УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[01] Стареющие клетки представляют собой клетки, которые частично функциональны или нефункциональны и которые находятся в состоянии остановки пролиферации. Старение является четко различимым состоянием клетки и связано с биомаркерами, такими как активация биомаркера p16^Ink4a («p16»), и экспрессией β-галактозидазы. Старение начинается с повреждения или стресса (такого как избыточная стимуляция факторами роста) клеток. Повреждение или стресс отрицательно влияют на митохондриальную ДНК в клетках, вызывая выработку в них свободных радикалов, которые вступают в реакцию с сахарами в клетке с образованием метилглиоксаля (МГ). В свою очередь МГ реагирует с белками или липидами с образованием конечных продуктов повышенного гликирования (AGE). МГ реагирует с компонентом белков лизином с образованием карбоксиметиллизина, который представляет собой AGE. AGE также образуются в результате неферментативного взаимодействия сахаров в крови с внешними клеточными белками.

[02] Повреждение или стресс митохондриальной ДНК также вызывает развитие ответа на повреждение ДНК, который индуцирует в клетке выработку белков, блокирующих клеточный цикл. Такие блокирующие белки препятствуют делению клетки. Длительное повреждение или стресс вызывает выработку mTOR, который, в свою очередь, активирует синтез белка и инактивирует распад белка. Дальнейшая стимуляция клеток приводит к запрограммированной гибели клеток (апоптозу).

[03] p16 представляет собой белок, который участвует в регуляции клеточного цикла путем ингибирования S-фазы. Он может быть активирован во время старения или в ответ на различные виды стресса, такие как повреждение ДНК, окислительный стресс или воздействие лекарственных препаратов. p16 обычно рассматривается как белок-супрессор роста опухолей, который вызывает старение клетки в ответ на повреждение ДНК и необратимо препятствует переходу клетки в гиперпролиферативное состояние. Однако в отношении упомянутых выше данных существует некоторая неясность, поскольку некоторые опухоли демонстрируют избыточную экспрессию p16, в то время как другие демонстрируют пониженную экспрессию. Имеющиеся данные свидетельствуют о том, что избыточная экспрессия р16 в некоторых опухолях обусловлена дефектным белком ретинобластомы («Rb»). p16 действует на Rb, ингибируя тем самым S-фазу, и Rb подавляет p16, создавая отрицательную обратную связь. Дефектный Rb не способен ингибировать S-фазу и подавлять p16, что приводит к избыточной экспрессии p16 в клетках с чрезмерной пролиферацией. Romagosa, C. et al., p16^Ink4a overexpression in cancer: a tumor suppressor gene associated with senescence and high-grade tumors, Oncogene, Vol. 30, 2087-2097 (2011).

[04] Известно, что стареющие клетки стимулируют размножение раковых клеток. Стареющие клетки связаны с секрецией многих факторов, участвующих в межклеточной передаче сигналов, включая провоспалительные факторы; секреция таких факторов была названа секреторным фенотипом, связанным со старением, или SASP. Результаты одного из исследований показали, что стареющие мезенхимальные стволовые клетки стимулируют пролиферацию и миграцию клеток рака молочной железы путем секреции IL-6 (Di, G-h. et al. IL-6 Secreted from Senescent Mesenchymal Stem Cells Promotes Proliferation and migration of Breast Cancer Cells, PLOS One, Vol. 9, 11, e113572 (2014)). Результаты другого исследования показали, что стареющие фибробласты человека увеличивают рост опухолей за счет секреции матриксной металлопротеиназы (Liu, D. et al. Senescent Human Fibroblasts Increase the Early Growth of Xenograft Tumors via Matrix Metalloproteinase Secretion, Cancer Res, Vol. 67, 3117-3126 (2007)).

[05] Стареющие клетки секретируют активные формы кислорода («ROS») как часть SASP. Полагают, что ROS играют важную роль в поддержании старения клеток. Секреция ROS создает эффект «свидетеля», когда стареющие клетки индуцируют старение в соседних клетках: ROS создают именно то клеточное повреждение, которое, как известно, активирует экспрессию p16, что приводит к старению (Nelson, G., A senescent cell bystander effect: senescence-induced senescence, Aging Cell, Vo. 11, 345-349 (2012)). Путь p16/Rb ведет к индукции ROS, которая, в свою очередь, активирует дельта-изоформу протеинкиназы C, создавая контур положительной обратной связи, который дополнительно усиливает выработку ROS, что содействует поддержанию необратимой остановки клеточного цикла; более того, было высказано предположение, что воздействие ROS на раковые клетки может быть эффективным для лечения рака путем индукции остановки перехода между фазами клеточного цикла в клетках с чрезмерной пролиферацией (Rayess, H. et al., Cellular senescence and tumor suppressor gene p16, Int J Cancer, Vol. 130, 1715-1725 (2012)).

[06] Конечные продукты повышенного гликирования (AGE, также называемые AGE-модифицированными белками или конечными продуктами гликирования) вырабатываются в результате неферментативной реакции сахаров с боковыми цепями белков (Ando, K. et al., Membrane Proteins of Human Erythrocytes Are Modified by Advanced Glycation End Products during Aging in the Circulation, Biochem Biophys Res Commun., Vol. 258, 123, 125 (1999)). Этот процесс начинается с обратимой реакции между восстанавливающим сахаром и аминогруппой с образованием основания Шиффа, из которого впоследствии в результате перегруппировки Амадори образуется ковалентно связанный продукт. После образования продукт перегруппировки Амадори подвергается дальнейшей перегруппировке с образованием AGE. Гипергликемия, вызванная сахарным диабетом (СД), и окислительный стресс стимулируют указанную посттрансляционную модификацию мембранных белков (Lindsey JB, et al., ʺReceptor For Advanced Glycation End-Products (RAGE) and soluble RAGE (sRAGE): Cardiovascular Implications,ʺ Diabetes Vascular Disease Research, Vol. 6(1), 7-14, (2009)). AGE связывают с несколькими патологическими состояниями, включая осложнения диабета, воспаление, ретинопатию, нефропатию, атеросклероз, инсульт, дисфункцию эндотелиальных клеток и нейродегенеративные расстройства (Bierhaus A, ʺAGEs and their interaction with AGE-receptors in vascular disease and diabetes mellitus. I. The AGE concept,ʺ Cardiovasc Res, Vol. 37(3), 586-600 (1998)).

[07] AGE-модифицированные белки также являются маркером стареющих клеток. Такая связь между конечным продуктом гликирования и старением хорошо известна в данной области техники. См., например, Gruber, L. (WO 2009/143411, 26 Nov. 2009), Ando, K. et al. (Membrane Proteins of Human Erythrocytes Are Modified by Advanced Glycation End Products during Aging in the Circulation, Biochem Biophys Res Commun., Vol. 258, 123, 125 (1999)), Ahmed, E.K. et al. (ʺProtein Modification and Replicative Senescence of WI-38 Human Embryonic Fibroblastsʺ Aging Cells, vol. 9, 252, 260 (2010)), Vlassara, H. et al. (Advanced Glycosylation Endproducts on Erythrocyte Cell Surface Induce Receptor-Mediated Phagocytosis by Macrophages, J. Exp. Med., Vol. 166, 539, 545 (1987)) и Vlassara et al. (ʺHigh-affinity-receptor-mediated Uptake and Degradation of Glucose-modified Proteins: A Potential Mechanism for the Removal of Senescent Macromoleculesʺ Proc. Natl. Acad. Sci. USAI, Vol. 82, 5588, 5591 (1985)). Помимо этого, в работе Ahmed, E.K. et al. указано, что конечные продукты гликирования являются «одной из основных причин спонтанного повреждения клеточных и внеклеточных белков» (Ahmed, E.K. et al., см. выше, стр. 353). Соответственно, накопление конечных продуктов повышенного гликирования связано со старением. Поскольку образование конечных продуктов повышенного гликирования связывают с окислением, накопление конечных продуктов повышенного гликирования может быть результатом образования ROS в стареющих клетках (Fu, M.-X., et al., The Advanced Glycation End Product, N^Ε-(Carboxymehtyl)lysine, Is a Product of both Lipid Peroxidation and Glycoxidation Reactions, J. Biol. Chem., Vol. 271, 9982-9986 (1996)).

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[08] Согласно первому аспекту настоящее изобретение относится к способу лечения рака, уничтожения метастатических раковых клеток, уничтожения потенциально злокачественных неопластических клеток и/или профилактики метастазов рака, включающему введение субъекту композиции, содержащей антитело к AGE.

[09] Согласно второму аспекту настоящее изобретение относится к способу лечения рака, уничтожения метастатических раковых клеток, уничтожения потенциально злокачественных неопластических клеток и/или профилактики метастазов рака, включающему введение композиции, содержащей первое антитело к AGE и второе антитело к AGE. Второе антитело к AGE и первое антитело к AGE являются различными.

[010] Согласно третьему аспекту настоящее изобретение относится к способу лечения субъекта, имеющего рак, уничтожения метастатических раковых клеток, уничтожения потенциально злокачественных неопластических клеток и/или профилактики метастазов рака, включающему первое введение антитела к AGE; затем исследование эффективности первого введения при лечении рака у субъекта, уничтожении метастатических раковых клеток, уничтожении потенциально злокачественных неопластических клеток и/или предотвращении метастазов рака; затем второе введение антитела к AGE.

[011] Согласно четвертому аспекту настоящее изобретение относится к применению антитела к AGE для изготовления лекарственного средства для лечения рака, уничтожения метастатических раковых клеток, уничтожения потенциально злокачественных неопластических клеток и/или профилактики метастазов рака.

[012] Согласно пятому аспекту настоящее изобретение относится к композиции, содержащей антитело к AGE для применения для лечения рака, уничтожения метастатических раковых клеток, уничтожения потенциально злокачественных неопластических клеток и/или профилактики метастазов рака.

[013] Согласно шестому аспекту настоящее изобретение относится к композиции для лечения рака, уничтожения метастатических раковых клеток, уничтожения потенциально злокачественных неопластических клеток и/или профилактики метастазов рака, содержащей первое антитело к AGE, второе антитело к AGE и фармацевтически приемлемый носитель. Первое антитело к AGE и второе антитело к AGE являются различными.

[014] Согласно седьмому аспекту настоящее изобретение относится к способу диагностики метастатического рака, включающему детектирование иммунного комплекса, содержащего антитело к AGE, связанное с клеткой, экспрессирующей модификацию AGE.

[015] Согласно восьмому аспекту настоящее изобретение относится к иммунному комплексу, содержащему антитело к AGE, связанное с метастатической раковой клеткой. Метастатическая раковая клетка экспрессирует модификацию AGE.

[016] Согласно девятому аспекту настоящее изобретение относится к набору для диагностики метастатического рака, содержащему антитело к AGE, контрольный образец и необязательно реагент, который связывается с антителом к AGE.

[017] ОПРЕДЕЛЕНИЯ

[018] Термин «пептид» означает молекулу, состоящую из 2-50 аминокислот.

[019] Термин «белок» означает молекулу, состоящую более чем из 50 аминокислот.

[020] Термины «конечный продукт повышенного гликирования», «AGE», «AGE-модифицированный белок или пептид», «конечный продукт гликирования» и «антиген AGE» относятся к модифицированным белкам или пептидам, которые образуются в результате реакции сахаров с боковыми цепями белков, которые дополнительно перегруппировываются и образуют необратимые поперечные сшивки. Этот процесс начинается с обратимой реакции между восстанавливающим сахаром и аминогруппой с образованием основания Шиффа, которое затем в результате перегруппировки Амадори образует ковалентно связанный продукт. После образования продукт перегруппировки Амадори подвергается дальнейшей перегруппировке с получением AGE. AGE-модифицированные белки и антитела к AGE-модифицированным белкам описаны в патенте США №5702704 автором Bucala («Bucala») и US 6380165 коллективом авторов Al-Abed et al. («Al-Abed»). Гликированные белки или пептиды, которые не претерпели необходимой перегруппировки для образования AGE, такие как N-дезоксифруктозиллизин, обнаруженный на гликированном альбумине, не являются AGE. AGE могут быть выявлены на основании присутствия модификаций AGE (также называемых эпитопами AGE или фрагментами AGE), таких как 2-(2-фуроил)-4(5)-(2-фуранил)-1Н-имидазол («FFI»); 5-гидроксиметил-1-алкилпиррол-2-карбальдегид («пирралин»); 1-алкил-2-формил-3,4-дигликозилпиррол («AFGP»), не флуоресцентная модель AGE; карбоксиметиллизин; и пентозидин. ALI, еще один AGE, описан в работе Al-Abed.

[021] «Антитело, которое связывается с AGE-модифицированным белком на клетке», «анти-AGE антитело» или «антитело к AGE» означает антитело или другой белок, который связывается с AGE-модифицированным белком или пептидом, и содержит константную область антитела, причем указанный белок или пептид, который был модифицирован AGE, представляет собой белок или пептид, который обычно обнаруживается на поверхности клетки, предпочтительно клетки млекопитающего, более предпочтительно клетки человека, кошки, собаки, лошади, верблюда (например, верблюда или альпаки), крупного рогатого скота, овцы или козы. «Антитело, которое связывается с AGE-модифицированным белком на клетке», «анти-AGE антитело» или «антитело к AGE» не включает антитело или другой белок, который связывается с аналогичной специфичностью и селективностью с AGE-модифицированным белком или пептидом, и тем же самым белком или пептидом, не модифицированным AGE (то есть присутствие модификации AGE не увеличивает связывание). AGE-модифицированный альбумин не является AGE-модифицированным белком на клетке, поскольку альбумин не является белком, обычно встречающимся на поверхности клеток. «Антитело, которое связывается с AGE-модифицированным белком на клетке», «анти-AGE антитело», или «антитело к AGE» включает только те антитела, которые приводят к удалению, разрушению или гибели клетки. В область настоящего изобретения также включены антитела, которые конъюгированы, например, с токсином, лекарственным препаратом или другим химическим веществом или частицей. Предпочтительно антитела являются моноклональными антителами, однако также допустимы поликлональные антитела.

[022] Термин «стареющая клетка» означает клетку, которая находится в состоянии остановки пролиферации и экспрессирует один или более биомаркеров старения, таких как активация p16^Ink4a или экспрессия связанной со старением β-галактозидазы.

[023] Термин «вариант» означает нуклеотидную, белковую или аминокислотную последовательность, отличную от конкретно идентифицированных последовательностей, в которой один или более нуклеотидов, белков или аминокислотных остатков удалены, заменены или добавлены. Варианты могут представлять собой природные аллельные варианты или неприродные варианты. Варианты идентифицированных последовательностей могут сохранять некоторые или все функциональные характеристики идентифицированных последовательностей.

