. 3

показаны графики накопления ампликонов кДНК целевого гена, а именно гена LIF, в первичной культуре гладкомышечных клеток мочевого пузыря человека HBdSMC (АТСС Кат. PCS-420-012) до их трансфекции и через 48 часов после трансфекции этих клеток ДНК-вектором VTvaf17-LIF с целью оценки способности проникать в эукариотические клетки и функциональной активности, то есть экспрессиицелевого гена на уровне мРНК.

На фиг. 3 отмечены кривые накопления ампликонов в ходе реакции, соответствующие:

1 - кДНК гена LIFв первичной культуре гладкомышечных клеток мочевого пузыря человека HBdSMC до трансфекции ДНК-вектором VTvaf17-LIF;

2 - кДНК гена LIFв первичной культуре гладкомышечных клеток мочевого пузыря человека HBdSMC после трансфекции ДНК-вектором VTvaf17-LIF;

3 - кДНК гена В2М в первичной культуре гладкомышечных клеток мочевого пузыря человека HBdSMC до трансфекции ДНК-вектором VTvaf17-LIF;

4 - кДНК гена В2М в первичной культуре гладкомышечных клеток мочевого пузыря человека HBdSMC после трансфекции ДНК-вектором VTvaf17-LIF.

В качестве референтного гена использовали ген В2М (Бета-2-микроглобулин) приведенный в базе данных GenBank под номером NM 004048.2.

На фиг. 4

показаны графики накопления ампликонов кДНК целевого гена, а именно гена DICER в первичной культуре клеток эпителия молочной железы человека НМЕС (АТСС Кат. PCS-600-01) до их трансфекции и через 48 часов после трансфекции этих клеток ДНК-вектором VTvaf17-DICER с целью оценки способности проникать в эукариотические клетки и функциональной активности, то есть экспрессиицелевого гена на уровне мРНК.

На фиг. 4 отмечены кривые накопления ампликонов в ходе реакции, соответствующие:

1 - кДНК гена DICERв первичной культуре клеток эпителия молочной железы человека НМЕС до трансфекции ДНК-вектором VTvaf17-DICER;

2 - кДНК гена DICERb первичной культуре клеток эпителия молочной железы человека НМЕС после трансфекции ДНК-вектором VTvaf17-DICER;

3 - кДНК гена В2М в первичной культуре клеток эпителия молочной железы человека НМЕС до трансфекции ДНК-вектором VTvaf17-DICER;

4 - кДНК гена В2М в первичной культуре клеток эпителия молочной железы человека НМЕС после трансфекции ДНК-вектором VTvaf17-DICER.

В качестве референтного гена использовали ген В2М (Бета-2-микроглобулин) приведенный в базе данных GenBank под номером NM 004048.2.

На фиг. 5

показаны графики накопления ампликонов кДНК целевого гена, а именно гена НОХА10, в иммортализированных фибробластах человека Т HESCs (АТСС Кат. CRL-4003) до их трансфекции и через 48 часов после трансфекции этих клеток ДНК-вектором VTvaf17-НОХА10 с целью оценки способности проникать в эукариотические клетки и функциональной активности, то есть экспрессиицелевого гена на уровне мРНК.

На фиг. 5 отмечены кривые накопления ампликонов в ходе реакции, соответствующие:

1 - кДНК гена НОХА10в иммортализированных фибробластах человека Т HESCs до трансфекции ДНК-вектором VTvaf17-НОХА10;

2 - кДНК гена НОХА10в иммортализированных фибробластах человека Т HESCs после трансфекции ДНК-вектором VTvaf17-НОХА10;

3 - кДНК гена В2М в иммортализированных фибробластах человека Т HESCs до трансфекции ДНК-вектором VTvaf17-НОХА10;

4 - кДНК гена В2М в иммортализированных фибробластах человека Т HESCs после трансфекции ДНК-вектором VTvaf17-НОХА10.

В качестве референтного гена использовали ген В2М (Бета-2-микроглобулин) приведенный в базе данных GenBank под номером NM 004048.2.

На фиг. 6

показаны графики накопления ампликонов кДНК целевого гена, а именно гена WT1 в первичной культуре клеток вагинального эпителия человека(АТСС Кат. PCS-480-010) до их трансфекции и через 48 часов после трансфекции этих клеток ДНК-вектором VTvaf17-WT1 с целью оценки способности проникать в эукариотические клетки и функциональной активности, то есть экспрессии целевого гена на уровне мРНК.

На фиг. 6 отмечены кривые накопления ампликонов в ходе реакции, соответствующие:

1 - кДНК гена WT1в первичной культуре клеток вагинального эпителия человека до трансфекции ДНК-вектором VTvaf17-WT1;

2 - кДНК гена WT1в первичной культуре клеток вагинального эпителия человека после трансфекции ДНК-вектором VTvaf17-WT1;

3 - кДНК гена В2М в первичной культуре клеток вагинального эпителия человека до трансфекции ДНК-вектором VTvaf17-WT1;

4 - кДНК гена В2М в первичной культуре клеток вагинального эпителия человека после трансфекции ДНК-вектором VTvaf17-WT1.

В качестве референтного гена использовали ген В2М (Бета-2-микроглобулин) приведенный в базе данных GenBank под номером NM_004048.2.

На фиг. 7

показана диаграмма концентрации белка интерлейкин 11 в лизате клеток аденокарциномы матки человека НЕС-1-А (АТСС Кат. НТВ-112)после трансфекции этих клеток ДНК-вектором VTvaf17-IL11с целью оценки функциональной активности, то есть экспрессии на уровне белка, по изменению количества белка IL11 влизате клеток.

На фиг. 7 отмечены следующие элементы:

культура А - культура клеток аденокарциномы матки человека НЕС-1-А, трансфицированная водным раствором дендримеров без плазмидной ДНК (контроль);

культура В - культура клеток аденокарциномы матки человека НЕС-1-А, трансфицированных ДНК-вектором VTvaf17;

культура С - культура клеток аденокарциномы матки человека НЕС-1-А, трансфицированных ДНК-вектором VTvaf17-IL11.

На фиг. 8

показана диаграмма концентрации белка LIF в лизате первичной культуры эндометрия матки человека, после трансфекции этих клеток ДНК-вектором VTvaf17-LIF с целью оценки функциональной активности, то есть экспрессии целевого гена на уровне белка, и возможности повышения уровня экспрессии белка с помощью генотерапевтического ДНК-вектора на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущего целевой ген LIF.

На фиг. 8 отмечены следующие элементы:

культура А - первичная культура клеток эндометрия матки человека, трансфицированная водным раствором дендримеров без плазмидной ДНК (контроль);

культура В - первичная культура клеток эндометрия матки человека, трансфицированная ДНК-вектором VTvaf17;

культура С - первичная культура клеток эндометрия матки человека, трансфицированных ДНК-вектором VTvaf17-LIF.

На фиг. 9

показана диаграмма концентрации белка DICERb лизатепервичной культуры клеток эпителия молочной железы человека НМЕС (АТСС Кат. PCS-600-01) после трансфекции этих клеток ДНК-вектором VTvaf17-DICER с целью оценки функциональной активности, то есть экспрессии целевого гена на уровне белка, и возможности повышения уровня экспрессии белка с помощью генотерапевтического ДНК-вектора на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущего целевой ген DICER.

На фиг. 9 отмечены следующие элементы:

культура А - культура клеток эпителия молочной железы человека НМЕС, трансфицированных водным раствором дендримеров без плазмидной ДНК (контроль);

культура В - культура клеток эпителия молочной железы человека НМЕС, трансфицированных ДНК-вектором VTvaf17;

культура С - культура клеток эпителия молочной железы человека НМЕС, трансфицированных ДНК-вектором VTvaf17-DICER.

На фиг. 10

показана диаграмма концентрации белка НОХА10в клеточном лизате иммортализированных фибробластов человека Т HESCs (АТСС Кат. CRL-4003) после трансфекции этих клеток ДНК-вектором VTvaf17-НОХА10 с целью оценки функциональной активности, то есть экспрессии целевого гена на уровне белка, и возможности повышения уровня экспрессии белка с помощью генотерапевтического ДНК-вектора на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущего целевой ген НОХА10.

На фиг. 10 отмечены следующие элементы:

культура А - культура иммортализированных фибробластов человека Т HESCs, трансфицированных водным раствором дендримеров без плазмидной ДНК (контроль);

культура В - культура иммортализированных фибробластов человека Т HESCs, трансфицированных ДНК-вектором VTvaf17;

культура С - культура иммортализированных фибробластов человека Т HESCs, трансфицированных ДНК-вектором VTvaf17-НОХА10.

На фиг. 11

показана диаграмма концентрации белка WT1в клеточном лизате первичной культуры клеток вагинального эпителия человека Primary Vaginal Epithelial Cells (АТСС Кат. PCS-480-010) после трансфекции этих клеток ДНК-вектором VTvaf17-WT1 с целью оценки функциональной активности, то есть экспрессии целевого гена на уровне белка, и возможности повышения уровня экспрессии белка с помощью генотерапевтического ДНК-вектора на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущего целевой ген WT1.

На фиг. 11 отмечены следующие элементы:

культура А - культура клеток вагинального эпителия человека, трансфицированных водным раствором дендримеров без плазмидной ДНК (контроль);

культура В - культура клеток вагинального эпителия человека, трансфицированных ДНК-вектором VTvaf17;

культура С - культура клеток вагинального эпителия человека, трансфицированных ДНК-вектором VTvaf17-WT1.

На фиг. 12

показана диаграмма концентрации белка IL11 в биоптатах кожи трех пациентов после введения в кожу этих пациентов генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-IL11 с целью оценки функциональной активности, то есть экспрессии целевого гена на уровне белка, и возможности повышения уровня экспрессии белка с помощью генотерапевтического ДНК-вектора на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущего целевой ген IL11.

На фиг. 12 отмечены следующие элементы:

П1I - биоптат кожи пациента П1 в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора VTvaf17-IL11;

П1II - биоптат кожи пациента П1 в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора VTvaf17 (плацебо);

П1III - биоптат кожи пациента П1 из интактного участка;

П2I - биоптат кожи пациента П2 в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора VTvaf17-IL11;

П2II - биоптат кожи пациента П2 в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора VTvaf17 (плацебо);

П2III - биоптат кожи пациента П2 из интактного участка;

П3I - биоптат кожи пациента П3 в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора VTvaf17-IL11;

П3II - биоптат кожи пациента П3 в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора VTvaf17 (плацебо);

П3III - биоптат кожи пациента П3 из интактного участка.

На фиг 13

показана диаграмма концентрации белка LIF в биоптатах икроножной мышцы трех пациентов после введения в икроножную мышцу этих пациентов генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-LIF, с целью оценки функциональной активности, то есть экспрессии целевого гена на уровне белка, и возможности повышения уровня экспрессии белка с помощью генотерапевтического ДНК-вектора на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущего целевой ген LIF.

На фиг. 13 отмечены следующие элементы:

П1I - биоптат икроножной мышцы пациента П1 в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора VTvaf17-LIF;

П1II - биоптат икроножной мышцы пациента П1 в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора VTvaf17 (плацебо);

П1III - биоптат интактного участка икроножной мышцы пациента П1;

П2I - биоптат икроножной мышцы пациента П2 в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора VTvaf17-LIF;

П2II - биоптат икроножной мышцы пациента П2 в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора VTvaf17 (плацебо);

П2III - биоптат интактного участка икроножной мышцы пациента П2;

П3I - биоптат икроножной мышцы пациента П3 в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора VTvaf17-LIF;

П3II - биоптат икроножной мышцы пациента П3 в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора VTvaf17 (плацебо);

П3III - биоптат интактного участка икроножной мышцы пациента П3.

На фиг. 14

показана диаграмма концентраций белков:белка IL11 человека, белка LIF человека, белка DICER человека в биоптатах матки крысы при интрацервикальном введении в матку крысы смеси генотерапевтических векторов: генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-IL11, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-LIF, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-DICERc целью демонстрации способа применения путем интрацервикального введениясмеси генотерапевтических ДНК-векторов.

На фиг. 14 отмечены следующие элементы:

KI - биоптат маток крыс группы животных, которым вводилась смесь генотерапевтических векторов: генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-IL11, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-LIF, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-DICER, (группа I);

KI - биоптат маток крыс группы животных, которым вводился генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17 (плацебо) (группа II);

KIII - биоптат маток крыс группы животных не подвергавшимся каким-либо манипуляциям (группа III).

Фиг. 15

показана диаграмма концентрации белка IL11 в биоптатах кожи человека после введения в кожу культуры аутологичных фибробластов, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-IL11с целью демонстрации способа применения путем введения аутологичных клеток, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-IL11.

На фиг. 15 отмечены следующие элементы:

П1С - биоптат кожи пациента П1 в зоне введения культуры аутологичных фибробластов пациента, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-IL11;

П1В - биоптат кожи пациента П1 в зоне введения аутологичных фибробластов пациента, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17;

П1А - биоптат кожи пациента П1 из интактного участка.

На фиг. 16

показаны графики накопления ампликонов кДНК целевого гена НОХА10 в клетках эндометрия матки коровы BEND (ATCC Кат. CRL-2398) до и через 48 часов после трансфекции этих клеток ДНК-вектором VTvaf17-HOXA10 с целью демонстрации способа применения путем введения генотерапевтического ДНК-вектора животным.

На фиг. 16 отмечены кривые накопления ампликонов в ходе реакции, соответствующие:

1 - кДНК гена НОХА10в клетках эндометрия матки коровы BEND до трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-НОХА10;

2 - кДНК гена НОХА10в клетках эндометрия матки коровы BEND после трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-HOXA10;

3 - кДНК гена АСТв клетках эндометрия матки коровы BEND до трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-НОХА10;

4 - кДНК гена АСТв клетках эндометрия матки коровы BEND после трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-НОХА10.

В качестве референтного гена использовали ген актина быка/коровы (ACT), приведенного в базе данных GenBank под номером АН001130.2.

