Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к способам определения сигнатур экспрессии генов для диагностики пациентов с раком предстательной железы, например, для установления прогноза для таких пациентов, для определения предрасположенности указанного пациента к развитию агрессивного или индолентного заболевания, например, после первичной терапии и/или для идентификации и стратификации пациентов на имеющиеся методы лечения. Изобретение также относится к продуктам, используемым в таких способах, например, наборам, программному обеспечению и тому подобное. Изобретение также относится к видам терапии для применения в лечении пациентов, которые были диагностированы, идентифицированы или стратифицированы в любом из способов, раскрытых здесь.

Уровень техники

Рак представляет класс заболеваний, при которых группа клеток проявляет неконтролируемый рост, инвазирование и иногда метастазирование. Данные три злокачественных свойства раковых заболеваний отличают их от доброкачественных опухолей, которые самоограничены, не инвазируют и не метастазируют.

Рак предстательной железы (РПЖ) является наиболее часто встречающейся некожной злокачественной опухолью у мужчин, и в 2008 г. в мире было диагностировано 900000 новых случаев. В ближайшие годы за счет старения населения заболеваемость РПЖ резко возрастет. Обычная диагностика определением уровней простатспецифического антигена (ПСА) в крови, пальцевым ректальным исследованием (DRE) и трансректальным ультразвуковым исследованием (TRUS) приводит к существенной, излишне часто приеняемой диагностике первой линии незлокачественных доброкачественных состояний предстательной железы: примерно 1 милл. биопсий предстательной железы ежегодно проводится только в США для выявления примерно 250000 новых случаев, т.е. примерно 75% выполняются без особой необходимости, приводя как к существенным осложнениям у пациентов (уросепсис, кровотечения, задержка мочи), так и высоким общим затратам > 2 млрд. долл. США (~США 2100 долл. США на каждую процедуру биопсии). По меньшей мере, 4 из 100 мужчин с отрицательным результатом биопсии имеют вероятность госпитализации за счет побочных эффектов, и 9 из 10000, подвергшихся биопсии пациентов, находятся под угрозой летального исхода от применяемой в настоящее время процедуры.

Примерно из 250000 вновь выявленных случаев РПЖ в США в год около 200000 случаев изначально характеризуются как локализованные заболевания, т. е. как рак, ограниченный только самим органом предстательной железы. Данное состояние в определенной степени излечимо с использованием подходов первичной терапии, таких как лучевая терапия или, в частности, частичное или полное удаление предстательной железы хирургическим путем (простатэктомия). Однако такие хирургические вмешательства обычно имеют серьезные побочные эффекты, в частности, приводят к недержанию мочи и/или эректильной дисфункции, как очень частые последствия простатэктомии. У 50% мужчин, подвергшихся радикальной простатэктомии, развивается недержание мочи. Исследования показали, что через один год после операции 15-50% мужчин все еще сообщают о наличии таких проблем. Проблемы с эрекцией также являются серьезными побочными эффектами после радикальной простатэктомии (РП). Только примерно у половины оперированных мужчин может частично восстановиться способность к эрекции. Кроме того, все обычно применяемые методы лечения локализованного РПЖ являются дорогостоящими (как правило, порядка 20000-30000 долл. США), и в США каждый год прямые затраты составляют 5 млрд. долл. США.

Примерно у 200000 мужчин в Соединенных Штатах с диагнозом клинически локализованного заболевания в 50% случаев имеет место рак с очень низким или низким уровнем риска. Следовательно, NCCN (Национальная комплексная онкологическая сеть) недавно пересмотрела свои руководства для лечения РПЖ с целью увеличения применения активного наблюдения (AS) в качестве мягкой и удобной альтернативы лечения пациентов с заболеванием с таким низким уровнем риска. В результате отнесения соответствующих пациентов к AS, качество жизни таких пациентов значительно улучшается по сравнению с мужчинами, прошедшими первичное лечение, и 5-летняя стоимость AS составляет менее 10000 долл. США на каждого пациента.

Более того, в случае, если в качестве лечения выбора для данного пациента выбрано хирургическое вмешательство (в противоположность AS), то большое значение имеет стратификация объема хирургической операции в зависимости от потенциальной агрессивности опухоли пациента. Например, можно более широко использовать оперативные методики с сохранением чувствительности нервных окончаний для мужчин с заболеванием с прогнозируемым низким уровнем риска, чтобы минимизировать побочные эффекты радикальной простатэктомии, связанные с потенцией. Аналогично, согласно самым последним рекомендациям Европейской ассоциации урологов (EAU) по профилактике рака простаты, расширенная диссекция лимфатических узлов рекомендуется в случае рака с прогнозируемым высоким риском, несмотря на то, что такая процедура является сложной, занимающей много времени и связанной с более высоким уровнем осложнений по сравнению с более ограниченными вмешательствами. Следовательно, несмотря на то, что было показано, что при менее ограниченной диссекции лимфатических узлов пропускается примерно 50% метастазов в лимфатических узлах, для контроля мужчин с локализованным раком предстательной железы требуется высокоточный дооперационный прогноз потенциала агрессивности каждой опухоли для обеспечения наиболее оптимального ухода за каждым пациентом.

В заявке на патент США 2013/196321 A1 описаны молекулярные тесты, которые включают измерение уровней экспрессии одного или нескольких генов в образце от пациента с раком предстательной железы для предоставления информации о вероятности клинического исхода, определения классификации риска и облегчения принятия решения о лечении. В данной ссылке раскрывается ряд генов, подлежащих анализу в таких тестах, которые нормализуются, например, к гену домашнего хозяйства. Кроме того, раскрываются наборы, содержащие генспецифические зонды и/или праймеры для выполнения анализов, и компьютерные системы, алгоритмы и компьютерные программные продукты для выполнения анализа уровней экспрессии.

В публикации «DYRK2 controls the epithelial-mesenchymal transition in breast cancer by degrading Snail» by Mimoto Rei et al. in Cancer Letters (2013), Volume 339, Number 2, pages 214-225, раскрывается, что DYRK2 подвергается отрицательной регуляции в ткани рака молочной железы человека, и что пациентки с опухолями с низкой экспрессией DYRK2, имеют более неблагоприятный исход, чем пациентки с опухолями с высокой экспрессией DYRK2. Авторы делают вывод о том, что DYRK2 является потенциальным прогностическим маркером рака молочной железы, и также было показано, что DYRK2 также подвергается отрицательной регуляции при раке легкого, ободочной кишки и предстательной железы.

Международная заявка WO 2010/131194 A1 относится к применению PDE4D7 в качестве маркера гормоночувствительной злокачественной опухоли, и раскрывает способ диагностики, обнаружения, мониторинга и прогнозирования гормоночувствительной злокачественной опухоли предстательной железы, который включает стадию определения уровня PDE4D7. Кроме того, описаны способы идентификации субъекта, подходящего для определенной терапии рака, а также композиция для осуществления способа, включающая олигонуклеотиды или зонды, специфические для продукта экспрессии PDE4D7.

В международной заявке WO 2014/153442 A2 раскрыты способы диагностики, прогнозирования и лечения рака яичников, которые включают определение уровней экспрессии некоторых маркерных генов. Уровни экспрессии преобразуются в показатель, где гены одинаково анализируются с уровнями экспрессии генов, подвергшихся отрицательной регуляции, за вычетом положительно регулируемых генов.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится к идентификации и применению профилей экспрессии генов, сигнатур или паттернов представляющих интерес биомаркерных генов (также называемых маркерными генами) с клинической значимостью для рака предстательной железы. В частности, изобретение основано на анализе экспрессии генов нуклеиновых кислот, предпочтительно транскриптов биомаркерных генов, полученных из биологических образцов, и идентификации биомаркерных генов, которые коррелируют с агрессивным и индолентным заболеванием, выживаемостью пациентов и рецидивированием рака предстательной железы. Анализ экспрессии этих маркерных генов может быть использован для обеспечения индекса прогрессирования рака простаты (PCPI), который может быть использован в классификации пациентов на пациентов с агрессивным и индолентным заболеванием и с соответствующим неблагоприятным или благоприятным прогнозом.

Кроме того, PCPI можно также использовать для прогноза прогрессирования заболевания у пациентов, ранее подвергшихся клиническому диагностированию и лечению, и для стратификации пациентов согласно их индивидуальному значению PCPI. Следовательно, PCPI обеспечивает очень полезный показатель для персонализированной медицины, связанный с диагнозом, прогнозом и лечением пациентов с раком предстательной железы. PCPI может использоваться самостоятельно или в комбинации с другими средствами и методами, которые предоставляют информацию об индивидуальном статусе болезни или стадии заболевания у пациентов.

Врачи и/или патологи могут преимущественно использовать PCPI для подтверждения результатов, полученных другими способами диагностики, идентификации, прогнозирования, классификации и/или стратификации пациентов, например, пациентов с предрасположенностью к развитию агрессивных и индолентных форм рака предстательной железы. Таким образом, способы и средства, обеспеченные изобретением, помогают провести лучшую диагностику, прогнозирование и т. д. для того, чтобы найти наилучшее лечение для пациента и избежать ненужной хирургической операции или других методов лечения, которые опасны за счет побочных эффектов, иногда сильно выраженных, и приводят к большим расходам в системе здравоохранения.

Один аспект изобретения относится к способу, включающему:

определение уровня генной экспрессии для сигнатурных генов: AZGP1, FBLN1, ILK, KRT15, MEIS2, MYBPC1, PAGE4, SRD5A2, COL1A1, COL3A1, COL5A2, INHBA, THBS2, VCAN, BGN, BIRC5 и DYRK2, и необязательно изоформ PDE4, включающих PDE4D5 и/ил PDE4D7, для получения субъективного профиля экспрессии для субъекта,и

классификацию субъекта как имеющего благоприятный прогноз или неблагоприятный прогноз рака предстательной железы на основе субъективного профиля экспрессии, где благоприятный прогноз предполагает повышенную вероятность выживаемости в течение предопределенного периода после постановки первоначального диагноза и/или отсутствие прогрессирования заболевания после первоначального лечения, и неблагоприятный прогноз предполагает агрессивное заболевание, пониженную вероятность выживаемости, повышенную вероятность биохимического рецидива, клинического рецидива и/или наличия локальных или отдаленных метастазов в течение предопределенного периода времени после постановки первоначального диагноза; и/или

классификацию субъекта как имеющего или не имеющего предрасположенность к развитию рака предстательной железы, т.е. склонного к прогрессированию заболевания, на основе субъективного профиля экспрессии, где предрасположенность предполагает агрессивное заболевание, пониженную вероятность выживаемости, повышенную вероятность биохимического рецидива, клинического рецидива и/или наличия локальных или отдаленных метастазов в течение предопределенного периода времени после постановки первоначального диагноза.

В одном варианте осуществления способ дополнительно включает:

классификацию субъекта как имеющего благоприятный прогноз или неблагоприятный прогноз рака предстательной железы на основе субъективного профиля экспрессии, где благоприятный прогноз предполагает повышенную вероятность выживаемости в течение предопределенного периода после постановки первоначального диагноза и/или отсутствие прогрессирования заболевания после первоначального лечения, и неблагоприятный прогноз предполагает агрессивное заболевание, пониженную вероятность выживаемости, повышенную вероятность биохимического рецидива, клинического рецидива и/или наличия локальных или отдаленных метастазов в течение предопределенного периода времени после постановки первоначального диагноза; или

классификацию субъекта как имеющего или не имеющего предрасположенность к развитию рака предстательной железы, т.е. склонного к прогрессированию заболевания, на основе субъективного профиля экспрессии, где предрасположенность предполагает агрессивное заболевание, пониженную вероятность выживаемости, повышенную вероятность биохимического рецидива, клинического рецидива и/или наличия локальных или отдаленных метастазов в течение предопределенного периода времени после постановки первоначального диагноза.

В одном варианте осуществления способ дополнительно включает:

классификацию субъекта как имеющего благоприятный прогноз или неблагоприятный прогноз рака предстательной железы на основе субъективного профиля экспрессии, где благоприятный прогноз предполагает повышенную вероятность выживаемости в течение предопределенного периода после постановки первоначального диагноза и/или отсутствие прогрессирования заболевания после первоначального лечения, и неблагоприятный прогноз предполагает агрессивное заболевание, пониженную вероятность выживаемости, повышенную вероятность биохимического рецидива, клинического рецидива и/или наличия локальных или отдаленных метастазов в течение предопределенного периода времени после постановки первоначального диагноза; и

классификацию субъекта как имеющего или не имеющего предрасположенность к развитию рака предстательной железы, т.е. склонного к прогрессированию заболевания, на основе субъективного профиля экспрессии, где предрасположенность предполагает агрессивное заболевание, пониженную вероятность выживаемости, повышенную вероятность биохимического рецидива, клинического рецидива и/или наличия локальных или отдаленных метастазов в течение предопределенного периода времени после постановки первоначального диагноза.

В одном варианте осуществления способ дополнительно включает:

классификацию субъекта как имеющего благоприятный прогноз или неблагоприятный прогноз рака предстательной железы на основе субъективного профиля экспрессии, где благоприятный прогноз предполагает повышенную вероятность выживаемости в течение предопределенного периода после постановки первоначального диагноза и/или отсутствие прогрессирования заболевания после первоначального лечения, и неблагоприятный прогноз предполагает агрессивное заболевание, пониженную вероятность выживаемости, повышенную вероятность биохимического рецидива, клинического рецидива и/или наличия локальных или отдаленных метастазов в течение предопределенного периода времени после постановки первоначального диагноза; или

классификацию субъекта как имеющего или не имеющего предрасположенность к развитию рака предстательной железы, т.е. склонного к прогрессированию заболевания, на основе субъективного профиля экспрессии, где предрасположенность предполагает агрессивное заболевание, пониженную вероятность выживаемости, повышенную вероятность биохимического рецидива, клинического рецидива и/или наличия локальных или отдаленных метастазов в течение предопределенного периода времени после постановки первоначального диагноза.

В одном варианте осуществления способ дополнительно включает:

классификацию субъекта как имеющего благоприятный прогноз или неблагоприятный прогноз рака предстательной железы, на основе субъективного профиля экспрессии, где благоприятный прогноз предполагает повышенную вероятность выживаемости в течение предопределенного периода после постановки первоначального диагноза и/или отсутствие прогрессирования заболевания после первоначального лечения, и неблагоприятный прогноз предполагает агрессивное заболевание, пониженную вероятность выживаемости, повышенную вероятность биохимического рецидива, клинического рецидива и/или наличия локальных или отдаленных метастазов в течение предопределенного периода времени после постановки первоначального диагноза; и

классификацию субъекта как имеющего или не имеющего предрасположенность к развитию рака предстательной железы, т.е. склонного к прогрессированию заболевания, на основе субъективного профиля экспрессии, где предрасположенность предполагает агрессивное заболевание, пониженную вероятность выживаемости, повышенную вероятность биохимического рецидива, клинического рецидива и/или наличия локальных или отдаленных метастазов в течение предопределенного периода времени после постановки первоначального диагноза.

Еще один аспект изобретения относится к способу, включающему:

классификацию субъекта как имеющего благоприятный прогноз или неблагоприятный прогноз рака предстательной железы, на основе субъективного профиля экспрессии для субъекта, где субъективный профиль экспрессии включает уровень генной экспрессии сигнатурных генов: AZGP1, FBLN1, ILK, KRT15, MEIS2, MYBPC1, PAGE4, SRD5A2, COL1A1, COL3A1, COL5A2, INHBA, THBS2, VCAN, BGN, BIRC5 и DYRK2, и необязательно изоформ PDE4, включающих PDE4D5 и/или PDE4D7; и где благоприятный прогноз предполагает повышенную вероятность выживаемости в течение предопределенного периода после постановки первоначального диагноза и/или отсутствие прогрессирования заболевания после первоначального лечения, и неблагоприятный прогноз предполагает агрессивное заболевание, пониженную вероятность выживаемости, повышенную вероятность биохимического рецидива, клинического рецидива и/или наличия локальных или отдаленных метастазов в течение предопределенного периода времени после постановки первоначального диагноза; и/или

классификацию субъекта как имеющего или не имеющего предрасположенность к развитию рака предстательной железы, т.е. склонного к прогрессированию заболевания, на основе субъективного профиля экспрессии для субъекта, где субъективный профиль экспрессии включает уровень генной экспрессии сигнатурных генов: AZGP1, FBLN1, ILK, KRT15, MEIS2, MYBPC1, PAGE4, SRD5A2, COL1A1, COL3A1, COL5A2, INHBA, THBS2, VCAN, BGN, BIRC5 и DYRK2, и необязательно изоформ PDE4, включающих PDE4D5 и/или PDE4D7; где предрасположенность предполагает агрессивное заболевание, пониженную вероятность выживаемости, повышенную вероятность биохимического рецидива, клинического рецидива, и/или наличия локальных или отдаленных метастазов в течение предопределенного периода времени после постановки первоначального диагноза.

В одном варианте осуществления способ включает:

классификацию субъекта как имеющего благоприятный прогноз или неблагоприятный прогноз рака предстательной железы на основе субъективного профиля экспрессии для субъекта, где субъективный профиль экспрессии включает уровень генной экспрессии сигнатурных генов: AZGP1, FBLN1, ILK, KRT15, MEIS2, MYBPC1, PAGE4, SRD5A2, COL1A1, COL3A1, COL5A2, INHBA, THBS2, VCAN, BGN, BIRC5 и DYRK2, и необязательно изоформ PDE4, включающих PDE4D5 и/или PDE4D7; и где благоприятный прогноз предполагает повышенную вероятность выживаемости в течение предопределенного периода после постановки первоначального диагноза и/или отсутствие прогрессирования заболевания после первоначального лечения, и неблагоприятный прогноз предполагает агрессивное заболевание, пониженную вероятность выживаемости, повышенную вероятность биохимического рецидива, клинического рецидива и/или наличия локальных или отдаленных метастазов в течение предопределенного периода времени после постановки первоначального диагноза; или

классификацию субъекта как имеющего или не имеющего предрасположенность к развитию рака предстательной железы, т.е. склонного к прогрессированию заболевания, на основе субъективного профиля экспрессии для субъекта, где субъективный профиль экспрессии включает уровень генной экспрессии сигнатурных генов: AZGP1, FBLN1, ILK, KRT15, MEIS2, MYBPC1, PAGE4, SRD5A2, COL1A1, COL3A1, COL5A2, INHBA, THBS2, VCAN, BGN, BIRC5 и DYRK2, и необязательно изоформ PDE4, включающих PDE4D5 и/или PDE4D7; где предрасположенность предполагает агрессивное заболевание, пониженную вероятность выживаемости, повышенную вероятность биохимического рецидива, клинического рецидива, и/или наличия локальных или отдаленных метастазов в течение предопределенного периода времени после постановки первоначального диагноза.

В еще одном варианте осуществления способ включает:

классификацию субъекта как имеющего благоприятный прогноз или неблагоприятный прогноз рака предстательной железы на основе субъективного профиля экспрессии для субъекта, где субъективный профиль экспрессии включает уровень генной экспрессии сигнатурных генов: AZGP1, FBLN1, ILK, KRT15, MEIS2, MYBPC1, PAGE4, SRD5A2, COL1A1, COL3A1, COL5A2, INHBA, THBS2, VCAN, BGN, BIRC5 и DYRK2, и необязательно изоформ PDE4, включающих PDE4D5 и/или PDE4D7; и где благоприятный прогноз предполагает повышенную вероятность выживаемости в течение предопределенного периода после постановки первоначального диагноза и/или отсутствие прогрессирования заболевания после первоначального лечения, и неблагоприятный прогноз предполагает агрессивное заболевание, пониженную вероятность выживаемости, повышенную вероятность биохимического рецидива, клинического рецидива и/или наличия локальных или отдаленных метастазов в течение предопределенного периода времени после постановки первоначального диагноза; и

классификацию субъекта как имеющего или не имеющего предрасположенность к развитию рака предстательной железы, т.е. склонного к прогрессированию заболевания, на основе субъективного профиля экспрессии для субъекта, где субъективный профиль экспрессии включает уровень генной экспрессии сигнатурных генов: AZGP1, FBLN1, ILK, KRT15, MEIS2, MYBPC1, PAGE4, SRD5A2, COL1A1, COL3A1, COL5A2, INHBA, THBS2, VCAN, BGN, BIRC5 и DYRK2, и необязательно изоформ PDE4, включающих PDE4D5 и/или PDE4D7; где предрасположенность предполагает агрессивное заболевание, пониженную вероятность выживаемости, повышенную вероятность биохимического рецидива, клинического рецидива, и/или наличия локальных или отдаленных метастазов в течение предопределенного периода времени после постановки первоначального диагноза.

В одном варианте осуществления способ включает:

классификацию субъекта как имеющего благоприятный прогноз или неблагоприятный прогноз рака предстательной железы на основе субъективного профиля экспрессии для субъекта, где субъективный профиль экспрессии включает уровень генной экспрессии сигнатурных генов: AZGP1, FBLN1, ILK, KRT15, MEIS2, MYBPC1, PAGE4, SRD5A2, COL1A1, COL3A1, COL5A2, INHBA, THBS2, VCAN, BGN, BIRC5 и DYRK2, и необязательно изоформ PDE4, включающих PDE4D5 и/или PDE4D7; и где благоприятный прогноз предполагает повышенную вероятность выживаемости в течение предопределенного периода после постановки первоначального диагноза и/или отсутствие прогрессирования заболевания после первоначального лечения, и неблагоприятный прогноз предполагает агрессивное заболевание, пониженную вероятность выживаемости, повышенную вероятность биохимического рецидива, клинического рецидива и/или наличия локальных или отдаленных метастазов в течение предопределенного периода времени после постановки первоначального диагноза; или

классификацию субъекта как имеющего или не имеющего предрасположенность к развитию рака предстательной железы, т.е. склонного к прогрессированию заболевания, на основе субъективного профиля экспрессии для субъекта, где субъективный профиль экспрессии включает уровень генной экспрессии сигнатурных генов: AZGP1, FBLN1, ILK, KRT15, MEIS2, MYBPC1, PAGE4, SRD5A2, COL1A1, COL3A1, COL5A2, INHBA, THBS2, VCAN, BGN, BIRC5 и DYRK2, и необязательно изоформ PDE4, включающих PDE4D5 и/или PDE4D7; где предрасположенность предполагает агрессивное заболевание, пониженную вероятность выживаемости, повышенную вероятность биохимического рецидива, клинического рецидива, и/или наличия локальных или отдаленных метастазов в течение предопределенного периода времени после постановки первоначального диагноза.

В одном варианте осуществления способ включает:

классификацию субъекта как имеющего благоприятный прогноз или неблагоприятный прогноз рака предстательной железы на основе субъективного профиля экспрессии для субъекта, где субъективный профиль экспрессии включает уровень генной экспрессии сигнатурных генов: AZGP1, FBLN1, ILK, KRT15, MEIS2, MYBPC1, PAGE4, SRD5A2, COL1A1, COL3A1, COL5A2, INHBA, THBS2, VCAN, BGN, BIRC5 и DYRK2, и необязательно изоформ PDE4, включающих PDE4D5 и/или PDE4D7; и где благоприятный прогноз предполагает повышенную вероятность выживаемости в течение предопределенного периода после постановки первоначального диагноза и/или отсутствие прогрессирования заболевания после первоначального лечения, и неблагоприятный прогноз предполагает агрессивное заболевание, снижение вероятности выживаемости, повышенную вероятность биохимического рецидива, клинического рецидива и/или наличия локальных или отдаленных метастазов в течение предопределенного периода времени после постановки первоначального диагноза; и

классификацию субъекта как имеющего или не имеющего предрасположенность к раку предстательной железы, т.е. склонного к прогрессированию заболевания, на основе субъективного профиля экспрессии для субъекта, где субъективный профиль экспрессии включает уровень генной экспрессии сигнатурных генов: AZGP1, FBLN1, ILK, KRT15, MEIS2, MYBPC1, PAGE4, SRD5A2, COL1A1, COL3A1, COL5A2, INHBA, THBS2, VCAN, BGN, BIRC5 и DYRK2, и необязательно изоформ PDE4, включающих PDE4D5 и/или PDE4D7; и где предрасположенность предполагает агрессивное заболевание, снижение вероятности выживаемости, повышенную вероятность биохимического рецидива, клинического рецидива, и/или наличия локальных или отдаленных метастазов в течение предопределенного периода времени после постановки первоначального диагноза.

В некоторых вариантах осуществления различных аспектов изобретения субъектом является пациент с диагнозом рака предстательной железы.

В некоторых вариантах осуществления различных аспектов изобретения субъективный профиль экспрессии получают из образца от субъекта.

В конкретном варианте осуществления различных аспектов изобретения образец представляет собой клеточные линии.

В некоторых вариантах осуществления различных аспектов изобретения пациент выбран из группы, включающей (а) пациентов с вновь диагностированным раком предстательной железы, (b) пациентов, которые подверглись первичной терапии рака предстательной железы.

В варианте осуществления различных аспектов изобретения у пациента ранее был диагностирован клинически локализованный рак предстательной железы.

В варианте осуществления различных аспектов изобретения первоначальное лечение выбрано из группы, состоящей из хирургической операции на предстательной железе, удаления предстательной железы, лучевой терапии, химиотерапии, ограниченного или расширенного удаления лимфатических узлов.

В варианте осуществления различных аспектов изобретения пациенты в группе (а) дополнительно выбраны из пациентов с вновь диагностированным раком предстательной железы, которые были подвергнуты, по меньшей мере, одному из следующих методов обследования: определению уровней простатспецифического антигена в крови (ПСА), пальцевому ректальному исследованию (DRE) и трансректальному ультразвуковому исследованию (TRUS) и биопсии предстательной железы.

В некоторых вариантах осуществления различных аспектов изобретения предопределенный период составляет, по меньшей мере, 6 месяцев, по меньшей мере, 1 год, по меньшей мере, 2 года, по меньшей мере, 3 года, по меньшей мере, 4 года, по меньшей мере, 5 лет, по меньшей мере, 10 лет или, по меньшей мере, 15 лет.

В некоторых вариантах осуществления различных аспектов изобретения уровень экспрессии гена определяется измерением экспрессии мРНК с использованием одного или нескольких зондов и/или одного или нескольких наборов зондов.

В некоторых вариантах осуществления различных аспектов изобретения уровень экспрессии генов определяется методом на основе амплификации и/или анализом с применением микрочипов.

В некоторых вариантах осуществления различных аспектов изобретения уровень экспрессии гена определяется секвенированием РНК, ПЦР, кПЦР или мультиплексной ПЦР.

В некоторых вариантах осуществления различных аспектов изобретения профиль экспрессии у пациента преобразуется в индекс прогрессирования рака предстательной железы (PCPI).

В одном варианте осуществления индекс прогрессирования рака предстательной железы рассчитывается согласно следующему уравнению:

PCPI=(GEV_av_GOI_up) - (GEV_av_GOI_down)

где GEV_av_GOI_up представляет среднее значение генной экспрессии генов с положительной регуляцией, и где GEV_av_GOI_down представляет среднее значение генной экспрессии генов с отрицательной регуляцией, и где значения определены на основе нормализованных данных экспрессии генов по каждому образцу субъекта. Расчет PCPI может обеспечить хорошее предсказание прогноза или хорошую эффективность в различных клинических применениях, как здесь описано.

В некоторых вариантах осуществления различных аспектов изобретения уровень экспрессии ряда сигнатурных генов нормализуется к экспрессии референсного гена, где предпочтительно референсный ген является геном домашнего хозяйства, и где более предпочтительно ген домашнего хозяйства представляет TBP, HPRT1, ACTB, RPLP0, PUM1, POLR2A или B2M.

Описанное здесь также представляет способ, где субъект классифицируется как положительный на рак предстательной железы, когда экспрессия любого одного или нескольких генов, выбранных из группы, состоящей из COL1A1, COL3A1, COL5A2, INHBA, THBS2, VCAN, BGN, BIRC5, DYRK2, подвергается положительной регуляции по сравнению с соответствующими уровнями экспрессии генов в контрольном образце, и где экспрессия любого одного или нескольких генов, выбранных из группы, состоящей из AZGP1, FBLN1, ILK, KRT15, MEIS2, MYBPC1, PAGE4, SRD5A2 и, необязательно PDE4D5 и/или PDE4D7, подвергается отрицательной регуляции по сравнению с соответствующими уровнями экспрессии генов в контрольном образце; или субъект классифицируется как отрицательный на рак предстательной железы, когда экспрессия любого одного или нескольких генов, выбранных из группы, состоящей из COL1A1, COL3A1, COL5A2, INHBA, THBS2, VCAN, BGN, BIRC5, DYRK2, подвергается отрицательной регуляции по сравнению с соответствующими уровнями экспрессии генов в контрольном образце, и где экспрессия любого одного или нескольких генов, выбранных из группы, состоящей из AZGP1, FBLN1, ILK, KRT15, MEIS2, MYBPC1, PAGE4, SRD5A2 и необязательно PDE4D5 и/или PDE4D7, подвергается положительной регуляции по сравнению с соответствующими уровнями экспрессии генов в контрольном образце. Выбранные гены могут обеспечить хорошую эффективность в классификации.

В некоторых вариантах осуществления различных аспектов изобретения субъект классифицируется как имеющий благоприятный прогноз, если индекс прогрессирования рака предстательной железы ниже выбранного порогового значения, или имеет неблагоприятный прогноз, если индекс прогрессирования рака предстательной железы выше выбранного порогового значения; и/или субъект классифицируется как имеющий предрасположенность к развитию рака предстательной железы, т.е. склонный к прогрессированию заболевания, если индекс прогрессирования рака предстательной железы выше выбранного порогового значения, или как не имеющий предрасположенности к развитию рака предстательной железы, т.е. несклонный к прогрессированию заболевания, если индекс прогрессирования рака предстательной железы ниже выбранного порогового значения.

В некоторых вариантах осуществления различных аспектов изобретения способ дополнительно включает стратификацию субъекта на риск агрессивного течения заболевания по сравнению с неагрессивным течением заболевания согласно определенному прогнозу или определенной предрасположенности; и/или обеспечение подходящей терапии рака для субъекта, нуждающегося в этом, согласно определенному прогнозу или определенной предрасположенности.

В некоторых вариантах осуществления различных аспектов изобретения лечение рака выбрано из хирургической операции на предстательной железе, удаления предстательной железы, лучевой терапии, химиотерапии, ограниченного или расширенного удаления лимфатических узлов, предпочтительно комбинации гормональной терапии и лучевой терапии.

В некоторых вариантах осуществления различных аспектов изобретения неблагоприятный прогноз или предрасположенность к раку предстательной железы, т.е. склонность к прогрессированию заболевания, указывает на пригодность субъекта для лечения одним или несколькими способами лечения, выбранными из группы, состоящей из хирургической операции на предстательной железе, удаления предстательной железы, химиотерапии, лучевой терапии, ограниченной или расширенной диссекции лимфатических узлов.

В некоторых вариантах осуществления различных аспектов изобретения предрасположенность к агрессивному течению рака предстательной железы указывает на пригодность для лечения, выбранного из группы, состоящей из повторной биопсии, хирургической операции на предстательной железе, удаления предстательной железы, химиотерапии, лучевой терапии, гормональной терапии, ограниченной или расширенной диссекции лимфатических узлов или их комбинаций, предпочтительно комбинации гормональной терапии и лучевой терапии.

В некоторых вариантах осуществления различных аспектов изобретения способ дополнительно включает расположение или помещение результата одной из стадий в устройство пользовательского интерфейса, считываемый компьютером носитель данных, монитор или компьютер, который является частью сети.

Еще один аспект относится к применению продукта, содержащего:

праймеры и/или зонды для определения уровня генной экспрессии сигнатурных генов: AZGP1, FBLN1, ILK, KRT15, MEIS2, MYBPC1, PAGE4, SRD5A2, COL1A1, COL3A1, COL5A2, INHBA, THBS2, VCAN, BGN, BIRC5 и DYRK2, и необязательно изоформ PDE4, включающих PDE4D5 и/или PDE4D7;

необязательно дополнительно содержащего праймеры и/или зонды для определения уровней экспрессии ряда генов, приведенных на фиг. 1 или 2, отличных от вышеуказанных генов; и/или

необязательно дополнительно содержащего праймеры и/или зонды для определения уровня генной экспрессии референсного гена, где предпочтительно референсный ген является геном домашнего хозяйства, и где более предпочтительно ген домашнего хозяйства представляет TBP, HPRT1, ACTB, RPLP0, PUM1, POLR2A или B2M

для установления прогноза для пациента с диагнозом рака предстательной железы, для стратификации пациента с диагнозом рака предстательной железы, для определения предрасположенности к развитию агрессивного или индолентного рака предстательной железы у пациента, имеющего рак предстательной железы.

