Генотерапевтический ДНК-вектор на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущий целевой ген, выбранный из группы генов COL1A1, COL1A2, P4HA1, P4HA2, COL7A1, CLCA2, ELN, PLOD1 для повышения уровня экспрессии этих целевых генов, способ его получения и применения, штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-COL1A1, или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-COL1A2, или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-P4HA1, или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-P4HA2, или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-COL7A1, или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-CLCA2, или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-ELN, или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17- PLOD1, несущий генотерапевтический ДНК-вектор, способ его получения, способ производства в промышленных масштабах генотерапевтического ДНК-вектора Российский патент 2020 года по МПК C12N15/12 C12N15/70 C12N1/21 A61K48/00 C12R1/21 

Область техники

Изобретение относится к генной инженерии и может быть использовано в биотехнологии, медицине и сельском хозяйстве для создания препаратов генной терапии.

Уровень техники

Генная терапия - это современный медицинский подход, направленный на лечение наследственных и приобретенных заболеваний путем введения нового генетического материала в клетки пациента с целью компенсации или подавления функции мутантного гена и/или исправления генетического дефекта. Конечным продуктом экспрессии гена может являться молекула РНК или белка. Однако осуществление большей части физиологических процессов в организме связано с функциональной активностью белковых молекул, тогда как молекулы РНК являются либо промежуточным продуктом в синтезе белков, либо осуществляют регуляторные функции. Таким образом целью генной терапии является, в большинстве случаев, введение в организм генов, обеспечивающих транскрипцию и последующую трансляцию белковых молекул, кодируемых этими генами. В рамках описания настоящего изобретения под экспрессией гена подразумевается продукция белковой молекулы, аминокислотная последовательность которой кодируется этим геном.

Гены COL1A1, COL1A2, P4HA1, P4HA2, COL7A1, CLCA2, ELN, PLOD1, входящие в группу генов, играют ключевую роль в ряде процессов в организме человека и животных. Эти гены участвуют в формировании внеклеточного матрикса кожи и других органов, а также в ряде других процессов.

Основными компонентами внеклеточного матрикса дермы являются эластичные волокна, коллаген и протеогликаны (27). Эластичные волокна состоят из фибриллин-богатых микрофибрилл, гликопротеинов, эластинов и некоторых других белков (Kielty et al., 2002). Компоненты внеклеточного матрикса дермы связаны между собой посредством гиалуроновой кислоты, формируя таким образом дермальную сеть (Naylor et al., 2011). Длинные коллагеновые волокна, образуемые коллагеном I и III типов, переплетаются между собой, формируя внутридермальную сеть, которая заякорена на границе дермы и эпидермиса коллагеном VII типа (12).

При старении кожи, которое преимущественно обусловлено внутренними механизмами, коллаген и эластичные волокна дермы формируют ячеистую структуру (22). При старении, вызванном внешними факторами, как, например, под действием ультрафиолета, происходит утрата коллагенов I, III и, что наиболее значимо, VII типа (3; 30). Кроме того, длинные коллагеновые фибриллы, эластичные волокна, гликопротеины и глюкозоаминогликаны утрачивают способность формировать функциональную сеть внеклеточного матрикса дермы, вместо этого они образуют неструктурированные фрагменты в дерме (22). Эти изменения ВКМ усугубляются действием эластаз, которые вырабатываются нейтрофилами, мигрирующими в дерму в результате воспаления или воздействия ультрафиолета (14), а также активацией матриксных металлопротеиназ.

Помимо старения кожи, которое является в большинстве случаев естественным процессом, внеклеточный матрикс дермы может быть вовлечен в патогенез различных заболеваний, при этом нарушения могут быть прямо или косвенно связаны с экспрессий различных генов, участвующих в его формировании. Более того, поскольку большинство молекул внеклеточного матрикса участвуют в различных биологических процессах, не ограничивающихся кожей, патологические и неблагоприятные для организма состояния, вызванные недостаточной экспрессией ряда генов, могут иметь проявления в виде нарушения структуры кожи, которые, тем не менее, не ограничиваются только этой тканью. Например, семейство белков коллагенов, участвует в структурной организации и метаболизме многих тканей в организме, включая хрящи, кости, сухожилия, кожу и белую часть глаза (склеру). Было обнаружено, что отдельные мутации в генах, кодирующих коллагены (например, I, III или V типа) или коллаген-модифицирующие ферменты (например, лизилгидроксилаза, коллагеназа) вызывают разные формы синдрома Элерса-Данлоса, которые влияют на соединительные ткани (системная дисплазия соединительной ткани), поддерживающие кожу, кости, кровеносные сосуды и другие органы. Симптомы и признаки этого заболевания варьируют в широких пределах. Преобладающие симптомы включают гиперподвижность суставов, образование патологических рубцов и нарушение ранозаживляющей активности, ломкость сосудов и бархатистую, гиперрастяжимую кожу.

Коллаген типа I является наиболее распространенной формой коллагена в организме человека. Коллаген типа I состоит из двух про-α1 (I) цепей и одной pro-α2 (I) цепи. Ген COL1A1 кодирует pro-α1 (I) цепь, ген COL1A2 - pro-α2 (I).

Описана мутация в гене COL1A1, которая вызывает инфантильный кортикальный гиперостоз или болезнь Каффи. Это состояние характеризуется отеком мягких тканей (например, мышц), болью и чрезмерным образованием новой костной ткани (гиперостоз). Отклонения костей в основном затрагивают челюстную кость, ключицы (ключицы) и диафизы длинных костей конечностей.

Другим наследственным заболеванием, вызванным мутациями в генах коллагенов и вызывающим диффузную ненормальную хрупкость костей иногда сопровождающуюся нейросенсорной тугоухостью, голубыми склерами, несовершенным дентиногенезом и гипермобильностью суставов, является несовершенный остеогенез. У 90% людей с одним из основных типов заболевания имеются мутации в генах COL1A1 или COL1A2. При этом генотерапевтический подход обсуждается как одно из перспективных направлений терапии данного синдрома (Niyibizi et al., 2000). Также описан клинический случай экспериментального лечения, когда пациенту с несовершенным остеогенезом были введены мезенхимальные стволовые клетки костного мозга, экспрессирующие нормальные гены коллагенов, в результате чего был достигнут заметный терапевтический эффект (18).

Коллаген типа VII является основным структурным компонентом в коже, входит в состав закрепляющих фибрилл. Эти фибриллы находятся в области, которая представляет собой двухслойную мембрану, расположенную между эпидермисом и дермой. Коллагеновые фибриллы удерживают два слоя кожи вместе, соединяя мембрану эпидермального основания с дермой.

Коллаген VII типа кодируется геном COL7A1. Три белковые цепи pro-α1 (VII) скручиваются вместе, образуя трехцепочечную молекулу проколлагена. Молекулы проколлагена секретируются клеткой и обрабатываются ферментами для удаления дополнительных сегментов белка с концов. Как только эти концевые сегменты удалены формируются длинные тонкие пучки зрелого коллагена VII.

Мутации в гене COL7A1 вызывают буллезный эпидермолиз дистрофического типа. Буллезные поражения чаще всего возникают в зонах, подверженных незначительному травмированию, например, разгибательные поверхности локтей и тыльные поверхности рук и ног. При заживлении возникают шрамы, поверхностные эпидермальные кисты и гиперпигментация. У некоторых пациентов наблюдается дистрофия ногтей. Часто встречаются внекожные проявления, включающие поражения желудочно-кишечного и мочеполового трактов, внешних оболочек глаза, хроническую анемию, остеопороз, задержку роста. У пациентов с булезным эпидермолизом наблюдается высокий риск онкологических заболеваний, в частности образования агрессивных плоскоклеточных карцином. По данным международной ассоциации DEBRA International в мире рождается один больной на 50-100 тысяч человек.

Генотерапевтические подходы к лечению буллезного эпидермолиза включают различные экспериментальные подходы. В ряде работ для коррекции мутаций в гене COL7A1 были успешно использованы ex vivo технологии редактирования генома (Mencía et al., 2018), микроинъекции линейных молекул ДНК, кодирующих ген COL7A1 (19), интеграция кДНК с использованием ферментов-интеграз (23), интрадермальные инъекции лентивирусных векторов (34), технология репарации мутаций на основе TALEN нуклеаз (24), а также введение аутологичных клеток - фибробластов или кератиноцитов, модифицированных с использованием различных ретровирусных векторов (11, 6, 7). В настоящее время клинические испытания подобных подходов находятся на различных этапах исследований (NCT01263379, NCT02810951).

Важным этапом в формировании и стабилизации коллагеновых молекул являются посттрансляционные модификации - гидроксилирование пролина, необходимое для стабилизации тройной спирали коллагена, а также гидроксилирование лизина для последующего образования ковалентных связей между молекулами коллагена при сборке коллагеновых фибрилл. Ферменты, которые осуществляют эти процессы модификаций - пролил-4-гидроксилаза и лизил-5-гидроксилаза соответственно.

Фермент пролил-4-гидроксилаза состоит из 2-х альфа и 2-х бета субъединиц. Альфа субъединицы бывают нескольких типов и кодируются генами P4HA1 и P4HA2. Мутации в гене P4HA1 могут являться причиной одной из форм синдрома Элерса-Данлоса, описанного выше. Также описана мутация в гене P4HA1 человека, которая вызывает уникальный фенотип патологии, характеризующийся рано проявляющейся суставной гипермобильностью, суставными контрактурами, мышечной слабостью и дисплазией костей, а также близорукостью (35). Описано, что курение вызывает супрессию экспрессии гена P4HA1. Авторы работы связывают этот феномен с индукцией нарушений метаболизма коллагена в стенках сосудов курильщиков, и, как следствие, повышением частоты атеросклероза и аневризм (25). Мутации в гене P4HA2 вызывают миопию (21). Также супрессия транскрипции гена P4HA2 происходит в клетках лимфомы, что может быть связано с патогенезом онкологического процесса (9). Изменение экспрессии P4HA1 предлагается как один из способов скрининга эффективности антивозрастных косметических субстанций, полученных из растительного сырья (28).

Наряду с коллагеном в межклеточном матриксе соединительной ткани содержится большое количество эластина - белка, кодируемого геном ELN. Эластин выполняет важные функции в органах, подверженных постоянному растяжению и сжатию, например, в артериях, легких, коже, сухожилиях, различных сфинктерах (39). Эластиновые и коллагеновые волокна помогают органам восстанавливать исходные размеры после растяжения, например, при защемлении кожи или после опустошения мочевого пузыря (38). При снижении образования нормальной формы эластина поперечные сшивки между волокнами образуются в недостаточном количестве или не образуются вообще. Вследствие этого у эластических тканей снижается предел прочности на разрыв и появляются такие нарушения, как истончённость, вялость, растяжимость, т.е. утрачиваются их резиноподобные свойства. Клинически такие нарушения могут проявляться кардиоваскулярными изменениями (аневризмы и разрывы аорты, дефекты клапанов сердца), частыми пневмониями и эмфиземой лёгких (36). При нарушении синтеза эластина в организме в результате мутации гена ELN развивается суправульвулярный аортальный стеноз (Ewart et al., 1994). При этом генно-инженерный подход с использованием вирусных векторов, экспрессирующих ген ELN, был успешно применен для модификации клеток для клеточной терапии, направленной на заживление повреждения мягких тканей у лабораторных животных (16).

Ген PLOD1 кодирует фермент лизилгидроксилазу 1. Этот фермент модифицирует лизин с образованием гидроксилизина, Гидроксилизин в молекулах коллагена необходим для формирования поперечных связей между волокнами коллагена. Как и большинство предыдущих генов, связанных с синтезом и формированием внеклеточного матрикса, мутации в гене PLOD1 связаны с развитием синдрома Элерса-Данлоса (van Dijk et al., 2017). Также есть свидетельства того, что полиморфизм этого гена может быть ассоциирован с плотностью костной ткани и рисками остеопороза (31).

Ген CLCA2 кодирует белок-регулятор Са каналов и экспрессируется в различных эпителиальных тканях (в коже, эпителии роговицы глаза, пищевода, гортани и вагинальном эпителии) (2). В экспериментах на крысах было показано, что экспрессия этого гена в кератиноцитах кожи сильно снижается под воздействием ультрафиолета (1). При исследовании механизмов патогенеза атопического дерматита исследователи выяснили, что экспрессия этого гена необходима для защиты клеток каратиноцитов от апоптоза в условиях гиреросмотического шока (вызванного недостаточным количество воды), при этом при подавлении экспрессии CLCA2 происходит нарушение адгезии клеток в эпидермисе. Таким образом ген CLCA2 необходим для адаптации и выживания эпителиальных клеток в условиях недостаточной влажности (29).

Таким образом предшествующий уровень техники свидетельствует о том, что мутации в генах COL1A1, COL1A2, P4HA1, P4HA2, COL7A1, CLCA2, ELN, PLOD1 или недостаточная экспрессия белков, кодируемых этими генами, связаны с развитием спектра заболеваний, включающих в себя, но не ограничивающихся, наследственными и приобретенными патологическими состояниями связанными с нарушениями в организации внеклеточного матрикса кожи и других органов, влекущими за собой как патологические процессы, так и неблагоприятные состояния, которые укладываются в границы общепринятой нормы, но могут быть изменены в лучшую сторону, а также процессами не связанными напрямую с внеклеточным матриксом. Этим обусловлено объединение генов COL1A1, COL1A2, P4HA1, P4HA2, COL7A1, CLCA2, ELN, PLOD1 в рамках данного патента в группу генов. Генетические конструкции, обеспечивающие экспрессию белков, кодируемых генами из группы COL1A1, COL1A2, P4HA1, P4HA2, COL7A1, CLCA2, ELN, PLOD1, могут быть использованы для разработки лекарственных препаратов для предотвращения и терапии различных заболеваний и патологических и неблагоприятных состояний.

Более того, приведенные данные свидетельствуют о том, что недостаточная экспрессия белков, кодируемых генами COL1A1, COL1A2, P4HA1, P4HA2, COL7A1, CLCA2, ELN, PLOD1 входящими в группу генов, связана не только с патологическими состояниями, но и с предрасположенность к их развитию. Также приведенные данные свидетельствуют о том, что недостаточная экспрессия данных белков может не проявляться в явном виде в форме патологии, которая может быть однозначно описана в рамках существующих стандартов клинической практики (например, с применением кода МКБ), однако при этом вызывать состояния, которые неблагоприятны для человека и животных и связанны с ухудшением качества жизни.

Анализ подходов для повышения экспрессии целевых генов подразумевает возможность использования различных генотерапевтических векторов.

Генотерапевтические векторы разделяют на вирусные, клеточные и ДНК-векторы (8). В последнее время в генной терапии всё большее внимание уделяется разработке невирусных систем доставки генетического материала, среди которых лидируют плазмидные векторы. Плазмидные векторы лишены недостатков, присущих клеточным и вирусным векторам. В клетке-мишени они существуют в эписомальной форме, не интегрируют в геном, производство их достаточно дешево, отсутствие иммунного ответа и побочных реакций на введение плазмидного вектора делают их удобным инструментом генной терапии и генетической профилактики (ДНК-вакцины) (15).

Тем не менее, ограничениями для использования плазмидных векторов для генной терапии являются: 1) наличие генов устойчивости к антибиотикам для наработки в бактериальных штаммах, 2) наличие различных регуляторных элементов, представленных последовательностями вирусных геномов 3) размер терапевтического плазмидного вектора, определяющий эффективность проникновения вектора в клетку-мишень.

Известно, что Европейское агентство по лекарственным средствам считает необходимым избегать введения маркеров антибиотикорезистентности в разрабатываемые плазмидные векторы для генной терапии (26) (Reflection paper on design modifications of gene therapy medicinal products during development / 14 December 2011 EMA/CAT/GTWP/44236/2009 Committee for advanced therapies). Данная рекомендация связана, в первую очередь, с потенциальной опасностью проникновения ДНК-вектора или горизонтального переноса генов антибиотикорезистентности в клетки бактерий, представленных в организме в составе нормальной или оппортунистической микрофлоры. Помимо этого, наличие генов антибиотикорезистентности значительно увеличивает размер ДНК-вектора, что приводит к снижению эффективности его проникновения в эукариотические клетки.

Необходимо отметить, что гены антибиотикорезистентности также вносят принципиальный вклад в способ получения ДНК-векторов. В случае наличия генов антибиотикорезистентности штаммы для наработки ДНК-векторов обычно культивируются в среде, содержащей селективный антибиотик, что создает риск наличия следовых количеств антибиотика в недостаточно очищенных препаратах ДНК-векторов. Таким образом, получение ДНК-векторов для генной терапии, в которых отсутствуют гены антибиотикорезистентности, связано с получением штаммов, обладающих такой отличительной особенностью как способность к стабильной амплификации целевых ДНК-векторов в среде без содержания антибиотиков.

Кроме того, Европейское Медицинское Агентство рекомендует избегать наличия в составе терапевтических плазмидных векторов регуляторных элементов для повышения экспрессии целевых генов (промоторов, энхансеров, посттрансляционных регуляторных элементов), являющихся нуклеотидными последовательностями геномов различных вирусов (Draft Guideline on the quality, non-clinical and clinical aspects of gene therapy medicinal products,http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/Scientific_guideline/2015/05/WC500187020.pdf). Данные последовательности, хотя и могут увеличивать уровень экспрессии целевого трансгена, однако создают риск рекомбинации с генетическим материалом вирусов дикого типа и интеграции в геном эукариотической клетки. Более того, целесообразность гиперэкспрессии того или иного гена в целях терапии остается нерешенным вопросом.

Также, существенным моментом является размер терапевтического вектора. Известно, что современные плазмидные векторы зачастую перегружены нефункциональными участками, серьезно увеличивающими размер вектора (17) (Mairhofer J, Grabherr R. // Mol Biotechnol. 2008.39(2):97-104). Например, ген устойчивости к ампициллину в векторах серии pBR322, как правило, состоит из не менее чем 1000 п.н., что составляет более 20% от размера самого вектора. При этом наблюдается обратная зависимость между размером вектора и его способностью проникать в эукариотические клетки - ДНК-векторы с небольшим размером эффективней проникаю в клетки человека и животных. Так, например, в серии экспериментов по трансфекции клеток HELA ДНК-векторами с размером от 383 до 4548 п.н. было показано, что разница в эффективности проникновения может достигать двух порядков (отличаться в 100 раз) (10) (Hornstein BD et al. // PLoS ONE. 2016;11(12): e0167537.).

Таким образом при выборе ДНК-вектора в целях безопасности и наибольшей эффективности следует отдавать предпочтение тем конструкциям, в которых не содержатся гены устойчивости к антибиотикам, последовательности вирусного происхождения и размер которых позволяет эффективно проникать в эукариотические клетки. Штамм для получения такого ДНК-вектора в количествах, достаточных для целей генной терапии, должен обеспечивать возможность стабильной амплификации ДНК-вектора с использованием питательных сред, не содержащих антибиотики.

Примером использования рекомбинантных ДНК-векторов для генной терапии является способ получения рекомбинантного вектора для генетической иммунизации по патенту US 9550998 В2. Плазмидный вектор представляет собой суперскученный плазмидный ДНК-вектор и предназначен для экспрессии клонированных генов в клетках животных и человека. Вектор состоит из ориджина репликации, регуляторных элементов, включающих промотор и энхансер цитомегаловируса человека, регуляторные элементы из Т-лимфотропного вируса человека.

Накопление вектора проводят в специальном штамме E. coli без использования антибиотиков за счет антисенс-комплементации гена sacB, введенного в штамм посредством бактериофага. Недостатком данного изобретения является наличие в составе ДНК-вектора регуляторных элементов, представляющих собой последовательности вирусных геномов.

Прототипами настоящего изобретения можно считать патенты и заявки описанные ниже.

В заявке WO2001042285A2 описан метод восстановления внеклеточного матрикса и предотвращения его деградации, в том числе, с использованием генотерапевтического подхода и векторов, экспрессирующих гены, содержащие последовательности, выбранные из группы последовательностей (SEQ1-SEQ21), экспрессия которых имеет место при формировании и поддержании внеклеточного матрикса. Недостатком данного изобретения является подход к выбору последовательностей, который в данном изобретении основан не на физиологической функции белков, кодируемых данными генами, а на анализе транскрипции различных последовательностей. Также в данном изобретении не приводится обоснования эффективности и безопасности использования того или иного вектора для генной терапии.

В заявке JPH0823979A описан генотерапевтический подход для улучшения формирования внеклеточного матрикса, в том числе, путем экспрессии коллагена и/или ферментов пролингидроксилаз, обеспечивающих биохимические реакции в процессе формирования коллагеновых волокон. Недостатком данного изобретения является ограниченность способа модуляции формирования внеклеточного матрикса только за счет обеспечения реакции гидроксилирования пролина в молекулах коллагена, также недостатком данного изобретения является использование бакуловирусных векторов.

В заявке WO2002094876A2 описан способ регуляции экспрессии муцина в тканях легких, одним из способов реализации которого является использование генотерапевтической конструкции, обеспечивающей экспрессию гена CLCA2. Недостатком данного изобретения является ограниченность способа использования и неопределенные требования безопасности используемых векторов.

Таким образом на настоящем уровне техники существует потребность в изобретении эффективного и безопасного генотерапевтического подхода, позволяющего повышать экспрессию генов, участвующих в формировании внеклеточного матрикса с учетом как непосредственных структурных молекул (таких как коллагены и эластин), так и ферментов, обеспечивающих их посттрансляционные модификации.

Раскрытие изобретения

Задачей изобретения является конструирование генотерапевтических ДНК-векторов для повышения уровня экспрессии генов, выбранных из группы: COL1A1, COL1A2, P4HA1, P4HA2, COL7A1, CLCA2, ELN, PLOD1 в организме человека и животных, сочетающих в себе следующие свойства:

I) Эффективность генотерапевтического ДНК-вектора для повышения уровня экспрессии целевых генов в эукариотических клетках.

II) Возможность безопасного применения для генетической терапии человека и животных за счет отсутствия в составе генотерапевтического ДНК-вектора регуляторных элементов, представляющих собой нуклеотидные последовательности вирусных геномов.

III) Возможность безопасного применения для генетической терапии человека и животных за счет отсутствия в составе генотерапевтического ДНК-вектора генов антибиотикорезистентности.

IV) Технологичность получения и возможность наработки генотерапевтического ДНК-вектора в промышленных масштабах.

Пункты II и III предусмотрены в данном техническом решении в соответствии с рекомендациями государственных регуляторов к лекарственным средствам для генной терапии, в частности, Европейского Агентства по лекарственным средствам касательно отказа от введения маркеров антибиотикорезистентности в разрабатываемые плазмидные векторы для генной терапии (Reflection paper on design modifications of gene therapy medicinal products during development / 14 December 2011, EMA/CAT/GTWP/44236/2009 Committee for advanced therapies) и касательно отказа от введения в разрабатываемые плазмидные векторы для генной терапии элементов вирусных геномов (Guideline on the quality, non-clinical and clinical aspects of gene therapy medicinal products / 23 March 2015, EMA/CAT/80183/2014, Committee for Advanced Therapies).

Задачей изобретения также является конструирование штаммов, несущих эти генотерапевтические ДНК-вектора, для наработки и производства в промышленных масштабах генотерапевтических ДНК-векторов.

Поставленная задача решается за счет того, что создан генотерапевтический ДНК-вектор на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущий целевой ген, выбранный из группы генов COL1A1, COL1A2, P4HA1, P4HA2, COL7A1, CLCA2, ELN, PLOD1, для повышения уровня экспрессии этого целевого гена в организме человека и животных, при этом генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-COL1A1 или VTvaf17-COL1A2 или VTvaf17-P4HA1 или VTvaf17-P4HA2 или VTvaf17-COL7A1 или VTvaf17-CLCA2 или VTvaf17-ELN или VTvaf17-PLOD1 имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID №1 или SEQ ID №2 или SEQ ID №3 или SEQ ID №4 или SEQ ID №5 или SEQ ID №6 или SEQ ID №7 или SEQ ID №8 соответственно. Каждый из созданных генотерапевтических ДНК-векторов: VTvaf17- COL1A1 или VTvaf17-COL1A2 или VTvaf17-P4HA1 или VTvaf17-P4HA2 или VTvaf17-COL7A1 или VTvaf17-CLCA2 или VTvaf17-ELN или VTvaf17-PLOD1 за счет ограниченного размера векторной части VTvaf17, не превышающей 3200 п.н., обладает способностью эффективно проникать в клетки и экспрессировать клонированный в него целевой ген, выбранный из группы генов COL1A1, COL1A2, P4HA1, P4HA2, COL7A1, CLCA2, ELN, PLOD1 соответственно. В составе генотерапевтического ДНК-вектора отсутствуют нуклеотидные последовательности вирусного происхождения и отсутствуют гены антибиотикорезистентности, обеспечивая возможность его безопасного применения для генетической терапии человека и животных.

Создан также способ получения генотерапевтического ДНК-вектора на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущего целевой ген, выбранный из группы генов: ген COL1A1, ген COL1A2, ген P4HA1, ген P4HA2, ген COL7A1, ген CLCA2, ген ELN, ген PLOD1, который заключается в том, что каждый из генотерапевтических ДНК-векторов: VTvaf17- COL1A1 или VTvaf17-COL1A2 или VTvaf17-P4HA1 или VTvaf17-P4HA2 или VTvaf17-COL7A1 или VTvaf17-CLCA2 или VTvaf17-ELN или VTvaf17-PLOD1 получают следующим образом: кодирующую часть целевого гена из группы COL1A1, COL1A2, P4HA1, P4HA2, COL7A1, CLCA2, ELN, PLOD1 клонируют в ДНК-вектор VTvaf17 и получают генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-COL1A1, SEQ ID №1 или VTvaf17-COL1A2, SEQ ID №2 или VTvaf17-P4HA1, SEQ ID №3 или VTvaf17-P4HA2, SEQ ID №4 или VTvaf17-COL7A1, SEQ ID №5 или VTvaf17-CLCA2, SEQ ID №6 или VTvaf17-ELN, SEQ ID №7 или VTvaf17-PLOD1, SEQ ID №8 соответственно.

Способ применения созданного генотерапевтического ДНК-вектора на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущего целевой ген, выбранный из группы генов: ген COL1A1, ген COL1A2, ген P4HA1, ген P4HA2, ген COL7A1, ген CLCA2, ген ELN, ген PLOD1 для повышения уровня экспрессии этих целевых генов, заключается во введении выбранного генотерапевтического ДНК-вектора или нескольких выбранных генотерапевтических ДНК-векторов в клетки, органы и ткани человека или животного, и/или во введении в органы и ткани человека или животного аутологичных клеток человека или животного, трансфицированных выбранным генотерапевтическим ДНК-вектором или несколькими выбранными генотерапевтическими ДНК-векторами, или в сочетании обозначенных способов.

Способ получения штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17- COL1A1 или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-COL1A2 или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-P4HA1 или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-P4HA2 или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-COL7A1 или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-CLCA2 или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-ELN или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-PLOD1 заключается в электропорации компетентных клеток штамма Escherichia coli SCS110-AF созданным генотерапевтическим ДНК-вектором и последующей селекцией стабильных клонов штамма с использованием селективной среды.

Заявлен штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-COL1A1 или штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-COL1A2 или штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-P4HA1 или штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-P4HA2 или штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-COL7A1 или штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-CLCA2 или штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-ELN или штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-PLOD1, несущий генотерапевтический ДНК-вектор для его наработки с возможностью культивирования штамма без использования антибиотиков.

Способ производства в промышленных масштабах генотерапевтического ДНК-вектора заключается в масштабировании бактериальной культуры штамма до количеств, необходимых для наращивания бактериальной биомассы в промышленном ферментере, после чего биомассу используют для выделения фракции, содержащей целевой ДНК-продукт - генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-COL1A1 или VTvaf17-COL1A2 или VTvaf17-P4HA1 или VTvaf17-P4HA2 или VTvaf17-COL7A1 или VTvaf17-CLCA2 или VTvaf17-ELN или VTvaf17-PLOD1 многостадийно фильтруют и очищают хроматографическими методами.

Изобретение поясняется чертежами, где:

На фиг.1

приведена схема генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущего целевой ген, выбранный из группы генов COL1A1, COL1A2, P4HA1, P4HA2, COL7A1, CLCA2, ELN, PLOD1, который представляет собой кольцевую двуцепочечную молекулу ДНК, способную к автономной репликации в клетках бактерии Escherichia coli.

На фиг.1 приведены схемы, соответствующие:

A - генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17- COL1A1;

B - генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17- COL1A2;

C - генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17- P4HA1;

D - генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17- P4HA2;

E - генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17- COL7A1;

F - генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17- CLCA2;

G - генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17- ELN;

H - генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17- PLOD1.

На схемах отмечены следующие структурные элементы вектора:

EF1a - промоторная область гена человеческого фактора элонгации EF1A с собственным энхансером, содержащимся в первом интроне гена. Служит для обеспечения высокого уровня транскрипции рекомбинантного гена в большинстве тканей человека;

Рамка считывания целевого гена, соответствующая кодирующей части гена COL1A1 (фиг. 1A), гена COL1A2 (фиг. 1B), гена P4HA1 (фиг. 1C), гена P4HA2 (фиг. 1D), гена COL7A1 (фиг. 1E), гена CLCA2 (фиг. 1F), гена ELN (фиг. 1G), гена PLOD1 (фиг. 1H) соответственно;

hGH-TA - терминатор транскрипции и сайт полиаденилирования гена фактора роста человека;

ori - ориджин репликации, служащий для автономной репликации с однонуклеотидной заменой для повышения копийности плазмиды в клетках большинства штаммов Escherichia coli;

RNA-out - регуляторный элемент РНК-out транспозона Tn 10, обеспечивающий возможность положительной селекции без использования антибиотиков при использовании штамма Escherichia coli SCS 110.

Отмечены уникальные сайты рестрикции.

На фиг.2 показаны графики накопления ампликонов кДНК целевого гена, а именно, гена COL1A1, в первичной культуре клеток фибробластов кожи человека HDFa (ATCC PCS-201-01) до их трансфекции и через 48 часов после трансфекции этих клеток генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-COL1A1 с целью оценки способности проникать в эукариотические клетки и функциональной активности, то есть экспрессии целевого гена на уровне мРНК.

На фиг.2 отмечены кривые накопления ампликонов в ходе реакции, соответствующие:

1 - кДНК гена COL1A1 в первичной культуре клеток фибробластов кожи человека HDFa до трансфекции ДНК-вектором VTvaf17-COL1A1;

2 - кДНК гена COL1A1 в первичной культуре клеток фибробластов кожи человека HDFa после трансфекции ДНК-вектором VTvaf17-COL1A1;

3 - кДНК гена B2M в первичной культуре клеток фибробластов кожи человека HDFa до трансфекции ДНК-вектором VTvaf17-COL1A1;

4 - кДНК гена B2M в первичной культуре клеток фибробластов кожи человека HDFa после трансфекции ДНК-вектором VTvaf17-COL1A1.

В качестве референтного гена использовали ген B2M (Бета-2-микроглобулин) приведенный в базе данных GenBank под номером NM 004048.2.

На фиг.3 показаны графики накопления ампликонов кДНК целевого гена, а именно гена COL1A2, в первичной культуре клеток фибробластов кожи человека HDFa (ATCC PCS-201-01) до их трансфекции и через 48 часов после трансфекции этих клеток ДНК-вектором VTvaf17-COL1A2 с целью оценки способности проникать в эукариотические клетки и функциональной активности, то есть экспрессии целевого гена на уровне мРНК.

На фиг.3 отмечены кривые накопления ампликонов в ходе реакции, соответствующие:

1 - кДНК гена COL1A2 в первичной культуре первичной культуры фибробластов кожи человека HDFa до трансфекции ДНК-вектором VTvaf17-COL1A2;

2 - кДНК гена COL1A2 первичной культуре первичной культуры фибробластов кожи человека HDFa после трансфекции ДНК-вектором VTvaf17-COL1A2;

3 - кДНК гена B2M в первичной культуре первичной культуры фибробластов кожи человека HDFa до трансфекции ДНК-вектором VTvaf17-COL1A2;

4 - кДНК гена B2M первичной культуре первичной культуры фибробластов кожи человека HDFa после трансфекции ДНК-вектором VTvaf17-COL1A2.

В качестве референтного гена использовали ген B2M (Бета-2-микроглобулин) приведенный в базе данных GenBank под номером NM 004048.2.

На фиг.4 показаны графики накопления ампликонов кДНК целевого гена, а именно гена P4HA1 в клетках фибробластов крайней плоти человека линии Hs27 (ATCC CRL-1634) до их трансфекции и через 48 часов после трансфекции этих клеток ДНК-вектором VTvaf17-P4HA1 с целью оценки способности проникать в эукариотические клетки и функциональной активности, то есть экспрессии целевого гена на уровне мРНК.

На фиг.4 отмечены кривые накопления ампликонов в ходе реакции, соответствующие:

1 - кДНК гена P4HA1 в клетках фибробластов крайней плоти человека линии Hs27 до трансфекции ДНК-вектором VTvaf17-P4HA1;

2 - кДНК гена P4HA1 клетках фибробластов крайней плоти человека линии Hs27 после трансфекции ДНК-вектором VTvaf17-P4HA1;

3 - кДНК гена B2M клетках фибробластов крайней плоти человека линии Hs27 до трансфекции ДНК-вектором VTvaf17-P4HA1;

4 - кДНК гена B2M клетках фибробластов крайней плоти человека линии Hs27 после трансфекции ДНК-вектором VTvaf17-P4HA1.

В качестве референтного гена использовали ген B2M (Бета-2-микроглобулин) приведенный в базе данных GenBank под номером NM 004048.2.

На фиг.5 показаны графики накопления ампликонов кДНК целевого гена, а именно гена P4HA2, в клетках фибробластов крайней плоти человека линии Hs27 (ATCC CRL-1634) до их трансфекции и через 48 часов после трансфекции этих клеток ДНК-вектором VTvaf17-P4HA2 с целью оценки способности проникать в эукариотические клетки и функциональной активности, то есть экспрессии целевого гена на уровне мРНК.

На фиг.5 отмечены кривые накопления ампликонов в ходе реакции, соответствующие:

1 - кДНК гена P4HA2 в клетках фибробластов крайней плоти человека линии Hs27 до трансфекции ДНК-вектором VTvaf17-P4HA2;

2 - кДНК гена P4HA2 в клетках фибробластов крайней плоти человека линии Hs27 после трансфекции ДНК-вектором VTvaf17-P4HA2;

3 - кДНК гена B2M в клетках фибробластов крайней плоти человека линии Hs27 до трансфекции ДНК-вектором VTvaf17-P4HA2;

4 - кДНК гена B2M в клетках фибробластов крайней плоти человека линии Hs27 после трансфекции ДНК-вектором VTvaf17-P4HA2.

В качестве референтного гена использовали ген B2M (Бета-2-микроглобулин) приведенный в базе данных GenBank под номером NM 004048.2.

На фиг.6 показаны графики накопления ампликонов кДНК целевого гена, а именно, гена COL7A1, в культуре фибробластов HT 297.T (ATCC® CRL-7782™) до их трансфекции и через 48 часов после трансфекции этих клеток генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-COL7A1 с целью оценки способности проникать в эукариотические клетки и функциональной активности, то есть экспрессии целевого гена на уровне мРНК.

На фиг.6 отмечены кривые накопления ампликонов в ходе реакции, соответствующие:

1 - кДНК гена COL7A1 в первичной культуре клеток фибробластов HT 297.T до трансфекции ДНК-вектором VTvaf17-COL7A1;

2 - кДНК гена COL7A1 в первичной культуре клеток фибробластов HT 297.T после трансфекции ДНК-вектором VTvaf17-COL7A1;

3 - кДНК гена B2M в первичной культуре клеток фибробластов HT 297.T до трансфекции ДНК-вектором VTvaf17-COL7A1;

4 - кДНК гена B2M в первичной культуре клеток фибробластов HT 297.T после трансфекции ДНК-вектором VTvaf17-COL7A1;

В качестве референтного гена использовали ген B2M (Бета-2-микроглобулин) приведенный в базе данных GenBank под номером NM 004048.2.

На фиг.7 показаны графики накопления ампликонов кДНК целевого гена, а именно, гена CLCA2, в культуре фибробластов HT 297.T (ATCC® CRL-7782™) до их трансфекции и через 48 часов после трансфекции этих клеток генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-CLCA2 с целью оценки способности проникать в эукариотические клетки и функциональной активности, то есть экспрессии целевого гена на уровне мРНК.