Реализация изобретения

На основе ДНК-вектора VTvaf17 размером 3165 п.н. созданы генотерапевтические ДНК-векторы, несущие целевые гены человека, предназначенные для повышения уровня экспрессии этих целевых генов в тканях человека и животных. При этом способ получения каждого генотерапевтического ДНК-вектора, несущего целевые гены заключается в том, что в полилинкер генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17 клонируют белок-кодирующую последовательность целевого гена, выбранного из группы генов: ген IL11 (кодирует белок интерлейкин 11), ген LIF (кодирует белок лейкозингибирующий фактор), ген DICER (кодирует белок рибонуклеаза III типа), ген НОХА10 (кодирует белок гомеобокс НОХА10), ген WT1 (кодирует белок опухоли Вильямса 1) человека. Известно, что способность ДНК-векторов проникать в эукариотические клетки обусловлена, главным образом, размером вектора. При этом ДНК-вектора с наименьшим размером обладат более высокой проникающей способностью. Таким образом, предпочтительным является отсутствие в составе вектора элементов, которые не несут функциональной нагрузки, но при этом увеличивают размер ДНК вектора. Данные особенности ДНК-векторов были учтены при получении генотерапевтического ДНК-вектора на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущего целевой ген, выбранный из группы генов IL11, LIF, DICER, НОХА10, WT1, путем отсутствия в составе вектора крупных нефункциональных последовательностей и генов антибиотикорезистентности, что позволило, помимо технологических преимуществ и преимуществ в плане безопасности применения, значительно уменьшить размер полученного генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущего целевой ген, выбранный из группы генов IL11, LIF, DICER, НОХА10, WT1. Таким образом, способность проникать в эукариотические клетки полученного генотерапевтического ДНК-вектора обусловлена его небольшими размерами.

Каждый из генотерапевтических ДНК-векторов: ДНК-вектор VTvaf17-IL11, или VTvaf17-LIF, или VTvaf17-DICER, или VTvaf17-НОХА10 или VTvaf17-WT1 получали следующим образом: кодирующую часть целевого гена IL11, или LIF, или DICER, или НОХА10, или WT1 клонировали в генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17 и получали генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-IL11, SEQ ID №1, или VTvaf17-LIF, SEQ ID №2 или VTvaf17-DICER, SEQ ID №3, или VTvaf17-HOXA10, SEQ ID №4, или VTvaf17-WT1, SEQ ID №5 соответственно. Кодирующую часть гена IL11 размером 622 п.н., или гена LIF размером 623 п.н., или гена DICER размером 5805 п.н., или гена НОХА10 размером 1270 п.н. или гена WT1 размером 1543 п.н. получали путем выделения суммарной РНК из биологического образца ткани здорового человека. Для получения первой цепи кДНК генов IL11, LIF, DICER, НОХА10, WT1 человека использовали реакцию обратной транскрипции. Амплификацию проводилис использованием созданных для этого методом химического синтеза олигонуклеотидов. Расщепление продукта амплификации специфическими эндонуклеазами рестрикции проводили с учетом оптимальной процедуры дальнейшего клонирования, причем клонирование в генотерапевтический ДНК-вектор VTvafl 7 проводили по сайтам рестрикции Sall, Kpnl, BamHI, EcoRI, EcoRV, расположенными в полилинкере вектора VTvafl 7. Выбор сайтов рестрикции проводили таким образом, чтобы клонированный фрагмент попадал в рамку считывания экспрессионной кассеты вектора VTvaf17, при этом белок-кодирующая последовательность не содержала сайты рестрикции для выбранных эндонуклеаз. При этом специалистам в данной области техники понятно, что методическая реализация получения генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-IL11, или VTvaf17-LIF, или VTvaf17-DICER, или VTvaf17-НОХА10, или VTvaf17-WT1 может варьировать в рамках выбора известных методов молекулярного клонирования генов, при этом эти способы подпадают под объем настоящего изобретения. Так, например, могут быть использованы различные последовательности олигонуклеотидов для амплификации гена IL11, или LIF, или DICER, или НОХА10, или WT1, различные эндонуклеазы рестрикции или такие лабораторные техники как безлигазное клонирование генов.

Генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-IL11, или VTvaf17-LIF, или VTvaf17-DICER, или VTvaf17-НОХА10, или VTvaf17-WT1 обладает нуклеотидной последовательностью SEQ ID №1 или SEQ ID №2 или SEQ ID №3 или SEQ ID №4 или SEQ ID №5 соответственно. При этом специалистам в данной области техники известно свойство вырожденности генетического кода, из которого следует, что под объем настоящего изобретения также подпадают варианты нуклеотидных последовательностей, отличающихся инсерцией, делецией или заменой нуклеотидов, которые не приводят к изменению полипептидной последовательности, кодируемой целевым геном, и/или не приводят к потере функциональной активности регуляторных элементов вектора VTvaf17. При этом специалистам в данной области техники известно явление генетического полиморфизма, из которого следует, что под объем настоящего изобретения также подпадают варианты нуклеотидных последовательностей генов из группы генов IL11, LIF, DICER, НОХА10 или WT1, которые при этом кодируют различные варианты аминокислотных последовательностей белков IL11, LIF, DICER, НОХА10 или WT1 не отличающихся от приведенных по своей функциональной активности при физиологических условиях.

Способность проникать в эукариотические клетки и функциональную активность, то есть способность экспрессировать целевой ген, полученного генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-IL11, или VTvaf17-LIF, или VTvaf17-DICER, или VTvaf17-НОХА10, или VTvaf17-WT1 подтверждают путем введения в эукариотические клетки полученного вектора и последующим анализом экспрессии специфической мРНК и/или белкового продукта целевого гена. Наличие специфической мРНК в клетках, в которые был введен генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-IL11, или VTvaf17-LIF, или VTvaf17-DICER, или VTvaf17-НОХА10, или VTvaf17-WT1 свидетельствует как о способности полученного вектора проникать в эукариотические клетки, так и о его способности экспрессировать мРНК целевого гена. При этом, как известно специалистам в данной области техники, наличие мРНК гена является обязательным условием, но не доказательством трансляции белка, кодируемого целевым геном. Поэтому для подтверждения свойства генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-IL11, или VTvaf17-LIF, или VTvaf17-DICER, или VTvaf17-НОХА10, или VTvaf17-WT1 экспрессировать целевой ген на уровне белка в эукариотических клетках, в которые был введен ггенотерапевтический ДНК-вектор, проводят анализ концентрации белков, кодируемых целевыми генами, с использованием иммунологических методов. Наличие белка IL11, или LIF, или DICER, или НОХА10, или WT1 подтверждает эффективность экспрессии целевых генов в эукариотических клетках и возможность повышения уровня концентрации белка с помощью генотерапевтического ДНК-вектора на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущего целевой ген, выбранный из группы генов IL11, LIF, DICER, НОХА10, WT1. Для подтверждения эффективности экспрессии созданного генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-IL11, несущего целевой ген, а именно, ген IL11, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-LIF, несущего целевой ген, а именно, ген LIF, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-DICER, несущего целевой ген, а именно, ген DICER, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-НОХА10, несущего целевой ген, а именно, ген НОХА10, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-WT1, несущего целевой ген, а именно, ген WT1 использовали следующие методы:

A) ПЦР в реальном времени - изменение накопления ампликонов кДНК целевых генов в лизате клеток человека и животного, после трансфекции различных клеточных линий человека и животного генотерапевтическим ДНК-векторами;

B) Иммуноферментный анализ - изменение количественного уровня целевых белков в лизате клеток человека, после трансфекции различных клеточных линий человека генотерапевтическими ДНК-векторами;

C) Иммуноферментный анализ - изменение количественного уровня целевых белков в супернатанте биоптатов тканей человека и животного, после введения в эти ткани генотерапевтических ДНК-векторов;

D) Иммуноферментный анализ - изменение количественного уровня целевых белков в супернатанте биоптатов тканей человека, после введения в эти ткани аутологичных клеток этого человека, трансфицированных генотерапевтическими ДНК-векторами;

Для подтверждения реализуемости способа применения созданного генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-IL11, несущего целевой ген, а именно, ген IL11, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-LIF, несущего целевой ген, а именно, ген LIF, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-DICER, несущего целевой ген, а именно, ген DICER генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-НОХА10, несущего целевой ген, а именно, ген НОХА10, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-WT1, несущего целевой ген, а именно, ген WT1 выполняли:

А) трансфекцию генотерапевтическими ДНК-векторами различных клеточных линий человека и животного;

В)введение генотерапевтических ДНК-векторов в различные ткани человека и животного;

С) введение в ткани животного смеси генотерапевтических ДНК-векторов;

D) введение в ткани человека аутологичных клеток, трансфицированных генотерапевтическими ДНК-векторами.

Указанные способы применения характеризуются отсутствием потенциальных рисков для генетической терапии человека и животных за счет отсутствия в составе генотерапевтического ДНК-вектора регуляторных элементов, представляющих собой нуклеотидные последовательности вирусных геномов и за счет отсутствия в составе генотерапевтического ДНК-вектора генов устойчивости к антибиотикам, что подтверждается отсутствием участков, гомологичных вирусным геномам и генам антибиотикорезистентности в нуклеотидных последовательностях генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-IL11, или генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-LIF, или генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-DICER, или генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-НОХА10, или генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-WT1 (SEQ ID №1 или SEQ ID №2 или SEQ ID №3 или SEQ ID №4 или SEQ ID №5 соответственно).

Как известно специалистам в данной области техники, гены антибиотикорезистентности в составе генотерапевтических ДНК-векторов используются с целью получения этих векторов в препаративных количествах путем наращивания бактериальной биомассы в питательной среде, содержащей селективный антибиотик. В рамках настоящего изобретения в целях возможности безопасного применения генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущего целевой ген IL11 или LIF, или DICER или НОХА10, или WT1, использование селективных питательных сред, содержащих антибиотик, не представляется возможным. В качестве технологического решения для получения генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущего целевой ген, выбранный из группы генов IL11, LIF, DICER, НОХА10, WT1 для возможности масштабирования до промышленных масштабов получения генотерапевтических векторов предлагается способ получения штаммов для наработки указанных генотерапевтических векторов на основе бактерии Escherichia coli SCS110-AF. Способ получения штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-IL11 или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-LIF, или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-DICER, или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-HOXA10 или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-WT1 заключается в получении компетентных клеток штамма Escherichia coli SCS110-AF с введением в эти клетки генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-IL11, или ДНК-вектора VTvaf17-LIF, или ДНК-вектора VTvaf17-DICER, или ДНК-вектора VTvaf17-НОХА10, или ДНК-вектора VTvaf17-WT1 соответственно с помощью методов трансформации (электропорации), общеизвестных специалистам в данной области техники. Полученный штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-IL11, или штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-LIF, или штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-DICER, или штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-HOXA10, или штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-WT1 используется для наработки генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-IL11, или VTvaf17-LIF, или VTvaf17-DICER, или VTvaf17-НОХА10, или VTvaf17-WT1 соответственно с возможностью использования сред без содержания антибиотиков.

Для подтверждения технологичности получения и возможности масштабирования до промышленного производства генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-IL11, несущего целевой ген, а именно, ген IL11, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-LIF, несущего целевой ген, а именно, ген LIF, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-DICER, несущего целевой ген, а именно, ген DICER генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-НОХА10, несущего целевой ген, а именно, ген НОХА10, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-WT1, несущего целевой ген, а именно, ген WT1 выполняли ферментацию в промышленном масштабе штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-IL11 или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-LIF или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-DICER, или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-HOXA10, или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-WT1, каждый из которых содержит генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17, несущий целевой ген, а именно IL11, или LIF, или DICER, или НОХА10, или WT1.

Способ масштабирования получения бактериальной массы до промышленных масштабов для выделения генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущего целевой ген, выбранный из группы генов IL11, LIF, DICER, HOXA10, WT1, подтвержадли тем, что затравочную культуру штамма Escherichia coli SCSI 10-AF/VTvaf17-IL11, или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-LIF, или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-DICER, или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-HOXA10, или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-WT1 инкубируют в объеме питательной среды без содержания антибиотика обеспечивающим подходящую динамику накопления биомассы, по достижению достаточного количества биомассы в логарифмической фазе роста, бактериальную культуру переносят в промышленный ферментер, после чего растят до достижения стационарной фазы роста, затем выделяют фракцию, содержащую целевой ДНК-продукт генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-IL11, или генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-LIF, или генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-DICER, или генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-НОХА10, или генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-WT1, многостадийно фильтруют и очищают хроматографическими методами. При этом специалистам в данной области техники понятно, что условия культивирования штаммов, состав питательных сред (за исключением содержания антибиотиков), используемое оборудование, методы очистки ДНК могут варьировать в рамках стандартных операционных процедур в зависимости от отдельно взятой производственной линии, но известные подходы к масштабированию, промышленному получению и очистке ДНК-векторов с использованием штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-IL11, или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-LIF, или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-DICER, или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-HOXA10, или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-WT1 подпадают под объем настоящего изобретения.

Описанное раскрытие изобретения подтверждается примерами реализации настоящего изобретения.

Изобретение поясняется примерами.

Пример 1.

Получение генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-IL11, несущего целевой ген, а именно, гена IL11.

Генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-IL11 конструировали клонированием кодирующей части гена IL11 размером 622 п. н. в ДНК-вектор VTvaf17 размером 3165 п. н. по сайтам рестрикции BamHI, EcoRI. Кодирующую часть гена IL11 размером 622 п. н. получали путем выделения суммарной РНК из биологического образца ткани человека с последующим проведением реакции обратной транскрипции с использованием коммерческого набора Mint-2 (Евроген, Россия)и ПЦР-амплификации с использованием олигонуклеотидов:

IL11_F AGGATCCCTGTGGGGACATGAACTGTG

IL11_R AGTGAATTCTCACAGCCGAGTCTTCAGC

и коммерческого набора Phusion® High-Fidelity DNA Polymerase (New England Biolabs, США).

Генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17 конструировали объединением шести фрагментов ДНК, полученных из разных источников:

(а) ориджин репликации получали путем ПЦР-амплификации участка коммерческой плазмиды pBR322 с внесением точечной мутации;

(б) промоторный регион EF1a получали путем ПЦР-амплификации участка геномной ДНК человека;

(в) терминатор транскрипции hGH-TA получали путем ПЦР-амплификации участка геномной ДНК человека;

(г) регуляторный участок транспозона Tn10 PHK-out получали путем синтеза из олигонуклеотидов;

(д) ген устойчивости к канамицину получали путем ПЦР-амплификации участка коммерческой плазмиды рЕТ-28 человека;

(е) полилинкер получали отжигом двух синтетических олигонуклеотидов.