В некоторых вариантах осуществления продукт представляет собой набор, включающий, например, набор для постановки ПЦР, набор для секвенирования РНК или набор микрочипов, предпочтительно набор ДНК-микрочипов. В еще одном варианте осуществления продукт представляет микрочип. Продукт может обеспечить эффективный способ определения уровней, как здесь описано, и, таким образом, может обеспечить хорошую эффективность в клинических применениях, как здесь описано.

В некоторых вариантах осуществления продукт представляет собой продукт для осуществления способа по изобретению, или продукт является продуктом для диагностики рака предстательной железы, для установления прогноза для пациента с диагнозом рака предстательной железы, для стратификации пациента с диагнозом рака предстательной железы, для определения предрасположенности к развитию агрессивного или индолентного рака предстательной железы у пациента, имеющего рак предстательной железы.

В некоторых вариантах осуществления продукт представляет собой композицию, содержащую набор молекул нуклеиновых кислот, каждая из которых содержит, по меньшей мере, последовательность одного полинуклеотидного зонда в анализе генной экспрессии генов, представленных на любой из фиг. 1 или 2, или генов, описанных выше.

В некоторых вариантах осуществления продукт представляет собой нуклеиновокислотный чип, содержащий для каждого гена в наборе генов, набор генов, включающий гены, приведенные на фиг.1 или 2, или гены, описанные выше, один или несколько полинуклеотидных зондов, комплементарных и гибридизуемых с кодирующей последовательностью в гене, для определения профиля экспрессии и/или PCPI в предстательной железе, как определено выше.

В некоторых вариантах осуществления продукт представляет набор для установления прогноза для пациента с диагнозом рака предстательной железы, для стратификации пациента с диагнозом рака предстательной железы, для определения предрасположенности к развитию агрессивного или индолентного рака предстательной железы у пациента, имеющего рак предстательной железы, согласно любому из описанных здесь способов, включающий: а) чип, как здесь определено, b) контрольный набор; и c) необязательно инструкции по применению.

В некоторых вариантах осуществления продукт представляет нуклеиновокислотный чип для анализа экспрессии нуклеиновых кислот, полученных из биологического образца, где указанный чип включает подложку, содержащую зонды, подходящие для специфического связывания нуклеиновых кислот или их фрагментов, кодированных генами, приведенными на фиг.1 или 2, или генами, описанными выше.

В некоторых вариантах осуществления продукт представляет изделие для постановки ПЦР, содержащее реагенты для специфической амплификации и детектирования нуклеиновых кислот или их фрагментов, кодированных генами, приведенными на фиг.1 или 2, или генами, описанными выше.

Еще один аспект изобретения относится к терапии, выбранной из хирургической операции на предстательной железе, удаления предстательной железы, лучевой терапии, гормональной терапии, химиотерапии, ограниченного или расширенного удаления лимфатических узлов или их комбинаций, для применения в лечении пациентов, идентифицированных в качестве подходящих, где у указанных пациентов диагностирована предрасположенность к агрессивному раку предстательной железы, что определено способами по изобретению.

Еще один аспект изобретения относится к компьютерному программному продукту, содержащему считываемый компьютером код, хранящийся на машиночитаемом носителе или загружаемый из сети связи, который при запуске на компьютере реализует одну или более стадий или все стадии любого описанных здесь способов.

Еще один аспект изобретения относится к непередаваемому считываемому компьютером носителю для хранения с исполняемой программой, хранящейся на нем, где программа дает команды микропроцессору выполнять одну или несколько стадий любого из способов изобретения.

Еще один аспект изобретения относится к устройству для анализа генной экспрессии нуклеиновых кислот (или их фрагментов), кодированных генами, приведенными на фиг.1 или 2, или генами, описанными выше, где устройство предпочтительно содержит:

а) базу данных, включающую записи, содержащие значения экспрессии референсных генов, ассоциированных с клиническими исходами, где каждый референсный профиль включает уровни экспрессии набора генов, приведенных на фиг.1 или 2, или генов, описанных выше, и/или

b) пользовательский интерфейс, способный принимать и/или вводить выбранные значения генной экспрессии ряда генов, где набор включает гены, приведенные на фиг.1 или 2, или гены, описанные выше, для применения в сравнении с референсными профилями экспрессии генов в базе данных;

c) выход, который отображает предсказание клинического прогноза в соответствии с уровнями экспрессии набора генов.

Еще один аспект изобретения относится к устройству для осуществления способа по изобретению.

Еще один аспект изобретения относится к системе, содержащей продукт, описанный выше, и компьютерный программный продукт, или непередаваемый считываемый компьютером носитель для хранения по изобретению, или устройство для анализа генной экспрессии нуклеиновых кислот по изобретению, или устройство для осуществления способа по изобретению.

Краткое описание фигур

На фиг.1 представлена таблица, содержащая анализированные гены-кандидаты, которые получены из общедоступных данных исследований.

На фиг.2 представлена таблица, содержащая 57 генов-кандидатов, анализированных для создания PCPI.

На фиг.3 представлен обзор эффективности PCPI_18 или PCPI_17 в прогнозировании развития отдаленных метастазов в качестве первичной конечной точки в течение 10-15 лет после первичного лечения (хирургической операции на предстательной железе) для рядов данных GSE21032, GSE41408, GSE25136, GSE16560, GSE10645.

На фиг.4 показана эффективность PCPI_18 в прогнозировании развития отдаленных метастазов в качестве первичной конечной точки в течение 10-15 лет после первичного лечения для рядов данных GSE46691.

На фиг.5 показана эффективность PCPI_18 или PCPI_17 в прогнозировании развития отдаленных метастазов в качестве первичной конечной точки в течение 10-15 лет после первичного лечения (в общем хирургической операции на предстательной железе) для рядов данных GSE21032, GSE41408, GSE16560, GSE10645 в многофакторном регрессионном анализе Кокса по сравнению со стандартными клиническими показателями, такими как уровень ПСА до проведения лечения, биопсия или балл патологии по шкале Глисона, или клиническая/патологическая стадия заболевания. Критерий хи-квадрат, а также отношение рисков для PCPI и отдельные клинические параметры показаны для каждого отдельного ряда данных.

На фиг. 6 представлен обзор эффективности PCPI_18 в прогнозировании развития биохимического рецидива заболевания (БХР) в качестве первичной конечной точки в течение 10-15 лет после первичного лечения (в общем хирургической операции на предстательной железе) для рядов данных GSE21032, GSE41408, GSE25136.

На фиг. 7 показана эффективность PCPI_18 в прогнозировании развития биохимического рецидива заболевания (БХР) в качестве первичной конечной точки в течение 10-15 лет после первичного лечения (в общем хирургической операции на предстательной железе) для рядов данных GSE21032, GSE41408, GSE25136 в многофакторном регрессионном анализе Кокса по сравнению со стандартными клиническими показателями, такими как уровень ПСА до проведения лечения, биопсия или балл патологии по шкале Глисона, или клиническая/патологическая стадия заболевания.

На фиг.8 показан анализ ROC-кривой с пороговым значением для PCPI_18 для поддержания принятия клинических решений, например, стратификации пациентов для активного наблюдения (AS) или активного лечения (например, простатэктомии, лучевой терапии и гормональной терапии).

На фиг.9 приведены интересующие гены, указанные в настоящей заявке, с их идентификатором транскрипта, идентификатором белка, а также последовательностями праймеров и зондов, специфичных для генов, представляющих интерес.

На фиг.10 приведены референсные гены, указанные в настоящей заявке, с их идентификатором транскрипта, идентификатором белка, а также последовательностями праймеров и зондов, специфичных для референсных генов.

На фиг.11 показан анализ рисков различных рецидивов в течение 5-10 лет для 422 пациентов, сгруппированных в соответствии с PCPI_19 и клиническими характеристиками рисков по NCCN, которые могут быть выведены из рекомендаций на веб-странице Национальной комплексной онкологической сети (NCCN) (https://www.nccn.org/professionals/physician_gls/f_guidelines.asp).

На фиг.12 показан анализ рисков различных рецидивов в течение 5-10 лет для 407 пациентов, сгруппированных в соответствии с оценкой GPSu и клиническими характеристиками рисков по NCCN, которые могут быть выведены из рекомендаций на веб-странице Национальной комплексной онкологической сети (NCCN) https://www.nccn.org/professionals/physician_gls/f_guidelines.asp).

На фиг.13 показан анализ рисков различных рецидивов в течение 5-10 лет для 407 пациентов, сгруппированных в соответствии с оценкой CCP и клиническими характеристиками рисков по NCCN, которые могут быть выведены из рекомендаций на веб-странице Национальной комплексной онкологической сети (NCCN) https://www.nccn.org/professionals/physician_gls/f_guidelines.asp).

Подробное описание изобретения

Несмотря на то, что настоящее изобретение будет описано при обращении к конкретным вариантам осуществления, данное описание не должно истолковываться в ограничивающем смысле.

Перед подробным описанием примерных вариантов осуществления настоящего изобретения, приводятся определения, важные для понимания настоящего изобретения.

Как используется в настоящем описании и в прилагаемой формуле изобретения, единственные формы «a» и «an» также включают соответствующие множественные формы, если контекст явно не диктует иное.

В контексте настоящего изобретения термины «примерно» и «приблизительно» означают диапазон точности, который, как это ясно специалисту в данной области, все еще гарантирует получение технического эффекта рассматриваемого признака. Этот термин обычно указывает на отклонение от указанного числового значения на величину ±20%, предпочтительно ±15%, более предпочтительно ±10% и еще более предпочтительно ±5%.

Следует иметь в виду, что термин «содержащий» не является ограничивающим. В целях настоящего изобретения считается, что термин «состоящий из» является предпочтительным вариантом по отношению к термину «содержащий». Если в дальнейшем группа определена как содержащая, по меньшей мере, определенное число вариантов осуществления, то это также означает, что охвачена группа, которая предпочтительно состоит только из этих вариантов осуществления.

Кроме того, термины «первый», «второй», «третий» или «(а)», «(b)», «(с)», «(d)» и т. д. и тому подобное в описании и в формуле изобретения, используются для различения похожих элементов и не обязательно для описания последовательного или хронологического порядка. Следует понимать, что используемые таким образом термины взаимозаменяемы при соответствующих обстоятельствах и что варианты осуществления изобретения, описанные здесь, способны функционировать в других последовательностях, чем описанные или иллюстрированные здесь.

В случае, если термины «первый», «второй», «третий» или «(a)», «(b)», «(c)», «(d)» и т. д. относятся к стадиям способа или используются там, где нет временной согласованности или промежутка времени между стадиями, т. е. стадии могут осуществляться одновременно или могут быть промежутки времени в секундах, минутах, часах, сутках, неделях, месяцах или даже годах между такими стадиями, если в заявке не указано иное, как показано здесь выше или ниже. Следует понимать, что настоящее изобретение не ограничивается конкретной методологией, протоколами, белками, бактериями, векторами, реагентами и т. д., описанными здесь, поскольку они могут отличаться. Также следует понимать, что используемая здесь терминология предназначена только для описания конкретных вариантов осуществления и не предназначена для ограничения объема настоящего изобретения, который будет ограничен только прилагаемой формулой изобретения. Если не указано иное, то все технические и научные термины, используемые здесь, имеют те же значения, которые обычно понимаются специалистом в данной области техники.

Термины «сигнатурный ген(ы)», «маркерный ген(ы)» или «представляющий интерес ген (GOI)» в контексте настоящего изобретения могут использоваться взаимозаменяемо и обозначают биомаркеры, уровень экспрессии которых определяется в способах по настоящему изобретению. В предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения эти гены приведены на фиг.2 настоящего раскрытия и четко указаны ниже, а также в формуле изобретения. Следовательно, настоящее изобретение относится к маркерному гену(ам), экспрессия которого подвергается положительной регуляции или отрицательной регуляции при сравнении экспрессии в ткани злокачественной опухоли предстательной железы, полученной после первичного лечения или после постановки первоначального диагноза рака предстательной железы, с экспрессией в ткани злокачественной опухоли предстательной железы, полученной до постановки первоначального диагноза рака предстательной железы и/или до первоначального лечения рака предстательной железы. Экспрессию маркерного гена в тканях, полученных после первичного лечения или после постановки первоначального диагноза рака предстательной железы, можно сопоставить с параметрами исхода у пациента, например, биохимическим рецидивом, развитием метастазов, раком кости и/или смертью.

Когда показатели экспрессии определяются в контексте способов по настоящему изобретению, то получают персонализированный «профиль экспрессии генов», который отражает показатели экспрессии генов GOI в образце или у субъекта. В последнем случае показатели экспрессии также относятся к «субъективному профилю экспрессии». Следует отметить, что профиль экспрессии в образце и/или субъективный профиль экспрессии могут изменяться в зависимости от времени. Например, профили экспрессии генов до или после терапевтического лечения пациента с диагностированным раком предстательной железы могут быть различными. Аналогично, профили экспрессии генов, установленные в образце, содержащем клетки злокачественной опухоли предстательной железы, будут отличаться от тех, которые обнаружены в образце, который не содержит клеток злокачественной опухоли предстательной железы.

Как здесь используется, термин «маркерный ген(ы)» или «ген(ы), представляющий интерес», относится к гену(ам), генетическому элементу(ам) или последовательности(ям) (нуклеотидной последовательности(ям)), как здесь определено выше, уровень экспрессии которых подвергается положительной регуляции или отрицательной регуляции в клетке или ткани злокачественной опухоли предстательной железы или в любом типе образца, содержащего такие клетки или ткани, или их части или фрагменты, по сравнению с контрольным уровнем, предпочтительно, по сравнению с экспрессией в ткани предстательной железы, полученной на другой временной точке, например, на время постановки первоначального диагноза, непосредственно после первичного лечения или позднее, т. е. через несколько месяцев или лет после постановки первоначального диагноза или первичного лечения. Термин относится к любому продукту экспрессии указанного генетического элемента или последовательности, в частности, к транскрипту мРНК. Когда маркерные гены или гены, представляющие интерес, исследуются впервые, т. е. когда у пациента впервые подозревается рак предстательной железы, то также предполагается использовать дополнительный контрольный материал, который получен из нормальной ткани или ткани доброкачественной опухоли предстательной железы.

Как здесь используется, термин «уровень экспрессии» относится к количеству транскрипта(ов) маркерного гена, полученному из определенного количества клеток или определенной порции ткани, предпочтительно к количеству транскрипта, полученного в стандартной процедуре экстракции нуклеиновой кислоты (например, РНК). Специалистам в данной области известны подходящие способы экстракции.

Как здесь используется, термин «контрольный уровень» (или «контрольное состояние»), относится к уровню экспрессии, который может быть определен одновременно и/или в аналогичных или сопоставимых условиях, например, для тестируемого образца, при использовании (а) образца(в), ранее отобранного у пациента/пациентов и находящегося на хранении, о которых известно, что их состояние или болезненное состояние, например, не является злокачественной опухолью, является нормальным или является доброкачественной опухолью предстательной железы, распространенным раком предстательной железы и т. д. Для определения предрасположенности к развитию агрессивного рака против индолентного рака, предпочтительно определяют контрольный уровень в ткани злокачественной опухоли, полученной на время установления первоначального диагноза, который затем сравнивается с экспрессией GOI, который определен на более поздней стадии, например, после первичного лечения. Термины «болезненное состояние» или «злокачественное болезненное состояние» относятся к любому состоянию или типу клеточного или молекулярного состояния между незлокачественным состоянием клетки и (включая) терминальным злокачественным состоянием клетки. Предпочтительно данный термин включает различные стадии пролиферации/развития злокачественной опухоли или уровни развития опухоли в организме между (и исключая) незлокачественным состоянием клетки и (включая) терминальным злокачественным состоянием клетки. Такие стадии развития могут включать все стадии согласно классификационной системе злокачественных опухолей TNM (опухоль, узел, метастаз), согласно классификации Международного Союза по борьбе с раком, UICC, например, стадии 0 и от I до IV. Указанный термин включает также стадии до TNM-стадии 0, например, стадии развития, при которых биомаркеры злокачественной опухоли, известные специалистам в данной области, проявляют модифицированную экспрессию или модифицированный паттерн экспрессии.

Уровень экспрессии, как указано выше, может предпочтительно представлять собой уровень экспрессии маркерного гена(ов) или GOI, как здесь определено.

Термин «злокачественное» в контексте настоящего изобретения относится к злокачественному болезненному состоянию, как здесь определено выше.

Термин «незлокачественное» в контексте настоящего изобретения относится к состоянию, при котором не может обнаруживаться ни доброкачественная, ни злокачественная пролиферация. Подходящие средства для указанного детектирования известны в данной области техники.

Контрольный уровень экспрессии можно определить статистическим методом на основе результатов, полученных путем анализа ранее определенного уровня(ов) экспрессии маркерного гена(ов) по настоящему изобретению в образцах от субъектов, статус заболевания которых известен. Кроме того, контрольный уровень может быть получен из базы данных паттернов экспрессии или уровней экспрессии для ранее тестированных пациентов, тканей или клеток. Контрольный уровень можно определить в референсном образце, полученном от пациента, у которого был диагностирован рак предстательной железы, например, гормононезависимый или гормонорезистентный рак предстательной железы. Кроме того, уровень экспрессии маркерных генов по настоящему изобретению в тестируемом биологическом образце можно сравнить с многочисленными контрольными уровнями, где контрольные уровни определены во многих референсных образцах. Предполагается использовать контрольный уровень, определенный в референсном образце, полученным из типа ткани, аналогичного типу биологического образца, полученного от субъекта. В данном случае, особенно предпочтительно использовать образец(ы), полученный от пациента, у которого заболевание является злокачественным, как здесь определено выше.

В общих диагностических способах для рака предстательной железы с использованием описанных здесь маркерных генов также можно определить контрольный уровень в тканях субъектов, имеющих состояние здоровья, при котором невозможно обнаружить доброкачественную или злокачественную пролиферацию. Также предполагается использовать образец(ы), полученный от пациента/пациентов, имеющих доброкачественную опухоль предстательной железы, как здесь определено выше, т. е., которые имеют состояние здоровья, при котором можно обнаружить доброкачественную пролиферацию.

Как здесь используется, термин «доброкачественная опухоль предстательной железы», относится к опухоли предстательной железы, которая не обладает всеми тремя свойствами злокачественного новообразования, т. е. не имеет неограниченного, агрессивного характера роста, не проникает в окружающие ткани и не метастазирует. Как правило, доброкачественная опухоль предстательной железы подразумевает умеренное и непрогрессирующее неопластическое или вызывающе отек заболевание предстательной железы, не обладающее инвазивными свойствами злокачественной опухоли. Кроме того, доброкачественные опухоли предстательной железы обычно инкапсулированы и, таким образом, ограничены в их способности вести себя злокачественным образом. Доброкачественную опухоль или здоровое состояние можно определить любым подходящим, независимым молекулярным, гистологическим или физиологическим методом, известным специалисту в данной области.

Альтернативно, референсные образцы могут содержать материал, полученный из клеточных линий, например, иммортализованных линий злокачественных клеток. Предпочтительно, чтобы материал, полученный из клеточных линий злокачественной опухоли предстательной железы, мог содержаться в референсном образце по настоящему изобретению. Примеры предпочтительных злокачественных клеточных линий включают линии клеток PC346P, PC346B, LNCaP, VCaP, DuCaP, PC346C, PC3, DU145, PC346CDD, PC346Flul, PC346Flu2.

В еще одной предпочтительной альтернативе референсные образцы могут быть получены из тканей субъекта/пациента, или панелей тканей или коллекций тканей, полученных в клинических условиях. Образцы могут быть получены, например, от пациентов-мужчин, перенесших операцию. Образцы могут быть получены из любого подходящего типа ткани, например, из ткани предстательной железы или лимфатических узлов. Предпочтительными примерами коллекций тканей пациента являются ткани, полученные после хирургических вмешательств (например, простатэктомии).

Кроме того, предполагается использовать стандартное значение уровней экспрессии маркерного гена(ов) по настоящему изобретению в популяции с известным статусом заболевания, например, популяции субъектов, имеющих доброкачественную опухоль предстательной железы, или здоровой популяции. Стандартное значение может быть получено любым способом, известным в данной области техники. Например, в качестве стандартного значения может использоваться среднее значение ±2 SD (стандартное отклонение) или среднее значение ±3 SD.

Кроме того, контрольный уровень также можно определить одновременно и/или в аналогичных или сопоставимых условиях для тестируемого образца, используя (а) образец(ы), ранее отобранный у пациента/пациентов и находящий на хранении, о которых известно, что их болезненное состояние является злокачественным, т.е. тем, у которых был независимо диагностирован рак предстательной железы, в частности, рак предстательной железы с агрессивным течением.

В контексте настоящего изобретения контрольный уровень, определяемый на основе биологического образца, о котором известно, что он не является злокачественным, например, является образцом здоровой ткани или образцом доброкачественной опухоли предстательной железы, называется «нормальным контрольным уровнем».

Если контрольный уровень определяется на основе биологического образца злокачественной опухоли, в частности, образца от пациента, которому был независимо поставлен диагноз рака предстательной железы, то его можно назвать «злокачественным контрольным уровнем».

Термин «рак предстательной железы» относится к злокачественной опухоли предстательной железы в мужской репродуктивной системе, которая возникает, когда клетки предстательной железы мутируют и начинают бесконтрольно размножаться. Как правило, рак предстательной железы связан с повышенным уровнем простатспецифического антигена (ПСА). В одном варианте осуществления настоящего изобретения термин «рак предстательной железы» относится к раку, при котором уровни ПСА выше 4,0. В другом варианте осуществления этот термин относится к раку, при котором уровни ПСА выше 2,0. Термин «уровень ПСА» относится к концентрации ПСА в крови в нг/мл.

Термин «рак предстательной железы» также включает злокачественную опухоль предстательной железы или клеточные линии злокачественной опухоли предстательной железы, которые чувствительны к стимуляции мужским половым гормоном в отношении их роста или пролиферации. Термин «чувствительный» относится к ситуациям, когда злокачественная опухоль предстательной железы или клеточная линия злокачественной опухоли предстательной железы проявляют характерную биохимическую или клеточную реакцию в присутствии мужских половых гормонов, и при этом мужской половой гормон необходим для роста и/или пролиферации. Таким образом, гормоночувствительный рак предстательной железы понимается как злокачественная опухоль предстательной железы, которая развилась из предзлокачественных форм, таких как ПИН (простатическая интраэпителиальная неоплазия) и характеризуется тем, что ее рост также зависит от наличия мужских половых гормонов андрогенов. В отличие от этого, когда такие опухоли поддаются лечению с помощью терапевтических методов истощения гормонов, то эти злокачественные опухоли обычно переходят в гормонорезистентную форму, рост которой не зависит от присутствия андрогенов.

Термин «гормонорезистентный рак предстательной железы» означает, что рост и пролиферация клеток злокачественной опухоли предстательной железы или клеточных линий злокачественной опухоли предстательной железы резистентны к стимуляции мужским половым гормоном. Данный термин также относится к поздней стадии развития злокачественной опухоли предстательной железы, которая больше не поддается лечению назначением антигормонов, предпочтительно антиандрогенов, как здесь определено выше.

Как здесь используется, термин «мужской половой гормон» относится к андрогену, предпочтительно к тестостерону, андростендиону, дигидротестостерону, дегидроэпиандростерону, андростендиолу или андростерону.

В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к использованию маркерного гена(ов) или GOI в качестве маркера для диагностики, обнаружения, мониторинга или прогнозирования злокачественного, гормоночувствительного рака предстательной железы или прогрессирования к раку предстательной железы.

Термины «подвергшийся положительной регуляции» или «повышенный уровень экспрессии» или «повышение уровня экспрессии» (которые можно использовать синонимично) в контексте настоящего изобретения, таким образом, означают повышение уровня экспрессии между анализируемой ситуацией, например, ситуацией, когда образец получен от пациента, и контрольной точкой, которая может представлять нормальный контрольный уровень или злокачественный контрольный уровень, полученный из любой подходящей опухоли предстательной железы или на любой стадии развития злокачественной опухоли, известной специалисту в данной области. Уровни экспрессии считаются «положительно регулированными», когда экспрессия гена, например, в образце, подлежащем анализу, отличается тем, что увеличивается, например, на 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50% или более 50% по сравнению с контрольным уровнем или, по меньшей мере, в 0,1 раза, по меньшей мере, в 0,2 раза, по меньшей мере, в 1 раз, по меньшей мере в 2 раза, по меньшей мере, в 5 раз или, по меньшей мере, в 10 раз или более по сравнению с контрольным уровнем. Контрольный уровень может представлять нормальный контрольный уровень или злокачественный контрольный уровень, как определено выше. Если необходимо провести сравнение со злокачественным контрольным уровнем, то предпочтительным является дополнительное сравнение с нормальным контрольным уровнем. Такое дополнительное сравнение позволяет определить тенденцию к модификации, например, может наблюдаться величина увеличения уровня экспрессии и/или можно сделать соответствующие заключения. Предпочтительным является сравнение с доброкачественной опухолью предстательной железы или со здоровой тканью или образцом, полученным от здорового субъекта.

Термин «подвергшийся отрицательной регуляции» или «пониженный уровень экспрессии» или «понижение уровня экспрессии» (которые можно использовать синонимично) в контексте настоящего изобретения, таким образом, означают снижение уровня экспрессии между анализируемой ситуацией, например, ситуацией, когда образец получен от пациента, и контрольной точкой, которая может представлять нормальный контрольный уровень или злокачественный контрольный уровень, полученный из любой подходящей опухоли предстательной железы или на любой стадии развития злокачественной опухоли, известной специалисту в данной области. Уровни экспрессии считаются «отрицательно регулированными», когда экспрессия гена, например, в образце, подлежащем анализу, отличается тем, что уменьшается, например, на 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50% или более 50% по сравнению с контрольным уровнем или, по меньшей мере, в 0,1 раза, по меньшей мере, в 0,2 раза, по меньшей мере, в 1 раз, по меньшей мере в 2 раза, по меньшей мере, в 5 раз или, по меньшей мере, в 10 раз или более по сравнению с контрольным уровнем. Контрольный уровень может представлять нормальный контрольный уровень или злокачественный контрольный уровень, как определено выше. Если необходимо провести сравнение со злокачественным контрольным уровнем, то предпочтительным является дополнительное сравнение с нормальным контрольным уровнем. Такое дополнительное сравнение позволяет определить тенденцию к модификации, например, может наблюдаться величина снижения уровня экспрессии и/или можно сделать соответствующие заключения. Предпочтительным является сравнение с доброкачественной опухолью предстательной железы или со здоровой тканью или образцом, полученным от здорового человека.

Значения экспрессии интересующего гена(ов), упомянутого здесь, могут быть использованы для установления «индекса прогрессирования рака простаты» (PCPI) с использованием следующего уравнения:

PCPI=(GEV_av_GOI_up) - (GEV_av_GOI_down), где GOI относится к выбранным генам, представляющим интерес, например, (био-)маркерным генам, которые сгруппированы в гены с отрицательной регуляцией между группами пациентов с и без прогрессирования после первичного лечения по сравнению с генами с положительной регуляцией между группами пациентов с прогрессированием и без прогрессирования после первичного лечения. Рассчитывается среднее значение генной экспрессии для отрицательно регулированных генов (GEV_av_GOI_down), а также среднее значение генной экспрессии для положительно регулированных генов (GEV_av_GOI_up).

Конкретный вариант осуществления показателя прогрессирования рака предстательной железы для конкретного образца рассчитывается согласно следующему уравнению:

PCPI=(GEV_av_GOI_up) - (GEV_av_GOI_down),

где GEV_av_GOI_up представляет среднее значение генной экспрессии генов с положительной регуляцией, и где GEV_av_GOI_down представляет среднее значение генной экспрессии генов с отрицательной регуляцией, где значения определяются на основе нормализованных данных по экспрессии генов на каждый образец пациента и где «положительно регулированные гены» относятся к генам с положительной регуляцией между группами пациентов с и без прогрессирования после первичного лечения, и «отрицательно регулированные гены» относятся к генам с отрицательной регуляцией между группами пациентов с и без прогрессирования после первичного лечения.

Выбор генов, потенциально имеющих отношение к стратификации пациентов при раке предстательной железы или определению предрасположенности к развитию агрессивного рака предстательной железы после первичного лечения, показан, например, на фиг. 2. На фиг. 2 представлен обзор 57 выбранных генов, для которых была обнаружена достоверно различающаяся экспрессия (p <0,05), и которые подверглись регуляции между группами пациентов в одном и том же направлении (т. е., как с положительной регуляцией, так и с отрицательной регуляцией). Данные 57 генов могут использоваться в качестве GOI согласно одному аспекту изобретения. Также возможно использовать выбранные гены из вышеуказанных 57 генов, например, по меньшей мере, 17 генов, по меньшей мере, 18 генов, по меньшей мере, 19 генов, по меньшей мере, 20 генов, по меньшей мере, 21 гена, по меньшей мере, 22 гена, по меньшей мере, 23 генов, по меньшей мере, 24 генов, по меньшей мере, 25 генов, по меньшей мере, 26 генов, по меньшей мере, 27 генов, по меньшей мере, 28 генов, по меньшей мере, 29 генов, по меньшей мере, 30 генов, по меньшей мере, 31 гена, по меньшей мере, 32 генов, по меньшей мере, 33 генов, по меньшей мере, 34 генов, по меньшей мере, 35 генов, по меньшей мере, 36 генов, по меньшей мере, 37 генов, по меньшей мере, 38 генов, по меньшей мере, 39 генов, по меньшей мере, 40 генов, по меньшей мере, 41 ген, по меньшей мере, 42 гена, по меньшей мере, 43 гена, по меньшей мере, 44 гена, по меньшей мере, 45 генов, по меньшей мере, 46 генов, по меньшей мере, 47 генов, по меньшей мере, 48 генов, по меньшей мере, 49 генов, по меньшей мере, 50 генов или более.

В еще одном аспекте обеспечивается прогностическая сигнатура экспрессии гена, состоящая из комбинации отдельных генов, где уровень экспрессии данных GOI может быть измерен количественно с использованием, например, РНК, экстрагированной из образцов ткани злокачественной опухоли предстательной железы человека. Комбинирование этих признаков в единую модель данных (т. е. PCPI) обеспечивает значительно улучшенную эффективность классификации для прогноза прогрессирования рака предстательной железы.

В одном предпочтительном варианте осуществления сигнатура PCPI включает следующие 19 генов: PDE4D5, PDE4D7, AZGP1, FBLN1, ILK, KRT15, MEIS2, MYBPC1, PAGE4, SRD5A2, COL1A1, COL3A1, COL5A2, INHBA, THBS2, VCAN, BGN, BIRC5 и DYRK2.

Термин «фосфодиэстераза 4D5» или «PDE4D5» относится к сплайсированному варианту 5 фосфодиэстеразы PDE4D человека, т. е. к гену фосфодиэстеразы PDE4D5 человека, предпочтительно к последовательности, определенной в референсной последовательности базы данных NCBI: NM_001197218.1, более предпочтительно к нуклеотидной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 1, которая соответствует последовательности вышеуказанной референсной последовательности NCBI транскрипта PDE4D5, и также относится к соответствующей аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 2, которая соответствует белковой последовательности, определенной в референсной белковой последовательности под инвентарным номером NCBI NP_001184147.1, кодирующей полипептид PDE4D5. Термин «фосфодиэстераза 4D5» или «PDE4D5» также относится к ампликону, который может быть получен с использованием пары праймеров PDE1D5_прямой (SEQ ID NO: 3) и PDE1D5_обратный (SEQ ID NO: 4) и может быть детектирован с помощью зонда SEQ ID NO: 5.

Термин «фосфодиэстераза 4D7» или «PDE4D7» относится к сплайсированному варианту 7 фосфодиэстеразы PDE4D человека, т. е. к гену фосфодиэстеразы PDE4D7 человека, предпочтительно к последовательности, определенной в референсной последовательности базы данных NCBI: NM_001165899.1, более предпочтительно к нуклеотидной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 6, которая соответствует последовательности вышеуказанной референсной последовательности NCBI транскрипта PDE4D7, и также относится к соответствующей аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 7, которая соответствует белковой последовательности, определенной в референсной белковой последовательности под инвентарным номером NCBI NP_001159371.1, кодирующей полипептид PDE4D7. Термин «фосфодиэстераза 4D7» или «PDE4D7» также относится к ампликону, который может быть получен с использованием пары праймеров PDE1D5_прямой (SEQ ID NO: 8) и PDE1D5_обратный (SEQ ID NO: 9) и может быть детектирован с помощью зонда SEQ ID NO: 10.