[024] Термин «процент (%) идентичности последовательностей» определяют как процент аминокислотных остатков в последовательности-кандидате, которые идентичны аминокислотным остаткам в эталонной полипептидной последовательности, после выравнивания последовательностей и введения пробелов, если это необходимо, для достижения максимального процента идентичности последовательностей, и без учета каких-либо консервативных замен как части идентичности последовательностей. Сопоставление для определения процента идентичности аминокислотных последовательностей может быть достигнуто различными способами, используя общедоступное компьютерное программное обеспечение, такое как BLAST, BLAST-2, ALIGN или Megalign (DNASTAR). Предпочтительно значения процента идентичности последовательностей (%) рассчитывают с использованием компьютерной программы для сравнения последовательностей ALIGN-2. Компьютерная программа для сравнения последовательностей ALIGN-2 общедоступна от Genentech, Inc. (Южный Сан-Франциско, Калифорния, США) или может быть скомпилирована из исходного кода, который был подан с документацией пользователя в Бюро по защите авторских прав США и зарегистрирован под номером регистрации прав на объект авторского права США TXU510087. Программа ALIGN-2 должна быть скомпилирована для использования в операционной системе UNIX, включая цифровой UNIX V4.0D. Все параметры сравнения последовательностей задаются программой ALIGN-2 и не меняются.

[025] В тех случаях, когда ALIGN-2 используется для сравнения аминокислотных последовательностей, идентичность последовательностей (%) конкретной аминокислотной последовательности A в отношении или с конкретной аминокислотной последовательностью B (что можно перефразировать как конкретная аминокислотная последовательность A, которая имеет или обладает определенным процентом идентичности аминокислотной последовательности в отношении, с или в сравнении с конкретной аминокислотной последовательностью B), рассчитывается следующим образом: 100 умножить на долю X/Y, где X это количество аминокислотных остатков, оцененных как идентичные совпадения программой выравнивания последовательностей ALIGN-2 при сопоставлении этой программой A и B, и где Y это общее количество аминокислотных остатков в B. Если длина аминокислотной последовательности A не равна длине аминокислотной последовательности B, то процент идентичности аминокислотной последовательности А с B не будет равен проценту идентичности аминокислотной последовательности B с A. Если не указано иное, в настоящей заявке все значения процента идентичности аминокислотных последовательностей получают с использованием компьютерной программы ALIGN-2.

[026] Термин «иммунный комплекс» означает комбинацию антитела, связанного с антигеном. Иммунный комплекс также может называться «комплекс антитело-антиген».

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

[027] На ФИГ. 1 представлен график зависимости ответа от времени в эксперименте со связыванием антитела.

[028] На ФИГ. 2 представлен набор для диагностики метастазов злокачественного новообразования.

[029] На ФИГ. 3 представлен график изменения нормированного объема опухоли в ходе исследования в условиях in vivo для изучения действия антитела к AGE на рост опухоли, метастатический потенциал и кахексию.

[030] На ФИГ. 4 представлен график изменения нормированной массы тела мышей в ходе исследования в условиях in vivo для изучения действия антитела к AGE на рост опухоли, метастатический потенциал и кахексию.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

[031] Результаты недавних исследований на C. elegans указывают на то, что активно пролиферирующие клетки не являются инвазивными и что инвазивные клетки, такие как метастазирующие раковые клетки, не способны к пролиферации и должны находиться в состоянии подавленного клеточного цикла (Matus et al., Invasive Cell Fate Requires G1 Cell-Cycle arrest and Histone Deacetylase-Mediated Changes in Gene Expression, Developmental Cell, Vol. 35, 162-174 (2015)). Другие исследователи обнаружили, что образование ROS может индуцировать метастазирование раковых клеток (Porporato, P. E., et al. A Mitochondrial Switch Promotes Tumor Metastasis, Cell Reports, Vol. 8, 754-766 (2014)).

[032] Остановка смены фаз клеточного цикла и выработка ROS придают метастазирующим раковым клеткам многие характеристики стареющих клеток, которые, как ожидается, могут включать присутствие AGE-модифицированных белков на поверхности клетки. Следовательно, AGE-модифицированные белки обеспечивают антиген, который может быть мишенью при применении антител, для поиска и уничтожения метастазирующих раковых клеток. Введение антител к AGE может уничтожить метастазирующие раковые клетки, обеспечивая тем самым лечение злокачественного новообразования. Введение антител к AGE может предотвратить образование метастазов у пациента, имеющего рак, и может применяться профилактически для предотвращения распространения рака.

[033] Потенциально злокачественные неопластические образования, такие как себорейный кератоз, актинический кератоз и карцинома in situ, имеют много характеристик стареющих клеток, таких как экспрессия p16, которые, как ожидается, могут включать присутствие AGE-модифицированных белков на поверхности клеток. Следовательно, AGE-модифицированные белки обеспечивают антиген, который может быть мишенью при применении антител, для поиска и уничтожения потенциально злокачественных неопластических клеток. Введение антител к AGE может уничтожить потенциально злокачественные неопластические клетки, предотвращая тем самым рак. Введение антител к AGE можно применять профилактически для предотвращения развития рака у пациента.

[034] Антитело, которое связывается с AGE-модифицированным белком на клетке («анти-AGE антитело» или «антитело к AGE»), известно в данной области техники. Примеры включают антитела, которые описаны в патентах США №5702704 (Bucala) и №6380165 (Al-Abed et al.). Примеры включают антитело, которое связывается с одним или более AGE-модифицированными белками, содержащими модификацию AGE, такую как FFI, пирралин, AFGP, ALI, карбоксиметиллизин, карбоксиэтиллизин и пентозидин, а также смеси указанных антител. Предпочтительно антитело связывается с белками, модифицированными карбоксиметиллизином. Предпочтительно антитело является неиммуногенным у животного, у которого оно будет использовано, например, неиммуногенным у человека; животных-компаньонов, включая кошек, собак и лошадей; и коммерчески важных животных, таких как верблюды (или альпака), рогатый скот (крупный рогатый скот), овцы и козы. Более предпочтительно антитело содержит константную область антител из того же вида, как и антитела животного, для снижения иммунного ответа на антитело, т.е. антитело гуманизировано (для человека), содержит фрагменты антител кошачьих (для кошек), содержит фрагменты антител собачьих (для собак), содержит фрагменты антител лошадиных (для лошадей), содержит фрагменты антител верблюдовых (для верблюда или альпаки), содержит фрагменты антител крупного рогатого скота (для крупного рогатого скота), содержит фрагменты антител овец (для овец) или коз (для коз). Наиболее предпочтительно антитело идентично антителу животного, у которого оно будет использовано (за исключением вариабельной области), такому как антитело человека, кошачье антитело, собачье антитело, конское антитело, верблюжье антитело, бычье антитело, овечье антитело или козье антитело. Более подробная информация о константных областях и других частях антител для указанных животных представлена ниже. Предпочтительно антитело представляет собой моноклональное антитело (мАт), однако также допустимы поликлональные антитела.

[035] Особенно предпочтительные антитела к AGE представляют собой антитела, которые связываются с белками или пептидами, которые содержат модификацию AGE, представляющую собой карбоксиметиллизин или карбоксиэтиллизин. Карбоксиметиллизин (также известный как N(эпсилон)-(карбоксиметил)лизин, N(6)-карбоксиметиллизин или 2-амино-6-(карбоксиметиламино)гексановая кислота) и карбоксиэтиллизин (также известный как N(эпсилон)-(карбоксиэтил)лизин) обнаружены на белках или пептидах и липидах как результат окислительного стресса и химического гликирования. CML- и CEL-модифицированные белки или пептиды распознаются рецептором RAGE, который экспрессируется на различных клетках. CML и CEL были хорошо изучены, и продукты, связанные с CML и CEL, являются коммерчески доступными. Например, Cell Biolabs, Inc. продает антигены CML-BSA, поликлональные антитела к CML, наборы для иммуноблоттинга CML и наборы для конкурентного ИФА CML (www.cellbiolabs.com/cml-assays), а также антигены CEL-BSA и наборы для конкурентного ИФА CEL (www.cellbiolabs.com/cel-n-epsilon-carboxyethyl-lysine-assays-and-reagents). Особенно предпочтительное антитело содержит вариабельную область коммерчески доступного мышиного антитела к конечному продукту гликирования, которое вырабатывается к карбоксиметиллизину, конъюгированного с гемоцианином фиссуреллы, мАт к карбоксиметиллизину (клон 318003), доступного от R&D Systems, Inc. (Миннеаполис, Миннесота, США; каталожный номер MAB3247), которое модифицировано для включения константной области человека (или константной области животного, которому оно будет введено). Коммерчески доступные антитела, такие как антитело к карбоксиметиллизину, соответствующее каталожному номеру MAB3247 от R&D Systems, Inc., могут быть предназначены для диагностических целей и могут содержать материал, который не подходит для использования у животных или человека. Предпочтительно коммерчески доступные антитела очищают и/или выделяют перед использованием у животных или человека для удаления токсинов или другого потенциально опасного материала.

[036] Антитело к AGE имеет низкую скорость диссоциации из комплекса антитело-антиген или k_d (также называемую k_back или скорость обратной реакции), предпочтительно не более 9×10^-3, 8×10^-3, 7×10^-3 или 6×10^-3 (с^-1). Антитело к AGE обладает высокой аффинностью в отношении AGE-модифицированного белка клетки, которая может быть выражена как низкая константа диссоциации K_D не более 9×10^-6, 8×10^-6, 7×10^-6, 6×10^-6, 5×10^-6, 4×10^-6 или 3×10^-6 (М). Предпочтительно связывающие свойства антитела к AGE сходны, аналогичны или лучше таковых для мАт к карбоксиметиллизину (клон 318003), доступного от R&D Systems, Inc. (Миннеаполис, Миннесота, США, каталожный номер MAB3247), как показано на ФИГ. 1.

[037] Антитело к AGE может разрушать AGE-модифицированные клетки посредством антителозависимой клеточной цитотоксичности (АЗКЦ). АЗКЦ представляет собой механизм опосредованной клетками иммунной защиты, при котором эффекторная клетка иммунной системы активно лизирует клетку-мишень, поверхностные мембранные антигены которой были связаны со специфичными антителами. АЗКЦ может быть опосредована природными клетками-киллерами (NK-клетками), макрофагами, нейтрофилами или эозинофилами. Эффекторные клетки связываются с частью Fc связанного антитела. Введение NK-клеток, таких как клетки NK92 (линия клеток, доступная от NantKwest, Калвер-Сити, Калифорния, США) совместно или после введения антител к AGE может усилить активность комплимента и, следовательно, эффективность уничтожения метастазирующих раковых клеток антителами к AGE. Антитело к AGE также может разрушать AGE-модифицированные клетки посредством комплементзависимой цитотоксичности (КЗЦ). При КЗЦ каскад комплемента иммунной системы инициируется в результате связывания антитела с антигеном-мишенью.

[038] Антитело к AGE может быть конъюгировано с агентом, который вызывает разрушение AGE-модифицированных клеток. Подходящие агенты могут представлять собой токсин, цитотоксический агент, магнитные наночастицы и магнитные спин-вихревые диски.

[039] Токсин, например, порообразующие токсины (PFT) (Aroian R. et al., ʺPore-Forming Toxins and Cellular Non-Immune Defenses (CNIDs),ʺ Current Opinion in Microbiology, 10:57-61 (2007)), конъюгированный с антителом к AGE, может быть введен пациенту путем инъекции, чтобы селективно нацелено воздействовать и удалить AGE-модифицированные клетки. Антитело к AGE распознает и связывается с AGE-модифицированными клетками. Затем токсин вызывает образование пор на поверхности клетки и последующее удаление клетки посредством осмотического лизиса.

[040] Магнитные наночастицы, конъюгированные с антителом к AGE, могут быть введены пациенту путем инъекции для нацеленного воздействия и удаления AGE-модифицированных клеток. Магнитные наночастицы могут быть нагреты путем применения магнитного поля для селективного удаления AGE-модифицированных клеток.

[041] В качестве альтернативы магнитные спин-вихревые диски, которые намагничиваются только при применении магнитного поля для того чтобы избежать самоагрегации, которая может блокировать кровеносные сосуды, начинают вращаться при применении магнитного поля, вызывая нарушение целостности мембраны клеток-мишеней. Магнитные спин-вихревые диски, конъюгированные с антителами к AGE, специфично нацелено воздействуют на AGE-модифицированные типы клеток, не удаляя другие клетки.

[042] Антитела, как правило, содержат две тяжелые цепи и две легкие цепи полипептидов, соединенные с образованием молекулы «Y»-формы. Константная область определяет механизм, используемый для нацеливания на антиген. Аминокислотная последовательность на конце «Y» (вариабельная область) варьируется среди различных антител. Такая изменчивость обеспечивает специфичность антитела в отношении связываемого антигена. Вариабельная область, которая включает концы легкой и тяжелой цепей, далее подразделяется на гипервариабельные области (HV, иногда также называемые участками, определяющими комплементарность, или CDR) и каркасные (FR) участки. Если антитела получают рекомбинантными способами, то можно получить одно антитело с вариабельными областями (или участками, определяющими комплементарность), которые связываются с двумя разными антигенами, причем каждый конец «Y» является специфичным в отношении одного из антигенов; такие антитела называют биспецифичными антителами.

[043] Гуманизированное антитело к AGE по настоящему изобретению может содержать аминокислотную последовательность константной области человека, представленную в SEQ ID NO:22. Участки, определяющие комплементарность, тяжелой цепи гуманизированного антитела к AGE могут содержать одну или более из последовательностей белка, представленных в SEQ ID NO:23 (CDR1H), SEQ ID NO:24 (CDR2H) и SEQ ID NO:25 (CDR3H). Участки, определяющие комплементарность, легкой цепи гуманизированного антитела к AGE могут содержать одну или более последовательностей белка, представленных в SEQ ID NO:26 (CDR1L), SEQ ID NO:27 (CDR2L) и SEQ ID NO:28 (CDR3L),

[044] Тяжелая цепь иммуноглобулина G1 человека (Homo sapiens) может иметь или может включать белковую последовательность, представленную в SEQ ID NO:1. Вариабельная область тяжелой цепи может содержать или может включать белковую последовательность, представленную в SEQ ID NO:2. Участки, определяющие комплементарность, вариабельной области тяжелой цепи (SEQ ID NO:2), представлены в последовательностях SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:42 и SEQ ID NO:43. Легкая каппа-цепь человека (Homo sapiens) иммуноглобулина G1 может содержать или может включать белковую последовательность, представленную в SEQ ID NO:3. Вариабельная область легкой каппа-цепи может содержать или может включать белковую последовательность, представленную в SEQ ID NO:4. Необязательно остаток аргинина (Arg или R) в положении 128 последовательности, представленной в SEQ ID NO:4, может отсутствовать. Участки, определяющие комплементарность, вариабельной области легкой цепи (SEQ ID NO:4), представлены в последовательностях SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:45 и SEQ ID NO:46. Вариабельные области могут быть оптимизированы по кодонам, синтезированы и клонированы в векторы экспрессии, содержащие константные области иммуноглобулина G1 человека. Помимо этого вариабельные области могут применяться для гуманизации антител, отличных от антител человека.