ПЦР-амплификацию проводили с использованием коммерческого набора Phusion® High-Fidelity DNA Polymerase (NewEnglandBiolabs, США) в соответствии с инструкцией производителя. Фрагменты имеют перекрывающиеся области для возможности их объединения с последующей ПЦР-амплификацией. Объединяли фрагменты (а) и (б) с использованием олигонуклеотидов Ori-F и EF1-R, а также фрагменты (в), (г) и (д) с использованием олигонуклеотидов hGH-F и Kan-R. Далее, полученные участки объединяли путем рестрикции с последующим лигированием по сайтам BamHI и Ncol. В результате получали плазмиду, пока еще не содержащую полилинкер. Для его введения проводили расщепление плазмиды по сайтам BamHI и EcoRI, и лигирование с фрагментом (е). Таким образом, получали вектор размером 3165 п.н., несущий ген устойчивости к канамицину, который фланкирован сайтами рестрикции Spel. Далее этот участок выщепляли по сайтам рестрикции Spel, после чего оставшийся фрагмент лигировали сам на себя. Таким образом получали генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17 размером 3165 п.н., который является рекомбинантным, с возможностью селекции без антибиотиков.

Расщепление продукта амплификации кодирующей части гена IL11 и ДНК-вектора VTvaf17 проводили эндонуклеазами рестрикции BamHI и EcoRI (NewEnglandBiolabs, США).

В результате получали ДНК-вектор VTvaf17-IL11 размером 3751 п.н. с нуклеотидной последовательностью SEQ ID №1 и общей структурой изображенной на фиг. 1А.

Пример 2.

Получение генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-LIF, несущего целевой ген, а именно, гена LIF.

Генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-LIF конструировали клонированием кодирующей части гена LIF размером 623 п.н. в ДНК-вектор VTvaf17 размером 3165 п.н. по сайтам рестрикции BamHI, EcoRI. Кодирующую часть гена LIF размером 623 п.н. получали путем выделения суммарной РНК из биологического образца ткани человека с последующим проведением реакции обратной транскрипции с использованием коммерческого набора Mint-2 (Евроген, Россия) и ПЦР-амплификации с использованием олигонуклеотидов:

LIF_F AGGATCCACCATGAAGGTCTTGGCGGCAG

LIF_R TATGAATTCTAGAAGGCCTGGGCCAAC

и коммерческого набора Phusion® High-Fidelity DNA Polymerase (NewEnglandBiolabs, США), расщепление продукта амплификации и ДНК-вектора VTvaf17 проводили эндонуклеазами рестрикции BamHI и EcoRI (NewEnglandBiolabs, США).

В результате получали ДНК-вектор VTvaf17-LIF размером 3752 п.н. с нуклеотидной последовательностью SEQ ID №2 и общей структурой изображенной на фиг. 1В.

При этом генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17 конструировали по Примеру 1.

Пример 3

Получение ДНК-вектора VTvaf17-DICER, несущего целевой ген, а именно, гена DICER человека.

Генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-DICER конструировали клонированием кодирующей части гена DICER размером 5805 п.н. в ДНК-вектор VTvaf17 размером 3165 п. н. по сайтам рестрикции Sall, Kpnl. Кодирующую часть гена DICER размером 5805 п. н. получали путем выделения суммарной РНК из биологического образца ткани человека с последующим проведением реакции обратной транскрипции с использованием коммерческого набора Mint-2 (Евроген, Россия) и ПЦР-амплификации с использованием олигонуклеотидов:

DICER_F ATCGTCGACGAGGAGATCTGCCGCCGCGATCGCC

DICER_R TCGGTACCTAGCTATTGGGAACCTGAGGTTG

и коммерческого набора Phusion® High-Fidelity DNA Polymerase (NewEnglandBiolabs, США), расщепление продукта амплификации и ДНК-вектора VTvaf17 проводили эндонуклеазами рестрикции Sall и Kpnl (NewEnglandBiolabs, США).

В результате получали ДНК-вектор VTvaf17-DICER размером 8952 п. н. с нуклеотидной последовательностью SEQ ID №3 и общей структурой изображенной на фиг. 1С.

При этом генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17 конструировали по Примеру 1.

Пример 4.

Получение генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-НОХА10, несущего целевой ген, а именно, гена НОХА10.

Генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-НОХА10 конструировали клонированием кодирующей части гена НОХА10 размером 1270 п.н. в ДНК-вектор VTvaf17 размером 3165 п. н. по сайтам рестрикции EcoRV, EcoRI. Кодирующую часть гена НОХА10 размером 1270 п. н. получали путем выделения суммарной РНК из биологического образца ткани человека с последующим проведением реакции обратной транскрипции с использованием коммерческого набора Mint-2 (Евроген) и ПЦР-амплификации с использованием олигонуклеотидов:

НОХА10_F CCGATATCGAGGAGATCTGCCGCCGCGATCGCC

HOXA10_R GGGAATTCTAGGAAAAATTAAAGTTGGCTG

и коммерческого набора Phusion® High-Fidelity DNA Polymerase (NewEnglandBiolabs, США), расщепление продукта амплификации и ДНК-вектора VTvaf17 проводили эндонуклеазами рестрикции EcoRV и EcoRI (NewEnglandBiolabs).

В результате получали ДНК-вектор VTvaf17-НОХА10 размером 4404 п.н. с нуклеотидной последовательностью SEQ ID №4 и общей структурой изображенной на фиг. 1D.

При этом генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17 конструировали по Примеру 1.

Пример 5.

Получение генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-WT1, несущего целевой ген, а именно, гена WT1.

Генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-WT1 конструировали клонированием кодирующей части гена WT1 размером 1543 п.н. в ДНК-вектор VTvaf17 размером 3165 п.н. по сайтам рестрикции Sall, EcoRI. Кодирующую часть гена WT1 размером 1543 п.н. получали путем выделения суммарной РНК из биологического образца ткани человека с последующим проведением реакции обратной транскрипции с использованием коммерческого набора Mint-2 (Евроген, Россия) и ПЦР-амплификации с использованием олигонуклеотидов:

WT1_F ATCGTCGACTGGATCCGGTACCGAGGAGATCTG

WT1_R GGGAATTCTAAAGCGCCAGCTGGAGTTTG

и коммерческого набора Phusion® High-Fidelity DNA Polymerase (NewEnglandBiolabs, США), расщепление продукта амплификации и ДНК-вектора VTvaf17 проводили эндонуклеазами рестрикции Sall и EcoRI (NewEnglandBiolabs).

В результате получали ДНК-вектор VTvaf17-WT1 размером 4684 п.н. с нуклеотидной последовательностью SEQ ID №5 и общей структурой изображенной на фиг. 1Е.

При этом генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17 конструировали по Примеру 1.

Пример 6.

Подтверждение способности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-IL11, несущего целевой ген, а именно, ген IL11, проникать в эукариотические клетки и подтверждение его функциональной активности на уровне экспрессии мРНК целевого гена. Данный пример также демонстрирует реализуемость способа применения генотерапевтического ДНК-вектора, несущего целевой ген.

Оценивали изменения накопления мРНК целевого гена IL11, в первичной культуре клеток эндометрия матки человека через 48 часов после их трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-IL11, несущим ген IL11 человека. Количество мРНК определяли по динамике накопления ампликонов кДНК в реакции ПРЦ в реальном времени.

Для оценки изменения накопления мРНК целевого гена IL11, использовалась первичная культура клеток эндометрия матки человека, выделенная из биопсийного материала эндометрия матки человека. Забор биоптатов осуществлялся в I фазе менструального цикла у здоровых женщин репродуктивного возраста в стерильных условиях методом аспирационной биопсии. Для подтверждения соответствия выделенной культуры клеток критериям эпителиальной культуры эндометрия выполняли морфологическое и фенотипическое охарактеризование полученной клеточной культуры с использованием специфических антител на маркеры CD31, CD34, CD44, CD73, CD45, цитокератина 18 и эстрогеновых рецепторов (BD Biosciences, США). Процент положительных клеток составил: на цитокератин 18 - (91,4±4,5)%, на CD31 - (85,6±5,1)%, на CD44 - (92,8±4,6)%, на CD73 - (85,3±4,3)%, на CD34 - (4,2±0,3)%, на CD45 - (2,8±0,1)%.

Клеточную культуру эндометрия матки человека выращивали в стандартных условиях (37°С, 5% CO2) с использованием питательной среды Keratinocyte-SFM Medium (Gibco, США) с добавлением антибиотиков пенициллин/стрептомицина (Панэко, Россия) в концентрации 50 мкг/мл. В процессе культивирования каждые 48 ч происходила смена ростовой среды.

Для получения 90% конфлюэнтности, за 24 часа до постановки трансфекции клетки высевали в 24-луночный планшет из расчета 5×10⁴ клеток/лунку. Трансфекцию генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-IL11, экспрессирующим ген IL11 человека, проводили с использованием Lipofectamine 3000 (ThermoFisherScientific, США). В пробирке №1 к 25 мкл среды Opti-МЕМ (Gibco, США) добавляли 1 мкл раствора ДНК-вектора VTvaf17-IL11 (концентрация 500 нг/мкл) и 1 мкл реагента Р3000. Аккуратно перемешивали легким встряхиванием. В пробирке №2 к 25 мкл среды Opti-MEM (Gibco, США) добавляли 1 мкл раствора Lipofectamin 3000. Аккуратно перемешивали легким встряхиванием. Добавляли содержимое пробирки №1 к содержимому пробирки №2, инкубировали 5 мин при комнатной температуре. Полученный раствор по каплям добавляли к клеткам в объеме 40 мкл.

В качестве контроля использовали клетки эндометрия матки человека, трансфицированные генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17, не содержащим вставку целевого гена (кДНК гена IL11 до и после трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17, не содержащим вставку целевого гена, на фигурах не показано). Подготовку контрольного вектора VTvaf17 для трансфекции проводили как описано выше.

Суммарную РНК из трансфицированных клеток выделяли с использованием Trizol Reagent (Invitrogen, США). В лунку с клетками добавляли 1 мл Trizol Reagent и гомогенизировали с последующим прогреванием в течение 5 мин при 65°С. Далее образец центрифугировали при 14000 g в течение 10 мин и снова прогревали в течение 10 мин при 65 0С. Далее добавляли 200 мкл хлороформа, плавно перемешивали и центрифугировали при 14000 g в течение 10 мин. Затем отбирали водную фазу, добавляли к ней 1/10 объема 3М ацетата натрия, рН5.2 и равный объем изопропилового спирта. Инкубировали образец при -20°С в течение 10 мин с последующим центрифугированием при 14000 g в течение 10 мин. Осадок промывали 1 мл 70% этилового спирта, высушивали на воздухе и растворяли в 10 мкл воды, свободной от РНКаз. Определение уровня экспрессии мРНК гена IL11 после трансфекции проводили путем оценки динамики накопления ампликонов кДНК методом ПЦР в режиме реального времени. Для получения и амплификации кДНК, специфичной для гена IL11 человека, использовали олигонуклеотиды IL11_SF и IL11_SR:

IL11_SF CTGAGCCTGTGGCCAGATACA

IL11_SR AGCACACCTGGGAGCTGTAG.

Длина продукта амплификации - 248 п.н.

Реакцию обратной транскрипции и ПЦР-амплификацию проводили с помощью набора реагентов SYBR GreenQuantitect RT-PCR Kit (Qiagen, США) для ПЦР в режиме реального времени. Реакцию проводили в объеме 20 мкл, содержащих: 25 мкл QuantiTect SYBR Green RT-PCR MasterMix, 2,5 мМ хлорида магния, по 0,5 мкМ каждого праймера, 5 мкл РНК. Реакцию осуществляли на амплификаторе CFX96 (Bio-Rad, США) при следующих условиях: 1 цикл обратной транскрипции при 42°С - 30 минут, денатурация 98°С - 15 мин, затем 40 циклов, включающих денатурацию 94°С - 15 сек, отжиг праймеров 60°С - 30 сек и элонгацию 72°С - 30 сек. В качестве положительного контроля использовали ампликоны, получаемых при ПЦР на матрицах, представляющих собой плазмиды в известных концентрациях, содержащие последовательности кДНК генов IL11 и В2М. В качестве отрицательного контроля использовали деионизированную воду. Количество динамику накопления ампликонов кДНК генов IL11 и В2М оценивали в режиме реального времени с помощью программного обеспечения амплификатора Bio-RadCFXManager 2.1 (Bio-Rad, США). Графики, полученные в результате анализа представлены на фиг. 2.

Из фигуры 2 следует, что в результате трансфекции первичной культуры клеток эндометрия матки человека генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-IL11, уровень специфической мРНК гена IL11 человека вырос многократно, что подтверждает способность вектора проникать в эукариотические клетки и экспрессировать ген IL11 на уровне мРНК. Представленные результаты также подтверждают реализуемость способа применения генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-IL11 для повышения уровня экспрессии гена IL11 в эукариотических клетках.

Пример 7.

Подтверждение способности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-LIF, несущего целевой ген, а именно, ген LIF, проникать в эукариотические клетки и подтверждение его функциональной активности на уровне экспрессии мРНК целевого гена. Данный пример также демонстрирует реализуемость способа применения генотерапевтического ДНК-вектора, несущего целевой ген.

Оценивали изменения накопления мРНК целевого гена LIF, в первичной культуре гладкомышечных клеток мочевого пузыря человека HBdSMC (ATCC PCS-420-012) через 48 часов после их трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-LIF, несущим ген LIF человека. Количество мРНК определяли по динамике накопления ампликонов кДНК в реакции ПРЦ в реальном времени.

Первичную культуру гладкомышечных клеток мочевого пузыря человека HBdSMC выращивали среде с ростовыми добавками, приготовленной с использованием набора Vascular Smooth Muscle Cell GroWT1h Kit (ATCC® PCS-100-042™) в стандартных условиях (37°С, 5% CO2). Для получения 90% конфлюэнтности, за 24 часа до постановки трансфекции клетки высевали в 24-луночный планшет из расчета 5×10⁴ клеток/лунку. Для трансфекции использовали реагент Lipofectamine 3000 (ThermoFisherScientific, США). Трансфекцию генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-LIF, экспрессирующим ген LIF человека, проводили как описано в примере 6. В качестве контроля использовали первичную культуру гладкомышечных клеток мочевого пузыря человека HBdSMC, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17, не несущим целевой ген (кДНК гена LIF до и после трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17, не содержащим вставку целевого гена на фигурах не показано). Выделение РНК, реакцию обратной транскрипции и ПЦР в реальном времени проводили как описано в примере 6, за исключением олигонуклеотидов с отличающимися от примера 6 последовательностями. Для амплификации кДНК, специфичной для гена LIF человека, использовали олигонуклеотиды LIF_SF и LIF_SR:

LIF_SF TATTACACAGCCCAGGGGGA

LIF_SR GAGTTGACAGCCCAGCTTCT

Длина продукта амплификации - 366 п.н.