На фиг.7 отмечены кривые накопления ампликонов в ходе реакции, соответствующие:

1 - кДНК гена CLCA2 в первичной культуре клеток фибробластов HT 297.T до трансфекции ДНК-вектором VTvaf17-CLCA2;

2 - кДНК гена CLCA2 в первичной культуре клеток фибробластов HT 297.T после трансфекции ДНК-вектором VTvaf17-CLCA2;

3 - кДНК гена B2M в первичной культуре клеток фибробластов HT 297.T до трансфекции ДНК-вектором VTvaf17-CLCA2;

4 - кДНК гена B2M в первичной культуре клеток фибробластов HT 297.T после трансфекции ДНК-вектором VTvaf17-CLCA2.

В качестве референтного гена использовали ген B2M (Бета-2-микроглобулин) приведенный в базе данных GenBank под номером NM 004048.2.

На фиг.8 показаны графики накопления ампликонов кДНК целевого гена, а именно, гена ELN, в первичной культуре клеток кератиноцитов эпидермиса человека HEKa (ATCC PCS-200-011) до их трансфекции и через 48 часов после трансфекции этих клеток генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-ELN с целью оценки способности проникать в эукариотические клетки и функциональной активности, то есть экспрессии целевого гена на уровне мРНК.

На фиг.8 отмечены кривые накопления ампликонов в ходе реакции, соответствующие:

1 - кДНК гена ELN в первичной культуре клеток кератиноцитов эпидермиса человека HEKa до трансфекции ДНК-вектором VTvaf17-ELN;

2 - кДНК гена ELN в первичной культуре клеток кератиноцитов эпидермиса человека HEKa после трансфекции ДНК-вектором VTvaf17-ELN;

3 - кДНК гена B2M в первичной культуре клеток кератиноцитов эпидермиса человека HEKa до трансфекции ДНК-вектором VTvaf17-ELN;

4 - кДНК гена B2M в первичной культуре клеток кератиноцитов эпидермиса человека HEKa после трансфекции ДНК-вектором VTvaf17-ELN.

В качестве референтного гена использовали ген B2M (Бета-2-микроглобулин) приведенный в базе данных GenBank под номером NM 004048.2.

На фиг.9 показаны графики накопления ампликонов кДНК целевого гена, а именно, гена PLOD1, в первичной культуре клеток меланоцитов эпидермиса HEMa (ATCC® PCS-200-013™) до их трансфекции и через 48 часов после трансфекции этих клеток генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-PLOD1 с целью оценки способности проникать в эукариотические клетки и функциональной активности, то есть экспрессии целевого гена на уровне мРНК.

На фиг.9 отмечены кривые накопления ампликонов в ходе реакции, соответствующие:

1 - кДНК гена PLOD1 в первичной культуре клеток меланоцитов эпидермиса HEMa до трансфекции ДНК-вектором VTvaf17-PLOD1;

2 - кДНК гена PLOD1 в первичной культуре клеток меланоцитов эпидермиса HEMa после трансфекции ДНК-вектором VTvaf17-PLOD1;

3 - кДНК гена B2M в первичной культуре клеток меланоцитов эпидермиса HEMa до трансфекции ДНК-вектором VTvaf17-PLOD1;

4 - кДНК гена B2M в первичной культуре клеток меланоцитов эпидермиса HEMa после трансфекции ДНК-вектором VTvaf17-PLOD1.

В качестве референтного гена использовали ген B2M (Бета-2-микроглобулин) приведенный в базе данных GenBank под номером NM 004048.2.

На фиг.10 показана диаграмма концентрации белка COL1A1 в клеточном лизате первичной культуры фибробластов кожи человека HDFa (ATCC PCS-201-01) после трансфекции этих клеток ДНК-вектором VTvaf17-COL1A1 с целью оценки функциональной активности, то есть экспрессии на уровне белка, по изменению количества белка COL1A1 в лизате клеток.

На фиг.10 отмечены следующие элементы:

культура А - культура клеток фибробластов кожи человека HDFa, трансфицированная водным раствором дендримеров без плазмидной ДНК (контроль);

культура B - культура клеток фибробластов кожи человека HDFa, трансфицированных ДНК-вектором VTvaf17;

культура C - культура клеток фибробластов кожи человека HDFa, трансфицированных ДНК-вектором VTvaf17-COL1A1.

На фиг.11 показана диаграмма концентрации белка COL1A2 в лизате клеток первичной культуры фибробластов кожи человека HDFa (ATCC PCS-201-01) после трансфекции этих клеток ДНК-вектором VTvaf17-COL1A2 с целью оценки функциональной активности, то есть экспрессии целевого гена на уровне белка, и возможности повышения уровня экспрессии белка с помощью генотерапевтического ДНК-вектора на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущего целевой ген COL1A2.

На фиг.11 отмечены следующие элементы:

культура А - первичная культура клеток фибробластов кожи человека HDFa, трансфицированная водным раствором дендримеров без плазмидной ДНК (контроль);

культура B - первичная культура клеток фибробластов кожи человека HDFa трансфицированная ДНК-вектором VTvaf17;

культура C - первичная культура клеток фибробластов кожи человека HDFa, трансфицированных ДНК-вектором VTvaf17-COL1A2.

На фиг.12 показана диаграмма концентрации белка P4HA1 в лизате клеток фибробластов крайней плоти человека линии Hs27 (ATCC CRL-1634) после трансфекции этих клеток ДНК-вектором VTvaf17-P4HA1 с целью оценки функциональной активности, то есть экспрессии целевого гена на уровне белка, и возможности повышения уровня экспрессии белка с помощью генотерапевтического ДНК-вектора на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущего целевой ген P4HA1.

На фиг.12 отмечены следующие элементы:

культура А - культура клеток фибробластов крайней плоти человека линии Hs27, трансфицированных водным раствором дендримеров без плазмидной ДНК (контроль);

культура B - культура клеток фибробластов крайней плоти человека линии Hs27, трансфицированных ДНК-вектором VTvaf17;

культура C - культура клеток фибробластов крайней плоти человека линии Hs27, трансфицированных ДНК-вектором VTvaf17-P4HA1.

На фиг. 13 показана диаграмма концентрации белка P4HA2 в лизате клеток фибробластов крайней плоти человека линии Hs27 (ATCC CRL-1634) после трансфекции этих клеток ДНК-вектором VTvaf17-P4HA2 с целью оценки функциональной активности, то есть экспрессии целевого гена на уровне белка, и возможности повышения уровня экспрессии белка с помощью генотерапевтического ДНК-вектора на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущего целевой ген P4HA2.

На фиг.13 отмечены следующие элементы:

культура А - культура клеток фибробластов крайней плоти человека линии Hs27, трансфицированных водным раствором дендримеров без плазмидной ДНК (контроль);

культура B - культура клеток фибробластов крайней плоти человека линии Hs27, трансфицированных ДНК-вектором VTvaf17;

культура C - культура клеток фибробластов крайней плоти человека линии Hs27 трансфицированных ДНК-вектором VTvaf17-P4HA2.

На фиг.14 показана диаграмма концентрации белка COL7A1 в клеточном лизате культуры фибробластов человека HT 297.T (ATCC® CRL-7782™) после трансфекции этих клеток ДНК-вектором VTvaf17-COL7A1 с целью оценки функциональной активности, то есть экспрессии на уровне белка, по изменению количества белка COL7A1 в лизате клеток.

На фиг.14 отмечены следующие элементы:

культура А - культура клеток фибробластов человека HT 297.T, трансфицированная водным раствором дендримеров без плазмидной ДНК (контроль);

культура B - культура клеток фибробластов человека HT 297.T, трансфицированных ДНК-вектором VTvaf17;

культура C - культура клеток фибробластов человека HT 297.T, трансфицированных ДНК-вектором VTvaf17-COL7A1.

На фиг.15 показана диаграмма концентрации белка CLCA2 в клеточном лизате культуры фибробластов человека HT 297.T (ATCC® CRL-7782™) после трансфекции этих клеток ДНК-вектором VTvaf17-CLCA2 с целью оценки функциональной активности, то есть экспрессии на уровне белка, по изменению количества белка CLCA2 в лизате клеток.

На фиг.15 отмечены следующие элементы:

культура А - культура клеток фибробластов человека HT 297.T, трансфицированная водным раствором дендримеров без плазмидной ДНК (контроль);

культура B - культура клеток фибробластов человека HT 297.T, трансфицированных ДНК-вектором VTvaf17;

культура C - культура клеток фибробластов человека HT 297.T, трансфицированных ДНК-вектором VTvaf17-CLCA2.

На фиг.16 показана диаграмма концентрации белка ELN в клеточном лизате культуры кератиноцитов эпидермиса человека HEKa (ATCC PCS-200-011) после трансфекции этих клеток ДНК-вектором VTvaf17-ELN с целью оценки функциональной активности, то есть экспрессии на уровне белка, по изменению количества белка ELN в лизате клеток.

На фиг.16 отмечены следующие элементы:

культура А - культура клеток кератиноцитов эпидермиса человека HEKa, трансфицированная водным раствором дендримеров без плазмидной ДНК (контроль);

культура B - культура клеток кератиноцитов эпидермиса человека HEKa , трансфицированных ДНК-вектором VTvaf17;

культура C - культура клеток кератиноцитов эпидермиса человека HEKa, трансфицированных ДНК-вектором VTvaf17-ELN.

На фиг.17 показана диаграмма концентрации белка PLOD1 в клеточном лизате культуры меланоцитов эпидермиса человека HEMa (ATCC® PCS-200-013™) после трансфекции этих клеток ДНК-вектором VTvaf17-PLOD1 с целью оценки функциональной активности, то есть экспрессии на уровне белка, по изменению количества белка PLOD1 в лизате клеток.

На фиг.17 отмечены следующие элементы:

культура А - культура клеток меланоцитов эпидермиса человека HEMa, трансфицированная водным раствором дендримеров без плазмидной ДНК (контроль);

культура B - культура клеток меланоцитов эпидермиса человека HEMa, трансфицированных ДНК-вектором VTvaf17;

культура C - культура клеток меланоцитов эпидермиса человека HEMa, трансфицированных ДНК-вектором VTvaf17-PLOD1.

На фиг. 18 показана диаграмма концентрации белка P4HA2 в биоптатах кожи трех пациентов после введения в кожу этих пациентов генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-P4HA2 с целью оценки функциональной активности, то есть экспрессии целевого гена на уровне белка, и возможности повышения уровня экспрессии белка с помощью генотерапевтического ДНК-вектора на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущего целевой ген P4HA2.

На фиг.18 отмечены следующие элементы:

П1I - биоптат кожи пациента П1 в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора VTvaf17-P4HA2;

П1II - биоптат кожи пациента П1 в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора VTvaf17 (плацебо);

П1III - биоптат кожи пациента П1 из интактного участка,

П2I - биоптат кожи пациента П2 в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора VTvaf17-P4HA2;

П2II - биоптат кожи пациента П2 в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора VTvaf17 (плацебо);

П2III - биоптат кожи пациента П2 из интактного участка;

П3I - биоптат кожи пациента П3 в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора VTvaf17-P4HA2;

П3II - биоптат кожи пациента П3 в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора VTvaf17 (плацебо);

П3III - биоптат кожи пациента П3 из интактного участка.

На фиг. 19 показана диаграмма концентрации белка P4HA1 в биоптатах кожи трех пациентов после введения в кожу этих пациентов генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17- P4HA1, с целью оценки функциональной активности, то есть экспрессии целевого гена на уровне белка, и возможности повышения уровня экспрессии белка с помощью генотерапевтического ДНК-вектора на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущего целевой ген P4HA1.

На фиг.19 отмечены следующие элементы:

П1I - биоптат кожи пациента П1 в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора VTvaf17- P4HA1;

П1II - биоптат кожи пациента П1 в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора VTvaf17 (плацебо);

П1III - биоптат интактного участка кожи пациента П1;

П2I - биоптат кожи пациента П2 в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора VTvaf17- P4HA1;

П2II - биоптат кожи пациента П2 в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора VTvaf17 (плацебо);

П2III - биоптат интактного участка кожи пациента П2;

П3I - биоптат кожи пациента П3 в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора VTvaf17- P4HA1;

П3II - биоптат кожи пациента П3 в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора VTvaf17 (плацебо);

П3III - биоптат интактного участка кожи пациента П3.

На фиг.20 показана диаграмма концентрации белка COL7A1, CLCA2, ELN и PLOD1 в биоптатах кожи трех пациентов после сочетанного введения в кожу этих пациентов генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17- COL7A1, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-CLCA2, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-ELN, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-PLOD1 с целью оценки их функциональной активности, то есть экспрессии целевых генов на уровне белка, и возможности повышения уровня экспрессии белка с помощью генотерапевтических ДНК-векторов на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущих целевой ген COL7A1, CLCA2, ELN и PLOD1.

На фиг.20 отмечены следующие элементы:

П1I - биоптат кожи пациента П1 в зоне введения смеси генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-COL7A1, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-CLCA2, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-ELN, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-PLOD1;

П1II - биоптат кожи пациента П1 в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора VTvaf17 (плацебо);

П1III - биоптат кожи пациента П1 из интактного участка;

П2I - биоптат кожи пациента П2 в зоне введения смеси генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-COL7A1, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-CLCA2, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-ELN, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-PLOD1;

П2II - биоптат кожи пациента П2 в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора VTvaf17 (плацебо);

П2III - биоптат кожи пациента П2 из интактного участка;

П3I - биоптат кожи пациента П3 в зоне введения смеси генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-COL7A1, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-CLCA2, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-ELN, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-PLOD1;

П3II - биоптат кожи пациента П3 в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора VTvaf17 (плацебо);

П3III - биоптат кожи пациента П3 из интактного участка.

На фиг. 21 показана диаграмма концентрации белка COL1A2 в биоптатах кожи человека после введения в кожу культуры аутологичных фибробластов, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-COL1A2 с целью демонстрации способа применения путем введения аутологичных клеток, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-COL1A2.

На фиг.21 отмечены следующие элементы:

П1С - биоптат кожи пациента П1 в зоне введения культуры аутологичных фибробластов пациента, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-COL1A2;

П1B - биоптат кожи пациента П1 в зоне введения аутологичных фибробластов пациента, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17;

П1А - биоптат кожи пациента П1 из интактного участка.

На фиг. 22 показана диаграмма концентрации белка COL1A1, COL1A2, P4HA1 и P4HA2 в биоптатах кожи трех крыс после сочетанного введения в кожи этих животных генотерапевтических ДНК векторов: VTvaf17-COL1A1, VTvaf17-COL1A2, VTvaf17-P4HA1 и VTvaf17-P4HA2 с целью оценки их функциональной активности, то есть экспрессии целевых генов на уровне белка, и возможности повышения уровня экспрессии белка с помощью генотерапевтических ДНК-векторов на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущих целевой ген COL1A1, COL1A2, P4HA1 и P4HA2.

На фиг.22 отмечены следующие элементы:

К1I - биоптат кожи крысы К1 в зоне введения смеси генотерапевтических ДНК векторов: VTvaf17-COL1A1, VTvaf17- COL1A2, VTvaf17-P4HA1 и VTvaf17-P4HA2;

К1II - биоптат кожи крысы К1 в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора VTvaf17 (плацебо);

К1III - биоптат контрольного интактного участка кожи крысы К1;

К2I - биоптат кожи крысы К2 в зоне введения смеси генотерапевтических ДНК векторов: VTvaf17-COL1A1, VTvaf17-COL1A2, VTvaf17-P4HA1 и VTvaf17-P4HA2;

К2II - биоптат кожи крысы К2 в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора VTvaf17 (плацебо);

К2III - биоптат контрольного интактного участка кожи крысы К2;

К3I - биоптат кожи крысы К3 в зоне введения смеси генотерапевтических ДНК векторов: VTvaf17-COL1A1, VTvaf17- COL1A2, VTvaf17-P4HA1 и VTvaf17-P4HA2;

К3II - биоптат кожи крысы К3 в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора VTvaf17 (плацебо);

К3III - биоптат контрольного интактного участка кожи крысы К3.

На фиг. 23 показаны графики накопления ампликонов кДНК целевого гена ELN в клетках фибробластов кожи быка (ScienCell, Кат. #B2300) до и через 48 часов после трансфекции этих клеток ДНК-вектором VTvaf17-ELN с целью демонстрации способа применения путем введения генотерапевтического ДНК-вектора животным

На фиг.23 отмечены кривые накопления ампликонов в ходе реакции, соответствующие:

1 - кДНК гена ELN в клетках фибробластов кожи быка до трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-ELN;

2 - кДНК гена ELN в клетках фибробластов кожи быка после трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-ELN;

3 - кДНК гена ACT в клетках фибробластов кожи быка до трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-ELN;

4 - кДНК гена ACT в клетках фибробластов кожи быка после трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-ELN.

В качестве референтного гена использовали ген актина быка/ коровы (АСТ), приведенного в базе данных GenBank под номером AH001130.2.

Реализация изобретения

На основе ДНК-вектора VTvaf17 размером 3165 п.н. созданы генотерапевтические ДНК-векторы, несущие целевые гены человека, предназначенные для повышения уровня экспрессии этих целевых генов в тканях человека и животных. При этом способ получения каждого генотерапевтического ДНК-вектора, несущего целевые гены заключается в том, что в полилинкер генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17 клонируют белок-кодирующую последовательность целевого гена, выбранного из группы генов: ген COL1A1 (кодирует белок COL1A1) , ген COL1A2 (кодирует белок COL1A2), ген P4HA1 (кодирует белок P4HA1), ген P4HA2 (кодирует белок P4HA2), ген COL7A1 (кодирует белок COL7A1), ген CLCA2 (кодирует белок CLCA2), ген ELN (кодирует белок ELN), ген PLOD1 (кодирует белок PLOD1) человека. Известно, что способность ДНК-векторов проникать в эукариотические клетки обусловлена, главным образом, размером вектора. При этом ДНК-вектора с наименьшим размером обладают более высокой проникающей способностью. Таким образом, предпочтительным является отсутствие в составе вектора элементов, которые не несут функциональной нагрузки, но при этом увеличивают размер ДНК-вектора. Данные особенности ДНК-векторов были учтены при получении генотерапевтического ДНК-вектора на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущего целевой ген, выбранный из группы генов COL1A1, COL1A2, P4HA1, P4HA2, COL7A1, CLCA2, ELN, PLOD1 путем отсутствия в составе вектора крупных нефункциональных последовательностей и генов антибиотикорезистентности, что позволило, помимо технологических преимуществ и преимуществ в плане безопасности применения, значительно уменьшить размер полученного генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущего целевой ген, выбранный из группы генов COL1A1, COL1A2, P4HA1, P4HA2, COL7A1, CLCA2, ELN, PLOD1. Таким образом, способность проникать в эукариотические клетки полученного генотерапевтического ДНК-вектора обусловлена его небольшими размерами.

Каждый из генотерапевтических ДНК-векторов: ДНК-вектор VTvaf17- COL1A1 или VTvaf17-COL1A2 или VTvaf17-P4HA1 или VTvaf17-P4HA2 или VTvaf17-COL7A1 или VTvaf17-CLCA2 или VTvaf17-ELN или VTvaf17-PLOD1 получали следующим образом: кодирующую часть целевого гена COL1A1 или COL1A2 или P4HA1 или P4HA2 или COL7A1 или CLCA2 или ELN или PLOD1 клонировали в генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17 и получали генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-COL1A1, SEQ ID №1 или VTvaf17-COL1A2, SEQ ID №2 или VTvaf17-P4HA1, SEQ ID №3 или VTvaf17-P4HA2, SEQ ID №4 или VTvaf17-COL7A1, SEQ ID №5 или VTvaf17-CLCA2, SEQ ID №6 или VTvaf17-ELN, SEQ ID №7 или VTvaf17-PLOD1, SEQ ID №8 соответственно. Кодирующую часть гена COL1A1 размером 4410 п.н., или гена COL1A2 размером 4116 п.н., или гена P4HA1 размером 1607 п.н., или гена P4HA2 размером 1605 п.н., или гена COL7A1 размером 8838 п.н., или гена CLCA2 размером 2833 п.н., или гена ELN размером 2068 п.н., или гена PLOD1 размером 2185 п.н. получали путем выделения суммарной РНК из биологического образца ткани здорового человека. Для получения первой цепи кДНК генов COL1A1, COL1A2, P4HA1, P4HA2, COL7A1, CLCA2, ELN, PLOD1 человека использовали реакцию обратной транскрипции. Амплификацию проводили с использованием созданных для этого методом химического синтеза олигонуклеотидов. Расщепление продукта амплификации специфическими эндонуклеазами рестрикции проводили с учетом оптимальной процедуры дальнейшего клонирования, причем клонирование в генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17 проводили по сайтам рестрикции BamHI, EcoRI, HindIII расположенными в полилинкере вектора VTvaf17. Выбор сайтов рестрикции проводили таким образом, чтобы клонированный фрагмент попадал в рамку считывания экспрессионной кассеты вектора VTvaf17, при этом белок-кодирующая последовательность не содержала сайты рестрикции для выбранных эндонуклеаз. При этом специалистам в данной области техники понятно, что методическая реализация получения генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17- COL1A1 или VTvaf17-COL1A2 или VTvaf17-P4HA1 или VTvaf17-P4HA2 или VTvaf17-COL7A1 или VTvaf17-CLCA2 или VTvaf17-ELN или VTvaf17-PLOD1 может варьировать в рамках выбора известных методов молекулярного клонирования генов, при этом эти способы подпадают под объем настоящего изобретения. Так, например, могут быть использованы различные последовательности олигонуклеотидов для амплификации гена COL1A1 или COL1A2 или P4HA1 или P4HA2 или COL7A1 или CLCA2 или ELN или PLOD1 различные эндонуклеазы рестрикции или такие лабораторные техники как безлигазное клонирование генов.

Генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-COL1A1 или VTvaf17-COL1A2 или VTvaf17-P4HA1 или VTvaf17-P4HA2 или VTvaf17-COL7A1 или VTvaf17-CLCA2 или VTvaf17-ELN или VTvaf17-PLOD1 обладает нуклеотидной последовательностью SEQ ID №1 или SEQ ID №2 или SEQ ID №3 или SEQ ID №4 или SEQ ID №5 или SEQ ID №6 или SEQ ID №7 или SEQ ID №8 соответственно. При этом специалистам в данной области техники известно свойство вырожденности генетического кода, из которого следует, что под объем настоящего изобретения также подпадают варианты нуклеотидных последовательностей, отличающихся инсерцией, делецией или заменой нуклеотидов, которые не приводят к изменению полипептидной последовательности, кодируемой целевым геном, и/или не приводят к потере функциональной активности регуляторных элементов вектора VTvaf17. При этом специалистам в данной области техники известно явление генетического полиморфизма, из которого следует, что под объем настоящего изобретения также подпадают варианты нуклеотидных последовательностей генов из группы генов COL1A1, COL1A2, P4HA1, P4HA2, COL7A1, CLCA2, ELN, PLOD1, которые при этом кодируют различные варианты аминокислотных последовательностей белков COL1A1, COL1A2, P4HA1, P4HA2, COL7A1, CLCA2, ELN, PLOD1, не отличающихся от приведенных по своей функциональной активности при физиологических условиях.

Способность проникать в эукариотические клетки и функциональную активность, то есть способность экспрессировать целевой ген, полученного генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17- COL1A1 или VTvaf17-COL1A2 или VTvaf17-P4HA1 или VTvaf17-P4HA2 или VTvaf17-COL7A1 или VTvaf17-CLCA2 или VTvaf17-ELN или VTvaf17-PLOD1 подтверждают путем введения в эукариотические клетки полученного вектора и последующим анализом экспрессии специфической мРНК и/или белкового продукта целевого гена. Наличие специфической мРНК в клетках, в которые был введен генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-COL1A1 или VTvaf17-COL1A2 или VTvaf17-P4HA1 или VTvaf17-P4HA2 или VTvaf17-COL7A1 или VTvaf17-CLCA2 или VTvaf17-ELN или VTvaf17-PLOD1 свидетельствует как о способности полученного вектора проникать в эукариотические клетки, так и о его способности экспрессировать мРНК целевого гена. При этом, как известно специалистам в данной области техники, наличие мРНК гена является обязательным условием, но не доказательством трансляции белка, кодируемого целевым геном. Поэтому для подтверждения свойства генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-COL1A1 или VTvaf17-COL1A2 или VTvaf17-P4HA1 или VTvaf17-P4HA2 или VTvaf17-COL7A1 или VTvaf17-CLCA2 или VTvaf17-ELN или VTvaf17-PLOD1 экспрессировать целевой ген на уровне белка в эукариотических клетках, в которые был введен генотерапевтический ДНК-вектор, проводят анализ концентрации белков, кодируемых целевыми генами, с использованием иммунологических методов. Наличие белка COL1A1 или COL1A2 или P4HA1 или P4HA2 или COL7A1 или CLCA2 или ELN или PLOD1 подтверждает эффективность экспрессии целевых генов в эукариотических клетках и возможность повышения уровня концентрации белка с помощью генотерапевтического ДНК-вектора на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущего целевой ген, выбранный из группы генов COL1A1, COL1A2, P4HA1, P4HA2, COL7A1, CLCA2, ELN, PLOD1.

Таким образом для подтверждения эффективности экспрессии созданного генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-COL1A1, несущего целевой ген, а именно, ген COL1A1, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-COL1A2, несущего целевой ген, а именно, ген COL1A2, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-P4HA1, несущего целевой ген, а именно, ген P4HA1, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17- P4HA2, несущего целевой ген, а именно, ген P4HA2, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-COL7A1, несущего целевой ген, а именно, ген COL7A1, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-CLCA2, несущего целевой ген, а именно, ген CLCA2, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-ELN, несущего целевой ген, а именно, ген ELN, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-PLOD1, несущего целевой ген, а именно, ген PLOD1 использовали следующие методы:

А) ПЦР в реальном времени - изменение накопления ампликонов кДНК целевых генов в лизате клеток человека и животного, после трансфекции различных клеточных линий человека и животного генотерапевтическим ДНК-векторами;

B) Иммуноферментный анализ - изменение количественного уровня целевых белков в лизате клеток человека, после трансфекции различных клеточных линий человека генотерапевтическими ДНК-векторами;

C) Иммуноферментный анализ - изменение количественного уровня целевых белков в супернатанте биоптатов тканей человека и животного, после введения в эти ткани генотерапевтических ДНК-векторов;

D) Иммуноферментный анализ - изменение количественного уровня целевых белков в супернатанте биоптатов тканей человека, после введения в эти ткани аутологичных клеток этого человека, трансфицированных генотерапевтическими ДНК-векторами.

Для подтверждения реализуемости способа применения созданного генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-COL1A1, несущего целевой ген, а именно, ген COL1A1, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-COL1A2, несущего целевой ген, а именно, ген COL1A2, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-P4HA1, несущего целевой ген, а именно, ген P4HA1, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17- P4HA2, несущего целевой ген, а именно, ген P4HA2, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-COL7A1, несущего целевой ген, а именно, ген COL7A1, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-CLCA2, несущего целевой ген, а именно, ген CLCA2, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-ELN, несущего целевой ген, а именно, ген ELN, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-PLOD1, несущего целевой ген, а именно, ген PLOD1 выполняли:

А) трансфекцию генотерапевтическими ДНК-векторами различных клеточных линий человека и животного;

B) введение генотерапевтических ДНК-векторов в различные ткани человека и животного;

С) введение в ткани человека и животного смеси генотерапевтических ДНК-векторов;

D) введение в ткани человека аутологичных клеток, трансфицированных генотерапевтическими ДНК-векторами.

Указанные способы применения характеризуются отсутствием потенциальных рисков для генетической терапии человека и животных за счет отсутствия в составе генотерапевтического ДНК-вектора регуляторных элементов, представляющих собой нуклеотидные последовательности вирусных геномов, и за счет отсутствия в составе генотерапевтического ДНК-вектора генов устойчивости к антибиотикам, что подтверждается отсутствием участков, гомологичных вирусным геномам и генам антибиотикорезистентности в нуклеотидных последовательностях генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17- COL1A1 или генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-COL1A2 или генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-P4HA1 или генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-P4HA2 или генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-COL7A1 или генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-CLCA2 или генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-ELN или генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-PLOD1 (SEQ ID №1 или SEQ ID №2 или SEQ ID №3 или SEQ ID №4 или SEQ ID №5 или SEQ ID №6 или SEQ ID №7 или SEQ ID №8 соответственно).

Как известно специалистам в данной области техники, гены антибиотикорезистентности в составе генотерапевтических ДНК-векторов используются с целью получения этих векторов в препаративных количествах путем наращивания бактериальной биомассы в питательной среде, содержащей селективный антибиотик. В рамках настоящего изобретения в целях возможности безопасного применения генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущего целевой ген COL1A1 или COL1A2 или P4HA1 или P4HA2 или COL7A1 или CLCA2 или ELN или PLOD1, использование селективных питательных сред, содержащих антибиотик, не представляется возможным. В качестве технологического решения для получения генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущего целевой ген, выбранный из группы генов COL1A1, COL1A2, P4HA1, P4HA2, COL7A1, CLCA2, ELN, PLOD1 для возможности масштабирования до промышленных масштабов получения генотерапевтических векторов предлагается способ получения штаммов для наработки указанных генотерапевтических векторов на основе бактерии Escherichia coli SCS110-AF. Способ получения штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-COL1A1 или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-COL1A2 или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-P4HA1 или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-P4HA2, или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-COL7A1 или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-CLCA2 или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-ELN или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-PLOD1 заключается в получении компетентных клеток штамма Escherichia coli SCS110-AF с введением в эти клетки генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-COL1A1 или ДНК-вектора VTvaf17-COL1A2 или ДНК-вектора VTvaf17-P4HA1 или ДНК-вектора VTvaf17-P4HA2 или ДНК-вектора VTvaf17-COL7A1 или ДНК-вектора VTvaf17-CLCA2 или ДНК-вектора VTvaf17-ELN или ДНК-вектора VTvaf17-PLOD1 соответственно с помощью методов трансформации (электропорации), общеизвестных специалистам в данной области техники. Полученный штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-COL1A1 или штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-COL1A2 или штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-P4HA1 или штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-P4HA2 или штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-COL7A1 или штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-CLCA2 или штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-ELN или штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-PLOD1 используется для наработки генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-COL1A1 или VTvaf17-COL1A2 или VTvaf17-P4HA1 или VTvaf17-P4HA2 или VTvaf17-COL7A1 или VTvaf17-CLCA2 или VTvaf17-ELN или VTvaf17-PLOD1 соответственно с возможностью использования сред без содержания антибиотиков.

Для подтверждения получения штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-COL1A1 или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17- COL1A2 или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-P4HA1 или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-P4HA2 или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-COL7A1 или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-CLCA2 или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-ELN или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-PLOD1 проводили трансформацию, селекцию и последующее наращивание с выделением плазмидной ДНК.

Для подтверждения технологичности получения и возможности масштабирования до промышленного производства генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-COL1A1, несущего целевой ген, а именно, ген COL1A1 или VTvaf17-COL1A2, несущего целевой ген, а именно, ген COL1A2 или VTvaf17-P4HA1, несущего целевой ген, а именно, ген P4HA1 или VTvaf17-P4HA2, несущего целевой ген, а именно, ген P4HA2 или VTvaf17-COL7A1, несущего целевой ген, а именно, ген COL7A1 или VTvaf17-CLCA2, несущего целевой ген, а именно, ген CLCA2 или VTvaf17-ELN, несущего целевой ген, а именно, ген ELN или VTvaf17-PLOD1, несущего целевой ген, а именно, ген PLOD1 выполняли ферментацию в промышленном масштабе штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17- COL1A1 или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-COL1A2 или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-P4HA1 или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-P4HA2 или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-COL7A1 или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-CLCA2 или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-ELN или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-PLOD1, каждый из которых содержит генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17, несущий целевой ген, а именно COL1A1 или COL1A2 или P4HA1 или P4HA2 или COL7A1 или CLCA2 или ELN или PLOD1.

Способ масштабирования получения бактериальной массы до промышленных масштабов для выделения генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущего целевой ген, выбранный из группы генов COL1A1, COL1A2, P4HA1, P4HA2, COL7A1, CLCA2, ELN, PLOD1 заключается в том, что затравочную культуру штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17- COL1A1 или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-COL1A2 или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-P4HA1 или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-P4HA2 или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-COL7A1 или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-CLCA2 или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-ELN или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-PLOD1 инкубируют в объеме питательной среды без содержания антибиотика, обеспечивающим подходящую динамику накопления биомассы, по достижению достаточного количества биомассы в логарифмической фазе роста, бактериальную культуру переносят в промышленный ферментер, после чего растят до достижения стационарной фазы роста, затем выделяют фракцию, содержащую целевой ДНК-продукт - генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-COL1A1 или генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-COL1A2 или генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-P4HA1 или генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-P4HA2 или генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-COL7A1 или генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-CLCA2 или генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-ELN или генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-PLOD1, многостадийно фильтруют и очищают хроматографическими методами. При этом специалистам в данной области техники понятно, что условия культивирования штаммов, состав питательных сред (за исключением содержания антибиотиков), используемое оборудование, методы очистки ДНК могут варьировать в рамках стандартных операционных процедур в зависимости от отдельно взятой производственной линии, но известные подходы к масштабированию, промышленному получению и очистке ДНК-векторов с использованием штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-COL1A1 или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-COL1A2 или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-P4HA1 или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-P4HA2 или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-COL7A1 или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-CLCA2 или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-ELN или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-PLOD1 подпадают под объем настоящего изобретения.

Изобретение поясняется следующими примерами.

Пример 1.

Получение генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-COL1A1, несущего целевой ген, а именно, гена COL1A1.

Генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-COL1A1 конструировали клонированием кодирующей части гена COL1A1 размером 4410 п.н. в ДНК-вектор VTvaf17 размером 3165 п.н. по сайтам рестрикции NheI и HindIII. Кодирующую часть гена COL1A1 размером 4410 п.н. получали путем выделения суммарной РНК из биологического образца ткани человека с последующим проведением реакции обратной транскрипции с использованием коммерческого набора Mint-2 (Евроген, Россия) и ПЦР-амплификации с использованием олигонуклеотидов:

Col1A1_F CCAGCTAGCGTCTAGGGTCTAGACATGTTC

Col1A1_R TATAAGCTTCTACAGGAAGCAGACAGGGCCAAC

и коммерческого набора Phusion® High-Fidelity DNA Polymerase (New England Biolabs, США).

Генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17 конструировали объединением шести фрагментов ДНК, полученных из разных источников:

(а) ориджин репликации получали путем ПЦР-амплификации участка коммерческой плазмиды pBR322 с внесением точечной мутации;

(б) промоторный регион EF1а получали путем ПЦР-амплификации участка геномной ДНК человека;

(в) терминатор транскрипции hGH-TA получали путем ПЦР-амплификации участка геномной ДНК человека;

(г) регуляторный участок транспозона Tn10 РНК-out получали путем синтеза из олигонуклеотидов;

(д) ген устойчивости к канамицину получали путем ПЦР-амплификации участка коммерческой плазмиды pET-28 человека;

(е) полилинкер получали отжигом двух синтетических олигонуклеотидов.

ПЦР-амплификацию проводили с использованием коммерческого набора Phusion® High-Fidelity DNA Polymerase (New England Biolabs, США) в соответствии с инструкцией производителя. Фрагменты имеют перекрывающиеся области для возможности их объединения с последующей ПЦР-амплификацией. Объединяли фрагменты (а) и (б) с использованием олигонуклеотидов Ori-F и EF1-R, а также фрагменты (в), (г) и (д) с использованием олигонуклеотидов hGH-F и Kan-R. Далее, полученные участки объединяли путем рестрикции с последующим лигированием по сайтам BamHI и NcoI. В результате получали плазмиду, пока еще не содержащую полилинкер. Для его введения проводили расщепление плазмиды по сайтам BamHI и EcoRI, и лигирование с фрагментом (е). Таким образом, получали вектор размером 4182 п.н., несущий ген устойчивости к канамицину, который фланкирован сайтами рестрикции SpeI. Далее этот участок выщепляли по сайтам рестрикции SpeI, после чего оставшийся фрагмент лигировали сам на себя. Таким образом получали генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17 размером 3165 п.н., который является рекомбинантным, с возможностью селекции без антибиотиков.

Расщепление продукта амплификации кодирующей части гена COL1A1 и ДНК-вектора VTvaf17 проводили эндонуклеазами рестрикции NheI и HindIII (New England Biolabs, США).