[045] Тяжелая цепь антитела может кодироваться последовательностью ДНК, приведенной в SEQ ID NO:12, которая представляет собой тяжелую цепь мышиного иммуноглобулина G2b к AGE. Белковая последовательность тяжелой цепи мышиного иммуноглобулина G2b к AGE, кодируемой последовательностью, представленной в SEQ ID NO:12, приведена в последовательности SEQ ID NO:16. Вариабельная область мышиного антитела представлена в SEQ ID NO:20, что соответствует положениям 25-142 из последовательности, приведенной в SEQ ID NO:16. Тяжелая цепь антитела альтернативно может кодироваться последовательностью ДНК, приведенной в SEQ ID NO:13, которая представляет собой тяжелую цепь химерного иммуноглобулина G1 человека к AGE. Белковая последовательность тяжелой цепи химерного иммуноглобулина G1 человека к AGE, кодируемой последовательностью, представленной в SEQ ID NO:13, приведена в SEQ ID NO:17. Химерный иммуноглобулин человека к AGE содержит мышиную вариабельную область, представленную в последовательности SEQ ID NO:20 в положениях 25-142. Легкая цепь антитела может кодироваться последовательностью ДНК, приведенной в SEQ ID NO:14, которая представляет собой легкую каппа-цепь мышиного антитела к AGE. Белковая последовательность легкой каппа-цепи мышиного антитела к AGE, кодируемой последовательностью, представленной в SEQ ID NO:14, приведена в SEQ ID NO:18. Вариабельная область мышиного антитела представлена в SEQ ID NO:21, что соответствует положениям 21-132 из последовательности SEQ ID NO:18. Легкая цепь антитела может альтернативно кодироваться последовательностью ДНК, приведенной в SEQ ID NO:15, которая представляет собой химерную легкую каппа-цепь антитела человека к AGE. Белковая последовательность химерной легкой каппа-цепи антитела человека к AGE, кодируемой последовательностью, представленной в SEQ ID NO:15, приведена в SEQ ID NO:19. Химерный иммуноглобулин человека к AGE содержит вариабельную область мыши, представленную в последовательности SEQ ID NO:21 в положениях 21-132.

[046] Гуманизированное антитело к AGE по настоящему изобретению может содержать или может включать одну или более гуманизированных тяжелых цепей или гуманизированных легких цепей. Гуманизированная тяжелая цепь может кодироваться последовательностью ДНК, представленной в SEQ ID NO:30, 32 или 34. Белковые последовательности гуманизированных тяжелых цепей, кодируемых последовательностями, представленными в SEQ ID NO:30, 32 и 34, приведены в SEQ ID NO:29, 31 и 33, соответственно. Гуманизированная легкая цепь может кодироваться последовательностью ДНК, представленной в SEQ ID NO:36, 38 или 40. Белковые последовательности гуманизированных легких цепей, кодируемые последовательностями, представленными в SEQ ID NO:36, 38 и 40, приведены в SEQ ID NO:35, 37 и 39, соответственно. Предпочтительно в гуманизированном антителе к AGE максимизировано количество последовательности человека при сохранении исходной специфичности антитела. Может быть сконструировано полное гуманизированное антитело, которое содержит тяжелую цепь, содержащую белковую последовательность, выбранную из последовательностей, приведенных в SEQ ID NO:29, 31 и 33, и легкую цепь, содержащую белковую последовательность, выбранную из последовательностей, приведенных в SEQ ID NO:35, 37 и 39.

[047] Особенно предпочтительные антитела к AGE могут быть получены путем гуманизации мышиных моноклональных антител к AGE. Мышиные моноклональные антитела к AGE имеют белковую последовательность тяжелой цепи, представленную в SEQ ID NO:47 (белковая последовательность вариабельной области представлена в SEQ ID NO:52), белковую последовательность легкой цепи, представленную в SEQ ID NO:57 (белковая последовательность вариабельной области представлена в SEQ ID NO:62). Предпочтительная гуманизированная тяжелая цепь может иметь белковую последовательность, представленную в SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:50 или SEQ ID NO:51 (белковые последовательности вариабельных областей гуманизированных тяжелых цепей представлены в SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:55 и SEQ ID NO:56, соответственно). Предпочтительная гуманизированная легкая цепь может иметь белковую последовательность, представленную в SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:60 или SEQ ID NO:61 (белковые последовательности вариабельных областей гуманизированных легких цепей представлены в SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:65 и SEQ ID NO:66, соответственно). Предпочтительно гуманизированное моноклональное антитело к AGE состоит из тяжелой цепи, имеющей белковую последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:50 и SEQ ID NO:51, и легкой цепи, имеющей белковую последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:60 и SEQ ID NO:61. Гуманизированные моноклональные антитела к AGE, состоящие из указанных белковых последовательностей, могут иметь улучшенное связывание и/или улучшенную активацию иммунной системы, что приводит к большей эффективности.

[048] Белковая последовательность антитела из вида, отличного от человека, может быть модифицирована с целью включения вариабельной области тяжелой цепи, содержащей последовательность, приведенную в SEQ ID NO:2, или легкой каппа-цепи, содержащей последовательность, приведенную в SEQ ID NO:4. Вид, отличный от человека, может представлять собой животного-компаньона, такого как домашняя кошка или домашняя собака, или домашний скот, такой как крупный рогатый скот, лошадь или верблюд. Предпочтительно вид, отличный от человека, не является мышью. Тяжелая цепь иммуноглобулина гамма-4 лошади (Equus caballus) может содержать или может включать белковую последовательность, представленную в SEQ ID NO:5 (номер доступа в EMBL/GenBank AY445518). Тяжелая цепь иммуноглобулина-дельта лошади (Equus caballus) может содержать или может включать белковую последовательность, представленную в SEQ ID NO:6 (номер доступа в EMBL/GenBank AY631942). Тяжелая цепь иммуноглобулина A собаки (Canis familiaris) может содержать или может включать белковую последовательность, представленную в SEQ ID NO:7 (номер доступа в GenBank L36871). Тяжелая цепь иммуноглобулина E собаки (Canis familiaris) может содержать или может включать белковую последовательность, представленную в SEQ ID NO:8 (номер доступа в GenBank L36872). Тяжелая цепь иммуноглобулина G2 кошки (Felis catus) может содержать или может включать белковую последовательность, представленную в SEQ ID NO:9 (номер доступа в DDBJ/EMBL/GenBank KF811175).

[049] Животные из семейства верблюдовых, такие как верблюды (Camelus dromedarius и Camelus bactrianus), ламы (Lama glama, Lama pacos и Lama vicugna), альпаки (Vicugna pacos) и гуанако (Lama guanicoe), имеют уникальное антитело, которое не встречается у других млекопитающих. В дополнение к обычным иммуноглобулинам G, состоящим из тетрамеров тяжелых и легких цепей, верблюдовые также имеют иммуноглобулины G, содержащие тяжелую цепь, но лишенные легких цепей, которые существуют как димеры тяжелой цепи. Эти антитела известны как антитела, состоящие только из тяжелой цепи, HCAbs, однодоменные антитела или sdAbs, и вариабельная область антитела верблюдовых, состоящего только из тяжелой цепи, известна как VHH. В антителах верблюдовых, состоящих только из тяжелой цепи, отсутствует домен CH1 тяжелой цепи и присутствует шарнирная область, которая не встречается у других видов. Вариабельная область однодоменного антитела арабского верблюда (Camelus dromedarius) может содержать или может включать белковую последовательность, представленную в SEQ ID NO:10 (номер доступа в GenBank AJ245148). Вариабельная область тяжелой цепи тетрамерного иммуноглобулина арабского верблюда (Camelus dromedarius) может содержать или может включать белковую последовательность, представленную в SEQ ID NO:11 (номер доступа в GenBank AJ245184).

[050] Помимо верблюдовых, антитела, состоящие только из тяжелой цепи, также встречаются у хрящевых рыб, таких как акулы, скаты и ромбовые скаты. Этот тип антитела известен как новый иммуноглобулиновый антигенный рецептор или IgNAR, и вариабельный домен IgNAR известен как VNAR. IgNAR существует в виде димеров двух идентичных тяжелых цепей, каждая из которых состоит из одного вариабельного домена и пяти константных доменов. Как и у верблюдовых, данный тип антител лишен легкой цепи.

[051] Белковые последовательности дополнительных видов, отличных от человека, могут быть легко найдены в онлайн базах данных, таких как международная база данных по иммуногенетике (www.imgt.org), Европейский институт биоинформатики (www.ebi.ac.uk), Банк ДНК Японии (ddbj.nig.ac.jp/arsa) или Национальный информационный центр по биотехнологии (www.ncbi.nlm.nih.gov).

[052] Антитело к AGE или его вариант может содержать вариабельную область тяжелой цепи, которая имеет по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:20, включая их посттрансляционные модификации. Вариабельная область, которая имеет по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичность последовательности, может содержать замены (например, консервативные замены), вставки или делеции относительно эталонной последовательности, однако антитело к AGE, содержащее указанную последовательность, сохраняет способность связываться с AGE. Замены, вставки или делеции могут возникать в областях, расположенных за пределами вариабельной области.

[053] Антитело к AGE или его вариант могут содержать вариабельную область легкой цепи, которая имеет по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO:4 или SEQ ID NO:21, включая их посттрансляционные модификации. Вариабельная область, которая имеет по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичность последовательности, может содержать замены (например, консервативные замены), вставки или делеции относительно эталонной последовательности, однако антитело к AGE, содержащее указанную последовательность, сохраняет способность связываться с AGE. Замены, вставки или делеции могут возникать в областях, расположенных за пределами вариабельной области.

[054] В другом варианте антитело может содержать участки, определяющие комплементарность, из коммерчески доступного мышиного антитела к конечному продукту гликирования, которое вырабатывается к карбоксиметиллизину, конъюгированного с гемоцианином (CML-KLH), мАт к карбоксиметиллизину (клон 318003), доступного от R&D Systems, Inc (Миннеаполис, Миннесота, США, каталожный номер MAB3247).

[055] Антитело может содержать или может включать константные области, которые позволяют разрушать клетки-мишени с помощью иммунной системы субъекта.

[056] Также могут быть использованы смеси антител, которые связываются более чем с одним типом AGE из AGE-модифицированных белков.

[057] Также могут быть использованы биспецифичные антитела, которые представляют собой антитела к AGE, направленные к двум разным эпитопам. Подходящие антитела будут содержать вариабельную область (или участок, определяющий комплементарность) из одного антитела к AGE и вариабельную область (или участок, определяющий комплементарность) из другого антитела.

[058] Фрагменты антител можно использовать вместо целых антител. Например, иммуноглобулин G может быть разделен на более мелкие фрагменты с помощью ферментативного расщепления. Расщепление папаином отделяет N-концевую часть дисульфидных мостиков между тяжелыми цепями с получением фрагментов Fab. Фрагменты Fab содержат легкую цепь и один из двух N-концевых доменов тяжелой цепи (также известный как фрагмент Fd). Расщепление пепсином отделяет С-концевую часть дисульфидных мостиков между тяжелыми цепями с получением фрагментов F(ab')₂. Фрагменты F(ab')₂ содержат легкие цепи и два N-концевых домена, соединенных дисульфидными мостиками. Расщепление пепсином также приводит к образованию фрагмента Fv (вариабельный фрагмент) и фрагмента Fc (кристаллизующийся фрагмент). Фрагмент Fv содержит два N-концевых вариабельных домена. Фрагмент Fc содержит домены, которые взаимодействуют с рецепторами иммуноглобулинов на клетках и с начальными элементами каскада комплемента. Пепсин также может расщеплять иммуноглобулин G до третьей константной области тяжелой цепи (C_H3) с образованием большого фрагмента F(abc) и небольшого фрагмента pFc'. В другом варианте фрагменты антител могут быть получены рекомбинантными способами.

[059] Если необходимы дополнительные антитела, они могут быть получены с использованием известных способов. Например, выработка поликлональных антител (ПАТ) может быть индуцирована у млекопитающего-хозяина путем введения одной или более инъекций иммуногена и, если необходимо, адъюванта. Как правило, иммуноген (и адъювант) вводят млекопитающему с помощью подкожной или внутрибрюшинной инъекции. Иммуноген может представлять собой AGE-модифицированный белок клетки, такой как AGE-антитромбин III, AGE-кальмодулин, AGE-инсулин, AGE-церулоплазмин, AGE-коллаген, AGE-катепсин B, AGE-альбумин, такой как AGE-бычий сывороточный альбумин (AGE-BSA), AGE-сывороточный альбумин человека или овальбумин, AGE-кристаллин, AGE-активатор плазминогена, AGE-белок плазматической мембраны клеток эндотелия, AGE-альдегидредуктаза, AGE-трансферрин, AGE-фибрин, AGE-медь/цинк-содержащая СОД, AGE-апоB, AGE-фибронектин, AGE-панкреатическая рибоза, AGE-апоA-I и II, AGE-гемоглобин, AGE-Na⁺/K⁺-АТФаза, AGE-плазминоген, AGE-миелин, AGE-лизоцим, AGE-иммуноглобулин, AGE-транспортирующий глюкозу белок эритроцитов, AGE-β-N-ацетилгексокиназа, AGE-апоE, AGE-белок клеточной мембраны эритроцитов, AGE-альдозоредуктаза, AGE-ферритин, AGE-спектрин эритроцитов, AGE-алкогольдегидрогеназа, AGE-гаптоглобин, AGE-тубулин, AGE-гормон щитовидной железы, AGE-фибриноген, AGE-β₂-микроглобулин, AGE-сорбитолдегидрогеназа, AGE-α₁-антитрипсин, AGE-карбонатдегидратаза, AGE-РНКаза, AGE-липопротеин низкой плотности, AGE-гексокиназа, AGE-апоC-I, AGE-гемоглобин, такой как AGE-гемоглобин человека, AGE-альбумин, такой как AGE-бычий сывороточный альбумин (AGE-БСА) и AGE-сывороточный альбумин человека, AGE-липопротеин низкой плотности (AGE-LDL) и AGE-коллаген IV. В качестве AGE-антигенов также могут быть использованы AGE-модифицированные клетки, такие как AGE-модифицированные эритроциты, целые, лизированные или частично расщепленные. Примеры адъювантов включают полный адъювант Фрейнда, монофосфориллипид A, синтетический дикориномиколат трегалозы, гидроксид алюминия (квасцы), белки теплового шока HSP 70 или HSP96, эмульсию сквалена, содержащую монофосфориллипид A, α2-макроглобулин и поверхностно-активные вещества, включая масляные эмульсии, плюроновые полиолы, полианионы и динитрофенол. Для улучшения иммунного ответа иммуноген может быть конъюгирован с полипептидом, который является иммуногенным у хозяина, таким как гемоцианин фиссуреллы (KLH), сывороточный альбумин, бычий тиреоглобулин, холерный токсин, нестойкий энтеротоксин, частицы диоксида кремния или ингибитор трипсина сои. Предпочтительный конъюгат иммуногена представляет собой AGE-KLH. В другом варианте ПАТ могут быть получены у кур, вырабатывающих молекулы IgY.