В качестве положительного контроля использовали ампликоны, получаемых при ПЦР на матрицах, представляющих собой плазмиды в известных концентрациях, содержащие последовательности кДНК генов LIF и В2М. В качестве отрицательного контроля использовали деионизированную воду. Количество ПЦР продуктов - кДНК генов LIF и В2М, полученных в результате амплификации, оценивали в режиме реального времени с помощью программного обеспечения амплификатора Bio-RadCFXManager 2.1 (Bio-Rad, США). Графики, полученные в результате анализа представлены на фиг. 3.

Из фигуры 3 следует, что в результате трансфекции первичной культуры гладкомышечных клеток мочевого пузыря человека HBdSMC генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-LIF, уровень специфической мРНК гена LIF человека вырос многократно, что подтверждает способность вектора проникать в эукариотические клетки и экспрессировать ген LIF на уровне мРНК. Представленные результаты также подтверждают реализуемость способа применения генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-LIF для повышения уровня экспрессии гена LIF в эукариотических клетках.

Пример 8.

Подтверждение способности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-DICER, несущего целевой ген, а именно, ген DICER, проникать в эукариотические клетки и подтверждение его функциональной активности на уровне экспрессии мРНК целевого гена. Данный пример также демонстрирует реализуемость способа применения генотерапевтического ДНК-вектора, несущего целевой ген.

Оценивали изменения накопления мРНК целевого гена DICER, в первичной культуре клеток эпителия молочной железы человека Primary Mammary Epithelial Cells; Normal, Human (НМЕС) (АТСС Кат. PCS-600-01) через 48 часов после их трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-DICER, несущим ген DICER человека. Количество мРНК определяли по динамике накопления ампликонов кДНК в реакции ПРЦ в реальном времени.

Первичную культуру клеток эпителия молочной железы человека НМЕС выращивали среде с ростовыми добавками, приготовленной с использованием набора Mammary Epithelial Cell GroWT1h Kit (АТСС® PCS-600-040™) в стандартных условиях (37°С, 5% CO2). Для получения 90% конфлюэнтности, за 24 часа до постановки трансфекции клетки высевали в 24-луночный планшет из расчета 5×10⁴ клеток/лунку. Для трансфекции использовали реагент Lipofectamine 3000 (ThermoFisherScientific, США). Трансфекцию генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-DICER, экспрессирующим ген DICER человека, проводили как описано в примере 6. В качестве контроля использовали первичную культуру клеток эпителия молочной железы человека НМЕС, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17, не несущим целевой ген (кДНК гена DICER до и после трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17, не содержащим вставку целевого гена на фигурах не показано). Выделение РНК, реакцию обратной транскрипции и ПЦР в реальном времени проводили как описано в примере 6, за исключением олигонуклеотидов с отличающимися от примера 6 последовательностями. Для амплификации кДНК, специфичной для гена DICER человека, использовали олигонуклеотиды DICER_SF и DICER_SR:

DICER_SF GGTGGTCCACGAGTCACAAT

DICER_SR TAGCACTGCCTTCGTTTCGT

Длина продукта амплификации - 386 п.н.

В качестве положительного контроля использовали ампликоны, получаемых при ПЦР на матрицах, представляющих собой плазмиды в известных концентрациях, содержащие последовательности кДНК генов DICER и B2M. В качестве отрицательного контроля использовали деионизированную воду. Количество ПЦР продуктов - кДНК генов DICER и B2M, полученных в результате амплификации, оценивали в режиме реального времени с помощью программного обеспечения амплификатора Bio-RadCFXManager 2.1 (Bio-Rad, США). Графики, полученные в результате анализа представлены на фиг. 4.

Из фигуры 4 следует, что в результате трансфекции первичной культуры клеток эпителия молочной железы человека НМЕС генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-DICER, уровень специфической мРНК гена DICER человека вырос многократно, что подтверждает способность вектора проникать в эукариотические клетки и экспрессировать ген DICER на уровне мРНК. Представленные результаты также подтверждают реализуемость способа применения генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-DICER для повышения уровня экспрессии гена DICER в эукариотических клетках.

Пример 9.

Подтверждение способности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-HOXA10, несущего целевой ген, а именно, ген НОХА10, проникать в эукариотические клетки и подтверждение его функциональной активности на уровне экспрессии мРНК целевого гена. Данный пример также демонстрирует реализуемость способа применения генотерапевтического ДНК-вектора, несущего целевой ген.

Оценивали изменения накопления мРНК целевого гена НОХА10, в культуре иммортализированных фибробластах человека Т HESCs (ATCC CRL-4003) через 48 часов после их трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-HOXA10, несущим ген НОХА10 человека. Количество мРНК определяли по динамике накопления ампликонов кДНК в реакции ПРЦ в реальном времени.

Культуру клеток иммортализированных фибробластов человека Т HESCs выращивали среде DМЕР-12 (Sigma, США) с добавлением до 1% ростовых добавок Corning™ ITS Premix Universal Culture Supplement (BD Cat# 354352, США), бикарбоната натрия в конечной концентрации 1,5 г/л; пуромицина в конечной концентрации 500 нг/мл и 10% сыворотки, очищенной от гормонов и ростовых факторов, HyClone™ Fetal Bovine Serum (Hyclone Laboratories Inc SH30068.03HI, США) в стандартных условиях (37°С, 5% CO2). Для получения 90% конфлюэнтности, за 24 часа до постановки трансфекции клетки высевали в 24-луночный планшет из расчета 5×10⁴ клеток/лунку. Для трансфекции использовали реагент Lipofectamine 3000 (ThermoFisherScientific, США). Трансфекцию генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-HOXA10, экспрессирующим ген НОХА10 человека, проводили как описано в примере 6. В качестве контроля использовали культуру клеток иммортализированных фибробластов человека Т HESCs, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17, не несущим целевой ген (кДНК гена НОХА10 до и после трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17, не содержащим вставку целевого гена на фигурах не показано). Выделение РНК, реакцию обратной транскрипции и ПЦР в реальном времени проводили как описано в примере 6, за исключением олигонуклеотидов с отличающимися от примера 6 последовательностями. Для амплификации кДНК, специфичной для гена НОХА10 человека, использовали олигонуклеотиды HOXA10_SF и НОХА10_SR:

НОХА10_SFCTACGACTCGGCGGACAAAT

НОХА10_SRTGGCTGCGTTTTCACCTTTG

Длина продукта амплификации - 473 п.н.

В качестве положительного контроля использовали ампликоны, получаемых при ПЦР на матрицах, представляющих собой плазмиды в известных концентрациях, содержащие последовательности кДНК генов НОХА10 и В2М. В качестве отрицательного контроля использовали деионизированную воду. Количество ПЦР продуктов - кДНК генов НОХА10 и В2М, полученных в результате амплификации, оценивали в режиме реального времени с помощью программного обеспечения амплификатора Bio-RadCFXManager 2.1 (Bio-Rad, США). Графики, полученные в результате анализа представлены на фиг. 5.

Из фигуры 5 следует, что в результате трансфекции иммортализированных фибробластов человека Т HESCs генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-HOXA10, уровень специфической мРНК гена НОХА10 человека вырос многократно, что подтверждает способность вектора проникать в эукариотические клетки и экспрессировать ген НОХА10 на уровне мРНК. Представленные результаты также подтверждают реализуемость способа применения генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-НОХА10 для повышения уровня экспрессии гена НОХА10 в эукариотических клетках.

Пример 10.

Подтверждение способности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-WT1, несущего целевой ген, а именно, ген WT1, проникать в эукариотические клетки и подтверждение его функциональной активности на уровне экспрессии мРНК целевого гена. Данный пример также демонстрирует реализуемость способа применения генотерапевтического ДНК-вектора, несущего целевой ген.

Оценивали количество мРНК целевого гена WT1, в первичной культуре клеток вагинального эпителия Primary Vaginal Epithelial Cells (ATCC® PCS-480-010™) через 48 часов после трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-WT1, несущим ген WT1 человека. Количество мРНК определяли по динамике накопления ампликонов кДНК в реакции ПРЦ в реальном времени.

Культуру клеток вагинального эпителия выращивали среде VaginalEpithelialCellBasalMedium (ATCCPCS-480-030) с добавлением ростовых добавок Vaginal Epithelial Cell GroWT1h Kit (ATCC® PCS-480-040™) в стандартных условиях (37°С, 5% CO2). Для получения 90% конфлюэнтности, за 24 часа до постановки трансфекции клетки высевали в 24-луночный планшет из расчета 5×10⁴ клеток/лунку. Для трансфекции использовали реагент Lipofectamine 3000 (ThermoFisherScientific, США). Трансфекцию генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-WT1, экспрессирующим ген WT1 человека, проводили как описано в примере 6. В качестве контроля использовали культуру клеток вагинального эпителия, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17, не несущим целевой ген (кДНК гена WT1 до и после трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17, не содержащим вставку целевого гена на фигурах не показано). Выделение РНК, реакцию обратной транскрипции и ПЦР в реальном времени проводили как описано в примере 6, за исключением олигонуклеотидов с отличающимися от примера 6 последовательностями. Для амплификации кДНК, специфичной для гена WT1 человека, использовали олигонуклеотиды WT1_SF и WT1_SR:

WT1_SFTGTTTCCTAACGCGCCCTAC

WT1_SRCCTGTGCTGTGGCCCTTTA

Длина продукта амплификации - 379 п.н.

В качестве положительного контроля использовали ампликоны, получаемых при ПЦР на матрицах, представляющих собой плазмиды в известных концентрациях, содержащие последовательности кДНК генов WT1 и В2М. В качестве отрицательного контроля использовали деионизированную воду. Количество ПЦР продуктов - кДНК генов WT1 и В2М, полученных в результате амплификации, оценивали в режиме реального времени с помощью программного обеспечения амплификатора Bio-RadCFXManager 2.1 (Bio-Rad, США). Графики, полученные в результате анализа представлены на фиг. 6.

Из фигуры 6 следует, что в результате трансфекции иммортализированных фибробластов человека Т HESCs генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-WT1, уровень специфической мРНК гена WT1 человека вырос многократно, что подтверждает способность вектора проникать в эукариотические клетки и экспрессировать ген WT1 на уровне мРНК. Представленные результаты также подтверждают реализуемость способа применения генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-WT1 для повышения уровня экспрессии гена WT1 в эукариотических клетках.

Пример 11.

Подтверждение эффективности реализуемости способа применения генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-IL11, несущего ген IL11, для повышения экспрессии белка IL11 в клетках млекопитающих.

Оценивали изменение количества белка IL11 в лизате клеток аденокарциномы матки человека НЕС-1-А (АТСС® НТВ-112™)после трансфекции этих клеток ДНК-вектором VTvaf17-IL11, несущим ген IL11 человека.

Клеточную культуру аденокарциномы матки человека НЕС-1-А выращивали в среде McCoy's 5A Medium (ATCC® 30-2007™) с добавлением 10% сыворотки Fetal Bovine Serum (FBS) (ATCC® 30-2020™) в стандартных условиях (плюс 37°С, 5% CO₂).

Для получения 90% конфлюэнтности, за 24 часа до постановки трансфекции клетки высевали в 24-луночный планшет из расчета 5×10⁴ клеток/лунку. Для трансфекции использовали реагент SuperFect Transfection Reagent 6-го поколения (Qiagen, Германия). В качестве контроля использовали водный раствор дендримеров без ДНК-вектора (А), ДНК-вектор VTvaf17, не содержащий кДНК гена IL11 (В), в качестве трансфицируемых агентов - ДНК-вектор VTvaf17-IL11, несущий ген IL11 человека. Приготовление комплекса ДНК/дендример проводили по методике производителя (QIAGEN, SuperFect Transfection Reagent Handbook, 2002) с некоторыми изменениями. Для трансфекции клеток в одной лунке 24-луночного планшета к 1 мкг ДНК-вектора, растворенного в буфере ТЕ, добавляли среду McCoy's 5A Medium до конечного объема 60 мкл, затем добавляли 5 мкл SuperFectTransfection Reagent и осторожно перемешивали пятикратным пипетированием. Комплекс инкубировали при комнатной температуре в течение 10-15 мин. Далее отбирали из лунок культуральную среду, лунки промывали 1 мл буфера PBS. К образовавшемуся комплексу добавляли 350 мкл среды McCoy's 5A Medium, содержащей 10 мкг/мл гентамицина, осторожно перемешивали и добавляли к клеткам. Клетки инкубировали с комплексом 2-3 часа при 37°С в атмосфере, содержащей 5% CO₂.

Затем осторожно удаляли среду, промывали клеточный монослой 1 мл буфера PBS. Затем добавляли среду McCoy's 5A Medium, содержащую 10 мкг/мл гентамицина и инкубировали 24-48 часов при 37°С в атмосфере 5% CO₂.

После трансфекции к 0,5 мл культуральной жидкости добавляли 0,1 мл 1N HCl, тщательно перемешивали и инкубировали 10 минут при комнатной температуре. Затем нейтрализовали смесь, добавляя 0,1 мл 1.2 М NaOH/0.5 M HEPES (рН 7-7,6) и тщательно перемешивали. Отбирали супернатант и использовали его для количественного определения целевого белка. Количественное определение белка IL11 проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), используя набор Human IL11 ELISA Kit (Interleukin-11) (Abeam Кат. ab100551, США) согласно методике производителя с детекцией оптической плотности при помощи автоматического биохимического и иммуноферментного анализатора ChemWell (Awareness Technology Inc., США).

Численное значение концентрации определяли с помощью калибровочной кривой, построенной по стандартным образцам с известной концентрацией белка интерлейкин 11, входящим в состав набора. Чувствительность метода составляла не менее 3 пг/мл, диапазон измерения - от 1.1 пг/мл до 800 пг/мл. Статистическую обработку полученных результатов осуществляли с помощью программного обеспечения для статистической обработки и визуализации данных R, версия 3.0.2 (https://www.r-project.org/). Графики, полученные в результате анализа представлены на фиг. 7.

Из фигуры 7 следует, что в результате трансфекции клеток аденокарциномы матки человека НЕС-1-А генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-IL11 приводит к увеличению количества белка IL11 по сравнению с контрольными образцами, что подтверждает способность вектора проникать в эукариотические клетки и экспрессировать ген IL11 на уровне белка. Представленные результаты также подтверждают реализуемость способа применения генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-IL11 для повышения уровня экспрессии IL11 в эукариотических клетках.

Пример 12.

Подтверждение эффективности и реализуемости способа применения генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-LIF, несущего ген LIF, для повышения экспрессии белка LIF в клетках млекопитающих.