Термин «AZGP1» относится к гену цинк-альфа 2-гликопротеина, предпочтительно к последовательности, определенной в референсной последовательности базы данных NCBI: NM_001185.3, более предпочтительно к нуклеотидной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 11, которая соответствует последовательности вышеуказанной референсной последовательности NCBI транскрипта AZGP1, и также относится к соответствующей аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 12, которая соответствует белковой последовательности, определенной в референсной белковой последовательности под инвентарным номером NCBI NP_001176.1, кодирующей полипептид PDE4D7. Термин «AZGP1» также относится к ампликону, который может быть получен с использованием пары праймеров AZGP1_прямой (SEQ ID NO: 13) и AZGP1_обратный (SEQ ID NO: 14) и может быть детектирован с помощью зонда SEQ ID NO: 15.

Термин «FBLN1» относится к гену фибулина 1, предпочтительно к одной или нескольким последовательностям, определенным в референсных последовательностях базы данных NCBI: NM_001996.3, NM_006485.3, NM_006486.2 и NM_006487.2, более предпочтительно к нуклеотидным последовательностям, показанным в SEQ ID NO: 16, 17, 18 и 19, соответственно, которые соответствуют последовательностям вышеуказанных референсных последовательностей NCBI транскриптов фибулина 1, и также относится к соответствующим аминокислотным последовательностям, показанным в SEQ ID NO: 20, 21, 22 и 23, которые соответствуют белковым последовательностям, определенным в референсных белковых последовательностях под инвентарными номерами NCBI NP_001987.2, NP_006476.2, NP_006477.2 и NP_006478.2, соответственно, кодирующих полипептиды фибулина 1. Термин «FBLN1» также относится к ампликону(ам), который может быть получен с использованием пары праймеров FBLN1_прямой (SEQ ID NO: 24) и FBLN1_обратный (SEQ ID NO: 25) и может быть детектирован с помощью зонда SEQ ID NO: 26.

Термин «ILK» относится к гену интегрин-связанной киназы, предпочтительно к одной или нескольким последовательностям, определенным в референсных последовательностях базы данных NCBI: NM_001014794.2, NM_001014795.2, NM_001278441.1, NM_001278442.1 и NM_004517.3, более предпочтительно к нуклеотидным последовательностям, показанным в SEQ ID NO: 27, 28, 29, 30 и 31 соответственно, которые соответствуют последовательностям вышеуказанных референсных последовательностей NCBI транскриптов интегрин-связанной киназы, и также относится к соответствующим аминокислотным последовательностям, показанным в SEQ ID NO: 32, 33, 34, 35 и 36, которые соответствуют белковым последовательностям, определенным в референсных белковых последовательностях под инвентарными номерами NCBI NP_001014794.1, NP_001014795.1, NP_001265370.1, NP_001265371.1 и NP_004508.1 соответственно, кодирующим полипептиды интегрин-связанной киназы. Термин «ILK» также относится к ампликону(ам), который может быть получен с использованием пары праймеров ILK _прямой (SEQ ID NO: 37) и ILK_обратный (SEQ ID NO: 38) и может быть детектирован с помощью зонда SEQ ID NO: 39.

Термин «KRT15» относится к гену кератина 15, предпочтительно к последовательности, определенной в референсной последовательности базы данных NCBI: NM_002275.3, более предпочтительно к нуклеотидной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 40, которая соответствует последовательности вышеуказанной референсной последовательности NCBI транскрипта KRT15, и также относится к соответствующей аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 41, которая соответствует белковой последовательности, определенной в референсной белковой последовательности под инвентарным номером NCBI NP_002266.2, кодирующей полипептид KRT15. Термин «KRT15» также относится к ампликону, который может быть получен с использованием пары праймеров KRT15_прямой (SEQ ID NO: 42) и KRT15_обратный (SEQ ID NO: 43) и может быть детектирован с помощью зонда SEQ ID NO: 44.

Термин «MEIS2» относится к гомеобоксу 2 Meis предпочтительно к одной или нескольким последовательностям, определенным в референсных последовательностях базы данных NCBI: NM_001220482.1, NM_002399.3, NM_170674.4, NM_170675.4, NM_170676.4, NM_170677.4, NM_172315.2 и NM_020149.2, более предпочтительно к нуклеотидным последовательностям, показанным в SEQ ID NO: 45, 46, 47, 48, 49, 50 и/или 51 соответственно, которые соответствуют последовательностям вышеуказанных референсных последовательностей NCBI транскриптов MEIS2, и также относится к соответствующей аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59 и/или 60, которые соответствуют белковым последовательностям, определенным в референсных белковых последовательностях под инвентарными номерами NCBI NP_001207411.1, NP_002390.1, NP_733774.1, NP_733775.1, NP_733776.1, NP_733777.1, NP_758526.1 и NP_758527.1 соответственно, кодирующим полипептиды MEIS2. Термин «MEIS2» также относится к ампликону(ам), который может быть получен с использованием пары праймеров MEIS2 _прямой (SEQ ID NO: 61) и MEIS2_обратный (SEQ ID NO: 62) и может быть детектирован с помощью зонда SEQ ID NO: 63.

Термин «MYBPC1» относится к миозинсвязывающему белку C, медленного типа предпочтительно к одной или нескольким последовательностям, определенным в референсных последовательностях базы данных NCBI: NM_001254718.1, NM_001254719.1, NM_001254720.1, NM_001254721.1, NM_001254722.1, NM_001254723.1, NM_002465.3, NM_206819.2, NM_206820.2 и NM_206821.2, более предпочтительно к нуклеотидным последовательностям, показанным в SEQ ID NO: 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72 и/или 73 соответственно, которые соответствуют последовательностям вышеуказанных референсных последовательностей NCBI транскриптов MYBPC1, и также относится к соответствующим аминокислотным последовательностям, показанным в SEQ ID NO: 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82 и/или 83, которые соответствуют белковым последовательностям, определенным в референсных белковых последовательностях под инвентарными номерами NCBI NP_001241647.1, NP_001241648.1, NP_001241649.1, NP_001241650.1, NP_001241651.1, NP_001241652.1, NP_002456.2, NP_996555.1, NP_996556.1 и NP_996557.1 соответственно, кодирующим полипептиды MYBPC1. Термин «MYBPC1» также относится к ампликону(ам), который может быть получен с использованием пары праймеров MYBPC1_прямой (SEQ ID NO: 84) и MYBPC1_обратный (SEQ ID NO: 85) и может быть детектирован с помощью зонда SEQ ID NO: 86.

Термин «PAGE4» относится к гену члена 4 семейства антигена P, предпочтительно к последовательности, определенной в референсной последовательности базы данных NCBI: NM_007003.3, более предпочтительно к нуклеотидной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 87, которая соответствует последовательности вышеуказанной референсной последовательности NCBI транскрипта PAGE4, и также относится к соответствующей аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 88, которая соответствует белковой последовательности, определенной в референсной белковой последовательности под инвентарным номером NCBI NP_008934.1, кодирующей полипептид PAGE4. Термин «PAGE4» также относится к ампликону, который может быть получен с использованием пары праймеров PAGE4_прямой (SEQ ID NO: 89) и PAGE4_обратный (SEQ ID NO: 90) и может быть детектирован с помощью зонда SEQ ID NO: 91.

Термин «SRD5A2» относится к гену стероидной 5-альфа-редуктазы 2, предпочтительно к последовательности, определенной в референсной последовательности базы данных NCBI: NM_000348.3, более предпочтительно к нуклеотидной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 92, которая соответствует последовательности вышеуказанной референсной последовательности NCBI транскрипта SRD5A2, и также относится к соответствующей аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 93, которая соответствует белковой последовательности, определенной в референсной белковой последовательности под инвентарным номером NCBI NP_000339.2, кодирующей полипептид SRD5A2. Термин «SRD5A2» также относится к ампликону, который может быть получен с использованием пары праймеров SRD5A2_прямой (SEQ ID NO: 94) и SRD5A2_обратный (SEQ ID NO: 95) и может быть детектирован с помощью зонда SEQ ID NO: 96.

Термин «COL1A1» относится к гену коллагена I типа альфа 1, предпочтительно к последовательности, определенной в референсной последовательности базы данных NCBI: NM_000088.3, более предпочтительно к нуклеотидной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 97, которая соответствует последовательности вышеуказанной референсной последовательности NCBI транскрипта COL1A1, и также относится к соответствующей аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 98, которая соответствует белковой последовательности, определенной в референсной белковой последовательности под инвентарным номером NCBI NP_000079.2 кодирующей полипептид COL1A1. Термин «COL1A1» также относится к ампликону, который может быть получен с использованием пары праймеров COL1A1_прямой (SEQ ID NO: 99) и COL1A1_обратный (SEQ ID NO: 100) и может быть детектирован с помощью зонда SEQ ID NO:101.

Термин «COL3A1» относится к гену коллагена III типа альфа 1, предпочтительно к последовательности, определенной в референсной последовательности базы данных NCBI: NM_000090.3, более предпочтительно к нуклеотидной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 102, которая соответствует последовательности вышеуказанной референсной последовательности NCBI транскрипта COL3A1, и также относится к соответствующей аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 103, которая соответствует белковой последовательности, определенной в референсной белковой последовательности под инвентарным номером NCBI NP_000081.1, кодирующей полипептид COL3A1. Термин «COL3A1» также относится к ампликону, который может быть получен с использованием пары праймеров COL3A1_прямой (SEQ ID NO: 104) и COL3A1_обратный (SEQ ID NO: 105) и может быть детектирован с помощью зонда SEQ ID NO:106.

Термин «COL5A2» относится к гену коллагена V типа альфа 2, предпочтительно к последовательности, определенной в референсной последовательности базы данных NCBI: NM_000393.3, более предпочтительно к нуклеотидной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 107, которая соответствует последовательности вышеуказанной референсной последовательности NCBI транскрипта COL5A2, и также относится к соответствующей аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 108, которая соответствует белковой последовательности, определенной в референсной белковой последовательности под инвентарным номером NCBI NP_000384.2, кодирующей полипептид COL3A2. Термин «COL5A2» также относится к ампликону, который может быть получен с использованием пары праймеров COL5A2_прямой (SEQ ID NO: 109) и COL5A2_обратный (SEQ ID NO: 110) и может быть детектирован с помощью зонда SEQ ID NO:111.

Термин «INHBA» относится к гену ингибина A бета, предпочтительно к последовательности, определенной в референсной последовательности базы данных NCBI: NM_002192.2, более предпочтительно к нуклеотидной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 112, которая соответствует последовательности вышеуказанной референсной последовательности NCBI транскрипта INHBA, и также относится к соответствующей аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 113, которая соответствует белковой последовательности, определенной в вышеуказанной референсной белковой последовательности под инвентарным номером NCBI NP_002183.1, кодирующей полипептид INHBA. Термин «INHBA» также относится к ампликону, который может быть получен с использованием пары праймеров INHBA_прямой (SEQ ID NO: 114) и INHBA_обратный (SEQ ID NO: 115) и может быть детектирован с помощью зонда SEQ ID NO: 116.

Термин «THBS2» относится к гену тромбоспондина-2, предпочтительно к последовательности, определенной в референсной последовательности базы данных NCBI: NM_003247.3, более предпочтительно к нуклеотидной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 117, которая соответствует последовательности вышеуказанной референсной последовательности NCBI транскрипта THBS2, и также относится к соответствующей аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 118, которая соответствует белковой последовательности, определенной в референсной белковой последовательности под инвентарным номером NCBI NP_003238.2, кодирующей полипептид THBS2. Термин «THBS2» также относится к ампликону, который может быть получен с использованием пары праймеров THBS2 _прямой (SEQ ID NO: 119) и THBS2_обратный (SEQ ID NO: 120) и может быть детектирован с помощью зонда SEQ ID NO: 121.

Термин «VCAN» относится к гену верзикана, предпочтительно к одной или нескольким последовательностям, определенным в референсных последовательностях базы данных NCBI: NM_001126336.2, NM_001164097.1, NM_001164098.1 и NM_004385.4, более предпочтительно к одной или нескольким нуклеотидным последовательностям, показанным в SEQ ID NO: 122, 123, 124 и 125 соответственно, которые соответствуют последовательностям вышеуказанных референсных последовательностей NCBI транскриптов VCAN, и также относится к соответствующим аминокислотным последовательностям, показанным в SEQ ID NO: 126, 127, 128 и 129, которые соответствуют белковым последовательностям, определенным в референсных белковых последовательностях под инвентарными номерами NCBI NP_001119808.1, NP_001157569.1, NP_001157570.1 и NP_004376.2 соответственно, кодирующих полипептиды VCAN. Термин «VCAN» также относится к ампликону(ам), который может быть получен с использованием пары праймеров VCAN_прямой (SEQ ID NO: 130) и VCAN_обратный (SEQ ID NO: 131) и может быть детектирован с помощью зонда SEQ ID NO: 132.

Термин «BNG» относится к гену бигликана, предпочтительно к последовательности, определенной в референсной последовательности базы данных NCBI: NM_001711.4, более предпочтительно к нуклеотидной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 133, которая соответствует последовательности вышеуказанной референсной последовательности NCBI транскрипта BNG, и также относится к соответствующей аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 134, которая соответствует белковой последовательности, определенной в референсной белковой последовательности под инвентарным номером NCBI NP_001702.1, кодирующей полипептид BNG. Термин «BNG» также относится к ампликону, который может быть получен с использованием пары праймеров BNG_прямой (SEQ ID NO: 135) и BNG_обратный (SEQ ID NO: 136) и может быть детектирован с помощью зонда SEQ ID NO: 137.

Термин «BIRC5» относится к гену бакуловирусного IAP повтор-содержащего 5, предпочтительно к одной или нескольким последовательностям, определенным в референсных последовательностях базы данных NCBI: NM_001012270.1, NM_001012271.1 и NM_001168.2, более предпочтительно к одной или нескольким нуклеотидным последовательностям, показанным в SEQ ID NO: 138, 139 и 140 соответственно, которые соответствуют последовательностям вышеуказанных референсных последовательностей NCBI транскриптов BIRC5, и также относится к соответствующим аминокислотным последовательностям, показанным в SEQ ID NO: 141, 142 и 143, которые соответствуют белковым последовательностям, определенным в референсных белковых последовательностях под инвентарными номерами NCBI NP_001012270.1, NP_001012271.1 и NP_001159.2 соответственно, кодирующим полипептиды BIRC5. Термин «BIRC5» также относится к ампликону(ам), который может быть получен с использованием пары праймеров BIRC5_прямой (SEQ ID NO: 144) и BIRC5_обратный (SEQ ID NO: 145) и может быть детектирован с помощью зонда SEQ ID NO: 146.

Термин «DYRK2» относится к гену тирозин-(Y)-фосфорилированием регулируемой киназы 2 с двойной специфичностью, предпочтительно к одной или нескольким последовательностям, определенным в референсных последовательностях базы данных NCBI: NM_003583.3 и NM_006482.2, более предпочтительно к одной или нескольким нуклеотидным последовательностям, показанным в SEQ ID NO: 147 и 148 соответственно, которые соответствуют последовательностям вышеуказанных референсных последовательностей NCBI транскриптов DYRK2, и также относится к соответствующим аминокислотным последовательностям, показанным в SEQ ID NO: 149 и 150, которые соответствуют белковым последовательностям, определенным в референсных белковых последовательностях под инвентарными номерами NP_003574.1 и NP_006473.2 соответственно, кодирующим полипептиды DYRK2. Термин «DYRK2» также относится к ампликону(ам), который может быть получен с использованием пары праймеров DYRK2_прямой (SEQ ID NO: 151) и DYRK2_обратный (SEQ ID NO: 152) и может быть детектирован с помощью зонда SEQ ID NO: 153.

В еще одних вариантах осуществления сигнатура PCPI может представлять собой список из 18 генов, содержащий PDE4D вместо PDE4D5 и PDE4D7, или он может содержать оставшиеся 17 генов. Следовательно, в предпочтительном варианте осуществления сигнатура PCPI может представлять список из 17 генов, который содержит вышеуказанные 17 генов и не содержит ни PDE4D5, ни PDE4D7.

В еще одном варианте осуществления настоящее изобретение обеспечивает прогностическую сигнатуру экспрессии генов, состоящую из комбинации 19 отдельных генов, экспрессия которых может быть измерена количественно на РНК, экстрагированной из образцов ткани злокачественной опухоли предстательной железы человека. Комбинирование этих признаков в единую модель данных (=PCPI→Индекс прогрессирования рака предстательной железы) обеспечивает существенно улучшенную эффективность классификации для прогноза прогрессирования рака предстательной железы. В вариантах осуществления с использованием данных 19 генов, или 17, 18 или 57 генов, PCPI, упомянутый в настоящем изобретении, используется в способах диагностики рака предстательной железы в образце, прогнозируя индивидуальный статус заболевания у пациента и ожидаемое развитие заболевания, и он обеспечивает показатель в способах стратификации и/или идентификации пациентов для индивидуально предпочтительных способов лечения или терапии, если это применимо. На основе показателя PCPI можно определить предрасположенность или вероятность того, что опухоль прогрессирует до агрессивной формы рака предстательной железы. Например, если значение PCPI, полученное при анализе опухоли, выше определенного порогового уровня (или порога), то вероятность того, что указанная опухоль прогрессирует до агрессивной формы также выше, и наоборот.

Стадия классификации образцов опухоли, которые анализируются в соответствии с описанными здесь способами, включает сравнение значений PCPI между образцами, которые были получены на определенной временной точке (например, до постановки первоначального диагноза рака предстательной железы), и образцами, полученными на более поздней стадии. Когда значение PCPI, полученное при анализе образца опухоли на указанной более поздней стадии, выше определенного порогового значения или порога, то этот показатель может использоваться в качестве указывающего на прогрессирование к агрессивному раку предстательной железы.

Пороговое значение может быть определено на основе ряда референсных данных, включающих группы пациентов с прогрессированием рака или без него. Пороговое значение может быть установлено, например, с 70%, 80%, 85%, 90%, 93%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% чувствительностью в отношении классификации пациентов без или с прогрессированием. В предпочтительном варианте осуществления пороговое значение может быть установлено с чувствительностью на уровне 90%.

Конечно, PCPI может также использоваться в способах определения прогноза для пациентов, в способе стратификации пациентов на группы для соответствующего лечения, с целью того, чтобы врач пришел к заключению о том, что специфическое лечение не подходит, что лечение еще не требуется или что лечение больше не нужно с учетом общего физического состояния пациентов.

Таким образом, варианты осуществления настоящего изобретения относятся к идентификации и применению паттернов экспрессии маркерного гена (или последовательности) (или «профилей» или «сигнатур»), которые имеют клиническое значение для рака предстательной железы. Профили экспрессии маркерного гена, независимо от того, выражаются они в экспрессии нуклеиновой кислоты, экспрессии белка или других форматах экспрессии, могут быть использованы для прогнозирования рецидивирования рака предстательной железы и/или выживаемости пациентов, страдающих раком предстательной железы. В частности, маркерные гены используются для установления описанного здесь индекса прогрессирования рака предстательной железы (PCPI), который используется для идентификации/классификации пациентов с агрессивным или индолентным течением злокачественного заболевания.

В контексте настоящей заявки выражение «первоначальный диагноз» относится к первому или последующему диагнозу, предшествующему дате, на которую был осуществлен один из способов по настоящему изобретению, и было вычислено значение PCPI. Например, первоначальный диагноз может быть установлен для пациента, материал ткани предстательной железы которого был анализирован в первый раз и предпочтительно до постановки диагноза рака предстательной железы.

В контексте настоящей заявки термин «предопределенный период после постановки первоначального диагноза» включает период 6 месяцев, 1 год, 2 года, 3 года, 4 года, 5 лет, 6 лет, 7 лет, 8 лет, 9 лет, 10 лет, 15 лет или 20 лет и более. В контексте настоящей заявки выражение «пациент с вновь диагностированным раком предстательной железы» относится к субъекту, который был диагностирован как имеющий биохимические показатели, клинические показатели или значения PCPI, которые подтверждают или вызывают подозрение на присутствие клеток злокачественной опухоли предстательной железы в образце, отобранном у этого пациента в первый раз.

В контексте настоящей заявки выражение «первичное лечение рака предстательной железы» относится к любому известному способу лечения рака предстательной железы, т. е. хирургической операции, химиотерапии, лечению биологическими препаратами, лучевой терапии и тому подобное.

В контексте настоящей заявки выражение «лечение биологическими препаратами» относится к лечению рака предстательной железы моноклональными антителами или их производными, или их пептидами или фрагментами, которые специфически ингибируют или блокируют, или нейтрализуют биологические молекулы in vivo, а также in vitro, которые вовлечены в рост, пролиферацию, поддержание или в любой другой метаболический путь, который используется клетками злокачественной опухоли предстательной железы. Моноклональные антитела, направленные на установленные мишени, включают антитела, которые одобрены к прменению для лечения солидных опухолей, такие как моноклональные антитела против человеческого EGFR-2, такие как трастузумаб, антитела против EGFR, такие как цитуксимаб и панитумумаб, и моноклональное антитело против сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF), такое как бевацизумаб.

В контексте настоящей заявки выражение «биохимический рецидив» относится, например, к повторяющимся повышенным биологическим значениям уровня ПСА, указывающим на присутствие клеток злокачественной опухоли предстательной железы в образце. Однако также можно использовать другие маркеры, которые могут применяться в выявлении присутствия злокачественных клеток или которые дают основание подозревать такое присутствие.

В контексте настоящей заявки термин «клинический рецидив» относится к наличию клинических признаков или клинических показателей, измеренных, например, с использованием баллов по шкале Глисона.

В контексте настоящей заявки выражение «предрасположенность к развитию рака предстательной железы, т.е. склонность к прогрессированию заболевания» относится к измеряемому и достоверному показателю (например, к PCPI), который указывает на вероятность того, что у пациента, от которого был отобран и исследован образец, будет развиваться агрессивная форма рака предстательной железы, т. е. после первичного лечения диагностированного рака предстательной железы, например, с помощью простатэктомии, химиотерапии и/или лучевой терапии, вновь появились клетки злокачественной опухоли предстательной железы, которые имеют потенциал к агрессивному росту, такому как образование метастазов в лимфатических узлах и костях.

В контексте настоящей заявки выражение «компьютерный способ определения прогноза для пациента, имеющего рак предстательной железы», относится к способу, в котором с помощью программных алгоритмов рассчитывается PCPI и основанные на нем данные обеспечивают прогноз для анализируемого пациента, где в данном способе используются необработанные данные, полученные при измерении уровня экспрессии генов, указанных здесь, и их преобразовании в PCPI с использованием вышеописанного уравнения.

В контексте настоящей заявки способы диагностики, прогнозирования, выявления предрасположенности к развитию или прогрессированию агрессивного рака предстательной железы, идентификации пациентов, страдающих раком предстательной железы или подверженных рецидивированию рака предстательной железы после первичного лечения, можно использовать с подходящей терапевтической схемой на основе результатов, полученных в любом из способов в соответствии с настоящим изобретением. Так, например, если прогноз заключается в том, что у пациента будет развиваться агрессивная форма рака предстательной железы на основе результатов определения предрасположенности к данной форме рака, то врач может решить, следует или нет использовать любой из доступных видов лечения, применяемых для лечения рака предстательной железы, таких как хирургическая операция, химиотерапия, лучевая терапия, гормональная терапия или их комбинации, и тому подобное.

Способы по настоящему изобретению также обеспечивают информацию с помощью PCPI, на основе которой можно решить, следует ли пациента подвергнуть хирургической операции, химиотерапии, лучевой терапии или провести дополнительную биопсию. Таким образом, PCPI представляет собой важный показатель в установлении персонализированного диагноза, прогноза, который позволяет идентифицировать пациентов с предрасположенностью к агрессивной форме рака предстательной железы или стратифицировать их для терапии, которая лучше всего подходит для этого пациента. PCPI можно также использовать в комбинации с другими средствами и методами установления диагноза или прогноза, и также для идентификации или стратификации пациентов, как здесь описано. Таким образом, настоящее изобретение относится также к специфическим видам лечения рака предстательной железы или способам лечения, как указано выше, для применения в лечении пациентов, которые были идентифицированы как подходящие для таких видов терапии, на основе PCPI, необязательно в комбинации с другими диагностическими или прогностическими методами, с целью выбора наиболее подходящего лечения рака для указанного пациента. Например, радикальное удаление лимфатических узлов может быть вариантом лечения пациентов, которые были идентифицированы или диагностированы, или для которых был установлен прогноз с использованием способов по настоящему изобретению, когда PCPI является высоким по сравнению с контрольным образцом.

В вариантах осуществления настоящего изобретения, включающих пациентов, которых лечили путем простатэктомии после постановки первоначального клинического диагноза, изобретение включает способы прогнозирования вероятности или предрасположенности к рецидивированию рака предстательной железы, метастазированию рака и/или рецидиву в виде повышенных уровней ПСА.

Дополнительные варианты осуществления настоящего изобретения относятся к способам идентификации и затем применения профилей экспрессии маркерного гена (или последовательности) в образце, которые обеспечивают прогностическую информацию, связанную с раком предстательной железы. Профили экспрессии коррелируют с (и поэтому способны различаться) пациентами с благоприятным и неблагоприятным прогнозом в отношение исходов по рецидивированию рака, метастазированию рака и/или выживаемостью.

В вариантах осуществления настоящего изобретения обеспечивается способ идентификации профилей экспрессии маркерных генов, связанных с рецидивированием и/или метастазированием рака у пациентов, страдающих раком предстательной железы.

В еще одних вариантах осуществления изобретения обеспечиваются способы сравнения экспрессии маркерного гена (или последовательности) в образце, включающие анализ экспрессии генов в клетках злокачественной опухоли предстательной железы от пациента с идентифицированным профилем экспрессии, PCPI, для определения вероятного исхода для пациента, например, после простатэктомии, химиотерапии, лучевой терапии и т. д. В дополнительных аспектах этих вариантов осуществления изобретения полученная информация может быть преимущественно использована для прогнозирования вероятности того, может ли пациент получить пользу, например, от хирургической операции по поводу удаления злокачественной опухоли предстательной железы, или для пациента будет лучше другой вид лечения, или потребуется адъювантное лечение в дополнение к операции. Пациенты, которые имеют вероятность получения пользы от хирургического вмешательства, такого как радикальная простатэктомия, могут быть выбраны на основе профиля экспрессии в образце простаты пациента, как здесь раскрыто, для устранения рецидивирования и/или метастазирования злокачественной опухоли после операции. В дополнительном варианте осуществления пациент, который, как можно ожидать, не получит пользу от хирургической операции, представляет пациента с прогнозом по профилю экспрессии в клетках злокачественной опухоли предстательной железы пациента, как здесь раскрыто, развития метастазов рака после операции. В качестве примера, рецидивирование рака предстательной железы может иметь место в одном и том же месте, в то время как метастазы часто развиваются в другом месте или ткани, например, в лимфатическом узле или кости. Дополнительные варианты осуществления настоящего изобретения относятся к способу идентификации пациента из популяции пациентов с клетками злокачественной опухоли предстательной железы или после простатэктомии, как относящегося к субпопуляции пациентов с меньшим рецидивированием рака и/или лучшей выживаемостью (например, меньший риск рецидивирования или метастазирования) по сравнению с другой субпопуляцией, или как относящегося к субпопуляции с более высоким рецидивированием рака и/или низкой выживаемостью (например, повышенный риск рецидивирования или метастазирования) по сравнению с другой субпопуляцией. Таким образом, способы по изобретению позволяют стратифицировать пациентов на субпопуляции или подтипы.

Способы по настоящему изобретению относятся к вариантам осуществления для идентификации пациентов с раком предстательной железы, необязательно после простатэктомии, которые могут иметь более высокую или более низкую вероятность рецидивирования рака, метастазирования рака и/или выживаемость, анализом PCPI, описанного здесь. Если ранее субъективная интерпретация образца, полученного от пациентов (например, на основе иммуногистохимического окрашивания и субъективного анализа), могла использоваться для определения предрасположенности к развитию агрессивного заболевания против индолентного заболевания и/или лечения пациентов с раком предстательной железы, или пациентов до или после простатэктомии, или пациентов с раком предстательной железы, которые подвергались лечению другой терапией, то настоящее изобретение вводит объективный показатель, отражающий паттерны экспрессии, которые могут использоваться одни или в комбинации с другими (субъективными и/или объективными) критериями для обеспечения более точной оценки исходов у пациентов, включая выживаемость и рецидивирование, или метастазирование рака. Таким образом, способы, основанные на анализе паттернов экспрессии маркерного гена по изобретению, включают средства для обнаружения/диагностики рака предстательной железы или прогноза до или после простатэктомии, или, в более общем плане, для определения предрасположенности к развитию агрессивной или индолентной формы болезни до или после первичного лечения.

С помощью PCPI, основанного на анализе более чем одного маркерного гена, или экспрессированной последовательности, можно различать стадии рака предстательной железы или стадии рака предстательной железы до или после простатэктомии с достоверной точностью. Уровень(и) экспрессии маркерного гена(ов) или экспрессии последовательности(ей), представляющих интерес, идентифицируются как коррелирующие с исходами таким образом, что уровень(и) экспрессии является(ются) важными для определения предпочтительных протоколов лечения пациента. Таким образом, изобретение включает варианты осуществления, относящиеся к способу определения исхода у субъекта, страдающего раком предстательной железы, необязательно до или после простатэктомии, путем анализа образца простаты, предположительно содержащего раковую клетку, от указанного пациента, на уровни экспрессии, которые коррелируют с исходами у пациентов, согласно раскрытым здесь способам. В еще одном варианте осуществления изобретения раскрывается способ определения риска рецидивирования и/или метастазирования рака предстательной железы у каждого отдельного пациента.

В способах по изобретению анализируется образец, предположительно содержащий клетки злокачественной опухоли предстательной железы от пациента, на уровни экспрессии маркерных генов, описанных здесь. Суммарные уровни экспрессии маркерных генов можно сравнить со средним или медианным уровнем(ями) экспрессии в популяции клеток злокачественной опухоли предстательной железы. Затем эту оценку можно использовать для определения риска рецидивирования и/или метастазирования рака предстательной железы у субъекта, от которого был получен образец, при использовании PCPI. Уровни экспрессии раскрытых генов (или экспрессированных последовательностей) коррелируют с низким риском рецидивирования и/или метастазирования рака предстательной железы или с высоким риском рецидивирования и/или метастазирования рака предстательной железы.

Другими словами, отдельные маркерные гены (или экспрессированные последовательности), раскрытые здесь, экспрессируются на более высоких или более низких уровнях (по сравнению с нормализованными значениями экспрессии в популяции клеток злокачественной опухоли предстательной железы) таким образом, что отклонение коррелирует с более высоким или более низким риском или предрасположенностью к развитию агрессивного против индолентного рака у пациентов, у которых ранее был диагностирован рак предстательной железы, необязательно пациентов, которые уже ранее получали специфическое лечение рака предстательной железы, или у пациентов с диагнозом de novo.

В некоторых вариантах осуществления анализ уровней экспрессии может быть выполнен с использованием выбранных нуклеиновокислотных зондов, которые специфически распознают маркерные гены, раскрытые здесь. Эти зонды гибридизуются, при соответствующих условиях, и детектируют экспрессированные последовательности, раскрытые здесь. В вариантах осуществления настоящего изобретения зонды могут быть использованы для детектирования области последовательности, амплифицированной из экспрессированной последовательности маркера (гена).

Детектирование или определение уровней экспрессии последовательностей маркера (гена) можно отнести к детектированию или определению профиля или сигнатуры экспрессии. Паттерны экспрессии по изобретению, включающие раскрытые последовательности маркерных генов, идентифицируют и применяют, как здесь описано. Для их идентификации получают большую выборку уровней экспрессии генов в образце, содержащем клетки злокачественной опухоли предстательной железы, путем количественного определения уровней экспрессии мРНК. В одном варианте осуществления изобретение включает определение уровней экспрессии маркерного гена (или последовательности) путем анализа экспрессии генов из отдельных клеток или гомогенных клеточных популяций, которые были препарированы или иным образом выделены или очищены от загрязняющих клеток сверх возможностей простой биопсии. Поскольку экспрессия многочисленных генов колеблется между клетками от разных пациентов, а также между клетками из одного и того же образца пациента, то многочисленные данные по экспрессии отдельных последовательностей генов используются в качестве референсных данных для генерации моделей, которые, в свою очередь, позволяют идентифицировать отдельные гены и последовательности, экспрессия которых коррелирует с исходами при определенных видах рака предстательной железы, или до или после простатэктомии, или позволяют классифицировать пациентов по их предрасположенности к агрессивной и злокачественной форме рака. В этих способах уровни экспрессии генов предпочтительно преобразуются в PCPI, как определено выше, с использованием интересующих маркеров генов, упомянутых в формуле изобретения и по всему тексту настоящей заявки.