[060] Моноклональные антитела (мАт) также могут быть получены путем иммунизации хозяина или лимфоцитов хозяина, сбора секретирующих мАт (или потенциально секретирующих) лимфоцитов, слияния полученных лимфоцитов с иммортализованными клетками (например, клетками миеломы) и отбора тех клеток, которые секретируют желаемое мАт. Могут быть использованы другие методики, такие как методика EBV-гибридомы. Методики получения химерных антител с помощью сплайсинга генов, кодирующих вариабельные области антител, с генами константных областей иммуноглобулина человека (или другого животного), позволяют получать «химерные антитела», которые по существу являются антителами человека (гуманизированными) или по существу «превращенными» в антитела других животных (например, кошки, собаки, лошади, верблюда или альпаки, крупного рогатого скота, овцы или козы) на уровне аминокислот. Если необходимо, мАт могут быть очищены от культуральной среды или асцитной жидкости с помощью стандартных методик, таких как хроматография на носителе белок A-сефароза или гидроксилапатит, гель-электрофорез, диализ, осаждение сульфатом аммония или аффинная хроматография. Помимо этого, моноклональные антитела человека могут быть получены путем иммунизации трансгенных мышей, содержащих третью копию транс-локусов IgG человека и подавленные эндогенные локусы Ig мыши, или с использованием трансгенных мышей, несущих гены человека. Гуманизированные моноклональные антитела и их фрагменты также могут быть получены с помощью технологий фагового дисплея.

[061] «Фармацевтически приемлемый носитель» включает любые и все растворители, дисперсионные среды, покрытия, антибактериальные и противогрибковые агенты, изотонические и замедляющие всасывание агенты и тому подобное, совместимые с фармацевтическим введением. Предпочтительные примеры подходящих носителей или разбавителей включают воду, физиологический раствор, растворы Рингера и раствор декстрозы. В композиции также могут быть включены дополнительные активные соединения. Растворы и суспензии, используемые для парентерального введения, могут включать стерильный разбавитель, такой как вода для инъекций, физиологический раствор, полиэтиленгликоли, глицерин, пропиленгликоль или другие синтетические растворители; антибактериальные агенты, такие как бензиловый спирт или метилпарабены; антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота или бисульфит натрия; буферы, такие как буферы на основе ацетатов, цитратов или фосфатов, и агенты для корректировки тоничности, такие как хлорид натрия или декстроза. pH можно корректировать с помощью кислот или оснований, таких как хлористоводородная кислота или гидроксид натрия. Парентеральный препарат может быть заключен в ампулы, одноразовые шприцы или многодозные флаконы из стекла или пластика.

[062] Фармацевтические композиции, подходящие для инъекций, включают стерильные водные растворы или дисперсии для немедленного приготовления стерильных растворов или дисперсии для инъекций. Фармацевтические композиции антител, подходящие для инъекций, могут содержать различные вспомогательные вещества. Носители, подходящие для внутривенного введения, включают физиологический раствор, бактериостатическую воду, CREMOPHOR EL ® (BASF, Парсиппани, Нью-Джерси, США) или забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS). Во всех случаях композиция должна быть стерильной и должна быть жидкой так, чтобы ее можно было ввести с использованием шприца. Подходящие композиции должны быть стабильными во время производства и хранения и должны быть защищены от загрязнения микроорганизмами, такими как бактерии и грибы. Различные антибактериальные и противогрибковые агенты, например, парабены, хлорбутанол, фенол, аскорбиновая кислота и тимеросал, могут быть загрязнены микроорганизмами. Композиция может содержать изотонические агенты, такие как сахара, полиспирты, такие как манит, сорбит, и хлорид натрия. Композиции, которые могут замедлять всасывание, содержат такие агенты как моностеарат алюминия и желатин. Стерильные растворы для инъекций могут быть получены путем включения антител и, необязательно, других терапевтических компонентов, в необходимом количестве в подходящий растворитель с одним или комбинацией ингредиентов, если требуется, с последующей стерилизацией. Способы получения стерильных твердых веществ для приготовления стерильных растворов для инъекций включают вакуумную сушку и сушку вымораживанием с получением твердого вещества.

[063] Для введения путем ингаляции антитела могут быть доставлены в виде аэрозольного спрея из распылителя или контейнера под давлением, который содержит подходящий пропеллент, например, газ, такой как диоксид углерода. Антитела также могут быть доставлены путем ингаляции в виде сухого порошка, например, с использованием платформы для доставки ингаляционных лекарственных препаратов iSPERSE™ (PULMATRIX, Лексингтон, Массачусетс, США). Использование антител к AGE, которые представляют собой куриные антитела (IgY), может быть неиммуногенным у различных животных, включая человека, при введении путем ингаляции.

[064] Местное применение может быть эффективным при различных видах рака и потенциально злокачественных неопластических образований, присутствующих на коже, например, меланомах, себорейном кератозе и актиническом кератозе. Композиции для местного применения могут быть в виде кремов или лосьонов.

[065] Соответствующий уровень дозировки каждого типа антитела обычно составит от приблизительно 0,01 до 500 мг на кг массы тела пациента. Предпочтительно уровень дозировки составит от приблизительно 0,1 до приблизительно 250 мг/кг; более предпочтительно от приблизительно 0,5 до приблизительно 100 мг/кг. Подходящий уровень дозировки может составлять от приблизительно 0,01 до 250 мг/кг, от приблизительно 0,05 до 100 мг/кг или от приблизительно 0,1 до 50 мг/кг. В пределах указанного диапазона дозировка может составлять от 0,05 до 0,5, от 0,5 до 5 или от 5 до 50 мг/кг. Несмотря на то, что каждый тип антитела можно вводить по схеме от 1 до 4 раз в сутки, например, один или два раза в сутки, антитела обычно имеют длительный период полувыведения в условиях in vivo. Соответственно, каждый тип антитела можно вводить один раз в сутки, один раз в неделю, один раз каждые две или три недели, один раз в месяц или один раз каждые 60-90 дней.

[066] Субъект, которому вводят антитело к AGE, может пройти обследование, чтобы определить, было ли лечение рака эффективным путем исследования распространения рака в различные части тела пациента, в частности, в лимфатические узлы. Может быть использован любой подходящий диагностический тест, такой как биопсия, эндоскопия, анализ крови или диагностическая визуализация, такая как рентгенография или КТ. Диагностический тест также может включать детектирование антител к AGE. Введение антитела и последующее обследование можно повторять до достижения желаемого терапевтического результата. Аналогичным образом, субъект может пройти обследование, чтобы определить, было ли лечение потенциально злокачественного неопластического образования эффективным на основании уменьшения размера или исчезновения неопластического образования.

[067] Стандартные лекарственные формы могут быть получены, чтобы облегчить введение и улучшить единообразие доз. Стандартная дозированная форма относится к физически дискретным единицам, подходящим для введения в виде однократных доз для субъекта, подлежащего лечению, содержащим терапевтически эффективное количество одного или более типов антител в комбинации с необходимым фармацевтическим носителем. Предпочтительно стандартная лекарственная форма находится в герметичном контейнере и является стерильной.

[068] Любое млекопитающее, у которого может развиваться метастатический рак, можно лечить с применением способов, описанных в настоящем документе. Человек является предпочтительным млекопитающим для лечения. Другие млекопитающие, которые могут получить лечение, включают мышей, крыс, коз, овец, коров, лошадей и животных-компаньонов, таких как собаки или кошки. Субъект, нуждающийся в лечении, может быть выявлен с помощью диагностики рака. Виды рака, которые особенно подвержены метастазированию, включают рак легкого, меланому, рак толстой кишки, рак почек, рак предстательной железы, рак шейки матки, рак мочевого пузыря, ректальный рак, рак пищевода, рак печени, рак полости рта и горла, множественную миелому, рак яичников и рак желудка. Лечение могут получить пациенты с метастатическим раком. Лечение также может быть назначено пациентам, страдающим раком, но до момента выявления каких-либо метастазов, чтобы предотвратить образование метастазов. Аналогичным образом, любое млекопитающее, у которого может развиться потенциально злокачественное неопластическое образование, может получить лечение с применением способов, описанных в настоящем документе. Человек является предпочтительным млекопитающим для лечения. Другие млекопитающие, которые могут получить лечение, включают мышей, крыс, коз, овец, коров, лошадей и животных-компаньонов, таких как собаки или кошки. Субъект, нуждающийся в лечении, может быть выявлен с помощью диагностики потенциально злокачественного неопластического образования.

[069] Особенно предпочтительная группа для лечения включает субъектов, у которых не могут быть использованы стандартные способы лечения рака, такие как хирургическое вмешательство, лучевая терапия или химиотерапия. Пациент с метастатическим раком или подверженный риску развития метастазов рака может быть не способен перенести определенные способы лечения рака из-за других диагнозов, физических состояний или осложнений. Например, беременные женщины не могут получать лучевую терапию из-за риска причинить вред плоду. Пожилые или ослабленные пациенты, такие как те, которые страдают раковой кахексией, могут не быть подходящими кандидатами для хирургического вмешательства вследствие риска не пережить инвазивную процедуру. Пациенты с уже подавленной иммунной системой или хронической инфекцией могут быть не способы получить химиотерапию, поскольку многие химиотерапевтические препараты наносят вред иммунной системе.

[070] Антитела к AGE можно применять в процессах клеточной очистки, таких как иммунопэннинг и иммуноадсорбция. Процессы очистки можно применять для выделения желательных или нежелательных клеток из культур тканей, клеточных культур или крови. Клеточная очистка может быть использована при трансплантациях, таких как трансплантация костного мозга, или переливаниях, таких как переливание крови. Клеточная очистка особенно полезна при трансплантации аутологичных стволовых клеток во время химиотерапии для удаления метастазирующих злокачественных клеток и концентрирования полезных стволовых клеток. Иммунопэннинг или иммуноадсорбция с применением антитела к AGE могут обеспечить выделение метастазирующего рака из культуры ткани, культуры клеток или образца крови.

[071] Антитела к AGE можно использовать для диагностики метастазов рака. Иммунный комплекс (также известный как комплекс антитело-антиген), содержащий антитело к AGE, связанное с метастатической раковой клеткой, экспрессирующей AGE-модифицированные белки, представляет собой уникальный аналит, который может прогнозировать или указывать на метастатический рак. Специфичное связывание антител к AGE с метастазирующими раковыми клетками может обеспечить детектирование метастазов рака на субклинических уровнях. Диагностические антитела к AGE можно применять для детектирования циркулирующих метастатических раковых клеток, которые вызывают риск образования метастазов в новом месте. В другом варианте диагностические антитела к AGE можно применять для исследования клеток, полученных из определенного места, чтобы определить присутствие метастатических раковых клеток. Биопсия может включать сбор клеток из определенной части тела, которая подвержена известному риску накопления метастатических раковых клеток, такой как лимфатические узлы, легкие, печень, мозг или кости, или из части тела, в которой подозревают присутствие метастазов вследствие других симптомов, таких как подозрительный комок. Антитела к AGE можно применять в любом диагностическом способе, в котором применяют антитела для детектирования аналита, представляющего интерес. Например, иммунный комплекс можно детектировать с использованием подходящей методики визуализации после прикрепления метки к антителам, такой как флуоресцентная метка или радиоактивная метка; с использованием цитологических методик, таких как иммунофлуоресценция, проточная цитометрия или сортировка клеток с активированной флуоресценцией (FACS); с использованием биохимических методик, таких как иммунологические количественные исследования, особенно твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА), Вестерн-блоттинг или иммунопреципитация; или с использованием методик клеточной очистки, таких как иммунопэннинг.

[072] На ФИГ. 2 представлен набор 200 для диагностики метастазов рака. Набор может содержать антитело к AGE 210, контроль 220 и необязательно реагент 230 для детектирования антитела к AGE. Антитело к AGE, контроль и необязательный реагент могут поставляться в любом подходящем контейнере, таком как бутылки, ампулы, конверты, пробирки, флаконы, колбы или шприцы. Антитело к AGE и/или реагент необязательно могут быть помечены, например, флуоресцентной меткой, радиоактивной меткой или золотой частицей. Контроль может представлять собой нормальную сыворотку от животного, у которого было получено вторичное антитело, раствор, содержащий известное количество белка или пептида, модифицированного AGE, или фиксированные или консервированные клетки, которые проявляют модификацию AGE. Примеры реагентов для детектирования антитела к AGE включают вторичные антитела, такие как поликлональное антитело к белку человека, полученное у осла и помеченное родамином. Набор может быть необязательно размещен в контейнере 240. Набор может необязательно включать печатные инструкции 250. Предпочтительно содержимое набора является стерильным и готово к использованию.

[073] Набор может необязательно включать контейнер для размещения ингредиентов набора. Контейнер может быть выполнен из жесткого, прочного материала, такого как пластик, или может быть гибким, например, в виде мешка или мягкой коробки.

[074] Набор может необязательно включать инструкции по использованию. Инструкции могут быть предоставлены в виде печатных инструкций или в электронном формате, например, на USB-накопителе (Universal Serial Bus - универсальная последовательная проводная шина), на защищенной цифровой (SD) карте или размещены через Интернет и доступны через код быстрого ответа (QR).

[075] Наборы необязательно могут содержать дополнительные диагностические материалы или оборудование, например, буферы, фиксаторы, блокирующие растворы, ингибиторы протеаз, субстраты для анализа, такие как предметные стекла и/или покровные стекла для микроскопа, планшеты для микротитрования и реагенты для экстракции клеток, такие как детергенты и растворы детергентов.

[076] Однобуквенная аминокислотная последовательность, которая соответствует последовательности SEQ ID NO:1, представлена ниже:

[077] Положения 16-133 вышеуказанной аминокислотной последовательности соответствуют последовательности, представленной в SEQ ID NO:2. Положения 46-50 вышеуказанной аминокислотной последовательности соответствуют последовательности, представленной в SEQ ID NO:41. Положения 65-81 вышеуказанной аминокислотной последовательности соответствуют последовательности, представленной в SEQ ID NO 42. Положения 114-122 вышеуказанной аминокислотной последовательности соответствуют последовательности, представленной в SEQ ID NO:43.