Оценивали изменение количества белка LIF в лизате клеток первичной культуры клеток эндометрия матки человека после трансфекции этих клеток ДНК-вектором VTvaf17-LIF, несущим ген LIF человека. Клетки получали из биоматериала человека и выращивали как описано в примере 6.

Для трансфекции использовали реагент SuperFect Transfection Reagent 6-го поколения (Qiagen, Германия). В качестве контроля использовали водный раствор дендримеров без ДНК-вектора (А), ДНК-вектор VTvaf17, не содержащий кДНК гена LIF (В), в качестве трансфицируемых агентов - ДНК-вектор VTvaf17-LIF, несущий ген LIF человека. Приготовление комплекса ДНК-дендример и трансфекцию клеток первичной культуры эндометрия матки человека проводили как описано в примере 11.

После трансфекции клетки промывали три раза PBS, далее к клеткам добавляли 1 мл PBS и подвергали трехкратному замораживанию/оттаиванию. Далее суспензию центрифугировали при 15000 об/мин в течение 15 мин, отбирали супернатант и использовали его для количественного определения целевого белка.

Количественное определение белка LIF проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), используя набор Human LIF ELISA Kit (Abeam Кат. ab.100582, США) методике производителя с детекцией оптической плотности при помощи автоматического биохимического и иммуноферментного анализатора ChemWell (Awareness Technology Inc., США).

Численное значение концентрации определяли с помощью калибровочной кривой, построенной по стандартным образцам с известной концентрацией белка LIF, входящим в состав набора. Чувствительность метода составляла не менее 15 пг/мл, диапазон измерения - от 8.23 пг/мл до 6000 пг/мл. Статистическую обработку полученных результатов осуществляли с помощью программного обеспечения для статистической обработки и визуализации данных R, версия 3.0.2 (https://www.r-project.org/). Графики, полученные в результате анализа представлены на фиг. 8.

Из фигуры 8 следует, что трансфекция первичной культуры клеток эндометрия матки человека генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-LIF приводит к увеличению количества белка LIF по сравнению с контрольными образцами, что подтверждает способность вектора проникать в эукариотические клетки и экспрессировать ген LIF на уровне белка. Представленные результаты также подтверждают реализуемость способа применения генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-LIF для повышения уровня экспрессии LIF в эукариотических клетках.

Пример 13.

Подтверждение эффективности и реализуемости способа применения генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-DICER, несущего ген DICER, для повышения экспрессии белка DICER в клетках млекопитающих.

Оценивали изменение количества белка DICER в лизате клеток первичной культуры эпителия молочной железы человека Primary Mammary Epithelial Cells; Normal, Human (НМЕС) (АТСС Кат. PCS-600-01) после трансфекции этих клеток ДНК-вектором VTvaf17-DICER, несущим ген DICER человека. Клетки культивировали как описано в примере 8.

Для трансфекции использовали реагент SuperFect Transfection Reagent 6-го поколения (Qiagen, Германия). В качестве контроля использовали водный раствор дендримеров без ДНК-вектора (А), ДНК-вектор VTvaf17, не содержащий кДНК гена DICER (В), в качестве трансфицируемых агентов - ДНК-вектор VTvaf17-DICER, несущий ген DICER человека. Приготовление комплекса ДНК-дендример и трансфекцию клеток НМЕС проводили как описано в примере 11.

После трансфекции клетки промывали три раза PBS, далее к клеткам добавляли 1 мл PBS и подвергали трехкратному замораживанию/оттаиванию. Далее суспензию центрифугировали при 15000 об/мин в течение 15 мин, отбирали супернатант и использовали его для количественного определения целевого белка.

Количественное определение белка DICER проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), используя набор Human DICER / Dicer ELISA Kit (Sandwich ELISA) - LS-F7611 (LifeSpan Biosciences Кат. LS-F7611, США) согласно методике производителя с детекцией оптической плотности при помощи автоматического биохимического и иммуноферментного анализатора ChemWell (Awareness Technology Inc., США).

Численное значение концентрации определяли с помощью калибровочной кривой, построенной по стандартным образцам с известной концентрацией белка DICER, входящим в состав набора. Чувствительность метода составляла не менее 312 пг/мл, диапазон измерения - от 312 пг/мл до 20000 пг/мл. Статистическую обработку полученных результатов осуществляли с помощью программного обеспечения для статистической обработки и визуализации данных R, версия 3.0.2 (https://www.r-project.org/). Графики, полученные в результате анализа представлены на фиг. 9.

Из фигуры 9 следует, что трансфекция культуры клеток НМЕС генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-DICER приводит к увеличению количества белка DICER по сравнению с контрольными образцами, что подтверждает способность вектора проникать в эукариотические клетки и экспрессировать ген DICER на уровне белка. Представленные результаты также подтверждают реализуемость способа применения генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-DICER для повышения уровня экспрессии DICER в эукариотических клетках.

Пример 14.

Подтверждение эффективности и реализуемости способа применения генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-HOXA10, несущего ген НОХА10, для повышения экспрессии белка НОХА10 в клетках млекопитающих.

Оценивали изменение количества белка НОХА10 в лизате культуры клеток иммортализированных фибробластов человека Т HESCs (ATCC CRL-4003) после трансфекции этих клеток ДНК-вектором VTvaf17-HOXA10, несущим ген НОХА10 человека. Клетки культивировали как описано в примере 9.

Для трансфекции использовали реагент SuperFect Transfection Reagent 6-го поколения (Qiagen, Германия). В качестве контроля использовали водный раствор дендримеров без ДНК-вектора (А), ДНК-вектор VTvaf17, не содержащий кДНК гена НОХА10 (В), в качестве трансфицируемых агентов - ДНК-вектор VTvaf17-HOXA10, несущий ген НОХА10 человека. Приготовление комплекса ДНК-дендримеры и трансфекцию клеток Т HESCs проводили как описано в примере 11.

После трансфекции клетки промывали три раза PBS, далее к клеткам добавляли 1 мл PBS и подвергали трехкратному замораживанию/оттаиванию. Далее суспензию центрифугировали при 15000 об/мин в течение 15 мин, отбирали супернатант и использовали его для количественного определения целевого белка.

Количественное определение белка НОХА10 проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), используя набор Human.

Human НОХА10 ELISA Kit (Sandwich ELISA) - LS-F38137 (LifeSpan Biosciences Кат. LS-F38137, США) согласно методике производителя с детекцией оптической плотности при помощи автоматического биохимического и иммуноферментного анализатора ChemWell (Awareness Technology Inc., США).

Численное значение концентрации определяли с помощью калибровочной кривой, построенной по стандартным образцам с известной концентрацией белка НОХА10, входящим в состав набора. Чувствительность метода составляла не менее 9,38 пг/мл, диапазон измерения - от 15,63 пг/мл до 1000 пг/мл. Статистическую обработку полученных результатов осуществляли с помощью программного обеспечения для статистической обработки и визуализации данных R, версия 3.0.2 (https://www.r-project.org/). Графики, полученные в результате анализа, представлены на фиг. 10.

Из фигуры 10 следует, что трансфекция культуры клеток Т HESCs генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-HOXA10 приводит к увеличению количества белка НОХА10 по сравнению с контрольными образцами, что подтверждает способность вектора проникать в эукариотические клетки и экспрессировать ген НОХА10 на уровне белка. Представленные результаты также подтверждают реализуемость способа применения генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-HOXA10 для повышения уровня экспрессии НОХА10 в эукариотических клетках.

Пример 15.

Подтверждение эффективности и реализуемости способа применения генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-WT1, несущего ген WT1, для повышения экспрессии белка WT1 в клетках млекопитающих.

Оценивали изменение количества белка WT1 в лизате клеток первичной культуры вагинального эпителия Primary Vaginal Epithelial Cells (ATCC® PCS-480-010™) после трансфекции этих клеток ДНК-вектором VTvaf17-WT1, несущим ген WT1 человека. Клетки культивировали как описано в примере 10.

Для трансфекции использовали реагент SuperFect Transfection Reagent 6-го поколения (Qiagen, Германия). В качестве контроля использовали водный раствор дендримеров без ДНК-вектора (А), ДНК-вектор VTvaf17, не содержащий кДНК гена WT1 (В), в качестве трансфицируемых агентов - ДНК-вектор VTvaf17-WT1, несущий ген WT1 человека (С). Приготовление комплекса ДНК-дендример и трансфекцию клеток первичной культуры эндометрия матки человека проводили как описано в примере 11.

После трансфекции клетки промывали три раза PBS, далее к клеткам добавляли 1 мл PBS и подвергали трехкратному замораживанию/оттаиванию. Далее суспензию центрифугировали при 15000 об/мин в течение 15 мин, отбирали супернатант и использовали его для количественного определения целевого белка.

Количественное определение белка WT1 проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), используя набор Human WT1 / Wilms Tumor 1 ELISA Kit (Sandwich ELISA) - LS-F7009 (LifeSpan Biosciences Кат. LS-F7009, США) согласно методике производителя с детекцией оптической плотности при помощи автоматического биохимического и иммуноферментного анализатора ChemWell (Awareness Technology Inc., США).

Численное значение концентрации определяли с помощью калибровочной кривой, построенной по стандартным образцам с известной концентрацией белка WT1, входящим в состав набора. Чувствительность метода составляла не менее 0,156 нг/мл, диапазон измерения - от 156 пг/мл до 10000 пг/мл. Статистическую обработку полученных результатов осуществляли с помощью программного обеспечения для статистической обработки и визуализации данных R, версия 3.0,2 (https://www.r-project.org/). Графики, полученные в результате анализа, представлены на фиг. 11.

Из фигуры 11 следует, что трансфекция первичной культуры клеток вагинального эпителия человека генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-WT1 приводит к увеличению количества белка WT1 по сравнению с контрольными образцами, что подтверждает способность вектора проникать в эукариотические клетки и экспрессировать ген WT1 на уровне белка. Представленные результаты также подтверждают реализуемость способа применения генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-WT1 для повышения уровня экспрессии WT1 в эукариотических клетках.

Пример 16.

Подтверждение эффективности и реализуемости способа применения генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-IL11, несущего ген IL11, для повышения экспрессии белка IL11 в тканях человека.

Для подтверждения эффективности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-IL11, несущего целевой ген, а именно, ген IL11 и реализуемости способа его применения оценивали изменения количества белка IL11 в коже человека при введении в кожу человека генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-IL11, несущего ген IL11 человека.

С целью анализа изменения количества белка интерлейкин 11 трем пациентам вводили в кожу предплечья генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-IL11, несущий ген IL11 и параллельно вводили плацебо, представляющее собой генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17, не содержащий кДНК гена IL11.

Пациент 1, мужчина 66 лет, (П1); пациент 2, женщина 65 лет, (П2); пациент 3, мужчина, 64 года, (П3). В качестве транспортной системы использовали полиэтиленимин Transfection reagent cGMP grade in-vivo-jetPEI (Polyplus Transfection, Франция). Генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-IL11, который содержит кДНК гена IL11 и Генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17, используемый в качестве плацебо, который не содержит кДНК генаIL11, каждый из которых растворяли в стерильной воде степени очистки Nuclease-Free. Для получения генетической конструкции готовили комплексы ДНК-cGMP grade in-vivo-jetPEI в соответствии с рекомендациями производителя.

Генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17 (плацебо) и Генотерапевтический ДНК векторVTvaf17-IL11, несущий ген IL11 вводили в количестве 1 мг для каждой генетической конструкции тоннельным методом иглой 30G на глубину 3 мм. Объем вводимого раствора генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17 (плацебо) и генотерапевтического ДНК вектора VTvaf17-IL11, несущего ген IL11, - 0,3 мл для каждой генетической конструкции. Очаги введения каждой генетической конструкции располагались на участке предплечья на расстоянии 8-10 см друг от друга.

Биопсийные образцы отбирали на 2-е сутки после введения генетических конструкций генотерапевтических ДНК-векторов. Взятие биопсии осуществляли из участков кожи пациентов в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора VTvaf17-IL11, несущего ген IL11 (I), генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17 (плацебо) (II), а также из интактных участков кожи (III), используя устройство для взятия биопсии Epitheasy 3.5 (Medax SRL, Италия). Кожу пациентов в зоне отбора биоптата предварительно промывали стерильным физиологическим раствором и анестезировали раствором лидокаина. Размер биопсийного образца составлял около 10 куб. мм, масса - около 11 мг. Образец помещали в буферный раствор, содержащий 50 мМ Трис-HCl рН 7.6, 100 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА и 1 мМ фенилметилсульфонилфторид, и гомогенизировали до получения однородной суспензии. Полученную суспензию центрифугировали в течение 10 мин при 14000g. Отбирали супернатант и использовали его для количественного определения целевого белка методом твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), используя набор Human IL11 ELISA Kit (Interleukin-11) (Abeam Кат. ab00551, США) согласно методике производителя с детекцией оптической плотности при помощи автоматического биохимического и иммуноферментного анализатора ChemWell (Awareness Technology Inc., США).

Численное значение концентрации определяли с помощью калибровочной кривой, построенной по стандартным образцам с известной концентрацией белка интерлейкин 11, входящим в состав набора. Чувствительность метода составляла не менее 3 пг/мл, диапазон измерения - от 1.1 пг/мл до 800 пг/мл. Графики, полученные в результате анализа представлены на фиг. 12.

Из фигуры 12 следует, что в коже всех трех пациентов в области введения генотерапевтического ДНК вектора VTvaf17-IL11, несущего целевой ген IL11 человека, произошло увеличение количества белка интерлейкин 11 в сравнении с количеством белка интерлейкин 11 в области введения генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17 (плацебо), не содержащего ген IL11 человека, что свидетельствует об эффективности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-IL11 и подтверждает реализуемость способа его применения, в частности при внутрикожном введении генотерапевтического ДНК-вектора в ткани человека.

Пример 17.

Подтверждение эффективности и реализуемости способа применения генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-LIF, несущего ген LIF, для повышения экспрессии белка LIF в тканях человека.

Для подтверждения эффективности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-LIF, несущего целевой ген LIF и реализуемости способа его применения оценивали изменение количества белка LIF в мышечной ткани человека при введении генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-LIF, несущего целевой ген, а именно, ген LIF человека.

С целью анализа изменения количества белка LIF трем пациентам вводили в ткань икроножной мышцы генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-LIF, несущий ген LIF с транспортной молекулой, и параллельно вводили плацебо, представляющее собой генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17, не содержащий кДНК гена LIF с транспортной молекулой.