Согласно настоящему изобретению уровни экспрессии маркерного гена различных генов в этих моделях затем анализируют для идентификации последовательностей нуклеиновых кислот, экспрессия которых положительно или отрицательно коррелирует с исходом рака предстательной железы или после лечения рака предстательной железы.

Предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения основаны на идентификации субрядов последовательностей экспрессированных генов-маркеров в клетке, идентифицированных как коррелирующие с исходами, как здесь описано. Паттерн или профиль экспрессии по изобретению включает комбинацию этих идентифицированных последовательностей маркеров (или генов), которые преобразуются в PCPI. Применение многочисленных образцов для идентификации экспрессированных последовательностей повышает достоверность, с которой считается, что ген коррелирует с рецидивированием, метастазированием рака предстательной железы и/или исходом по выживаемости. Без достаточной достоверности остается непредсказуемым, действительно ли конкретный ген коррелирует с исходом, и также непредсказуемо, может ли экспрессия гена быть успешно использована для определения исхода рака предстательной железы или до или после простатэктомии, у субъекта или пациента. Могут быть выбраны определенные последовательности нуклеиновых кислот, соответствующие раскрытым маркерным генам (или экспрессированным последовательностям), для оценки профиля экспрессии, который должен быть детектирован или оценен на его прогнозирующие свойства.

Профиль уровней экспрессии или PCPI, который высоко коррелирует с одним исходом относительно другого, может быть использован для анализа образца, содержащего клетки злокачественной опухоли предстательной железы, от субъекта или пациента, для прогнозирования исхода для субъекта, от которого был получен образец. Такой анализ может быть использован в качестве части способа для определения терапевтического лечения указанного субъекта на основании идентифицированного исхода. Такая корреляция обеспечивает молекулярное определение рецидивирования рака предстательной железы, метастазирование рака и/или исхода по выживаемости, как здесь описано. Не желая связываться с теорией, и для улучшения понимания настоящего изобретения, раскрытое молекулярное определение является более эффективным, чем другие молекулярные показатели, связанные с раком предстательной железы, такие как определение уровней простатспецифического антигена (ПСА). Дополнительные применения коррелированных паттернов и профилей экспрессии связаны с классификацией клеток и тканей; установлением диагноза и/или прогноза; и определением и/или изменением терапии.

Способность к различению обеспечивается идентификацией экспрессии последовательностей отдельных маркерных генов в качестве релевантных, а не формой анализа, используемой для определения фактического уровня экспрессии. Способы по изобретению отражают, количественно или качественно, экспрессию последовательности(ей) маркерного гена в «транскриптоме» (транскрибируемой фракции генов в геноме). Характер образца, содержащего клетку злокачественной опухоли предстательной железы, не является ограничивающим, поскольку в раскрытых способах можно использовать только отобранную ткань, свежезамороженную ткань и фиксированную ткань, такую как ткани, зафиксированные в формалине и залитые в парафин (FFPE). В некоторых вариантах осуществления образец может представлять собой образец, полученный игольчатой биопсией (кор-биопсией) или другой биопсии.

Для детектирования идентифицированного паттерна экспрессии или сигнатуры PCPI варианты осуществления изобретения включают детектирование паттернов экспрессии гена (или последовательности) путем сбора полных или почти полных данных по экспрессии генов из отдельных клеток или гомогенных клеточных популяций, которые были препарированы от или иным образом выделены или очищены от загрязняющих клеток, ниже возможных пределов простой биопсии. Затем детектируются или иным образом измеряются уровни экспрессии маркерных генов (последовательностей) в паттерне или профиле. В еще одних вариантах осуществления с помощью способа можно детектировать или измерить уровни экспрессии генов (последовательностей) в профиле без оценки или иного определения экспрессии других генов или последовательностей.

В дополнительном аспекте анализ уровней экспрессии можно выполнять в комбинации с другими оценками или показателями рака предстательной железы или вместо него. В некоторых вариантах осуществления анализ проводится в комбинации со способом определения степени рака предстательной железы в образце, включающем клетки злокачественной опухоли предстательной железы, у субъекта. В еще одних вариантах осуществления комбинация представляет способ определения стадии рака предстательной железы в образце. Третьей возможностью является комбинация с детектированием или определением уровней ПСА у субъекта, необязательно до процедуры, используемой для выделения клеток злокачественной опухоли предстательной железы. Конечно, возможна комбинация с одним, двумя или тремя из этих репрезентативных примеров. Всякий раз, когда используется более одного типа оценки, то результатом является многофакторный анализ. Изобретение ясно включает все возможные комбинации оценок, описанных здесь, такие как многофакторные варианты осуществления.

Как правило, может быть использован любой приемлемый метод оценки степени и/или стадии рака простаты, известный специалисту в данной области. В некоторых случаях метод определения рака предстательной железы включает определение баллов по шкале Глисона (или степени по шкале Глисона). В других случаях метод определения стадии рака предстательной железы включает определение согласно системе определения стадии опухолей Американского объединенного комитета по раку (AJCC) для оценки стадии рака предстательной железы. И, как здесь описано, анализ уровней экспрессии гена (последовательности) может выполняться вместо или в комбинации с показателем по шкале Глисона или с определением стадии опухоли по AJCC. В случае анализа уровней ПСА, то его оценка может быть проведена до простатэктомии, которая используется для обеспечения образца, содержащего клетки злокачественной опухоли предстательной железы, для применения в любом способе, описанном здесь.

В еще одних вариантах осуществления изобретение включает физические и методические средства для детектирования экспрессии генов (или последовательностей), раскрытых здесь. Данные средства могут быть направлены на анализ одного или более аспектов матрицы(ц) ДНК, лежащих в основе экспрессии гена (или последовательности), РНК, используемой в качестве промежуточного продукта для экспрессии гена (или последовательности), или белкового продукта, экспрессированного геном (или последовательностью).

Несмотря на то, что настоящее изобретение описано главным образом в контексте рака предстательной железы человека, его можно применять в контексте рака предстательной железы любого животного, которое, как известно, потенциально страдает раком предстательной железы. Неограничивающими примерами животных для применения по настоящему изобретению являются млекопитающие, особенно те, которые имеют значение для применения в сельском хозяйстве (таких как, не ограничиваясь этим, крупный рогатый скот, овцы, лошади и другие «сельскохозяйственные животные»), животные модели рака предстательной железы и животные-компаньоны для человека (такие как, не ограничиваясь этим, собаки и кошки).

«Паттерн» или «профиль», или «сигнатура» экспрессии генов и соответствующий рассчитанный PCPI относится к относительной экспрессии интересующих генов (экспрессированных последовательностей) для двух или более типов рака предстательной железы, или до или после простатэктомии, рецидивирования рака, метастазирования рака и/или исходов по выживаемости, где экспрессия коррелируют таким образом, что исходы можно различать.

«Ген» или «экспрессированная последовательность» представляет собой полинуклеотид, который кодирует и экспрессирует детектируемым образом дискретный продукт, будь он по своей природе РНК или белковым продуктом. Понятно, что более чем один полинуклеотид может быть способен кодировать дискретный продукт. Термин включает аллели и полиморфизмы гена или экспрессированной последовательности, которая кодирует один и тот же продукт, или его функционально ассоциированный (включая усиление, потерю или модуляцию функции) аналог, основанный на положении в хромосоме и способности рекомбинировать во время нормального митоза.

Термины «коррелировать» или «корреляция» или их эквиваленты относятся к ассоциации между экспрессией двух или более генов и физиологическим состоянием клетки простаты, за исключением одного или нескольких других состояний, идентифицированных с использованием способов, описанных здесь. Ген может экспрессироваться на более высоком или более низком уровне и по-прежнему коррелировать с одним или более видом рака предстательной железы, или состоянием или исходом до или после простатэктомии.

Как здесь используется, термин «маркерный ген» или «последовательность маркерного гена», экспрессия которого анализируется в контексте настоящего изобретения, также может быть описан как представляющий интерес ген (GOI).

В вариантах осуществления изобретения уровень экспрессии данного маркерного гена (или экспрессированной последовательности) нормализуется (например, относительно экспрессии референсного гена, который экспрессируется на относительно постоянных уровнях, или экспрессия GOI измеряется во всех доступных образцах, и значение экспрессии нормализуется), для получения нормализованного значения или балла для корреляционного анализа сигнатуры экспрессии маркерного гена (например, PCPI) и другого показателя, например, клинических данных. Во многих случаях данные по экспрессии нормализуют, центрируют и логарифмически преобразуют, как известно специалисту в данной области, для дальнейшего применения, например, в кластерном и дискриминантном анализе. Если используется более чем один уровень экспрессии (как в случае профиля или индекса экспрессии генов, например PCPI), то значения или баллы могут суммироваться, и затем анализироваться как суммарный показатель для оценки корреляции или проведения классификации на основе корреляции.

«Полинуклеотид» представляет собой полимерную форму нуклеотидов любой длины, рибонуклеотиды или дезоксирибонуклеотиды. Данный термин относится только к первичной структуре молекулы. Таким образом, этот термин включает двух- и одноцепочечные ДНК и РНК. Он также включает известные типы модификаций, в том числе метки, известные в данной области техники, метилирование, «кэпы», замену одного или нескольких встречающихся в природе нуклеотидов аналогом, межнуклеотидные модификации, например, такие как межнуклеотидные модификации незаряженными связями (например, фосфоротиоаты, фосфородитиоаты и т. д.), а также немодифицированные формы полинуклеотида.

Термин «амплифицировать» используется в широком смысле, означая, что создание продукта амплификации можно осуществить ферментативно с использованием ДНК- или РНК-полимераз. Как здесь используется, «амплификация» обычно относится к процессу получению многочисленных копий желаемой последовательности, в частности, из образца. «Многочисленные копии» означают не менее 2 копий. «Копия» не обязательно означает точную комплементарность или идентичность последовательности для последовательности матрицы. Можно дополнительно использовать любой способ секвенирования, известный в данной области, для идентификации последовательностей GOI.

Термин «соответствующий» может относиться, где это подходит, к молекуле нуклеиновой кислоты, разделяющей значительную степень идентичности последовательности с другой молекулой нуклеиновой кислоты. Значительная степень означает, по меньшей мере, 95%, обычно, по меньшей мере, 98% и более обычно, по меньшей мере, 99%, и идентичность последовательности определяется с использованием алгоритма BLAST, как описано в публикации Altschul et al. (1990), J. Mol. Biol. 215: 403-410 (с использованием опубликованного алгоритма по умолчанию, т. е. параметров w=4, t=17). Способы амплификации мРНК обычно известны в данной области и включают ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР), и методы, которые описаны в заявке на патент США, серийный номер 10/062857 (подана 25 октября 2001 г.), а также в предварительных заявках на патент США 60/298847 (подана 15 июня 2001 г.) и 60/257801 (подана 22 декабря 2000 г.), которые все включены здесь в качестве ссылки во всей полноте, как если бы они были здесь полностью изложены. Другим методом, который можно использовать, является количественная ПЦР (или кПЦР). Альтернативно, РНК можно непосредственно метить в виде соответствующей кДНК способами, известными в данной области.

Термин «значение Cq» определяет, что цикл ПЦР в ОТ-кПЦР (количественная ПЦР в режиме реального времени), где измеренная флуоресценция первый раз пересекает фоновую флуоресценцию.

«Микрочип» представляет собой линейный или двумерный чип дискретных областей, каждая из которых имеет определенную площадь, образованную на поверхности, как правило, твердой подложки, такой как, не ограничиваясь этим, стекло, пластик или синтетическая мембрана. Плотность дискретных областей на микрочипе определяется суммарным количеством иммобилизованных полинуклеотидов, предназначенных для детектирования на поверхности одной твердофазной подложки, например, по меньшей мере, примерно 50/см², по меньшей мере, примерно 100/см², по меньшей мере, примерно 500/см², но ниже примерно 1000/см² в некоторых вариантах осуществления. Чипы могут содержать всего примерно 500, примерно 1000, примерно 1500, примерно 2000, примерно 2500 или примерно 3000 иммобилизованных полинуклеотидов. Как здесь используется, ДНК-микрочип представляет собой чип с олигонуклеотидами или полинуклеотидами, нанесенными на чип или другие поверхности, используемые для гибридизации с амплифицированными или клонированными полинуклеотидами из образца. Поскольку положение каждой конкретной группы полинуклеотидов на чипе известно, то идентичность полинуклеотидов в образце можно определить на основе их связывания с определенным положением на микрочипе.

Поскольку изобретение основано на идентификации генов (или экспрессированных последовательностей), которые гиперэкспрессируются или экспрессируются недостаточно, то один вариант осуществления изобретения включает определение экспрессии путем гибридизации мРНК или ее амплифицированной или клонированной версии (такой как ДНК или кДНК), клетки в образце с полинуклеотидом, который является уникальным для конкретной последовательности генов. Полинуклеотиды данного типа могут содержать, по меньшей мере, примерно 20, по меньшей мере примерно 22, по меньшей мере примерно 24, по меньшей мере примерно 26, по меньшей мере примерно 28, по меньшей мере примерно 30 или, по меньшей мере, примерно 32 последовательные пары оснований последовательности гена, которые не обнаружены в последовательностях других генов. Термин «примерно», используемый в предыдущем предложении, относится к увеличению или уменьшению на 1 от указанного цифрового значения. В еще одних вариантах осуществления могут использоваться полинуклеотиды, по меньшей мере, или примерно из 50, по меньшей мере, или примерно из 100, по меньшей мере, примерно из 150, по меньшей мере, или примерно из 200, по меньшей мере, или примерно из 250, по меньшей мере, или примерно из 300, по меньшей мере, или примерно из 350, или, по меньшей мере, или примерно из 400 пар оснований последовательности гена, которые не обнаружены в последовательностях других генов. Термин «примерно», используемый в предыдущем предложении, относится к увеличению или уменьшению на 10% от указанного цифрового значения. Такие полинуклеотиды могут также упоминаться как полинуклеотидные зонды, которые способны гибридизоваться с последовательностями генов или их уникальными участками, описанными здесь. Во многих случаях условия гибридизации представляют собой жесткие условия: примерно от 30% до примерно 50% об./об. формамида и примерно от 0,01 М до примерно 0,15 М соли для гибридизации и примерно от 0,01 М до примерно 0,15 М соли для условий отмывки при температуре примерно от 55°С до примерно 65°С или выше, или эквивалентные им условия.

В еще одних вариантах осуществления полинуклеотидные зонды для применения в изобретении могут иметь примерно 95% или примерно 96%, примерно 97% или примерно 98% или примерно 99% идентичность с последовательностями маркерного гена, экспрессия которых подлежит определению. Идентичность определяется с использованием алгоритма BLAST, как описано выше. Такие зонды также могут быть описаны на основе способности гибридизоваться с экспрессируемыми маркерными генами, используемыми в способах по изобретению, в жестких условиях, как описано выше, или эквивалентных им условиях.

Во многих случаях последовательностями являются последовательности мРНК, кодированные маркерными генами, соответствующими кДНК для таких мРНК и/или амплифицированными вариантами таких последовательностей. В некоторых вариантах осуществления изобретения полинуклеотидные зонды иммобилизуются на чипе, других устройствах или в отдельных пятнах, в которых находятся зонды.

Подходящие метки, которые можно использовать по изобретению, включают радиоизотопы, хромофоры нуклеотидов, ферменты, субстраты, флуоресцентные молекулы, хемилюминесцентные соединения, магнитные частицы, биолюминесцентные соединения и тому подобное. Таким образом, меткой является любая композиция, детектируемая спектроскопическими, фотохимическими, биохимическими, иммунохимическими, электрическими, оптическими или химическими средствами. Термин «подложка» относится к обычным подложкам, таким как шарики, частицы, стержни, волокна, фильтры, мембраны и силановые или силикатные подложки, такие как предметные стекла.

Как здесь используется, термин «образец ткани предстательной железы» или «образец клетки злокачественной опухоли предстательной железы» относится к образцу ткани предстательной железы, выделенному из организма субъекта, например, субъекта с раком предстательной железы. Образец может происходить из материала, полученного в результате простатэктомии, такой как радикальная простатэктомия. В качестве альтернативы их получают другими способами, такими как игольчатая биопсия (кор-биопсия) или другие методы биопсии, такие как биопсия с латеральным направлением, традиционный метод секстантной биопсии, различные комбинации секстантной и латеральной биопсий в качестве расширенных методов, трансректальная биопсия простаты под ультразвуковым контролем и другие, известные специалисту. Такие образцы являются первичными изолятами (в отличие от культивированных клеток), и могут отбираться любыми подходящими методами, признанными в данной области. В некоторых вариантах осуществления «образец» может быть отобран инвазивным методом, включая, не ограничиваясь этим, хирургическую биопсию. Образец может содержать опухолевые клетки предстательной железы, которые выделены известными способами или другими подходящими способами, которые считаются желательными с точки зрения практикующего специалиста. Методы выделения включают, не ограничиваются этим, микродиссекцию, лазерную захватывающую микродиссекцию (LCM) или лазерную микродиссекцию (LMD) перед использованием по изобретению. «Экспрессия» и «экспрессия генов» включают транскрипцию и/или трансляцию вещества нуклеиновой кислоты. Как здесь используется, термин «содержащий» и его родственные варианты используются в их включающем смысле; т. е. эквивалентно термину «включающий» и его соответствующим родственными вариантами.

Условиями, которые «позволяют» событию иметь место, или условия, которые являются «подходящими» для того, чтобы событие имело место, такое как гибридизация, удлинение участка и т. п., или «подходящие» условия, представляют условия, которые не препятствуют проявлению таких событий. Таким образом, эти условия позволяют, улучшают, облегчают и/или способствуют проявлению события. Такие условия, известные в данной области и описанные здесь, зависят, например, от природы нуклеотидной последовательности, температуры и буфера. Эти условия также зависят от того, какое событие желательно, например, гибридизация, расщепление, удлинение участка или транскрипция.

«Детектирование» включает любые средства детектирования, включая прямое и опосредованное обнаружение экспрессии генов и изменения в нем. Например, «детектируемо меньше» продуктов может наблюдаться прямо или опосредованно, и данный термин указывает на любое уменьшение (в том числе отсутствие детектируемого сигнала). Аналогично «детектируемо больше» продукта означает любое увеличение, независимо от того, наблюдается оно прямо или опосредованно.

«Простатэктомия» относится к удалению ткани предстательной железы квалифицированным врачом, таким как хирург. Неограничивающие примеры включают радикальную простатэктомию; открытую (традиционную) простатэктомию (с использованием разреза через промежность); лапароскопическую простатэктомию; и роботическую (нервосберегающую) простатэктомию.

«Шкала Глисона» относится к классификации образца злокачественной опухоли предстательной железы квалифицированным патологом согласно системе Глисона, которая приписывает балл по шкале Глисона с использованием чисел от 1 до 5 на основе сходства в клетках образца ткани предстательной железы со злокачественной тканью или нормальной тканью предстательной железы. Ткань, которая выглядит очень похожей на нормальную ткань предстательной железы, получает балл или оценку 1, в то время как ткань, которая не имеет нормальных признаков и клеток, по-видимому, случайно попавших в простату, получает балл или оценку 5. Баллы или степени от 2 до 4 включительно, имеют признаки между этими указанными возможными вариантами. Но поскольку злокачественная опухоль предстательной железы может иметь области с различными баллами или степенями, то отдельные баллы или степени даются двум областям, которые составляют большую часть ткани простаты. Два балла или степени суммируются с получением общего балла Глисона (или суммы Глисона) в диапазоне от 2 до 10.

Уровни экспрессии маркерных генов, упомянутые здесь, коррелируют с клиническими исходами, как здесь описано, и поэтому могут использоваться в качестве прогнозирующих показателей, как здесь описано. Сообщалось, что идентифицированные гены участвуют в различных клеточных функциях, как представлено в http://csbi.ltdk.Helsinki.fi/anduril/tcga-gbm/table4_2.html. В способах, лежащих в основе вариантов осуществления настоящего изобретения, эти данные коррелируют с гипотетическим прогностическим геном-маркером PDE4D7, как описано в международных заявках WO2010131194 и WO2010131195, содержание которых включено в настоящее описание посредством ссылки. В контексте настоящего изобретения данные молекулярные пути, которые показали достоверную корреляцию, были выбраны для даун-стрим анализа (фиг.2).

В вариантах осуществления изобретения паттерн экспрессии маркерного гена (или PCPI) может быть соотнесен с уровнями ПСА до или после операции, баллом по шкале Глисона и стадией pT. Профиль также имеет возможность стратифицировать образцы с баллами по шкале Глисона ≤6 и 7 на низкий и высокий риск ПСА. В многофакторном анализе с известными прогностическими факторами профиль был единственным прогностическим показателем, который оставался статистически значимым (р<0,05). Таким образом, детектирование профиля при биопсии или в ткани, полученной во время простатэктомии, позволяет отличить индолентную форму от агрессивной формы рака.

Таким образом, варианты осуществления изобретения относятся к идентификации и применению паттернов экспрессии генов (или профилей или «сигнатур»), которые различаются (или коррелируют) по выживаемости и рецидивами рака предстательной железы у субъекта. Такие паттерны можно определить с помощью способов по изобретению с использованием ряда образцов референсных клеток или тканей, таких как те, которые были исследованы специалистом в области патологии рака предстательной железы, которые отражают клетки злокачественные опухоли предстательной железы, в отличие от нормальных или других незлокачественных клеток. Исходы, имеющие место у субъектов, от которых получены образцы, можно сопоставть с данными по экспрессии, для идентификации паттернов, которые коррелируют с исходами. Поскольку общий профиль экспрессии генов различается от человека к человеку, от одного вида злокачественной опухоли к другой злокачественной опухоли, и от одной раковой клетки к другой раковой клетке, то сопоставления могут быть сделаны между определенными клетками и экспрессируемыми или слабо экспрессируемыми генами, как здесь описано, для идентификации генов, которые способны различаться между исходами рака предстательной железы.

В вариантах осуществления настоящего изобретения гены со значительными корреляциями (или до или после простатэктомии) с выживаемостью, метастазированием или рецидивированием при раке предстательной железы, используются для различения исходов. Паттерны или показатели способны прогнозировать классификацию неизвестного образца на основе экспрессии генов, используемых для различения в моделях.

В вариантах осуществления настоящего изобретения маркерные гены (последовательности), экспрессированные в корреляции с исходами рака предстательной железы, или до или после простатэктомии/первичного лечения, обеспечивают возможность сосредоточить анализ экспрессии генов только на тех генах, которые способствуют возможности стратифицировать субъекта среди разных исходов.

Специалисты в данной области техники понимают, что паттерны экспрессии (и PCPI) очень пригодны для различения различных исходов при раке предстательной железы или до или после простатэктомии, и могут быть легко выполнены квалифицированным специалистом для генерации модели, как описано выше, для прогнозирования статуса неизвестного образца на основе уровней экспрессии этих генов.

Для определения уровней экспрессии генов (с положительной регуляций или отрицательной регуляцией) в практике изобретения может быть использован любой способ, известный в данной области. В некоторых вариантах осуществления используется экспрессия, основанная на детектировании РНК, которая гибридизуется с генами (или последовательностями зонда), идентифицированными и раскрытыми здесь. Это легко выполнить любым способом детектирования или амплификации или определения РНК+способом детектирования, известным или признанным в качестве эквивалентного в данной области, таким как, не ограничиваясь этим, секвенирование РНК, ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР), ПЦР в режиме реального времени, ОТ-ПЦР в режиме реального времени, способы, раскрытые в заявке на патент США с серийным номером 10/062857 (поданной 25 октября 2001 г.), а также в предварительных заявках на патент США 60/298847 (поданной 15 июня 2001 г.) и 60/257801 (поданной 22 декабря 2000 г.), а также способы детектирования присутствия или отсутствия стабилизирующих или дестабилизирующих последовательностей РНК.

Альтернативно, можно использовать экспрессию, основанную на детектировании статуса ДНК. Детектирование ДНК идентифицированного гена в качестве метилированного или делецированного может быть использовано для генов, которые имеют пониженную экспрессию в корреляции с конкретным раком предстательной железы, или до или после простатэктомии. Это можно легко выполнить с помощью методов на основе ПЦР, известных в данной области, включая, не ограничиваясь этим, кПЦР.

И наоборот, детектирование ДНК идентифицированного гена в виде амплифицированного может быть использовано для генов, которые имеют положительную регуляцию экспрессии в корреляции с конкретным раком предстательной железы, или до или после простатэктомии. Это может быть легко осуществлено с использованием методов ПЦР на основе флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) и хромогенной гибридизации in situ (CISH), известных в данной области техники.

Также можно использовать экспрессию, основанную на детектировании присутствия, повышения или снижения уровней или активности белка, например, в дополнение к вычислению PCPI для отдельного образца/пациента. Детектирование можно проводить с помощью любого иммуногистохимического исследования (IHC), на основе образца крови (особенно для секретируемых белков), на основе антител (включая аутоантитела к белку), на основе эксфолиантной клетки (из злокачественной опухоли), на основе масс-спектроскопии и на основе метода визуализации (включая использование меченного лиганда), известного в данной области техники и признанного в качестве подходящего для детектирования белка. Методы на основе антител и визуализации также пригодны для установления локализации опухолей после определения злокачественных опухолей с использованием клеток, полученных неинвазивной процедурой (такой как лаваж или игольчатая аспирация), когда источник злокачественных клеток неизвестен. Меченое антитело или лиганд можно использовать для установления локализации карциномы(м) в организме пациента.

Варианты осуществления настоящего изобретения, относящиеся к применению анализа на основе нуклеиновых кислот для определения экспрессии, осуществляются путем иммобилизации одной или более последовательностей маркерных генов, идентифицированных здесь, в виде полинуклеотида на твердой подложке, включая, не ограничиваясь этим, твердый субстрат в виде чипа или на основе шариков или технологии на основе шариков, известных в данной области техники. В некоторых вариантах осуществления анализ представляет собой DASL (кДНК-опосредованные отжиг, селекция, удлинение и лигирование), доступный от Illumina. Альтернативно, также можно использовать анализы экспрессии на основе раствора, известные в данной области. Иммобилизованные полинуклеотидные зонды могут быть уникальными или иначе специфическими для раскрытых генов (или экспрессированных последовательностей), так что полинуклеотиды способны гибридизоваться с ДНК или РНК, соответствующих генам (или экспрессированным последовательностям). Данные полинуклеотиды могут соответствовать полноразмерным генам (или экспрессированным последовательностям), или представлять зонды более короткой длины (на один нуклеотид короче, чем полноразмерная последовательность, известная в данной области, путем делеции с 5'- или 3'-конца последовательности), которые необязательно могут минимально прерываться (например, ошибочными спариваниями или вставленными некомплементарными парами оснований), что не оказывает отрицательного влияния на их гибридизацию с родственной ДНК или РНК, соответствующей генам (или экспрессированным последовательностям). Во многих вариантах осуществления полинуклеотидный зонд содержит последовательность из 3'-конца раскрытого гена или экспрессированной последовательности. Полинуклеотидные зонды, содержащие мутации относительно последовательностей описанных генов, также могут быть использованы при условии, что присутствие мутаций по-прежнему позволяет генерировать детектируемый сигнал в результате гибридизации. Иммобилизованные полинуклеотиды можно использовать для определения состояния образцов нуклеиновой кислоты, полученных из клетки(ок) образца предстательной железы, для которых исход для субъекта образца (например, пациента, от которого получен образец) неизвестен или для подтверждения исхода, который уже приписан субъекту, от которого получен образец. Не ограничивая объем изобретения, такая клетка может происходить от пациента с раком предстательной железы, например, из материала, удаленного простатэктомией. Иммобилизованный полинуклеотид(ы) должен быть достаточным для специфической гибридизации с соответствующими молекулами нуклеиновой кислоты, полученными из образца в подходящих условиях. Несмотря на то, что экспрессия даже одного коррелированного гена может обеспечить достаточную точность при распознавании двух исходов рака предстательной железы, изобретение включает использование уровней экспрессии более чем одного гена или экспрессированной последовательности. В частности, используются гены (экспрессированные последовательности), входящие в ряд из 17, 18, 19 генов или ряд из 57 генов, указанных в разделе «Примеры» (ниже).

В некоторых вариантах осуществления нуклеиновую кислоту, полученную из клетки(ок) образца злокачественной опухоли предстательной железы, можно предпочтительно амплифицировать с использованием подходящих праймеров (таких как используются в ПЦР), так, чтобы амплифицировались только гены, предназначенные для анализа, с целью снижения загрязняющих фоновых сигналов от других экспрессированных генов или последовательностей, находящихся в образце. Размер ампликона после проведения ПЦР по изобретению может быть любым, включая, по меньшей мере, или примерно 50, по меньшей мере, или примерно 100, по меньшей мере, или примерно 150, по меньшей мере, или примерно 200, по меньшей мере, или примерно 250, по меньшей мере, или примерно 300, по меньшей мере, или примерно 350 или, по меньшей мере, или примерно 400 последовательно расположенных нуклеотидов, все с включением участка, комплементарного используемым праймерам ПЦР. Конечно, ПЦР может необязательно представлять ПЦР с обратной транскрипцией (или ОТ-ПЦР в случае, если исходным материалом является РНК) или количественную ПЦР, такую как ПЦР в режиме реального времени или их комбинации. Конечно, РНК из образцов, описанных здесь, может быть получена и использована с помощью средств, хорошо известных специалисту в данной области. В качестве альтернативы, когда нужно анализировать много генов, или когда используется очень мало клеток (или одна клетка), то нуклеиновую кислоту из образца можно полностью амплифицировать до гибридизации с иммобилизованными полинуклеотидными зондами, такими как чип или микрочип. Конечно, РНК или ее аналог кДНК можно непосредственно метить и использовать без амплификации способами, известными в данной области. Предпочтительным вариантом осуществления способов детектирования описанных здесь маркерных генов является секвенирование РНК.

Изобретение обеспечивает более объективный набор критериев, в виде профилей экспрессии генов дискретного набора маркерных генов, для различения (или установления) исходов рака предстательной железы, или до или после простатэктомии, и позволяет прогнозировать предрасположенность к развитию агрессивной формы против индолентной формы заболевания. В некоторых вариантах осуществления анализы используются для того, чтобы различить более благоприятные и менее благоприятные исходы в течение примерно 6 месяцев, 1 года, 2 года, 3 года, 4 года, 5 лет, 7 лет, 10 лет, 15 лет или даже позднее.

Несмотря на то, что более благоприятные и менее благоприятные исходы в отношение рецидивирования, метастазирования рака предстательной железы и/или выживаемости можно определить относительно при сравнении друг с другом, «более благоприятный» исход или «благоприятный прогноз» можно рассматривать как таковой, который лучше, чем 50% вероятность рецидива рака и/или 50% вероятность выживаемости примерно через 60 месяцев после хирургического вмешательства по поводу удаления злокачественной опухоли(ей) рака предстательной железы. «Более благоприятный» исход или «благоприятный прогноз» также может быть лучше, чем примерно 60%, примерно 70%, примерно 80% или примерно 90% вероятность рецидивирования рака и/или вероятность выживаемости примерно через 60 месяцев после хирургического вмешательства. «Менее благоприятный» исход/прогноз можно рассматривать как 50% вероятность или выше рецидивирования рака и/или ниже чем 50% вероятность выживаемости примерно через 60 месяцев после хирургического вмешательства по поводу удаления злокачественной опухоли(ей) предстательной железы. PCPI и способы по изобретению помогают классифицировать пациентов на пациентов, которые имеют вышеуказанный прогноз.

Раскрытые способы также можно использовать с материалом твердых тканей. Например, может быть проведена биопсия твердых тканей, и их можно подготовить для визуализации с последующим определением экспрессии двух или более генов или экспрессированных последовательностей, идентифицированных здесь, для определения рака предстательной железы, или до или после простатэктомии. Одним из способов является использование гибридизации in situ с полинуклеотидным идентифицирующим зондом(ами) для анализа экспрессии указанного гена(ов).

В некоторых вариантах осуществления изобретения детектирование экспрессии гена из образцов можно осуществить с использованием одного микрочипа, способного анализировать экспрессию гена, выбранного из некоторых или всех генов, раскрытых здесь, для удобства и обеспечения точности.

Другие варианты применения изобретения включают обеспечение возможности идентифицировать образцы клеток злокачественной опухоли предстательной железы, как коррелирующие с определенными исходами по выживаемости или рецидивированию рака предстательной железы, для дальнейших исследований или опытов. Это обеспечивает особое преимущество во многих контекстах, когда требуется идентификация клеток на основе объективных генетических или молекулярных критериев.