В результате получали ДНК-вектор VTvaf17-COL1A1 размером 7563 п.н. с нуклеотидной последовательностью SEQ ID №1 и общей структурой изображенной на фиг.1A.

Пример 2.

Получение генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-COL1A2, несущего целевой ген, а именно, гена COL1A2.

Генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-COL1A2 конструировали клонированием кодирующей части гена COL1A2 размером 4116 п.н. в ДНК-вектор VTvaf17 размером 3165 п.н. по сайтам рестрикции NheI и HindIII. Кодирующую часть гена COL1A2 размером 4116 п.н. получали путем выделения суммарной РНК из биологического образца ткани человека с последующим проведением реакции обратной транскрипции с использованием коммерческого набора Mint-2 (Евроген, Россия) и ПЦР-амплификации с использованием олигонуклеотидов:

Col1A2_F CCAGCTAGCGTCTAAGTGCTAGACATGCTC

Col1A2_R CGAAGCTTTTATTTGAAACAGACTGGGCCA

и коммерческого набора Phusion® High-Fidelity DNA Polymerase (New England Biolabs, США), расщепление продукта амплификации и ДНК-вектора VTvaf17 проводили эндонуклеазами рестрикции NheI и HindIII (New England Biolabs, США).

В результате получали ДНК-вектор VTvaf17-COL1A2 размером 7269 п.н. с нуклеотидной последовательностью SEQ ID №2 и общей структурой изображенной на фиг.1B.

При этом генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17 конструировали по Примеру 1.

Пример 3

Получение ДНК-вектора VTvaf17-P4HA1, несущего целевой ген, а именно, гена P4HA1 человека.

Генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-P4HA1 конструировали клонированием кодирующей части гена P4HA1 размером 1607 п.н. в ДНК-вектор VTvaf17 размером 3165 п.н. по сайтам рестрикции BamHI и KpnI. Кодирующую часть гена P4HA1 размером 1607 п.н. получали путем выделения суммарной РНК из биологического образца ткани человека с последующим проведением реакции обратной транскрипции с использованием коммерческого набора Mint-2 (Евроген, Россия) и ПЦР-амплификации с использованием олигонуклеотидов:

P4HA1_F AGGATCCACCATGATCTGGTATATATTAATTATAGG

P4HA1_R TTCGGTACCTATTCCAATTCTGACAACGTACAAG

и коммерческого набора Phusion® High-Fidelity DNA Polymerase (New England Biolabs, США), расщепление продукта амплификации и ДНК-вектора VTvaf17 проводили эндонуклеазами рестрикции BamHI и KpnI (New England Biolabs, США).

В результате получали ДНК-вектор VTvaf17-P4HA1 размером 4754 п.н. с нуклеотидной последовательностью SEQ ID №3 и общей структурой изображенной на фиг.1C.

При этом генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17 конструировали по Примеру 1.

Пример 4.

Получение генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-P4HA2, несущего целевой ген, а именно, гена P4HA2.

Генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-P4HA2 конструировали клонированием кодирующей части гена P4HA2 размером 1605 п.н. в ДНК-вектор VTvaf17 размером 3165 п.н. по сайтам рестрикции BamHII и SalI. Кодирующую часть гена P4HA2 размером 1605 п.н. получали путем выделения суммарной РНК из биологического образца ткани человека с последующим проведением реакции обратной транскрипции с использованием коммерческого набора Mint-2 (Евроген) и ПЦР-амплификации с использованием олигонуклеотидов:

P4HA2_F AGGATCCACCATGAAACTCTGGGTGTCTGCA

P4HA2_R CTTGTCGACTTAGTCAACTTCTGTTGATCCACA

и коммерческого набора Phusion® High-Fidelity DNA Polymerase (New England Biolabs, США), расщепление продукта амплификации и ДНК-вектора VTvaf17 проводили эндонуклеазами рестрикции BamHII и SalI (New England Biolabs, США).

В результате получали ДНК-вектор VTvaf17-P4HA2 размером 4704 п.н. с нуклеотидной последовательностью SEQ ID №4 и общей структурой изображенной на фиг.1D.

При этом генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17 конструировали по Примеру 1.

Пример 5.

Получение генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-COL7A1, несущего целевой ген, а именно, гена COL7A1.

Генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-COL7A1 конструировали клонированием кодирующей части гена COL7A1 размером 8838 п.н. в ДНК-вектор VTvaf17 размером 3165 п.н. по сайтам рестрикции SalI, EcoRI. Кодирующую часть гена COL7A1 размером 8838 п.н. получали путем выделения суммарной РНК из биологического образца ткани человека с последующим проведением реакции обратной транскрипции с использованием коммерческого набора Mint-2 (Евроген, Россия) и ПЦР-амплификации с использованием олигонуклеотидов:

COL7A1_F ATCGTCGACCACCATGACGCTGCGGCTTCTGGT

COL7A1_R ATAGAATTCAGTCCTGGGCAGTACCTGTC

и коммерческого набора Phusion® High-Fidelity DNA Polymerase (New England Biolabs, США), расщепление продукта амплификации и ДНК-вектора VTvaf17 проводили эндонуклеазами рестрикции SalI, EcoRI (New England Biolabs, США).

В результате получали ДНК-вектор VTvaf17-COL7A1 размером 11990 п.н. с нуклеотидной последовательностью SEQ ID №5 и общей структурой изображенной на фиг.1E.

При этом генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17 конструировали по Примеру 1.

Пример 6.

Получение ДНК-вектора VTvaf17-CLCA2, несущего целевой ген, а именно, гена CLCA2 человека.

Генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-CLCA2 конструировали клонированием кодирующей части гена CLCA2 размером 2833 п.н. в ДНК-вектор VTvaf17 размером 3165 п.н. по сайтам рестрикции BamHI и EcoRI. Кодирующую часть гена CLCA2 размером 2833 п.н. получали путем выделения суммарной РНК из биологического образца ткани человека с последующим проведением реакции обратной транскрипции с использованием коммерческого набора Mint-2 (Евроген, Россия) и ПЦР-амплификации с использованием олигонуклеотидов:

CLCA2_F AGGATCCACCATGACCCAAAGGAGCATTGC

CLCA2_R ATAGAATTCATAATAATTTTGTTCCATTCTCTTTC

и коммерческого набора Phusion® High-Fidelity DNA Polymerase (New England Biolabs, США), расщепление продукта амплификации и ДНК-вектора VTvaf17 проводили эндонуклеазами рестрикции BamHI и EcoRI (New England Biolabs, США).

В результате получали ДНК-вектор VTvaf17-CLCA2 размером 5974 п.н. с нуклеотидной последовательностью SEQ ID №6 и общей структурой изображенной на фиг.1F.

При этом генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17 конструировали по Примеру 1.

Пример 7.

Получение генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-ELN, несущего целевой ген, а именно, гена ELN.

Генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-ELN конструировали клонированием кодирующей части гена ELN размером 2068 п.н. в ДНК-вектор VTvaf17 размером 3165 п.н. по сайтам рестрикции SalI и EcoRI. Кодирующую часть гена ELN размером 2068 п.н. получали путем выделения суммарной РНК из биологического образца ткани человека с последующим проведением реакции обратной транскрипции с использованием коммерческого набора Mint-2 (Евроген) и ПЦР-амплификации с использованием олигонуклеотидов:

ELN_F TTTGTCGACCACCATGGCGGGTCTGACGGCGG

ELN_R TTTTTGAATTCTCATTTTCTCTTCCGGCCACAAGCTT

и коммерческого набора Phusion® High-Fidelity DNA Polymerase (New England Biolabs, США), расщепление продукта амплификации и ДНК-вектора VTvaf17 проводили эндонуклеазами рестрикции SalI и EcoRI (New England Biolabs, США).

В результате получали ДНК-вектор VTvaf17-ELN размером 5257 п.н. с нуклеотидной последовательностью SEQ ID №7 и общей структурой изображенной на фиг.1G.

При этом генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17 конструировали по Примеру 1.

Пример 8.

Получение генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-PLOD1, несущего целевой ген, а именно, гена PLOD1.

Генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-PLOD1 конструировали клонированием кодирующей части гена PLOD1 размером 2185 п.н. в ДНК-вектор VTvaf17 размером 3165 п.н. по сайтам рестрикции BamHII и EcoRI. Кодирующую часть гена PLOD1 размером 2185 п.н. получали путем выделения суммарной РНК из биологического образца ткани человека с последующим проведением реакции обратной транскрипции с использованием коммерческого набора Mint-2 (Евроген) и ПЦР-амплификации с использованием олигонуклеотидов:

PLOD1_F GGATCCACCATGCGGCCCCTGCTGCTACT

PLOD1_R ATAGAATTCAGGGATCGACGAAGGAGACT

и коммерческого набора Phusion® High-Fidelity DNA Polymerase (New England Biolabs, США), расщепление продукта амплификации и ДНК-вектора VTvaf17 проводили эндонуклеазами рестрикции BamHII и EcoRI (New England Biolabs, США).

В результате получали ДНК-вектор VTvaf17-PLOD1 размером 5326 п.н. с нуклеотидной последовательностью SEQ ID №8 и общей структурой изображенной на фиг.1H.

При этом генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17 конструировали по Примеру 1.

Пример 9.

Подтверждение способности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-COL1A1, несущего целевой ген, а именно, ген COL1A1, проникать в эукариотические клетки и подтверждение его функциональной активности на уровне экспрессии мРНК целевого гена. Данный пример также демонстрирует реализуемость способа применения генотерапевтического ДНК-вектора, несущего целевой ген.

Оценивали изменения накопления мРНК целевого гена COL1A1, в первичной культуре фибробластов кожи человека HDFa (ATCC PCS-201-01) через 48 часов после их трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-COL1A1, несущим ген COL1A1 человека. Количество мРНК определяли по динамике накопления ампликонов кДНК в реакции ПРЦ в реальном времени.

Для оценки изменения накопления мРНК целевого гена COL1A1, использовалась первичная культура фибробластов кожи человека HDFa. Клеточную культуру HDFa выращивали в стандартных условиях (37°С, 5% СО2) с использованием питательной среды Fibroblast Growth Kit-Serum-Free (ATCC® PCS-201-040). В процессе культивирования каждые 48 ч происходила смена ростовой среды.

Для получения 90% конфлюэнтности, за 24 часа до постановки трансфекции клетки высевали в 24-луночный планшет из расчета 5×10⁴ клеток/лунку. Трансфекцию генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-COL1A1, экспрессирующим ген COL1A1 человека, проводили с использованием Lipofectamine 3000 (ThermoFisher Scientific, США) согласно рекомендациям производителя. В пробирке №1 к 25 мкл среды Opti-MEM (Gibco, США) добавляли 1 мкл раствора ДНК-вектора VTvaf17-COL1A1 (концентрация 500 нг/мкл) и 1 мкл реагента Р3000. Аккуратно перемешивали легким встряхиванием. В пробирке №2 к 25 мкл среды Opti-MEM (Gibco, США) добавляли 1 мкл раствора Lipofectamin 3000. Аккуратно перемешивали легким встряхиванием. Добавляли содержимое пробирки №1 к содержимому пробирки №2, инкубировали 5 мин при комнатной температуре. Полученный раствор по каплям добавляли к клеткам в объеме 40 мкл.

В качестве контроля использовали клетки HDFa, трансфицированные генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17, не содержащим вставку целевого гена (кДНК гена COL1A1 до и после трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17, не содержащим вставку целевого гена на фигурах не показано). Подготовку контрольного вектора VTvaf17 для трансфекции проводили как описано выше.

Суммарную РНК из клеток HDFa выделяли с использованием Trizol Reagent (Invitrogen, США) согласно рекомендациям производителя. В лунку с клетками добавляли 1 мл Trizol Reagent и гомогенизировали с последующим прогреванием в течении 5 мин при 65°С. Далее образец центрифугировали при 14 000g в течении 10 мин и снова прогревали в течении 10 мин при 65°C. Далее добавляли 200 мкл хлороформа, плавно перемешивали и центрифугировали при 14 000g в течении 10 мин. Затем отбирали водную фазу, добавляли к ней 1/10 объема 3М ацетата натрия, рН 5.2 и равный объем изопропилового спирта. Инкубировали образец при -20°C в течении 10 мин с последующим центрифугированием при 14 000g в течении 10 мин. Осадок промывали 1 мл 70% этилового спирта, высушивали на воздухе и растворяли в 10 мкл воды, свободной от РНКаз. Определение уровня экспрессии мРНК гена COL1A1 после трансфекции проводили путем оценки динамики накопления ампликонов кДНК методом ПЦР в режиме реального времени. Для получения и амплификации кДНК, специфичной для гена COL1A1 человека, использовали олигонуклеотиды COL1A1_SF и COL1A1_SR:

Col1A1_SF TGACCTCAAGATGTGCCACT

Col1A1_SR CAGACATGCCTCTTGTCCTTG

Длина продукта амплификации - 195 п.н.

Реакцию обратной транскрипции и ПЦР-амплификацию проводили с помощью набора реагентов SYBR GreenQuantitect RT-PCR Kit (Qiagen, США) для ПЦР в режиме реального времени. Реакцию проводили в объеме 20 мкл, содержащих: 25 мкл QuantiTect SYBR Green RT-PCR MasterMix, 2,5 мM хлорида магния, по 0,5 мкМ каждого праймера, 5 мкл РНК. Реакцию осуществляли на амплификаторе CFX96 (Bio-Rad, США) при следующих условиях: 1 цикл обратной транскрипции при 42°С - 30 минут, денатурация 98°С - 15 мин, затем 40 циклов, включающих денатурацию 94°С - 15 сек, отжиг праймеров 60°C - 30 сек и элонгацию 72°С - 30 сек. В качестве референтного гена использовали ген B2M (Бета-2-микроглобулин) приведенный в базе данных GenBank под номером NM 004048.2. В качестве положительного контроля использовали ампликоны, получаемых при ПЦР на матрицах, представляющих собой плазмиды в известных концентрациях, содержащие последовательности кДНК генов COL1A1 и B2M. В качестве отрицательного контроля использовали деионизированную воду. Количество динамику накопления ампликонов кДНК генов COL1A1 и B2M оценивали в режиме реального времени с помощью программного обеспечения амплификатора Bio-RadCFXManager 2.1 (Bio-Rad, США). Графики, полученные в результате анализа представлены на фиг. 2.

Из фигуры 2 следует, что в результате трансфекции первичной культуры клеток фибробластов человека HDFa генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-COL1A1, уровень специфической мРНК гена COL1A1 человека вырос многократно, что подтверждает способность вектора проникать в эукариотические клетки и экспрессировать ген COL1A1 на уровне мРНК. Представленные результаты также подтверждают реализуемость способа применения генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-COL1A1 для повышения уровня экспрессии гена COL1A1 в эукариотических клетках.

Пример 10.

Подтверждение способности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-COL1A2, несущего целевой ген, а именно, ген COL1A2, проникать в эукариотические клетки и подтверждение его функциональной активности на уровне экспрессии мРНК целевого гена. Данный пример также демонстрирует реализуемость способа применения генотерапевтического ДНК-вектора, несущего целевой ген.

Оценивали изменения накопления мРНК целевого гена COL1A2, в первичной культуре фибробластов кожи человека HDFa (ATCC PCS-201-01) через 48 часов после их трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-COL1A2, несущим ген COL1A2 человека. Количество мРНК определяли по динамике накопления ампликонов кДНК в реакции ПРЦ в реальном времени.

Первичную культуру клеток фибробластов кожи человека HDFa выращивали в среде Fibroblast Growth Kit-Serum-Free (ATCC® PCS-201-040) в стандартных условиях (37°С, 5% СО2). Для получения 90% конфлюэнтности, за 24 часа до постановки трансфекции клетки высевали в 24-луночный планшет из расчета 5×10⁴ клеток/лунку. Для трансфекции использовали реагент Lipofectamine 3000 (ThermoFisher Scientific, США). Трансфекцию генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-COL1A2, экспрессирующим ген COL1A2 человека, проводили как описано в примере 9. В качестве референтного гена использовали ген B2M (Бета-2-микроглобулин) приведенный в базе данных GenBank под номером NM 004048.2. В качестве контроля использовали культуру клеток HDFa, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17, не несущим целевой ген (кДНК гена COL1A2 до и после трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17, не содержащим вставку целевого гена на фигурах не показано). Выделение РНК, реакцию обратной транскрипции и ПЦР в реальном времени проводили как описано в примере 9, за исключением олигонуклеотидов с отличающимися от примера 9 последовательностями. Для амплификации кДНК, специфичной для гена COL1A2 человека, использовали олигонуклеотиды COL1A2_SF и COL1A2_SR:

COL1A2_SF TGAACTTGTTGCTGAGGGCA

COL1A2_SR CCAGTTCTTGGCTGGGATGT

Длина продукта амплификации - 195 п.н.

В качестве положительного контроля использовали ампликоны, получаемых при ПЦР на матрицах, представляющих собой плазмиды в известных концентрациях, содержащие последовательности кДНК генов COL1A2 и B2M. В качестве отрицательного контроля использовали деионизированную воду. Количество ПЦР продуктов - кДНК генов COL1A2 и B2M, полученных в результате амплификации, оценивали в режиме реального времени с помощью программного обеспечения амплификатора Bio-RadCFXManager 2.1 (Bio-Rad, США). Графики, полученные в результате анализа представлены на фиг. 3.

Из фигуры 3 следует, что в результате трансфекции культуры фибробластов кожи человека HDFa генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-COL1A2, уровень специфической мРНК гена COL1A2 человека вырос многократно, что подтверждает способность вектора проникать в эукариотические клетки и экспрессировать ген COL1A2 на уровне мРНК. Представленные результаты также подтверждают реализуемость способа применения генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-COL1A2 для повышения уровня экспрессии гена COL1A2 в эукариотических клетках.

Пример 11.

Подтверждение способности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-P4HA1, несущего целевой ген, а именно, ген P4HA1, проникать в эукариотические клетки и подтверждение его функциональной активности на уровне экспрессии мРНК целевого гена. Данный пример также демонстрирует реализуемость способа применения генотерапевтического ДНК-вектора, несущего целевой ген.

Оценивали изменения накопления мРНК целевого гена P4HA1 в культуре клеток фибробластов крайней плоти человека линии Hs27 (ATCC CRL-1634) через 48 часов после их трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-P4HA1, несущим ген P4HA1 человека. Количество мРНК определяли по динамике накопления ампликонов кДНК в реакции ПРЦ в реальном времени.

Культуру клеток фибробластов крайней плоти человека линии Hs27 выращивали в среде Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) (ATCC® 30-2002™) с добавлением 10 % сыворотки крупного рогатого скота (ATCC® 30-2020™) в стандартных условиях (37°С, 5% СО2). Для получения 90% конфлюэнтности, за 24 часа до постановки трансфекции клетки высевали в 24-луночный планшет из расчета 5×10⁴ клеток/лунку. Для трансфекции использовали реагент Lipofectamine 3000 (ThermoFisher Scientific, США). Трансфекцию генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-P4HA1, экспрессирующим ген P4HA1 человека, проводили как описано в примере 9. В качестве референтного гена использовали ген B2M (Бета-2-микроглобулин) приведенный в базе данных GenBank под номером NM 004048.2. В качестве контроля использовали культуру клеток линии Hs27, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17, не несущим целевой ген (кДНК гена P4HA1 до и после трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17, не содержащим вставку целевого гена на фигурах не показано). Выделение РНК, реакцию обратной транскрипции и ПЦР в реальном времени проводили как описано в примере 9, за исключением олигонуклеотидов с отличающимися от примера 9 последовательностями. Для амплификации кДНК, специфичной для гена P4HA1 человека, использовали олигонуклеотиды P4HA1_SF и P4HA1_SR:

P4HA1_SF AAAAGTGCCTGGCTCTCTGG

P4HA1_SR TGGCTCATCTTTCCGTGCAA

Длина продукта амплификации - 171 п.н.

В качестве положительного контроля использовали ампликоны, получаемых при ПЦР на матрицах, представляющих собой плазмиды в известных концентрациях, содержащие последовательности кДНК генов P4HA1 и B2M. В качестве отрицательного контроля использовали деионизированную воду. Количество ПЦР продуктов - кДНК генов P4HA1 и B2M, полученных в результате амплификации, оценивали в режиме реального времени с помощью программного обеспечения амплификатора Bio-RadCFXManager 2.1 (Bio-Rad, США). Графики, полученные в результате анализа представлены на фиг. 4.

Из фигуры 4 следует, что в результате трансфекции культуры клеток фибробластов крайней плоти человека линии Hs27 генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-P4HA1 уровень специфической мРНК гена P4HA1 человека вырос многократно, что подтверждает способность вектора проникать в эукариотические клетки и экспрессировать ген P4HA1 на уровне мРНК. Представленные результаты также подтверждают реализуемость способа применения генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-P4HA1 для повышения уровня экспрессии гена P4HA1 в эукариотических клетках.

Пример 12.

Подтверждение способности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-P4HA2, несущего целевой ген, а именно, ген P4HA2, проникать в эукариотические клетки и подтверждение его функциональной активности на уровне экспрессии мРНК целевого гена. Данный пример также демонстрирует реализуемость способа применения генотерапевтического ДНК-вектора, несущего целевой ген.

Оценивали изменения накопления мРНК целевого гена P4HA2, в культуре клеток фибробластов крайней плоти человека линии Hs27 (ATCC CRL-1634) через 48 часов после их трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-P4HA2, несущим ген P4HA2 человека. Количество мРНК определяли по динамике накопления ампликонов кДНК в реакции ПРЦ в реальном времени.

Культуру клеток фибробластов крайней плоти человека линии Hs27 выращивали в среде Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) (ATCC® 30-2002™) с добавлением 10 % сыворотки крупного рогатого скота (ATCC® 30-2020™) в стандартных условиях (37°С, 5% СО2). Для получения 90% конфлюэнтности, за 24 часа до постановки трансфекции клетки высевали в 24-луночный планшет из расчета 5×10⁴ клеток/лунку. Для трансфекции использовали реагент Lipofectamine 3000 (ThermoFisher Scientific, США). Трансфекцию генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-P4HA2, экспрессирующим ген P4HA2 человека, проводили как описано в примере 9. В качестве контроля использовали культуру клеток Hs27, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17, не несущим целевой ген (кДНК гена P4HA2 до и после трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17, не содержащим вставку целевого гена на фигурах не показано). Выделение РНК, реакцию обратной транскрипции и ПЦР в реальном времени проводили как описано в примере 9, за исключением олигонуклеотидов с отличающимися от примера 9 последовательностями. Для амплификации кДНК, специфичной для гена P4HA2 человека, использовали олигонуклеотиды P4HA2_SF и P4HA2_SR:

P4HA2_SF AGGTACCACCATGGCAACAG

P4HA2_SR GTCTTGGGATCACGAACGGT

Длина продукта амплификации - 179 п.н.

В качестве положительного контроля использовали ампликоны, получаемых при ПЦР на матрицах, представляющих собой плазмиды в известных концентрациях, содержащие последовательности кДНК генов P4HA2 и B2M. В качестве референтного гена использовали ген B2M (Бета-2-микроглобулин) приведенный в базе данных GenBank под номером NM 004048.2. В качестве отрицательного контроля использовали деионизированную воду. Количество ПЦР продуктов - кДНК генов P4HA2 и B2M, полученных в результате амплификации, оценивали в режиме реального времени с помощью программного обеспечения амплификатора Bio-RadCFXManager 2.1 (Bio-Rad, США). Графики, полученные в результате анализа представлены на фиг. 5.

Из фигуры 5 следует, что в результате трансфекции культуры клеток фибробластов крайней плоти человека линии Hs27 генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-P4HA2, уровень специфической мРНК гена P4HA2 человека вырос многократно, что подтверждает способность вектора проникать в эукариотические клетки и экспрессировать ген P4HA2 на уровне мРНК. Представленные результаты также подтверждают реализуемость способа применения генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-P4HA2 для повышения уровня экспрессии гена P4HA2 в эукариотических клетках.

Пример 13.

Подтверждение способности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-COL7A1, несущего целевой ген, а именно, ген COL7A1, проникать в эукариотические клетки и подтверждение его функциональной активности на уровне экспрессии мРНК целевого гена. Данный пример также демонстрирует реализуемость способа применения генотерапевтического ДНК-вектора, несущего целевой ген.

Оценивали изменения накопления мРНК целевого гена COL7A1, в культуре фибробластов человека HT 297.T (ATCC® CRL-7782™) через 48 часов после их трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-COL7A1, несущим ген COL7A1 человека. Количество мРНК определяли по динамике накопления ампликонов кДНК в реакции ПРЦ в реальном времени.

Культуру клеток фибробластов кожи человека линии HT 297.T выращивали в среде Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) (ATCC® 30-2002™) с добавлением 10 % сыворотки крупного рогатого скота (ATCC® 30-2020™) в стандартных условиях (37°С, 5% СО2). Для получения 90% конфлюэнтности, за 24 часа до постановки трансфекции клетки высевали в 24-луночный планшет из расчета 5×10⁴ клеток/лунку. Для трансфекции использовали реагент Lipofectamine 3000 (ThermoFisher Scientific, США). Трансфекцию генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-COL7A1, экспрессирующим ген COL7A1 человека, проводили как описано в примере 9. В качестве референтного гена использовали ген B2M (Бета-2-микроглобулин) приведенный в базе данных GenBank под номером NM 004048.2. В качестве контроля использовали культуру клеток HT 297.T, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17, не несущим целевой ген (кДНК гена COL7A1 до и после трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17, не содержащим вставку целевого гена на фигурах не показано). Выделение РНК, реакцию обратной транскрипции и ПЦР в реальном времени проводили как описано в примере 9, за исключением олигонуклеотидов с отличающимися от примера 9 последовательностями. Для амплификации кДНК, специфичной для гена COL7A1 человека, использовали олигонуклеотиды COL7A1 _SF и COL7A1 _SR:

COL7A1_SF CAAAGGAGAGATGGGGGAGC

COL7A1_SR ATCATTTCCACTGGGGCCTG

Длина продукта амплификации - 184 п.н.

В качестве положительного контроля использовали ампликоны, получаемых при ПЦР на матрицах, представляющих собой плазмиды в известных концентрациях, содержащие последовательности кДНК генов COL7A1 и B2M. В качестве отрицательного контроля использовали деионизированную воду. Количество ПЦР продуктов - кДНК генов COL7A1 и B2M, полученных в результате амплификации, оценивали в режиме реального времени с помощью программного обеспечения амплификатора Bio-RadCFXManager 2.1 (Bio-Rad, США). Графики, полученные в результате анализа представлены на фиг. 6.

Из фигуры 6 следует, что в результате трансфекции культуры клеток фибробластов человека HT 297.T генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-COL7A1, уровень специфической мРНК гена COL7A1 человека вырос многократно, что подтверждает способность вектора проникать в эукариотические клетки и экспрессировать ген COL7A1 на уровне мРНК. Представленные результаты также подтверждают реализуемость способа применения генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-COL7A1 для повышения уровня экспрессии гена COL7A1 в эукариотических клетках.

Пример 14.

Подтверждение способности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-CLCA2, несущего целевой ген, а именно, ген CLCA2, проникать в эукариотические клетки и подтверждение его функциональной активности на уровне экспрессии мРНК целевого гена. Данный пример также демонстрирует реализуемость способа применения генотерапевтического ДНК-вектора, несущего целевой ген.

Оценивали изменения накопления мРНК целевого гена CLCA2 в культуре фибробластов человека HT 297.T (ATCC® CRL-7782™) через 48 часов после их трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-CLCA2, несущим ген CLCA2 человека. Количество мРНК определяли по динамике накопления ампликонов кДНК в реакции ПРЦ в реальном времени.

Культуру клеток фибробластов кожи человека линии HT 297.T выращивали в среде Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) (ATCC® 30-2002™) с добавлением 10 % сыворотки крупного рогатого скота (ATCC® 30-2020™) в стандартных условиях (37°С, 5% СО2). Для получения 90% конфлюэнтности, за 24 часа до постановки трансфекции клетки высевали в 24-луночный планшет из расчета 5×10⁴ клеток/лунку. Для трансфекции использовали реагент Lipofectamine 3000 (ThermoFisher Scientific, США). Трансфекцию генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-CLCA2, экспрессирующим ген CLCA2 человека, проводили как описано в примере 9. В качестве референтного гена использовали ген B2M (Бета-2-микроглобулин) приведенный в базе данных GenBank под номером NM 004048.2. В качестве контроля использовали культуру клеток линии HT 297.T, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17, не несущим целевой ген (кДНК гена CLCA2 до и после трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17, не содержащим вставку целевого гена на фигурах не показано). Выделение РНК, реакцию обратной транскрипции и ПЦР в реальном времени проводили как описано в примере 9, за исключением олигонуклеотидов с отличающимися от примера 9 последовательностями. Для амплификации кДНК, специфичной для гена CLCA2 человека, использовали олигонуклеотиды CLCA2_SF и CLCA2_SR:

CLCA2_SF GGAGGCTCCTTTTCAGTGCT

CLCA2_SR GTAGCCTGGCCCTGATCAAA

Длина продукта амплификации - 155 п.н.

В качестве положительного контроля использовали ампликоны, получаемых при ПЦР на матрицах, представляющих собой плазмиды в известных концентрациях, содержащие последовательности кДНК генов CLCA2 и B2M. В качестве отрицательного контроля использовали деионизированную воду. Количество ПЦР продуктов - кДНК генов CLCA2 и B2M, полученных в результате амплификации, оценивали в режиме реального времени с помощью программного обеспечения амплификатора Bio-RadCFXManager 2.1 (Bio-Rad, США). Графики, полученные в результате анализа представлены на фиг. 7.

Из фигуры 7 следует, что в результате трансфекции культуры клеток фибробластов человека HT 297.T генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-CLCA2 уровень специфической мРНК гена CLCA2 человека вырос многократно, что подтверждает способность вектора проникать в эукариотические клетки и экспрессировать ген CLCA2 на уровне мРНК. Представленные результаты также подтверждают реализуемость способа применения генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-CLCA2 для повышения уровня экспрессии гена CLCA2 в эукариотических клетках.

Пример 15.

Подтверждение способности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-ELN, несущего целевой ген, а именно, ген ELN, проникать в эукариотические клетки и подтверждение его функциональной активности на уровне экспрессии мРНК целевого гена. Данный пример также демонстрирует реализуемость способа применения генотерапевтического ДНК-вектора, несущего целевой ген.

Оценивали изменения накопления мРНК целевого гена ELN, в культуре кератиноцитов эпидермиса человека HEKa (ATCC PCS-200-011) через 48 часов после их трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-ELN, несущим ген ELN человека. Количество мРНК определяли по динамике накопления ампликонов кДНК в реакции ПРЦ в реальном времени.

Культуру клеток кератиноцитов эпидермиса человека HEKa выращивали в среде Keratinocyte Growth Kit (ATCC® PCS-200-040™) в стандартных условиях (37°С, 5% СО2). в стандартных условиях (37°С, 5% СО2). Для получения 90% конфлюэнтности, за 24 часа до постановки трансфекции клетки высевали в 24-луночный планшет из расчета 5×10⁴ клеток/лунку. Для трансфекции использовали реагент Lipofectamine 3000 (ThermoFisher Scientific, США). Трансфекцию генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-ELN, экспрессирующим ген ELN человека, проводили как описано в примере 9. В качестве контроля использовали культуру клеток HEKa, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17, не несущим целевой ген (кДНК гена ELN до и после трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17, не содержащим вставку целевого гена на фигурах не показано). Выделение РНК, реакцию обратной транскрипции и ПЦР в реальном времени проводили как описано в примере 9, за исключением олигонуклеотидов с отличающимися от примера 9 последовательностями. Для амплификации кДНК, специфичной для гена ELN человека, использовали олигонуклеотиды ELN _SF и ELN _SR:

ELN_SF CCAGTTTGGCCTAGTGGGAG

ELN_SR ATGGGAGACAATCCGAAGCC

Длина продукта амплификации - 159 п.н.

В качестве положительного контроля использовали ампликоны, получаемых при ПЦР на матрицах, представляющих собой плазмиды в известных концентрациях, содержащие последовательности кДНК генов ELN и B2M. В качестве референтного гена использовали ген B2M (Бета-2-микроглобулин) приведенный в базе данных GenBank под номером NM 004048.2. В качестве отрицательного контроля использовали деионизированную воду. Количество ПЦР продуктов - кДНК генов ELN и B2M, полученных в результате амплификации, оценивали в режиме реального времени с помощью программного обеспечения амплификатора Bio-RadCFXManager 2.1 (Bio-Rad, США). Графики, полученные в результате анализа представлены на фиг. 8.

Из фигуры 8 следует, что в результате трансфекции культуры клеток кератиноцитов эпидермиса человека HEKa генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-ELN, уровень специфической мРНК гена ELN человека вырос многократно, что подтверждает способность вектора проникать в эукариотические клетки и экспрессировать ген ELN на уровне мРНК. Представленные результаты также подтверждают реализуемость способа применения генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-ELN для повышения уровня экспрессии гена ELN в эукариотических клетках.

Пример 16.

Подтверждение способности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-PLOD1, несущего целевой ген, а именно, ген PLOD1, проникать в эукариотические клетки и подтверждение его функциональной активности на уровне экспрессии мРНК целевого гена. Данный пример также демонстрирует реализуемость способа применения генотерапевтического ДНК-вектора, несущего целевой ген.

Оценивали изменения накопления мРНК целевого гена PLOD1, в культуре меланоцитов эпидермиса HEMa (ATCC® PCS-200-013™) через 48 часов после их трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-PLOD1, несущим ген PLOD1 человека. Количество мРНК определяли по динамике накопления ампликонов кДНК в реакции ПРЦ в реальном времени.

Культуру клеток меланоцитов эпидермиса человека линии HEMa выращивали в среде Dermal Cell Basal Medium (ATCC® PCS-200-030™) с добавлением Adult Melanocyte Growth Kit (ATCC® PCS-200-042™) в стандартных условиях (37°С, 5% СО2). в стандартных условиях (37°С, 5% СО2). Для получения 90% конфлюэнтности, за 24 часа до постановки трансфекции клетки высевали в 24-луночный планшет из расчета 5×10⁴ клеток/лунку. Для трансфекции использовали реагент Lipofectamine 3000 (ThermoFisher Scientific, США). Трансфекцию генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-PLOD1, экспрессирующим ген PLOD1 человека, проводили как описано в примере 9. В качестве контроля использовали культуру клеток HEMa, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17, не несущим целевой ген (кДНК гена PLOD1 до и после трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17, не содержащим вставку целевого гена на фигурах не показано). Выделение РНК, реакцию обратной транскрипции и ПЦР в реальном времени проводили как описано в примере 9, за исключением олигонуклеотидов с отличающимися от примера 9 последовательностями. Для амплификации кДНК, специфичной для гена PLOD1 человека, использовали олигонуклеотиды PLOD1_SF и PLOD1_SR:

PLOD1_SF GCCTCCACCTTCACCATCAA

PLOD1_SR AAGGAGACTGCGATGTAGCG

Длина продукта амплификации - 197 п.н.

В качестве положительного контроля использовали ампликоны, получаемых при ПЦР на матрицах, представляющих собой плазмиды в известных концентрациях, содержащие последовательности кДНК генов PLOD1 и B2M. В качестве референтного гена использовали ген B2M (Бета-2-микроглобулин) приведенный в базе данных GenBank под номером NM 004048.2. В качестве отрицательного контроля использовали деионизированную воду. Количество ПЦР продуктов - кДНК генов PLOD1 и B2M, полученных в результате амплификации, оценивали в режиме реального времени с помощью программного обеспечения амплификатора Bio-RadCFXManager 2.1 (Bio-Rad, США). Графики, полученные в результате анализа представлены на фиг. 9.

Из фигуры 9 следует, что в результате трансфекции культуры клеток меланоцитов эпидермиса HEMa генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-PLOD1, уровень специфической мРНК гена PLOD1 человека вырос многократно, что подтверждает способность вектора проникать в эукариотические клетки и экспрессировать ген PLOD1 на уровне мРНК. Представленные результаты также подтверждают реализуемость способа применения генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-PLOD1 для повышения уровня экспрессии гена PLOD1 в эукариотических клетках.

Пример 17.

Подтверждение эффективности и реализуемости способа применения генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-COL1A1, несущего ген COL1A1, для повышения экспрессии белка COL1A1 в клетках млекопитающих.

Оценивали изменение количества белка COL1A1 в лизате фибробластов кожи человека HDFa (ATCC PCS-201-01) после трансфекции этих клеток ДНК-вектором VTvaf17-COL1A1, несущим ген COL1A1 человека.