Пациент 1, женщина 59 лет, (П1); пациент 2, мужчина 58 лет, (П2); пациент 3, мужчина, 66 лет, (П3). В качестве транспортной системы использовали полиэтиленимин Transfection reagent cGMP grade in-vivo-jetPEI (Polyplus Transfection, Франция), пробоподготовку проводили в соответствии с рекомендациями производителя.

Генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17 (плацебо) и генотерапевтический ДНК векторVTvaf17-LIF, несущий генLIF вводили в количестве 1 мг для каждой генетической конструкции тоннельным методом иглой 30G на глубину около 10 мм. Объем вводимого раствора генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17 (плацебо) и генотерапевтического ДНК вектора VTvaf17-LIF, несущего ген LIF - 0,3 мл для каждой генетической конструкции. Очаги введения каждой генетической конструкции располагали медиально на расстоянии 8-10 см друг от друга.

Биопсийные образцы отбирали на 2-е сутки после введения генетических конструкций генотерапевтических ДНК-векторов. Взятие биопсии осуществляли из участков мышечной ткани пациентов в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора VTvaf17-LIF, несущего генLIF (I), генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17 (плацебо) (II), а также из интактного участка икроножной мышцы (III), используя устройство для взятия биопсии MAGNUM (BARD, США). Кожу пациентов в зоне отбора биоптата предварительно промывали стерильным физиологическим раствором и анестезировали раствором лидокаина. Размер биопсийного образца составлял около 20 куб. мм, масса - около 22 мг. Образец помещали в буферный раствор, содержащий 50 мМ Трис-HCl рН 7.6, 100 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА и 1 мМ фенилметилсульфонилфторид, и гомогенизировали до получения однородной суспензии. Полученную суспензию центрифугировали в течение 10 мин при 14000g. Отбирали супернатант и использовали его для количественного определения целевого белка.

Количественное определение белка LIF проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), используя набор Human LIF ELISA Kit (Abeam Кат. ab100582, США) согласно методике производителя с детекцией оптической плотности при помощи автоматического биохимического и иммуноферментного анализатора ChemWell (Awareness Technology Inc., США).

Численное значение концентрации определяли с помощью калибровочной кривой, построенной по стандартным образцам с известной концентрацией белка LIF, входящим в состав набора. Чувствительность метода составляла не менее 15 пг/мл, диапазон измерения - от 8.23 пг/мл до 6000 пг/мл. Графики, полученные в результате анализа представлены на фиг. 13.

Из фигуры 13 следует, что в икроножной мышце всех трех пациентов в области введения генотерапевтического ДНК вектора VTvaf17-LIF, несущего целевой ген, а именно, ген LIF человека, произошло увеличение количества белка LIF в сравнении с количеством белка LIF в области введения генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17 (плацебо), не содержащего генLIF человека, что свидетельствует об эффективности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-LIF и подтверждает реализуемость способа его применения, в частности при внутримышечном введении генотерапевтического ДНК-вектора в ткани человека.

Пример 18.

Подтверждение эффективности и реализуемости способа сочетанного применения генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-IL11, несущего ген IL11, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-LIF, несущего ген LIF, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-DICER, несущего ген DICER, для повышения уровня экспрессии белков IL11, LIF и DICER в тканях млекопитающих.

Оценивали изменение количества белков IL11, LIF и DICER в биоптате матки крысы при интрацервикальном введении в матку крысы смеси генотерапевтических векторов.

В матку самок целевой группы крыс (группа I, N=10) линии Sprague-Dawley вводили раствор эквимолярной смеси генотерапевтических векторов с добавлением транспортной системы на основе полиэтиленимина Transfection reagent cGMP grade in-vivo-jetPEI (Polyplus Transfection, Франция). Контрольной группе крыс (группа II, N=10) вводили плацебо, представляющее собой раствор генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17. Пробоподготовку проводили согласно инструкции производителя. Объем вводимого раствора составлял 0,3 мл с концентрацией ДНК 0,09 мкг/мкл. Для введения в цервикальный канал самкам крыс линии Sprague-Dawley, использовали спинальные иглы для анестезии.

Биопсийные образцы отбирали на 2 сутки после введения генотерапевтических ДНК-векторов. Взятие биопсии осуществляли после некропсии животных из биоптата матки у трех групп животных:

группа I - животные, которым вводилась смесь генотерапевтических векторов: генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-IL11, несущего ген IL11, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-LIF, несущего ген LIF, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-DICER, несущего ген DICER;

группа II - животные, которым вводился генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17 (плацебо);

группа III - интактные животные, не подвергавшиеся каким-либо манипуляциям.

Размер каждого биопсийного образца составлял около 11 куб. мм, масса - около 15 мг. Каждый образец помещали в буферный раствор, содержащий 50 мМ Трис-HCl рН 7.6, 100 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА и 1 мМ фенилметилсульфонилфторид, и гомогенизировали до получения однородной суспензии. Полученную суспензию центрифугировали в течение 10 мин при 14000g. Отбирали супернатант и использовали его для количественного определения целевых белков как это описано в примере 11 (количественное определение белка IL11), примере 12 (количественное определение белка LIF), примере 13 (количественное определение белка DICER). Графики, полученные в результате анализа, представлены на фиг. 14.

Из фигуры 14 следует, что в матке крыс из группы I, которым вводилась смесь генотерапевтических векторов: генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-IL11, несущего ген IL11, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-LIF, ген LIF, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-DICER, несущего целевой ген DICER, произошло увеличение количества белка IL11, LIF, белка DICER по сравнению с контрольной группой II (плацебо) и контрольной группой III (интактные животные). Полученные результаты свидетельствуют об эффективности сочетанного применения генотерапевтических ДНК-векторов и подтверждает реализуемость способа применения для повышения уровня экспрессии целевых белков в тканях млекопитающих, в частности при интрацервикальном введении генотерапевтических ДНК-векторов.

Пример 19.

Подтверждение эффективности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-IL11, несущего ген IL11 и реализуемости способа его применения для повышения уровня экспрессии белка IL11 в тканях человека путем введения аутологичных фибробластов, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-IL11.

Для подтверждения эффективности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-IL11, несущего ген IL11 и реализуемости способа его применения оценивали изменения количества белка IL11 в коже человека при введении в кожу пациента культуры аутологичных фибробластов этого пациента, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-IL11.

Пациенту вводили в кожу предплечья соответствующую культуру аутологичных фибробластов, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-IL11, несущим ген IL11, и параллельно вводили плацебо, представляющее собой культуру аутологичных фибробластов пациента, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17, не несущим ген IL11.

Первичную культуру фибробластов человека выделяли из биоптатов кожи пациента. Используя устройство для взятия биопсии кожи Epitheasy 3.5 (MedaxSRL, Италия) брали образец биоптата кожи из зоны, защищенной от действия ультрафиолета, а именно за ушной раковиной или с боковой внутренней поверхности в зоне локтевого сустава, размером около 10 кв. мм, массой - около 11 мг. Кожу пациента предварительно промывали стерильным физиологическим раствором и анестезировали раствором лидокаина. Культивирование первичной культуры клеток осуществляли при 37°С в атмосфере, содержащей 5% CO₂ в среде DMEM с 10% фетальной телячьей сывороткой и ампициллином 100 Ед/мл. Пересев культуры и смену культуральной среды осуществляли каждые 2 дня. Общая продолжительность роста культуры не превышала 25-30 дней. Из культуры клеток отбирали аликвоту, содержащую 5×10⁴ клеток. Культуру фибробластов пациента трансфицировали генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-IL11, несущим ген IL11 или плацебо - вектор VTvaf17, не несущий целевой ген IL11.

Трансфекцию осуществляли с помощью катионного полимера полиэтиленимина JETPEI (Polyplus transfection, Франция), согласно инструкции фирмы-производителя. Клетки культивировали 72 часа и затем вводили пациенту. Введение пациенту культуры аутологичных фибробластов этого пациента, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-IL11, и плацебо, представляющее собой культуру аутологичных фибробластов пациента, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17, осуществляли туннельным методом в область предплечья иглой 30G длиной 13 мм на глубину около 3 мм. Концентрация модифицированных аутологичных фибробластов в вводимой суспензии составляла примерно 5 млн клеток на 1 мл суспензии, количество вводимых клеток не превышало 15 млн. Очаги введения культуры аутологичных фибробластов располагались на расстоянии 8-10 см друг от друга.

Биопсийные образцы отбирали на 4-е сутки после введения культуры аутологичных фибробластов, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-IL11, несущим целевой ген, а именно, ген IL11 и плацебо. Взятие биопсии осуществляли из участков кожи пациента в зоне введения культуры аутологичных фибробластов, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-IL11, несущим целевой ген, а именно, ген IL11 (С), культуры аутологичных фибробластов, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17, не несущим целевой ген IL11 (плацебо) (В), а также из участков интактной кожи (А), используя устройство для взятия биопсии Epitheasy 3.5 (Medax SRL, Италия). Кожу в зоне отбора биоптата пациентов предварительно промывали стерильным физиологическим раствором и анестезировали раствором лидокаина. Размер биопсийного образца составлял около 10 куб. мм, масса - около 11 мг. Образец помещали в буферный раствор, содержащий 50 мМ Трис-HCl рН 7.6, 100 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА и 1 мМ фенилметилсульфонилфторид, и гомогенизировали до получения однородной суспензии. Полученную суспензию центрифугировали в течение 10 мин при 14000g. Отбирали супернатант и использовали его для количественного определения целевого белка как это описано в примере 11.

Графики, полученные в результате анализа, представлены на фиг. 15.

Из фигуры 15 следует, что в коже пациента в области введения культуры аутологичных фибробластов, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-IL11, несущим ген IL11, произошло увеличение количества белка IL11 в сравнении с количеством белка IL11 в области введения культуры аутологичных фибробластов, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17, не несущим ген IL11 (плацебо), что свидетельствует об эффективности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-IL11 и подтверждает реализуемость способа его применения для повышения уровня экспрессии IL11 в тканях человека, в частности при введении аутологичных фибробластов, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-IL11.

Пример 20.

Подтверждение эффективности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-HOXA10, несущего ген НОХА10 и реализуемости способа его применения для повышения уровня экспрессии белка НОХА в клетках млекопитающих.

Для подтверждения эффективности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-HOXA10, несущего ген НОХА10 оценивали изменение накопления мРНК целевого гена НОХА10 в клетках эндометрия матки коровы BEND (ATCC CRL-2398) через 48 часов после их трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-HOXA10, несущим ген НОХА10 человека по сравнению с контрольными клетками BEND, трансфицированными генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17, не несущим ген НОХА10 человека (плацебо).

Клетки эндометрия матки коровы ВЕND выращивали в среде, представляющей собой смесь 1:1 среды F12 (ATCC® 30-2004™, США) и среды ЕМЕМ (ATCC® 30-2003™, США) с добавлением 1,5 мМ L-глутамина (Панэко, Россия), 1.5 г/л бикарбоната натрия (Панэко, Россия), 0.034 г/л D-валина (Sigma, США), 10% бычьей сыворотки (АТСС® 30-2020™) и 10% лошадиной сыворотки (АТСС® 30-2040™, США). Трансфекцию генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-HOXA10, несущим ген НОХА10 человека и ДНК-вектором VTvaf17 не несущим ген НОХА10 человека (контороль), выделение РНК, реакцию обратной транскрипции, ПЦР амплификации и анализ данных проводили как описано в примере 5. В качестве референтного гена использовали ген актина быка/ коровы (ACT), приведенного в базе данных GenBank под номером АН001130.2. В качестве положительного контроля использовали ампликоны, получаемых при ПЦР на матрицах, представляющих собой плазмиды в известных концентрациях, содержащие последовательности генов НОХА10 и ACT. В качестве отрицательного контроля использовали деионизированную воду. Количество ПЦР продуктов - кДНК генов НОХА10 и ACT, полученных в результате амплификации, оценивали в режиме реального времени с помощью программного обеспечения амплификатора Bio-RadCFXManager 2.1. (Bio-Rad, USA).

Графики, полученные в результате анализа представлены на фиг. 16.

Из фигуры 16 следует, что в результате трансфекции клеток эндометрия матки коровы BEND генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-HOXA10, уровень специфической мРНК гена НОХА10 человека вырос многократно, что подтверждает способность вектора проникать в эукариотические клетки и экспрессировать ген НОХА10 на уровне мРНК. Представленные результаты подтверждают реализуемость способа применения генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-HOXA10 для повышения уровня экспрессии гена НОХА10 в клетках млекопитающих.

Пример 21.

Штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-IL11 или штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-LIF или штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-DICER или штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-HOXA10 или штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-WT1, несущий генотерапевтический ДНК-вектор, и способ его получения.

Конструирование штамма для наработки в промышленных масштабах генотерапевтического ДНК-вектора на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущего целевой ген, выбранный из группы генов: IL11, LIF, DICER, НОХА10, WT1, а именно штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-IL11, или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-LIF, или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-DICER, или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-HOXA10, или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-WT1, несущего генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-IL11, или VTvaf17-LIF, или VTvaf17-DICER, или VTvaf17-НОХА10, или VTvaf17-WT1 соответственно для его наработки с возможностью селекции без использования антибиотиков заключается в получении электрокомпетентных клеток штамма Escherichia coli SCS110-AF с проведением электропорации этих клеток генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-IL11, или ДНК-вектором VTvaf17-LIF, или ДНК-вектором VTvaf17-DICER, или ДНК-вектором VTvaf17-HOXA10 или ДНК-вектором VTvaf17-WT1, после чего клетки высеваются на чашки Петри с агаризованной селективной средой, содержащей дрожжевой экстракт, пептон, 6% сахарозы, а также 10 мкг/мл хлорамфеникола. При этом штамм Escherichia coli SCS110-AF для наработки генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17 или генотерапевтических ДНК-векторов на его основе с возможностью положительной селекции без использования антибиотиков получали путем конструирования линейного фрагмента ДНК, содержащего регуляторный элемент RNA-in транспозона Tn10 для селекции без применения антибиотиков размером 64 п.н., ген левансахаразы sacB, продукт которого обеспечивает селекцию на сахарозосодержащей среде размером 1422 п.н., ген устойчивости к хлорамфениколу catR, необходимый для отбора клонов штамма, в гомологичные последовательности, обеспечивающие процесс гомологичной рекомбинации в области гена rесА с одновременной его инактивацией размером 329 п.н. и 233 п.н., после чего проводили трансформацию клеток Escherichia coli путем электропорации и отбирали клоны, выжившие на среде, содержащей 10 мкг/мл хлорамфеникола. Полученные штаммы для наработки были внесены в коллекции Национального биоресурсного центра - Всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов (НБЦ ВКПМ), РФ и NCIMB Patent Deposit Service, UK c присвоением регистрационных номеров: штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-IL11 - регистрационный № ВКПМ В-13327, дата депонирования 12.11.2018, INTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORITY № NCIMB 43243, дата депонирования 08.11.2018, штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-LIF - регистрационный № ВКПМ В-13326, дата депонирования 12.11.2018, INTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORITY № NCIMB 43245, дата депонирования 08.11.2018, штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-DICER - регистрационный № ВКПМ В-13329, дата депонирования 12.11.2018, INTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORITY № NCIMB 43241, дата депонирования 08.11.2018, штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-HOXA10 - регистрационный № ВКПМ В-13328, дата депонирования 12.11.2018, INTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORITY № NCIMB 43242, дата депонирования 08.11.2018, штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-WT1 - регистрационный № ВКПМ В-13319, дата депонирования 12.11.2018, INTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORITY № NCIMB 43250, дата депонирования 08.11.2018.