Материалы для применения в способах по настоящему изобретению идеально подходят для приготовления наборов, изготовленных в соответствии с хорошо известными процедурами. Таким образом, изобретение обеспечивает наборы, содержащие агенты для детектирования экспрессии описанных генов и последовательностей, для идентификации рака предстательной железы или исходов до или после простатэктомии. Такие наборы, которые необязательно содержат агент с идентификационным описанием или этикеткой, или инструкции по их применению в способах по настоящему изобретению. Такой набор может содержать контейнеры, каждый из которых содержит один или несколько различных реагентов (обычно в концентрированной форме), используемых в способах, включая, например, заранее изготовленные микрочипы, буферы, соответствующие нуклеотидтрифосфаты (например, dATP, dCTP, dGTP и dTTP или rATP, rCTP, RGTP и UTP), обратную транскриптазу, ДНК-полимеразу, РНК-полимеразу и один или несколько праймерных комплексов по настоящему изобретению (например, poly(T) или случайные праймеры с подходящей длиной, связанные с промотором РНК-полимеразы). Обычно также включается ряд инструкций.

Способы, обеспеченные изобретением, также могут быть полностью или частично автоматизированы. Все аспекты изобретения также могут быть осуществлены на практике таким образом, чтобы они состояли в основном из субряда описанных генов, для исключения материала, не имеющего отношения к идентификации рецидивирования, метастазирования рака предстательной железы и/или исходов по выживаемости, посредством образца, содержащего клетку.

В контексте способов по настоящему изобретению PCPI применяется для диагностики рака предстательной железы у пациентов, для обнаружения рака предстательной железы у пациентов и для установления прогноза для пациентов с раком предстательной железы, для определения предрасположенности к развитию агрессивной и индолентной формы заболевания, и для стратификации пациентов с раком предстательной железы для того, чтобы лечащий врач мог принять решение о том, как, если вообще это требуется, пациент должен лечиться. PCPI можно использовать в качестве единственного показателя для вышеуказанных целей или его можно использовать в комбинации с другими известными диагностическими, прогностическими или стратификационными методами для обеспечения дополнительного основания для врача.

Как здесь используется, термин «диагностирование рака предстательной железы» означает, что пациент или субъект могут считаться страдающими раком предстательной железы, когда уровень экспрессии GOI по настоящему изобретению подвергается положительной регуляции, отрицательной регуляции по сравнению с контрольным уровнем, как здесь определено выше, предпочтительно, по сравнению с нормальным контрольным уровнем, как здесь определено выше, таким образом, что PCPI достоверно выше/отличается от уровня, детектированного в контрольной ткани. Термин «диагностирование» также относится к заключению, достигнутому в ходе такого процесса сравнения.

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения диагностика может комбинироваться с определением уровней экспрессии дополнительных биомаркеров рака, в частности, биомаркеров рака предстательной железы. Специалистам в данной области техники известно несколько специфических биомаркеров рака предстательной железы. Например, может быть тестирована экспрессия биомаркеров, таких как ПСА.

Рак предстательной железы можно считать диагностированным, когда уровень экспрессии GOI по настоящему изобретению подвергается положительной регуляции или отрицательной регуляции по сравнению с нормальным контрольным уровнем, как здесь определено выше, и когда PCPI (достоверно выше, чем данный показатель, полученный с контрольным материалом).

В еще одном предпочтительном варианте осуществления рак предстательной железы может считаться диагностированным или имеющим предрасположенность к развитию агрессивной и индолентной формы заболевания, если уровень экспрессии GOI, упомянутый здесь, подвергается положительной регуляции или отрицательной регуляции на величину в диапазоне от 20% до 80%, предпочтительно на 30%, 40%, 50%, 60% или 70% в тестируемом образце по сравнению с контрольным уровнем, предпочтительно с нормализованным контрольным уровнем. Контрольный уровень может представлять нормальный контрольный уровень или злокачественный контрольный уровень, как здесь определено выше. В особенно предпочтительном варианте осуществления рак предстательной железы можно считать диагностированным или имеющим предрасположенность к развитию агрессивной формы против индолентной формы заболевания, если уровень экспрессии, как здесь определено выше, подвергается положительной регуляции или отрицательной регуляции в 1,5-10 раз, предпочтительно в 2-5 раз в тестируемом образце по сравнению с контрольным уровнем, в частности, здоровой тканью или доброкачественной опухолью предстательной железы, или особенно предпочтительно по сравнению с тканью предстательной железы одного и того же пациента на время постановки первоначального диагноза.

Как здесь используется, термин «обнаружение рака предстательной железы», означает, что может быть определено наличие злокачественного заболевания или расстройства предстательной железы в организме, или что такое заболевание или расстройство может быть идентифицировано в организме. Обнаружение или идентификация злокачественного заболевания или расстройства предстательной железы может быть достигнуто сравнением уровня экспрессии GOI по настоящему изобретению и нормального контрольного уровня, как здесь определено выше, или определением PCPI. Рак предстательной железы может быть обнаружен, когда уровень экспрессии GOI подвергается положительной регуляции или отрицательной регуляции по сравнению с нормальным контрольным уровнем, как здесь определено выше. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения рак предстательной железы может быть обнаружен, если уровень экспрессии GOI сходен уровню экспрессии установленному, например, независимо установленному, в клетке злокачественной опухоли предстательной железы или клеточной линии, например, клеточной линии злокачественной опухоли предстательной железы или клеточной линии, указанной выше.

Как здесь используется, термины «мониторинг рака предстательной железы» и «идентификация субъекта с предрасположенностью к развитию рака предстательной железы, т.е. склонного к прогрессированию заболевания» (т. е. идентификация агрессивной формы заболевания против индолентной формы заболевания), относятся к сопровождению диагностированного или обнаруженного злокачественного заболевания или расстройства предстательной железы, например во время или после лечебной процедуры или во время или после определенного периода времени, как правило, в течение 2 месяцев, 3 месяцев, 4 месяцев, 6 месяцев, 1 года, 2 года, 3 года, 5 лет, 10 лет или любого другого периода время во время или после начала или окончания первичной терапии. Термин «сопровождение» означает, что состояние заболевания или PCPI, как здесь определено выше, и, в частности, изменения данного состояния заболевания или PCPI, можно детектировать сравнением уровней экспрессии GOI по настоящему изобретению в образце с нормальным контрольным уровнем, как здесь определено выше, предпочтительно контрольным уровнем экспрессии, полученным на доброкачественной контрольной опухоли или здоровой контрольной ткани, или уровнем экспрессии в установленной, например, независимо установленной, клетке злокачественной опухоли предстательной железы или клеточной линии, например, клеточной линии злокачественной опухоли предстательной железы или клеточной линии, с любым временным интервалом периодичности, например, каждую неделю, каждые 2 недели, каждый месяц, каждые 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 месяцев, каждые 1,5 года, каждые 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 лет, в течение любого периода времени, например, в течение 2 недель, 3 недель, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 месяцев, 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 или 20 лет, соответственно. Установленная, например, независимо установленная, клетка злокачественной опухоли предстательной железы или клеточная линия, дающие дополнительный контрольный уровень, могут быть получены из образцов, соответствующих различным стадиям развития рака, например, стадии 0 и I-IV согласно системе классификации TNM. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения термин относится к сопровождению диагностированной злокачественной опухоли предстательной железы, например, злокачественной, гормоночувствительный опухоли предстательной железы. Мониторинг может также включать детектирование экспрессии дополнительных генов или генетических элементов, например, генов домашнего хозяйства, таких как GAPDH или PBGD. Настоящее изобретение также относится к способам мониторинга пациентов с целью детектирования изменений в раскрытых здесь сигнатурных генах с использованием PCPI, как раскрыто по тексту описания, для идентификации тех пациентов, у которых имеется вероятность развития агрессивной форма рака предстательной железы. Затем этих пациентов будут лечить, как описано в описании.

Как здесь используется, термин «прогнозирование (агрессивного) рака предстательной железы», относится к прогнозу течения или исхода диагностированного или детектированного агрессивного рака предстательной железы, например, в течение определенного периода времени, во время лечения или после лечения. Данный термин также относится к определению вероятности выживаемости или выздоровления от заболевания, а также к прогнозу ожидаемого времени выживаемости пациента. Прогноз может, в частности, включать установление вероятности выживаемости пациента в течение определенного периода времени в будущем, например, в течение 6 месяцев, 1 года, 2 лет, 3 лет, 5 лет, 10 лет или любой другого периода времени.

Как здесь используется, термины «прогрессирование к раку предстательной железы» и «прогрессирование к агрессивному (против индолентного) рака предстательной железы», относятся к переходу между различными стадиями развития рака, например, стадиями 0 и I-IV по классификации TNM, или в любую другую стадию или подстадию, начиная от здорового состояния до злокачественной, гормоночувствительной или злокачественной гормонорезистентной опухоли предстательной железы. Обычно такие переходы сопровождаются модификацией уровня экспрессии маркерного гена(ов) или GOI и другого PCPI, как здесь используется, в тестируемом образце по сравнению с предыдущим тестируемым образцом от одного и того же субъекта, например, по сравнению с образцом, полученным из доброкачественной контрольной опухоли предстательной железы или здоровой контрольной ткани. Прогрессирование к агрессивному раку предстательной железы может рассматриваться как детектированное или диагностированное, если уровень экспрессии GOI, используемый для вычисления PCPI, как здесь определено, отличается, например, на величину от 3% до 50%, предпочтительно на 10%, 15%, 20% или 25% в тестируемом образце по сравнению с предыдущим значением PCPI, рассчитанным по значениям экспрессии гена в тестируемом образце от одного и того же субъекта. Модификация может быть детектирована в течение любого периода времени, предпочтительно более 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 месяцев, 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 или 20 лет, т. е. вышеуказанное значение может быть рассчитано сравнением уровня экспрессии маркерного гена(ов) или GOI или PCPI на первую временную точку и на вторую временную точку после вышеуказанного периода времени.

В особенно предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения термин «прогрессирование к раку предстательной железы» относится к переходу из здорового состояния или состояния доброкачественной опухоли предстательной железы в состояние злокачественной опухоли предстательной железы. Прогрессирование от здорового состояния до состояния злокачественной опухоли предстательной железы может рассматриваться как детектированное или диагностированное, если значение PCPI, как здесь определено выше, повышается на величину от 20% до 50%, предпочтительно на 20%, 25%, 30% или 35% в тестируемом образце по сравнению с предыдущим тестируемым образцом от одного и того же субъекта, который был диагностирован как здоровый. Альтернативно, для сравнения могут использоваться тестируемые образцы от других субъектов, например, тестируемые образцы от здоровых субъектов. Также предусматривается использование доступной информации из базы данных по экспрессии или использование образцов из коллекции злокачественных клеток и т. д.

Прогрессирование от состояния доброкачественной опухоли предстательной железы до состояния злокачественной опухоли предстательной железы может считаться детектированным или диагностированным, если значение PCPI, как здесь определено выше, повышается на величину от 3% до 30%, предпочтительно на величину 5%, 10%, 15% или 20% в тестируемом образце по сравнению с предыдущим тестируемым образцом от одного и того же субъекта, который был диагностирован как страдающий доброкачественной опухолью предстательной железы. Альтернативно, для сравнения могут использоваться тестируемые образцы от других субъектов, например, тестируемые образцы от здоровых субъектов. Также предусматривается использование доступной информации из базы данных по экспрессии или использование образцов из коллекции злокачественных клеток и т. д.

Модификация может быть детектирована в течение любого периода времени, предпочтительно в течение 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 месяцев, 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 или 20 лет, т. е. вышеуказанное значение может быть рассчитано путем сравнения уровня экспрессии маркерного гена(ов) или GOI на первую временную точку и на вторую временную точку после вышеуказанного периода времени.

В дополнительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к диагностике и детектированию предрасположенности к развитию рака предстательной железы. «Предрасположенность к развитию (агрессивного) раку предстательной железы» в контексте настоящего изобретения представляет состояние риска развития (агрессивного) рака предстательной железы. Предпочтительно предрасположенность к развитию агрессивного рака предстательной железы может иметь место в случаях, когда уровень экспрессии GOI или PCPI, определенный здесь выше, достоверно отличается от контрольного уровня, как здесь определено, т.е. референсного уровня экспрессии или референсного PCPI, полученного из тканей или образцов субъекта, который явно здоров, или из образца или тканей пациента, полученных до постановки первоначального диагноза рака предстательной железы, таким образом, что и PCPI, рассчитанный на основе экспрессии генов в раковых тканях, выше, чем PCPI, полученный для контрольного образца. Таким образом, предрасположенность к агрессивному раку предстательной железы может считаться диагностированной или детектированной, если наблюдается вышеуказанная ситуация.

Как правило, и также при установлении PCPI, разница между уровнями экспрессии в тестируемом биологическом образце и контрольным уровнем может быть нормализована к уровню экспрессии дополнительных контрольных нуклеиновых кислот, например, которые, как известно, не различаются в зависимости от злокачественного или незлокачественного состояния клетки. Типичные контрольные гены включают, среди прочего, β-актин, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу (GAPDH), порфибилиноген-дегидрогеназу (PBGD) и тому подобное.

В контексте настоящего изобретения термины «диагностирование» и «прогнозирование» также предназначены для включения прогностических и вероятностных анализов. Таким образом, значение PCPI в качестве показателя может использоваться в клинических условиях для принятия решений относительно подходов и методов лечения, включая терапевтическое вмешательство или диагностические критерии, такие как наблюдение за заболеванием. Согласно настоящему изобретению может быть предоставлен промежуточный результат для исследования состояния пациента. Такой промежуточный результат может быть объединен с дополнительной информацией, для оказания помощи лечащему врачу, медсестре или другому практическому специалисту диагностировать, что пациент страдает этим заболеванием. Альтернативно, настоящее изобретение может быть использовано для детектирования злокачественных клеток в ткани, полученной от пациента, и предоставить врачу полезную информацию для диагностики того, что пациент страдает этим заболеванием.

Пациент или субъект, который подлежит диагностике, мониторингу, или в отношение которого нужно детектировать или прогнозировать прогрессирование к агрессивному против индолентного рака предстательной железы или предрасположенность к развитию агрессивного против индолентного рака предстательной железы, по настоящему изобретению, представляет животное, предпочтительно млекопитающее, более предпочтительно человека. Способы молекулярной визуализации, известные специалисту в данной области техники, например, технологию магнитно-резонансной томографии (МРТ) и/или магнитно-резонансные методы визуализации (МРВ), и/или технологию мультипараметрической МРТ (мпМРТ) можно использовать в дополнение к PCPI в качестве маркера для диагностики, обнаружения, мониторинга или прогнозирования рака предстательной железы или прогрессирования к агрессивному против индолентного рака предстательной железы.

В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к композиции для диагностики, обнаружения, мониторинга или прогнозирования рака предстательной железы или прогрессирования к раку предстательной железы, или предрасположенности к развитию рака предстательной железы у субъекта. Композиция по настоящему изобретению может содержать аффинный лиганд на основе нуклеиновой кислоты для продукта(ов) экспрессии GOI.

Как здесь используется, термин «аффинный лиганд на основе нуклеиновой кислоты для продукта экспрессии GOI», относится к молекуле нуклеиновой кислоты, которая может специфически связываться с транскриптом GOI. Аффинный лиганд на основе нуклеиновой кислоты также может быть способен специфически связываться с последовательностью нуклеиновой кислоты, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична последовательностям GOI или любым фрагментам указанных последовательностей.

Как здесь используется, термин «продукт экспрессии» относится к транскрипту GOI или молекуле мРНК, полученной в результате экспрессии GOI. Более предпочтительно, данный термин относится к процессированному транскрипту, как здесь определено выше.

Композиция по настоящему изобретению может, например, содержать набор олигонуклеотидов, специфичных для продуктов экспрессии GOI, и/или зонд, специфичный для продуктов экспрессии GOI. Как здесь используется, термин «олигонуклеотид, специфичный для продуктов экспрессии GOI», относится к нуклеотидной последовательности, которая комплементарна смысловой или антисмысловой цепи GOI.

Олигонуклеотид может иметь любую подходящую длину и последовательность, известные специалисту в данной области, и происходит из последовательности GOI или комплементарной ей последовательности. Как правило, олигонуклеотид может иметь длину от 8 до 60 нуклеотидов, предпочтительно от 10 до 35 нуклеотидов, более предпочтительно 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 или 33 нуклеотида. Олигонуклеотидные последовательности, например, олигонуклеотиды, используемые в качестве прямого и обратного праймеров, специфичные для продуктов экспрессии GOI, могут быть определены с помощью программного обеспечения, известного специалисту в данной области техники.

Как здесь используется, термин «зонд, специфичный для продукта экспрессии GOI», означает нуклеотидную последовательность, которая комплементарна смысловой или антисмысловой цепи описанных здесь GOI.

Зонд может иметь любую подходящую длину и последовательность, известные специалисту в данной области техники, и происходит из последовательности описанного здесь GOI. Обычно зонд может иметь длину от 6 до 300 нуклеотидов, предпочтительно от 15 до 60 нуклеотидов, более предпочтительно 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 или 50 нуклеотидов. Последовательности зонда, специфичные для продукта экспрессии GOI, могут быть определены с помощью программного обеспечения, известного специалисту в данной области техники.

Аффинный лиганд на основе нуклеиновой кислоты, как здесь описано выше, можно метить различными маркерами или можно детектировать с помощью вторичного аффинного лиганда, меченного различными маркерами для обеспечения детектирования, визуализации и/или количественной оценки. Это может быть достигнуто с использованием любых подходящих меток, которые можно конъюгировать с аффинным лигандом, способным взаимодействовать с продуктом экспрессии или с любым вторичным аффинным лигандом, с использованием любого подходящего способа или способов, известных специалисту в данной области. Термин «вторичный аффинный лиганд» относится к молекуле, которая способна связываться с аффинным лигандом, как здесь определено выше (т. е. «первичным аффинным лигандом», если использовать его в контексте системы с двумя взаимодействующими аффинными лигандами). Связывающее взаимодействие предпочтительно представляет собой специфическое связывание.

Примеры меток, которые могут быть конъюгированы с первичными и/или вторичными аффинными лигандами, включают флуоресцентные красители или металлы (например, флуоресцеин, родамин, фикоэритрин, флуорескамин), хромофорные красители (например, родопсин), хемилюминесцентные соединения (например, люминал, имидазол) и биолюминесцентные белки (например, люциферин, люцифераза), гаптены (например, биотин).

В вариантах осуществления настоящего изобретения аффинные лиганды на основе нуклеиновой кислоты, используемые в качестве зондов, в частности зонда, специфичного для продуктов экспрессии GOI, как здесь определено выше, могут быть мечены флуоресцентной меткой, такой как 6-FAM, HEX, TET, ROX, Cy3, Cy5, техасский красный или родамин, и/или в тоже время гасящей меткой, такой как TAMRA, Dabcyl, Black Hole Quencher, BHQ-I или BHQ-2. Различные другие пригодные флуоресцентные метки и хромофоры описаны в публикации Stryer, 1968, Science, 162: 526-533. Аффинные лиганды также могут быть мечены ферментами (например, пероксидазой хрена, щелочной фосфатазой, бета-лактамазой), радиоизотопами (например, ³H, ¹⁴C, ³²P, ³³P, ³⁵S, ¹²⁵I) или частицами (например, золотом). Различные типы меток могут быть конъюгированы с аффинным лигандом с использованием различных химических реакций, например, реакции аминов или реакции тиолов. Однако могут быть также использованы другие реакционноспособные группы, отличные от аминов и тиолов, например, альдегиды, карбоновые кислоты и глутамин.

В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения композиция может дополнительно содержать вспомогательные ингредиенты, такие как буферы для ПЦР, dNTP, полимеразу, ионы, такие как двухвалентные катионы или одновалентные катионы, растворы для гибридизации, красители для детектирования и любое другое подходящее соединение или жидкость, необходимые для выполнения детектирования, как здесь определено выше, как известно специалисту в данной области техники.

В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к применению нуклеиновой кислоты для продукта экспрессии GOI, как здесь определено выше, для получения композиции для диагностики, обнаружения, мониторинга или прогнозирования рака предстательной железы или прогрессирования к агрессивному раку против индолентного рака предстательной железы, или предрасположенности к развитию агрессивного против индолентного заболевания у субъекта, как здесь описано выше.

В предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к применению набора олигонуклеотидов, специфичных для продуктов экспрессии GOI, и/или зонда, специфичного для продуктов экспрессии, как определено здесь выше, для получения композиции для диагностики, обнаружения, мониторинга или прогнозирования рака предстательной железы, или прогрессирования к агрессивному раку против индолентного рака предстательной железы, или предрасположенности к развитию агрессивного против индолентного заболевания у субъекта, как здесь описано выше.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения композиция, как определено выше, представляет собой диагностическую композицию.

В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к диагностическому набору для обнаружения, диагностики, мониторинга или прогнозирования рака предстательной железы или прогрессирования к агрессивному раку предстательной железы, или предрасположенности к развитию агрессивного рака предстательной железы, включающему набор олигонуклеотидов, специфичных для продуктов экспрессии GOI, зонд, специфичный для продуктов экспрессии GOI.

Как правило, диагностический набор по настоящему изобретению содержит один или несколько агентов, обеспечивающих специфическое детектирование маркерного гена(ов) или GOI, как здесь определено выше. Агенты или ингредиенты диагностического набора могут, по настоящему изобретению, находиться в одном или нескольких контейнерах или отдельных элементах набора. Характер агентов определяется методом детектирования, для которого предназначен набор.

Кроме того, набор может содержать количество известной молекулы нуклеиновой кислоты, которая может быть использована для калибровки набора или в качестве внутреннего контроля. Как правило, диагностический набор для детектирования маркерного гена(ов) или продуктов экспрессии GOI может содержать вспомогательные ингредиенты, такие как буферы для ПЦР, dNTP, полимеразу, ионы, такие как двухвалентные катионы или одновалентные катионы, растворы для гибридизации и т. д. Такие ингредиенты известны специалистам в данной области техники и могут варьироваться в зависимости от используемого метода детектирования. Кроме того, набор может содержать буклет инструкции и/или может предоставлять информацию относительно значения полученных результатов.

В еще одних аспектах настоящее изобретение относится к способам обнаружения, диагностики, мониторинга или прогнозирования рака предстательной железы или прогрессирования к агрессивному раку против индолентного рака предстательной железы, например, у субъекта, включающим, по меньшей мере, стадию определения уровня маркерного гена(ов) или GOI в образце. Термин «определение уровня маркерного гена (ов) или GOI» относится к определению присутствия или количества маркерного гена(ов) или продуктов экспрессии GOI. Термин «уровень маркерного гена(ов) или GOI» означает, таким образом, присутствие или количество маркерного гена(ов) или продуктов экспрессии GOI, например, транскрипта(ов), и/или определение присутствия или количества маркерного гена(ов) или GOI. Определение присутствия или количества маркерного гена(ов) или продуктов экспрессии GOI может быть осуществлено любыми способами, известными в данной области.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения определение присутствия или количества маркерного гена(ов) или продуктов экспрессии GOI осуществляется путем измерения нуклеиновой кислоты. Таким образом, уровень(и) экспрессии можно определить с помощью способа, включающего детектирование мРНК, кодируемой геном.

Например, измерение уровня нуклеиновой кислоты маркерного гена(ов) или экспрессии GOI можно оценить разделением молекул нуклеиновых кислот (например, РНК или кДНК), полученных из образца, с последующей гибридизацией со специфическими олигонуклеотидными зондами, как здесь определено выше. Сравнение уровней экспрессии может выполняться визуально или с помощью соответствующего устройства. Способы детектирования мРНК или продуктов экспрессии известны специалисту в данной области техники.

Альтернативно, уровень нуклеиновой кислоты маркерного гена(ов) или экспрессии GOI можно определить с использованием подходов ДНК-чипа или ДНК-микрочипа. Как правило, образцы нуклеиновых кислот, полученные от пациентов, подлежащих тестированию, обрабатывают и метят, предпочтительно флуоресцентной меткой. Затем такие молекулы нуклеиновых кислот могут использоваться в подходе гибридизации с иммобилизованными захватывающими зондами, соответствующими маркерным генам по настоящему изобретению. Специалисту в данной области известны подходящие средства для проведения анализов на микрочипах.

В стандартной процедуре ДНК-чип или ДНК-микрочип содержит иммобилизованные зонды с высокой плотностью для детектирования ряда генов. Зонды на чипе комплементарны одному или нескольким участкам последовательности маркерных генов. Как правило, кДНК, ПЦР-продукты и олигонуклеотиды пригодны в качестве зондов.

Способ детектирования на основе ДНК-чипа или на основе ДНК-микрочипа обычно включает следующие стадии: (1) выделение мРНК из образца и необязательное превращение мРНК в кДНК и последующее мечение данной РНК или кДНК. Способы выделения РНК, превращения ее в кДНК и мечения нуклеиновых кислот описаны в руководствах по технологии микрочипов. (2) Гибридизация нуклеиновых кислот со стадии 1 с зондами для маркерных генов. Нуклеиновые кислоты из образца можно метить красителем, таким как флуоресцентные красители Cy3 (красный) или Cy5 (синий). Обычно контрольный образец метят другим красителем. (3) Детектирование гибридизации нуклеиновых кислот из образца с помощью зондов и определение, по меньшей мере, качественно, и более предпочтительно количественно, количеств мРНК в образце для исследованных маркерных генов. Разницу в уровне экспрессии между образцом и контролем можно оценить на основании разницы в интенсивности сигналов. Ее можно измерить и анализировать с помощью соответствующего программного обеспечения, такого как, не ограничиваясь этим, программное обеспечение, предоставленное, например, Affymetrix.

Отсутствует ограничение на количество зондов, соответствующих используемым маркерным генам, которые наносят на ДНК-чип. Кроме того, маркерный ген может быть представлен двумя или более зондами, где зонды гибридизуются с различными участками гена. Зонды конструируют для каждого выбранного маркерного гена. Такой зонд обычно представляет собой олигонуклеотид, содержащий 5-50 нуклеотидных остатков. Более длинные ДНК могут быть синтезированы с помощью ПЦР или химически. Способы синтеза таких олигонуклеотидов и их нанесение на подложку хорошо известны в области микрочипов. Также на ДНК-чип можно нанести гены, отличные от маркерных генов. Например, зонд для гена, уровень экспрессии которого достоверно не изменяется, можно нанести на ДНК-чип для нормализации результатов анализа или для сравнения результатов анализа множества чипов или разных анализов.

Альтернативно, уровень нуклеиновой кислоты маркерного гена(ов) или экспрессии GOI можно определить в количественном варианте ОТ-ПЦР, предпочтительно ПЦР в режиме в режиме реального времени после обратной транскрипции транскриптов, представляющих интерес. Как правило, в качестве первой стадии транскрипт подвергают обратной транскрипции в молекулу кДНК в соответствии с любым подходящим способом, известным специалисту в данной области. Затем можно выполнить количественный вариант ПЦР или ПЦР в режиме реального времени на основе первой ДНК-цепи, полученной, как описано выше.

Предпочтительно для количественного определения ПЦР можно использовать зонды Taqman или Molecular Beacon в качестве основных зондов на основе FRET данного типа. В обоих случаях зонды служат в качестве внутренних зондов, которые используются в сочетании с парой противоположных праймеров, которые фланкируют интересующую область мишени, предпочтительно набор специфических олигонуклеотидов маркерного гена(ов), как здесь определено выше. После амплификации сегмента-мишени зонд может избирательно связываться с продуктами в идентифицируемой последовательности между сайтами праймера, тем самым вызывая усиление FRET-сигналов по сравнению с частотой мишени.

Предпочтительно, зонд Taqman, используемый в методе количественной ПЦР по настоящему изобретению, может содержать специфический олигонуклеотид, как определено выше, примерно из 22 до 30 оснований, который метят на обоих концах FRET-парой. Как правило, на 5'-конце будет находиться флуорофор с более короткой длиной волны, такой как флуоресцеин (например, FAM), и на 3'-конце обычно находится флуоресцентный гаситель с более длинной длиной волны (например, TAMRA) или нефлуоресцентный гаситель (например, гаситель Black Hole). Предпочтительно, чтобы зонды, используемые для количественной ПЦР, в частности, зонды, как здесь определено выше, не содержали гуанин (G) на 5'-конце, смежным с репортерным красителем, для избежания гашения флуоресценции репортера после деградации зонда.

При применении зонда Molecular Beacon в количественном методе ПЦР по настоящему изобретению, предпочтительно используют FRET-взаимодействия для детектирования и количественного определения продукта ПЦР, где каждый зонд имеет 5'-конец, меченный флуоресцентной меткой, и 3'-конец, меченный гасителем флуоресценции. Данная конфигурация зонда в виде «шпильки» или «стебля-петли» предпочтительно содержит стебель с двумя короткими самосвязывающимися концами и петлю с длинным внутренним участком, специфичным для мишени, примерно из 20-30 оснований.

Альтернативные механизмы детектирования, которые также могут быть использованы в контексте настоящего изобретения, направлены на зонд, сконструированный таким образом, что в нем имеется только структура «петли», и отсутствует короткая комплементарная область «стебля». Альтернативный подход на основе FRET для количественной ПЦР, который также может быть использован в контексте настоящего изобретения, основан на применении двух гибридизующихся зондов, которые связываются с соседними сайтами на мишени, где первый зонд имеет флуоресцентную донорную метку на 3'-конце, и второй зонд имеет флуоресцентную акцепторную метку на своем 5'-конце.

В еще одном варианте осуществления в качестве следующей дополнительной стадии, заключение в отношении присутствия или стадии злокачественной опухоли или прогрессирования злокачественной опухоли может быть основано на результатах стадии сравнения. Злокачественная опухоль предстательной железы может быть диагностирована или прогнозирована, или прогрессирование к злокачественной опухоли предстательной железы может быть диагностировано или прогнозировано в указанном способе, согласно соответствующим определениям, приведенным здесь выше, в контексте маркерного гена(ов) или GOI в качестве маркера злокачественной опухоли предстательной железы.

В еще одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу обнаружения, диагностики, мониторинга или прогнозирования (агрессивного) рака предстательной железы или прогрессирования к (агрессивному) раку предстательной железы, включающему, по меньшей мере, следующие стадии:

(а) тестирование, по меньшей мере, одного образца, полученного, по меньшей мере, от одного субъекта, предположительно страдающего раком предстательной железы, на уровень экспрессии продуктов экспрессии GOI;

(b) тестирование, по меньшей мере, одного контрольного образца на уровень экспрессии продукта экспрессии GOI;

(c) определение разницы в экспрессии на стадиях (a) и (b); и

(d) принятие решения о наличии или стадии рака предстательной железы или о прогрессировании к агрессивному раку предстательной железы на основе результатов, полученных на стадии (с).

В еще одном варианте осуществления стадии а), b), с) и/или d) данного способа диагностики могут быть выполнены вне организма человека или животного, например, на образцах, полученных от пациента или субъекта.

В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к способу диагностики, мониторинга или прогнозирования, например, агрессивного рака предстательной железы, или прогрессирования к агрессивному раку предстательной железы, где указанный способ дает возможность различить доброкачественную опухоль и агрессивный рак предстательной железы, включающий стадии:

(а) определение уровня маркерного гена(ов) или GOI;

(b) определение уровня экспрессии референсного гена в образце;

(c) нормализация измеренного уровня экспрессии маркерного гена(ов) или GOI к экспрессии референсного гена; и

(d) сравнение нормализованного уровня экспрессии с заранее определенным пороговым значением, выбранным для исключения доброкачественной опухоли предстательной железы, где нормализованный уровень экспрессии выше порогового значения указывает на агрессивный рак предстательной железы, где указанное пороговое значение составляет от -2 до +2, предпочтительно примерно 0.

Результаты экспрессии могут быть нормализованы в соответствии с любым подходящим способом, известным специалисту в данной области. Как правило, такие тесты или соответствующие формулы, которые известны специалисту в данной области, используют для стандартизации данных экспрессии, чтобы обеспечить дифференциацию реальных изменений уровней экспрессии генов и вариаций за счет самих процессов измерения. Для микрочипов в качестве метода нормализации может использоваться фоновая поправка Robust Multiarray Avarage (RMA).

В конкретном варианте осуществления нормализованные значения получают путем применения следующего:

N (Cq_{представляющего интерес гена})=среднее значение (Cq_{референсного гена}) - (Cq_{представляющего интерес гена})

где N (Cq_{представляющего интерес гена}) является нормализованным значением генной экспрессии для выбранных генов, представляющих интерес; где среднее значение (Cq_{референсного гена}) представляет среднее арифметическое из значений PCR Cq выбранной комбинации референсных генов; где (Cq_{представляющего интерес гена}) представляет собой значение ПЦР Cq представляющего интерес гена.