[078] Однобуквенная аминокислотная последовательность, которая соответствует последовательности SEQ ID NO:3, представлена ниже:

[079] Положения 16-128 вышеуказанной аминокислотной последовательности соответствуют последовательности, представленной в SEQ ID NO:4. Необязательно остаток аргинина (Arg или R) в положении 128 из последовательности, представленной в SEQ ID NO:4, может отсутствовать. Положения 39-54 вышеуказанной аминокислотной последовательности соответствуют последовательности, представленной в SEQ ID NO:44. Положения 70-76 вышеуказанной аминокислотной последовательности соответствуют последовательности, представленной в SEQ ID NO:45. Положения 109-117 вышеуказанной аминокислотной последовательности соответствуют последовательности, представленной в SEQ ID NO:46.

[080] Последовательность ДНК, которая соответствует последовательности, приведенной в SEQ ID NO:12, представлена ниже:

ATGGACCCCAAGGGCAGCCTGAGCTGGAGAATCCTGCTGTTCCTGAGCCTGGCCTTCGAGCTGAGCTACGGCCAGGTGCAGCTGCTGCAGCCAGGTGCCGAGCTCGTGAAACCTGGCGCCTCTGTGAAGCTGGCCTGCAAGGCTTCCGGCTACCTGTTCACCACCTACTGGATGCACTGGCTGAAGCAGAGGCCAGGCCAGGGCCTGGAATGGATCGGCGAGATCTCCCCCACCAACGGCAGAGCCTACTACAACGCCCGGTTCAAGTCCGAGGCCACCCTGACCGTGGACAAGTCCTCCAACACCGCCTACATGCAGCTGTCCTCCCTGACCTCTGAGGCCTCCGCCGTGTACTACTGCGCCAGAGCTTACGGCAACTACGAGTTCGCCTACTGGGGCCAGGGCACCCTCGTGACAGTGTCTGTGGCTAAGACCACCCCTCCCTCCGTGTACCCTCTGGCTCCTGGCTGTGGCGACACCACCGGATCCTCTGTGACCCTGGGCTGCCTCGTGAAGGGCTACTTCCCTGAGTCCGTGACCGTGACCTGGAACTCCGGCTCCCTGTCCTCCTCCGTGCACACCTTTCCAGCCCTGCTGCAGTCCGGCCTGTACACCATGTCCTCCAGCGTGACAGTGCCCTCCTCCACCTGGCCTTCCCAGACCGTGACATGCTCTGTGGCCCACCCTGCCTCTTCCACCACCGTGGACAAGAAGCTGGAACCCTCCGGCCCCATCTCCACCATCAACCCTTGCCCTCCCTGCAAAGAATGCCACAAGTGCCCTGCCCCCAACCTGGAAGGCGGCCCTTCCGTGTTCATCTTCCCACCCAACATCAAGGACGTGCTGATGATCTCCCTGACCCCCAAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGTCCGAGGACGACCCTGACGTGCAGATCAGTTGGTTCGTGAACAACGTGGAAGTGCACACCGCCCAGACCCAGACACACAGAGAGGACTACAACAGCACCATCAGAGTGGTGTCTACCCTGCCCATCCAGCACCAGGACTGGATGTCCGGCAAAGAATTCAAGTGCAAAGTGAACAACAAGGACCTGCCCAGCCCCATCGAGCGGACCATCTCCAAGATCAAGGGCCTCGTGCGGGCTCCCCAGGTGTACATTCTGCCTCCACCAGCCGAGCAGCTGTCCCGGAAGGATGTGTCTCTGACATGTCTGGTCGTGGGCTTCAACCCCGGCGACATCTCCGTGGAATGGACCTCCAACGGCCACACCGAGGAAAACTACAAGGACACCGCCCCTGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTACTTCATCTACTCCAAGCTGAACATGAAGACCTCCAAGTGGGAAAAGACCGACTCCTTCTCCTGCAACGTGCGGCACGAGGGCCTGAAGAACTACTACCTGAAGAAAACCATCTCCCGGTCCCCCGGCTAG

[081] Последовательность ДНК, которая соответствует последовательности, приведенной в SEQ ID NO:13, представлена ниже:

ATGGACCCCAAGGGCAGCCTGAGCTGGAGAATCCTGCTGTTCCTGAGCCTGGCCTTCGAGCTGAGCTACGGCCAGGTGCAGCTGCTGCAGCCAGGTGCCGAGCTCGTGAAACCTGGCGCCTCTGTGAAGCTGGCCTGCAAGGCTTCCGGCTACCTGTTCACCACCTACTGGATGCACTGGCTGAAGCAGAGGCCAGGCCAGGGCCTGGAATGGATCGGCGAGATCTCCCCCACCAACGGCAGAGCCTACTACAACGCCCGGTTCAAGTCCGAGGCCACCCTGACCGTGGACAAGTCCTCCAACACCGCCTACATGCAGCTGTCCTCCCTGACCTCTGAGGCCTCCGCCGTGTACTACTGCGCCAGAGCTTACGGCAACTACGAGTTCGCCTACTGGGGCCAGGGCACCCTCGTGACAGTGTCTGTGGCTAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCTCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGAACCGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAGCCCGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGCGCTCTGACCAGCGGAGTGCACACCTTCCCTGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACTCCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCTCCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCTAAGAGCTGCGACAAGACCCACACCTGCCCTCCCTGCCCCGCCCCCGAGCTGCTGGGCGGACCCAGCGTGTTCCTGTTCCCTCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCCGCACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAGGACCCCGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCTCGGGAGGAGCAGTACAACTCCACCTACCGCGTGGTGAGCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTGAGCAACAAGGCCCTGCCCGCTCCCATCGAGAAGACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCCGGGAGCCTCAGGTGTACACCCTGCCCCCCAGCCGCGACGAGCTGACCAAGAACCAGGTGAGCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCTCCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCTGAGAACAACTACAAGACCACCCCTCCCGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGAGCCCCGGATAG

[082] Последовательность ДНК, которая соответствует последовательности, приведенной в SEQ ID NO:14, представлена ниже:

ATGGAGACCGACACCCTGCTGCTCTGGGTGCTGCTGCTCTGGGTGCCCGGCTCCACCGGAGACGTCGTGATGACCCAGACCCCTCTGTCCCTGCCTGTGTCTCTGGGCGACCAGGCCTCCATCTCCTGCCGGTCTAGACAGTCCCTCGTGAACTCCAACGGCAACACCTTCCTGCAGTGGTATCTGCAGAAGCCCGGCCAGTCCCCCAAGCTGCTGATCTACAAGGTGTCCCTGCGGTTCTCCGGCGTGCCCGACAGATTTTCCGGCTCTGGCTCTGGCACCGACTTCACCCTGAAGATCTCCCGGGTGGAAGCCGAGGACCTGGGCCTGTACTTCTGCAGCCAGTCCACCCACGTGCCCCCTACATTTGGCGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAACGGGCAGATGCTGCACCAACTGTATCCATCTTCCCACCATCCAGTGAGCAGTTAACATCTGGAGGTGCCTCAGTCGTGTGCTTCTTGAACAACTTCTACCCCAAAGACATCAATGTCAAGTGGAAGATTGATGGCAGTGAACGACAAAATGGCGTCCTGAACAGTTGGACTGATCAGGACAGCAAAGACAGCACCTACAGCATGAGCAGCACCCTCACGTTGACCAAGGACGAGTATGAACGACATAACAGCTATACCTGTGAGGCCACTCACAAGACATCAACTTCACCCATTGTCAAGAGCTTCAACAGGAATGAGTGTTGA

[083] Последовательность ДНК, которая соответствует последовательности, приведенной в SEQ ID NO:15, представлена ниже:

ATGGAGACCGACACCCTGCTGCTCTGGGTGCTGCTGCTCTGGGTGCCCGGCTCCACCGGAGACGTCGTGATGACCCAGACCCCTCTGTCCCTGCCTGTGTCTCTGGGCGACCAGGCCTCCATCTCCTGCCGGTCTAGACAGTCCCTCGTGAACTCCAACGGCAACACCTTCCTGCAGTGGTATCTGCAGAAGCCCGGCCAGTCCCCCAAGCTGCTGATCTACAAGGTGTCCCTGCGGTTCTCCGGCGTGCCCGACAGATTTTCCGGCTCTGGCTCTGGCACCGACTTCACCCTGAAGATCTCCCGGGTGGAAGCCGAGGACCTGGGCCTGTACTTCTGCAGCCAGTCCACCCACGTGCCCCCTACATTTGGCGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAGCGGACCGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTCATCTTCCCTCCCAGCGACGAGCAGCTGAAGTCTGGCACCGCCAGCGTGGTGTGCCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGCGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACTCCAAGGACAGCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGCGAGGTGACCCACCAGGGACTGTCTAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGCTAA

[084] Однобуквенная аминокислотная последовательность, которая соответствует последовательности, приведенной в SEQ ID NO:16, представлена ниже:

MDPKGSLSWRILLFLSLAFELSYGQVQLLQPGAELVKPGASVKLACKASGYLFTTYWMHWLKQRPGQGLEWIGEISPTNGRAYYNARFKSEATLTVDKSSNTAYMQLSSLTSEASAVYYCARAYGNYEFAYWGQGTLVTVSVAKTTPPSVYPLAPGCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPESVTVTWNSGSLSSSVHTFPALLQSGLYTMSSSVTVPSSTWPSQTVTCSVAHPASSTTVDKKLEPSGPISTINPCPPCKECHKCPAPNLEGGPSVFIFPPNIKDVLMISLTPKVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTIRVVSTLPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPSPIERTISKIKGLVRAPQVYILPPPAEQLSRKDVSLTCLVVGFNPGDISVEWTSNGHTEENYKDTAPVLDSDGSYFIYSKLNMKTSKWEKTDSFSCNVRHEGLKNYYLKKTISRSPG*

[085] Остаток аланина в положении 123 вышеуказанной аминокислотной последовательности необязательно может быть заменен остатком серина. Остаток тирозина в положении 124 вышеуказанной аминокислотной последовательности необязательно может быть заменен остатком фенилаланина. Положения 25-142 вышеуказанной аминокислотной последовательности соответствуют последовательности, приведенной в SEQ ID NO:20. SEQ ID NO:20 может необязательно содержать замены в положениях 123 и 124. SEQ ID NO:20 может необязательно содержать один дополнительный остаток лизина после концевого остатка валина.

[086] Однобуквенная аминокислотная последовательность, которая соответствует последовательности, приведенной в SEQ ID NO:17, представлена ниже:

MDPKGSLSWRILLFLSLAFELSYGQVQLLQPGAELVKPGASVKLACKASGYLFTTYWMHWLKQRPGQGLEWIGEISPTNGRAYYNARFKSEATLTVDKSSNTAYMQLSSLTSEASAVYYCARAYGNYEFAYWGQGTLVTVSVASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG*

[087] Однобуквенная аминокислотная последовательность, которая соответствует последовательности, приведенной в SEQ ID NO:18, представлена ниже:

METDTLLLWVLLLWVPGSTGDVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSRQSLVNSNGNTFLQWYLQKPGQSPKLLIYKVSLRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGLYFCSQSTHVPPTFGGGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC*

[088] Положения 21-132 вышеуказанной аминокислотной последовательности соответствуют последовательности, приведенной в SEQ ID NO:21.

[089] Однобуквенная аминокислотная последовательность, которая соответствует последовательности, приведенной в SEQ ID NO:19, представлена ниже:

METDTLLLWVLLLWVPGSTGDVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSRQSLVNSNGNTFLQWYLQKPGQSPKLLIYKVSLRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGLYFCSQSTHVPPTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC*

[090] Однобуквенная аминокислотная последовательность, которая соответствует последовательности, приведенной в SEQ ID NO:22, представлена ниже:

[091] Однобуквенная аминокислотная последовательность, которая соответствует последовательности, приведенной в SEQ ID NO:23, представляет собой SYTMGVS.

[092] Однобуквенная аминокислотная последовательность, которая соответствует последовательности, приведенной в SEQ ID NO:24, представляет собой TISSGGGSTYYPDSVKG.

[093] Однобуквенная аминокислотная последовательность, которая соответствует последовательности, приведенной в SEQ ID NO:25, представляет собой QGGWLPPFAX, где X может представлять собой любую природную аминокислоту.

[094] Однобуквенная аминокислотная последовательность, которая соответствует последовательности, приведенной в SEQ ID NO:26, представляет собой RASKSVSTSSRGYSYMH.

[095] Однобуквенная аминокислотная последовательность, которая соответствует последовательности, приведенной в SEQ ID NO:27, представляет собой LVSNLES.

[096] Однобуквенная аминокислотная последовательность, которая соответствует последовательности, приведенной в SEQ ID NO:28, представляет собой QHIRELTRS.

[097] Однобуквенная аминокислотная последовательность, которая соответствует последовательности, приведенной в SEQ ID NO:29, представляет собой MDPKGSLSWRILLFLSLAFELSYGQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYLFTTYWMHWVRQAPGQGLEWMGEISPTNGRAYYNQKFQGRVTMTVDKSTNTVYMELSSLRSEDTAVYYCARAYGNYFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG.

[098] Последовательность ДНК, которая соответствует последовательности, приведенной в SEQ ID NO:30, представляет собой:

ATGGACCCCAAGGGCAGCCTGAGCTGGAGAATCCTGCTGTTCCTGAGCCTGGCCTTCGAGCTGAGCTACGGCCAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGCGCCGAAGTGAAGAAACCTGGCGCCTCCGTGAGGTGTCCTGCAAGGCTTCCGGCTACCTGTTCACCACCTACTGGATGCACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAGGGCCTGGAATGGATGGGCGAGATCTCCCCTACCAACGGCAGAGCCTACTACAACAGAAATTCCAGGGCAGAGTGACCATGACCGTGGACAAGTCCACCAACACCGTGTACATGGAACTGTCCTCCCTGCGGAGCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCTAGAGCCTACGGCAACTACGATTCGCCTACTGGGGCCAGGGCACCCTCGTGACAGTGTCCTCTGCTAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCTCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGAACCGCCGCCCTGGGCTGCCTGGGAAGGACTACTTCCCCGAGCCCGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGCGCTCTGACCAGCGGAGTGCACACCTTCCCTGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACTCCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCTCCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCTAAGAGCTGCGACAAGACCCACACCTGCCCTCCCTGCCCCGCCCCGAGCTGCTGGGCGGACCCAGCGTGTTCCTGTTCCCTCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCCGCACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAGGACCCCGAGGTGAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCTCGGGAGGAGCAGTACAACTCCACCTACCGCGTGGTGAGCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAGGAGTACAAGTGCAAGGTGAGCAACAAGGCCCTGCCCGCTCCCATCGAGAAGACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCCGGGAGCCTCAGGTGTACACCCTGCCCCCCAGCCGCGACGAGCTGACAAGAACCAGGTGAGCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCTCCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCTGAGAACAACTACAAGACCACCCCTCCCGTGCTGGACAGCGACGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGAGCCCGGATAGTAA.

[099] Однобуквенная аминокислотная последовательность, которая соответствует последовательности, приведенной в SEQ ID NO:31, представляет собой: MDPKGSLSWRILLFLSLAFELSYGQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYLFTTYWMHWVRQAPGQGLEWMGEISPTNGRAYYNAKFQGRVTMTVDKSTNTAYMELSSLRSEDTAVYYCARAYGNYFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG.

[0100] Последовательность ДНК, которая соответствует последовательности, приведенной в SEQ ID NO:32, представляет собой:

ATGGACCCCAAGGGCAGCCTGAGCTGGAGAATCCTGCTGTTCCTGAGCCTGGCCTTCGAGCTGAGCTACGGCCAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGCGCCGAAGTGAAGAAACCTGGCGCCTCCGTGAGGTGTCCTGCAAGGCTTCCGGCTACCTGTTCACCACCTACTGGATGCACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAGGGCCTGGAATGGATGGGCGAGATCTCCCCTACCAACGGCAGAGCCTACTACAACCAAAATTCCAGGGCAGAGTGACCATGACCGTGGACAAGTCCACCAACACCGCTTACATGGAACTGTCCTCCCTGCGGAGCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCTAGAGCCTACGGCAACTACGATTCGCCTACTGGGGCCAGGGCACCCTCGTGACAGTGTCCTCTGCTAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCTCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGAACCGCCGCCCTGGGCTGCCTGGGAAGGACTACTTCCCCGAGCCCGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGCGCTCTGACCAGCGGAGTGCACACCTTCCCTGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACTCCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCTCCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCTAAGAGCTGCGACAAGACCCACACCTGCCCTCCCTGCCCCGCCCCGAGCTGCTGGGCGGACCCAGCGTGTTCCTGTTCCCTCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCCGCACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAGGACCCCGAGGTGAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCTCGGGAGGAGCAGTACAACTCCACCTACCGCGTGGTGAGCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAGGAGTACAAGTGCAAGGTGAGCAACAAGGCCCTGCCCGCTCCCATCGAGAAGACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCCGGGAGCCTCAGGTGTACACCCTGCCCCCCAGCCGCGACGAGCTGACAAGAACCAGGTGAGCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCTCCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCTGAGAACAACTACAAGACCACCCCTCCCGTGCTGGACAGCGACGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGAGCCCGGATAGTAA.

[0101] Однобуквенная аминокислотная последовательность, которая соответствует последовательности, приведенной в SEQ ID NO:33, представляет собой:

MDPKGSLSWRILLFLSLAFELSYGQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYLFTTYWMHWVRQAPGQGLEWMGEISPTNGRAYYNAKFQGRVTMTVDKSINTAYMELSRLRSDDTAVYYCARAYGNYFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG.

[0102] Последовательность ДНК, которая соответствует последовательности, приведенной в SEQ ID NO:34, представляет собой:

ATGGACCCCAAGGGCAGCCTGAGCTGGAGAATCCTGCTGTTCCTGAGCCTGGCCTTCGAGCTGAGCTACGGCCAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGCGCCGAAGTGAAGAAACCTGGCGCCTCCGTGAGGTGTCCTGCAAGGCTTCCGGCTACCTGTTCACCACCTACTGGATGCACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAGGGCCTGGAATGGATGGGCGAGATCTCCCCTACCAACGGCAGAGCCTACTACAACCAAAATTCCAGGGCAGAGTGACCATGACCGTGGACAAGTCCATCAACACCGCTTACATGGAACTGTCCAGACTGCGGAGCGATGACACCGCCGTGTACTACTGCGCTAGAGCCTACGGCAACTACGATTCGCCTACTGGGGCCAGGGCACCCTCGTGACAGTGTCCTCTGCTAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCTCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGAACCGCCGCCCTGGGCTGCCTGGGAAGGACTACTTCCCCGAGCCCGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGCGCTCTGACCAGCGGAGTGCACACCTTCCCTGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACTCCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCTCCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCTAAGAGCTGCGACAAGACCCACACCTGCCCTCCCTGCCCCGCCCCGAGCTGCTGGGCGGACCCAGCGTGTTCCTGTTCCCTCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCCGCACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAGGACCCCGAGGTGAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCTCGGGAGGAGCAGTACAACTCCACCTACCGCGTGGTGAGCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAGGAGTACAAGTGCAAGGTGAGCAACAAGGCCCTGCCCGCTCCCATCGAGAAGACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCCGGGAGCCTCAGGTGTACACCCTGCCCCCCAGCCGCGACGAGCTGACAAGAACCAGGTGAGCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCTCCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCTGAGAACAACTACAAGACCACCCCTCCCGTGCTGGACAGCGACGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGAGCCCGGATAGTAA

[0103] Однобуквенная аминокислотная последовательность, которая соответствует последовательности, приведенной в SEQ ID NO:35, представляет собой:

METDTLLLWVLLLWVPGSTGDVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSLVNSNGNTFLQWYQQRPGQSPRLLIYKVSLRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHVPPTFGGGTVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC.

[0104] Последовательность ДНК, которая соответствует последовательности, приведенной в SEQ ID NO:36, представляет собой:

ATGGAGACCGACACCCTGCTGCTCTGGGTGCTGCTGCTCTGGGTGCCCGGCTCCACCGGAGACGTCGTGATGACCCAGTCCCCTCTGTCCCTGCCTGTGACCCTGGGACAGCCTGCCTCCATCTCCTCAGATCCTCCCAGTCCCTCGTGAACTCCAACGGCAACACCTTCCTGCAGTGGTATCAGCAGCGGCCTGGCCAGAGCCCCAGACTGCTGATCTACAAGGTGTCCCTGCGGTTCTCCGGCGTGCCCGACGATTTTCCGGCTCTGGCTCTGGCACCGACTTCACCCTGAAGATCTCCCGGGTGGAAGCCGAGGACGTGGGCGTGTACTACTGCTCCCAGAGCACCCACGTGCCCCCTACATTTGGCGGAGGCACCAAGTGGAAATCAAGCGGACCGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTCATCTTCCCTCCCAGCGACGAGCAGCTGAAGTCTGGCACCGCCAGCGTGGTGTGCCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGCGAGGCCAAGGGCAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACTCCAAGGACAGCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGACAAGGTGTACGCCTGCGAGGTGACCCACCAGGGACTGTCTAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGCTAA.

[0105] Однобуквенная аминокислотная последовательность, которая соответствует последовательности, приведенной в SEQ ID NO:37, представляет собой:

METDTLLLWVLLLWVPGSTGDVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSRQSLVNSNGNTFLQWYQQRPGQSPRLLIYKVSLRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHVPPTFGGGTVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC.

[0106] Последовательность ДНК, которая соответствует последовательности, приведенной в SEQ ID NO:38, представляет собой:

ATGGAGACCGACACCCTGCTGCTCTGGGTGCTGCTGCTCTGGGTGCCCGGCTCCACCGGAGACGTCGTGATGACCCAGTCCCCTCTGTCCCTGCCTGTGACCCTGGGACAGCCTGCCTCCATCTCCTCAGATCCAGGCAGTCCCTCGTGAACTCCAACGGCAACACCTTCCTGCAGTGGTATCAGCAGCGGCCTGGCCAGAGCCCCAGACTGCTGATCTACAAGGTGTCCCTGCGGTTCTCCGGCGTGCCCGACGATTTTCCGGCTCTGGCTCTGGCACCGACTTCACCCTGAAGATCTCCCGGGTGGAAGCCGAGGACGTGGGCGTGTACTACTGCTCCCAGAGCACCCACGTGCCCCCTACATTTGGCGGAGGCACCAAGTGGAAATCAAGCGGACCGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTCATCTTCCCTCCCAGCGACGAGCAGCTGAAGTCTGGCACCGCCAGCGTGGTGTGCCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGCGAGGCCAAGGGCAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACTCCAAGGACAGCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGACAAGGTGTACGCCTGCGAGGTGACCCACCAGGGACTGTCTAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGCTAA.

[0107] Однобуквенная аминокислотная последовательность, которая соответствует последовательности, приведенной в SEQ ID NO:39, представляет собой:

METDTLLLWVLLLWVPGSTGDVVMTQSPLSSPVTLGQPASISCRSSQSLVNSNGNTFLQWYHQRPGQPPRLLIYKVSLRFSGVPDRFSGSGAGKDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHVPPTFGQGTLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC.

[0108] Последовательность ДНК, которая соответствует последовательности, приведенной в SEQ ID NO:40, представляет собой:

ATGGAGACCGACACCCTGCTGCTCTGGGTGCTGCTGCTCTGGGTGCCCGGCTCCACCGGAGACGTCGTGATGACCCAGTCCCCTCTGTCCAGTCCTGTGACCCTGGGACAGCCTGCCTCCATCTCCTCAGATCCTCCCAGTCCCTCGTGAACTCCAACGGCAACACCTTCCTGCAGTGGTATCACCAGCGGCCTGGCCAGCCTCCCAGACTGCTGATCTACAAGGTGTCCCTGCGGTTCTCCGGCGTGCCCGACGATTTTCCGGCTCTGGCGCTGGCAAGGACTTCACCCTGAAGATCTCCCGGGTGGAAGCCGAGGACGTGGGCGTGTACTACTGCTCCCAGAGCACCCACGTGCCCCCTACATTTGGCCAGGGCACCAACTGGAAATCAAGCGGACCGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTCATCTTCCCTCCCAGCGACGAGCAGCTGAAGTCTGGCACCGCCAGCGTGGTGTGCCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGCGAGGCCAAGGGCAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACTCCAAGGACAGCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGACAAGGTGTACGCCTGCGAGGTGACCCACCAGGGACTGTCTAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGCTAA.

[0109] Однобуквенная аминокислотная последовательность, которая соответствует последовательности, приведенной в SEQ ID NO:47, представляет собой:

MGWTLVFLFLLSVTAGVHSQVQLLQPGAELVKPGASVKLACKASGYLFTTYWMHWLKQRPGQGLEWIGEISPTNGRAYYNARFKSEATLTVDKSSNTAYMQLSSLTSEASAVYYCARSFGNYEFAYWQGTLVTVSVASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK.

[0110] Однобуквенная аминокислотная последовательность, которая соответствует последовательности, приведенной в SEQ ID NO:48, представляет собой:

MGWTLVFLFLLSVTAGVHSEVQLLESGAEAKKPGASVKLSCKASGYLFTTYWMHWVHQAPGQRLEWMGEISPTNGRAYYNARFKSRVTITVDKSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSFGNYEFAYWQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK.

[0111] Однобуквенная аминокислотная последовательность, которая соответствует последовательности, приведенной в SEQ ID NO:49, представляет собой:

MGWTLVFLFLLSVTAGVHSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYLFTTYWMHWVRQAPGQRLEWIGEISPTNGRAYYNARFKSRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSFGNYEFAYWQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK.

[0112] Однобуквенная аминокислотная последовательность, которая соответствует последовательности, приведенной в SEQ ID NO:50, представляет собой:

MGWTLVFLFLLSVTAGVHSQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYLFTTYWMHWVRQAPGQGLEWMGEISPTNGRAYYNARFKSRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSFGNYEFAYWQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK.

[0113] Однобуквенная аминокислотная последовательность, которая соответствует последовательности, приведенной в SEQ ID NO:51, представляет собой:

MGWTLVFLFLLSVTAGVHSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCEASGYLFTTYWMHWVRQAPGQGLEWMGEISPTNGRAYYNARFKSRVTITRDTSINTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSFGNYEFAYWQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK.

[0114] Однобуквенная аминокислотная последовательность, которая соответствует последовательности, приведенной в SEQ ID NO:52, представляет собой:

QVQLLQPGAELVKPGASVKLACKASGYLFTTYWMHWLKQRPGQGLEWIGEISPTNGRAYYNARFKSEATLTVDKSSNTAYMQLSSLTSEASAVYYCARSFGNYEFAYWGQGTLVTVSV.

[0115] Однобуквенная аминокислотная последовательность, которая соответствует последовательности, приведенной в SEQ ID NO:53, представляет собой:

EVQLLESGAEAKKPGASVKLSCKASGYLFTTYWMHWVHQAPGQRLEWMGEISPTNGRAYYNARFKSRVTITVDKSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSFGNYEFAYWGQGTLVTVSS.

[0116] Однобуквенная аминокислотная последовательность, которая соответствует последовательности, приведенной в SEQ ID NO:54, представляет собой:

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYLFTTYWMHWVRQAPGQRLEWIGEISPTNGRAYYNARFKSRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSFGNYEFAYWGQGTLVTVSS.

[0117] Однобуквенная аминокислотная последовательность, которая соответствует последовательности, приведенной в SEQ ID NO:55, представляет собой:

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYLFTTYWMHWVRQAPGQGLEWMGEISPTNGRAYYNARFKSRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSFGNYEFAYWGQGTLVTVSS.

[0118] Однобуквенная аминокислотная последовательность, которая соответствует последовательности, приведенной в SEQ ID NO:56, представляет собой:

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCEASGYLFTTYWMHWVRQAPGQGLEWMGEISPTNGRAYYNARFKSRVTITRDTSINTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSFGNYEFAYWGQGTLVTVSS.

[0119] Однобуквенная аминокислотная последовательность, которая соответствует последовательности, приведенной в SEQ ID NO:57, представляет собой:

MVSSAQFLGLLLLCFQGTRCDVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSRQSLVNSNGNTFLQWYLQKPGQSPKLLIYKVSLRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGLYFCSQSTHVPPTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC.

[0120] Однобуквенная аминокислотная последовательность, которая соответствует последовательности, приведенной в SEQ ID NO:58, представляет собой:

MVSSAQFLGLLLLCFQGTRCDIVMTQTPLSLPVTLGQPASISCRSRQSLVNSNGNTFLQWLQQRPGQPPRLLIYKVSLRFSGVPDRFSGSGAGTDFTLTISRVEAEDVGIYFCSQSTHVPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC.

[0121] Однобуквенная аминокислотная последовательность, которая соответствует последовательности, приведенной в SEQ ID NO:59, представляет собой:

MVSSAQFLGLLLLCFQGTRCDIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCRSRQSLVNSNGNTFLQWYLQKPGQSPQLLIYKVSLRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEPEDVGVYYCSQSTHVPPTFGGGTKVEVKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC.

[0122] Однобуквенная аминокислотная последовательность, которая соответствует последовательности, приведенной в SEQ ID NO:60, представляет собой:

MVSSAQFLGLLLLCFQGTRCDVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSRQSLVNSNGNTFLQWFQQRPGQSPRRLIYKVSLRFSGVPDRFSGSGSDTDFTLRISRVEAEDVGLYYCSQSTHVPPTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC.

[0123] Однобуквенная аминокислотная последовательность, которая соответствует последовательности, приведенной в SEQ ID NO:61, представляет собой:

MVSSAQFLGLLLLCFQGTRCDIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCRSRQSLVNSNGNTFLQWLLQKPGQPPQLLIYKVSLRFSGVPNRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGLYYCSQSTHVPPTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC.