Клеточную культуру фибробластов кожи человека HDFa выращивали как это описано в примере 9.

Для получения 90% конфлюэнтности, за 24 часа до постановки трансфекции клетки высевали в 24-луночный планшет из расчета 5×10⁴ клеток/лунку. Для трансфекции использовали реагент SuperFect Transfection Reagent 6-го поколения (Qiagen, Германия). В качестве контроля использовали водный раствор дендримеров без ДНК-вектора (А), ДНК-вектор VTvaf17, не содержащий кДНК гена COL1A1 (В), в качестве трансфицируемых агентов - ДНК-вектор VTvaf17-COL1A1, несущий ген COL1A1 человека (C). Приготовление комплекса ДНК/дендример проводили по методике производителя (QIAGEN, SuperFect Transfection Reagent Handbook, 2002) с некоторыми изменениями. Для трансфекции клеток в одной лунке 24-луночного планшета к 1 мкг ДНК-вектора, растворенного в буфере ТЕ, добавляли культуральную среду до конечного объема 60 мкл, затем добавляли 5 мкл SuperFect Transfection Reagent и осторожно перемешивали пятикратным пипетированием. Комплекс инкубировали при комнатной температуре в течении 10-15 мин. Далее отбирали из лунок культуральную среду, лунки промывали 1 мл буфера PBS. К образовавшемуся комплексу добавляли 350 мкл среды, содержащей 10 мкг/мл гентамицина, осторожно перемешивали и добавляли к клеткам. Клетки инкубировали с комплексом 2-3 часа при 37°С в атмосфере, содержащей 5% СО2.

Затем осторожно удаляли среду, промывали клеточный монослой 1 мл буфера PBS. Затем добавляли среду, содержащую 10 мкг/мл гентамицина, и инкубировали 24-48 часов при 37°С в атмосфере 5% СО2.

После трансфекции клетки промывали три раза PBS, далее к клеткам добавляли 1 мл PBS и подвергали трехкратному замораживанию/оттаиванию. Далее суспензию центрифугировали при 15 000 об/мин в течение 15 мин, отбирали супернатант и использовали его для количественного определения целевого белка.

Количественное определение белка COL1A1 проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), используя набор Human COL1A1 / Collagen I Alpha 1 ELISA Kit (Sandwich ELISA) (LifeSpan BioSciences, LS-F22003-1) согласно методике производителя с детекцией оптической плотности при помощи автоматического биохимического и иммуноферментного анализатора ChemWell (Awareness Technology Inc., США).

Численное значение концентрации определяли с помощью калибровочной кривой, построенной по стандартным образцам с известной концентрацией белка COL1A1, входящим в состав набора. Чувствительность метода составляла не менее 188 пг/мл, диапазон измерения - от 313 пг/мл до 20000 пг/мл. Статистическую обработку полученных результатов осуществляли с помощью программного обеспечения для статистической обработки и визуализации данных R, версия 3.0.2 (https://www.r-project.org/). Графические материалы, полученные в результате анализа представлены на фиг. 10.

Из фигуры 10 следует, что трансфекция клеток фибробластов кожи человека HDFa генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-COL1A1 приводит к увеличению количества белка COL1A1 по сравнению с контрольными образцами, что подтверждает способность вектора проникать в эукариотические клетки и экспрессировать ген COL1A1 на уровне белка. Представленные результаты также подтверждают реализуемость способа применения генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-COL1A1 для повышения уровня экспрессии COL1A1 в эукариотических клетках.

Пример 18.

Подтверждение эффективности и реализуемости способа применения генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-COL1A2, несущего ген COL1A2, для повышения экспрессии белка COL1A2 в клетках млекопитающих.

Оценивали изменение количества белка COL1A2 в клеточном лизате фибробластов кожи человека HDFa (ATCC PCS-201-01) после трансфекции этих клеток ДНК-вектором VTvaf17-COL1A2, несущим ген COL1A2 человека. Клетки выращивали как описано в примере 10.

Для трансфекции использовали реагент SuperFect Transfection Reagent 6-го поколения (Qiagen, Германия). В качестве контроля использовали водный раствор дендримеров без ДНК-вектора (А), ДНК-вектор VTvaf17, не содержащий кДНК гена COL1A2 (В), в качестве трансфицируемых агентов - ДНК-вектор VTvaf17-COL1A2, несущий ген COL1A2 человека (С). Приготовление комплекса ДНК-дендример и трансфекцию клеток HDFa проводили как описано в примере 17.

После трансфекции к 0,5 мл культуральной жидкости добавляли 0,1 мл 1N HCl, тщательно перемешивали и инкубировали 10 минут при комнатной температуре. Затем нейтрализовали смесь, добавляя 0,1 мл 1.2М NaOH/0.5M HEPES (pH 7-7,6) и тщательно перемешивали. Отбирали супернатант и использовали его для количественного определения целевого белка. Количественное определение белка COL1A2 проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), используя набор Human COL1A2 / Collagen I Alpha 2 ELISA Kit (Sandwich ELISA) (LifeSpan Biosciences, LS-F26740) согласно методике производителя с детекцией оптической плотности при помощи автоматического биохимического и иммуноферментного анализатора ChemWell (Awareness Technology Inc., США).

Численное значение концентрации определяли с помощью калибровочной кривой, построенной по стандартным образцам с известной концентрацией белка COL1A2, входящим в состав набора. Чувствительность метода составляла не менее 100 пг/мл, диапазон измерения - от 500 пг/мл до 10000 пг/мл. Статистическую обработку полученных результатов осуществляли с помощью программного обеспечения для статистической обработки и визуализации данных R, версия 3.0.2 (https://www.r-project.org/). Графические материалы, полученные в результате анализа представлены на фиг. 11.

Из фигуры 11 следует, что трансфекция первичной культуры фибробластов кожи человека HDFa человека генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-COL1A2 приводит к увеличению количества белка COL1A2 по сравнению с контрольными образцами, что подтверждает способность вектора проникать в эукариотические клетки и экспрессировать ген COL1A2 на уровне белка. Представленные результаты также подтверждают реализуемость способа применения генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-COL1A2 для повышения уровня экспрессии COL1A2 в эукариотических клетках.

Пример 19.

Подтверждение эффективности и реализуемости способа применения генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-P4HA1, несущего ген P4HA1, для повышения экспрессии белка P4HA1 в клетках млекопитающих.

Оценивали изменение количества белка P4HA1 в лизате клеток фибробластов крайней плоти человека линии Hs27 (ATCC CRL-1634) после трансфекции этих клеток ДНК-вектором VTvaf17-P4HA1, несущим ген P4HA1 человека. Клетки культивировали как описано в примере 11.

Для трансфекции использовали реагент SuperFect Transfection Reagent 6-го поколения (Qiagen, Германия). В качестве контроля использовали водный раствор дендримеров без ДНК-вектора (А), ДНК-вектор VTvaf17, не содержащий кДНК гена P4HA1 (В), в качестве трансфицируемых агентов - ДНК-вектор VTvaf17-P4HA1, несущий ген P4HA1 человека (C). Приготовление комплекса ДНК-дендример и трансфекцию клеток Hs27 проводили как описано в примере 17.

После трансфекции к 0,5 мл культуральной жидкости добавляли 0,1 мл 1N HCl, тщательно перемешивали и инкубировали 10 минут при комнатной температуре. Затем нейтрализовали смесь, добавляя 0,1 мл 1.2М NaOH/0.5M HEPES (pH 7-7,6) и тщательно перемешивали. Отбирали супернатант и использовали его для количественного определения целевого белка. Количественное определение белка P4HA1 проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), используя набор Human P4HA1 ELISA Kit (Sandwich ELISA) (LifeSpan BioSciences, LS-F12242-1) согласно методике производителя с детекцией оптической плотности при помощи автоматического биохимического и иммуноферментного анализатора ChemWell (Awareness Technology Inc., США).

Численное значение концентрации определяли с помощью калибровочной кривой, построенной по стандартным образцам с известной концентрацией белка P4HA1, входящим в состав набора. Чувствительность метода составляла не менее 625 пг/мл, диапазон измерения - от 625 пг/мл до 40000 пг/мл. Статистическую обработку полученных результатов осуществляли с помощью программного обеспечения для статистической обработки и визуализации данных R, версия 3.0.2 (https://www.r-project.org/). Графические материалы, полученные в результате анализа представлены на фиг. 12.

Из фигуры 12 следует, что трансфекция культуры клеток фибробластов крайней плоти человека линии Hs27 генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-P4HA1 приводит к увеличению количества белка P4HA1 по сравнению с контрольными образцами, что подтверждает способность вектора проникать в эукариотические клетки и экспрессировать ген P4HA1 на уровне белка. Представленные результаты также подтверждают реализуемость способа применения генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-P4HA1 для повышения уровня экспрессии P4HA1 в эукариотических клетках.

Пример 20.

Подтверждение эффективности и реализуемости способа применения генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-P4HA2, несущего ген P4HA2, для повышения экспрессии белка P4HA2 в клетках млекопитающих.

Оценивали изменение количества белка P4HA2 в лизате культуры клеток фибробластов крайней плоти человека линии Hs27 (ATCC CRL-1634) после трансфекции этих клеток ДНК-вектором VTvaf17-P4HA2, несущим ген P4HA2 человека. Клетки культивировали как описано в примере 12.

Для трансфекции использовали реагент SuperFect Transfection Reagent 6-го поколения (Qiagen, Германия). В качестве контроля использовали водный раствор дендримеров без ДНК-вектора (А), ДНК-вектор VTvaf17, не содержащий кДНК гена P4HA2 (В), в качестве трансфицируемых агентов - ДНК-вектор VTvaf17-P4HA2, несущий ген P4HA2 человека (C). Приготовление комплекса ДНК-дендримеры и трансфекцию клеток Hs27 проводили как описано в примере 17.

После трансфекции к 0,5 мл культуральной жидкости добавляли 0,1 мл 1N HCl, тщательно перемешивали и инкубировали 10 минут при комнатной температуре. Затем нейтрализовали смесь, добавляя 0,1 мл 1.2М NaOH/0.5M HEPES (pH 7-7,6) и тщательно перемешивали. Отбирали супернатант и использовали его для количественного определения целевого белка.

Количественное определение белка P4HA2 проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), используя набор Human P4HA2 ELISA Kit (Sandwich ELISA) (LifeSpan BioSciences, LS-F33689-1) с детекцией оптической плотности при помощи автоматического биохимического и иммуноферментного анализатора ChemWell (Awareness Technology Inc., США).

Численное значение концентрации определяли с помощью калибровочной кривой, построенной по стандартным образцам с известной концентрацией белка P4HA2, входящим в состав набора. Чувствительность метода составляла не менее 469 пг/мл, диапазон измерения - от 780 пг/мл до 50000 пг/мл. Статистическую обработку полученных результатов осуществляли с помощью программного обеспечения для статистической обработки и визуализации данных R, версия 3.0.2 (https://www.r-project.org/). Графические материалы, полученные в результате анализа, представлены на фиг. 13.

Из фигуры 13 следует, что трансфекция культуры клеток фибробластов крайней плоти человека линии Hs27 генотерапевтическим ДНК-вектором Vtvaf17-P4HA2 приводит к увеличению количества белка P4HA2 по сравнению с контрольными образцами, что подтверждает способность вектора проникать в эукариотические клетки и экспрессировать ген P4HA2 на уровне белка. Представленные результаты также подтверждают реализуемость способа применения генотерапевтического ДНК-вектора Vtvaf17-P4HA2 для повышения уровня экспрессии P4HA2 в эукариотических клетках.

Пример 21.

Подтверждение эффективности и реализуемости способа применения генотерапевтического ДНК-вектора Vtvaf17-COL7A1, несущего ген COL7A1, для повышения экспрессии белка COL7A1 в клетках млекопитающих.

Оценивали изменение количества белка COL7A1 в лизате фибробластов человека HT 297.T (ATCC® CRL-7782™) после трансфекции этих клеток ДНК-вектором Vtvaf17-COL7A1, несущим ген COL7A1 человека. Клетки выращивали как описано в примере 13.

Для трансфекции использовали реагент SuperFect Transfection Reagent 6-го поколения (Qiagen, Германия). В качестве контроля использовали водный раствор дендримеров без ДНК-вектора (А), ДНК-вектор Vtvaf17, не содержащий кДНК гена COL7A1 (В), в качестве трансфицируемых агентов - ДНК-вектор Vtvaf17-COL7A1, несущий ген COL7A1 человека (С). Приготовление комплекса ДНК-дендример и трансфекцию клеток HT 297.T проводили как описано в примере 17.

После трансфекции к 0,5 мл культуральной жидкости добавляли 0,1 мл 1N HCl, тщательно перемешивали и инкубировали 10 минут при комнатной температуре. Затем нейтрализовали смесь, добавляя 0,1 мл 1.2М NaOH/0.5M HEPES (pH 7-7,6) и тщательно перемешивали. Отбирали супернатант и использовали его для количественного определения целевого белка. Количественное определение белка COL7A1 проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), используя набор Human COL7A1 / Collagen VII ELISA Kit (Sandwich ELISA) (LifeSpan BioSciences, LS-F11164-1) согласно методике производителя с детекцией оптической плотности при помощи автоматического биохимического и иммуноферментного анализатора ChemWell (Awareness Technology Inc., США).

Численное значение концентрации определяли с помощью калибровочной кривой, построенной по стандартным образцам с известной концентрацией белка COL7A1, входящим в состав набора. Чувствительность метода составляла не менее 156 пг/мл, диапазон измерения - от 156 пг/мл до 10000 пг/мл. Статистическую обработку полученных результатов осуществляли с помощью программного обеспечения для статистической обработки и визуализации данных R, версия 3.0.2 (https://www.r-project.org/). Графические материалы, полученные в результате анализа представлены на фиг. 14.

Из фигуры 14 следует, что трансфекция фибробластов человека HT 297.T генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-COL7A1 приводит к увеличению количества белка COL7A1 по сравнению с контрольными образцами, что подтверждает способность вектора проникать в эукариотические клетки и экспрессировать ген COL7A1 на уровне белка. Представленные результаты также подтверждают реализуемость способа применения генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-COL7A1 для повышения уровня экспрессии COL7A1 в эукариотических клетках.

Пример 22.

Подтверждение эффективности и реализуемости способа применения генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-CLCA2, несущего ген CLCA2, для повышения экспрессии белка CLCA2 в клетках млекопитающих.

Оценивали изменение количества белка CLCA2 в лизате фибробластов человека HT 297.T (ATCC® CRL-7782™) после трансфекции этих клеток ДНК-вектором VTvaf17-CLCA2, несущим ген CLCA2 человека. Клетки культивировали как описано в примере 14.

Для трансфекции использовали реагент SuperFect Transfection Reagent 6-го поколения (Qiagen, Германия). В качестве контроля использовали водный раствор дендримеров без ДНК-вектора (А), ДНК-вектор VTvaf17, не содержащий кДНК гена CLCA2 (В), в качестве трансфицируемых агентов - ДНК-вектор VTvaf17-CLCA2, несущий ген CLCA2 человека (C). Приготовление комплекса ДНК-дендример и трансфекцию клеток HT 297.T проводили как описано в примере 17.

После трансфекции к 0,5 мл культуральной жидкости добавляли 0,1 мл 1N HCl, тщательно перемешивали и инкубировали 10 минут при комнатной температуре. Затем нейтрализовали смесь, добавляя 0,1 мл 1.2М NaOH/0.5M HEPES (pH 7-7,6) и тщательно перемешивали. Отбирали супернатант и использовали его для количественного определения целевого белка. Количественное определение белка CLCA2 проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), используя набор Human Calcium activated chloride channel regulator 2 (CLCA2) ELISA Kit (MyBioSource, MBS7242681) согласно методике производителя с детекцией оптической плотности при помощи автоматического биохимического и иммуноферментного анализатора ChemWell (Awareness Technology Inc., США).

Численное значение концентрации определяли с помощью калибровочной кривой, построенной по стандартным образцам с известной концентрацией белка CLCA2, входящим в состав набора. Чувствительность метода составляла не менее 1 пг/мл, диапазон измерения - от 50 пг/мл до 1000 пг/мл. Статистическую обработку полученных результатов осуществляли с помощью программного обеспечения для статистической обработки и визуализации данных R, версия 3.0.2 (https://www.r-project.org/). Графические материалы, полученные в результате анализа представлены на фиг. 15.

Из фигуры 15 следует, что трансфекция фибробластов человека HT 297.T генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-CLCA2 приводит к увеличению количества белка CLCA2 по сравнению с контрольными образцами, что подтверждает способность вектора проникать в эукариотические клетки и экспрессировать ген CLCA2 на уровне белка. Представленные результаты также подтверждают реализуемость способа применения генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-CLCA2 для повышения уровня экспрессии CLCA2 в эукариотических клетках.

Пример 23.

Подтверждение эффективности и реализуемости способа применения генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-ELN, несущего ген ELN, для повышения экспрессии белка ELN в клетках млекопитающих.

Оценивали изменение количества белка ELN в лизате культуры кератиноцитов эпидермиса HEKa (ATCC PCS-200-011) после трансфекции этих клеток ДНК-вектором VTvaf17-ELN, несущим ген ELN человека. Клетки культивировали как описано в примере 15.

Для трансфекции использовали реагент SuperFect Transfection Reagent 6-го поколения (Qiagen, Германия). В качестве контроля использовали водный раствор дендримеров без ДНК-вектора (А), ДНК-вектор VTvaf17, не содержащий кДНК гена ELN (В), в качестве трансфицируемых агентов - ДНК-вектор VTvaf17-ELN, несущий ген ELN человека (C). Приготовление комплекса ДНК-дендримеры и трансфекцию клеток HEKa проводили как описано в примере 17.

После трансфекции к 0,5 мл культуральной жидкости добавляли 0,1 мл 1N HCl, тщательно перемешивали и инкубировали 10 минут при комнатной температуре. Затем нейтрализовали смесь, добавляя 0,1 мл 1.2М NaOH/0.5M HEPES (pH 7-7,6) и тщательно перемешивали. Отбирали супернатант и использовали его для количественного определения целевого белка.

Количественное определение белка ELN проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), используя набор Elastin ELISA Kit (Reddot Biotech, RD-ELN-Ra) согласно методике производителя с детекцией оптической плотности при помощи автоматического биохимического и иммуноферментного анализатора ChemWell (Awareness Technology Inc., США).

Численное значение концентрации определяли с помощью калибровочной кривой, построенной по стандартным образцам с известной концентрацией белка ELN, входящим в состав набора. Чувствительность метода составляла не менее 12,7 пг/мл, диапазон измерения - от 31,25 пг/мл до 2000 пг/мл. Статистическую обработку полученных результатов осуществляли с помощью программного обеспечения для статистической обработки и визуализации данных R, версия 3.0.2 (https://www.r-project.org/). Графики, полученные в результате анализа, представлены на фиг. 16.

Из фигуры 16 следует, что трансфекция культуры клеток кератиноцитов эпидермиса HEKa генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-ELN приводит к увеличению количества белка ELN по сравнению с контрольными образцами, что подтверждает способность вектора проникать в эукариотические клетки и экспрессировать ген ELN на уровне белка. Представленные результаты также подтверждают реализуемость способа применения генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-ELN для повышения уровня экспрессии ELN в эукариотических клетках.

Пример 24.

Подтверждение эффективности и реализуемости способа применения генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-PLOD1, несущего ген PLOD1, для повышения экспрессии белка PLOD1 в клетках млекопитающих.

Оценивали изменение количества белка PLOD1 в лизате культуры меланоцитов эпидермиса человека HEMa (ATCC® PCS-200-013™) после трансфекции этих клеток ДНК-вектором VTvaf17-PLOD1, несущим ген PLOD1 человека. Клетки культивировали как описано в примере 16.

Для трансфекции использовали реагент SuperFect Transfection Reagent 6-го поколения (Qiagen, Германия). В качестве контроля использовали водный раствор дендримеров без ДНК-вектора (А), ДНК-вектор VTvaf17, не содержащий кДНК гена PLOD1 (В), в качестве трансфицируемых агентов - ДНК-вектор VTvaf17- PLOD1, несущий ген PLOD1 человека (C). Приготовление комплекса ДНК-дендримеры и трансфекцию клеток HEMa проводили как описано в примере 17.

После трансфекции к 0,5 мл культуральной жидкости добавляли 0,1 мл 1N HCl, тщательно перемешивали и инкубировали 10 минут при комнатной температуре. Затем нейтрализовали смесь, добавляя 0,1 мл 1.2М NaOH/0.5M HEPES (pH 7-7,6) и тщательно перемешивали. Отбирали супернатант и использовали его для количественного определения целевого белка.

Количественное определение белка PLOD1 проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), используя набор Human PLOD / PLOD1 ELISA Kit (Sandwich ELISA) (LifeSpan BioSciences, LS-F9705-1) согласно методике производителя с детекцией оптической плотности при помощи автоматического биохимического и иммуноферментного анализатора ChemWell (Awareness Technology Inc., США).

Численное значение концентрации определяли с помощью калибровочной кривой, построенной по стандартным образцам с известной концентрацией белка PLOD1, входящим в состав набора. Чувствительность метода составляла не менее 66 пг/мл, диапазон измерения - от 156 пг/мл до 10000 пг/мл. Статистическую обработку полученных результатов осуществляли с помощью программного обеспечения для статистической обработки и визуализации данных R, версия 3.0.2 (https://www.r-project.org/). Графики, полученные в результате анализа, представлены на фиг. 17.

Из фигуры 17 следует, что трансфекция культуры клеток меланоцитов эпидермиса человека HEMa генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17- PLOD1 приводит к увеличению количества белка PLOD1 по сравнению с контрольными образцами, что подтверждает способность вектора проникать в эукариотические клетки и экспрессировать ген PLOD1 на уровне белка. Представленные результаты также подтверждают реализуемость способа применения генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-PLOD1 для повышения уровня экспрессии PLOD1 в эукариотических клетках.

Пример 25.

Подтверждение эффективности и реализуемости способа применения генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-P4HA2, несущего ген P4HA2, для повышения экспрессии белка P4HA2 в тканях человека.

Для подтверждения эффективности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-P4HA2, несущего целевой ген, а именно, ген P4HA2 и реализуемости способа его применения оценивали изменения количества белка P4HA2 в коже человека при введении в кожу человека генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-P4HA2, несущего ген человека P4HA2.

С целью анализа изменения количества белка P4HA2 трем пациентам вводили в кожу предплечья генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-P4HA2, несущий ген P4HA2 и параллельно вводили плацебо, представляющее собой генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17, не содержащий кДНК гена P4HA2.

Пациент 1, женщина 44 года, (П1); пациент 2, женщина 61 год, (П2); пациент 3, мужчина, 50 лет, (П3). В качестве транспортной системы использовали полиэтиленимин Transfection reagent cGMP grade in-vivo-jetPEI (Polyplus Transfection, Франция). Генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-P4HA2, который содержит кДНК гена P4HA2 и генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17, используемый в качестве плацебо, который не содержит кДНК гена P4HA2, каждый из которых растворяли в стерильной воде степени очистки Nuclease-Free. Для получения генетической конструкции готовили комплексы ДНК- cGMP grade in-vivo-jetPEI в соответствии с рекомендациями производителя.

Генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17 (плацебо) и генотерапевтический ДНК вектор VTvaf17-P4HA2, несущий ген P4HA2 вводили в количестве 1 мг для каждой генетической конструкции тоннельным методом иглой 30G на глубину 3 мм. Объем вводимого раствора генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17 (плацебо) и генотерапевтического ДНК вектора VTvaf17-P4HA2, несущего ген P4HA2 - 0,3 мл для каждой генетической конструкции. Очаги введения каждой генетической конструкции располагались на участке предплечья на расстоянии 8-10 см друг от друга.

Биопсийные образцы отбирали на 2-е сутки после введения генетических конструкций генотерапевтических ДНК-векторов. Взятие биопсии осуществляли из участков кожи пациентов в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора VTvaf17-P4HA2, несущего ген P4HA2 (I), генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17 (плацебо) (II), а также из интактных участков кожи (III), используя устройство для взятия биопсии Epitheasy 3.5 (Medax SRL, Италия). Кожу пациентов в зоне отбора биоптата предварительно промывали стерильным физиологическим раствором и анестезировали раствором лидокаина. Размер биопсийного образца составлял около 10 куб. мм, масса - около 11 мг. Образец помещали в буферный раствор, содержащий 50 мМ Трис-HCl рН 7.6, 100 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА и 1 мМ фенилметилсульфонилфторид, и гомогенизировали до получения однородной суспензии. Полученную суспензию центрифугировали в течение 10 мин при 14000g. Отбирали супернатант и использовали его для количественного определения целевого белка методом твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), используя набор Human P4HA2 ELISA Kit (Sandwich ELISA) (LifeSpan BioSciences, LS-F33689-1) согласно методике производителя с детекцией оптической плотности при помощи автоматического биохимического и иммуноферментного анализатора ChemWell (Awareness Technology Inc., США).

Численное значение концентрации определяли с помощью калибровочной кривой, построенной по стандартным образцам с известной концентрацией белка P4HA2, входящим в состав набора. Чувствительность метода составляла не менее 469 пг/мл, диапазон измерения - от 780 пг/мл до 50000 пг/мл. Статистическую обработку полученных результатов осуществляли с помощью программного обеспечения для статистической обработки и визуализации данных R, версия 3.0.2 (https://www.r-project.org/). Графические материалы, полученные в результате анализа, представлены на фиг. 18.

Из фигуры 18 следует, что в коже всех трех пациентов в области введения генотерапевтического ДНК вектора VTvaf17-P4HA2, несущего целевой ген P4HA2 человека, произошло увеличение количества белка P4HA2 в сравнении с количеством белка P4HA2 в области введения генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17 (плацебо), не содержащего ген P4HA2 человека, что свидетельствует об эффективности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-P4HA2 и подтверждает реализуемость способа его применения, в частности при внутрикожном введении генотерапевтического ДНК-вектора в ткани человека.

Пример 26.

Подтверждение эффективности и реализуемости способа применения генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-P4HA1, несущего ген P4HA1, для повышения экспрессии белка P4HA1 в тканях человека.

Для подтверждения эффективности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-P4HA1, несущего целевой ген P4HA1 и реализуемости способа его применения оценивали изменение количества белка P4HA1 в коже человека при введении генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-P4HA1, несущего целевой ген, а именно, ген P4HA1 человека.

С целью анализа изменения количества белка P4HA1 трем пациентам вводили в кожу предплечья генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-P4HA1, несущий ген P4HA1 с транспортной молекулой, и параллельно вводили плацебо, представляющее собой генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17, не содержащий кДНК гена P4HA1 с транспортной молекулой.

Пациент 1, мужчина 59 лет, (П1); пациент 2, женщина 56 лет (П2); пациент 3, мужчина, 58 лет, (П3). В качестве транспортной системы использовали полиэтиленимин Transfection reagent cGMP grade in-vivo-jetPEI (Polyplus Transfection, Франция), пробоподготовку проводили в соответствии с рекомендациями производителя.

Генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17 (плацебо) и генотерапевтический ДНК вектор VTvaf17-P4HA1, несущий ген P4HA1 вводили в количестве 1 мг для каждой генетической конструкции тоннельным методом иглой 30G на глубину около 1 мм. Объем вводимого раствора генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17 (плацебо) и генотерапевтического ДНК вектора VTvaf17-P4HA1, несущего ген P4HA1 - 0,3 мл для каждой генетической конструкции. Очаги введения каждой генетической конструкции располагали на расстоянии 5 см друг от друга.

Биопсийные образцы отбирали на 2-е сутки после введения генетических конструкций генотерапевтических ДНК-векторов. Взятие биопсии осуществляли из участков кожи пациентов в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора VTvaf17-P4HA1, несущего ген P4HA1 (I), генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17 (плацебо) (II), а также из интактного участка кожи (III), используя устройство для взятия биопсии кожи. Кожу пациентов в зоне отбора биоптата предварительно промывали стерильным физиологическим раствором и анестезировали раствором лидокаина. Размер биопсийного образца составлял около 10 куб. мм, масса - около 11 мг. Образец помещали в буферный раствор, содержащий 50 мМ Трис-HCl рН 7.6, 100 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА и 1 мМ фенилметилсульфонилфторид, и гомогенизировали до получения однородной суспензии. Полученную суспензию центрифугировали в течение 10 мин при 14000g. Отбирали супернатант и использовали его для количественного определения целевого белка.

Количественное определение белка P4HA1 проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), используя набор используя набор Human P4HA1 ELISA Kit (Sandwich ELISA) (LifeSpan BioSciences, LS-F12242-1) согласно методике производителя с детекцией оптической плотности при помощи автоматического биохимического и иммуноферментного анализатора ChemWell (Awareness Technology Inc., США). Чувствительность метода составляла 0.625 нг/мл, диапазон измерения 0.625 - 40 нг/мл.

Численное значение концентрации определяли с помощью калибровочной кривой, построенной по стандартным образцам с известной концентрацией белка P4HA1, входящим в состав набора. Чувствительность метода составляла не менее 625 пг/мл, диапазон измерения - от 625 пг/мл до 40000 пг/мл. Статистическую обработку полученных результатов осуществляли с помощью программного обеспечения для статистической обработки и визуализации данных R, версия 3.0.2 (https://www.r-project.org/). Графические материалы, полученные в результате анализа представлены на фиг. 19.

Из фигуры 19 следует, что в коже всех трех пациентов в области введения генотерапевтического ДНК вектора VTvaf17-P4HA1, несущего целевой ген, а именно, ген P4HA1 человека, произошло увеличение количества белка P4HA1 в сравнении с количеством белка P4HA1 в области введения генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17 (плацебо), не содержащего ген P4HA1 человека, что свидетельствует об эффективности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-P4HA1 и подтверждает реализуемость способа его применения, в частности при внутрикожном введении генотерапевтического ДНК-вектора в ткани человека.

Пример 27.

Подтверждение эффективности и реализуемости способа сочетанного применения генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-COL7A1, несущего ген COL7A1, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-CLCA2, несущего ген CLCA2, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-ELN, несущего ген ELN, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-PLOD1, несущего ген PLOD1, для повышения уровня экспрессии белков COL7A1, CLCA2, ELN и PLOD1 в тканях человека.

Для подтверждения эффективности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-COL7A1, несущего ген COL7A1, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-CLCA2, несущего ген CLCA2, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-ELN, несущего ген ELN, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-PLOD1, несущего ген PLOD1, и реализуемости способа их применения оценивали изменения количества белка COL7A1, CLCA2, ELN и PLOD1 в коже человека при сочетанном введении в кожу человека смеси генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-COL7A1, несущего ген COL7A1, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-CLCA2, несущего ген CLCA2, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-ELN, несущего ген ELN, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-PLOD1, несущего ген PLOD1.

С целью анализа изменения количества белка COL7A1, CLCA2, ELN и PLOD1 трем пациентам вводили в кожу предплечья смесь генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-COL7A1, несущего ген COL7A1, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-CLCA2, несущего ген CLCA2, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-ELN, несущего ген ELN, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-PLOD1, несущего ген PLOD1, и параллельно вводили плацебо, представляющее собой генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17, не содержащий кДНК гена COL7A1, CLCA2, ELN и PLOD1.

Пациент 1, женщина 38 лет (П1); пациент 2, мужчина 48 лет (П2); пациент 3, мужчина, 52 лет (П3). В качестве транспортной системы использовали полиэтиленимин Transfection reagent cGMP grade in-vivo-jetPEI (Polyplus Transfection, Франция). Смесь (в соотношении 1:1:1:1) генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-COL7A1, несущего ген COL7A1, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-CLCA2, несущего ген CLCA2, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-ELN, несущего ген ELN, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-PLOD1, несущего ген PLOD1 и генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17, используемый в качестве плацебо, который не содержит кДНК генов COL7A1, CLCA2, ELN и PLOD1, растворяли в стерильной воде степени очистки Nuclease-Free. Для получения генетической конструкции готовили комплексы ДНК- cGMP grade in-vivo-jetPEI в соответствии с рекомендациями производителя.

Генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17 (плацебо) и смесь генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-COL7A1, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-CLCA2, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-ELN, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-PLOD1 вводили в количестве 4 мг для каждой генетической конструкции тоннельным методом иглой 30G на глубину 3 мм. Объем вводимого раствора генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17 (плацебо) и смеси генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-COL7A1, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-CLCA2 генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-ELN генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-PLOD1 - 1,2 мл для каждой генетической конструкции. Очаги введения каждой генетической конструкции располагались на участке кожи предплечья на расстоянии 8-10 см друг от друга.

Биопсийные образцы отбирали на 2-е сутки после введения генотерапевтических ДНК-векторов. Взятие биопсии осуществляли из участков кожи пациентов в зоне введения смеси генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-COL7A1, несущего ген COL7A1, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-CLCA2, несущего ген CLCA2, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-ELN, несущего ген ELN, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-PLOD1, несущего ген PLOD1 (I), генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17 (плацебо) (II), а также из интактных участков кожи (III), используя устройство для взятия биопсии Epitheasy 3.5 (Medax SRL, Италия). Кожу пациентов в зоне отбора биоптата предварительно промывали стерильным физиологическим раствором и анестезировали раствором лидокаина. Размер биопсийного образца составлял около 10 куб. мм, масса - около 11 мг. Образец помещали в буферный раствор, содержащий 50 мМ Трис-HCl рН 7.6, 100 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА и 1 мМ фенилметилсульфонилфторид, и гомогенизировали до получения однородной суспензии. Полученную суспензию центрифугировали в течение 10 мин при 14000g. Отбирали супернатант и использовали его для количественного определения целевых белков как это описано в примере 21 (количественное определение белка COL7A1), примере 22 (количественное определение белка CLCA2), примере 23 (количественное определение белка ELN), примере 24 (количественное определение белка PLOD1).

Численное значение концентрации определяли с помощью калибровочной кривой, построенной по стандартным образцам с известной концентрацией белка COL7A1, CLCA2, ELN и PLOD1, входящим в состав каждого набора. Статистическую обработку полученных результатов осуществляли с помощью программного обеспечения для статистической обработки и визуализации данных R, версия 3.0.2 (https://www.r-project.org/). Графические материалы, полученные в результате анализа, представлены на фиг. 20.

Из фигуры 20 следует, что в коже всех трех пациентов в области введения смеси генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-COL7A1, несущего ген COL7A1, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-CLCA2, несущего ген CLCA2, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-ELN, несущего ген ELN, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-PLOD1, несущего ген PLOD1 человека, произошло увеличение количества белка COL7A1, CLCA2, ELN и PLOD1 в сравнении с количеством белка COL7A1, CLCA2, ELN и PLOD1 в области введения генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17 (плацебо), не содержащего ген COL7A1, CLCA2, ELN и PLOD1 человека, что свидетельствует об эффективности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-COL7A1, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-CLCA2, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-ELN, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-PLOD1 и подтверждает реализуемость способа их применения, в частности при внутрикожном сочетанном введении генотерапевтических ДНК-векторов в ткани человека.

Пример 28.

Подтверждение эффективности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-COL1A2, несущего ген COL1A2 и реализуемости способа его применения для повышения уровня экспрессии белка COL1A2 в тканях человека путем введения аутологичных фибробластов, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-COL1A2.

Для подтверждения эффективности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-COL1A2, несущего ген COL1A2 и реализуемости способа его применения оценивали изменения количества белка COL1A2 в коже человека при введении в кожу пациента культуры аутологичных фибробластов этого пациента, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-COL1A2.

Пациенту вводили в кожу предплечья соответствующую культуру аутологичных фибробластов, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-COL1A2, несущим ген COL1A2, и параллельно вводили плацебо, представляющее собой культуру аутологичных фибробластов пациента, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17, не несущим ген COL1A2.

Первичную культуру фибробластов человека выделяли из биоптатов кожи пациента. Используя устройство для взятия биопсии кожи Epitheasy 3.5 (Medax SRL, Италия) брали образец биоптата кожи из зоны, защищенной от действия ультрафиолета, а именно за ушной раковиной или с боковой внутренней поверхности в зоне локтевого сустава, размером около 10 кв. мм, массой - около 11 мг. Кожу пациента предварительно промывали стерильным физиологическим раствором и анестезировали раствором лидокаина. Культивирование первичной культуры клеток осуществляли при 37°С в атмосфере, содержащей 5 % СО2 в среде DMEM с 10 % фетальной телячьей сывороткой и ампициллином 100 Ед/мл. Пересев культуры и смену культуральной среды осуществляли каждые 2 дня. Общая продолжительность роста культуры не превышала 25-30 дней. Из культуры клеток отбирали аликвоту, содержащую 5×10⁴ клеток. Культуру фибробластов пациента трансфицировали генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-COL1A2, несущим ген COL1A2 и плацебо - вектором VTvaf17, не несущим целевой ген COL1A2.