В конкретном варианте осуществления нормализованные значения получают путем применения следующего:

N (Cq_{представляющего интерес гена})=среднее значение (Cq_{референсного гена}) - (Cq_{представляющего интерес гена})

где N (Cq_{представляющего интерес гена}) является нормализованным значением генной экспрессии для выбранных генов, представляющих интерес; где среднее значение (Cq_{референсного гена}) является средним арифметическим из значений ПЦР Cq, по меньшей мере, двух референсных генов, выбранных из TBP, HPRT1, ACTB, RPLP0, POLR2A, B2M, PUM1, K-ALPHA-1 и ALAS-1; где (Cq_{представляющего интерес гена}) представляет собой значение ПЦР Cq представляющего интерес гена.

В конкретном варианте осуществления нормализованные значения получают путем применения следующего:

N (Cq_{представляющего интерес гена})=среднее значение (Cq_{референсного гена}) - (Cq_{представляющего интерес гена})

где N (Cq_{представляющего интерес гена}) является нормализованным значением генной экспрессии для выбранных генов, представляющих интерес; где среднее значение (Cq_{референсного гена}) является средним арифметическим из значений ПЦР Cq референсных генов, выбранных из TBP, HPRT1, ACTB и RPLP0; где (Cq_{представляющего интерес гена}) представляет собой значение ПЦР Cq представляющего интерес гена.

В конкретном варианте осуществления нормализованные значения получают путем применения следующего:

N (Cq_{представляющего интерес гена})=среднее значение (Cq_{референсного гена}) - (Cq_{представляющего интерес гена})

где N (Cq_{представляющего интерес гена}) является нормализованным значением генной экспрессии для выбранных генов, представляющих интерес; где среднее значение (Cq_{референсного гена}) является средним арифметическим из значений ПЦР Cq референсных генов, выбранных из TBP, HPRT1, PUM1, K-ALPHA-1 и ALAS-1; где (Cq_{представляющего интерес гена}) представляет собой значение ПЦР Cq представляющего интерес гена.

Типичные референсные гены включают, среди прочего, гены TATA-связывающего белка человека (TBP), гипоксантинфосфорибозилтрансферазы человека 1 (HPRT1), бета-актина человека, мРНК (ACTB), кислого рибосомального фосфопротеина PO мРНК 60S (RPLP0), члена 1 РНК-связывающего семейства pumilio (PUM1), полипептида А РНК-полимеразы II (ДНК-направленной), 220 кДа (POLR2A), бета-2-микроглобулина (B2M), тубулина-альфа-1b (K-ALPHA-1), аминолевулинатсинтазы дельта (ALAS-1).

В предпочтительном варианте осуществления комбинация референсных генов выбрана из генов TATA-связывающего белка человека (TBP), гипоксантинфосфорибозилтрансферазы человека 1 (HPRT1), бета-актина человека, мРНК (ACTB), кислого рибосомального фосфопротеина PO мРНК 60S (RPLP0), члена 1 РНК-связывающего семейства pumilio (PUM1), полипептида А РНК-полимеразы II (ДНК-направленной), 220 кДа (POLR2A), бета-2-микроглобулина (B2M), тубулина-альфа-1b (K-ALPHA-1), аминолевулинатсинтазы дельта (ALAS-1).

В конкретном варианте осуществления уровень экспрессии сигнатурного гена нормализуется к экспрессии референсного гена, где референсный ген предпочтительно является геном домашнего хозяйства, и ген домашнего хозяйства предпочтительно представляет собой TBP, HPRT1, ACTB, RPLP0, PUM1, POLR2A или B2M.

В еще одном предпочтительном варианте осуществления комбинация референсных генов включает TBP, HPRT1 и, по меньшей мере, один, по меньшей мере, два или, по меньшей мере, три дополнительных контрольных гена, выбранных из группы, включающей ACTB, RPLP0, PUM1, POLR2A, B2M, K-ALPHA-1 (TUBA1B) или ALAS-1.

В еще одном предпочтительном варианте осуществления комбинация референсных генов включает TBP, HPRT1 и, по меньшей мере, два дополнительных референсных гена, выбранных из группы, включающей ACTB, RPLP0, PUM1, K-ALPHA-1 (TUBA1B) или ALAS-1.

Особенно предпочтительной комбинацией является комбинация TBP, HPRT1, ACTB, RPLP0. Еще одной особенно предпочтительной комбинацией является компбинация TBP, HPRT1, PUM1, K-ALPHA-1, ALAS-1.

Подробное описание референсных генов, включая их идентификатор транскрипта (NCBI RefSeq) и SEQ ID NO соответствующей нуклеотидной последовательности, идентификатор белка (инвентарный номер белка) и SEQ ID NO соответствующей аминокислотной последовательности, приведены на фиг. 10. Также на фиг. 10 для каждого референсного гена раскрывается прямой праймер, обратный праймер для получения ампликона, который является специфичным для референсного гена, и последовательность зонда, который специфически связывается с ампликоном. Уровень экспрессии маркерного гена(ов) или GOI может быть определен на нуклеиновой кислоте, как описано выше. Предпочтительным является определение уровня экспрессии маркерного гена(ов) или транскрипта(ов) GOI. Кроме того, можно определить уровень гена домашнего хозяйства в образце.

Как здесь используется, термин «референсный ген» относится к любому подходящему гену, например, к любому постоянно экспрессируемому и постоянно детектируемому гену, генному продукту, продукту экспрессии, белку или белковому варианту в выбранном организме.

Экспрессия может быть предпочтительно осуществлена в одном и том же образце, т. е. уровень маркерного гена(ов) или GOI и референсного гена определяется в одном и том же образце. Если тестирование проводится на одном и том же образце, то может быть выполнен подход однократного детектирования или многократного детектирования, как здесь описано. Для выполнения многократного детектирования можно модифицировать концентрацию праймеров и/или олигонуклеотидов зонда. Кроме того, концентрацию и присутствие дополнительных ингредиентов, таких как буферы, ионы и т. д., можно модифицировать, например, повысить или снизить по сравнению с рекомендациями изготовителей.

Кроме того, результаты по экспрессии можно сравнить с уже известными результатами из ссылочных случаев или баз данных. Сравнение может дополнительно включать процедуру нормализации для повышения статистической значимости результатов.

Результаты по экспрессии можно нормализовать в соответствии с любым подходящим способом, известным специалисту в данной области, например, в соответствии со статистическими методами нормализации, такими как стандартная оценка, t-критерий Стьюдента, стьюдентизированный остаточный тест, стандартизованный моментный тест или показатель коэффициент вариации. Как правило, такие тесты или соответствующая формула, которые известны специалисту в данной области, будут использоваться для стандартизации данных по экспрессии для того, чтобы обеспечить дифференциацию между реальными изменениями уровней экспрессии генов и изменениями, обусловленными самими способами измерения.

На основании результатов по экспрессии, полученных на стадиях (а) и (b) и/или нормализованных результатов, полученных на стадии (с), можно провести сравнение с пороговым значением для уровней экспрессии GOI. Пороговое значение, выше которого уровень экспрессии маркерного гена(ов) или GOП указывает на агрессивный рак предстательной железы, тем самым исключая доброкачественные формы опухолей предстательной железы или здоровые ситуации или формы здоровых тканей, составляет примерно от -3 до +3, от -3 до +2,75, от -3 до +2,5, от -3 до +2,25, от -3 до +2, от -3 до +1,75, от -3 до +1,5, от -3 до +1,25, от -3 до +1, от -3 до +0,75, от -3 до +0,5, от -3 до +0,25, от -3 до 0, от -2,75 до +3, от -2,5 до +3, от -2,25 до +3, от -2 до +3, от -1,75 до +3, от -1,5 до +3, от -1,25 до +3, от -1 до +3, от -0,75 до +3, -0,5 до +3, от -0,25 до +3, от 0 до +3. Более предпочтительным является пороговое значение примерно 0, например, 0,9, 0,8, 0,7, 0,6, 0,5, 0,4, 0,3, 0,2, 0,1 или -9, -0,8, -0,7, -0,6, -0,5, -0,4, -0,3, 0,2 или -0,1.

Если измеренные и/или нормализованные уровни экспрессии ниже указанного порогового значения, то это можно рассматривать как указание на, что субъект здоров в отношение наличия опухолей предстательной железы или страдает только доброкачественными опухолями предстательной железы, но не агрессивной формой рака предстательной железы.

В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к способу сбора данных, включающему, по меньшей мере, стадии:

(а) тестирование у субъекта экспрессии маркерного гена(ов) или GOI; и

(b) сравнение экспрессии, определенной на стадии (а), с контрольным уровнем. Тестирование на экспрессию маркерного гена(ов) или GOI можно проводить в соответствии со стадиями, описанными выше. Предпочтительно тестирование можно проводить в виде измерения нуклеиновой кислоты маркерного гена(ов) или GOI. Тестирование может проводиться у субъекта, т. е. in vivo, или вне организма субъекта, т. е. ex vivo или in vitro. Термин «контрольный уровень», используемый в контексте способа сбора данных, относится к экспрессии генов-маркеров, упомянутых здесь, или других подходящих маркеров в нормальном контроле или злокачественном контроле, как здесь определено выше. Статус, характер, количество и состояние контрольного уровня можно корректировать при необходимости. Предпочтительно может использоваться нормальный здоровый контрольный уровень. Сравнение экспрессии с контрольным уровнем может быть выполнено в соответствии с любым подходящим методом оценки, вычисления, характеристики или обработки данных и, в частности, оно направлено на обнаружение различий между двумя рядами данных. Кроме того, может быть проведена статистическая оценка значимости разницы. Специалистам в данной области известны подходящие статистические методы. Полученные данные и информация могут храниться, накапливаться или обрабатываться с помощью соответствующей информационных или компьютерных методов или инструментов, известных специалисту в данной области техники, и/или могут быть представлены соответствующим образом, чтобы позволить практику использовать данные для одной или нескольких последующих стадий обобщения или заключения.

Кроме того, можно определить уровень референсного гена, как определено здесь выше, в образце. Альтернативно, определение референсного гена может быть проведено любым другим подходящим агентом или в сочетании с обнаружением присутствия или количества нуклеиновых кислот, как здесь описано.

В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к способу идентификации субъекта, подходящего для лечения рака предстательной железы, включающему:

(а) тестирование в образце, полученном от субъекта, экспрессии маркерного гена(ов) или GOI;

(b) тестирование в указанном образце экспрессии референсного гена и/или тестирование в контрольном образце экспрессии маркерного гена(ов) или GOI;

(c) классификация уровней экспрессии на стадии (a) относительно уровней на стадии (b); и вычисление соответствующих PCPI;

(d) идентификация субъекта, как подходящего для лечения рака предстательной железы, где образец субъекта классифицируется как имеющий повышенный или пониженный уровень экспрессии маркерного гена(ов) или GOI, или PCPI, что указывает на агрессивное заболевание.

Как используется здесь, термин «классификация уровней экспрессии на стадии (а) относительно уровней на стадии (b)», означает, что сравнивается экспрессия GOI в тестируемом образце и экспрессия GOI в контрольном образце, например, после нормализации относительно подходящих референсных значений для нормализации и/или после вычисления соответствующих PCPI.

Согласно расчетам PCPI, субъект может считаться подходящим для лечения рака предстательной железы, когда уровни экспрессии генов достоверно отличаются по сравнению с контрольным образцом.

Как используется здесь, термин «стратификация субъекта или когорты субъектов для терапии рака предстательной железы» означает, что субъект идентифицирован как принадлежащий к группе схожих субъектов, для которых оптимальная форма лечения представляет собой лечение рака предстательной железы, например, лечение в соответствии с результатами расчета PCPI, как описано выше.

Субъект считается пригодным для лечения рака предстательной железы или стратифицированным для лечения рака предстательной железы, как описано выше, может получать любое подходящее терапевтическое лечение для этой формы рака предстательной железы, известное специалисту в данной области. В частности, как здесь используется, термин «лечение рака предстательной железы», относится к любой подходящей терапии рака предстательной железы, известной специалисту в данной области, и предпочтительно включает хирургическую кастрацию путем удаления яичек в качестве основного органа секреции мужских половых гормонов, химическую кастрацию, например, гормональную терапию, такую как подавление синтеза андрогенов или ингибирование активности рецепторов андрогенов, цитотоксическую терапию, химиотерапию, лучевую терапию (наружную лучевую терапию, брахитерапию), криотерапию, фокальную терапию, такую как абляция HIFU (высокочастотная ультразвуковая абляция предстательной железы), или термическую абляцию или их комбинации, предпочтительно комбинацию гормональной терапии и лучевой терапии.

Как правило, субъект, который считается подходящим для лечения рака предстательной железы, может считаться страдающим (агрессивным) раком предстательной железы или предрасположенным к его развитию в будущем, например, в течение последующих 1-24 месяцев. Соответственно идентифицированный или стратифицированный субъект может быть подвергнут лечению ингибиторной фармацевтической композицией. В еще одном варианте осуществления соответственно идентифицированного субъекта можно лечить ингибиторной фармацевтической композицией в комбинации с дополнительной терапией рака. Термин «дополнительная терапия рака» относится к любым типам терапии рака, известным специалисту в данной области. Предпочтительными являются виды лечения рака, известные для рака предстательной железы. Данный термин включает, например, все подходящие формы химиотерапии, лучевой терапии, хирургической операции, терапии антителами и т. д.

Альтернативно, соответственно идентифицированный или стратифицированный субъект также можно лечить только одним или несколькими методами лечения рака, такими как химиотерапия, лучевая терапия, хирургическая операция, терапия антителами и т. д. Предпочтительными являются методы лечения рака, обычно используемые для рака предстательной железы, более предпочтительны методы лечения рака, используемые для лечения агрессивной формы рака предстательной железы.

В дополнительном варианте осуществления настоящего изобретения способ классификации по пригодности или для стратификации, как описано выше, может также использоваться для мониторинга лечения субъекта, например, субъекта, классифицированного как страдающего агрессивной формой рака предстательной железы. Процесс мониторинга может быть выполнен в виде определения экспрессии в течение длительного периода времени, например, во время или после курсов лечения, в течение 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 недель, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 месяцев или 1, 2, 3 или более лет. Стадии определения могут быть выполнены с подходящими интервалами, например, каждую неделю, 2 недели, 3 недели, каждый месяц, 2 месяца, 3 месяца, 6 месяцев, 12 месяцев и т. д. В дополнительном варианте осуществления настоящего изобретения любую схему лечения, упомянутую выше, можно корректировать, усилить или ослабить, изменить любым подходящим образом в соответствии с результатами процесса мониторинга.

В дополнительном варианте осуществления настоящего изобретения способ идентификации субъекта, подходящего для лечения агрессивного рака предстательной железы, на основе экспрессии маркерного гена(ов) или GOI и соответствующего PCPI, как здесь описано выше, затем можно объединить с одним или несколькими аналогичными способами идентификации, основанными на экспрессии одного или нескольких других биомаркеров. Предпочтительным является определение уровня простатспецифического антигена (ПСА) в крови. Таким образом, если уровень ПСА в крови находится в диапазоне примерно от 2 до 5 нг/мл или выше, предпочтительно от 2,2 до 4,8 нг/мл или выше, от 2,4 до 4,4 нг/мл или выше, от 2,6 до 4,2 нг/мл или выше, или от 2,8 до 4,0 нг/мл или выше, более предпочтительно от примерно 2,5 до 4 нг/мл или выше, то субъект может считаться страдающим злокачественной опухолью предстательной железы, или у него имеется вероятность развития злокачественной опухоли предстательной железы в ближайшем будущем, т. е. в течение следующих 1, 2, 3, 4, 5, 6, 12, 14, 48 месяцев. Тестирование на экспрессию маркерного гена(ов) или GOI и определение PCPI может проводиться в соответствии со стадиями, описанными выше.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения диагностирование, обнаружение, мониторинг или прогнозирование, как упомянуто выше, должно проводиться на образце, полученном от субъекта. Как здесь используется, термин «образец, полученный от субъекта» относится к любому биологическому материалу, полученному с помощью подходящих методов, известных специалисту в данной области, от субъекта. Образец, используемый в контексте настоящего изобретения, предпочтительно должен быть отобран клинически приемлемым образом, более предпочтительно таким образом, чтобы сохранялись нуклеиновые кислоты (в частности, РНК) или белки.

Биологические образцы могут включать ткани и жидкости организма, такие как кровь, пот и моча. Кроме того, биологический образец может содержать клеточный экстракт, полученный из клеточной популяции, включающей эпителиальную клетку, предпочтительно злокачественную эпителиальную клетку или эпителиальную клетку, полученную из ткани, предположительно являющейся злокачественной. Еще более предпочтительно, чтобы биологический образец мог содержать клеточную популяцию, полученную из железистой ткани, например, образец может быть получен из предстательной железы мужчины. Кроме того, при необходимости клетки можно выделить из полученных тканей и жидкостей организма, и затем использовать в качестве биологического образца.

Образцы, в частности после первоначальной обработки, можно объединить. Однако также могут использоваться необъединенные образцы.

В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения содержание биологического образца также можно подвергнуть стадии обогащения. Например, образец может контактировать с лигандами, специфичными к клеточной мембране или органеллам определенных типов клеток, например, клеток предстательной железы, функционализированных, например, магнитными частицами. Материал, концентрированный с помощью магнитных частиц, затем можно использовать для стадий детектирования и анализа, как здесь описано выше или ниже.

В конкретном варианте осуществления изобретения могут быть получены и/или использованы образцы, полученные при биопсии или резекции. Такие образцы могут содержать клетки или клеточные лизаты.

Кроме того, клетки, например, опухолевые клетки, можно обогатить способами фильтрации текучих или жидких образцов, например, крови, мочи и т. д. Такие способы фильтрации также можно объединить со стадиями обогащения на основе лиганд-специфических взаимодействий, как здесь описано выше.

В особенно предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения образец может представлять собой образец ткани, образец, полученный при биопсии, образец мочи, образец осадка мочи, образец крови, образец слюны, образец спермы, образец, содержащий циркулирующие опухолевые клетки, или образец, содержащий секретируемые предстательной железой экзосомы. Образец крови может быть, например, образцом сыворотки или образцом плазмы.

При лечении рака предстательной железы можно использовать соединения или фармацевтические композиции, активные против злокачественных клеток. Фармацевтическая композиция может включать ингибиторы гормонов, предпочтительно антиандрогены или антагонисты андрогенов, такие как спиронолактон, ципротеронацетат, флутамид, нилутамид, бикалутамид, кетоконазол, финастерид или дутастерид.

В еще одном конкретном варианте осуществления настоящее изобретение предусматривает способ мониторинга развития рака предстательной железы, который включает определение маркерного гена(ов) или GOI, предпочтительно в комбинации с определением референсного гена, как здесь описано выше, в течение определенного периода времени, т. е. после повторных стадий определения, например, каждые 4 недели, 6 недель, два месяца, 4 месяца, 6 месяцев, 8 месяцев, 12 месяцев, 1,5 года, 2 года, 2,5 года, 3 года, 4 года или любой другой подходящий период времени и т. д. Способ может предоставлять данные показывающие увеличение или уменьшение уровня маркерного гена(ов) или GOI по сравнению с контролями, например, незлокачественным контролем, злокачественным контролем, или более ранними данными, полученными от одного и того же субъекта. С помощью подходящих статистических методов, известных специалисту в данной области, можно определить положение внутри указанной кривой. В зависимости от положения внутри указанной кривой, т. е. в возрастающем участке или нисходящем участке указанной кривой, может быть диагностировано наличие рака предстательной железы или его развитие в будущем. Соответственно, предусматривается применение фармацевтических композиций. Предпочтительно любое такое определение можно объединить с определением вторичных биомаркеров, например, маркеров рака предстательной железы, в частности, ПСА. В случае низких уровней ПСА (до 2,0-4,0 нг/мл) данные GOI могут интерпретироваться как наличие раннего рака предстательной железы, т. е. доброкачественной опухоли или гормонозависимой/гормоночувствительной злокачественной опухоли предстательной железы. В случае более высоких уровней ПСА (выше примерно 20 нг/мл, например, примерно 30, 40 или 50 нг/мл) данные могут интерпретироваться как наличие более распространенного рака предстательной железы, например, гормонорезистентного рака предстательной железы.

Как здесь используется, «стадия I-IV гормоночувствительного рака предстательной железы» обозначает рак предстательной железы, который можно классифицировать согласно системе TNM Международным союзом против рака (UICC) на стадии I-IV.

Как здесь используется, «гормоночувствительный рецидивирующий рак предстательной железы» обозначает рак предстательной железы, рост и прогрессирование которого регулируется и зависит от мужского полового гормона. Предпочтительным примером такого мужского полового гормона является андроген.

Как здесь используется, «гормоночувствительный метастатический рак предстательной железы» обозначает рак предстательной железы, рост и прогрессирование которого регулируется и зависит от мужского полового гормона. Предпочтительным примером такого мужского полового гормона является андроген.

Как здесь используется, «гормононечувствительный рак предстательной железы» обозначает рак предстательной железы, рост и прогрессирование которого не регулируются и не зависят от мужского полового гормона. Предпочтительным примером такого мужского полового гормона является андроген.

Еще один аспект изобретения относится к компьютерному программному продукту, содержащему считываемый компьютером код, хранящийся на машиночитаемом носителе или загружаемый из сети связи, который при запуске на компьютере реализует одну или более стадий или все стадии любого описанных здесь способов.

Может использоваться любая комбинация одного или нескольких считываемых компьютером носителей. Считываемый компьютером носитель может представлять собой считываемый компьютером носитель сигнала или считываемый компьютером носитель данных. Считываемый компьютером носитель данных, например, не ограничиваясь этим, может представлять электронную, магнитную, оптическую, электромагнитную, инфракрасную или полупроводниковую систему, аппаратуру или устройство, или любую подходящую комбинацию вышеуказанного. Более конкретные примеры (неисчерпывающий список) считываемого компьютером носителя включают следующее: электрическое соединение с одним или более проводами, портативную компьютерную дискету, жесткий диск, оперативную память (RAM), постоянную память (ROM), стираемую программируемую постоянную память (EPROM или флэш-память), оптическое волокно, и портативную постоянную память на компактных дисках (CD-ROM), оптическое запоминающее устройство, магнитное запоминающее устройство, или любую другую подходящую комбинацию вышеуказанного. В контексте данного документа считываемый компьютером носитель может представлять собой любой материальный носитель, который может содержать или хранить программу для использования или в связи с системой, аппаратурой или устройством выполнения команд.

Считываемый компьютером носитель сигнала может включать передаваемый сигнал данных со считываемым программным кодом, воплощенным в нем, например, в полосе частот или как часть несущей волны. Такой передаваемый сигнал может принимать любую из множества форм, включая, не ограничиваясь этим, электромагнитную, оптическую или любую подходящую их комбинацию. Считываемый компьютером носитель сигнала может представлять собой любой считываемый компьютером носитель, который не является считываемым компьютером запоминающим носителем и который может связывать, передавать или транспортировать программу для использования или в связи с системой, аппаратурой или устройством выполнения команд.

Программный код, воплощенный на считываемом компьютером носителе, может быть передан с использованием любого подходящего носителя, включая, не ограничиваясь этим, беспроводной, проводной, волоконно-оптический кабель, RF и т. д., или любую подходящую комбинацию вышеуказанного.

Компьютерный программный код для выполнения операций для аспектов настоящего изобретения может быть записан в любой комбинации одного или нескольких языков программирования, включая объектно-ориентированный язык программирования, такой как Java, Smalltalk, C++ или т.п. и обычные процедурные языки программирования, такие как язык программирования «C» или аналогичные языки программирования. Программный код может полностью выполняться на компьютере пользователя, частично на компьютере пользователя, в виде автономного программного пакета, частично на компьютере пользователя, и на частично удаленном компьютере или на полностью удаленном компьютере или сервере. В последнем случае удаленный компьютер может быть подключен к компьютеру пользователя через сеть любого типа, включая локальную сеть (LAN) или глобальную сеть (WAN), или соединение может быть выполнено с внешним компьютером (например, через интернет через ннтернет-провайдер).

Данные команды компьютерной программы также могут сохраняться на считываемом комьютером носителе, который может направить компьютер, другое программируемое устройство обработки данных или другие устройства для функционирования определенным образом, так что команды, хранящиеся на считываемом компьютером носителе, производят изделие производства, включая инструкции, которые реализуют указанную здесь функцию/действие.

Команды компьютерной программы также могут быть загружены на компьютер, другое программируемое устройство обработки данных или на другие устройства, чтобы вызвать ряд рабочих стадий, которые должны выполняться на компьютере, другом программируемом устройстве или других устройствах для создания процесса, реализованного компьютером, так, что команды, которые выполняются на компьютере или другом программируемом устройстве, обеспечивают процессы для реализации указанных здесь функций/действий.

Если не указано иное, то все технические и научные термины, используемые здесь, имеют то же значение, которое обычно понимается специалисту в данной области техники, к которой относится настоящее изобретение.

Следующие примеры и фигуры приведены для иллюстративных целей. Таким образом, понятно, что примеры и фигуры не должны рассматриваться в качестве ограничивающих. Специалист в данной области, очевидно, сможет предусмотреть дополнительные модификации принципов, изложенных здесь.

Примеры

Пример 1 - Выбор гена для создания прогностического индекса рака предстательной железы (PCPI)

Для выбора генов-кандидатов для создания PCPI были исследованы различные молекулярные пути (приведенные на http://csbi.ltdk.helsinki.fi/anduril/tcga-gbm/table4_2.html) в отношение корреляции предполагаемого прогностического маркерного гена PDE4D7, как описано в международных заявках WO2010131194 и WO2010131195. Молекулярные пути, показавшие достоверную корреляцию, были выбраны для даунстрим анализа (фиг. 1).

Кроме того, гены-кандидаты, связанные с метастатическим и/или гормонорефрактерным раком предстательной железы, были выбраны из следующих литературных ссылок:

Gorlov I.P. et al. Candidate pathways and genes for prostate cancer: a meta-analysis of gene expression data; BMC Medical Genomics 2009, 2:48;

Stanbrough M. et al: Increased Expression of Genes Converting Adrenal Androgens to Testosterone in Androgen-Independent Prostate Cancer; Cancer Res 2006;66:2815-2825;

Tamura K. et al. Molecular Features of Hormone-Refractory Prostate Cancer Cells by Genome-Wide Gene Expression Profiles; Cancer Res 2007; 67(11):5117-25;

Lapointe J. et al. Gene expression profiling identifies clinically relevant subtypes of prostate cancer; PNAS 2003; 101(3):8110816;

Sun Y. et al. Optimizing Molecular Signatures for Predicting Prostate Cancer Recurrence. The Prostate, 69:1119-1127 (2009).

В целом для дальнейшего анализа было отобрано 967 генов (см. фиг. 1), которые потенциально связаны с прогрессированием рака предстательной железы.

Для построения прогностической 19-генной сигнатуры, т. е. набора маркерных генов, представляющих интерес, были использованы данные из следующих ссылок:

Taylor B.S. et al. Integrative Genomic Profiling of Human Prostate Cancer. Cancer Cell 18, 11-22, 2010 (GEO data set ID: GSE21032);

Boormans J.L. et al. Identification of TDRD1 as a direct target gene of ERG in primary prostate cancer. Int J Cancer 2013 Jul 15; 133(2):335-45 (GEO data set ID: GSE41408);

Sun Y. et al. Optimizing Molecular Signatures for Predicting Prostate Cancer Recurrence. The Prostate, 69:1119-1127 (2009) (GEO data set ID: GSE25136);

Sboner A. et al. Molecular sampling of prostate cancer: a dilemma for predicting disease progression. BMC Medical Genomics 2010, 3:8 (GEO data set ID: GSE16560);

Nagakawa T. et al. A Tissue Biomarker Panel Predicting Systemic Progression after PSA Recurrence Post-Definitive Prostate Cancer Therapy. PLoS ONE 3(5), e2318 (2010) (GEO data set ID: GSE10645).

Для дальнейшего тестирования и валидации полученного прогностического индекса рака предстательной железы (PCPI) были использованы данные из следующей ссылки:

Erho N. et al. Discovery and Validation of a Prostate Cancer Genomic Classifier that Predicts Early Metastasis Following Radical Prostatectomy. PLoS One 8(6), e66855 (2013) (GEO data set ID: GSE46691).

Обработка данных GSE по экспрессии гена

Соответствующие файлы CEL были загружены из базы данных экспрессии GEO (Gene Expression Omnibus): http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/. Данные файла CEL были загружены в Expression Console (Affymetrix Inc; Build 1.3.1.187) и были предварительно обработаны с использованием соответствующих аннотационных файлов к набору зондов, предоставленных Affymetrix Inc., где это необходимо, т.е. ряды данных на платформе Affymetrix Inc: GSE21032, GSE41408, GSE25136. Для рядов данных платформе DASL (т. е. GSE16560, GSE10645), файлы матриц серии данных использовались, как приведено GEO для анализа даунстрим данных.

Референсные гены должны иметь стабильную экспрессию независимо от испытуемого образца и, следовательно, их можно использовать в качестве внутреннего стандарта для нормализации выходных значений ПЦР Cq, чтобы результаты были сопоставимы независимо от используемого входного количества образца. Несмотря на то, что такие гены должны быть стабильными, в их экспрессии всегда присутствует некоторая изменчивость, и стабильность также может зависеть от анализируемой ткани. По этой причине рекомендуется использовать более одного референсного гена для нормализации значений ПЦР Cq и использовать набор генов, которые характеризуются низкой изменчивостью в конкретном типе анализируемой ткани/образца (C. L. Andersen, J. L. Jensen, and T. F. Ørntoft, «Normalization of Real-Time Quantitative Reverse Transcription-PCR Data: A Model-Based Variance Estimation Approach to Identify Genes Suited for Normalization, Applied to Bladder and Colon Cancer Data Sets», Cancer Res., vol. 64, no. 15, pp. 5245-5250, Aug. 2004; J. Vandesompele, K. De Preter, F. Pattyn, B. Poppe, N. Van Roy, A. De Paepe, and F. Speleman, «Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes», Genome Biol., vol. 3, no. 7, p. RESEARCH0034, Jun. 2002).

Первоначально отобрали 9 референсных генов для использования в данном исследовании. Окончательный выбор набора референсных генов, используемых для нормализации данных, выполняли с использованием программного обеспечения Biogazelle (qBase+ with GeNorm analysis J. Hellemans, G. Mortier, A. D. Paepe, F. Speleman, and J. Vandesompele, «qBase relative quantification framework and software for management and automated analysis of real-time quantitative PCR data», Genome Biol., vol. 8, no. 2, p. R19, Feb. 2007) на всех анализированных клинических образцах.

Выходные значения Cq ПЦР-анализа являются по существу логарифмическими (по основанию 2) и обратно пропорциональными количеству мРНК, присутствующей в образце. Использовали следующую формулу для нормализации исходных значений Cq:

N (Cq_{представляющего интерес гена})=среднее значение(Cq_{референсного гена}) - (Cq_{представляющего интерес гена})

где N (Cq_{представляющего интерес гена}) является нормализованным значением генной экспрессии для выбранных генов, представляющих интерес; где среднее значение (Cq_{референсного гена}) представляет среднее арифметическое из значений ПЦР Cq выбранной комбинации референсных генов; где (Cq_{представляющего интерес гена}) представляет собой значение ПЦР Cq представляющего интерес гена.

В случае, если для измерения экспрессии референсных генов или генов, представляющих интерес, используются другие технологии, отличные от ОТ-кПЦР, то значение ПЦР Cq заменяется нормализованным значением для соответствующей технологии (например, RMA (Robust Multiarray Average), нормализованное значение экспрессии генов для ДНК-микрочипов, или FKKM (Fragements per Kilobase of Exon per Million Fragments Mapped), нормализованное значение экспрессии генов для секвенирования РНК).

Расчет индекса прогрессирования рака предстательной железы (PCPI)

Выбранные гены, представляющие интерес (GOI), были сгруппированы в гены, которые подвергались отрицательной регуляции, среди групп пациентов с прогрессированием и без прогрессирования после первоначального лечения по сравнению с генами, которые подвергались положительной регуляции, среди групп пациентов с прогрессированием и без прогрессирования после первоначального лечения. Рассчитывали среднее значение генной экспрессии для генов с отрицательной регуляцией (GEV_av_GOI_down), а также среднее значение генной экспрессии для генов с положительной регуляцией (GEV_av_GOI_up) из нормализованных данных по экспрессии генов для каждого анализированного образца пациента. Индекс прогрессирования рака предстательной железы PCPI на образец пациента определяли следующим образом:

PCPI=(GEV_av_GOI_up) - (GEV_av_GOI_down)

Рассчитанный PCPI использовали для дальнейшего статистического анализа данных.