[0124] Однобуквенная аминокислотная последовательность, которая соответствует последовательности, приведенной в SEQ ID NO:62, представляет собой:

DVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSRQSLVNSNGNTFLQWYLQKPGQSPKLLIYKVSLRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGLYFCSQSTHVPPTFGGGTKLEIK.

[0125] Однобуквенная аминокислотная последовательность, которая соответствует последовательности, приведенной в SEQ ID NO:63, представляет собой:

DIVMTQTPLSLPVTLGQPASISCRSRQSLVNSNGNTFLQWLQQRPGQPPRLLIYKVSLRFSGVPDRFSGSGAGTDFTLTISRVEAEDVGIYFCSQSTHVPPTFGQGTKVEIK.

[0126] Однобуквенная аминокислотная последовательность, которая соответствует последовательности, приведенной в SEQ ID NO:64, представляет собой:

DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCRSRQSLVNSNGNTFLQWYLQKPGQSPQLLIYKVSLRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEPEDVGVYYCSQSTHVPPTFGGGTKVEVK.

[0127] Однобуквенная аминокислотная последовательность, которая соответствует последовательности, приведенной в SEQ ID NO:65, представляет собой:

DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSRQSLVNSNGNTFLQWFQQRPGQSPRRLIYKVSLRFSGVPDRFSGSGSDTDFTLRISRVEAEDVGLYYCSQSTHVPPTFGQGTKLEIK.

[0128] Однобуквенная аминокислотная последовательность, которая соответствует последовательности, приведенной в SEQ ID NO:66, представляет собой:

DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCRSRQSLVNSNGNTFLQWLLQKPGQPPQLLIYKVSLRFSGVPNRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGLYYCSQSTHVPPTFGGGTKVEIK.

[0129] ПРИМЕРЫ

[0130] Пример 1. Исследование введения антитела к конечному продукту гликирования в условиях in vivo. В этом примере показано, что антитело к AGE может быть нацелено к клеткам, содержащим AGE-модифицированные белки на клеточной поверхности. Несмотря на то, что клетки, рассмотренные в данном исследовании, представляют собой стареющие клетки, они могут считаться моделью метастазирующих раковых клеток.

[0131] Для того чтобы исследовать влияние антитела к конечному продукту гликирования, антитело вводили старой мыши CD1 (ICR) (Charles River Laboratories) два раза в сутки путем внутривенной инъекции с частотой один раз в неделю в течение трех недель (1, 8 и 15 день), с последующим десятинедельным перерывом в применении препарата. Испытываемое антитело представляло собой коммерчески доступное мышиное антитело к конечному продукту гликирования, которое вырабатывалось к карбоксиметиллизину, конъюгированное с гемоцианином фиссуреллы, мАт к карбоксиметиллизину (клон 318003), доступное от R&D Systems, Inc. (Миннеаполис, Миннесота, США, каталожный номер MAB3247). У контрольных животных в качестве контроля использовали физиологический солевой раствор.

[0132] Возраст мышей, называемых «молодыми», составил 8 недель, в то время как возраст мышей, называемых «старыми», составил 88 недель (±2 дня). При введении антитела нежелательные явления не были обнаружены. Различные группы животных, использованные в исследовании, представлены в таблице 1.

[0133]

Таблица 1: Различные группы животных, использованные в исследовании № группы Исследуемый материал Мыши Уровень дозы (мкг/г/2 р./сутки/
неделю) Кол-во животных Основное исследование Период без введения препарата Самки Самки 1 PBS Молодые 0 20 - 2 PBS Старые 0 20 20 3 Антитело Старые 2,5 20 20 4 Без введения Старые 0 20 Исходные условия 5 Антитело Старые 5,0 20 20

- =Неприменимо, Исходные условия=Подгруппа животных, умерщвленных до начала лечения для сбора жировой ткани.

[0134] мРНК P16^INK4a, маркер стареющих клеток, количественно определяли в жировой ткани групп с помощью кПЦР в режиме реального времени. Результаты представлены в таблице 2. В таблице ΔΔCt=среднее значение ΔCt контрольной группы (2) -среднее значение ΔCt экспериментальной группы (1 или 3, или 5); Относительная экспрессия=2^-ΔΔCt.

[0135]

Таблица 2: Количество мРНК P16^Ink4a, определенное в жировой ткани Расчет (не скорректи-рованный для группы 4: 5,59) Группа 2 в сравнении с Группой 1 Группа 2 в сравнении с Группой 3 Группа 2 в сравнении с Группой 5 Группа 2 Группа 1 Группа 2 Группа 3 Группа 2 Группа 5 Среднее значение ΔCt 5,79 7,14 5,79 6,09 5,79 7,39 ΔΔCt -1,35 -0,30 -1,60 Относительная экспрессия 2,55 1,23 3,03

[0136] Результаты в приведенной выше таблице свидетельствуют о том, что, как и ожидалось, старые мыши, не получавшие лечения (контрольная группа 2), экспрессируют в 2,55 раза больше мРНК p16^Ink4a, чем молодые мыши, не получавшие лечения (контрольная группа 1). Данный факт был обнаружен при сравнении результатов старых мышей в группе 2, не получавших лечения, которых умерщвляли в конце периода восстановления на 85 день, с результатами для молодых мышей в группе 1, не получавших лечения, которых умерщвляли по завершении лечения на 22 день. При сравнении результатов старых мышей в группе 2, не получавших лечения, с результатами старых мышей в группе 3, получавших лечение, которых умерщвляли на 85 день, было выявлено, что количество мРНК p16^Ink4a было в 1,23 раза выше в группе 2, чем в группе 3. Таким образом, уровень экспрессии мРНК p16^Ink4a был ниже, когда старых мышей лечили с использованием антитела в дозе 2,5 мкг/г/2 раза в сутки/неделю.

[0137] При сравнении результатов старых мышей в группе 2 (контроль), не получавших лечения, с результатами старых мышей в группе 5 (5 мкг/г), получавших лечение, которых умерщвляли на 22 день, было выявлено, что количество мРНК p16^Ink4a было в 3,03 раза выше в группе 2 (контроль), чем в группе 5 (5 мкг/г). Это сравнение показало, что животные в группе 5 имели более низкие уровни экспрессии мРНК p16^Ink4a после лечения антителом в дозе 5,0 мкг/г/2 раза в сутки/неделю, в результате чего уровни экспрессии мРНК p16^Ink4a были сравнимы с уровнями у молодых мышей, не получавших лечения (т.е. в 1 группе). В отличие от мышей в группе 3 (2,5 мкг/г), которых умерщвляли в конце периода восстановления на 85 день, мышей в группе 5 умерщвляли по завершении лечения на 22 день.

[0138] Полученные результаты указывают на то, что введение антитела привело к гибели стареющих клеток.

[0139] Также измеряли массу икроножной мышцы, чтобы определить влияние введения антитела при саркопении. Результаты представлены в таблице 3. Полученные результаты указывают на то, что введение антитела увеличивало мышечную массу по сравнению с контролем, но только при более высокой дозе 5,0 мкг/г/2 раза в сутки/неделю.

[0140]

Таблица 3: Влияние введения антитела на массу икроножной мышцы Группа Краткая информация Абсолютная масса икроножной мышцы Масса икроножной мышцы в сравнении с массой тела 1 Среднее значение 0,3291 1,1037 Станд. откл.сред. 0,0412 0,1473 N 20 20 2 Среднее значение 0,3304 0,7671 Станд. откл.сред. 0,0371 0,1246 N 20 20 3 Среднее значение 0,3410 0,7706 Станд. откл.сред. 0,0439 0,0971 N 19 19 5 Среднее значение 0,4074 0,9480 Станд. откл.сред. 0,0508 0,2049 N 9 9

[0141] Полученные результаты свидетельствуют о том, что введение антител, которые связываются с AGE клетки, привело к уменьшению количества клеток, экспрессирующих p16^Ink4a, биомаркер старения. Данные указывают на то, что снижение количества стареющих клеток приводит непосредственно к увеличению мышечной массы у старых мышей. Эти результаты указывают на то, что потерю мышечной массы, классический признак саркопении, можно лечить путем введения антител, которые связываются с AGE клетки. Результаты позволяют предположить, что введение антител может быть эффективным при лечении метастазов рака за счет устранения стареющих клеток.

[0142] Пример 2. Аффинность и кинетика исследуемого антитела

[0143] Аффинность и кинетику исследуемого антитела, использованного в примере 1, исследовали с использованием Nα,Nα-бис(карбоксиметил)-L-лизинтрифторацетатной соли (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США) в качестве модельного субстрата для AGE-модифицированного белка клетки. Исследование взаимодействия без использования метки проводили на устройстве BIACORE™ T200 (GE Healthcare, Питтсбург, Пенсильвания, США), используя сенсорный чип серии S CM5 (GE Healthcare, Питтсбург, Пенсильвания, США), при этом проточную ячейку FC1 установили как пустую, и проточную ячейку FC2 иммобилизовали с исследуемым антителом (молекулярная масса 150000 Да). Подвижный буфер представлял собой буфер HBS-EP (10 мМ HEPES, 150 мМ NaCl, 3 мМ ЭДТА и 0,05% Р-20, рН=7,4), при температуре 25 °С. Программное обеспечение представляло собой программное обеспечение для анализа данных BIACORE™ T200, версия 2.0. При анализе использовали двойной контроль (Fc2-1 и впрыскивание только буфера), и данные аппроксимировали с использованием модели связывания Ленгмюра 1:1.

[0144]

Таблица 4: Экспериментальные параметры в исследовании аффинности и кинетики Ассоциация и диссоциация Путь потока Fc1 и Fc2 Скорость потока (мкл/мин) 30 Время ассоциации (с) 300 Время диссоциации (с) 300 Концентрация образца (мкМ) 20-5 - 1,25 (×2) -0,3125-0,078-0

[0145] График зависимости ответа от времени представлен на ФИГ.1. В исследовании определяли следующие значения: k_a (1/Мс)=1,857×10³; k_d (1/с)=6,781×10^-3; K_D (M)=3,651×10^-6; R_max (ед. ответа)=19,52; и χ²=0,114. Поскольку значение χ² при аппроксимации составляет менее 10% от R_max, подобранная модель является достоверной.

[0146] Пример 3. Конструирование и получение мышиного антитела IgG2b к AGE и химерного антитела IgG1 к AGE

[0147] Получали мышиные антитела к AGE и химерные антитела человека к AGE. Последовательность ДНК тяжелой цепи мышиного антитела IgG2b к AGE приведена в SEQ ID NO:12. Последовательность ДНК химерного антитела человека IgG1 к AGE приведена в SEQ ID NO:13. Последовательность ДНК легкой каппа-цепи мышиного антитела к AGE приведена в SEQ ID NO:14. Последовательность ДНК легкой каппа-цепи химерного антитела человека к AGE приведена в SEQ ID NO:15. Последовательности генов синтезировали и клонировали в векторы с высоким уровнем экспрессии у млекопитающих. Последовательности оптимизировали по кодонам. Готовые конструкции подтверждали с помощью секвенирования перед трансфекцией.

[0148] Клетки линии HEK293 высевали во встряхиваемую колбу за один день до трансфекции и выращивали с использованием бессывороточных сред с определенным химическим составом. Конструкции для экспрессии ДНК кратковременно трансфецировали в 0,03 литра суспензии клеток линии HEK293. Через 20 часов клетки отбирали, чтобы получить жизнеспособные клетки и жизнеспособное количество клеток и измеряли титры (Octet QKe, ForteBio). Дополнительные показатели регистрировали во время ряда этапов трансфекции. Культуры собирали на 5 день, и для каждой культуры измеряли дополнительный образец, чтобы определить плотность и жизнеспособность клеток, а также титр антител.

[0149] Кондиционированные среды для мышиных и химерных антител к AGE собирали и очищали после ряда этапов трансфекции путем центрифугирования и фильтрации. Супернатанты пропускали через колонку с белком А и элюировали буфером с низким рН. Фильтрацию с использованием мембранного фильтра с размером пор 0,2 мкм проводили перед разделением на аликвоты. После очистки и фильтрации концентрации белка рассчитывали на основании OD280 и коэффициента экстинкции. Обобщенные данные по величинам выхода и количеству аликвот приведены в таблице 5:

[0150]

Таблица 5: Величины выхода и количество аликвот Белок Концентрация (мг/мл) Объем (мл) Количество флаконов Общий выход (мг) Мышиное антитело к AGE 0,08 1,00 3 0,24 Химерное антитело к AGE 0,23 1,00 3 0,69

[0151] Чистоту антител оценивали с помощью капиллярного электрофореза в присутствии додецилсульфата натрия (CE-SDS) с использованием LabChip® GXII (PerkinElmer).

[0152] Пример 4. Связывание мышиных (исходных) и химерных антител к AGE

[0153] Связывание мышиных (исходных) и химерных антител к AGE, описанных в примере 3, исследовали с помощью ИФА с прямым связыванием. В качестве контроля использовали антитело к карбоксиметиллизину (CML) (R&D Systems, MAB3247). CML конъюгировали с KLH (CML-KLH), и планшеты для ИФА покрывали CML и CML-KLH в течение ночи. Конъюгированное с пероксидазой хрена (ПХ) козье антитело к Fc мыши использовали для детектирования контрольных и мышиных (исходных) антител к AGE. Конъюгированное с пероксидазой хрена козье антитело к Fc человека использовали для детектирования химерного антитела к AGE.

[0154] Антигены разбавляли до концентрации 1 мкг/мл в 1× фосфатном буфере при рН=6,5. 96-луночный планшет для микротитрования для ИФА покрывали 100 мкл/лунку разведенного антигена и выдерживали в течение ночи при 4 °C. Планшет блокировали 1× PBS с добавлением 2,5% БСА и выдерживали в течение 1-2 часов на следующее утро при комнатной температуре. Образцы антитела получали в виде последовательных разведений с использованием 1× PBS с добавлением 1% БСА с начальной концентрацией 50 мкг/мл. Вторичные антитела разбавляли в соотношении 1:5000. По 100 мкл разбавленных антител вносили в каждую лунку. Планшет инкубировали при комнатной температуре в течение 0,5-1 ч на шейкере для микропланшетов. Планшет промывали 3 раза с использованием 1× PBS. В лунки вносили по 100 мкл/лунку разбавленного конъюгированного с пероксидазой хрена вторичного козьего антитела к Fc человека. Планшет инкубировали в течение 1 часа на шейкере для микропланшетов. Затем планшет промывали 3 раза с использованием 1× PBS. По 100 мкл субстрата ПХ, TMB, добавляли в каждую лунку для развития окрашивания в планшетах. По истечении 3-5 минут реакцию останавливали добавлением 100 мкл 1 н HCl. Второй вариант ИФА с прямым связыванием выполняли только с покрытием CML. Абсорбцию при OD450 считывали с помощью считывателя для микропланшетов.