Пример 22.

Способ масштабирования получения генотерапевтического ДНК-вектора на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущего целевой ген, выбранный из группы генов: IL11, LIF, DICER, HOXA10, WT1 до промышленного масштаба.

Для подтверждения технологичности получения и возможности производства в промышленных масштабах генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-IL11 (SEQ ID №1), или VTvaf17-LIF (SEQ ID №2), или VTvaf17-DICER (SEQ ID №3), или VTvaf17-HOXA10 (SEQ ID №4), или VTvaf17-WT1 (SEQ ID №5) проводили масштабную ферментацию штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-IL11, или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-LIF, или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-DICER, или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-HOXA10, или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-WT1, каждый из которых содержит генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17, несущий целевой ген, а именно IL11, или LIF, или DICER, или НОХА10, или WT1. Каждый штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-IL11, или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-LIF, или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-DICER, или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-HOXA10, или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-WT1 получали на базе штамма Escherichia coli SCS110-AF (Cell and Gene Therapy LLC, Великобритания; ПИТ, РФ) по примеру 21 путем электропорации компетентных клеток этого штамма генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-IL11, или VTvaf17-LIF, или VTvaf17-DICER, или VTvaf17-HOXA10, или VTvaf17-WT1, несущим целевой ген, а именно, IL11, или LIF, или DICER, или НОХА10, или WT1 с последующим высевом трансформированных клеток на чашки Петри с агаризованной селективной средой, содержащей дрожжевой экстракт, пептон, 6% сахарозы и отбором отдельных клонов.

Ферментацию полученного штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-IL11, несущего генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-IL11 проводили в ферментере объемом 10 л с последующим выделением генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-IL11.

Для ферментации штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-IL11 готовили среду, содержащую на 10 л: 100 г триптон, 50 г дрожжевой экстракт (Becton Dickinson, США), доводили водой до 8800 мл и автоклавировали при 121°С 20 мин, затем добавляли 1200 мл 50% (вес/объем) сахарозы. Далее засевали в колбу затравочную культуру штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-IL11 в объеме 100 мл. Инкубировали в шейкере-инкубаторе 16 ч при 30°С. Переносили затравочную культуру в ферментер Techfors S (Infers HT, Швейцария), растили до достижения стационарной фазы. Контроль осуществляли измерением оптической плотности культуры при длине волны 600 нм. Клетки осаждали центрифугированием 30 мин при 5000-10000g. Супернатант удаляли, клеточную массу ресуспендировали в 10% по объему фосфатно-солевого буфера. Повторно центрифугировали 30 мин при 5000-10000g. Супернатант удаляли, к клеточной массе добавляли раствор 20 мМ TrisCl, 1 мМ ЭДТА, 200 г/л сахароза, рН 8,0 в объеме 1000 мл, тщательно перемешивали до образования гомогенной суспензии. Добавляли раствор яичного лизоцима до конечной концентрации 100 мкг/мл. Инкубировали 20 мин на льду при бережном перемешивании. Далее, добавляли 2500 мл раствора 0,2 М NaOH, 10 г/л додецилсульфат натрия, инкубировали 10 мин на льду при бережном перемешивании, затем добавляли 3500 мл раствора 3 М ацетат натрия, 2 М уксусная кислота, рН 5-5,5, инкубировали 10 мин на льду при бережном перемешивании. Полученный образец центрифугировали 20-30 мин при 15000 g или более. Раствор аккуратно декантировали, от остатков осадка избавлялись фильтрацией через грубый фильтр (фильтровальную бумагу). Добавляли РНКазу A (Sigma, США) до конечной концентрации 20 нг/мл, инкубировали ночь 16 ч при комнатной температуре. Раствор центрифугировали 20-30 мин при 15000 g, затем фильтровали через мембранный фильтр с порами 0,45 мкм (Millipore, США). Далее проводили ультрафильтрацию через мембрану размером отсечения 100 кДа (Millipore, США) и разбавляли до начального объема буфером 25 мМ TrisCl, рН 7.0. Операцию повторяли три - четыре раза. Наносили раствор, на колонку с 250 мл сорбента DEAE sepharose HP (GE, США), уравновешенную раствором 25 мМ TrisCl, рН 7.0. После нанесения образца колонку промывали тремя объемами этого же раствора, а затем проводили элюцию генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-IL11 линейным градиентом от раствора 25 мМ TrisCl, рН 7.0 до раствора 25 мМ TrisCl, рН 7.0, 1 М NaCl в объеме пяти объемов колонки. Контроль элюции осуществляли по оптической плотности сходящего раствора при 260 нм. Хроматографические фракции, содержащие генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-IL11, объединяли и проводили гель-фильтрацию на сорбенте Superdex 200 (GE, США). Колонку уравновешивали фосфатно-солевым буфером. Контроль элюции осуществляли по оптической плотности сходящего раствора при 260 нм, фракции анализировали электрофорезом в агарозном геле. Фракции, содержащие генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-IL11 объединяли и хранили при -20°С. Для оценки воспроизводимости техпроцесса обозначенные технологические операции повторяли пятикратно. Все технологические операции для штаммов Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-LIF, или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-DICER, или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-HOXA10, или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-WT1 проводили аналогичным образом.

Воспроизводимость техпроцесса и количественные характеристики выхода конечного продукта подтверждают технологичность получения и возможность производства в промышленных масштабах генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-IL11, или VTvaf17-LIF, или VTvaf17-DICER, или VTvaf17-НОХА10 или VTvaf17-WT1.

Таким образом, созданный генотерапевтический ДНК-вектор с целевым геном может быть использован для введения в клетки организма животных и человека, характеризующихся сниженной или недостаточной экспрессией белка, кодируемого данным геном, обеспечивая таким образом достижение терапевтического эффекта.

Задача, поставленная в данном изобретении, а именно; конструирование генотерапевтических ДНК-векторов для повышения уровня экспрессии генов IL11, LIF, DICER, HOXA10, WT1, сочетающих в себе следующие свойства:

Эффективность повышения экспрессии целевых генов в эукариотических клетках;

Возможность безопасного применения для генетической терапии человека и животных за счет отсутствия в составе генотерапевтического ДНК-вектора регуляторных элементов, представляющих собой нуклеотидные последовательности вирусных геномов;

Возможность безопасного применения для генетической терапии человека и животных за счет отсутствия в составе генотерапевтического ДНК-вектора генов антибиотикорезистентности.

Технологичность получения и возможность наработки в штаммах в промышленных масштабах;

а также задача по конструированию штаммов, несущих эти генотерапевтические ДНК-вектора для производства этих генотерапевтических ДНК-векторов решена, что подтверждается примерами:

для п. I - пример 1, 2, 3, 4, 5; 6; 7; 8; 9; 10; 11; 12; 13; 14; 15; 16; 17; 18; 19; 20

для п. II - пример 1, 2, 3, 4, 5

для п. III - пример 1, 2, 3, 4, 5

для п. IV - пример 21, 22.

Промышленная применимость:

Все представленные выше примеры подтверждают промышленную применимость предлагаемого генотерапевтического ДНК-вектора на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущего целевой ген, выбранный из группы генов: ген IL11, ген LIF, ген DICER, ген НОХА10, ген WT1 для повышения уровня экспрессии этих целевых генов, штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-IL11 или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-LIF или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-DICER или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-HOXA10 или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-WT1 несущего генотерапевтический ДНК-вектор, способа его получения, способа производства в промышленных масштабах генотерапевтического ДНК-вектора.

Перечень сокращений

VTvaf17 - вектор генотерапевтический, не содержащий последовательностей вирусных геномов и маркеров антибиотикорезистентности (vectortherapeuticvirus-antibiotic-free),

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота,

кДНК - комплементарная дезоксирибонуклеиновая кислота,

РНК - рибонуклеиновая кислота,

мРНК - матричная рибонуклеиновая кислота,

п.н. - пар нуклеотидов,

ПЦР - полимеразная цепная реакция,

мл - миллилитр, мкл - микролитр,

куб. мм - кубический миллиметр,

л - литр,

мкг - микрограмм,

мг - миллиграмм,

г - грамм,

мкМ - микромоль,

мМ - миллимоль,

мин - минута,

сек - секунда,

об/мин - обороты в минуту,

нм - нанометр,

см - сантиметр,

мВт - милливатт,

о.е. ф-относительная единица флуоресценции,

РВС - фосфатно-солевой буфер.

Список литературы

1. Молекулярная биология, 2011, том 45, №1, с. 44-55.

2. Qian L. Decreased interleukin-11 levels in the semen of infertile males. Cytokine. 2018 Aug; 108:57-59.

3. Sabzevary-Ghahfarokhi M, Shohan M, Shirzad H, Rahimian G, Bagheri N, Soltani A, Deris F, Ghatreh-Samani M, Razmara E. The expression analysis of Fra-1 gene and IL11 protein in Iranian patients with ulcerative colitis. BMC Immunol. 2018 Jun 18; 19(1):17

4. Ragni MV, Novelli ЕМ, Murshed A, Merricks EP, Kloos MT, Nichols TC. Phase II prospective open-label trial of recombinant interleukin-11 in desmopressin-unresponsive von Willebrand disease and mild or moderate haemophilia A. Thromb Haemost. 2013 Feb; 109(2):248-54.

5. Mackiewicz J, Kotlarski M, Dondajewska E, Nowicka-Kotlarska A, Krokowicz , Kazimierczak U. Cell-based Hyper-interleukin 6 or Hyper-interleukin 11 secreting vaccines combined with low dose cyclophosphamide in an orthotopic murine prostate cancer model. Contemp Oncol (Pozn). 2015; 19(3);187-94.

6. Dimitriadis E et al. // Hum. Reprod. 2005; 11(6); 613-30.

7. Serafini P et al. // Int J Gynecol Obstet 2008; 102:23-7.

8. Foronjy RF, Dabo AJ, Cummins N, Geraghty P. Leukemia inhibitory factor protects the lung during respiratory syncytial viral infection. BMC Immunol. 2014 Oct 3;15:41.

9. Vela L, Caballero I, Fang L, Liu Q, de Los Frailes M. Discovery of Enhancers of the Secretion of Leukemia Inhibitory Factor for the Treatment of Multiple Sclerosis. J Biomol Screen. 2016 Jun; 21(5):437-45.

10. Slaets H, Hendriks JJA, Van den Haute C, Coun F, Baekelandt V, Stinissen P. CNS-targeted LIF expression improves therapeutic efficacy and limits autoimmune-mediated demyelination in a model of multiple sclerosis. Mol Ther 2010; 18:684-691.

11. Kawahara Y. Human diseases caused by germline and somatic abnormalities in microRNA and microRNA-related genes. Congenit Anom (Kyoto). 2014 Feb; 54(1):12-21.

12. Kim G.J., Georg I., Scherthan H., Merkenschlager M., Guillou F., Scherer G., Barrionuevo F. (2010) Dicer is required for Sertoli cell function and survival. Int. J. Dev. Biol. 54, 867-875.

13. Taylor HS. 2000. The role of HOX genes in the development and function of the female reproductive tract. Semin Reprod Med 18:81-89.

14. Bagot CN, Troy PJ, Taylor HS. Alteration of maternal Hoxa10 expression by in vivo gene transfection affects implantation. GeneTher. 2000:7:1378-84.

15. Wang H, Li G, Zhang J, Gao F, Li W, Qin Y, Chen ZJ. Novel WT1 Missense Mutations in Han Chinese Women with Premature Ovarian Failure. Sci Rep. 2015 Sep 11; 5:13983. doi: 10.1038/srepl 3983).

16. Seabra CM, Quental S, Lima AC, Carvalho F, Fernandes S, Pereira I, Silva J, Marques PI, Sousa M, Barros A, Seixas S, Amorim A, Lopes AM. The mutational spectrum of WT1 in male infertility. J Urol. 2015 May; 193(5):1709-15.

17. Nathan A, Reinhardt P, Kruspe D, et al. The Wilms tumor protein WT1 contributes to female fertility by regulating oviductal proteostasis. Human Molecular Genetics. 2017; 26(9):1694-1705.

18. Guideline on the quality, non-clinical and clinical aspects of gene therapy medicinal Products EMA/CAT/80183/2014.

19. Li L, Petrovsky N. Molecular mechanisms for enhanced DNA vaccine immunogenicity. Expert Rev Vaccines. 2016; 15(3):313-29.

20. Reflection paper on design modifications of gene therapy medicinal products during development / 14 December 2011 EMA/CAT/GTWP/44236/2009 Committee for advanced therapies.

21. Draft Guideline on the quality, non-clinical and clinical aspects of gene therapy medicinal products, http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/Scientific_guideline/2015/05/WC500187020.pdf.

22. Mairhofer J, Grabherr R. Rational vector design for efficient non-viral gene delivery: challenges facing the use of plasmid DNA. Mol Biotechnol. 2008. 39(2):97-104.

23. Hornstein BD, Roman D, Engevik MA, Zechiedrich L. Effects of Circular DNA Length on Transfection Efficiency by Electroporation into HeLa Cells. ed. PLoS ONE. 2016; 11(12):e0167537. doi:10.1371/journal.pone.0167537.