Расчет PCPI_17 (на основе данных количественной ПЦР в режиме реального времени)

PCPI рассчитывали с использованием следующей формулы:

PCPI=среднее значение (N (Cq_{PCPI гены с положительной регуляцией})) - среднее значение (N (Cq_{PCPI гены с отрицательной регуляцией}))

где

среднее значение (N (_{PCPIгены с положительной регуляцией})) является средним арифметическим из нормализованных значений экспрессии (см. выше) генов: BGN, BIRC5, COL1A1, COL3A1, COL5A2, DYRK2, INHBA, THBS2 и VCAN

и где

среднее значение (N (_{PCPIгены с отрицательной регуляцией})) является средним арифметическим из нормализованных значений экспрессии (см. выше) генов: AZGP1, FBLN1, ILK, KRT15, MEIS2, MYBPC1, PAGE4 и SRD5A2.

Расчет PCPI_18 (на основе данных количественной ПЦР в режиме реального времени)

PCPI рассчитывали с использованием следующей формулы:

PCPI=среднее значение (N (Cq_{PCPI гены с положительной регуляцией})) - среднее значение (N (Cq_{PCPI гены с отрицательной регуляцией}))

где

среднее значение (N (Cq_{PCPIгены с положительной регуляцией})) является средним арифметическим из нормализованных значений экспрессии (см. выше) генов: BGN, BIRC5, COL1A1, COL3A1, COL5A2, DYRK2, INHBA, THBS2 и VCAN

и где

среднее значение (N (Cq_{PCPI гены с отрицательной регуляцией})) является средним арифметическим из нормализованных значений экспрессии (см. выше) генов: AZGP1, FBLN1, ILK, KRT15, MEIS2, MYBPC1, PAGE4 и SRD5A2.

Расчет PCPI_19 (на основе данных количественной ПЦР в режиме реального времени)

PCPI рассчитывали с использованием следующей формулы:

PCPI=среднее значение (N (Cq_{PCPI гены с положительной регуляцией})) - среднее значение (N (Cq_{PCPI гены с отрицательной регуляцией}))

где

среднее значение (N (Cq_{PCPI гены с положительной регуляцией})) является средним арифметическим из нормализованных значений экспрессии (см. выше) генов: BGN, BIRC5, COL1A1, COL3A1, COL5A2, DYRK2, INHBA, THBS2 и VCAN

и где

среднее значение (N (Cq_{PCPI гены с отрицательной регуляцией})) является средним арифметическим из нормализованных значений экспрессии (см. выше) генов: AZGP1, FBLN1, ILK, KRT15, MEIS2, MYBPC1, PAGE4 и SRD5A2.

Корреляционный анализ индекса прогрессирования рака предстательной железы (PCPI) против клинических показателей с исходом у пациентов

Весь статистический анализ (например, анализ логистической регрессии, ROC-анализ, регрессионный анализ Кокса и т. д.) PCPI и его корреляцию с исходами у пациентов по сравнению с обычными клиническими показателями, такими как ПСА, показатель по шкале Глисона, стадия pT, проводили с использованием XLSTAT версии 2014.1.03.

Результаты

967 выбранных генов-кандидатов были исследованы в отношение дифференциальной экспрессии в вышеприведенных рядах данных по экспрессии генов среди пациентов с раком предстательной железы, у которых отсутствовало прогрессирование заболевания после первичного лечения, по сравнению с группами пациентов, у которых имело место прогрессирование заболевания по любой из следующих клинических точек: биохимический рецидив, клинический рецидив, наличие локальных или отдаленных метастазов, смерть от рака предстательной железы.

В таблице 2 (см. фиг. 2) представлен обзор 57 выбранных генов, которые статистически достоверно экспрессировались дифференциально (p<0,05) и подвергались регуляции среди групп пациентов в одном и том же направлении (т. е. с повышением или понижением) среди вышеуказанных групп пациентов, по меньшей мере, в трех из пяти тестированных рядов данных. Затем гены ранжировали в три категории согласно следующим критериям:

Ранг_3: все гены, которые наблюдали максимально в 3 рядах, экспрессировались дифференциально со статистически достоверным p-значением (p<0,05) в одном направлении, или гены с неуникальной аннотацией

Ранг_2: все гены, которые наблюдали максимально в 4 или 5 рядах данных, экспрессировались дифференциально со статистически достоверным p-значением (p<0,05) в одном направлении

Ранг_1: все гены, которые наблюдали в 4 или 5 рядах данных, экспрессировались дифференциально со статистически достоверным p-значением (p<0,05) в одном направлении, но сводились к 9 генам с положительной регуляцией, а также к 10 генам с отрицательной регуляцией.

Предпочтительная сигнатура PCPI включает или состоит из следующих 19 генов: PDE4D5, PDE4D7, AZGP1, FBLN1, ILK, KRT15, MEIS2, MYBPC1, PAGE4, SRD5A2, COL1A1, COL3A1, COL5A2, INHBA, THBS2, VCAN, BGN, BIRC5 и DYRK2.

Поскольку не все ряды данных предоставляют информацию об уровне транскрипта изоформ PDE4D (т. е. PDE4D5 и PDE4D7), то приведенные результаты основаны на измерении экспрессии гена PDE4D, поскольку экспрессия PDE4D очень хорошо коррелирует с экспрессией PDE4D7 (нормализована к экспрессии PDE4D5) в рядах данных GSE21032 и GSE41408); следовательно, определенный PCPI_18 состоял из следующих 18 генов: PDE4D, AZGP1, FBLN1, ILK, KRT15, MEIS2, MYBPC1, PAGE4, SRD5A2, COL1A1, COL3A1, INHBA, THBS2, VCAN, BGN, BIRC5, DYRK2.

Для таких рядов данных, где экспрессию гена PDE4D не измеряли (например, GSE16560, GSE10645), определенный PCPI_17 состоял из следующих 17 генов: AZGP1, FBLN1, ILK, KRT15, MEIS2, MYBPC1, PAGE4, SRD5A2, COL1A1, COL3A1, INHBA, THBS2, VCAN, BGN, BIRC5, DYRK2.

Корреляция PCPI с данными по клиническим исходам для пациентов с раком предстательной железы после первичного лечения

В таблице 3 (см. фиг. 3) представлен обзор эффективности PCPI_18 или PCPI_17 для прогнозирования развития отдаленных метастазов в качестве первичной конечной точки в течение 10-15 лет после первичного лечения (в общем хирургической операции на предстательной железе) для рядов данных GSE21032, GSE41408, GSE25136, GSE16560, GSE10645. Для пациентов, исследованных в ряду данных GSE16560, рак предстательной железы был обнаружен во время TURP (трансуретральной резекции), и затем пациентов лечили консервативно (т. е. без удаления предстательной железы). Для пациентов, исследованных в ряду данных GSE10645, мониторинг пациентов на конечную точку начали только после биохимического рецидива. Эти ряды данных использовали для создания сигнатуры PCPI (данные обучения). Показано количество пациентов в группе (без прогрессирования против прогрессирования до метастазов), а также AUC (площадь под кривой концентрации), полученная из ROC-анализа. AUC указывает на относительную эффективность PCPI в разных рядах данных для прогнозирования первичной конечной точки внутри когорты пациентов.

В таблице 4 (см. фиг. 4) показана эффективность PCPI_18 для прогнозирования развития отдаленных метастазов в качестве первичной конечной точки в течение 10-15 лет после первичного лечения для ряда данных GSE46691; этот ряд данных не использовали для обучения PCPI, и использовали как независимый ряд данных для валидации (данные валидации). Для пациентов, исследованных в ряду данных GSE10645, мониторинг пациентов на конечную точку начали только после биохимического рецидива. Показано количество пациентов в группе (без прогрессирования против прогрессирования до метастазов), а также AUC (площадь под кривой концентрации), полученная из ROC-анализа. AUC указывает на относительную эффективность PCPI в разных рядах данных для прогнозирования первичной конечной точки внутри когорты пациентов.

В таблице 5 (см. фиг. 5) показана эффективность PCPI_18 или PCPI_17 для прогнозирования развития отдаленных метастазов в качестве первичной конечной точки в течение 10-15 лет после первичного лечения (в основном хирургической операции на предстательной железе) для рядов данных GSE21032, GSE41408, GSE16560, GSE10645 в мультифакторном регрессионном анализе Кокса по сравнению со стандартными клиническими показателями, такими как значение ПСА до лечения, биопсия или оценка патологии по шкале Глисона или клиническая/патологическая стадия заболевания. Кси-квадрат, а также отношение рисков для PCPI и отдельных клинических показателей представлены для каждого отдельного ряда данных.

В таблице 6 (см. фиг. 6) приведен обзор по эффективности PCPI_18 для прогнозирования развития биохимического рецидива заболевания (БХР) в качестве первичной конечной точки в течение 10-15 лет после первичного лечения (в основном хирургической операции на предстательной железе) для рядов данных GSE21032, GSE41408, GSE25136. Показано количество пациентов в группе (без прогрессирования против прогрессирования до БХР), а также AUC (площадь под кривой концентрации), полученная из ROC-анализа. AUC указывает относительную эффективность PCPI в разных рядах данных для прогнозирования первичной конечной точки внутри когорты пациентов.

В таблице 7 (см. фиг. 7) показана эффективность PCPI_18 или PCPI_17 для прогнозирования развития биохимического рецидива заболевания (БХР) в качестве первичной конечной точки в течение 10-15 лет после первичного лечения (в основном хирургической операции на предстательной железе) для рядов данных GSE21032, GSE41408, GSE25136 в мультифакторном регрессионном анализе Кокса по сравнению со стандартными клиническими показателями, такими как значение ПСА до лечения, биопсия или оценка патологии по шкале Глисона или клиническая/патологическая стадия заболевания. Кси-квадрат, а также отношение рисков для PCPI и отдельных клинических показателей, представлены для каждого отдельного ряда данных.

В таблице 8 (см. фиг. 8) представлен анализ ROC-кривой с пороговым значением для PCPI_18 для поддержки принятия клинических решений в отношении стратификации пациентов для активного наблюдения (AS) или активного лечения (например, простатэктомии, лучевой терапии, гормональной терапии). Пороговое значение, как показано в таблице, было выбрано из ROC-кривой, и в результате ≥90% мужчин с агрессивным заболеванием было классифицировано правильно (соответствует 90% чувствительности). Данное пороговое значение обеспечивает стратификацию 134 пациентов с профилем с очень низким риском, например, активное наблюдение вместо, например, хирургической операции. Выживаемость без прогрессирования в данной когорте до развития метастатического заболевания в качестве конечной точки в течение примерно 10 лет наблюдения близка к 85%. Такой же подход использовали к клинической модели (балл оценки патологии по шкале Глисона), в результате чего пороговое значение балла по шкале Глисона <= 6 привело бы к стратификации только 57 мужчин, например, для активного наблюдения, а не, например, хирургической операции. Выживаемость без прогрессирования в этой когорте пациентов была бы близка к 90%, но это имело место за счет того, что значительно больше мужчин с прогрессирующим заболеванием было стратифицировано, например, на хирургическую операцию; использование PCPI_18 стратифицирует более в два раза больше мужчин на AS по сравнению с баллом оценки патологии по шкале Глисона, в то время, как профиль риска был сопоставим (85% против 90% с выживаемостью без прогрессирования, соответственно). Эффективность стратификации можно повысить еще больше с использованием комбинационной модели PCPI_18 и оценки патологии по шкале Глисона. Используя эту модель, 146 мужчин (по сравнению с 134) стратифицировано на AS с вероятностью выживаемости без прогрессирования в течение 10 лет, что составляет примерно 87%.

Анализ порогового значения показанной когорты пациентов проводили для общей когорты (545 пациентов), подгруппы с оценкой патологии по шкале Глисона ≥7 (482 пациента), а также другой подгруппы с оценкой патологии по шкале Глисона ≥8 (211 пациент).

Фиг. 11, 12 и 13 относятся к результатам анализа, полученным в исследовании, которое было выполнено примерно на 500 пациентах с длительным наблюдением, сравнением эффективности PCPI_19 (фиг. 11), балла GPSu, который был получен из данных RNAseq с анализом экспрессии 12 генов, связанных с раком, и 5 референсных генов, и рассчитанной по методу, насколько это было возможно, описанному в публикации «Analytical validation of the Oncotype DX prostate cancer assay - a clinical RT-PCR assay optimized for prostate needle biopsies», Dejan Knezevic et al. in BMC Genomics (2013), 14: 690», (фиг. 12) и оценки CCP, полученной из уровней экспрессии 31 гена и рассчитанной, насколько это было возможным, как описано в публикации «Prognostic value of an RNA expression signature derived from cell cycle proliferation genes for recurrence and death from prostate cancer: A retrospective study in two cohorts», Jack Cuzick et al. in Lancet Oncol. (2011); 12(3): 245-255) (фиг. 13).

Для лучшего сравнения баллы оценки GPSu и CCP были масштабированы до диапазона от 1 до 5.

На фиг. 11, 12 и 13 показаны различные риски рецидивов (см. описание ниже) за 5 или 10 лет в разных группах пациентов. На оси Х группы пациентов определены группами с риском по NCCN; VL & LR=очень низкий и низкий риск; FIR=благоприятный промежуточный риск; UIR=неблагоприятный промежуточный риск; HR=высокий риск. NCCN представляют обычно применяемые в США рекомедации в онкологии (https://www.nccn.org/professionals/physician_gls/f_guidelines.asp). На оси Y группы пациентов определены 4 категориями по разным баллам: оценка 1-2; 2-3; 3-4 и 4-5. В решетке 4×4 пациенты были выбраны для любой из ячеек решетки в соответствии с их клиническими характеристиками в отношение риска по NCCN и в соответствии с баллом, который они имеют по PCPI, GPSu или CCP. Был рассчитан различный риск по группе клинических рисков (линия внизу) или по категории баллов (столбец с правой стороны таблицы). В ячейках для обеспечения ясности приводится только риск рецидива БХР за 5 лет.

Описания рисков являются следующими:

5-y BCR - биохимический рецидив за 5 лет

10-y CR - клинический рецидив в виде метастазов за 10 лет

10-y PCSM - смертность от рака предстательной железы за 10 лет

10-летняя ОМ - общая смертность (по всем причинам) за 10 лет

Цифровые значения, приведенные на фиг. 11, 12 и 13, указывают области повышенной эффективности PCPI по сравнению с другими сигнатурами. Пациенты, которые попадают в эти категории, являются потенциальными пациентами для активного наблюдения по сравнению с клиническим решением на активное лечение, и поэтому предпочтительно будут иметь низкий риск рецидивирования рака. PCPI превосходит другие сигнатуры в этих областях.

--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Koninklijke Philips N.V.