Трансфекцию осуществляли с помощью катионного полимера полиэтиленимина JETPEI (Polyplus Transfection, Франция), согласно инструкции фирмы-производителя. Клетки культивировали 72 часа и затем вводили пациенту. Введение пациенту культуры аутологичных фибробластов этого пациента, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-COL1A2, и плацебо, представляющее собой культуру аутологичных фибробластов пациента, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17, осуществляли туннельным методом в область предплечья иглой 30G длиной 13 мм на глубину около 3 мм. Концентрация модифицированных аутологичных фибробластов в вводимой суспензии составляла примерно 5 млн клеток на 1 мл суспензии, количество вводимых клеток не превышало 15 млн. Очаги введения культуры аутологичных фибробластов располагались на расстоянии 8-10 см друг от друга.

Биопсийные образцы отбирали на 4-е сутки после введения культуры аутологичных фибробластов, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-COL1A2, несущим целевой ген, а именно, ген COL1A2 и плацебо. Взятие биопсии осуществляли из участков кожи пациента в зоне введения культуры аутологичных фибробластов, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-COL1A2, несущим целевой ген, а именно, ген COL1A2 (C), культуры аутологичных фибробластов, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17, не несущим целевой ген COL1A2 (плацебо) (B), а также из участков интактной кожи (A), используя устройство для взятия биопсии Epitheasy 3.5 (Medax SRL, Италия). Кожу в зоне отбора биоптата пациентов предварительно промывали стерильным физиологическим раствором и анестезировали раствором лидокаина. Размер биопсийного образца составлял около 10 куб. мм, масса - около 11 мг. Образец помещали в буферный раствор, содержащий 50 мМ Трис-HCl рН 7.6, 100 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА и 1 мМ фенилметилсульфонилфторид, и гомогенизировали до получения однородной суспензии. Полученную суспензию центрифугировали в течение 10 мин при 14000g. Отбирали супернатант и использовали его для количественного определения целевого белка COL1A2 как это описано в примере 18.

Графические материалы, полученные в результате анализа, представлены на фиг. 21.

Из фигуры 21 следует, что в коже пациента в области введения культуры аутологичных фибробластов, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-COL1A2, несущим ген COL1A2, произошло увеличение количества белка COL1A2 в сравнении с количеством белка COL1A2 в области введения культуры аутологичных фибробластов, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17, не несущим ген COL1A2 (плацебо), что свидетельствует об эффективности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-COL1A2 и подтверждает реализуемость способа его применения для повышения уровня экспрессии COL1A2 в тканях человека, в частности при введении аутологичных фибробластов, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-COL1A2.

Пример 29.

Подтверждение эффективности и реализуемости способа сочетанного применения генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-COL1A1, несущего ген COL1A1, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-COL1A2, несущего ген COL1A2, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-P4HA1, несущего ген P4HA1, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-P4HA2, несущего ген P4HA2, для повышения уровня экспрессии белков COL1A1, COL1A2, P4HA1 и P4HA2 в тканях млекопитающих.

Оценивали изменение количества белка COL1A1, COL1A2, P4HA1 и P4HA2 в коже крысы при введении трем крысам смеси генотерапевтических векторов.

В качестве транспортной системы использовали полиэтиленимин Transfection reagent cGMP grade in-vivo-jetPEI (Polyplus Transfection, Франция). Эквимолярную смесь генотерапевтических ДНК-векторов растворяли в стерильной воде степени очистки Nuclease-Free. Для получения генетической конструкции готовили комплексы ДНК- cGMP grade in-vivo-jetPEI в соответствии с рекомендациями производителя. Объем вводимого раствора составлял 0,05 мл с суммарным количеством ДНК 100 мкг. Введение раствора осуществляли тоннельным методом иглой 33G на глубину 0.5 мм в зону предварительно эпилированной кожи спины крысы.

Биопсийные образцы отбирали на 2 сутки после введения генотерапевтических ДНК-векторов. Взятие биопсии осуществляли из участков кожи в зоне введения смеси четырех генотерапевтических ДНК-векторов, несущих гены COL1A1, COL1A2, P4HA1, P4HA2 (зона I), зоны введения генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17 (плацебо) (зона II), а также из интактных участков кожи животного (зона III), используя устройство для взятия биопсии Epitheasy 3.5 (Medax SRL). Зону отбора биоптата предварительно промывали стерильным физиологическим раствором и анестезировали раствором лидокаина. Размер каждого биопсийного образца составлял около 10 куб. мм, масса - около 11 мг. Каждый образец помещали в буферный раствор, содержащий 50 мМ Трис-HCl рН 7.6, 100 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА и 1 мМ фенилметилсульфонилфторид, и гомогенизировали до получения однородной суспензии. Полученную суспензию центрифугировали в течение 10 мин при 14000g. Отбирали супернатант и использовали его для количественного определения целевых белков как это описано в примере 17 (количественное определение белка COL1A1), примере 18 (количественное определение белка COL1A2), примере 19 (количественное определение белка P4HA1), примере 20 (количественное определение белка P4HA2). Графические материалы, полученные в результате анализа, представлены на фиг. 22.

Из фигуры 22 следует, что в зоне кожи всех крыс (зона I), в которую вводилась смесь генотерапевтических векторов: генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-COL1A1, несущего целевой ген COL1A1, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-COL1A2, несущего целевой ген COL1A2, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-P4HA1, несущего целевой ген P4HA1, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-P4HA2, несущего целевой ген P4HA2, произошло увеличение количества белков COL1A1, COL1A2, P4HA1, P4HA2 по сравнению с зоной II (зона плацебо) и зоной III (интактная зона). Полученные результаты свидетельствуют об эффективности сочетанного применения генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-COL1A1, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-COL1A2, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-P4HA1, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-P4HA2, и подтверждает реализуемость способа их применения для повышения уровня экспрессии целевых белков в тканях млекопитающих.

Пример 30.

Подтверждение эффективности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-ELN, несущего ген ELN и реализуемости способа его применения для повышения уровня экспрессии белка ELN в клетках млекопитающих.

Для подтверждения эффективности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-ELN, несущего ген ELN оценивали изменение накопления мРНК целевого гена ELN в клетках фибробластов кожи быка BDF (ScienCell, Кат. #B2300) через 48 часов после их трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17- ELN, несущим ген ELN человека.

Клетки фибробластов кожи быка BDF выращивали в среде FM-2 (ScienCell, Кат. #2331). Трансфекцию генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-ELN, несущим ген ELN человека и ДНК-вектором VTvaf17, не несущим ген ELN человека (контроль), выделение РНК, реакцию обратной транскрипции, ПЦР амплификации и анализ данных проводили как описано в примере 15. В качестве референтного гена использовали ген актина быка/ коровы (АСТ), приведенного в базе данных GenBank под номером AH001130.2. В качестве положительного контроля использовали ампликоны, получаемых при ПЦР на матрицах, представляющих собой плазмиды в известных концентрациях, содержащие последовательности генов ELN и ACT. В качестве отрицательного контроля использовали деионизированную воду. Количество ПЦР продуктов - кДНК генов ELN и ACT, полученных в результате амплификации, оценивали в режиме реального времени с помощью программного обеспечения амплификатора Bio-RadCFXManager 2.1. (Bio-Rad, USA).

Графики, полученные в результате анализа, представлены на фиг. 23.

Из фигуры 23 следует, что в результате трансфекции клеток фибробластов кожи быка BDF генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-ELN, уровень специфической мРНК гена ELN человека вырос многократно, что подтверждает способность вектора проникать в эукариотические клетки и экспрессировать ген ELN на уровне мРНК. Представленные результаты подтверждают реализуемость способа применения генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-ELN для повышения уровня экспрессии гена ELN в клетках млекопитающих.

Пример 31.

Штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-COL1A1 или штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-COL1A2 или штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-P4HA1 или штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-P4HA2 или штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-COL7A1 или штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-CLCA2 или штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-ELN или штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-PLOD1, несущий генотерапевтический ДНК-вектор, и способ его получения.

Конструирование штамма для наработки в промышленных масштабах генотерапевтического ДНК-вектора на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущего целевой ген, выбранный из группы генов: COL1A1, COL1A2, P4HA1, P4HA2, COL7A1, CLCA2, ELN, PLOD1, а именно штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17- COL1A1 или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-COL1A2 или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-P4HA1 или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-P4HA2 или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-COL7A1 или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-CLCA2 или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-ELN или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-PLOD1, несущего генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-COL1A1 или VTvaf17-COL1A2 или VTvaf17-P4HA1 или VTvaf17-P4HA2 или VTvaf17-COL7A1 или VTvaf17-CLCA2 или VTvaf17-ELN или VTvaf17-PLOD1 соответственно для его наработки с возможностью селекции без использования антибиотиков заключается в получении электрокомпетентных клеток штамма Escherichia coli SCS110-AF с проведением электропорации этих клеток генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-COL1A1 или ДНК-вектором VTvaf17-COL1A2 или генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-P4HA1 или генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-P4HA2 или генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-COL7A1 или генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-CLCA2 или генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-ELN или генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-PLOD1, после чего клетки высеваются на чашки Петри с агаризованной селективной средой, содержащей дрожжевой экстракт, пептон, 6% сахарозы, а также 10 мкг/мл хлорамфеникола. При этом штамм Escherichia coli SCS110-AF для наработки генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17 или генотерапевтических ДНК-векторов на его основе с возможностью положительной селекции без использования антибиотиков получали путем конструирования линейного фрагмента ДНК, содержащего регуляторный элемент RNA-in транспозона Tn10 для селекции без применения антибиотиков размером 64 п.н., ген левансахаразы sacB, продукт которого обеспечивает селекцию на сахарозо-содержащей среде размером 1422 п.н., ген устойчивости к хлорамфениколу catR, необходимый для отбора клонов штамма, в которых прошла гомологичная рекомбинация размером 763 п.н. и две гомологичные последовательности, обеспечивающие процесс гомологичной рекомбинации в области гена recA с одновременной его инактивацией размером 329 п.н. и 233 п.н., после чего проводили трансформацию клеток Escherichia coli путем электропорации и отбирали клоны, выжившие на среде, содержащей 10 мкг/мл хлорамфеникола.

Полученные штаммы для наработки были внесены в коллекции Национального биоресурсного центра - Всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов (НБЦ ВКПМ), РФ и NCIMB Patent Deposit Service, UK с присвоением регистрационных номеров:

штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-COL1A1 - регистрационный № ВКПМ В-13165, дата депонирования 11.05.2018; INTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORITY № NCIMB 43033, дата депонирования 20.04.2018;

штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-COL1A2 - регистрационный № ВКПМ В-13164, дата депонирования 11.05.2018; INTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORITY № NCIMB 43035, дата депонирования 20.04.2018;

штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-P4HA1 - регистрационный № ВКПМ В-13384, дата депонирования 14.12.2018; INTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORITY № NCIMB 43311, дата депонирования 13.12.2018;

штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-P4HA2 - регистрационный № ВКПМ В-13388, дата депонирования 14.12.2018; INTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORITY № NCIMB 43312, дата депонирования 13.12.2018;

штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-CLCA2 - регистрационный № ВКПМ В-13385, дата депонирования 14.12.2018; INTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORITY № NCIMB 43308, дата депонирования 13.12.2018;

штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-ELN - регистрационный № ВКПМ В-13341, дата депонирования 22.11.2018; INTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORITY № NCIMB 43281, дата депонирования 22.11.2018;

штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-PLOD1 - регистрационный № ВКПМ В-13387, дата депонирования 14.12.2018; INTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORITY № NCIMB 43313, дата депонирования 13.12.2018.

Пример 32.

Способ масштабирования получения генотерапевтического ДНК-вектора на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущего целевой ген, выбранный из группы генов: COL1A1, COL1A2, P4HA1, P4HA2, COL7A1, CLCA2, ELN, PLOD1 до промышленного объема.

Для подтверждения технологичности получения и возможности производства в промышленных масштабах генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17- COL1A1, (SEQ ID №1) или VTvaf17-COL1A2, (SEQ ID №2) или VTvaf17-P4HA1, (SEQ ID №3) или VTvaf17-P4HA2, (SEQ ID №4) или VTvaf17-COL7A1, (SEQ ID №5) или VTvaf17-CLCA2, (SEQ ID №6) или VTvaf17-ELN, (SEQ ID №7) или VTvaf17-PLOD1, (SEQ ID №8) проводили масштабную ферментацию штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-COL1A1 или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17- COL1A2 или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-P4HA1 или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-P4HA2 или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-COL7A1 или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-CLCA2 или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-ELN или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-PLOD1, каждый из которых содержит генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17, несущий целевой ген, а именно COL1A1 или COL1A2 или P4HA1 или P4HA2 или COL7A1 или CLCA2 или ELN или PLOD1. Каждый штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-COL1A1 или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17- COL1A2 или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-P4HA1 или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-P4HA2 или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-COL7A1 или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-CLCA2 или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-ELN или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-PLOD1 получали на базе штамма Escherichia coli SCS110-AF (Cell and Gene Therapy LLC, Великобритания) по примеру 31 путем электропорации компетентных клеток этого штамма генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17- COL1A1 или VTvaf17-COL1A2 или VTvaf17-P4HA1 или VTvaf17-P4HA2 или VTvaf17-COL7A1 или VTvaf17-CLCA2 или VTvaf17-ELN или VTvaf17-PLOD1, несущим целевой ген, а именно, COL1A1, COL1A2, P4HA1, P4HA2, COL7A1, CLCA2, ELN, PLOD1 с последующим высевом трансформированных клеток на чашки Петри с агаризованной селективной средой, содержащей дрожжевой экстракт, пептон, 6% сахарозы и отбором отдельных клонов.

Ферментацию полученного штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-COL1A1, несущего генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17- COL1A1 проводили в ферментере объемом 10 л с последующим выделением генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-COL1A1.

Для ферментации штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17- COL1A1 готовили среду, содержащую на 10 л: 100 г триптон, 50 г дрожжевой экстракт (Becton Dickinson, США), доводили водой до 8800 мл и автоклавировали при 121°С 20 мин, затем добавляли 1200 мл 50% (вес/объем) сахарозы. Далее засевали в колбу затравочную культуру штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-COL1A1 в объеме 100 мл. Инкубировали в шейкере-инкубаторе 16 ч при 30°С. Переносили затравочную культуру в ферментер Techfors S (Infors HT, Швейцария), растили до достижения стационарной фазы. Контроль осуществляли измерением оптической плотности культуры при длине волны 600 нм. Клетки осаждали центрифугированием 30 мин при 5000-10000 g. Супернатант удаляли, клеточную массу ресуспендировали в 10% по объему фосфатно-солевого буфера. Повторно центрифугировали 30 мин при 5000-10000g. Супернатант удаляли, к клеточной массе добавляли раствор 20 мМ TrisCl, 1 мМ ЭДТА, 200 г/л сахароза, рН 8,0 в объеме 1000 мл, тщательно перемешивали до образования гомогенной суспензии. Добавляли раствор яичного лизоцима до конечной концентрации 100мкг/мл. Инкубировали 20 мин на льду при бережном перемешивании. Далее, добавляли 2500 мл раствора 0,2 М NaOH, 10 г/л додецилсульфат натрия, инкубировали 10 мин на льду при бережном перемешивании, затем добавляли 3500 мл раствора 3M ацетат натрия, 2М уксусная кислота, рН 5-5,5, инкубировали 10 мин на льду при бережном перемешивании. Полученный образец центрифугировали 20-30 мин при 15000 g или более. Раствор аккуратно декантировали, от остатков осадка избавлялись фильтрацией через грубый фильтр (фильтровальную бумагу). Добавляли РНКазу А (Sigma, США) до конечной концентрации 20 нг/мл, инкубировали ночь 16 ч при комнатной температуре. Раствор центрифугировали 20-30 мин при 15000g, затем фильтровали через мембранный фильтр с порами 0,45 мкм (Millipore, США). Далее проводили ультрафильтрацию через мембрану размером отсечения 100кДа (Millipore, США) и разбавляли до начального объема буфером 25 мМ TrisCl, pH 7.0. Операцию повторяли три - четыре раза. Наносили раствор, на колонку с 250 мл сорбента DEAE sepharose HP (GE, США), уравновешенную раствором 25 мМ TrisCl, pH 7.0. После нанесения образца колонку промывали тремя объемами этого же раствора, а затем проводили элюцию генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-COL1A1 линейным градиентом от раствора 25 мМ TrisCl, pH 7.0 до раствора 25 мМ TrisCl, pH 7.0, 1М NaCl в объеме пяти объемов колонки. Контроль элюции осуществляли по оптической плотности сходящего раствора при 260 нм. Хроматографические фракции, содержащие генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-COL1A1, объединяли и проводили гель-фильтрацию на сорбенте Superdex 200 (GE, США). Колонку уравновешивали фосфатно-солевым буфером. Контроль элюции осуществляли по оптической плотности сходящего раствора при 260 нм, фракции анализировали электрофорезом в агарозном геле. Фракции, содержащие генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-COL1A1 объединяли и хранили при -20°С. Для оценки воспроизводимости техпроцесса обозначенные технологические операции повторяли пятикратно. Все технологические операции для штаммов Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-COL1A2 или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-P4HA1 или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-P4HA2 или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-COL7A1 или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-CLCA2 или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-ELN или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-PLOD1 проводили аналогичным образом.

Воспроизводимость техпроцесса и количественные характеристики выхода конечного продукта подтверждают технологичность получения и возможность производства в промышленных масштабах генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17- COL1A1 или VTvaf17-COL1A2 или VTvaf17-P4HA1 или VTvaf17-P4HA2 или VTvaf17-COL7A1 или VTvaf17-CLCA2 или VTvaf17-ELN или VTvaf17-PLOD1.

Таким образом, созданный генотерапевтический ДНК-вектор с целевым геном может быть использован для введения в клетки организма животных и человека, характеризующихся сниженной или недостаточной экспрессией белка, кодируемого данным геном, обеспечивая таким образом достижение терапевтического эффекта.

Задача, поставленная в данном изобретении, а именно: конструирование генотерапевтических ДНК-векторов для повышения уровня экспрессии генов COL1A1, COL1A2, P4HA1, P4HA2, COL7A1, CLCA2, ELN, PLOD1, сочетающих в себе следующие свойства:

I) Эффективность повышения экспрессии целевых генов в эукариотических клетках за счет полученных генотерапевтических векторов с ограниченным размером векторной части;

II) Возможность безопасного применения для генетической терапии человека и животных за счет отсутствия в составе генотерапевтического ДНК-вектора регуляторных элементов, представляющих собой нуклеотидные последовательности вирусных геномов и генов антибиотикорезистентности;

III) Технологичность получения и возможность наработки в штаммах в промышленных масштабах;

IV) также задача по конструированию штаммов, несущих эти генотерапевтические ДНК-вектора для производства этих генотерапевтических ДНК-векторов решена, что подтверждается примерами:

для I - пример 1, 2, 3, 4, 5; 6; 7; 8; 9; 10; 11; 12; 13; 14; 15; 16; 17; 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30;

для II - пример 1, 2, 3, 4, 5; 6; 7; 8; 9; 10; 11; 12; 13; 14; 15; 16; 17; 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30;

для III - 1, 2, 3, 4, 5; 6; 7; 8, 31, 32;

для IV - пример 31, 32.

Промышленная применимость:

Все представленные выше примеры подтверждают промышленную применимость предлагаемого генотерапевтического ДНК-вектора на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущего целевой ген, выбранный из группы генов: ген COL1A1, ген COL1A2, ген P4HA1, ген P4HA2, ген COL7A1, ген CLCA2, ген ELN, ген PLOD1 для повышения уровня экспрессии этих целевых генов, штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-COL1A1 или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17- COL1A2 или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-P4HA1 или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-P4HA2 или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-COL7A1 или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-CLCA2 или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-ELN или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-PLOD1, несущего генотерапевтический ДНК-вектор, способа получения генотерапевтического ДНК-вектора, способа производства в промышленных масштабах генотерапевтического ДНК-вектора.

Перечень сокращений

VTvaf17 - вектор генотерапевтический, не содержащий последовательностей вирусных геномов и маркеров антибиотико-резистентности (vector therapeutic virus-antibiotic-free)

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

кДНК - комплементарная дезоксирибонуклеиновая кислота

РНК - рибонуклеиновая кислота

мРНК - матричная рибонуклеиновая кислота

п.н. - пар нуклеотидов

ПЦР - полимеразная цепная реакция

мл - миллилитр, мкл - микролитр

куб. мм - кубический миллиметр

л - литр

мкг - микрограмм

мг - миллиграмм

г - грамм

мкМ - микромоль

мМ - миллимоль

мин - минута

сек - секунда

об/мин - обороты в минуту

нм - нанометр

см - сантиметр

мВт - милливатт

о.е. ф-относительная единица флуоресценции

РВС - фосфатно-солевой буфер.

Список литературы

1. Bart G, Hämäläinen L, Rauhala L, Salonen P, Kokkonen M, Dunlop TW, Pehkonen P, Kumlin T, Tammi MI, Pasonen-Seppänen S, Tammi RH. rClca2 is associated with epidermal differentiation and is strongly downregulated by ultraviolet radiation. Br J Dermatol. 2014 Aug;171(2):376-87.

2. Connon CJ, Yamasaki K, Kawasaki S, Quantock AJ, Koizumi N, Kinoshita S. Calcium-activated chloride channel-2 in human epithelia. J Histochem Cytochem. 2004 Mar;52(3):415-8.

3. Craven et al., 1997.

4. Draft Guideline on the quality, non-clinical and clinical aspects of gene therapy medicinal products, http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/Scientific_guideline/2015/05/WC500187020.pdf.

5. Ewart AK, Jin W, Atkinson D, Morris CA, Keating MT. Supravalvular aortic stenosis associated with a deletion disrupting the elastin gene. J Clin Invest. 1994 Mar;93(3):1071-7.

6. Georgiadis C, Syed F, Petrova A, Abdul-Wahab A, Lwin SM, Farzaneh F, Chan L, Ghani S, Fleck RA, Glover L, McMillan JR, Chen M, Thrasher AJ, McGrath JA, Di WL, Qasim W. Lentiviral Engineered Fibroblasts Expressing Codon-Optimized COL7A1 Restore Anchoring Fibrils in RDEB. J Invest Dermatol. 2016 Jan;136(1):284-92.

7. Goto M, Sawamura D, Ito K, Abe M, Nishie W, Sakai K, Shibaki A, Akiyama M, Shimizu H. Fibroblasts show more potential as target cells than keratinocytes in COL7A1 gene therapy of dystrophic epidermolysis bullosa. J Invest Dermatol. 2006 Apr;126(4):766-72.

8. Guideline on the quality, non-clinical and clinical aspects of gene therapy medicinal Products EMA/CAT/80183/2014.

9. Hatzimichael E, Lo Nigro C, Lattanzio L, Syed N, Shah R, Dasoula A, Janczar K, Vivenza D, Monteverde M, Merlano M, Papoudou-Bai A, Bai M, Schmid P, Stebbing J, Bower M, Dyer MJ, Karran LE, ElguetaKarstegl C, Farrell PJ, Thompson A, Briasoulis E, Crook T. The collagen prolyl hydroxylases are novel transcriptionally silenced genes in lymphoma. Br J Cancer. 2012 Oct 9;107(8):1423-32.

10. Hornstein BD, Roman D, Arévalo-Soliz LM, Engevik MA, Zechiedrich L. Effects of Circular DNA Length on Transfection Efficiency by Electroporation into HeLa Cells. Ceña V, ed. PLoS ONE. 2016;11(12):e0167537.

11. Jacków J, Titeux M, Portier S, Charbonnier S, Ganier C, Gaucher S, Hovnanian A. Gene-Corrected Fibroblast Therapy for Recessive Dystrophic Epidermolysis Bullosa using a Self-Inactivating COL7A1 Retroviral Vector. J Invest Dermatol. 2016 Jul;136(7):1346-1354.

12. Keene DR, Sakai LY, Lunstrum GP, Morris NP, Burgeson RE. Type VII collagen forms an extended network of anchoring fibrils. J Cell Biol. 1987 Mar;104(3):611-21.

13. Kielty CM, Sherratt MJ, Shuttleworth CA. Elastic fibres. J Cell Sci. 2002 Jul 15;115(Pt 14):2817-28.

14. Labat-Robert J. Cell-matrix interactions, alteration with aging and age associated diseases. A review. Pathol Biol (Paris). 2001 May;49(4):349-52.

15. Li L, Petrovsky N. Molecular mechanisms for enhanced DNA vaccine immunogenicity. Expert Rev Vaccines. 2016;15(3):313-29.

16. Li SH, Sun Z, Guo L, Han M, Wood MF, Ghosh N, Vitkin IA, Weisel RD, Li RK. Elastin overexpression by cell-based gene therapy preserves matrix and prevents cardiac dilation. J Cell Mol Med. 2012 Oct;16(10):2429-39.

17. Mairhofer J, Grabherr R. Rational vector design for efficient non-viral gene delivery: challenges facing the use of plasmid DNA. Mol Biotechnol. 2008.39(2):97-104.

18. Majka, Magdalena Janeczko, Jolanta Goździk, Danuta Jarocha, Aleksandra Auguściak-Duma, Joanna Witecka, Marta Lesiak, Halina Koryciak-Komarska, Aleksander L. Sieroń, Jacek Józef Pietrzyk, Cell therapy of a patient with type III osteogenesis imperfecta caused by mutation in COL1A2 gene and unstable collagen type I. Open Journal of Genetics, Vol.3 No.1, 2013.

19. Mecklenbeck S, Compton SH, Mejía JE, Cervini R, Hovnanian A, Bruckner-Tuderman L, Barrandon Y. A microinjected COL7A1-PAC vector restores synthesis of intact procollagen VII in a dystrophic epidermolysis bullosa keratinocyte cell line. Hum Gene Ther. 2002 Sep 1;13(13):1655-62.

20. Mencía Á, Chamorro C, Bonafont J, Duarte B, Holguin A, Illera N, Llames SG, Escámez MJ, Hausser I, Del Río M, Larcher F, Murillas R. Deletion of a Pathogenic Mutation-Containing Exon of COL7A1 Allows Clonal Gene Editing Correction of RDEB Patient Epidermal Stem Cells. Mol Ther Nucleic Acids. 2018 Jun 1;11:68-78.

21. Napolitano F, Di Iorio V, Testa F, Tirozzi A, Reccia MG, Lombardi L, Farina O, Simonelli F, Gianfrancesco F, Di Iorio G, Melone MAB, Esposito T, Sampaolo S. Autosomal-dominant myopia associated to a novel P4HA2 missense variant and defective collagen hydroxylation. Clin Genet. 2018 May;93(5):982-991.

22. Naylor EC, Watson RE, Sherratt MJ. Molecular aspects of skin ageing. Maturitas. 2011 Jul;69(3):249-56. Niyibizi C, Smith P, Mi Z, Robbins P, Evans C. Potential of gene therapy for treating osteogenesis imperfecta. Clin Orthop Relat Res. 2000 Oct;(379 Suppl): S126-33.

23. Ortiz-Urda S, Thyagarajan B, Keene DR, Lin Q, Fang M, Calos MP, Khavari PA. Stable nonviral genetic correction of inherited human skin disease. Nat Med. 2002 Oct;8(10):1166-70. Epub 2002 Sep 16. Erratum in: Nat Med. 2003 Feb;9(2):237.

24. Osborn MJ, Starker CG, McElroy AN, Webber BR, Riddle MJ, Xia L, DeFeo AP, Gabriel R, Schmidt M, von Kalle C, Carlson DF, Maeder ML, Joung JK, Wagner JE, Voytas DF, Blazar BR, Tolar J. TALEN-based gene correction for epidermolysis bullosa. Mol Ther. 2013 Jun;21(6):1151-9.

25. Raveendran M, Senthil D, Utama B, Shen Y, Dudley D, Wang J, Zhang Y, Wang XL. Cigarette suppresses the expression of P4Halpha and vascular collagen production.Biochem Biophys Res Commun. 2004 Oct 15;323(2):592-8.

26. Reflection paper on design modifications of gene therapy medicinal products during development / 14 December 2011 EMA/CAT/GTWP/44236/2009 Committee for advanced therapies.

27. Ritz-Timme et al., 2003.

28. Santos VJ. High Throughput Screen for molecules and metabolites with potential cosmetic application UNIVERSIDADE DE LISBOA, Mestrado em Microbiologia Aplicada,2010.

29. Seltmann K, Meyer M, Sulcova J, Kockmann T, Wehkamp U, Weidinger S, Auf dem Keller U, Werner S. Humidity-regulated CLCA2 protects the epidermis from hyperosmotic stress. Sci Transl Med. 2018 May 9;10(440).

30. Talwar HS, Griffiths CE, Fisher GJ, Hamilton TA, Voorhees JJ. Reduced type I and type III procollagens in photodamaged adult human skin. J Invest Dermatol.

31. 1995 Aug;105(2):285-90. Tasker PN, Macdonald H, Fraser WD, Reid DM, Ralston SH, Albagha OM. Association of PLOD1 polymorphisms with bone mineral density in a population-based study of women from the UK. Osteoporos Int. 2006;17(7):1078-85.

32. Uchinaka A, Kawaguchi N, Hamada Y, Miyagawa S, Saito A, Mori S, Sawa Y, Matsuura N. Transplantation of elastin-secreting myoblast sheets improves cardiac function in infarcted rat heart. Mol Cell Biochem. 2012 Sep;368(1-2):203-14.

33. van Dijk FS, Mancini GMS, Maugeri A, Cobben JM. Ehlers Danlos syndrome, kyphoscoliotic type due to Lysyl Hydroxylase 1 deficiency in two children without congenital or early onset kyphoscoliosis. Eur J Med Genet. 2017 Oct;60(10):536-540.

34. Woodley DT, Keene DR, Atha T, Huang Y, Ram R, Kasahara N, Chen M. Intradermal injection of lentiviral vectors corrects regenerated human dystrophic epidermolysis bullosa skin tissue in vivo. Mol Ther. 2004 Aug;10(2):318-26.

35. Zou Y, Donkervoort S, Salo AM, Foley AR, Barnes AM, Hu Y, Makareeva E, Leach ME, Mohassel P, Dastgir J, Deardorff MA, Cohn RD, DiNonno WO, Malfait F, Lek M,Leikin S, Marini JC, Myllyharju J, Bönnemann CG. P4HA1 mutations cause a unique congenital disorder of connective tissue involving tendon, bone, muscle and the eye. Hum Mol Genet. 2017 Jun 15;26(12):2207-2217.

36. Биохимия: Учеб. для вузов, под ред. Е.С. Северина., 2003. 779 с. ISBN 5-9231-0254-4.

37. Молекулярная биология, 2011, том 45, № 1, с. 44-55.

38. С.С. Кузнецов, В.В. Дуденкова, М.В. Кочуева, Е.Б. Киселева, Н.Ю. Игнатьева, О.Л. Захаркина, Е.А. Сергеева, К.В. Бабак, А.В. Масленникова. Многофотонная микроскопия в изучении морфологических особенностей радиационно-индуцированных повреждений мочевого пузыря. Современные технологии в медицине, 2016, том 8, номер 2, стр. 31-39.

39. Урология: учебник / Б.К. Комяков. - 2012. - 464 с.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Селл энд Джин Терапи Лтд (CELL and GENE THERAPY Ltd), Общество с ограниченной ответственностью «Прорывные Инновационные Технологии»,

<120> Генотерапевтический ДНК-вектор на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущий целевой ген, выбранный из группы генов COL1A1, COL1A2, P4HA1, P4HA2, COL7A1, CLCA2, ELN, PLOD1 для повышения уровня экспрессии этих целевых генов, способ его получения и применения, штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-COL1A1 или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-COL1A2 или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-P4HA1 или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-P4HA2 или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-COL7A1 или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-CLCA2 или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-ELN или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17- PLOD1 несущий генотерапевтический ДНК-вектор, способ его получения, способ производства в промышленных масштабах генотерапевтического ДНК-вектора.