24. WO 1996018372 A2 «Cationic amphiphiles and plasmids for intracellular delivery of therapeutic molecules».

25. WO 2001094605 A3 «Recombinant aav vectors for gene therapy of obesity».

26. US 007732417 B2 «Methods and compositions for RNA interference using recombinant Dicer and Argonaut».

27. CN 104531763 A «Method for producing transgenic pigs through overexpression HOXA10 genes».

28. US 20150328298 A1 «WT1 Vaccine».

Изобретение относится к генной инженерии и может быть использовано в биотехнологии для создания препаратов генной терапии. Создан генотерапевтический ДНК-вектор на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущий целевой ген, выбранный из группы генов IL11, LIF, DICER, HOXA10, WT1, для повышения уровня экспрессии этого целевого гена в организме человека и животных, при этом генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-IL11, или VTvaf17-LIF, или VTvaf17-DICER, или VTvaf17-HOXA10, или VTvaf17-WT1 имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID №1, или SEQ ID №2, или SEQ ID №3, или SEQ ID №4, или SEQ ID №5 соответственно. Изобретение обеспечивает возможность его безопасного применения для генетической терапии человека и животных. 16 н.п. ф-лы, 16 ил., 22 пр.

1. Генотерапевтический ДНК-вектор на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17 для лечения заболеваний, характеризующихся нарушением механизма адгезии, прикрепления, имплантации и аппозиции бластоцисты, развитием женского бесплодия, обусловленным несостоятельностью эндометрия в период имплантации бластоцисты, в том числе при выполнении процедур экстракорпорального оплодотворения, при этом генотерапевтический ДНК-вектор содержит кодирующую часть целевого гена IL11, клонированную в генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17, с получением генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-IL11, с нуклеотидной последовательностью SEQ ID №1.

2. Генотерапевтический ДНК-вектор на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17 для лечения заболеваний, характеризующихся нарушением механизма адгезии, прикрепления, имплантации и аппозиции бластоцисты, развитием женского бесплодия, обусловленным несостоятельностью эндометрия в период имплантации бластоцисты, в том числе при выполнении процедур экстракорпорального оплодотворения, при этом генотерапевтический ДНК-вектор содержит кодирующую часть целевого гена LIF, клонированную в генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17, с получением генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-LIF, с нуклеотидной последовательностью SEQ ID №2.

3. Генотерапевтический ДНК-вектор на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17 для лечения заболеваний, характеризующихся нарушением механизма адгезии, прикрепления, имплантации и аппозиции бластоцисты, развитием женского бесплодия, обусловленным несостоятельностью эндометрия в период имплантации бластоцисты, в том числе при выполнении процедур экстракорпорального оплодотворения, при этом генотерапевтический ДНК-вектор содержит кодирующую часть целевого гена DICER, клонированную в генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17, с получением генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-DICER, с нуклеотидной последовательностью SEQ ID №3.

4. Генотерапевтический ДНК-вектор на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17 для лечения заболеваний, характеризующихся нарушением механизма адгезии, прикрепления, имплантации и аппозиции бластоцисты, развитием женского бесплодия, обусловленным несостоятельностью эндометрия в период имплантации бластоцисты, в том числе при выполнении процедур экстракорпорального оплодотворения, при этом генотерапевтический ДНК-вектор содержит кодирующую часть целевого гена HOXA10, клонированную в генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17, с получением генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-HOXA10, с нуклеотидной последовательностью SEQ ID №4.

5. Генотерапевтический ДНК-вектор на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17 для лечения заболеваний, характеризующихся нарушением механизма адгезии, прикрепления, имплантации и аппозиции бластоцисты, развитием женского бесплодия, обусловленным несостоятельностью эндометрия в период имплантации бластоцисты, в том числе при выполнении процедур экстракорпорального оплодотворения, при этом генотерапевтический ДНК-вектор содержит кодирующую часть целевого гена WT1, клонированную в генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17, с получением генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-WT1, с нуклеотидной последовательностью SEQ ID №5.

6. Генотерапевтический ДНК-вектор на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущий целевой ген IL11, LIF, DICER, HOXA10, WT1 по пп. 1-4 или 5, отличающийся тем, что каждый из созданных генотерапевтических ДНК-векторов: VTvaf17-IL11, или VTvaf17-LIF, или VTvaf17-DICER, или VTvaf17-HOXA10, или VTvaf17-WT1 по пп. 1-4 или 5, за счет ограниченного размера векторной части VTvaf17, не превышающей 3200 п.н., обладает способностью эффективно проникать в клетки человека и животных и экспрессировать клонированный в него целевой ген IL11, или LIF, или DICER, или HOXA10, или WT1.

7. Генотерапевтический ДНК-вектор на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущий целевой ген IL11, LIF, DICER, HOXA10, WT1 по пп. 1-4 или 5, отличающийся тем, что в составе каждого из созданных генотерапевтических ДНК-векторов: VTvaf17-IL11, или VTvaf17-LIF, или VTvaf17-DICER, или VTvaf17-HOXA10, или VTvaf17-WT1 по пп. 1-4 или 5, в качестве структурных элементов используются нуклеотидные последовательности, которые не являются генами антибиотикорезистентности, вирусными генами и регуляторными элементами вирусных геномов, обеспечивая возможность его безопасного применения для генетической терапии человека и животных.

8. Способ получения генотерапевтического ДНК-вектора на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущего целевой ген IL11, LIF, DICER, HOXA10, WT1 по пп. 1-4 или 5, заключающийся в том, что каждый из генотерапевтических ДНК-векторов: VTvaf17-IL11, или VTvaf17-LIF, или VTvaf17-DICER, или VTvaf17-HOXA10, или VTvaf17-WT1 получают следующим образом: кодирующую часть целевого гена IL11, или LIF, или DICER, или HOXA10, или WT1 клонируют в генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17 и получают генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-IL11, SEQ ID №1, или VTvaf17-LIF, SEQ ID №2, или VTvaf17-DICER, SEQ ID №3, или VTvaf17-HOXA10, SEQ ID №4, или VTvaf17-WT1, SEQ ID №5 соответственно, при этом кодирующую часть целевого гена IL11, или LIF, или DICER, или HOXA10, или WT1 получают путем выделения суммарной РНК из биологического образца ткани человека с последующим проведением реакции обратной транскрипции и ПЦР-амплификации с использованием созданных олигонуклеотидов и расщеплением продукта амплификации соответствующими эндонуклеазами рестрикции, причем клонирование в генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17 проводят по сайтам рестрикции SalI и KpnI, или по сайтам рестрикции BamHI и EcoRI, причем селекцию проводят без антибиотиков,

при этом при получении генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-IL11, SEQID №1 для проведения реакции обратной транскрипции и ПЦР-амплификации, в качестве созданных для этого олигонуклеотидов используют олигонуклеотиды

IL11_F AGGATCCCTGTGGGGACATGAACTGTG

IL11_R AGTGAATTCTCACAGCCGAGTCTTCAGC,

а расщепление продукта амплификации и клонирование кодирующей части гена IL11 в генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17 проводят с использованием эндонуклеаз рестрикции BamHI и EcoRI,

причем при получении генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-LIF, SEQID №2 для проведения реакции обратной транскрипции и ПЦР-амплификации, в качестве созданных для этого олигонуклеотидов используют олигонуклеотиды

LIF_F AGGATCCACCATGAAGGTCTTGGCGGCAG

LIF_R TATGAATTCTAGAAGGCCTGGGCCAAC,

а расщепление продукта амплификации и клонирование кодирующей части гена LIF в генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17 проводят с использованием эндонуклеаз рестрикции BamHI и EcoRI,

причем при получении генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17- DICER, SEQID №3 для проведения реакции обратной транскрипции и ПЦР-амплификации, в качестве созданных для этого олигонуклеотидов используют олигонуклеотиды

DICER_F ATCGTCGACGAGGAGATCTGCCGCCGCGATCGCC

DICER_R TCGGTACCTAGCTATTGGGAACCTGAGGTTG,

а расщепление продукта амплификации и клонирование кодирующей части гена DICER в генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17 проводят с использованием эндонуклеаз рестрикции SalI и KpnI,

причем при получении генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17- HOXA10, SEQID №4 для проведения реакции обратной транскрипции и ПЦР-амплификации, в качестве созданных для этого олигонуклеотидов используют олигонуклеотиды

HOXA10_F CCGATATCGAGGAGATCTGCCGCCGCGATCGCC

HOXA10_R GGGAATTCTAGGAAAAATTAAAGTTGGCTG,

а расщепление продукта амплификации и клонирование кодирующей части гена HOXA10 в генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17 проводят с использованием эндонуклеаз рестрикции EcoRV и EcoRI,

причем при получении генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-WT1, SEQID №5 для проведения реакции обратной транскрипции и ПЦР-амплификации, в качестве созданных для этого олигонуклеотидов используют олигонуклеотиды

WT1_F ATCGTCGACTGGATCCGGTACCGAGGAGATCTG

WT1_R GGGAATTCTAAAGCGCCAGCTGGAGTTTG,

а расщепление продукта амплификации и клонирование кодирующей части гена WT1 в генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17 проводят с использованием эндонуклеаз рестрикции SalI и EcoRI.

9. Способ использования генотерапевтического ДНК-вектора на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущего целевой ген IL11, LIF, DICER, HOXA10, WT1 по пп. 1-4 и/или 5 для лечения заболеваний, характеризующихся нарушением механизма адгезии, прикрепления, имплантации и аппозиции бластоцисты, развитием женского бесплодия, обусловленным несостоятельностью эндометрия в период имплантации бластоцисты, в том числе при выполнении процедур экстракорпорального оплодотворения, заключающийся в трансфекции выбранным генотерапевтическим ДНК-вектором, несущим целевой ген на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, или несколькими выбранными генотерапевтическими ДНК-векторами, несущими целевые гены на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, из созданных генотерапевтических ДНК-векторов, несущих целевые гены на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, клеток органов и тканей пациента или животного, и/или во введении в органы и ткани пациента или животного аутологичных клеток этого пациента или животного, трансфицированных выбранным генотерапевтическим ДНК-вектором, несущим целевой ген на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17 или несколькими выбранными генотерапевтическими ДНК-векторами, несущими целевые гены на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, из созданных генотерапевтических ДНК-векторов, несущих целевые гены на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, и/или во введении в органы и ткани пациента или животного выбранного генотерапевтического ДНК-вектора, несущего целевой ген на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17 или нескольких выбранных генотерапевтических ДНК-векторов, несущих целевые гены на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, из созданных генотерапевтических ДНК-векторов, несущих целевые гены на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, или в сочетании обозначенных способов.

10. Способ получения штамма для производства генотерапевтического ДНК-вектора по пп. 1-4 или 5 для лечения заболеваний, характеризующихся нарушением механизма адгезии, прикрепления, имплантации и аппозиции бластоцисты, развитием женского бесплодия, обусловленным несостоятельностью эндометрия в период имплантации бластоцисты, в том числе при выполнении процедур экстракорпорального оплодотворения, заключающийся в получении электрокомпетентных клеток штамма Escherichia coli SCS110-AF с последующим проведением электропорации этих клеток генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-IL11, или ДНК-вектором VTvaf17-LIF, или ДНК-вектором VTvaf17-DICER, или ДНК-вектором VTvaf17-HOXA10, или ДНК-вектором VTvaf17-WT1, после чего клетки высеивают на чашки Петри с агаризованной селективной средой, содержащей дрожжевой экстракт, пептон, 6% сахарозы, а также 10 мкг/мл хлорамфеникола с получением в результате штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-IL11, или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-LIF, или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-DICER, или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-HOXA10, или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-WT1.

11. Штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-IL11, полученный способом по п. 10, несущий генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-IL11, для его наработки с возможностью селекции без использования антибиотиков при получении генотерапевтического ДНК-вектора для лечения заболеваний, характеризующихся нарушением механизма адгезии, прикрепления, имплантации и аппозиции бластоцисты, развитием женского бесплодия, обусловленным несостоятельностью эндометрия в период имплантации бластоцисты, в том числе при выполнении процедур экстракорпорального оплодотворения.

12. Штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-LIF, полученный способом по п. 10, несущий генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-LIF, для его наработки с возможностью селекции без использования антибиотиков при получении генотерапевтического ДНК-вектора для лечения заболеваний, характеризующихся нарушением механизма адгезии, прикрепления, имплантации и аппозиции бластоцисты, развитием женского бесплодия, обусловленным несостоятельностью эндометрия в период имплантации бластоцисты, в том числе при выполнении процедур экстракорпорального оплодотворения.

13. Штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-DICER, полученный способом по п. 10, несущий генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-DICER, для его наработки с возможностью селекции без использования антибиотиков при получении генотерапевтического ДНК-вектора для лечения заболеваний, характеризующихся нарушением механизма адгезии, прикрепления, имплантации и аппозиции бластоцисты, развитием женского бесплодия, обусловленным несостоятельностью эндометрия в период имплантации бластоцисты, в том числе при выполнении процедур экстракорпорального оплодотворения.

14. Штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-HOXA10, полученный способом по п. 10, несущий генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-HOXA10, для его наработки с возможностью селекции без использования антибиотиков при получении генотерапевтического ДНК-вектора для лечения заболеваний, характеризующихся нарушением механизма адгезии, прикрепления, имплантации и аппозиции бластоцисты, развитием женского бесплодия, обусловленным несостоятельностью эндометрия в период имплантации бластоцисты, в том числе при выполнении процедур экстракорпорального оплодотворения.

15. Штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-WT1, полученный способом по п. 10, несущий генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-WT1, для его наработки с возможностью селекции без использования антибиотиков при получении генотерапевтического ДНК-вектора для лечения заболеваний, характеризующихся нарушением механизма адгезии, прикрепления, имплантации и аппозиции бластоцисты, развитием женского бесплодия, обусловленным несостоятельностью эндометрия в период имплантации бластоцисты, в том числе при выполнении процедур экстракорпорального оплодотворения.

16. Способ производства в промышленных масштабах генотерапевтического ДНК-вектора на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущего целевой ген IL11, или LIF, или DICER, или HOXA10, или WT1, по пп. 1-4 или 5 для лечения заболеваний, характеризующихся нарушением механизма адгезии, прикрепления, имплантации и аппозиции бластоцисты, развитием женского бесплодия, обусловленным несостоятельностью эндометрия в период имплантации бластоцисты, в том числе при выполнении процедур экстракорпорального оплодотворения, заключающийся в том, что генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-IL11, или генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-LIF, или генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-DICER, или генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-HOXA10, или генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-WT1 получают путем того, что засевают в колбу с приготовленной средой затравочную культуру, выбранную из штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-IL11, или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-LIF, или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-DICER, или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-HOXA10, или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-WT1, затем инкубируют затравочную среду в шейкере-инкубаторе и переносят ее в промышленный ферментер, после чего растят до достижения стационарной фазы, затем выделяют фракцию, содержащую целевой ДНК-продукт, многостадийно фильтруют и очищают хроматографическими методами.