<120> Способы прогнозирования рака предстательной железы

<130> P14144 2014PF00611

<160> 204

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 7979

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 1

cagcagcagg ctcagacctg cttccctgga catttccggg accgtgagcg agggaaccac 60

gttgccctgg attcttgcca gctgtacaaa gttgaccagg aaaatggctc agcagacaag 120

cccggacact ttaacagtac ctgaagtgga taatccgcat tgtccaaacc cgtggctgaa 180

cgaagacctt gtgaaatcct tgcgagaaaa cctgttgcag catgagaagt ccaagacagc 240

gaggaaatcg gtttctccca agctctctcc agtgatctct ccgagaaatt cccccaggct 300

tctgcgcaga atgcttctca gcagcaacat ccccaaacag cggcgtttca cggtggcaca 360

tacatgtttt gatgtggaca atggcacatc tgcgggacgg agtcccttgg atcccatgac 420

cagcccagga tccgggctaa ttctccaagc aaattttgtc cacagtcaac gacgggagtc 480

cttcctgtat cgatccgaca gcgattatga cctctctcca aagtctatgt cccggaactc 540

ctccattgcc agtgatatac acggagatga cttgattgtg actccatttg ctcaggtctt 600

ggccagtctg cgaactgtac gaaacaactt tgctgcatta actaatttgc aagatcgagc 660

acctagcaaa agatcaccca tgtgcaacca accatccatc aacaaagcca ccataacaga 720

ggaggcctac cagaaactgg ccagcgagac cctggaggag ctggactggt gtctggacca 780

gctagagacc ctacagacca ggcactccgt cagtgagatg gcctccaaca agtttaaaag 840

gatgcttaat cgggagctca cccatctctc tgaaatgagt cggtctggaa atcaagtgtc 900

agagtttata tcaaacacat tcttagataa gcaacatgaa gtggaaattc cttctccaac 960

tcagaaggaa aaggagaaaa agaaaagacc aatgtctcag atcagtggag tcaagaaatt 1020

gatgcacagc tctagtctga ctaattcaag tatcccaagg tttggagtta aaactgaaca 1080

agaagatgtc cttgccaagg aactagaaga tgtgaacaaa tggggtcttc atgttttcag 1140

aatagcagag ttgtctggta accggccctt gactgttatc atgcacacca tttttcagga 1200

acgggattta ttaaaaacat ttaaaattcc agtagatact ttaattacat atcttatgac 1260

tctcgaagac cattaccatg ctgatgtggc ctatcacaac aatatccatg ctgcagatgt 1320

tgtccagtct actcatgtgc tattatctac acctgctttg gaggctgtgt ttacagattt 1380

ggagattctt gcagcaattt ttgccagtgc aatacatgat gtagatcatc ctggtgtgtc 1440

caatcaattt ctgatcaata caaactctga acttgccttg atgtacaatg attcctcagt 1500

cttagagaac catcatttgg ctgtgggctt taaattgctt caggaagaaa actgtgacat 1560

tttccagaat ttgaccaaaa aacaaagaca atctttaagg aaaatggtca ttgacatcgt 1620

acttgcaaca gatatgtcaa aacacatgaa tctactggct gatttgaaga ctatggttga 1680

aactaagaaa gtgacaagct ctggagttct tcttcttgat aattattccg ataggattca 1740

ggttcttcag aatatggtgc actgtgcaga tctgagcaac ccaacaaagc ctctccagct 1800

gtaccgccag tggacggacc ggataatgga ggagttcttc cgccaaggag accgagagag 1860

ggaacgtggc atggagataa gccccatgtg tgacaagcac aatgcttccg tggaaaaatc 1920

acaggtgggc ttcatagact atattgttca tcccctctgg gagacatggg cagacctcgt 1980

ccaccctgac gcccaggata ttttggacac tttggaggac aatcgtgaat ggtaccagag 2040

cacaatccct cagagcccct ctcctgcacc tgatgaccca gaggagggcc ggcagggtca 2100

aactgagaaa ttccagtttg aactaacttt agaggaagat ggtgagtcag acacggaaaa 2160

ggacagtggc agtcaagtgg aagaagacac tagctgcagt gactccaaga ctctttgtac 2220

tcaagactca gagtctactg aaattcccct tgatgaacag gttgaagagg aggcagtagg 2280

ggaagaagag gaaagccagc ctgaagcctg tgtcatagat gatcgttctc ctgacacgta 2340

acagtgcaaa aactttcatg cctttttttt ttttaagtag aaaaattgtt tccaaagtgc 2400

atgtcacatg ccacaaccac ggtcacacct cactgtcatc tgccaggacg tttgttgaac 2460

aaaactgacc ttgactactc agtccagcgc tcaggaatat cgtaaccagt tttttcacct 2520

ccatgtcatc cgagcaaggt ggacatcttc acgaacagcg tttttaacaa gatttcagct 2580

tggtagagct gacaaagcag ataaaatcta ctccaaatta ttttcaagag agtgtgactc 2640

atcaggcagc ccaaaagttt attggacttg gggtttctat tcctttttat ttgtttgcaa 2700

tattttcaga agaaaggcat tgcacagagt gaacttaatg gacgaagcaa caaatatgtc 2760

aagaacagga catagcacga atctgttacc agtaggagga ggatgagcca cagaaattgc 2820

ataattttct aatttcaagt cttcctgata catgactgaa tagtgtggtt cagtgagctg 2880

cactgacctc tacattttgt atgatatgta aaacagattt tttgtagagc ttacttttat 2940

tattaaatgt attgaggtat tatatttaaa aaaaactatg ttcagaactt catctgccac 3000

tggttatttt tttctaagga gtaacttgca agttttcagt acaaatctgt gctacactgg 3060

ataaaaatct aatttatgaa ttttacttgc accttatagt tcatagcaat taactgattt 3120

gtagtgattc attgtttgtt ttatatacca atgacttcca tattttaaaa gagaaaaaca 3180

actttatgtt gcaggaaacc ctttttgtaa gtctttatta tttactttgc attttgtttc 3240

actctttcca gataagcaga gttgctcttc accagtgttt ttcttcatgt gcaaagtgac 3300

tatttgttct ataatacttt tatgtgtgtt atatcaaatg tgtcttaagc ttcatgcaaa 3360

ctcagtcatc agttcgtgtt gtctgaagca agtgggagat atataaatac ccagtagcta 3420

aaatggtcag tcttttttag atgttttcct acttagtatc tcctaataac gttttgctgt 3480

gtcactagat gttcatttca caagtgcatg tctttctaat aatccacaca tttcatgctc 3540

taataatcca cacatttcat gctcattttt attgttttta cagccagtta tagtaagaaa 3600

aaggtttttc cccttgtgct gctttataat ttagcgtgtg tctgaacctt atccatgttt 3660

gctagatgag gtcttgtcaa atatatcact accattgtca ccggtgaaaa gaaacaggta 3720

gttaagttag ggttaacatt catttcaacc acgaggttgt atatcatgac tagcttttac 3780

tcttggttta cagagaaaag ttaaacagcc aactaggcag tttttaagaa tattaacaat 3840

atattaacaa acaccaatac aactaatcct atttggtttt aatgatttca ccatgggatt 3900

aagaactata tcaggaacat ccctgagaaa cggttttaag tgtagcaact actcttcctt 3960

aatggacagc cacataacgt gtaggaagtc ctttatcact tatcctcgat ccataagcat 4020

atcttgcaga ggggaactac ttctttaaac acatggaggg aaagaagatg atgccactgg 4080

caccagaggg ttagtactgt gatgcatcct aaaatattta ttatattggt aaaaattctg 4140

gttaaataaa aaattagaga tcactcttgg ctgatttcag caccaggaac tgtattacag 4200

ttttagagat taattcctag tgtttacctg attatagcag ttggcatcat ggggcattta 4260

attctgactt tatccccacg tcagccttaa taaagtcttc tttaccttct ctatgaagac 4320

tttaaagccc aaataatcat ttttcacatt gatattcaag aattgagata gatagaagcc 4380

aaagtgggta tctgacaagt ggaaaatcaa acgtttaaga agaattacaa ctctgaaaag 4440

catttatatg tggaacttct caaggagcct cctggggact ggaaagtaag tcatcagcca 4500

ggcaaatgac tcatgctgaa gagagtcccc atttcagtcc cctgagatct agctgatgct 4560

tagatccttt gaaataaaaa ttatgtcttt ataactctga tcttttacat aaagcagaag 4620

aggaatcaac tagttaattg caaggtttct actctgtttc ctctgtaaag atcagatggt 4680

aatctttcaa ataagaaaaa aataaagacg tatgtttgac caagtagttt cacaagaata 4740

tttgggaact tgtttctttt aattttattt gtccctgagt gaagtctaga aagaaaggta 4800

aagagtctag agtttattcc tctttccaaa acattctcat tcctctcctc cctacactta 4860

gtatttcccc cacagagtgc ctagaatctt aataatgaat aaaataaaaa gcagcaatat 4920

gtcattaaca aatccagacc tgaaagggta aagggtttat aactgcacta ataaagagag 4980

gctctttttt tttcttccag tttgttggtt tttaatggta ccgtgttgta aagataccca 5040

ctaatggaca atcaaattgc agaaaaggct caatatccaa gagacaggga ctaatgcact 5100

gtacaatctg cttatccttg cccttctctc ttgccaaagt gtgcttcaga aatatatact 5160

gctttaaaaa agaataaaag aatatccttt tacaagtggc tttacatttc ctaaaatgcc 5220

ataagaaaat gcaatatctg ggtactgtat ggggaaaaaa atgtccaagt ttgtgtaaaa 5280

ccagtgcatt tcagcttgca agttactgaa cacaataatg ctgttttaat tttgttttat 5340

atcagttaaa attcacaata atgtagatag aacaaattac agacaaggaa agaaaaaact 5400

tgaatgaaat ggattttaca gaaagcttta tgataatttt tgaatgcatt atttattttt 5460

tgtgccatgc attttttttc tcaccaaatg accttacctg taatacagtc ttgtttgtct 5520

gtttacaacc atgtatttat tgcaatgtac atactgtaat gttaattgta aattatctgt 5580

tcttattaaa acatcatccc atgatgggat ggtgttgata tatttggaaa ctcttggtga 5640

gagaatgaat ggtgtgtata catactctgt acatttttct tttctcctgt aatatagtct 5700

tgtcacctta gagcttgttt atggaagatt caagaaaact ataaaatact taaagatata 5760

taaatttaaa aaaacatagc tgcaggtctt tggtcccagg gctgtgcctt aactttaacc 5820

aatattttct tctgttttgc tgcatttgaa aggtaacagt ggagctaggg ctgggcattt 5880

tacatccagg cttttaattg attagaattc tgccaatagg tggattttac aaaaccacag 5940

acaacctctg aaagattctg agaccctttt gagacagaag ctcttaagta cttcttgcca 6000

gggagcagca ctgcatgtgt gatggttgtt tgccatctgt tgatcaggaa ctacttcagc 6060

tacttgcatt tgattatttc cttttttttt ttttttaact cggaaacaca actggggaaa 6120

tatattcttt cccagtgatt ataaacaatc tttttctttt ttttaagtcc ttttggcttc 6180

tagagctcat aggaaaatgg acttgatttg aaattggagc cagagtttac tcgtgttggt 6240

tatctattca tcagcttcct gacatgttaa gagaatacat taaagagaaa atactgtttt 6300

ttaatcctaa aatttttctt ccactaagat aaaccaaatg tccttacata tatgtaaacc 6360

catctattta aacgcaaagg tgggttgatg tcagtttaca tagcagaaag cattcactat 6420

cctctaagat ttgtttctgc aaaactttca ttgctttaga attttaaaat ttcaccttgt 6480

acaatggcca gcccctaaag caggaaacat ttataatgga ttatatggaa acatcctccc 6540

agtacttgcc cagcccttga atcatgtggc ttttcagtga aaggaaagat tctttttcta 6600

ggaaaaatga gcctatttta ttttatttta ttttattttt tgacacaaac tgtagatttt 6660

agcagccctg gcccaaagga atttgattac ttttgtttta aacagtacaa aggggacact 6720

ataattacaa aaacatcctt aactgatttg agttgttttt atttctttgg atatattttc 6780

agagtggtaa attgtgtgtg agaattacaa atgattattc ttttagtggt ttcttagcct 6840

ctcttacagc ccacggggat agtactgtac atcaatacct tcatatgaaa tttttatatg 6900

caatgaaaat aaaagcatgg gttgattctg cctatttatg actcaatctt ttacaaataa 6960

aagattattc attttaaatt atagttcaat cagcatgtct cttaggatac tgaacgtggt 7020

tgaaatgaaa ggatagtgac atcataagtt agtactgata ttcataacca aataaagcca 7080

acttgagtaa ttttgctaca ttaaaaatta ccaaaattac ttagatggcc tataagatta 7140

agcatggtgt tttctaagca agctttgaaa ggggccttcc atacttactt aattgaatat 7200

tctgggatat tgaaaattat tcagatactt gacaattatt tttggttacc tactccgcaa 7260

actacaaagt tttaaggact caacaataag ttaatgagac acagtgtttg ctttcatgga 7320

gcttacagtc tggaggggac aaaggcttaa acaatactca tataattata tatgtgatca 7380

gtacaatgaa ggagctcagt ggggtaaata agcaggaacc tgaacttgat ctgttccgga 7440

gggccacaga aggcttcctt gaggccttga gaaagtgatt tgcatctgag ttctgaagga 7500

ttgtaagagg taactaggga aaaagttgac aggaagagga aggggatcca gacaagaaac 7560

atttgcaaag atcttgaggc ataaatgagc ttgagacatc tggagaaact gaggaaaagt 7620

gagagagtag gcagggcctg gagccgcaga gccattgcta accatcctgt gtgagatatc 7680

ccccattctg tagctttatt ctcataaccc tgctcaattt tctttataac acttctcaca 7740

gatttatata cgtgtttgtt tttgttatct gtctctccca ccagaccaca gctccatgag 7800

agcaaggtct ttgcttacca atatatcact agcacttaaa actatgcctg gtacacagta 7860

ggttcttaat atgtgttgaa tatagccatc aaattgatat tggatataat tcaatctgat 7920

aagatatttt gagatattaa agagttttta acttgatacc ataaaaaaaa aaaaaaaaa 7979

<210> 2

<211> 745

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 2

Met Ala Gln Gln Thr Ser Pro Asp Thr Leu Thr Val Pro Glu Val Asp

1 5 10 15

Asn Pro His Cys Pro Asn Pro Trp Leu Asn Glu Asp Leu Val Lys Ser

20 25 30

Leu Arg Glu Asn Leu Leu Gln His Glu Lys Ser Lys Thr Ala Arg Lys

35 40 45

Ser Val Ser Pro Lys Leu Ser Pro Val Ile Ser Pro Arg Asn Ser Pro

50 55 60

Arg Leu Leu Arg Arg Met Leu Leu Ser Ser Asn Ile Pro Lys Gln Arg

65 70 75 80

Arg Phe Thr Val Ala His Thr Cys Phe Asp Val Asp Asn Gly Thr Ser

85 90 95

Ala Gly Arg Ser Pro Leu Asp Pro Met Thr Ser Pro Gly Ser Gly Leu

100 105 110

Ile Leu Gln Ala Asn Phe Val His Ser Gln Arg Arg Glu Ser Phe Leu

115 120 125

Tyr Arg Ser Asp Ser Asp Tyr Asp Leu Ser Pro Lys Ser Met Ser Arg

130 135 140

Asn Ser Ser Ile Ala Ser Asp Ile His Gly Asp Asp Leu Ile Val Thr

145 150 155 160

Pro Phe Ala Gln Val Leu Ala Ser Leu Arg Thr Val Arg Asn Asn Phe

165 170 175

Ala Ala Leu Thr Asn Leu Gln Asp Arg Ala Pro Ser Lys Arg Ser Pro

180 185 190

Met Cys Asn Gln Pro Ser Ile Asn Lys Ala Thr Ile Thr Glu Glu Ala

195 200 205

Tyr Gln Lys Leu Ala Ser Glu Thr Leu Glu Glu Leu Asp Trp Cys Leu

210 215 220

Asp Gln Leu Glu Thr Leu Gln Thr Arg His Ser Val Ser Glu Met Ala

225 230 235 240

Ser Asn Lys Phe Lys Arg Met Leu Asn Arg Glu Leu Thr His Leu Ser

245 250 255

Glu Met Ser Arg Ser Gly Asn Gln Val Ser Glu Phe Ile Ser Asn Thr

260 265 270

Phe Leu Asp Lys Gln His Glu Val Glu Ile Pro Ser Pro Thr Gln Lys

275 280 285

Glu Lys Glu Lys Lys Lys Arg Pro Met Ser Gln Ile Ser Gly Val Lys

290 295 300

Lys Leu Met His Ser Ser Ser Leu Thr Asn Ser Ser Ile Pro Arg Phe

305 310 315 320

Gly Val Lys Thr Glu Gln Glu Asp Val Leu Ala Lys Glu Leu Glu Asp

325 330 335

Val Asn Lys Trp Gly Leu His Val Phe Arg Ile Ala Glu Leu Ser Gly

340 345 350

Asn Arg Pro Leu Thr Val Ile Met His Thr Ile Phe Gln Glu Arg Asp

355 360 365

Leu Leu Lys Thr Phe Lys Ile Pro Val Asp Thr Leu Ile Thr Tyr Leu

370 375 380

Met Thr Leu Glu Asp His Tyr His Ala Asp Val Ala Tyr His Asn Asn

385 390 395 400

Ile His Ala Ala Asp Val Val Gln Ser Thr His Val Leu Leu Ser Thr

405 410 415

Pro Ala Leu Glu Ala Val Phe Thr Asp Leu Glu Ile Leu Ala Ala Ile

420 425 430

Phe Ala Ser Ala Ile His Asp Val Asp His Pro Gly Val Ser Asn Gln

435 440 445

Phe Leu Ile Asn Thr Asn Ser Glu Leu Ala Leu Met Tyr Asn Asp Ser

450 455 460

Ser Val Leu Glu Asn His His Leu Ala Val Gly Phe Lys Leu Leu Gln

465 470 475 480

Glu Glu Asn Cys Asp Ile Phe Gln Asn Leu Thr Lys Lys Gln Arg Gln

485 490 495

Ser Leu Arg Lys Met Val Ile Asp Ile Val Leu Ala Thr Asp Met Ser

500 505 510

Lys His Met Asn Leu Leu Ala Asp Leu Lys Thr Met Val Glu Thr Lys

515 520 525

Lys Val Thr Ser Ser Gly Val Leu Leu Leu Asp Asn Tyr Ser Asp Arg

530 535 540

Ile Gln Val Leu Gln Asn Met Val His Cys Ala Asp Leu Ser Asn Pro

545 550 555 560

Thr Lys Pro Leu Gln Leu Tyr Arg Gln Trp Thr Asp Arg Ile Met Glu

565 570 575

Glu Phe Phe Arg Gln Gly Asp Arg Glu Arg Glu Arg Gly Met Glu Ile

580 585 590

Ser Pro Met Cys Asp Lys His Asn Ala Ser Val Glu Lys Ser Gln Val

595 600 605

Gly Phe Ile Asp Tyr Ile Val His Pro Leu Trp Glu Thr Trp Ala Asp

610 615 620

Leu Val His Pro Asp Ala Gln Asp Ile Leu Asp Thr Leu Glu Asp Asn

625 630 635 640

Arg Glu Trp Tyr Gln Ser Thr Ile Pro Gln Ser Pro Ser Pro Ala Pro

645 650 655

Asp Asp Pro Glu Glu Gly Arg Gln Gly Gln Thr Glu Lys Phe Gln Phe

660 665 670

Glu Leu Thr Leu Glu Glu Asp Gly Glu Ser Asp Thr Glu Lys Asp Ser

675 680 685

Gly Ser Gln Val Glu Glu Asp Thr Ser Cys Ser Asp Ser Lys Thr Leu

690 695 700

Cys Thr Gln Asp Ser Glu Ser Thr Glu Ile Pro Leu Asp Glu Gln Val

705 710 715 720

Glu Glu Glu Ala Val Gly Glu Glu Glu Glu Ser Gln Pro Glu Ala Cys

725 730 735

Val Ile Asp Asp Arg Ser Pro Asp Thr

740 745

<210> 3

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> PDE4D5_прямой праймер

<400> 3

gcttctcagc agcaacatc 19

<210> 4

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> PDE4D5_обратный праймер

<400> 4

tgccattgtc cacatcaaaa 20

<210> 5

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> PDE4D5 зонд

<400> 5

acagcggcgt ttcacggtgg caca 24

<210> 6

<211> 8130

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 6

agattatagc ccagcgtacg agaagcacga gtcctatagt tggcgtaccc tgaggcctgc 60

cagttcctgc cttaatgcat atgtagtcgt aattgagttc tgacacggcc ttggatgttt 120

ctgtcctaaa tagctgacat tgcatcttca agactgtcat tccagttggc ttttgagtgg 180

atacgtgcag tgagatcatt gacactggaa acactagttc ccattttaat tacttaaaac 240

accacgatga aaagaaatac ctgtgatttg ctttctcgga gcaaaagtgc ctctgaggaa 300

acactacatt ccagtaatga agaggaagac cctttccgcg gaatggaacc ctatcttgtc 360

cggagacttt catgtcgcaa tattcagctt ccccctctcg ccttcagaca gttggaacaa 420

gctgacttga aaagtgaatc agagaacatt caacgaccaa ccagcctccc cctgaagatt 480

ctgccgctga ttgctatcac ttctgcagaa tccagtggtt ttgatgtgga caatggcaca 540

tctgcgggac ggagtccctt ggatcccatg accagcccag gatccgggct aattctccaa 600

gcaaattttg tccacagtca acgacgggag tccttcctgt atcgatccga cagcgattat 660

gacctctctc caaagtctat gtcccggaac tcctccattg ccagtgatat acacggagat 720

gacttgattg tgactccatt tgctcaggtc ttggccagtc tgcgaactgt acgaaacaac 780

tttgctgcat taactaattt gcaagatcga gcacctagca aaagatcacc catgtgcaac 840

caaccatcca tcaacaaagc caccataaca gaggaggcct accagaaact ggccagcgag 900

accctggagg agctggactg gtgtctggac cagctagaga ccctacagac caggcactcc 960

gtcagtgaga tggcctccaa caagtttaaa aggatgctta atcgggagct cacccatctc 1020

tctgaaatga gtcggtctgg aaatcaagtg tcagagttta tatcaaacac attcttagat 1080

aagcaacatg aagtggaaat tccttctcca actcagaagg aaaaggagaa aaagaaaaga 1140

ccaatgtctc agatcagtgg agtcaagaaa ttgatgcaca gctctagtct gactaattca 1200

agtatcccaa ggtttggagt taaaactgaa caagaagatg tccttgccaa ggaactagaa 1260

gatgtgaaca aatggggtct tcatgttttc agaatagcag agttgtctgg taaccggccc 1320

ttgactgtta tcatgcacac catttttcag gaacgggatt tattaaaaac atttaaaatt 1380

ccagtagata ctttaattac atatcttatg actctcgaag accattacca tgctgatgtg 1440

gcctatcaca acaatatcca tgctgcagat gttgtccagt ctactcatgt gctattatct 1500

acacctgctt tggaggctgt gtttacagat ttggagattc ttgcagcaat ttttgccagt 1560

gcaatacatg atgtagatca tcctggtgtg tccaatcaat ttctgatcaa tacaaactct 1620

gaacttgcct tgatgtacaa tgattcctca gtcttagaga accatcattt ggctgtgggc 1680

tttaaattgc ttcaggaaga aaactgtgac attttccaga atttgaccaa aaaacaaaga 1740

caatctttaa ggaaaatggt cattgacatc gtacttgcaa cagatatgtc aaaacacatg 1800

aatctactgg ctgatttgaa gactatggtt gaaactaaga aagtgacaag ctctggagtt 1860

cttcttcttg ataattattc cgataggatt caggttcttc agaatatggt gcactgtgca 1920

gatctgagca acccaacaaa gcctctccag ctgtaccgcc agtggacgga ccggataatg 1980

gaggagttct tccgccaagg agaccgagag agggaacgtg gcatggagat aagccccatg 2040

tgtgacaagc acaatgcttc cgtggaaaaa tcacaggtgg gcttcataga ctatattgtt 2100

catcccctct gggagacatg ggcagacctc gtccaccctg acgcccagga tattttggac 2160

actttggagg acaatcgtga atggtaccag agcacaatcc ctcagagccc ctctcctgca 2220

cctgatgacc cagaggaggg ccggcagggt caaactgaga aattccagtt tgaactaact 2280

ttagaggaag atggtgagtc agacacggaa aaggacagtg gcagtcaagt ggaagaagac 2340

actagctgca gtgactccaa gactctttgt actcaagact cagagtctac tgaaattccc 2400

cttgatgaac aggttgaaga ggaggcagta ggggaagaag aggaaagcca gcctgaagcc 2460

tgtgtcatag atgatcgttc tcctgacacg taacagtgca aaaactttca tgcctttttt 2520

ttttttaagt agaaaaattg tttccaaagt gcatgtcaca tgccacaacc acggtcacac 2580

ctcactgtca tctgccagga cgtttgttga acaaaactga ccttgactac tcagtccagc 2640

gctcaggaat atcgtaacca gttttttcac ctccatgtca tccgagcaag gtggacatct 2700

tcacgaacag cgtttttaac aagatttcag cttggtagag ctgacaaagc agataaaatc 2760

tactccaaat tattttcaag agagtgtgac tcatcaggca gcccaaaagt ttattggact 2820

tggggtttct attccttttt atttgtttgc aatattttca gaagaaaggc attgcacaga 2880

gtgaacttaa tggacgaagc aacaaatatg tcaagaacag gacatagcac gaatctgtta 2940

ccagtaggag gaggatgagc cacagaaatt gcataatttt ctaatttcaa gtcttcctga 3000

tacatgactg aatagtgtgg ttcagtgagc tgcactgacc tctacatttt gtatgatatg 3060

taaaacagat tttttgtaga gcttactttt attattaaat gtattgaggt attatattta 3120

aaaaaaacta tgttcagaac ttcatctgcc actggttatt tttttctaag gagtaacttg 3180

caagttttca gtacaaatct gtgctacact ggataaaaat ctaatttatg aattttactt 3240

gcaccttata gttcatagca attaactgat ttgtagtgat tcattgtttg ttttatatac 3300

caatgacttc catattttaa aagagaaaaa caactttatg ttgcaggaaa ccctttttgt 3360

aagtctttat tatttacttt gcattttgtt tcactctttc cagataagca gagttgctct 3420

tcaccagtgt ttttcttcat gtgcaaagtg actatttgtt ctataatact tttatgtgtg 3480

ttatatcaaa tgtgtcttaa gcttcatgca aactcagtca tcagttcgtg ttgtctgaag 3540

caagtgggag atatataaat acccagtagc taaaatggtc agtctttttt agatgttttc 3600

ctacttagta tctcctaata acgttttgct gtgtcactag atgttcattt cacaagtgca 3660

tgtctttcta ataatccaca catttcatgc tctaataatc cacacatttc atgctcattt 3720

ttattgtttt tacagccagt tatagtaaga aaaaggtttt tccccttgtg ctgctttata 3780

atttagcgtg tgtctgaacc ttatccatgt ttgctagatg aggtcttgtc aaatatatca 3840

ctaccattgt caccggtgaa aagaaacagg tagttaagtt agggttaaca ttcatttcaa 3900

ccacgaggtt gtatatcatg actagctttt actcttggtt tacagagaaa agttaaacag 3960

ccaactaggc agtttttaag aatattaaca atatattaac aaacaccaat acaactaatc 4020

ctatttggtt ttaatgattt caccatggga ttaagaacta tatcaggaac atccctgaga 4080

aacggtttta agtgtagcaa ctactcttcc ttaatggaca gccacataac gtgtaggaag 4140

tcctttatca cttatcctcg atccataagc atatcttgca gaggggaact acttctttaa 4200

acacatggag ggaaagaaga tgatgccact ggcaccagag ggttagtact gtgatgcatc 4260

ctaaaatatt tattatattg gtaaaaattc tggttaaata aaaaattaga gatcactctt 4320

ggctgatttc agcaccagga actgtattac agttttagag attaattcct agtgtttacc 4380

tgattatagc agttggcatc atggggcatt taattctgac tttatcccca cgtcagcctt 4440

aataaagtct tctttacctt ctctatgaag actttaaagc ccaaataatc atttttcaca 4500

ttgatattca agaattgaga tagatagaag ccaaagtggg tatctgacaa gtggaaaatc 4560

aaacgtttaa gaagaattac aactctgaaa agcatttata tgtggaactt ctcaaggagc 4620

ctcctgggga ctggaaagta agtcatcagc caggcaaatg actcatgctg aagagagtcc 4680

ccatttcagt cccctgagat ctagctgatg cttagatcct ttgaaataaa aattatgtct 4740

ttataactct gatcttttac ataaagcaga agaggaatca actagttaat tgcaaggttt 4800

ctactctgtt tcctctgtaa agatcagatg gtaatctttc aaataagaaa aaaataaaga 4860

cgtatgtttg accaagtagt ttcacaagaa tatttgggaa cttgtttctt ttaattttat 4920

ttgtccctga gtgaagtcta gaaagaaagg taaagagtct agagtttatt cctctttcca 4980

aaacattctc attcctctcc tccctacact tagtatttcc cccacagagt gcctagaatc 5040

ttaataatga ataaaataaa aagcagcaat atgtcattaa caaatccaga cctgaaaggg 5100

taaagggttt ataactgcac taataaagag aggctctttt tttttcttcc agtttgttgg 5160

tttttaatgg taccgtgttg taaagatacc cactaatgga caatcaaatt gcagaaaagg 5220

ctcaatatcc aagagacagg gactaatgca ctgtacaatc tgcttatcct tgcccttctc 5280

tcttgccaaa gtgtgcttca gaaatatata ctgctttaaa aaagaataaa agaatatcct 5340

tttacaagtg gctttacatt tcctaaaatg ccataagaaa atgcaatatc tgggtactgt 5400

atggggaaaa aaatgtccaa gtttgtgtaa aaccagtgca tttcagcttg caagttactg 5460

aacacaataa tgctgtttta attttgtttt atatcagtta aaattcacaa taatgtagat 5520

agaacaaatt acagacaagg aaagaaaaaa cttgaatgaa atggatttta cagaaagctt 5580

tatgataatt tttgaatgca ttatttattt tttgtgccat gcattttttt tctcaccaaa 5640

tgaccttacc tgtaatacag tcttgtttgt ctgtttacaa ccatgtattt attgcaatgt 5700

acatactgta atgttaattg taaattatct gttcttatta aaacatcatc ccatgatggg 5760

atggtgttga tatatttgga aactcttggt gagagaatga atggtgtgta tacatactct 5820

gtacattttt cttttctcct gtaatatagt cttgtcacct tagagcttgt ttatggaaga 5880

ttcaagaaaa ctataaaata cttaaagata tataaattta aaaaaacata gctgcaggtc 5940

tttggtccca gggctgtgcc ttaactttaa ccaatatttt cttctgtttt gctgcatttg 6000

aaaggtaaca gtggagctag ggctgggcat tttacatcca ggcttttaat tgattagaat 6060

tctgccaata ggtggatttt acaaaaccac agacaacctc tgaaagattc tgagaccctt 6120

ttgagacaga agctcttaag tacttcttgc cagggagcag cactgcatgt gtgatggttg 6180

tttgccatct gttgatcagg aactacttca gctacttgca tttgattatt tccttttttt 6240

ttttttttaa ctcggaaaca caactgggga aatatattct ttcccagtga ttataaacaa 6300

tctttttctt ttttttaagt ccttttggct tctagagctc ataggaaaat ggacttgatt 6360

tgaaattgga gccagagttt actcgtgttg gttatctatt catcagcttc ctgacatgtt 6420

aagagaatac attaaagaga aaatactgtt ttttaatcct aaaatttttc ttccactaag 6480

ataaaccaaa tgtccttaca tatatgtaaa cccatctatt taaacgcaaa ggtgggttga 6540

tgtcagttta catagcagaa agcattcact atcctctaag atttgtttct gcaaaacttt 6600

cattgcttta gaattttaaa atttcacctt gtacaatggc cagcccctaa agcaggaaac 6660

atttataatg gattatatgg aaacatcctc ccagtacttg cccagccctt gaatcatgtg 6720

gcttttcagt gaaaggaaag attctttttc taggaaaaat gagcctattt tattttattt 6780

tattttattt tttgacacaa actgtagatt ttagcagccc tggcccaaag gaatttgatt 6840

acttttgttt taaacagtac aaaggggaca ctataattac aaaaacatcc ttaactgatt 6900

tgagttgttt ttatttcttt ggatatattt tcagagtggt aaattgtgtg tgagaattac 6960

aaatgattat tcttttagtg gtttcttagc ctctcttaca gcccacgggg atagtactgt 7020

acatcaatac cttcatatga aatttttata tgcaatgaaa ataaaagcat gggttgattc 7080

tgcctattta tgactcaatc ttttacaaat aaaagattat tcattttaaa ttatagttca 7140

atcagcatgt ctcttaggat actgaacgtg gttgaaatga aaggatagtg acatcataag 7200

ttagtactga tattcataac caaataaagc caacttgagt aattttgcta cattaaaaat 7260

taccaaaatt acttagatgg cctataagat taagcatggt gttttctaag caagctttga 7320

aaggggcctt ccatacttac ttaattgaat attctgggat attgaaaatt attcagatac 7380

ttgacaatta tttttggtta cctactccgc aaactacaaa gttttaagga ctcaacaata 7440

agttaatgag acacagtgtt tgctttcatg gagcttacag tctggagggg acaaaggctt 7500

aaacaatact catataatta tatatgtgat cagtacaatg aaggagctca gtggggtaaa 7560

taagcaggaa cctgaacttg atctgttccg gagggccaca gaaggcttcc ttgaggcctt 7620

gagaaagtga tttgcatctg agttctgaag gattgtaaga ggtaactagg gaaaaagttg 7680

acaggaagag gaaggggatc cagacaagaa acatttgcaa agatcttgag gcataaatga 7740

gcttgagaca tctggagaaa ctgaggaaaa gtgagagagt aggcagggcc tggagccgca 7800

gagccattgc taaccatcct gtgtgagata tcccccattc tgtagcttta ttctcataac 7860

cctgctcaat tttctttata acacttctca cagatttata tacgtgtttg tttttgttat 7920

ctgtctctcc caccagacca cagctccatg agagcaaggt ctttgcttac caatatatca 7980

ctagcactta aaactatgcc tggtacacag taggttctta atatgtgttg aatatagcca 8040

tcaaattgat attggatata attcaatctg ataagatatt ttgagatatt aaagagtttt 8100

taacttgata ccataaaaaa aaaaaaaaaa 8130

<210> 7

<211> 748

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 7

Met Lys Arg Asn Thr Cys Asp Leu Leu Ser Arg Ser Lys Ser Ala Ser

5 10 15

Glu Glu Thr Leu His Ser Ser Asn Glu Glu Glu Asp Pro Phe Arg Gly

20 25 30

Met Glu Pro Tyr Leu Val Arg Arg Leu Ser Cys Arg Asn Ile Gln Leu

35 40 45

Pro Pro Leu Ala Phe Arg Gln Leu Glu Gln Ala Asp Leu Lys Ser Glu

50 55 60

Ser Glu Asn Ile Gln Arg Pro Thr Ser Leu Pro Leu Lys Ile Leu Pro

65 70 75 80

Leu Ile Ala Ile Thr Ser Ala Glu Ser Ser Gly Phe Asp Val Asp Asn

85 90 95

Gly Thr Ser Ala Gly Arg Ser Pro Leu Asp Pro Met Thr Ser Pro Gly

100 105 110

Ser Gly Leu Ile Leu Gln Ala Asn Phe Val His Ser Gln Arg Arg Glu

115 120 125

Ser Phe Leu Tyr Arg Ser Asp Ser Asp Tyr Asp Leu Ser Pro Lys Ser

130 135 140

Met Ser Arg Asn Ser Ser Ile Ala Ser Asp Ile His Gly Asp Asp Leu

145 150 155 160

Ile Val Thr Pro Phe Ala Gln Val Leu Ala Ser Leu Arg Thr Val Arg

165 170 175

Asn Asn Phe Ala Ala Leu Thr Asn Leu Gln Asp Arg Ala Pro Ser Lys

180 185 190

Arg Ser Pro Met Cys Asn Gln Pro Ser Ile Asn Lys Ala Thr Ile Thr

195 200 205

Glu Glu Ala Tyr Gln Lys Leu Ala Ser Glu Thr Leu Glu Glu Leu Asp

210 215 220

Trp Cys Leu Asp Gln Leu Glu Thr Leu Gln Thr Arg His Ser Val Ser

225 230 235 240

Glu Met Ala Ser Asn Lys Phe Lys Arg Met Leu Asn Arg Glu Leu Thr

245 250 255

His Leu Ser Glu Met Ser Arg Ser Gly Asn Gln Val Ser Glu Phe Ile

260 265 270

Ser Asn Thr Phe Leu Asp Lys Gln His Glu Val Glu Ile Pro Ser Pro

275 280 285

Thr Gln Lys Glu Lys Glu Lys Lys Lys Arg Pro Met Ser Gln Ile Ser

290 295 300

Gly Val Lys Lys Leu Met His Ser Ser Ser Leu Thr Asn Ser Ser Ile

305 310 315 320

Pro Arg Phe Gly Val Lys Thr Glu Gln Glu Asp Val Leu Ala Lys Glu

325 330 335

Leu Glu Asp Val Asn Lys Trp Gly Leu His Val Phe Arg Ile Ala Glu

340 345 350

Leu Ser Gly Asn Arg Pro Leu Thr Val Ile Met His Thr Ile Phe Gln

355 360 365

Glu Arg Asp Leu Leu Lys Thr Phe Lys Ile Pro Val Asp Thr Leu Ile

370 375 380

Thr Tyr Leu Met Thr Leu Glu Asp His Tyr His Ala Asp Val Ala Tyr

385 390 395 400

His Asn Asn Ile His Ala Ala Asp Val Val Gln Ser Thr His Val Leu

405 410 415

Leu Ser Thr Pro Ala Leu Glu Ala Val Phe Thr Asp Leu Glu Ile Leu

420 425 430

Ala Ala Ile Phe Ala Ser Ala Ile His Asp Val Asp His Pro Gly Val

435 440 445

Ser Asn Gln Phe Leu Ile Asn Thr Asn Ser Glu Leu Ala Leu Met Tyr

450 455 460

Asn Asp Ser Ser Val Leu Glu Asn His His Leu Ala Val Gly Phe Lys

465 470 475 480

Leu Leu Gln Glu Glu Asn Cys Asp Ile Phe Gln Asn Leu Thr Lys Lys

485 490 495

Gln Arg Gln Ser Leu Arg Lys Met Val Ile Asp Ile Val Leu Ala Thr

500 505 510

Asp Met Ser Lys His Met Asn Leu Leu Ala Asp Leu Lys Thr Met Val

515 520 525

Glu Thr Lys Lys Val Thr Ser Ser Gly Val Leu Leu Leu Asp Asn Tyr

530 535 540

Ser Asp Arg Ile Gln Val Leu Gln Asn Met Val His Cys Ala Asp Leu

545 550 555 560

Ser Asn Pro Thr Lys Pro Leu Gln Leu Tyr Arg Gln Trp Thr Asp Arg

565 570 575

Ile Met Glu Glu Phe Phe Arg Gln Gly Asp Arg Glu Arg Glu Arg Gly

580 585 590

Met Glu Ile Ser Pro Met Cys Asp Lys His Asn Ala Ser Val Glu Lys

595 600 605

Ser Gln Val Gly Phe Ile Asp Tyr Ile Val His Pro Leu Trp Glu Thr

610 615 620

Trp Ala Asp Leu Val His Pro Asp Ala Gln Asp Ile Leu Asp Thr Leu

625 630 635 640

Glu Asp Asn Arg Glu Trp Tyr Gln Ser Thr Ile Pro Gln Ser Pro Ser

645 650 655

Pro Ala Pro Asp Asp Pro Glu Glu Gly Arg Gln Gly Gln Thr Glu Lys

660 665 670

Phe Gln Phe Glu Leu Thr Leu Glu Glu Asp Gly Glu Ser Asp Thr Glu

675 680 685

Lys Asp Ser Gly Ser Gln Val Glu Glu Asp Thr Ser Cys Ser Asp Ser

690 695 700

Lys Thr Leu Cys Thr Gln Asp Ser Glu Ser Thr Glu Ile Pro Leu Asp

705 710 715 720

Glu Gln Val Glu Glu Glu Ala Val Gly Glu Glu Glu Glu Ser Gln Pro

725 730 735

Glu Ala Cys Val Ile Asp Asp Arg Ser Pro Asp Thr

740 745

<210> 8

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> PDE4D7

<400> 8

gaacattcaa cgaccaacca 20

<210> 9

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> PDE4D7_обратный праймер

<400> 9

tgccattgtc cacatcaaaa 20

<210> 10

<211> 27

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> PDE4D7 зонд

<400> 10

ctgccgctga ttgctatcac ttctgca 27

<210> 11

<211> 1278

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 11

ccattggcct gtagattcac ctcccctggg cagggcccca ggacccagga taatatctgt 60

gcctcctgcc cagaaccctc caagcagaca caatggtaag aatggtgcct gtcctgctgt 120

ctctgctgct gcttctgggt cctgctgtcc cccaggagaa ccaagatggt cgttactctc 180

tgacctatat ctacactggg ctgtccaagc atgttgaaga cgtccccgcg tttcaggccc 240

ttggctcact caatgacctc cagttcttta gatacaacag taaagacagg aagtctcagc 300

ccatgggact ctggagacag gtggaaggaa tggaggattg gaagcaggac agccaacttc 360

agaaggccag ggaggacatc tttatggaga ccctgaaaga catcgtggag tattacaacg 420

acagtaacgg gtctcacgta ttgcagggaa ggtttggttg tgagatcgag aataacagaa 480

gcagcggagc attctggaaa tattactatg atggaaagga ctacattgaa ttcaacaaag 540

aaatcccagc ctgggtcccc ttcgacccag cagcccagat aaccaagcag aagtgggagg 600

cagaaccagt ctacgtgcag cgggccaagg cttacctgga ggaggagtgc cctgcgactc 660

tgcggaaata cctgaaatac agcaaaaata tcctggaccg gcaagatcct ccctctgtgg 720

tggtcaccag ccaccaggcc ccaggagaaa agaagaaact gaagtgcctg gcctacgact 780

tctacccagg gaaaattgat gtgcactgga ctcgggccgg cgaggtgcag gagcctgagt 840

tacggggaga tgttcttcac aatggaaatg gcacttacca gtcctgggtg gtggtggcag 900

tgcccccgca ggacacagcc ccctactcct gccacgtgca gcacagcagc ctggcccagc 960

ccctcgtggt gccctgggag gccagctagg aagcaagggt tggaggcaat gtgggatctc 1020

agacccagta gctgcccttc ctgcctgatg tgggagctga accacagaaa tcacagtcaa 1080

tggatccaca aggcctgagg agcagtgtgg ggggacagac aggaggtgga tttggagacc 1140

gaagactggg atgcctgtct tgagtagact tggacccaaa aaatcatctc accttgagcc 1200

cacccccacc ccattgtcta atctgtagaa gctaataaat aatcatccct ccttgcctag 1260

cataaaaaaa aaaaaaaa 1278

<210> 12

<211> 298

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 12

Met Val Arg Met Val Pro Val Leu Leu Ser Leu Leu Leu Leu Leu Gly

1 5 10 15

Pro Ala Val Pro Gln Glu Asn Gln Asp Gly Arg Tyr Ser Leu Thr Tyr

20 25 30

Ile Tyr Thr Gly Leu Ser Lys His Val Glu Asp Val Pro Ala Phe Gln

35 40 45

Ala Leu Gly Ser Leu Asn Asp Leu Gln Phe Phe Arg Tyr Asn Ser Lys

50 55 60

Asp Arg Lys Ser Gln Pro Met Gly Leu Trp Arg Gln Val Glu Gly Met

65 70 75 80

Glu Asp Trp Lys Gln Asp Ser Gln Leu Gln Lys Ala Arg Glu Asp Ile

85 90 95

Phe Met Glu Thr Leu Lys Asp Ile Val Glu Tyr Tyr Asn Asp Ser Asn

100 105 110

Gly Ser His Val Leu Gln Gly Arg Phe Gly Cys Glu Ile Glu Asn Asn

115 120 125

Arg Ser Ser Gly Ala Phe Trp Lys Tyr Tyr Tyr Asp Gly Lys Asp Tyr

130 135 140

Ile Glu Phe Asn Lys Glu Ile Pro Ala Trp Val Pro Phe Asp Pro Ala

145 150 155 160

Ala Gln Ile Thr Lys Gln Lys Trp Glu Ala Glu Pro Val Tyr Val Gln

165 170 175

Arg Ala Lys Ala Tyr Leu Glu Glu Glu Cys Pro Ala Thr Leu Arg Lys

180 185 190

Tyr Leu Lys Tyr Ser Lys Asn Ile Leu Asp Arg Gln Asp Pro Pro Ser

195 200 205

Val Val Val Thr Ser His Gln Ala Pro Gly Glu Lys Lys Lys Leu Lys

210 215 220

Cys Leu Ala Tyr Asp Phe Tyr Pro Gly Lys Ile Asp Val His Trp Thr

225 230 235 240

Arg Ala Gly Glu Val Gln Glu Pro Glu Leu Arg Gly Asp Val Leu His

245 250 255

Asn Gly Asn Gly Thr Tyr Gln Ser Trp Val Val Val Ala Val Pro Pro

260 265 270

Gln Asp Thr Ala Pro Tyr Ser Cys His Val Gln His Ser Ser Leu Ala

275 280 285

Gln Pro Leu Val Val Pro Trp Glu Ala Ser

290 295

<210> 13

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> AZGP1_прямой праймер

<400> 13

tggagaccct gaaagacatc 20

<210> 14

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> AZGP1_обратный праймер

<400> 14

ctcgatctca caaccaaacc 20

<210> 15

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> AZGP1 зонд

<400> 15

acgggtctca cgtattgcag gga 23

<210> 16

<211> 2312

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 16

ctcctcccgg gcgggataat tgaacggcgc ggccctggcc cagcgttggc tgccgaggct 60

cggccggagc gtggagcccg cgccgctgcc ccaggaccgc gcccgcgcct ttgtccgccg 120

ccgcccaccg cccgtcgccc gccgcccatg gagcgcgccg cgccgtcgcg ccgggtcccg 180

cttccgctgc tgctgctcgg cggccttgcg ctgctggcgg ccggagtgga cgcggatgtc 240

ctcctggagg cctgctgtgc ggacggacac cggatggcca ctcatcagaa ggactgctcg 300

ctgccatatg ctacggaatc caaagaatgc aggatggtgc aggagcagtg ctgccacagc 360

cagctggagg agctgcactg tgccacgggc atcagcctgg ccaacgagca ggaccgctgt 420

gccacgcccc acggtgacaa cgccagcctg gaggccacat ttgtgaagag gtgctgccat 480

tgctgtctgc tggggagggc ggcccaggcc cagggccaga gctgcgagta cagcctcatg 540

gttggctacc agtgtggaca ggtcttccgg gcatgctgtg tcaagagcca ggagaccgga 600

gatttggatg tcgggggcct ccaagaaacg gataagatca ttgaggttga ggaggaacaa 660

gaggacccat atctgaatga ccgctgccga ggaggcgggc cctgcaagca gcagtgccga 720

gacacgggtg acgaggtggt ctgctcctgc ttcgtgggct accagctgct gtctgatggt 780

gtctcctgtg aagatgtcaa tgaatgcatc acgggcagcc acagctgccg gcttggagaa 840

tcctgcatca acacagtggg ctctttccgc tgccagcggg acagcagctg cgggactggc 900

tatgagctca cagaggacaa tagctgcaaa gatattgacg agtgtgagag tggtattcat 960

aactgcctcc ccgattttat ctgtcagaat actctgggat ccttccgctg ccgacccaag 1020

ctacagtgca agagtggctt tatacaagat gctctaggca actgtattga tatcaatgag 1080

tgtttgagta tcagtgcccc gtgccctatc gggcatacat gcatcaacac agagggctcc 1140

tacacgtgcc agaagaacgt gcccaactgt ggccgtggct accatctcaa cgaggaggga 1200

acgcgctgtg ttgatgtgga cgagtgcgcg ccacctgctg agccctgtgg gaagggacat 1260

cgctgcgtga actctcccgg cagtttccgc tgcgaatgca agacgggtta ctattttgac 1320

ggcatcagca ggatgtgtgt cgatgtcaac gagtgccagc gctaccccgg gcgcctgtgt 1380

ggccacaagt gcgagaacac gctgggctcc tacctctgca gctgttccgt gggcttccgg 1440

ctctctgtgg atggcaggtc atgtgaagac atcaatgagt gcagcagcag cccctgtagc 1500

caggagtgtg ccaacgtcta cggctcctac cagtgttact gccggcgagg ctaccagctc 1560

agcgatgtgg atggagtcac ctgtgaagac atcgacgagt gcgccctgcc caccgggggc 1620

cacatctgct cctaccgctg catcaacatc cctggaagct tccagtgcag ctgcccctcg 1680

tctggctaca ggctggcccc caatggccgc aactgccaag acattgatga gtgtgtgact 1740

ggcatccaca actgctccat caacgagacc tgcttcaaca tccagggcgg cttccgctgc 1800

ctggccttcg agtgccctga gaactaccgc cgctccgcag ccacccgctg tgagcgcttg 1860

ccttgccatg agaatcggga gtgctccaag ctgcctctga gaataaccta ctaccacctc 1920

tctttcccca ccaacatcca agcgcccgcg gtggttttcc gcatgggccc ctccagtgct 1980

gtccccgggg acagcatgca gctggccatc accggcggca atgaggaggg ctttttcacc 2040

acccggaagg tgagccccca cagtggggtg gtggccctca ccaagcctgt ccccgagccc 2100

agggacttgc tcctgaccgt caagatggat ctctctcgcc acggcaccgt cagctccttt 2160

gtggccaagc ttttcatctt tgtgtctgca gagctctgag cactcgcttc gcgtcgcggg 2220

gtctccctcc tgttgctttc ctaaccctgc cctccggggc gttaataaag tcttagcaag 2280

cgtcccacac agtgaaaaaa aaaaaaaaaa aa 2312

<210> 17

<211> 2662

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 17