<160> 8

<170> BiSSAP 1.3.6

<210> 1

<211> 7563

<212> DNA

<213> Homo Sapiens

<400> 1

cgtgaggctc cggtgcccgt cagtgggcag agcgcacatc gcccacagtc cccgagaagt 60

tggggggagg ggtcggcaat tgaaccggtg cctagagaaa gtggcgcggg gtaaactggg 120

aaagtgatgt cgtgtactgg ctccgccttt ttcccgaggg tgggggagaa ccgtatataa 180

gtgcagtagt cgccgtgaac gttctttttc gcaacgggtt tgccgccaga acacaggtaa 240

gtgccgtgtg tggttcccgc gggcctggcc tctttacggg ttatggccct tgcgtgcctt 300

gaattacttc cacgcccctg gctgcagtac gtgattcttg atcccgagct tcgggttgga 360

agtgggtggg agagttcgag gccttgcgct taaggagccc cttcgcctcg tgcttgagtt 420

gaggcctggc ttgggcgctg gggccgccgc gtgcgaatct ggtggcacct tcgcgcctgt 480

ctcgctgctt tcgataagtc tctagccatt taaaattttt gatgacctgc tgcgacgctt 540

tttttctggc aagatagtct tgtaaatgcg ggccaagatc tgcacactgg tatttcggtt 600

tttggggccg cgggcggcga cggggcccgt gcgtcccagc gcacatgttc ggcgaggcgg 660

ggcctgcgag cgcggccacc gagaatcgga cgggggtagt ctcaagctgg ccggcctgct 720

ctggtgcctg gcctcgcgcc gccgtgtatc gccccgccct gggcggcaag gctggcccgg 780

tcggcaccag ttgcgtgagc ggaaagatgg ccgcttcccg gccctgctgc agggagctca 840

aaatggagga cgcggcgctc gggagagcgg gcgggtgagt cacccacaca aaggaaaagg 900

gcctttccgt cctcagccgt cgcttcatgt gactccacgg agtaccgggc gccgtccagg 960

cacctcgatt agttctcgag cttttggagt acgtcgtctt taggttgggg ggaggggttt 1020

tatgcgatgg agtttcccca cactgagtgg gtggagactg aagttaggcc agcttggcac 1080

ttgatgtaat tctccttgga atttgccctt tttgagtttg gatcttggtt cattctcaag 1140

cctcagacag tggttcaaag tttttttctt ccatttcagg tgtcgtgaaa actaccccta 1200

aaagccagct agcgtctagg gtctagacat gttcagcttt gtggacctcc ggctcctgct 1260

cctcttagcg gccaccgccc tcctgacgca cggccaagag gaaggccaag tcgagggcca 1320

agacgaagac atcccaccaa tcacctgcgt acagaacggc ctcaggtacc atgaccgaga 1380

cgtgtggaaa cccgagccct gccggatctg cgtctgcgac aacggcaagg tgttgtgcga 1440

tgacgtgatc tgtgacgaga ccaagaactg ccccggcgcc gaagtccccg agggcgagtg 1500

ctgtcccgtc tgccccgacg gctcagagtc acccaccgac caagaaacca ccggcgtcga 1560

gggacccaag ggagacactg gcccccgagg cccaagggga cccgcaggcc cccctggccg 1620

agatggcatc cctggacagc ctggacttcc cggacccccc ggaccccccg gacctcccgg 1680

accccctggc ctcggaggaa actttgctcc ccagctgtct tatggctatg atgagaaatc 1740

aaccggagga atttccgtgc ctggccccat gggtccctct ggtcctcgtg gtctccctgg 1800

cccccctggt gcacctggtc cccaaggctt ccaaggtccc cctggtgagc ctggcgagcc 1860

tggagcttca ggtcccatgg gtccccgagg tcccccaggt ccccctggaa agaatggaga 1920

tgatggggaa gctggaaaac ctggtcgtcc tggtgagcgt gggcctcctg ggcctcaggg 1980

tgctcgagga ttgcccggaa cagctggcct ccctggaatg aagggacaca gaggtttcag 2040

tggtttggat ggtgccaagg gagatgctgg tcctgctggt cctaagggtg agcctggcag 2100

ccctggtgaa aatggagctc ctggtcagat gggcccccgt ggcctgcctg gtgagagagg 2160

tcgccctgga gcccctggcc ctgctggtgc tcgtggaaat gatggtgcta ctggtgctgc 2220

cgggccccct ggtcccaccg gccccgctgg tcctcctggc ttccctggtg ctgttggtgc 2280

taagggtgaa gctggtcccc aagggccccg aggctctgaa ggtccccagg gtgtgcgtgg 2340

tgagcctggc ccccctggcc ctgctggtgc tgctggccct gctggaaacc ctggtgctga 2400

tggacagcct ggtgctaaag gtgccaatgg tgctcctggt attgctggtg ctcctggctt 2460

ccctggtgcc cgaggcccct ctggacccca gggccccggc ggccctcctg gtcccaaggg 2520

taacagcggt gaacctggtg ctcctggcag caaaggagac actggtgcta agggagagcc 2580

tggccctgtt ggtgttcaag gaccccctgg ccctgctgga gaggaaggaa agcgaggagc 2640

tcgaggtgaa cccggaccca ctggcctgcc cggaccccct ggcgagcgtg gtggacctgg 2700

tagccgtggt ttccctggcg cagatggtgt tgctggtccc aagggtcccg ctggtgaacg 2760

tggttctcct ggccccgctg gccccaaagg atctcctggt gaagctggtc gtcccggtga 2820

agctggtctg cctggtgcca agggtctgac tggaagccct ggcagccctg gtcctgatgg 2880

caaaactggc ccccctggtc ccgccggtca agatggtcgc cccggacccc caggcccacc 2940

tggtgcccgt ggtcaggctg gtgtgatggg attccctgga cctaaaggtg ctgctggaga 3000

gcccggcaag gctggagagc gaggtgttcc cggaccccct ggcgctgtcg gtcctgctgg 3060

caaagatgga gaggctggag ctcagggacc ccctggccct gctggtcccg ctggcgagag 3120

aggtgaacaa ggccctgctg gctcccccgg attccagggt ctccctggtc ctgctggtcc 3180

tccaggtgaa gcaggcaaac ctggtgaaca gggtgttcct ggagaccttg gcgcccctgg 3240

cccctctgga gcaagaggcg agagaggttt ccctggcgag cgtggtgtgc aaggtccccc 3300

tggtcctgct ggaccccgag gggccaacgg tgctcccggc aacgatggtg ctaagggtga 3360

tgctggtgcc cctggagctc ccggtagcca gggcgcccct ggccttcagg gaatgcctgg 3420

tgaacgtggt gcagctggtc ttccagggcc taagggtgac agaggtgatg ctggtcccaa 3480

aggtgctgat ggctctcctg gcaaagatgg cgtccgtggt ctgaccggcc ccattggtcc 3540

tcctggccct gctggtgccc ctggtgacaa gggtgaaagt ggtcccagcg gccctgctgg 3600

tcccactgga gctcgtggtg cccccggaga ccgtggtgag cctggtcccc ccggccctgc 3660

tggctttgct ggcccccctg gtgctgacgg ccaacctggt gctaaaggcg aacctggtga 3720

tgctggtgcc aaaggcgatg ctggtccccc tgggcctgcc ggacccgctg gaccccctgg 3780

ccccattggt aatgttggtg ctcctggagc caaaggtgct cgcggcagcg ctggtccccc 3840

tggtgctact ggtttccctg gtgctgctgg ccgagtcggt cctcctggcc cctctggaaa 3900

tgctggaccc cctggccctc ctggtcctgc tggcaaagaa ggcggcaaag gtccccgtgg 3960

tgagactggc cctgctggac gtcctggtga agttggtccc cctggtcccc ctggccctgc 4020

tggcgagaaa ggatcccctg gtgctgatgg tcctgctggt gctcctggta ctcccgggcc 4080

tcaaggtatt gctggacagc gtggtgtggt cggcctgcct ggtcagagag gagagagagg 4140

cttccctggt cttcctggcc cctctggtga acctggcaaa caaggtccct ctggagcaag 4200

tggtgaacgt ggtccccccg gtcccatggg cccccctgga ttggctggac cccctggtga 4260

atctggacgt gagggggctc ctgctgccga aggttcccct ggacgagacg gttctcctgg 4320

cgccaagggt gaccgtggtg agaccggccc cgctggaccc cctggtgctc ctggtgctcc 4380

tggtgcccct ggccccgttg gccctgctgg caagagtggt gatcgtggtg agactggtcc 4440

tgctggtccc gccggtcccg tcggccccgt cggcgcccgt ggccccgccg gaccccaagg 4500

cccccgtggt gacaagggtg agacaggcga acagggcgac agaggcataa agggtcaccg 4560

tggcttctct ggcctccagg gtccccctgg ccctcctggc tctcctggtg aacaaggtcc 4620

ctctggagcc tctggtcctg ctggtccccg aggtccccct ggctctgctg gtgctcctgg 4680

caaagatgga ctcaacggtc tccctggccc cattgggccc cctggtcctc gcggtcgcac 4740

tggtgatgct ggtcctgttg gtccccccgg ccctcctgga cctcctggtc cccctggtcc 4800

tcccagcgct ggtttcgact tcagcttcct gccccagcca cctcaagaga aggctcacga 4860

tggtggccgc tactaccggg ctgatgatgc caatgtggtt cgtgaccgtg acctcgaggt 4920

ggacaccacc ctcaagagcc tgagccagca gatcgagaac atccggagcc cagagggaag 4980

ccgcaagaac cccgcccgca cctgccgtga cctcaagatg tgccactctg actggaagag 5040

tggagagtac tggattgacc ccaaccaagg ctgcaacctg gatgccatca aagtcttctg 5100

caacatggag actggtgaga cctgcgtgta ccccactcag cccagtgtgg cccagaagaa 5160

ctggtacatc agcaagaacc ccaaggacaa gaggcatgtc tggttcggcg agagcatgac 5220

cgatggattc cagttcgagt atggcggcca gggctccgac cctgccgatg tggccatcca 5280

gctgaccttc ctgcgcctga tgtccaccga ggcctcccag aacatcacct accactgcaa 5340

gaacagcgtg gcctacatgg accagcagac tggcaacctc aagaaggccc tgctcctcaa 5400

gggctccaac gagatcgaga tccgcgccga gggcaacagc cgcttcacct acagcgtcac 5460

tgtcgatggc tgcacgagtc acaccggagc ctggggcaag acagtgattg aatacaaaac 5520

caccaagtcc tcccgcctgc ccatcatcga tgtggccccc ttggacgttg gtgccccaga 5580

ccaggaattc ggcttcgacg ttggccctgt ctgcttcctg tagaagcttg gtaccgaatt 5640

ccctgtgacc cctccccagt gcctctcctg gccctggaag ttgccactcc agtgcccacc 5700

agccttgtcc taataaaatt aagttgcatc attttgtctg actaggtgtc cttctataat 5760

attatggggt ggaggggggt ggtatggagc aaggggcaag ttgggaagac aacctgtagg 5820

gcctgcgggg tctattggga accaagctgg agtgcagtgg cacaatcttg gctcactgca 5880

atctccgcct cctgggttca agcgattctc ctgcctcagc ctcccgagtt gttgggattc 5940

caggcatgca tgaccaggct cagctaattt ttgttttttt ggtagagacg gggtttcacc 6000

atattggcca ggctggtctc caactcctaa tctcaggtga tctacccacc ttggcctccc 6060

aaattgctgg gattacaggc gtgaaccact gctcccttcc ctgtccttac gcgtagaatt 6120

ggtaaagaga gtcgtgtaaa atatcgagtt cgcacatctt gttgtctgat tattgatttt 6180

tggcgaaacc atttgatcat atgacaagat gtgtatctac cttaacttaa tgattttgat 6240

aaaaatcatt aactagtcca tggctgcctc gcgcgtttcg gtgatgacgg tgaaaacctc 6300

tgacacatgc agctcccgga gacggtcaca gcttgtctgt aagcggatgc cgggagcaga 6360

caagcccgtc agggcgcgtc agcgggtgtt ggcgggtgtc ggggcgcagc catgacccag 6420

tcacgtagcg atagcggagt gtatactggc ttaactatgc ggcatcagag cagattgtac 6480

tgagagtgca ccatatgcgg tgtgaaatac cgcacagatg cgtaaggaga aaataccgca 6540

tcaggcgctc ttccgcttcc tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt cggctgcggc 6600

gagcggtatc agctcactca aaggcggtaa tacggttatc cacagaatca ggggataacg 6660

caggaaagaa catgtgagca aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt 6720

tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa 6780

gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct 6840

ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc 6900

cttcgggaag cgtggcgctt tctcatagct cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg 6960

tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct 7020

tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag 7080

cagccactgg taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga 7140

agtggtggcc taactacggc tacactagaa gaacagtatt tggtatctgc gctctgctga 7200

agccagttac cttcggaaaa agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg 7260

gtagcggtgg tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag 7320

aagatccttt gatcttttct acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag 7380

ggattttggt catgagatta tcaaaaagga tcttcaccta gatcctttta aattaaaaat 7440

gaagttttaa atcaatctaa agtatatatg agtaaacttg gtctgacagt taccaatgct 7500

taatcagtga ggcacctatc tcagcgatct gtctatttcg ttcatccata gttgcctgac 7560

tcc 7563

<210> 2

<211> 7269

<212> DNA

<213> Homo Sapiens

<400> 2

cgtgaggctc cggtgcccgt cagtgggcag agcgcacatc gcccacagtc cccgagaagt 60

tggggggagg ggtcggcaat tgaaccggtg cctagagaaa gtggcgcggg gtaaactggg 120

aaagtgatgt cgtgtactgg ctccgccttt ttcccgaggg tgggggagaa ccgtatataa 180

gtgcagtagt cgccgtgaac gttctttttc gcaacgggtt tgccgccaga acacaggtaa 240

gtgccgtgtg tggttcccgc gggcctggcc tctttacggg ttatggccct tgcgtgcctt 300

gaattacttc cacgcccctg gctgcagtac gtgattcttg atcccgagct tcgggttgga 360

agtgggtggg agagttcgag gccttgcgct taaggagccc cttcgcctcg tgcttgagtt 420

gaggcctggc ttgggcgctg gggccgccgc gtgcgaatct ggtggcacct tcgcgcctgt 480

ctcgctgctt tcgataagtc tctagccatt taaaattttt gatgacctgc tgcgacgctt 540

tttttctggc aagatagtct tgtaaatgcg ggccaagatc tgcacactgg tatttcggtt 600

tttggggccg cgggcggcga cggggcccgt gcgtcccagc gcacatgttc ggcgaggcgg 660

ggcctgcgag cgcggccacc gagaatcgga cgggggtagt ctcaagctgg ccggcctgct 720

ctggtgcctg gcctcgcgcc gccgtgtatc gccccgccct gggcggcaag gctggcccgg 780

tcggcaccag ttgcgtgagc ggaaagatgg ccgcttcccg gccctgctgc agggagctca 840

aaatggagga cgcggcgctc gggagagcgg gcgggtgagt cacccacaca aaggaaaagg 900

gcctttccgt cctcagccgt cgcttcatgt gactccacgg agtaccgggc gccgtccagg 960

cacctcgatt agttctcgag cttttggagt acgtcgtctt taggttgggg ggaggggttt 1020

tatgcgatgg agtttcccca cactgagtgg gtggagactg aagttaggcc agcttggcac 1080

ttgatgtaat tctccttgga atttgccctt tttgagtttg gatcttggtt cattctcaag 1140

cctcagacag tggttcaaag tttttttctt ccatttcagg tgtcgtgaaa actaccccta 1200

aaagccagct agcgtctaag tgctagacat gctcagcttt gtggatacgc ggactttgtt 1260

gctgcttgca gtaaccttat gcctagcaac atgccaatct ttacaagagg aaactgtaag 1320

aaagggccca gccggagata gaggaccacg tggagaaagg ggtccaccag gccccccagg 1380

cagagatggt gaagatggtc ccacaggccc tcctggtcca cctggtcctc ctggcccccc 1440

tggtctcggt gggaactttg ctgctcagta tgatggaaaa ggagttggac ttggccctgg 1500

accaatgggc ttaatgggac ctagaggccc acctggtgca gctggagccc caggccctca 1560

aggtttccaa ggacctgctg gtgagcctgg tgaacctggt caaactggtc ctgcaggtgc 1620

tcgtggtcca gctggccctc ctggcaaggc tggtgaagat ggtcaccctg gaaaacccgg 1680

acgacctggt gagagaggag ttgttggacc acagggtgct cgtggtttcc ctggaactcc 1740

tggacttcct ggcttcaaag gcattagggg acacaatggt ctggatggat tgaagggaca 1800

gcccggtgct cctggtgtga agggtgaacc tggtgcccct ggtgaaaatg gaactccagg 1860

tcaaacagga gcccgtgggc ttcctggtga gagaggacgt gttggtgccc ctggcccagc 1920

tggtgcccgt ggcagtgatg gaagtgtggg tcccgtgggt cctgctggtc ccattgggtc 1980

tgctggccct ccaggcttcc caggtgcccc tggccccaag ggtgaaattg gagctgttgg 2040

taacgctggt cctgctggtc ccgccggtcc ccgtggtgaa gtgggtcttc caggcctctc 2100

cggccccgtt ggacctcctg gtaatcctgg agcaaacggc cttactggtg ccaagggtgc 2160

tgctggcctt cccggcgttg ctggggctcc cggcctccct ggaccccgcg gtattcctgg 2220

ccctgttggt gctgccggtg ctactggtgc cagaggactt gttggtgagc ctggtccagc 2280

tggctccaaa ggagagagcg gtaacaaggg tgagcccggc tctgctgggc cccaaggtcc 2340

tcctggtccc agtggtgaag aaggaaagag aggccctaat ggggaagctg gatctgccgg 2400

ccctccagga cctcctgggc tgagaggtag tcctggttct cgtggtcttc ctggagctga 2460

tggcagagct ggcgtcatgg gccctcctgg tagtcgtggt gcaagtggcc ctgctggagt 2520

ccgaggacct aatggagatg ctggtcgccc tggggagcct ggtctcatgg gacccagagg 2580

tcttcctggt tcccctggaa atatcggccc cgctggaaaa gaaggtcctg tcggcctccc 2640

tggcatcgac ggcaggcctg gcccaattgg ccccgctgga gcaagaggag agcctggcaa 2700

cattggattc cctggaccca aaggccccac tggtgatcct ggcaaaaacg gtgataaagg 2760

tcatgctggt cttgctggtg ctcggggtgc tccaggtcct gatggaaaca atggtgctca 2820

gggacctcct ggaccacagg gtgttcaagg tggaaaaggt gaacagggtc ccgctggtcc 2880

tccaggcttc cagggtctgc ctggcccctc aggtcccgct ggtgaagttg gcaaaccagg 2940

agaaaggggt ctccatggtg agtttggtct ccctggtcct gctggtccaa gaggggaacg 3000

cggtccccca ggtgagagtg gtgctgccgg tcctactggt cctattggaa gccgaggtcc 3060

ttctggaccc ccagggcctg atggaaacaa gggtgaacct ggtgtggttg gtgctgtggg 3120

cactgctggt ccatctggtc ctagtggact cccaggagag aggggtgctg ctggcatacc 3180

tggaggcaag ggagaaaagg gtgaacctgg tctcagaggt gaaattggta accctggcag 3240

agatggtgct cgtggtgctc ctggtgctgt aggtgcccct ggtcctgctg gagccacagg 3300

tgaccggggc gaagctgggg ctgctggtcc tgctggtcct gctggtcctc ggggaagccc 3360

tggtgaacgt ggtgaggtcg gtcctgctgg ccccaatgga tttgctggtc ctgctggtgc 3420

tgctggtcaa cctggtgcta aaggagaaag aggagccaaa gggcctaagg gtgaaaacgg 3480

tgttgttggt cccacaggcc ccgttggagc tgctggccca gctggtccaa atggtccccc 3540

cggtcctgct ggaagtcgtg gtgatggagg cccccctggt atgactggtt tccctggtgc 3600

tgctggacgg actggtcccc caggaccctc tggtatttct ggccctcctg gtccccctgg 3660

tcctgctggg aaagaagggc ttcgtggtcc tcgtggtgac caaggtccag ttggccgaac 3720

tggagaagta ggtgcagttg gtccccctgg cttcgctggt gagaagggtc cctctggaga 3780

ggctggtact gctggacctc ctggcactcc aggtcctcag ggtcttcttg gtgctcctgg 3840

tattctgggt ctccctggct cgagaggtga acgtggtcta ccaggtgttg ctggtgctgt 3900

gggtgaacct ggtcctcttg gcattgccgg ccctcctggg gcccgtggtc ctcctggtgc 3960

tgtgggtagt cctggagtca acggtgctcc tggtgaagct ggtcgtgatg gcaaccctgg 4020

gaacgatggt cccccaggtc gcgatggtca acccggacac aagggagagc gcggttaccc 4080

tggcaatatt ggtcccgttg gtgctgcagg tgcacctggt cctcatggcc ccgtgggtcc 4140

tgctggcaaa catggaaacc gtggtgaaac tggtccttct ggtcctgttg gtcctgctgg 4200

tgctgttggc ccaagaggtc ctagtggccc acaaggcatt cgtggcgata agggagagcc 4260

cggtgaaaag gggcccagag gtcttcctgg cttaaaggga cacaatggat tgcaaggtct 4320

gcctggtatc gctggtcacc atggtgatca aggtgctcct ggctccgtgg gtcctgctgg 4380

tcctaggggc cctgctggtc cttctggccc tgctggaaaa gatggtcgca ctggacatcc 4440

tggtacagtt ggacctgctg gcattcgagg ccctcagggt caccaaggcc ctgctggccc 4500

ccctggtccc cctggccctc ctggacctcc aggtgtaagc ggtggtggtt atgactttgg 4560

ttacgatgga gacttctaca gggctgacca gcctcgctca gcaccttctc tcagacccaa 4620

ggactatgaa gttgatgcta ctctgaagtc tctcaacaac cagattgaga cccttcttac 4680

tcctgaaggc tctagaaaga acccagctcg cacatgccgt gacttgagac tcagccaccc 4740

agagtggagc agtggttact actggattga ccctaaccaa ggatgcacta tggatgctat 4800

caaagtatac tgtgatttct ctactggcga aacctgtatc cgggcccaac ctgaaaacat 4860

cccagccaag aactggtata ggagctccaa ggacaagaaa cacgtctggc taggagaaac 4920

tatcaatgct ggcagccagt ttgaatataa tgtagaagga gtgacttcca aggaaatggc 4980

tacccaactt gccttcatgc gcctgctggc caactatgcc tctcagaaca tcacctacca 5040

ctgcaagaac agcattgcat acatggatga ggagactggc aacctgaaaa aggctgtcat 5100

tctacagggc tctaatgatg ttgaacttgt tgctgagggc aacagcaggt tcacttacac 5160

tgttcttgta gatggctgct ctaaaaagac aaatgaatgg ggaaagacaa tcattgaata 5220

caaaacaaat aagccatcac gcctgccctt ccttgatatt gcacctttgg acatcggtgg 5280

tgctgaccag gaattctttg tggacattgg cccagtctgt ttcaaataaa agcttggtac 5340

cgaattccct gtgacccctc cccagtgcct ctcctggccc tggaagttgc cactccagtg 5400

cccaccagcc ttgtcctaat aaaattaagt tgcatcattt tgtctgacta ggtgtccttc 5460

tataatatta tggggtggag gggggtggta tggagcaagg ggcaagttgg gaagacaacc 5520

tgtagggcct gcggggtcta ttgggaacca agctggagtg cagtggcaca atcttggctc 5580

actgcaatct ccgcctcctg ggttcaagcg attctcctgc ctcagcctcc cgagttgttg 5640

ggattccagg catgcatgac caggctcagc taatttttgt ttttttggta gagacggggt 5700

ttcaccatat tggccaggct ggtctccaac tcctaatctc aggtgatcta cccaccttgg 5760

cctcccaaat tgctgggatt acaggcgtga accactgctc ccttccctgt ccttacgcgt 5820

agaattggta aagagagtcg tgtaaaatat cgagttcgca catcttgttg tctgattatt 5880

gatttttggc gaaaccattt gatcatatga caagatgtgt atctacctta acttaatgat 5940

tttgataaaa atcattaact agtccatggc tgcctcgcgc gtttcggtga tgacggtgaa 6000

aacctctgac acatgcagct cccggagacg gtcacagctt gtctgtaagc ggatgccggg 6060

agcagacaag cccgtcaggg cgcgtcagcg ggtgttggcg ggtgtcgggg cgcagccatg 6120

acccagtcac gtagcgatag cggagtgtat actggcttaa ctatgcggca tcagagcaga 6180

ttgtactgag agtgcaccat atgcggtgtg aaataccgca cagatgcgta aggagaaaat 6240

accgcatcag gcgctcttcc gcttcctcgc tcactgactc gctgcgctcg gtcgttcggc 6300

tgcggcgagc ggtatcagct cactcaaagg cggtaatacg gttatccaca gaatcagggg 6360

ataacgcagg aaagaacatg tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac cgtaaaaagg 6420

ccgcgttgct ggcgtttttc cataggctcc gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac 6480

gctcaagtca gaggtggcga aacccgacag gactataaag ataccaggcg tttccccctg 6540

gaagctccct cgtgcgctct cctgttccga ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct 6600

ttctcccttc gggaagcgtg gcgctttctc atagctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg 6660

tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct 6720

gcgccttatc cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac 6780

tggcagcagc cactggtaac aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt 6840

tcttgaagtg gtggcctaac tacggctaca ctagaagaac agtatttggt atctgcgctc 6900

tgctgaagcc agttaccttc ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca 6960

ccgctggtag cggtggtttt tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat 7020

ctcaagaaga tcctttgatc ttttctacgg ggtctgacgc tcagtggaac gaaaactcac 7080

gttaagggat tttggtcatg agattatcaa aaaggatctt cacctagatc cttttaaatt 7140

aaaaatgaag ttttaaatca atctaaagta tatatgagta aacttggtct gacagttacc 7200

aatgcttaat cagtgaggca cctatctcag cgatctgtct atttcgttca tccatagttg 7260

cctgactcc 7269

<210> 3

<211> 4754

<212> DNA

<213> Homo Sapiens

<400> 3

cgtgaggctc cggtgcccgt cagtgggcag agcgcacatc gcccacagtc cccgagaagt 60

tggggggagg ggtcggcaat tgaaccggtg cctagagaaa gtggcgcggg gtaaactggg 120

aaagtgatgt cgtgtactgg ctccgccttt ttcccgaggg tgggggagaa ccgtatataa 180

gtgcagtagt cgccgtgaac gttctttttc gcaacgggtt tgccgccaga acacaggtaa 240

gtgccgtgtg tggttcccgc gggcctggcc tctttacggg ttatggccct tgcgtgcctt 300

gaattacttc cacgcccctg gctgcagtac gtgattcttg atcccgagct tcgggttgga 360

agtgggtggg agagttcgag gccttgcgct taaggagccc cttcgcctcg tgcttgagtt 420

gaggcctggc ttgggcgctg gggccgccgc gtgcgaatct ggtggcacct tcgcgcctgt 480

ctcgctgctt tcgataagtc tctagccatt taaaattttt gatgacctgc tgcgacgctt 540

tttttctggc aagatagtct tgtaaatgcg ggccaagatc tgcacactgg tatttcggtt 600

tttggggccg cgggcggcga cggggcccgt gcgtcccagc gcacatgttc ggcgaggcgg 660

ggcctgcgag cgcggccacc gagaatcgga cgggggtagt ctcaagctgg ccggcctgct 720

ctggtgcctg gcctcgcgcc gccgtgtatc gccccgccct gggcggcaag gctggcccgg 780

tcggcaccag ttgcgtgagc ggaaagatgg ccgcttcccg gccctgctgc agggagctca 840

aaatggagga cgcggcgctc gggagagcgg gcgggtgagt cacccacaca aaggaaaagg 900

gcctttccgt cctcagccgt cgcttcatgt gactccacgg agtaccgggc gccgtccagg 960

cacctcgatt agttctcgag cttttggagt acgtcgtctt taggttgggg ggaggggttt 1020

tatgcgatgg agtttcccca cactgagtgg gtggagactg aagttaggcc agcttggcac 1080

ttgatgtaat tctccttgga atttgccctt tttgagtttg gatcttggtt cattctcaag 1140

cctcagacag tggttcaaag tttttttctt ccatttcagg tgtcgtgaaa actaccccta 1200

aaagccagga tccaccatga tctggtatat attaattata ggaattctgc ttccccagtc 1260

tttggctcat ccaggctttt ttacttcaat tggtcagatg actgatttga tccatactga 1320

gaaagatctg gtgacttctc tgaaagatta tattaaggca gaagaggaca agttagaaca 1380

aataaaaaaa tgggcagaga agttagatcg gctaactagt acagcgacaa aagatccaga 1440

aggatttgtt gggcatccag taaatgcatt caaattaatg aaacgtctga atactgagtg 1500

gagtgagttg gagaatctgg tccttaagga tatgtcagat ggctttatct ctaacctaac 1560

cattcagaga cagtactttc ctaatgatga agatcaggtt ggggcagcca aagctctgtt 1620

acgtctccag gatacctaca atttggatac agataccatc tcaaagggta atcttccagg 1680

agtgaaacac aaatcttttc taacggctga ggactgcttt gagttgggca aagtggccta 1740

tacagaagca gattattacc atacggaact gtggatggaa caagccctaa ggcaactgga 1800

tgaaggcgag atttctacca tagataaagt ctctgttcta gattatttga gctatgcggt 1860

atatcagcag ggagacctgg ataaggcact tttgctcaca aagaagcttc ttgaactaga 1920

tcctgaacat cagagagcta atggtaactt aaaatatttt gagtatataa tggctaaaga 1980

aaaagatgtc aataagtctg cttcagatga ccaatctgat cagaaaacta caccaaagaa 2040

aaaaggggtt gctgtggatt acctgccaga gagacagaag tacgaaatgc tgtgccgtgg 2100

ggagggtatc aaaatgaccc ctcggagaca gaaaaaactc ttttgccgct accatgatgg 2160

aaaccgtaat cctaaattta ttctggctcc agctaaacag gaggatgaat gggacaagcc 2220

tcgtattatt cgcttccatg atattatttc tgatgcagaa attgaaatcg tcaaagacct 2280

agcaaaacca aggctgaggc gagccaccat ttcaaaccca ataacaggag acttggagac 2340

ggtacattac agaattagca aaagtgcctg gctctctggc tatgaaaatc ctgtggtgtc 2400

tcgaattaat atgagaatac aagatctaac aggactagat gtttccacag cagaggaatt 2460

acaggtagca aattatggag ttggaggaca gtatgaaccc cattttgact ttgcacggaa 2520

agatgagcca gatgctttca aagagctggg gacaggaaat agaattgcta catggctgtt 2580

ttatatgagt gatgtgtctg caggaggagc cactgttttt cctgaagttg gagctagtgt 2640

ttggcccaaa aaaggaactg ctgttttctg gtataatctg tttgccagtg gagaaggaga 2700

ttatagtaca cggcatgcag cctgtccagt gctagttggc aacaaatggg tatccaataa 2760

atggctccat gaacgtggac aagaatttcg aagaccttgt acgttgtcag aattggaata 2820

ggtaccgaat tccctgtgac ccctccccag tgcctctcct ggccctggaa gttgccactc 2880

cagtgcccac cagccttgtc ctaataaaat taagttgcat cattttgtct gactaggtgt 2940

ccttctataa tattatgggg tggagggggg tggtatggag caaggggcaa gttgggaaga 3000

caacctgtag ggcctgcggg gtctattggg aaccaagctg gagtgcagtg gcacaatctt 3060

ggctcactgc aatctccgcc tcctgggttc aagcgattct cctgcctcag cctcccgagt 3120

tgttgggatt ccaggcatgc atgaccaggc tcagctaatt tttgtttttt tggtagagac 3180

ggggtttcac catattggcc aggctggtct ccaactccta atctcaggtg atctacccac 3240

cttggcctcc caaattgctg ggattacagg cgtgaaccac tgctcccttc cctgtcctta 3300

cgcgtagaat tggtaaagag agtcgtgtaa aatatcgagt tcgcacatct tgttgtctga 3360

ttattgattt ttggcgaaac catttgatca tatgacaaga tgtgtatcta ccttaactta 3420

atgattttga taaaaatcat taactagtcc atggctgcct cgcgcgtttc ggtgatgacg 3480

gtgaaaacct ctgacacatg cagctcccgg agacggtcac agcttgtctg taagcggatg 3540

ccgggagcag acaagcccgt cagggcgcgt cagcgggtgt tggcgggtgt cggggcgcag 3600

ccatgaccca gtcacgtagc gatagcggag tgtatactgg cttaactatg cggcatcaga 3660

gcagattgta ctgagagtgc accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag 3720

aaaataccgc atcaggcgct cttccgcttc ctcgctcact gactcgctgc gctcggtcgt 3780

tcggctgcgg cgagcggtat cagctcactc aaaggcggta atacggttat ccacagaatc 3840

aggggataac gcaggaaaga acatgtgagc aaaaggccag caaaaggcca ggaaccgtaa 3900

aaaggccgcg ttgctggcgt ttttccatag gctccgcccc cctgacgagc atcacaaaaa 3960

tcgacgctca agtcagaggt ggcgaaaccc gacaggacta taaagatacc aggcgtttcc 4020

ccctggaagc tccctcgtgc gctctcctgt tccgaccctg ccgcttaccg gatacctgtc 4080

cgcctttctc ccttcgggaa gcgtggcgct ttctcatagc tcacgctgta ggtatctcag 4140

ttcggtgtag gtcgttcgct ccaagctggg ctgtgtgcac gaaccccccg ttcagcccga 4200

ccgctgcgcc ttatccggta actatcgtct tgagtccaac ccggtaagac acgacttatc 4260

gccactggca gcagccactg gtaacaggat tagcagagcg aggtatgtag gcggtgctac 4320

agagttcttg aagtggtggc ctaactacgg ctacactaga agaacagtat ttggtatctg 4380

cgctctgctg aagccagtta ccttcggaaa aagagttggt agctcttgat ccggcaaaca 4440

aaccaccgct ggtagcggtg gtttttttgt ttgcaagcag cagattacgc gcagaaaaaa 4500

aggatctcaa gaagatcctt tgatcttttc tacggggtct gacgctcagt ggaacgaaaa 4560

ctcacgttaa gggattttgg tcatgagatt atcaaaaagg atcttcacct agatcctttt 4620

aaattaaaaa tgaagtttta aatcaatcta aagtatatat gagtaaactt ggtctgacag 4680

ttaccaatgc ttaatcagtg aggcacctat ctcagcgatc tgtctatttc gttcatccat 4740

agttgcctga ctcc 4754

<210> 4

<211> 4764

<212> DNA

<213> Homo Sapiens

<400> 4

cgtgaggctc cggtgcccgt cagtgggcag agcgcacatc gcccacagtc cccgagaagt 60

tggggggagg ggtcggcaat tgaaccggtg cctagagaaa gtggcgcggg gtaaactggg 120

aaagtgatgt cgtgtactgg ctccgccttt ttcccgaggg tgggggagaa ccgtatataa 180

gtgcagtagt cgccgtgaac gttctttttc gcaacgggtt tgccgccaga acacaggtaa 240

gtgccgtgtg tggttcccgc gggcctggcc tctttacggg ttatggccct tgcgtgcctt 300

gaattacttc cacgcccctg gctgcagtac gtgattcttg atcccgagct tcgggttgga 360

agtgggtggg agagttcgag gccttgcgct taaggagccc cttcgcctcg tgcttgagtt 420

gaggcctggc ttgggcgctg gggccgccgc gtgcgaatct ggtggcacct tcgcgcctgt 480

ctcgctgctt tcgataagtc tctagccatt taaaattttt gatgacctgc tgcgacgctt 540

tttttctggc aagatagtct tgtaaatgcg ggccaagatc tgcacactgg tatttcggtt 600

tttggggccg cgggcggcga cggggcccgt gcgtcccagc gcacatgttc ggcgaggcgg 660

ggcctgcgag cgcggccacc gagaatcgga cgggggtagt ctcaagctgg ccggcctgct 720

ctggtgcctg gcctcgcgcc gccgtgtatc gccccgccct gggcggcaag gctggcccgg 780

tcggcaccag ttgcgtgagc ggaaagatgg ccgcttcccg gccctgctgc agggagctca 840

aaatggagga cgcggcgctc gggagagcgg gcgggtgagt cacccacaca aaggaaaagg 900

gcctttccgt cctcagccgt cgcttcatgt gactccacgg agtaccgggc gccgtccagg 960

cacctcgatt agttctcgag cttttggagt acgtcgtctt taggttgggg ggaggggttt 1020

tatgcgatgg agtttcccca cactgagtgg gtggagactg aagttaggcc agcttggcac 1080

ttgatgtaat tctccttgga atttgccctt tttgagtttg gatcttggtt cattctcaag 1140

cctcagacag tggttcaaag tttttttctt ccatttcagg tgtcgtgaaa actaccccta 1200

aaagccagga tccaccatga aactctgggt gtctgcattg ctgatggcct ggtttggtgt 1260

cctgagctgt gtgcaggccg aattcttcac ctctattggg cacatgactg acctgattta 1320

tgcagagaaa gagctggtgc agtctctgaa agagtacatc cttgtggagg aagccaagct 1380

ttccaagatt aagagctggg ccaacaaaat ggaagccttg actagcaagt cagctgctga 1440

tgctgagggc tacctggctc accctgtgaa tgcctacaaa ctggtgaagc ggctaaacac 1500

agactggcct gcgctggagg accttgtcct gcaggactca gctgcaggtt ttatcgccaa 1560

cctctctgtg cagcggcagt tcttccccac tgatgaggac gagataggag ctgccaaagc 1620

cctgatgaga cttcaggaca catacaggct ggacccaggc acaatttcca gaggggaact 1680

tccaggaacc aagtaccagg caatgctgag tgtggatgac tgctttggga tgggccgctc 1740

ggcctacaat gaaggggact attatcatac ggtgttgtgg atggagcagg tgctaaagca 1800

gcttgatgcc ggggaggagg ccaccacaac caagtcacag gtgctggact acctcagcta 1860

tgctgtcttc cagttgggtg atctgcaccg tgccctggag ctcacccgcc gcctgctctc 1920

ccttgaccca agccacgaac gagctggagg gaatctgcgg tactttgagc agttattgga 1980

ggaagagaga gaaaaaacgt taacaaatca gacagaagct gagctagcaa ccccagaagg 2040

catctatgag aggcctgtgg actacctgcc tgagagggat gtttacgaga gcctctgtcg 2100

tggggagggt gtcaaactga caccccgtag acagaagagg cttttctgta ggtaccacca 2160

tggcaacagg gccccacagc tgctcattgc ccccttcaaa gaggaggacg agtgggacag 2220

cccgcacatc gtcaggtact acgatgtcat gtctgatgag gaaatcgaga ggatcaagga 2280

gatcgcaaaa cctaaacttg cacgagccac cgttcgtgat cccaagacag gagtcctcac 2340

tgtcgccagc taccgggttt ccaaaagctc ctggctagag gaagatgatg accctgttgt 2400

ggcccgagta aatcgtcgga tgcagcatat cacagggtta acagtaaaga ctgcagaatt 2460

gttacaggtt gcaaattatg gagtgggagg acagtatgaa ccgcacttcg acttctctag 2520

gcgacctttt gacagcggcc tcaaaacaga ggggaatagg ttagcgacgt ttcttaacta 2580

catgagtgat gtagaagctg gtggtgccac cgtcttccct gatctggggg ctgcaatttg 2640

gcctaagaag ggtacagctg tgttctggta caacctcttg cggagcgggg aaggtgacta 2700

ccgaacaaga catgctgcct gccctgtgct tgtgggctgc aagtgggtct ccaataagtg 2760

gttccatgaa cgaggacagg agttcttgag accttgtgga tcaacagaag ttgactaagt 2820

cgacaagctt ggtaccgaat tccctgtgac ccctccccag tgcctctcct ggccctggaa 2880

gttgccactc cagtgcccac cagccttgtc ctaataaaat taagttgcat cattttgtct 2940

gactaggtgt ccttctataa tattatgggg tggagggggg tggtatggag caaggggcaa 3000

gttgggaaga caacctgtag ggcctgcggg gtctattggg aaccaagctg gagtgcagtg 3060

gcacaatctt ggctcactgc aatctccgcc tcctgggttc aagcgattct cctgcctcag 3120

cctcccgagt tgttgggatt ccaggcatgc atgaccaggc tcagctaatt tttgtttttt 3180

tggtagagac ggggtttcac catattggcc aggctggtct ccaactccta atctcaggtg 3240

atctacccac cttggcctcc caaattgctg ggattacagg cgtgaaccac tgctcccttc 3300

cctgtcctta cgcgtagaat tggtaaagag agtcgtgtaa aatatcgagt tcgcacatct 3360

tgttgtctga ttattgattt ttggcgaaac catttgatca tatgacaaga tgtgtatcta 3420

ccttaactta atgattttga taaaaatcat taactagtcc atggctgcct cgcgcgtttc 3480

ggtgatgacg gtgaaaacct ctgacacatg cagctcccgg agacggtcac agcttgtctg 3540

taagcggatg ccgggagcag acaagcccgt cagggcgcgt cagcgggtgt tggcgggtgt 3600

cggggcgcag ccatgaccca gtcacgtagc gatagcggag tgtatactgg cttaactatg 3660

cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat 3720

gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgct cttccgcttc ctcgctcact gactcgctgc 3780

gctcggtcgt tcggctgcgg cgagcggtat cagctcactc aaaggcggta atacggttat 3840

ccacagaatc aggggataac gcaggaaaga acatgtgagc aaaaggccag caaaaggcca 3900

ggaaccgtaa aaaggccgcg ttgctggcgt ttttccatag gctccgcccc cctgacgagc 3960

atcacaaaaa tcgacgctca agtcagaggt ggcgaaaccc gacaggacta taaagatacc 4020

aggcgtttcc ccctggaagc tccctcgtgc gctctcctgt tccgaccctg ccgcttaccg 4080

gatacctgtc cgcctttctc ccttcgggaa gcgtggcgct ttctcatagc tcacgctgta 4140

ggtatctcag ttcggtgtag gtcgttcgct ccaagctggg ctgtgtgcac gaaccccccg 4200

ttcagcccga ccgctgcgcc ttatccggta actatcgtct tgagtccaac ccggtaagac 4260

acgacttatc gccactggca gcagccactg gtaacaggat tagcagagcg aggtatgtag 4320

gcggtgctac agagttcttg aagtggtggc ctaactacgg ctacactaga agaacagtat 4380

ttggtatctg cgctctgctg aagccagtta ccttcggaaa aagagttggt agctcttgat 4440

ccggcaaaca aaccaccgct ggtagcggtg gtttttttgt ttgcaagcag cagattacgc 4500

gcagaaaaaa aggatctcaa gaagatcctt tgatcttttc tacggggtct gacgctcagt 4560

ggaacgaaaa ctcacgttaa gggattttgg tcatgagatt atcaaaaagg atcttcacct 4620

agatcctttt aaattaaaaa tgaagtttta aatcaatcta aagtatatat gagtaaactt 4680

ggtctgacag ttaccaatgc ttaatcagtg aggcacctat ctcagcgatc tgtctatttc 4740

gttcatccat agttgcctga ctcc 4764

<210> 5

<211> 11990

<212> DNA

<213> Homo Sapiens

<400> 5

cgtgaggctc cggtgcccgt cagtgggcag agcgcacatc gcccacagtc cccgagaagt 60

tggggggagg ggtcggcaat tgaaccggtg cctagagaaa gtggcgcggg gtaaactggg 120

aaagtgatgt cgtgtactgg ctccgccttt ttcccgaggg tgggggagaa ccgtatataa 180

gtgcagtagt cgccgtgaac gttctttttc gcaacgggtt tgccgccaga acacaggtaa 240

gtgccgtgtg tggttcccgc gggcctggcc tctttacggg ttatggccct tgcgtgcctt 300

gaattacttc cacgcccctg gctgcagtac gtgattcttg atcccgagct tcgggttgga 360

agtgggtggg agagttcgag gccttgcgct taaggagccc cttcgcctcg tgcttgagtt 420

gaggcctggc ttgggcgctg gggccgccgc gtgcgaatct ggtggcacct tcgcgcctgt 480

ctcgctgctt tcgataagtc tctagccatt taaaattttt gatgacctgc tgcgacgctt 540

tttttctggc aagatagtct tgtaaatgcg ggccaagatc tgcacactgg tatttcggtt 600

tttggggccg cgggcggcga cggggcccgt gcgtcccagc gcacatgttc ggcgaggcgg 660

ggcctgcgag cgcggccacc gagaatcgga cgggggtagt ctcaagctgg ccggcctgct 720

ctggtgcctg gcctcgcgcc gccgtgtatc gccccgccct gggcggcaag gctggcccgg 780

tcggcaccag ttgcgtgagc ggaaagatgg ccgcttcccg gccctgctgc agggagctca 840

aaatggagga cgcggcgctc gggagagcgg gcgggtgagt cacccacaca aaggaaaagg 900

gcctttccgt cctcagccgt cgcttcatgt gactccacgg agtaccgggc gccgtccagg 960

cacctcgatt agttctcgag cttttggagt acgtcgtctt taggttgggg ggaggggttt 1020

tatgcgatgg agtttcccca cactgagtgg gtggagactg aagttaggcc agcttggcac 1080

ttgatgtaat tctccttgga atttgccctt tttgagtttg gatcttggtt cattctcaag 1140

cctcagacag tggttcaaag tttttttctt ccatttcagg tgtcgtgaaa actaccccta 1200

aaagccagga tccgatatcg tcgaccacca tgacgctgcg gcttctggtg gccgcgctct 1260

gcgccgggat cctggcagag gcgccccgag tgcgagccca gcacagggag agagtgacct 1320

gcacgcgcct ttacgccgct gacattgtgt tcttactgga tggctcctca tccattggcc 1380

gcagcaattt ccgcgaggtc cgcagctttc tcgaagggct ggtgctgcct ttctctggag 1440

cagccagtgc acagggtgtg cgctttgcca cagtgcagta cagcgatgac ccacggacag 1500

agttcggcct ggatgcactt ggctctgggg gtgatgtgat ccgcgccatc cgtgagctta 1560

gctacaaggg gggcaacact cgcacagggg ctgcaattct ccatgtggct gaccatgtct 1620

tcctgcccca gctggcccga cctggtgtcc ccaaggtctg catcctgatc acagacggga 1680

agtcccagga cctggtggac acagctgccc aaaggctgaa ggggcagggg gtcaagctat 1740

ttgctgtggg gatcaagaat gctgaccctg aggagctgaa gcgagttgcc tcacagccaa 1800

cctccgactt cttcttcttc gtcaatgact tcagcatctt gaggacacta ctgcccctcg 1860

tttcccggag agtgtgcacg actgctggtg gcgtgcctgt gacccgacct ccggatgact 1920

cgacctctgc tccacgagac ctggtgctgt ctgagccaag cagccaatcc ttgagagtac 1980

agtggacagc ggccagtggc cctgtgactg gctacaaggt ccagtacact cctctgacgg 2040

ggctgggaca gccactgccg agtgagcggc aggaggtgaa cgtcccagct ggtgagacca 2100

gtgtgcggct gcggggtctc cggccactga ccgagtacca agtgactgtg attgccctct 2160

acgccaacag catcggggag gctgtgagcg ggacagctcg gaccactgcc ctagaagggc 2220

cggaactgac catccagaat accacagccc acagcctcct ggtggcctgg cggagtgtgc 2280

caggtgccac tggctaccgt gtgacatggc gggtcctcag tggtgggccc acacagcagc 2340

aggagctggg ccctgggcag ggttcagtgt tgctgcgtga cttggagcct ggcacggact 2400

atgaggtgac cgtgagcacc ctatttggcc gcagtgtggg gcccgccact tccctgatgg 2460

ctcgcactga cgcttctgtt gagcagaccc tgcgcccggt catcctgggc cccacatcca 2520

tcctcctttc ctggaacttg gtgcctgagg cccgtggcta ccggttggaa tggcggcgtg 2580

agactggctt ggagccaccg cagaaggtgg tactgccctc tgatgtgacc cgctaccagt 2640

tggatgggct gcagccgggc actgagtacc gcctcacact ctacactctg ctggagggcc 2700

acgaggtggc cacccctgca accgtggttc ccactggacc agagctgcct gtgagccctg 2760

taacagacct gcaagccacc gagctgcccg ggcagcgggt gcgagtgtcc tggagcccag 2820

tccctggtgc cacccagtac cgcatcattg tgcgcagcac ccagggggtt gagcggaccc 2880

tggtgcttcc tgggagtcag acagcattcg acttggatga cgttcaggct gggcttagct 2940

acactgtgcg ggtgtctgct cgagtgggtc cccgtgaggg cagtgccagt gtcctcactg 3000

tccgccggga gccggaaact ccacttgctg ttccagggct gcgggttgtg gtgtcagatg 3060

caacgcgagt gagggtggcc tggggacccg tccctggagc cagtggattt cggattagct 3120

ggagcacagg cagtggtccg gagtccagcc agacactgcc cccagactct actgccacag 3180

acatcacagg gctgcagcct ggaaccacct accaggtggc tgtgtcggta ctgcgaggca 3240

gagaggaggg ccctgctgca gtcatcgtgg ctcgaacgga cccactgggc ccagtgagga 3300

cggtccatgt gactcaggcc agcagctcat ctgtcaccat tacctggacc agggttcctg 3360

gcgccacagg atacagggtt tcctggcact cagcccacgg cccagagaaa tcccagttgg 3420

tttctgggga ggccacggtg gctgagctgg atggactgga gccagatact gagtatacgg 3480

tgcatgtgag ggcccatgtg gctggcgtgg atgggccccc tgcctctgtg gttgtgagga 3540

ctgcccctga gcctgtgggt cgtgtgtcga ggctgcagat cctcaatgct tccagcgacg 3600

ttctacggat cacctgggta ggggtcactg gagccacagc ttacagactg gcctggggcc 3660

ggagtgaagg cggccccatg aggcaccaga tactcccagg aaacacagac tctgcagaga 3720

tccggggtct cgaaggtgga gtcagctact cagtgcgagt gactgcactt gtcggggacc 3780

gcgagggcac acctgtctcc attgttgtca ctacgccgcc tgaggctccg ccagccctgg 3840

ggacgcttca cgtggtgcag cgcggggagc actcgctgag gctgcgctgg gagccggtgc 3900

ccagagcgca gggcttcctt ctgcactggc aacctgaggg tggccaggaa cagtcccggg 3960

tcctggggcc cgagctcagc agctatcacc tggacgggct ggagccagcg acacagtacc 4020

gcgtgaggct gagtgtccta gggccggctg gagaagggcc ctctgcagag gtgactgcgc 4080

gcactgagtc acctcgtgtt ccaagcattg aactacgtgt ggtggacacc tcgatcgact 4140

cggtgacttt ggcctggact ccagtgtcca gggcatccag ctacatccta tcctggcggc 4200

cactcagagg ccctggccag gaagtgcctg ggtccccgca gacacttcca gggatctcaa 4260

gctcccagcg ggtgacaggg ctagagcctg gcgtctctta catcttctcc ctgacgcctg 4320

tcctggatgg tgtgcggggt cctgaggcat ctgtcacaca gacgccagtg tgcccccgtg 4380

gcctggcgga tgtggtgttc ctaccacatg ccactcaaga caatgctcac cgtgcggagg 4440

ctacgaggag ggtcctggag cgtctggtgt tggcacttgg gcctcttggg ccacaggcag 4500

ttcaggttgg cctgctgtct tacagtcatc ggccctcccc actgttccca ctgaatggct 4560

cccatgacct tggcattatc ttgcaaagga tccgtgacat gccctacatg gacccaagtg 4620

ggaacaacct gggcacagcc gtggtcacag ctcacagata catgttggca ccagatgctc 4680

ctgggcgccg ccagcacgta ccaggggtga tggttctgct agtggatgaa cccttgagag 4740

gtgacatatt cagccccatc cgtgaggccc aggcttctgg gcttaatgtg gtgatgttgg 4800

gaatggctgg agcggaccca gagcagctgc gtcgcttggc gccgggtatg gactctgtcc 4860

agaccttctt cgccgtggat gatgggccaa gcctggacca ggcagtcagt ggtctggcca 4920

cagccctgtg tcaggcatcc ttcactactc agccccggcc agagccctgc ccagtgtatt 4980

gtccaaaggg ccagaagggg gaacctggag agatgggcct gagaggacaa gttgggcctc 5040

ctggcgaccc tggcctcccg ggcaggaccg gtgctcccgg cccccagggg ccccctggaa 5100

gtgccactgc caagggcgag aggggcttcc ctggagcaga tgggcgtcca ggcagccctg 5160

gccgcgccgg gaatcctggg acccctggag cccctggcct aaagggctct ccagggttgc 5220

ctggccctcg tggggacccg ggagagcgag gacctcgagg cccaaagggg gagccggggg 5280

ctcccggaca agtcatcgga ggtgaaggac ctgggcttcc tgggcggaaa ggggaccctg 5340

gaccatcggg cccccctgga cctcgtggac cactggggga cccaggaccc cgtggccccc 5400

cagggcttcc tggaacagcc atgaagggtg acaaaggcga tcgtggggag cggggtcccc 5460

ctggaccagg tgaaggtggc attgctcctg gggagcctgg gctgccgggt cttcccggaa 5520

gccctggacc ccaaggcccc gttggccccc ctggaaagaa aggagaaaaa ggtgactctg 5580

aggatggagc tccaggcctc ccaggacaac ctgggtctcc gggtgagcag ggcccacggg 5640

gacctcctgg agctattggc cccaaaggtg accggggctt tccagggccc ctgggtgagg 5700

ctggagagaa gggcgaacgt ggacccccag gcccagcggg atcccggggg ctgccagggg 5760

ttgctggacg tcctggagcc aagggtcctg aagggccacc aggacccact ggccgccaag 5820

gagagaaggg ggagcctggt cgccctgggg accctgcagt ggtgggacct gctgttgctg 5880

gacccaaagg agaaaaggga gatgtggggc ccgctgggcc cagaggagct accggagtcc 5940

aaggggaacg gggcccaccc ggcttggttc ttcctggaga ccctggcccc aagggagacc 6000

ctggagaccg gggtcccatt ggccttactg gcagagcagg acccccaggt gactcagggc 6060

ctcctggaga gaagggagac cctgggcggc ctggcccccc aggacctgtt ggcccccgag 6120

gacgagatgg tgaagttgga gagaaaggtg acgagggtcc tccgggtgac ccgggtttgc 6180

ctggaaaagc aggcgagcgt ggccttcggg gggcacctgg agttcggggg cctgtgggtg 6240

aaaagggaga ccagggagat cctggagagg atggacgaaa tggcagccct ggatcatctg 6300

gacccaaggg tgaccgtggg gagccgggtc ccccaggacc cccgggacgg ctggtagaca 6360

caggacctgg agccagagag aagggagagc ctggggaccg cggacaagag ggtcctcgag 6420

ggcccaaggg tgatcctggc ctccctggag cccctgggga aaggggcatt gaagggtttc 6480

ggggaccccc aggcccacag ggggacccag gtgtccgagg cccagcagga gaaaagggtg 6540

accggggtcc ccctgggctg gatggccgga gcggactgga tgggaaacca ggagccgctg 6600

ggccctctgg gccgaatggt gctgcaggca aagctgggga cccagggaga gacgggcttc 6660

caggcctccg tggagaacaa ggcctccctg gcccctctgg tccccctgga ttaccgggaa 6720

agccaggcga ggatgggaaa cctggcctga atggaaaaaa cggagaacct ggggaccctg 6780

gagaagacgg gaggaaggga gagaaaggag attcaggcgc ctctgggaga gaaggtcgtg 6840

atggccccaa gggtgagcgt ggagctcctg gtatccttgg accccagggg cctccaggcc 6900

tcccagggcc agtgggccct cctggccagg gttttcctgg tgtcccagga ggcacgggcc 6960

ccaagggtga ccgtggggag actggatcca aaggggagca gggcctccct ggagagcgtg 7020

gcctgcgagg agagcctgga agtgtgccga atgtggatcg gttgctggaa actgctggca 7080

tcaaggcatc tgccctgcgg gagatcgtgg agacctggga tgagagctct ggtagcttcc 7140

tgcctgtgcc cgaacggcgt cgaggcccca agggggactc aggcgaacag ggccccccag 7200

gcaaggaggg ccccatcggc tttcctggag aacgcgggct gaagggcgac cgtggagacc 7260

ctggccctca ggggccacct ggtctggccc ttggggagag gggccccccc gggccttccg 7320

gccttgccgg ggagcctgga aagcctggta ttcccgggct cccaggcagg gctgggggtg 7380

tgggagaggc aggaaggcca ggagagaggg gagaacgggg agagaaagga gaacgtggag 7440

aacagggcag agatggccct cctggactcc ctggaacccc tgggcccccc ggaccccctg 7500

gccccaaggt gtctgtggat gagccaggtc ctggactctc tggagaacag ggaccccctg 7560

gactcaaggg tgctaagggg gagccgggca gcaatggtga ccaaggtccc aaaggagaca 7620

ggggtgtgcc aggcatcaaa ggagaccggg gagagcctgg accgaggggt caggacggca 7680

acccgggtct accaggagag cgtggtatgg ctgggcctga agggaagccg ggtctgcagg 7740

gtccaagagg cccccctggc ccagtgggtg gtcatggaga ccctggacca cctggtgccc 7800

cgggtcttgc tggccctgca ggaccccaag gaccttctgg cctgaagggg gagcctggag 7860

agacaggacc tccaggacgg ggcctgactg gacctactgg agctgtggga cttcctggac 7920

cccccggccc ttcaggcctt gtgggtccac aggggtctcc aggtttgcct ggacaagtgg 7980

gggagacagg gaagccggga gccccaggtc gagatggtgc cagtggaaaa gatggagaca 8040

gagggagccc tggtgtgcca gggtcaccag gtctgcctgg ccctgtcgga cctaaaggag 8100

aacctggccc cacgggggcc cctggacagg ctgtggtcgg gctccctgga gcaaagggag 8160

agaagggagc ccctggaggc cttgctggag acctggtggg tgagccggga gccaaaggtg 8220

accgaggact gccagggccg cgaggcgaga agggtgaagc tggccgtgca ggggagcccg 8280

gagaccctgg ggaagatggt cagaaagggg ctccaggacc caaaggtttc aagggtgacc 8340

caggagtcgg ggtcccgggc tcccctgggc ctcctggccc tccaggtgtg aagggagatc 8400

tgggcctccc tggcctgccc ggtgctcctg gtgttgttgg gttcccgggt cagacaggcc 8460

ctcgaggaga gatgggtcag ccaggcccta gtggagagcg gggtctggca ggccccccag 8520

ggagagaagg aatcccagga cccctggggc cacctggacc accggggtca gtgggaccac 8580

ctggggcctc tggactcaaa ggagacaagg gagaccctgg agtagggctg cctgggcccc 8640

gaggcgagcg tggggagcca ggcatccggg gtgaagatgg ccgccccggc caggagggac 8700

cccgaggact cacggggccc cctggcagca ggggagagcg tggggagaag ggtgatgttg 8760

ggagtgcagg actaaagggt gacaagggag actcagctgt gatcctgggg cctccaggcc 8820

cacggggtgc caagggggac atgggtgaac gagggcctcg gggcttggat ggtgacaaag 8880

gacctcgggg agacaatggg gaccctggtg acaagggcag caagggagag cctggtgaca 8940

agggctcagc cgggttgcca ggactgcgtg gactcctggg accccagggt caacctggtg 9000

cagcagggat ccctggtgac ccgggatccc caggaaagga tggagtgcct ggtatccgag 9060

gagaaaaagg agatgttggc ttcatgggtc cccggggcct caagggtgaa cggggagtga 9120

agggagcctg tggccttgat ggagagaagg gagacaaggg agaagctggt cccccaggcc 9180

gccccgggct ggcaggacac aaaggagaga tgggggagcc tggtgtgccg ggccagtcgg 9240

gggcccctgg caaggagggc ctgatcggtc ccaagggtga ccgaggcttt gacgggcagc 9300

caggccccaa gggtgaccag ggcgagaaag gggagcgggg aaccccagga attgggggct 9360

tcccaggccc cagtggaaat gatggctctg ctggtccccc agggccacct ggcagtgttg 9420

gtcccagagg ccccgaagga cttcagggcc agaagggtga gcgaggtccc cccggagaga 9480

gagtggtggg ggctcctggg gtccctggag ctcctggcga gagaggggag caggggcggc 9540

cagggcctgc cggtcctcga ggcgagaagg gagaagctgc actgacggag gatgacatcc 9600

ggggctttgt gcgccaagag atgagtcagc actgtgcctg ccagggccag ttcatcgcat 9660

ctggatcacg acccctccct agttatgctg cagacactgc cggctcccag ctccatgctg 9720

tgcctgtgct ccgcgtctct catgcagagg aggaagagcg ggtaccccct gaggatgatg 9780

agtactctga atactccgag tattctgtgg aggagtacca ggaccctgaa gctccttggg 9840

atagtgatga cccctgttcc ctgccactgg atgagggctc ctgcactgcc tacaccctgc 9900

gctggtacca tcgggctgtg acaggcagca cagaggcctg tcaccctttt gtctatggtg 9960

gctgtggagg gaatgccaac cgttttggga cccgtgaggc ctgcgagcgc cgctgcccac 10020

cccgggtggt ccagagccag gggacaggta ctgcccagga ctgaattccc tgtgacccct 10080

ccccagtgcc tctcctggcc ctggaagttg ccactccagt gcccaccagc cttgtcctaa 10140

taaaattaag ttgcatcatt ttgtctgact aggtgtcctt ctataatatt atggggtgga 10200

ggggggtggt atggagcaag gggcaagttg ggaagacaac ctgtagggcc tgcggggtct 10260

attgggaacc aagctggagt gcagtggcac aatcttggct cactgcaatc tccgcctcct 10320

gggttcaagc gattctcctg cctcagcctc ccgagttgtt gggattccag gcatgcatga 10380

ccaggctcag ctaatttttg tttttttggt agagacgggg tttcaccata ttggccaggc 10440

tggtctccaa ctcctaatct caggtgatct acccaccttg gcctcccaaa ttgctgggat 10500

tacaggcgtg aaccactgct cccttccctg tccttacgcg tagaattggt aaagagagtc 10560

gtgtaaaata tcgagttcgc acatcttgtt gtctgattat tgatttttgg cgaaaccatt 10620

tgatcatatg acaagatgtg tatctacctt aacttaatga ttttgataaa aatcattaac 10680

tagtccatgg ctgcctcgcg cgtttcggtg atgacggtga aaacctctga cacatgcagc 10740

tcccggagac ggtcacagct tgtctgtaag cggatgccgg gagcagacaa gcccgtcagg 10800

gcgcgtcagc gggtgttggc gggtgtcggg gcgcagccat gacccagtca cgtagcgata 10860

gcggagtgta tactggctta actatgcggc atcagagcag attgtactga gagtgcacca 10920

tatgcggtgt gaaataccgc acagatgcgt aaggagaaaa taccgcatca ggcgctcttc 10980

cgcttcctcg ctcactgact cgctgcgctc ggtcgttcgg ctgcggcgag cggtatcagc 11040

tcactcaaag gcggtaatac ggttatccac agaatcaggg gataacgcag gaaagaacat 11100

gtgagcaaaa ggccagcaaa aggccaggaa ccgtaaaaag gccgcgttgc tggcgttttt 11160

ccataggctc cgcccccctg acgagcatca caaaaatcga cgctcaagtc agaggtggcg 11220

aaacccgaca ggactataaa gataccaggc gtttccccct ggaagctccc tcgtgcgctc 11280

tcctgttccg accctgccgc ttaccggata cctgtccgcc tttctccctt cgggaagcgt 11340

ggcgctttct catagctcac gctgtaggta tctcagttcg gtgtaggtcg ttcgctccaa 11400

gctgggctgt gtgcacgaac cccccgttca gcccgaccgc tgcgccttat ccggtaacta 11460

tcgtcttgag tccaacccgg taagacacga cttatcgcca ctggcagcag ccactggtaa 11520

caggattagc agagcgaggt atgtaggcgg tgctacagag ttcttgaagt ggtggcctaa 11580

ctacggctac actagaagaa cagtatttgg tatctgcgct ctgctgaagc cagttacctt 11640

cggaaaaaga gttggtagct cttgatccgg caaacaaacc accgctggta gcggtggttt 11700

ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag aaaaaaagga tctcaagaag atcctttgat 11760

cttttctacg gggtctgacg ctcagtggaa cgaaaactca cgttaaggga ttttggtcat 11820

gagattatca aaaaggatct tcacctagat ccttttaaat taaaaatgaa gttttaaatc 11880

aatctaaagt atatatgagt aaacttggtc tgacagttac caatgcttaa tcagtgaggc 11940

acctatctca gcgatctgtc tatttcgttc atccatagtt gcctgactcc 11990

<210> 6

<211> 5257

<212> DNA

<213> Homo Sapiens

<400> 6

ggatccgata tcgtcgacca ccatggcggg actgacggcg gcggccccgc ggcccggagt 60

cctcctgctc ctgctgtcca tcctccaccc ctctcggcct ggaggggtcc ctggggccat 120

tcctggtgga gttcctggag gagtctttta tccaggggct ggtctcggag cccttggagg 180

aggagcgctg gggcctggag gcaaacctct taagccagtt cccggagggc ttgcgggtgc 240

tggccttggg gcagggctcg gcgccttccc cgcagttacc tttccggggg ctctggtgcc 300

tggtggagtg gctgacgctg ctgcagccta taaagctgct aaggctggcg ctgggcttgg 360

tggtgtccca ggagttggtg gcttaggagt gtctgcaggt gcggtggttc ctcagcctgg 420

agccggagtg aagcctggga aagtgccggg tgtggggctg ccaggtgtat acccaggtgg 480

cgtgctccca ggagctcggt tccccggtgt gggggtgctc cctggagttc ccactggagc 540

aggagttaag cccaaggctc caggtgtagg tggagctttt gctggaatcc caggagttgg 600

accctttggg ggaccgcaac ctggagtccc actggggtat cccatcaagg cccccaagct 660

gcctggtggc tatggactgc cctacaccac agggaaactg ccctatggct atgggcccgg 720

aggagtggct ggtgcagcgg gcaaggctgg ttacccaaca gggacagggg ttggccccca 780

ggcagcagca gcagcggcag ctaaagcagc agcaaagttc ggtgctggag cagccggagt 840

cctccctggt gttggagggg ctggtgttcc tggcgtgcct ggggcaattc ctggaattgg 900

aggcatcgca ggcgttggga ctccagctgc agctgcagct gcagcagcag ccgctaaggc 960

agccaagtat ggagctgctg caggcttagt gcctggtggg ccaggctttg gcccgggagt 1020

agttggtgtc ccaggagctg gcgttccagg tgttggtgtc ccaggagctg ggattccagt 1080

tgtcccaggt gctgggatcc caggtgctgc ggttccaggg gttgtgtcac cagaagcagc 1140

tgctaaggca gctgcaaagg cagccaaata cggggccagg cccggagtcg gagttggagg 1200

cattcctact tacggggttg gagctggggg ctttcccggc tttggtgtcg gagtcggagg 1260

tatccctgga gtcgcaggtg tccctagtgt cggaggtgtt cccggagtcg gaggtgtccc 1320

gggagttggc atttcccccg aagctcaggc agcagctgcc gccaaggctg ccaagtacgg 1380

gttagttcct ggtgtcggcg tggctcctgg agttggcgtg gctcctggtg tcggtgtggc 1440

tcctggagtt ggcttggctc ctggagttgg cgtggctcct ggagttggtg tggctcctgg 1500

cgttggcgtg gctcccggca ttggccctgg tggagttgca gctgcagcaa aatccgctgc 1560

caaggtggct gccaaagccc agctccgagc tgcagctggg cttggtgctg gcatccctgg 1620

acttggagtt ggtgtcggcg tccctggact tggagttggt gctggtgttc ctggacttgg 1680

agttggtgct ggtgttcctg gcttcggggc agtacctgga gccctggttg ccgctaaagc 1740

agccaaatat ggagcagcag tgcctggggt ccttggaggg ctcggggctc tcggtggagt 1800

aggcatccca ggcggtgtgg tgggagccag acccgccgcc gccgctgccg cagccaaagc 1860

tgctgccaaa gccgcccagt ttggcctagt gggagccgct gggctcggag gactcggagt 1920

cggagggctt ggagttccag gtgttggggg ccttggaggt atacctccag ctgcagccgc 1980

taaagcagct aaatacggag tggcagcaag acctggcttc ggattgtctc ccattttccc 2040

aggtggggcc tgcctgggga aagcttgtgg ccggaagaga aaatgagaat tccgtgaggc 2100

tccggtgccc gtcagtgggc agagcgcaca tcgcccacag tccccgagaa gttgggggga 2160

ggggtcggca attgaaccgg tgcctagaga aagtggcgcg gggtaaactg ggaaagtgat 2220

gtcgtgtact ggctccgcct ttttcccgag ggtgggggag aaccgtatat aagtgcagta 2280

gtcgccgtga acgttctttt tcgcaacggg tttgccgcca gaacacaggt aagtgccgtg 2340

tgtggttccc gcgggcctgg cctctttacg ggttatggcc cttgcgtgcc ttgaattact 2400

tccacgcccc tggctgcagt acgtgattct tgatcccgag cttcgggttg gaagtgggtg 2460

ggagagttcg aggccttgcg cttaaggagc cccttcgcct cgtgcttgag ttgaggcctg 2520

gcttgggcgc tggggccgcc gcgtgcgaat ctggtggcac cttcgcgcct gtctcgctgc 2580

tttcgataag tctctagcca tttaaaattt ttgatgacct gctgcgacgc tttttttctg 2640

gcaagatagt cttgtaaatg cgggccaaga tctgcacact ggtatttcgg tttttggggc 2700

cgcgggcggc gacggggccc gtgcgtccca gcgcacatgt tcggcgaggc ggggcctgcg 2760

agcgcggcca ccgagaatcg gacgggggta gtctcaagct ggccggcctg ctctggtgcc 2820

tggcctcgcg ccgccgtgta tcgccccgcc ctgggcggca aggctggccc ggtcggcacc 2880

agttgcgtga gcggaaagat ggccgcttcc cggccctgct gcagggagct caaaatggag 2940

gacgcggcgc tcgggagagc gggcgggtga gtcacccaca caaaggaaaa gggcctttcc 3000

gtcctcagcc gtcgcttcat gtgactccac ggagtaccgg gcgccgtcca ggcacctcga 3060

ttagttctcg agcttttgga gtacgtcgtc tttaggttgg ggggaggggt tttatgcgat 3120

ggagtttccc cacactgagt gggtggagac tgaagttagg ccagcttggc acttgatgta 3180

attctccttg gaatttgccc tttttgagtt tggatcttgg ttcattctca agcctcagac 3240

agtggttcaa agtttttttc ttccatttca ggtgtcgtga aaactacccc taaaagccag 3300

gatccgatat cgtcgacaag cttggtaccg aattccctgt gacccctccc cagtgcctct 3360

cctggccctg gaagttgcca ctccagtgcc caccagcctt gtcctaataa aattaagttg 3420

catcattttg tctgactagg tgtccttcta taatattatg gggtggaggg gggtggtatg 3480

gagcaagggg caagttggga agacaacctg tagggcctgc ggggtctatt gggaaccaag 3540

ctggagtgca gtggcacaat cttggctcac tgcaatctcc gcctcctggg ttcaagcgat 3600

tctcctgcct cagcctcccg agttgttggg attccaggca tgcatgacca ggctcagcta 3660

atttttgttt ttttggtaga gacggggttt caccatattg gccaggctgg tctccaactc 3720

ctaatctcag gtgatctacc caccttggcc tcccaaattg ctgggattac aggcgtgaac 3780

cactgctccc ttccctgtcc ttacgcgtag aattggtaaa gagagtcgtg taaaatatcg 3840

agttcgcaca tcttgttgtc tgattattga tttttggcga aaccatttga tcatatgaca 3900

agatgtgtat ctaccttaac ttaatgattt tgataaaaat cattaactag tccatggctg 3960

cctcgcgcgt ttcggtgatg acggtgaaaa cctctgacac atgcagctcc cggagacggt 4020

cacagcttgt ctgtaagcgg atgccgggag cagacaagcc cgtcagggcg cgtcagcggg 4080

tgttggcggg tgtcggggcg cagccatgac ccagtcacgt agcgatagcg gagtgtatac 4140

tggcttaact atgcggcatc agagcagatt gtactgagag tgcaccatat gcggtgtgaa 4200

ataccgcaca gatgcgtaag gagaaaatac cgcatcaggc gctcttccgc ttcctcgctc 4260

actgactcgc tgcgctcggt cgttcggctg cggcgagcgg tatcagctca ctcaaaggcg 4320

gtaatacggt tatccacaga atcaggggat aacgcaggaa agaacatgtg agcaaaaggc 4380

cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc 4440

ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga 4500

ctataaagat accaggcgtt tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc 4560

ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat 4620

agctcacgct gtaggtatct cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg 4680

cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc 4740

aacccggtaa gacacgactt atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga 4800

gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact 4860

agaagaacag tatttggtat ctgcgctctg ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt 4920

ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag 4980

cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg 5040

tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt taagggattt tggtcatgag attatcaaaa 5100

aggatcttca cctagatcct tttaaattaa aaatgaagtt ttaaatcaat ctaaagtata 5160

tatgagtaaa cttggtctga cagttaccaa tgcttaatca gtgaggcacc tatctcagcg 5220

atctgtctat ttcgttcatc catagttgcc tgactcc 5257

<210> 7

<211> 5326

<212> DNA

<213> Homo Sapiens

<400> 7

cgtgaggctc cggtgcccgt cagtgggcag agcgcacatc gcccacagtc cccgagaagt 60

tggggggagg ggtcggcaat tgaaccggtg cctagagaaa gtggcgcggg gtaaactggg 120

aaagtgatgt cgtgtactgg ctccgccttt ttcccgaggg tgggggagaa ccgtatataa 180

gtgcagtagt cgccgtgaac gttctttttc gcaacgggtt tgccgccaga acacaggtaa 240

gtgccgtgtg tggttcccgc gggcctggcc tctttacggg ttatggccct tgcgtgcctt 300

gaattacttc cacgcccctg gctgcagtac gtgattcttg atcccgagct tcgggttgga 360

agtgggtggg agagttcgag gccttgcgct taaggagccc cttcgcctcg tgcttgagtt 420

gaggcctggc ttgggcgctg gggccgccgc gtgcgaatct ggtggcacct tcgcgcctgt 480

ctcgctgctt tcgataagtc tctagccatt taaaattttt gatgacctgc tgcgacgctt 540

tttttctggc aagatagtct tgtaaatgcg ggccaagatc tgcacactgg tatttcggtt 600

tttggggccg cgggcggcga cggggcccgt gcgtcccagc gcacatgttc ggcgaggcgg 660

ggcctgcgag cgcggccacc gagaatcgga cgggggtagt ctcaagctgg ccggcctgct 720

ctggtgcctg gcctcgcgcc gccgtgtatc gccccgccct gggcggcaag gctggcccgg 780

tcggcaccag ttgcgtgagc ggaaagatgg ccgcttcccg gccctgctgc agggagctca 840

aaatggagga cgcggcgctc gggagagcgg gcgggtgagt cacccacaca aaggaaaagg 900

gcctttccgt cctcagccgt cgcttcatgt gactccacgg agtaccgggc gccgtccagg 960

cacctcgatt agttctcgag cttttggagt acgtcgtctt taggttgggg ggaggggttt 1020

tatgcgatgg agtttcccca cactgagtgg gtggagactg aagttaggcc agcttggcac 1080

ttgatgtaat tctccttgga atttgccctt tttgagtttg gatcttggtt cattctcaag 1140

cctcagacag tggttcaaag tttttttctt ccatttcagg tgtcgtgaaa actaccccta 1200

aaagccagga tccaccatgc ggcccctgct gctactggcc ctgctgggct ggctgctgct 1260

ggccgaagcg aagggcgacg ccaagccgga ggacaacctt ttagtcctca cggtggccac 1320

taaggagacc gagggattcc gtcgcttcaa gcgctcagct cagttcttca actacaagat 1380

ccaggcgctt ggcctagggg aggactggaa tgtggagaag gggacgtcgg caggtggagg 1440

gcagaaggtc cggctgctga agaaagctct ggagaagcac gcagacaagg aggatctggt 1500

cattctcttc gcagacagct atgacgtgct gtttgcatcg gggccccggg agctcctgaa 1560

gaagttccgg caggccagga gccaggtggt cttctctgct gaggagctca tctacccaga 1620

ccgcaggctg gagaccaagt atccggtggt gtccgatggc aagaggttcc tgggctctgg 1680

aggcttcatc ggttatgccc ccaacctcag caaactggtg gccgagtggg agggccagga 1740

cagcgacagc gatcagctgt tttacaccaa gatcttcttg gacccggaga agagggagca 1800

gatcaatatc accctggacc accgctgccg tatcttccag aacctggatg gagccttgga 1860

tgaggtcgtg ctcaagtttg aaatgggcca tgtgagagcg aggaacctgg cctatgacac 1920

cctcccggtc ctgatccatg gcaacgggcc aaccaagctg cagttgaact acctgggcaa 1980

ctacatcccg cgcttctgga ccttcgaaac aggctgcacc gtgtgtgacg aaggcttgcg 2040

cagcctcaag ggcattgggg atgaagctct gcccacggtc ctggtcggcg tgttcatcga 2100

acagcccacg ccgtttgtgt ccctgttctt ccagcggctc ctgcggctcc actaccccca 2160

gaaacacatg cgacttttca tccacaacca cgagcagcac cacaaggctc aggtggaaga 2220

gttcctggca cagcatggca gcgagtacca gtctgtgaag ctggtgggcc ctgaggtgcg 2280

gatggcgaat gcagatgcca ggaacatggg cgcagacctg tgccggcagg accgcagctg 2340

cacctactac ttcagcgtgg atgctgacgt ggccctgacc gagcccaaca gcctgcggct 2400

gctgatccaa cagaacaaga acgtcattgc cccgctgatg acccggcatg ggaggctgtg 2460

gtcgaacttc tggggggctc tcagtgcaga tggctactat gcccgttccg aggactacgt 2520

ggacattgtg caggggcggc gtgttggtgt ctggaatgtg ccctatattt caaacatcta 2580

cttgatcaag ggcagtgccc tgcggggtga gctgcagtcc tcagatctct tccaccacag 2640

caagctggac cccgacatgg ccttctgtgc caacatccgg cagcaggatg tgttcatgtt 2700

cctgaccaac cggcacaccc ttggccatct gctctcccta gacagctacc gcaccaccca 2760

cctgcacaac gacctctggg aggtgttcag caaccccgag gactggaagg agaagtacat 2820

ccaccagaac tacaccaaag ccctggcagg gaagctggtg gagacgccct gcccggatgt 2880

ctattggttc cccatcttca cggaggtggc ctgtgatgag ctggtggagg agatggagca 2940

ctttggccag tggtctctgg gcaacaacaa ggacaaccgc atccagggtg gctacgagaa 3000

cgtgccgact attgacatcc acatgaacca gatcggcttt gagcgggagt ggcacaaatt 3060

cctgctggag tacattgcgc ccatgacgga gaagctctac cccggctact acaccagggc 3120

ccagtttgac ctggcctttg tcgtccgcta caagcctgat gagcagccct cactgatgcc 3180

acaccatgat gcctccacct tcaccatcaa catcgccctg aaccgagtcg gggtggatta 3240

cgagggcggg ggctgtcggt tcctgcgcta caactgttcc atccgagccc caaggaaggg 3300

ctggaccctc atgcaccctg gacgactcac gcattaccat gaggggctcc ccaccaccag 3360

gggcacccgc tacatcgcag tctccttcgt cgatccctga attccctgtg acccctcccc 3420

agtgcctctc ctggccctgg aagttgccac tccagtgccc accagccttg tcctaataaa 3480

attaagttgc atcattttgt ctgactaggt gtccttctat aatattatgg ggtggagggg 3540

ggtggtatgg agcaaggggc aagttgggaa gacaacctgt agggcctgcg gggtctattg 3600

ggaaccaagc tggagtgcag tggcacaatc ttggctcact gcaatctccg cctcctgggt 3660

tcaagcgatt ctcctgcctc agcctcccga gttgttggga ttccaggcat gcatgaccag 3720

gctcagctaa tttttgtttt tttggtagag acggggtttc accatattgg ccaggctggt 3780

ctccaactcc taatctcagg tgatctaccc accttggcct cccaaattgc tgggattaca 3840

ggcgtgaacc actgctccct tccctgtcct tacgcgtaga attggtaaag agagtcgtgt 3900

aaaatatcga gttcgcacat cttgttgtct gattattgat ttttggcgaa accatttgat 3960

catatgacaa gatgtgtatc taccttaact taatgatttt gataaaaatc attaactagt 4020

ccatggctgc ctcgcgcgtt tcggtgatga cggtgaaaac ctctgacaca tgcagctccc 4080

ggagacggtc acagcttgtc tgtaagcgga tgccgggagc agacaagccc gtcagggcgc 4140

gtcagcgggt gttggcgggt gtcggggcgc agccatgacc cagtcacgta gcgatagcgg 4200

agtgtatact ggcttaacta tgcggcatca gagcagattg tactgagagt gcaccatatg 4260

cggtgtgaaa taccgcacag atgcgtaagg agaaaatacc gcatcaggcg ctcttccgct 4320

tcctcgctca ctgactcgct gcgctcggtc gttcggctgc ggcgagcggt atcagctcac 4380

tcaaaggcgg taatacggtt atccacagaa tcaggggata acgcaggaaa gaacatgtga 4440

gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg cgttgctggc gtttttccat 4500

aggctccgcc cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct caagtcagag gtggcgaaac 4560

ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa gctccctcgt gcgctctcct 4620

gttccgaccc tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc tcccttcggg aagcgtggcg 4680

ctttctcata gctcacgctg taggtatctc agttcggtgt aggtcgttcg ctccaagctg 4740

ggctgtgtgc acgaaccccc cgttcagccc gaccgctgcg ccttatccgg taactatcgt 4800

cttgagtcca acccggtaag acacgactta tcgccactgg cagcagccac tggtaacagg 4860

attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct tgaagtggtg gcctaactac 4920

ggctacacta gaagaacagt atttggtatc tgcgctctgc tgaagccagt taccttcgga 4980

aaaagagttg gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccg ctggtagcgg tggttttttt 5040

gtttgcaagc agcagattac gcgcagaaaa aaaggatctc aagaagatcc tttgatcttt 5100

tctacggggt ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgtt aagggatttt ggtcatgaga 5160

ttatcaaaaa ggatcttcac ctagatcctt ttaaattaaa aatgaagttt taaatcaatc 5220

taaagtatat atgagtaaac ttggtctgac agttaccaat gcttaatcag tgaggcacct 5280

atctcagcga tctgtctatt tcgttcatcc atagttgcct gactcc 5326

<210> 8

<211> 5974

<212> DNA

<213> Homo Sapiens

<400> 8

cgtgaggctc cggtgcccgt cagtgggcag agcgcacatc gcccacagtc cccgagaagt 60

tggggggagg ggtcggcaat tgaaccggtg cctagagaaa gtggcgcggg gtaaactggg 120

aaagtgatgt cgtgtactgg ctccgccttt ttcccgaggg tgggggagaa ccgtatataa 180

gtgcagtagt cgccgtgaac gttctttttc gcaacgggtt tgccgccaga acacaggtaa 240

gtgccgtgtg tggttcccgc gggcctggcc tctttacggg ttatggccct tgcgtgcctt 300

gaattacttc cacgcccctg gctgcagtac gtgattcttg atcccgagct tcgggttgga 360

agtgggtggg agagttcgag gccttgcgct taaggagccc cttcgcctcg tgcttgagtt 420

gaggcctggc ctgggcgctg gggccgccgc gtgcgaatct ggtggcacct tcgcgcctgt 480

ctcgctgctt tcgataagtc tctagccatt taaaattttt gatgacctgc tgcgacgctt 540

tttttctggc aagatagtct tgtaaatgcg ggccaagatc tgcacactgg tatttcggtt 600

tttggggccg cgggcggcga cggggcccgt gcgtcccagc gcacatgttc ggcgaggcgg 660

ggcctgcgag cgcggccacc gagaatcgga cgggggtagt ctcaagctgg ccggcctgct 720

ctggtgcctg gcctcgcgcc gccgtgtatc gccccgccct gggcggcaag gctggcccgg 780

tcggcaccag ttgcgtgagc ggaaagatgg ccgcttcccg gccctgctgc agggagctca 840

aaatggagga cgcggcgctc gggagagcgg gcgggtgagt cacccgcaca aaggaaaagg 900

gcctttccgt cctcagccgt cgcttcatgt gactccacgg agtaccgggc gccgtccagg 960

cacctcgatt agttctcgag cttttggagt acgtcgtctt taggttgggg ggaggggttt 1020

tatgcgatgg agtttcccca cactgagtgg gtggagactg aagttaggcc agcttggcac 1080

ttgatgtaat tctccttgga atttgccctt tttgagtttg gatcttggtt cattctcaag 1140

cctcagacag tggttcaaag tttttttctt ccatttcagg tgtcgtgaaa actaccccta 1200

aaagccagga tccaccatga cccaaaggag cattgcaggt cctatttgca acctgaagtt 1260

tgtgactctc ctggttgcct taagttcaga actcccattc ctgggagctg gagtacagct 1320

tcaagacaat gggtataatg gattgctcat tgcaattaat cctcaggtac ctgagaatca 1380

gaacctcatc tcaaacatta aggaaatgat aactgaagct tcattttacc tatttaatgc 1440

taccaagaga agagtatttt tcagaaatat aaagatttta atacctgcca catggaaagc 1500

taataataac agcaaaataa aacaagaatc atatgaaaag gcaaatgtca tagtgactga 1560

ctggtatggg gcacatggag atgatccata caccctacaa tacagagggt gtggaaaaga 1620

gggaaaatac attcatttca cacctaattt cctactgaat gataacttaa cagctggcta 1680

cggatcacga ggccgagtgt ttgtccatga atgggcccac ctccgttggg gtgtgttcga 1740

tgagtataac aatgacaaac ctttctacat aaatgggcaa aatcaaatta aagtgacaag 1800

gtgttcatct gacatcacag gcatttttgt gtgtgaaaaa ggtccttgcc cccaagaaaa 1860

ctgtattatt agtaagcttt ttaaagaagg atgcaccttt atctacaata gcacccaaaa 1920

tgcaactgca tcaataatgt tcatgcaaag tttatcttct gtggttgaat tttgtaatgc 1980

aagtacccac aaccaagaag caccaaacct acagaaccag atgtgcagcc tcagaagtgc 2040

atgggatgta atcacagact ctgctgactt tcaccacagc tttcccatga atgggactga 2100

gcttccacct cctcccacat tctcgcttgt acaggctggt gacaaagtgg tctgtttagt 2160

gctggatgtg tccagcaaga tggcagaggc tgacagactc cttcaactac aacaagccgc 2220

agaattttat ttgatgcaga ttgttgaaat tcataccttc gtgggcattg ccagtttcga 2280

cagcaaagga gagatcagag cccagctaca ccaaattaac agcaatgatg atcgaaagtt 2340

gctggtttca tatctgccca ccactgtatc agctaaaaca gacatcagca tttgttcagg 2400

gcttaagaaa ggatttgagg tggttgaaaa actgaatgga aaagcttatg gctctgtgat 2460

gatattagtg accagcggag atgataagct tcttggcaat tgcttaccca ctgtgctcag 2520

cagtggttca acaattcact ccattgccct gggttcatct gcagccccaa atctggagga 2580

attatcacgt cttacaggag gtttaaagtt ctttgttcca gatatatcaa actccaatag 2640

catgattgat gctttcagta gaatttcctc tggaactgga gacattttcc agcaacatat 2700

tcagcttgaa agtacaggtg aaaatgtcaa acctcaccat caattgaaaa acacagtgac 2760

tgtggataat actgtgggca acgacactat gtttctagtt acgtggcagg ccagtggtcc 2820

tcctgagatt atattatttg atcctgatgg acgaaaatac tacacaaata attttatcac 2880

caatctaact tttcggacag ctagtctttg gattccagga acagctaagc ctgggcactg 2940

gacttacacc ctgaacaata cccatcattc tctgcaagcc ctgaaagtga cagtgacctc 3000

tcgcgcctcc aactcagctg tgcccccagc cactgtggaa gcctttgtgg aaagagacag 3060

cctccatttt cctcatcctg tgatgattta tgccaatgtg aaacagggat tttatcccat 3120

tcttaatgcc actgtcactg ccacagttga gccagagact ggagatcctg ttacgctgag 3180

actccttgat gatggagcag gtgctgatgt tataaaaaat gatggaattt actcgaggta 3240

ttttttctcc tttgctgcaa atggtagata tagcttgaaa gtgcatgtca atcactctcc 3300

cagcataagc accccagccc actctattcc agggagtcat gctatgtatg taccaggtta 3360

cacagcaaac ggtaatattc agatgaatgc tccaaggaaa tcagtaggca gaaatgagga 3420

ggagcgaaag tggggcttta gccgagtcag ctcaggaggc tccttttcag tgctgggagt 3480

tccagctggc ccccaccctg atgtgtttcc accatgcaaa attattgacc tggaagctgt 3540

aaaagtagaa gaggaattga ccctatcttg gacagcacct ggagaagact ttgatcaggg 3600

ccaggctaca agctatgaaa taagaatgag taaaagtcta cagaatatcc aagatgactt 3660

taacaatgct attttagtaa atacatcaaa gcgaaatcct cagcaagctg gcatcaggga 3720

gatatttacg ttctcacccc aaatttccac gaatggacct gaacatcagc caaatggaga 3780

aacacatgaa agccacagaa tttatgttgc aatacgagca atggatagga actccttaca 3840

gtctgctgta tctaacattg cccaggcgcc tctgtttatt ccccccaatt ctgatcctgt 3900

acctgccaga gattatctta tattgaaagg agttttaaca gcaatgggtt tgataggaat 3960

catttgcctt attatagttg tgacacatca tactttaagc aggaaaaaga gagcagacaa 4020

gaaagagaat ggaacaaaat tattatgaat tccctgtgac ccctccccag tgcctctcct 4080

ggccctggaa gttgccactc cagtgcccac cagccttgtc ctaataaaat taagttgcat 4140

cattttgtct gactaggtgt ccttctataa tattatgggg tggagggggg tggtatggag 4200

caaggggcaa gttgggaaga caacctgtag ggcctgcggg gtctattggg aaccaagctg 4260

gagtgcagtg gcacaatctt ggctcactgc aatctccgcc tcctgggttc aagcgattct 4320

cctgcctcag cctcccgagt tgttgggatt ccaggcatgc atgaccaggc tcagctaatt 4380

tttgtttttt tggtagagac ggggtttcac catattggcc aggctggtct ccaactccta 4440

atctcaggtg atctacccac cttggcctcc caaattgctg ggattacagg cgtgaaccac 4500

tgctcccttc cctgtcctta cgcgtagaat tggtaaagag agtcgtgtaa aatatcgagt 4560

tcgcacatct tgttgtctga ttattgattt ttggcgaaac catttgatca tatgacaaga 4620

tgtgtatcta ccttaactta atgattttga taaaaatcat taactagtcc atggctgcct 4680

cgcgcgtttc ggtgatgacg gtgaaaacct ctgacacatg cagctcccgg agacggtcac 4740

agcttgtctg taagcggatg ccgggagcag acaagcccgt cagggcgcgt cagcgggtgt 4800

tggcgggtgt cggggcgcag ccatgaccca gtcacgtagc gatagcggag tgtatactgg 4860

cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc accatatgcg gtgtgaaata 4920

ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgct cttccgcttc ctcgctcact 4980

gactcgctgc gctcggtcgt tcggctgcgg cgagcggtat cagctcactc aaaggcggta 5040

atacggttat ccacagaatc aggggataac gcaggaaaga acatgtgagc aaaaggccag 5100

caaaaggcca ggaaccgtaa aaaggccgcg ttgctggcgt ttttccatag gctccgcccc 5160

cctgacgagc atcacaaaaa tcgacgctca agtcagaggt ggcgaaaccc gacaggacta 5220

taaagatacc aggcgtttcc ccctggaagc tccctcgtgc gctctcctgt tccgaccctg 5280

ccgcttaccg gatacctgtc cgcctttctc ccttcgggaa gcgtggcgct ttctcatagc 5340

tcacgctgta ggtatctcag ttcggtgtag gtcgttcgct ccaagctggg ctgtgtgcac 5400

gaaccccccg ttcagcccga ccgctgcgcc ttatccggta actatcgtct tgagtccaac 5460

ccggtaagac acgacttatc gccactggca gcagccactg gtaacaggat tagcagagcg 5520

aggtatgtag gcggtgctac agagttcttg aagtggtggc ctaactacgg ctacactaga 5580

agaacagtat ttggtatctg cgctctgctg aagccagtta ccttcggaaa aagagttggt 5640

agctcttgat ccggcaaaca aaccaccgct ggtagcggtg gtttttttgt ttgcaagcag 5700

cagattacgc gcagaaaaaa aggatctcaa gaagatcctt tgatcttttc tacggggtct 5760

gacgctcagt ggaacgaaaa ctcacgttaa gggattttgg tcatgagatt atcaaaaagg 5820

atcttcacct agatcctttt aaattaaaaa tgaagtttta aatcaatcta aagtatatat 5880

gagtaaactt ggtctgacag ttaccaatgc ttaatcagtg aggcacctat ctcagcgatc 5940

tgtctatttc gttcatccat agttgcctga ctcc 5974

<---

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ

(1) Col1A1_F CCAGCTAGCGTCTAGGGTCTAGACATGTTC

(2) Col1A1_R TATAAGCTTCTACAGGAAGCAGACAGGGCCAAC

(3) Col1A1_SF TGACCTCAAGATGTGCCACT

(4) Col1A1_SR CAGACATGCCTCTTGTCCTTG

(5) Col1A2_F CCAGCTAGCGTCTAAGTGCTAGACATGCTC

(6) Col1A2_R CGAAGCTTTTATTTGAAACAGACTGGGCCA

(7) Col1A2_SF TGAACTTGTTGCTGAGGGCA

(8) Col1A2_SR CCAGTTCTTGGCTGGGATGT

(9) P4HA1_F AGGATCCACCATGATCTGGTATATATTAATTATAGG

(10) P4HA1_R TTCGGTACCTATTCCAATTCTGACAACGTACAAG

(11) P4HA1_SF AAAAGTGCCTGGCTCTCTGG

(12) P4HA1_SR TGGCTCATCTTTCCGTGCAA

(13) P4HA2_F AGGATCCACCATGAAACTCTGGGTGTCTGCA

(14) P4HA2_R CTTGTCGACTTAGTCAACTTCTGTTGATCCACA

(15) P4HA2_SF AGGTACCACCATGGCAACAG

(16) P4HA2_SR GTCTTGGGATCACGAACGGT

(17) COL7A1_F ATCGTCGACCACCATGACGCTGCGGCTTCTGGT

(18) COL7A1_R ATAGAATTCAGTCCTGGGCAGTACCTGTC

(19) COL7A1_SF CAAAGGAGAGATGGGGGAGC

(20) COL7A1_SR ATCATTTCCACTGGGGCCTG

(21) ELN_F TTTGTCGACCACCATGGCGGGTCTGACGGCGG

(22) ELN_R TTTTTGAATTCTCATTTTCTCTTCCGGCCACAAGCTT

(23) ELN_SF CCAGTTTGGCCTAGTGGGAG

(24) ELN_SR ATGGGAGACAATCCGAAGCC

(25) PLOD1_F GGATCCACCATGCGGCCCCTGCTGCTACT

(26) PLOD1_R ATAGAATTCAGGGATCGACGAAGGAGACT

(27) PLOD1_SF GCCTCCACCTTCACCATCAA

(28) PLOD1_SR AAGGAGACTGCGATGTAGCG

(29) CLCA2_F AGGATCCACCATGACCCAAAGGAGCATTGC

(30) CLCA2_R ATAGAATTCATAATAATTTTGTTCCATTCTCTTTC

(31) CLCA2_SF GGAGGCTCCTTTTCAGTGCT

(32) CLCA2_SR GTAGCCTGGCCCTGATCAAA

<---

Изобретение относится к генной инженерии и может быть использовано в биотехнологии, медицине и сельском хозяйстве для создания препаратов генной терапии. Предложен генотерапевтический ДНК-вектор на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущий целевой ген, выбранный из группы генов COL1A1, COL1A2, P4HA1, P4HA2, COL7A1, CLCA2, ELN, PLOD1, для повышения уровня экспрессии этого целевого гена в организме человека и животных. При этом генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-COL1A1, или VTvaf17-COL1A2, или VTvaf17-P4HA1, или VTvaf17-P4HA2, или VTvaf17-COL7A1, или VTvaf17-CLCA2, или VTvaf17-ELN, или VTvaf17-PLOD1 имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID №1, или SEQ ID №2, или SEQ ID №3, или SEQ ID №4, или SEQ ID №5, или SEQ ID №6, или SEQ ID №7, или SEQ ID №8 соответственно. Предложены также способ получения указанного вектора, применение вектора, штамм Escherichia coli, несущий указанный вектор, а также способ производства в промышленных масштабах указанного вектора. Изобретение обеспечивает возможность его безопасного применения для генетической терапии человека и животных. 20 н. и 2 з.п. ф-лы, 23 ил., 32 пр.

1. Генотерапевтический ДНК-вектор на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17 для лечения заболеваний, связанных с недостаточной экспрессией целевого гена, при этом генотерапевтический ДНК-вектор содержит генотерапевтический кодирующую часть целевого гена COL1A1, клонированную в ДНК-вектор VTvaf17, с получением генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-COL1A1, с нуклеотидной последовательностью SEQ ID №1.

2. Генотерапевтический ДНК-вектор на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17 для лечения заболеваний, связанных с недостаточной экспрессией целевого гена, при этом генотерапевтический ДНК-вектор содержит кодирующую часть целевого гена COL1A2, клонированную в генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17, с получением генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-COL1A2, с нуклеотидной последовательностью SEQ ID №2.

3. Генотерапевтический ДНК-вектор на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17 для лечения заболеваний, связанных с недостаточной экспрессией целевого гена, при этом генотерапевтический ДНК-вектор содержит кодирующую часть целевого гена P4HA1, клонированную в генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17, с получением генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-P4HA1, с нуклеотидной последовательностью SEQ ID №3.

4. Генотерапевтический ДНК-вектор на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17 для лечения заболеваний, связанных с недостаточной экспрессией целевого гена, при этом генотерапевтический ДНК-вектор содержит кодирующую часть целевого гена P4HA2, клонированную в генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17, с получением генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-P4HA2, с нуклеотидной последовательностью SEQ ID №4.

5. Генотерапевтический ДНК-вектор на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17 для лечения заболеваний, связанных с недостаточной экспрессией целевого гена, при этом генотерапевтический ДНК-вектор содержит кодирующую часть целевого гена COL7A1, клонированную в генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17, с получением генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-COL7A1, с нуклеотидной последовательностью SEQ ID №5.

6. Генотерапевтический ДНК-вектор на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17 для лечения заболеваний, связанных с недостаточной экспрессией целевого гена, при этом генотерапевтический ДНК-вектор содержит кодирующую часть целевого гена CLCA2, клонированную в генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17, с получением генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-CLCA2, с нуклеотидной последовательностью SEQ ID №6.

7. Генотерапевтический ДНК-вектор на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17 для лечения заболеваний, связанных с недостаточной экспрессией целевого гена, при этом генотерапевтический ДНК-вектор содержит кодирующую часть целевого гена ELN, клонированную в генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17, с получением генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-ELN, с нуклеотидной последовательностью SEQ ID №7.

8. Генотерапевтический ДНК-вектор на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17 для лечения заболеваний, связанных с недостаточной экспрессией целевого гена, при этом генотерапевтический ДНК-вектор содержит кодирующую часть целевого гена PLOD1, клонированную в генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17, с получением генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-PLOD1, с нуклеотидной последовательностью SEQ ID №8.

9. Генотерапевтический ДНК-вектор на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущий целевой ген COL1A1, COL1A2, P4HA1, P4HA2, COL7A1, CLCA2, ELN, PLOD1, по пп. 1-7 или 8, отличающийся тем, что каждый из созданных генотерапевтических ДНК-векторов: VTvaf17-COL1A1, или VTvaf17-COL1A2, или VTvaf17-P4HA1, или VTvaf17-P4HA2, или VTvaf17-COL7A1, или VTvaf17-CLCA2, или VTvaf17-ELN, или VTvaf17-PLOD1 по пп. 1-7 или 8, за счет ограниченного размера векторной части VTvaf17, не превышающей 3200 п.н., обладает способностью эффективно проникать в клетки человека и животных и экспрессировать клонированный в него целевой ген COL1A1, или COL1A2, или P4HA1, или P4HA2, или COL7A1, или CLCA2, или ELN, или PLOD1.

10. Генотерапевтический ДНК-вектор на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущий целевой ген COL1A1, COL1A2, P4HA1, P4HA2, COL7A1, CLCA2, ELN, PLOD1, по пп. 1-7 или 8, отличающийся тем, что в составе каждого из созданных генотерапевтических ДНК-векторов: VTvaf17-COL1A1, или VTvaf17-COL1A2, или VTvaf17-P4HA1, или VTvaf17-P4HA2, или VTvaf17-COL7A1, или VTvaf17-CLCA2, или VTvaf17-ELN, или VTvaf17-PLOD1 по пп. 1-7 или 8, в качестве структурных элементов используются нуклеотидные последовательности, которые не являются генами антибиотикорезистентности, вирусными генами и регуляторными элементами вирусных геномов, обеспечивая возможность его безопасного применения для генетической терапии человека и животных.

11. Способ получения генотерапевтического ДНК-вектора на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущего целевой ген COL1A1, COL1A2, P4HA1, P4HA2, COL7A1, CLCA2, ELN, PLOD1, по пп. 1-7 или 8, заключающийся в том, что каждый из генотерапевтических ДНК-векторов: VTvaf17-COL1A1, или VTvaf17-COL1A2, или VTvaf17-P4HA1, или VTvaf17-P4HA2, или VTvaf17-COL7A1, или VTvaf17-CLCA2, или VTvaf17-ELN, или VTvaf17-PLOD1, получают следующим образом: кодирующую часть целевого гена COL1A1, COL1A2, P4HA1, P4HA2, COL7A1, CLCA2, ELN, PLOD1 по пп.1-7 или 8 клонируют в генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17 и получают генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17- COL1A1, SEQ ID №1, или VTvaf17-COL1A2, SEQ ID №2, или VTvaf17-P4HA1, SEQ ID №3, или VTvaf17-P4HA2, SEQ ID №4, или VTvaf17-COL7A1, SEQ ID №5, или VTvaf17-CLCA2, SEQ ID №6, или VTvaf17-ELN, SEQ ID №7, или VTvaf17-PLOD1, SEQ ID №8, соответственно, при этом кодирующую часть целевого гена COL1A1, или COL1A2, или P4HA1, или P4HA2, или COL7A1, или CLCA2, или ELN, или PLOD1 получают путем выделения суммарной РНК из биологического образца ткани человека с последующим проведением реакции обратной транскрипции и ПЦР-амплификации с использованием созданных олигонуклеотидов и расщеплением продукта амплификации соответствующими эндонуклеазами рестрикции, причем клонирование в генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17 проводят по сайтам рестрикции NheI и HindIII, причем селекцию проводят без антибиотиков,

при этом при получении генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-COL1A1, SEQ ID №1 для проведения реакции обратной транскрипции и ПЦР-амплификации, в качестве созданных для этого олигонуклеотидов используют олигонуклеотиды

Col1A1_F CCAGCTAGCGTCTAGGGTCTAGACATGTTC,

Col1A1_R TATAAGCTTCTACAGGAAGCAGACAGGGCCAAC,

а расщепление продукта амплификации и клонирование кодирующей части гена COL1A1 в генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17 проводят с использованием эндонуклеаз рестрикции NheI и HindIII,

причем при получении генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-COL1A2, SEQ ID №2 для проведения реакции обратной транскрипции и ПЦР-амплификации, в качестве созданных для этого олигонуклеотидов используют олигонуклеотиды

Col1A2_F CCAGCTAGCGTCTAAGTGCTAGACATGCTC,

Col1A2_R CGAAGCTTTTATTTGAAACAGACTGGGCCA,

а расщепление продукта амплификации и клонирование кодирующей части гена COL1A2 в генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17 проводят с использованием эндонуклеаз рестрикции NheI и HindIII,

причем при получении генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-P4HA1, SEQ ID №3 для проведения реакции обратной транскрипции и ПЦР-амплификации, в качестве созданных для этого олигонуклеотидов используют олигонуклеотиды

P4HA1_F AGGATCCACCATGATCTGGTATATATTAATTATAGG,

P4HA1_R TTCGGTACCTATTCCAATTCTGACAACGTACAAG,

а расщепление продукта амплификации и клонирование кодирующей части гена P4HA1 в генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17 проводят с использованием эндонуклеаз рестрикции BamHI и KpnI,

причем при получении генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-P4HA2, SEQ ID №4 для проведения реакции обратной транскрипции и ПЦР-амплификации, в качестве созданных для этого олигонуклеотидов используют олигонуклеотиды

P4HA2_F AGGATCCACCATGAAACTCTGGGTGTCTGCA,

P4HA2_R CTTGTCGACTTAGTCAACTTCTGTTGATCCACA,

а расщепление продукта амплификации и клонирование кодирующей части гена P4HA2 в генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17 проводят с использованием эндонуклеаз рестрикции BamHII и SalI,

причем при получении генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-COL7A1, SEQID №5 для проведения реакции обратной транскрипции и ПЦР-амплификации, в качестве созданных для этого олигонуклеотидов используют олигонуклеотиды

COL7A1_F ATCGTCGACCACCATGACGCTGCGGCTTCTGGT

COL7A1_R ATAGAATTCAGTCCTGGGCAGTACCTGTC,

а расщепление продукта амплификации и клонирование кодирующей части гена COL7A1 в генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17 проводят с использованием эндонуклеаз рестрикции SalI, EcoRI,

причем при получении генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-CLCA2, SEQ ID №6 для проведения реакции обратной транскрипции и ПЦР-амплификации, в качестве созданных для этого олигонуклеотидов используют олигонуклеотиды

CLCA2_F AGGATCCACCATGACCCAAAGGAGCATTGC,

CLCA2_R ATAGAATTCATAATAATTTTGTTCCATTCTCTTTC,

а расщепление продукта амплификации и клонирование кодирующей части гена CLCA2 в генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17 проводят с использованием эндонуклеаз рестрикции BamHI и EcoRI,

причем при получении генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-ELN, SEQ ID №7 для проведения реакции обратной транскрипции и ПЦР-амплификации, в качестве созданных для этого олигонуклеотидов используют олигонуклеотиды

ELN_F TTTGTCGACCACCATGGCGGGTCTGACGGCGG,

ELN_R TTTTTGAATTCTCATTTTCTCTTCCGGCCACAAGCTT,

а расщепление продукта амплификации и клонирование кодирующей части гена ELN в генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17 проводят с использованием эндонуклеаз рестрикции SalI и EcoRI,

причем при получении генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-PLOD1, SEQ ID №8 для проведения реакции обратной транскрипции и ПЦР-амплификации, в качестве созданных для этого олигонуклеотидов используют олигонуклеотиды

PLOD1_F GGATCCACCATGCGGCCCCTGCTGCTACT,

PLOD1_R ATAGAATTCAGGGATCGACGAAGGAGACT,

а расщепление продукта амплификации и клонирование кодирующей части гена PLOD1 в генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17 проводят с использованием эндонуклеаз рестрикции BamHII и EcoRI.

12. Способ использования генотерапевтического ДНК-вектора на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущего целевой ген COL1A1, COL1A2, P4HA1, P4HA2, COL7A1, CLCA2, ELN, PLOD1, по пп. 1-7 или 8 для лечения заболеваний, связанных с недостаточной экспрессией целевого гена, заключающийся в трансфекции выбранным генотерапевтическим ДНК-вектором, несущим целевой ген на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, или несколькими выбранными генотерапевтическими ДНК-векторами, несущими целевые гены на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, из созданных генотерапевтических ДНК-векторов, несущих целевые гены на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, клеток органов и тканей пациента или животного, и/или во введении в органы и ткани пациента или животного аутологичных клеток этого пациента или животного, трансфицированных выбранным генотерапевтическим ДНК-вектором, несущим целевой ген на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17 или несколькими выбранными генотерапевтическими ДНК-векторами, несущими целевые гены на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, из созданных генотерапевтических ДНК-векторов, несущих целевые гены на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, и/или во введении в органы и ткани пациента или животного выбранного генотерапевтического ДНК-вектора, несущего целевой ген на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17 или нескольких выбранных генотерапевтических ДНК-векторов, несущих целевые гены на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, из созданных генотерапевтических ДНК-векторов, несущих целевые гены на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, или в сочетании обозначенных способов.

13. Способ получения штамма для производства генотерапевтического ДНК-вектора по пп. 1-7 или 8 для лечения заболеваний, связанных с недостаточной экспрессией целевого гена, заключающийся в получении электрокомпетентных клеток штамма Escherichia coli SCS110-AF с последующим проведением электропорации этих клеток генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-COL1A1, или генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-COL1A2, или генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-P4HA1, или генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-P4HA2, или генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-COL7A1, или генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-CLCA2, или генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-ELN, или генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-PLOD1, после чего клетки высеивают на чашки Петри с агаризованной селективной средой, содержащей дрожжевой экстракт, пептон, 6% сахарозы, а также 10 мкг/мл хлорамфеникола, с получением в результате штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-COL1A1, или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-COL1A2, или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-P4HA1, или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-P4HA2, или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-COL7A1, или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-CLCA2, или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-ELN, или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-PLOD1.

14. Штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-COL1A1, полученный способом по п. 13, несущий генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-COL1A1, для его наработки с возможностью селекции без использования антибиотиков при получении генотерапевтического ДНК-вектора для лечения заболеваний, связанных с недостаточной экспрессией целевого гена.

15. Штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-COL1A2, полученный способом по п. 13, несущий генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-COL1A2, для его наработки с возможностью селекции без использования антибиотиков при получении генотерапевтического ДНК-вектора для лечения заболеваний, связанных с недостаточной экспрессией целевого гена.

16. Штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-P4HA1, полученный способом по п. 13, несущий генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-P4HA1, для его наработки с возможностью селекции без использования антибиотиков при получении генотерапевтического ДНК-вектора для лечения заболеваний, связанных с недостаточной экспрессией целевого гена.

17. Штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-P4HA2, полученный способом по п. 13, несущий генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-P4HA2, для его наработки с возможностью селекции без использования антибиотиков при получении генотерапевтического ДНК-вектора для лечения заболеваний, связанных с недостаточной экспрессией целевого гена.

18. Штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-COL7A1, полученный способом по п. 13, несущий генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-COL7A1, для его наработки с возможностью селекции без использования антибиотиков при получении генотерапевтического ДНК-вектора для лечения заболеваний, связанных с недостаточной экспрессией целевого гена.

19. Штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-CLCA2, полученный способом по п. 13, несущий генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-CLCA2, для его наработки с возможностью селекции без использования антибиотиков при получении генотерапевтического ДНК-вектора для лечения заболеваний, связанных с недостаточной экспрессией целевого гена.

20. Штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-ELN, полученный способом по п. 13, несущий генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-ELN, для его наработки с возможностью селекции без использования антибиотиков при получении генотерапевтического ДНК-вектора для лечения заболеваний, связанных с недостаточной экспрессией целевого гена.

21. Штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-PLOD1, полученный способом по п. 13, несущий генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-PLOD1, для его наработки с возможностью селекции без использования антибиотиков при получении генотерапевтического ДНК-вектора для лечения заболеваний, связанных с недостаточной экспрессией целевого гена.

22. Способ производства в промышленных масштабах генотерапевтического ДНК-вектора на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущего целевой ген COL1A1, COL1A2, P4HA1, P4HA2, COL7A1, CLCA2, ELN, PLOD1, по пп. 1-7 или 8 для лечения заболеваний, связанных с недостаточной экспрессией целевого гена, заключающийся в том, что генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-COL1A1, или генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-COL1A2, или генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-P4HA1, или генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-P4HA2, или генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-COL7A1, или генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-CLCA2, или генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-ELN, или генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-PLOD1 получают путем того, что засевают в колбу с приготовленной средой затравочную культуру, выбранную из штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-COL1A1, или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-COL1A2, или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-P4HA1, или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-P4HA2, или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-COL7A1, или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-CLCA2, или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-ELN, или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-PLOD1, затем инкубируют затравочную среду в шейкере-инкубаторе и переносят ее в промышленный ферментер, после чего растят до достижения стационарной фазы, затем выделяют фракцию, содержащую целевой ДНК-продукт, многостадийно фильтруют и очищают хроматографическими методами.