[0155] Исходные данные по абсорбции OD450 для ИФА с покрытием CML и CML-KLH приведены на карте планшета ниже. Использовали 48 из 96 лунок. Пустые лунки на карте планшета обозначают неиспользованные лунки.

[0156] Карта планшета для ИФА с покрытием CML и CML-KLH:

Концен-трация (мкг/мл) 1 2 3 4 5 6 7 50 0,462 0,092 0,42 1,199 0,142 1,852 16,67 0,312 0,067 0,185 0,31 0,13 0,383 5,56 0,165 0,063 0,123 0,19 0,115 0,425 1,85 0,092 0,063 0,088 0,146 0,099 0,414 0,62 0,083 0,072 0,066 0,108 0,085 0,248 0,21 0,075 0,066 0,09 0,096 0,096 0,12 0,07 0,086 0,086 0,082 0,098 0,096 0,098 0 0,09 0,085 0,12 0,111 0,083 0,582 R&D
Положительный контроль Исходное антитело к AGE Химерное антитело к AGE R&D
Положительный контроль Исходное антитело к AGE Химерное антитело к AGE Покрытие CML-KLH Покрытие CML

[0157] Исходные данные по абсорбции при OD450 для ИФА с покрытием только CML представлены в таблице ниже. Использовали 24 из 96 лунок в планшете. Пустые лунки на карте планшета обозначают неиспользованные лунки.

[0158] Карта планшета для ИФА с покрытием только CML:

Концентрация (мкг/мл) 1 2 3 4 5 6 7 50 1,913 0,165 0,992 16,66667 1,113 0,226 0,541 5,555556 0,549 0,166 0,356 1,851852 0,199 0,078 0,248 0,617284 0,128 0,103 0,159 0,205761 0,116 0,056 0,097 0,068587 0,073 0,055 0,071 0 0,053 0,057 0,06 R&D
Положительный контроль Исходное антитело к AGE Химерное антитело к AGE

[0159] Контрольные и химерные антитела к AGE связывались как с CML, так и с CML-KLH. Мышиное (исходное) антитело к AGE не связывалось или связывалось в незначительной степени как с CML, так и с CML-KLH. Данные повторного ИФА подтверждают связывание контроля и химерного антитела к AGE с CML. Все контрольные пробы с использованием только буфера показали отрицательный сигнал.

[0160] Пример 5: Гуманизированные антитела

[0161] Гуманизированные антитела конструировали путем создания множества гибридных последовательностей, в которых отдельные части последовательности исходного (мышиного) антитела гибридизовали с каркасными последовательностями человека. Акцепторные каркасные участки выявляли на основании общей идентичности последовательностей по всей длине каркаса, совпадающих положений границ раздела, аналогично классифицированных канонических положений CDR и присутствия сайтов N-гликозилирования, которые необходимо было бы удалить. Три гуманизированные легкие цепи и три гуманизированные тяжелые цепи конструировали на основании двух различных акцепторных каркасов тяжелой и легкой цепи человека. Аминокислотные последовательности тяжелых цепей представлены в SEQ ID NO:29, 31 и 33, которые кодируются последовательностями ДНК, представленными в SEQ ID NO:30, 32 и 34, соответственно. Аминокислотные последовательности легких цепей представлены в SEQ ID NO:35, 37 и 39, которые кодируются последовательностями ДНК, представленными в SEQ ID NO:36, 38 и 40, соответственно. Указанные гуманизированные последовательности методично исследовали визуально и с помощью компьютерного моделирования, чтобы выделить последовательности, которые наиболее вероятно сохранят связывание с антигеном. Цель заключалась в том, чтобы максимально увеличить количество последовательности человека в готовых гуманизированных антителах, сохраняя при этом первоначальную специфичность антител. Легкие и тяжелые гуманизированные цепи могут быть объединены, чтобы создать девять вариантов полностью гуманизированных антител.

[0162] Три тяжелые цепи и три легкие цепи исследовали для определения их гуманизированности. Оценки гуманизированности антитела рассчитывали в соответствии со способом, описанным в Gao, S. H., et al., ʺMonoclonal antibody humanness score and its applicationsʺ, BMC Biotechnology, 13:55 (July 5, 2013). Оценка гуманизированности описывает степень сходства последовательности вариабельной области антитела с последовательностью антитела человека. Для тяжелых цепей оценка 79 баллов или выше свидетельствует о том, что они сходны с последовательностями человека; для легких цепей оценка 86 или выше свидетельствует о том, что они сходны с последовательностями человека. Оценки гуманизированности трех тяжелых цепей, трех легких цепей, исходной (мышиной) тяжелой цепи и исходной (мышиной) легкой цепи представлены ниже в таблице 6:

[0163] Таблица 6: Оценки гуманизированности антитела человека

Антитело Гуманизированность (каркас+CDR) Исходная (мышиная) тяжелая цепь 63,60 Тяжелая цепь 1 (SEQ ID NO:29) 82,20 Тяжелая цепь 2 (SEQ ID NO:31) 80,76 Тяжелая цепь 3 (SEQ ID NO:33) 81,10 Исходная (мышиная) легкая цепь 77,87 Легкая цепь 1 (SEQ ID NO:35) 86,74 Легкая цепь 2 (SEQ ID NO:37) 86,04 Легкая цепь 3 (SEQ IN NO: 39) 83,57

[0164] Гены полноразмерных антител конструировали путем в первую очередь синтеза последовательностей вариабельных областей. Последовательности оптимизировали для экспрессии в клетках млекопитающих. Полученные последовательности вариабельных областей затем клонировали в векторы экспрессии, которые уже содержали домены Fc человека; для тяжелой цепи использовали IgG1.

[0165] Маломасштабное получение гуманизированных антител осуществляли путем трансфекции плазмид для тяжелых и легких цепей в суспензию клеток линии HEK293 с использованием бессывороточных сред с определенным химическим составом. Целые антитела в кондиционированной среде очищали с использованием среды MabSelect SuRe Protein A (GE Healthcare).

[0166] Девять гуманизированных антител получали из каждой комбинации трех тяжелых цепей, имеющих аминокислотные последовательности, приведенные в SEQ ID NO:29, 31 и 33, и трех легких цепей, имеющих аминокислотные последовательности, приведенные в SEQ ID NO:35, 37 и 39. Также получали сравнительное химерное исходное антитело. Антитела и их соответствующие титры представлены в таблице 7 ниже:

[0167]

Таблица 7: Титры антител Антитело Титр (мг/л) Химерное исходное антитело 23,00 SEQ ID NO:29+SEQ ID NO:35 24,67 SEQ ID NO:29+SEQ ID NO:37 41,67 SEQ ID NO:29+SEQ ID NO:39 29,67 SEQ ID NO:31+SEQ ID NO:35 26,00 SEQ ID NO:31+SEQ ID NO:37 27,33 SEQ ID NO:31+SEQ ID NO:39 35,33 SEQ ID NO:33+SEQ ID NO:35 44,00 SEQ ID NO:33+SEQ ID NO:37 30,33 SEQ ID NO:33+SEQ ID NO:39 37,33

[0168] Связывание гуманизированных антител можно оценить, например, в исследовании дозозависимого связывания методом ИФА или клеточного анализа связывания.

[0169] Пример 6 (возможное применение): уничтожение метастатических раковых клеток и лечение метастатического рака

[0170] Агрегаты клеток рака яичников человека (Creative BioArray, Ширли, Нью-Йорк, США) инокулировали в/б в двух группах (A и B) мышей prkdcscid (SCID) с дефицитом T- и B-клеток, в частности, мышам линии NSG, доступным от Jackson Laboratories (Фармингтон, Коннектикут, США). Группа A являлась контрольной группой, в которой физиологический раствор вводили путем внутривенной инъекции, и в группе B любое из описанных моноклональных антител к AGE вводили в дозе 5 мкг/г/мышь путем внутривенной инъекции.

[0171] Через 80 дней после инокуляции раковых клеток мышей из групп A и B подвергали макроскопическому и гистологическому обследованию. Мыши в группе B, получившие антитела, имели значительно меньше метастатических очагов, чем контрольные мыши в группе А.

[0172] Пример 6: Исследование введения моноклонального антитела к карбоксиметиллизину в условиях in vivo

[0173] Исследовали влияние антитела к карбоксиметиллизину на рост опухоли, метастатический потенциал и кахексию. Исследования в условиях in vivo проводили у мышей с использованием опухолевой модели рака молочной железы мышей. Возраст самок мышей линии BALB/c (BALB/cAnNCrl, Charles River) составлял одиннадцать недель в 1 день исследования.

[0174] Клетки рака молочной железы мышей 4T1 (ATCC CRL-2539) культивировали в среде RPMI 1640, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки, 2 мМ глутамина, 25 мкг/мл гентамицина, 100 единиц/мл натриевой соли пенициллина G и 100 мкг/мл сульфата стрептомицина. Опухолевые клетки поддерживали в колбах для тканевых культур в инкубаторе при 37°C в увлажненной атмосфере 5% СО₂/95% O₂.

[0175] Культивируемые клетки рака молочной железы затем имплантировали мышам. Клетки 4T1 собирали во время логарифмической фазы размножения и повторно суспендировали в фосфатно-солевом буфере (PBS) в концентрации 1×10⁶ клеток/мл в день имплантации. Опухоли инициировали путем подкожной имплантации 1×10⁵ клеток 4T1 (0,1 мл суспензии) в правый бок каждого испытуемого животного. Опухоли контролировали до достижения целевого диапазона объемов опухолей 80-120 мм³. Объем опухоли определяли по формуле: объем опухоли=(ширина опухоли)²(длина опухоли)/2. Массу опухоли аппроксимировали, исходя из предположения, что 1 мм³ объема опухоли имеет массу 1 мг. Через тринадцать дней после имплантации, обозначенной как 1-й день исследования, мышей распределяли на четыре группы (n=15/группу), при этом индивидуальные объемы опухолей колебались от 108 до 126 мм³ и средний объем опухоли составлял 112 мм³. Четыре группы лечения представлены в таблице 8 ниже:

[0176]

[0177] В качестве терапевтического агента использовали моноклональное антитело к карбоксиметиллизину. 250 мг моноклонального антитела к карбоксиметиллизину получили от R&D Systems (Миннеаполис, Миннесота, США). Растворы моноклонального антитела к карбоксиметиллизину для дозирования готовили в концентрации 1 и 0,5 мг/мл в носителе (PBS) для получения активных дозировок 10 и 5 мкг/г, соответственно, в объеме дозирования 10 мл/кг. Растворы для дозирования хранили при 4°C в защищенном от света месте.

[0178] Все лекарственные препараты вводили внутривенно (в/в) два раза в сутки в течение 21 дня, за исключением 1 дня исследования, когда мышам вводили одну дозу. На 19 день исследования в/в дозу заменяли внутрибрюшинной (в/б) дозой для тех животных, которым из-за разрушения хвостовой вены не могли вводить внутривенные инъекции. Объем дозирования составил 0,200 мл на 20 г массы тела (10 мл/кг) и был скорректирован в соответствии с массой тела каждого отдельного животного.

[0179] Исследование продолжали в течение 23 дней. Опухоли измеряли с помощью штангенциркулей два раза в неделю. Животных взвешивали ежедневно на 1-5 день, затем два раза в неделю до завершения исследования. Мыши также находились под контролем для обнаружения любых побочных эффектов. Приемлемую токсичность определяли как среднюю потерю массы тела менее 20% во время исследования и не более 10% смертей, связанных с лечением. Эффективность лечения определяли с использованием данных, полученных в последний день исследования (23 день).

[0180] Способность антитела к карбоксиметиллизину ингибировать рост опухоли определяли путем сравнения медианы объема опухоли (MTV) для групп 1-3. Объем опухоли измеряли, как описано выше. Процент ингибирования роста опухоли (TGI, %) определяли как разницу между MTV контрольной группы (группа 1) и MTV группы, получавшей лекарственный препарат, выраженную в процентах от MTV контрольной группы. TGI (%) можно рассчитать по формуле: TGI (%)=(1-MTV_{лечение}/MTV_{контроль})×100. На ФИГ. 3 представлен график изменения нормированного объема опухоли в ходе исследования в условиях in vivo для изучения влияния антитела к AGE на рост опухоли, метастатический потенциал и кахексию.

[0181] Способность антитела к карбоксиметиллизину ингибировать метастазы рака определяли путем сравнения очагов рака легких для групп 1-3. Процент ингибирования (ингибирование, %) определяли как разность между средним количеством метастатических очагов контрольной группы и средним количеством метастатических очагов группы, получавшей лекарственный препарат, выраженную в процентах от среднего количества метастатических очагов контрольной группы. Ингибирование (%) может быть рассчитано по следующей формуле: Ингибирование (%)=(1-Среднее кол-во очагов_{лечение}/Среднее кол-во очагов_{контроль})×100.

[0182] Способность антитела к карбоксиметиллизину ингибировать кахексию определяли путем сравнения массы ткани легких и массы икроножных мышц для групп 1-3. Значения массы тканей также нормировали к 100 г массы тела. На ФИГ. 4 представлен график изменения нормированной массы тела мышей в ходе исследования в условиях in vivo для изучения влияния антитела к AGE на рост опухоли, метастатический потенциал и кахексию.

[0183] Эффективность лечения также оценивали по частоте и величине регрессионных ответов, наблюдавшихся во время исследования. Лечение может вызвать частичную регрессию (PR) или полную регрессию (CR) опухоли у животного. При PR-ответе объем опухоли составлял 50% или менее от объема опухоли в 1 день для трех последовательных измерений в ходе исследования и был равен или превышал 13,5 мм³ для одного или более из этих трех измерений. При CR-ответе объем опухоли составлял менее 13,5 мм³ для трех последовательных измерений в ходе исследования.

[0184] Статистический анализ проводили с использованием Prism (GraphPad) для Windows 6.07. Статистические анализы различий между средними объемами опухолей (MTV) двух групп на 23 день осуществляли с использованием U-теста Манна-Уитни. Сравнения метастатических очагов оценивали с использованием дисперсионного анализа и критерия Даннетта. Нормированные значения массы ткани сравнивали с использованием дисперсионного анализа. Двусторонние статистические анализы проводили при уровне значимости P=0,05. Результаты классифицировали как статистически значимые или статистически незначимые.

[0185] Результаты исследования приведены ниже в таблице 9.

[0186] Таблица 9: Результаты

Груп-
па MTV (мм³) TGI (%) Очаги в легких Ингибирование (%) PR CR Нормированная масса икроножных мышц (мг) Нормированная масса легких
(мг) 1 1800 Нет данных 70,4 Нет данных 0 0 353,4/19,68 2799,4/
292,98 2 1568 13% 60,3 14% 0 0 330,4/21,62 2388,9/
179,75 3 1688 6% 49,0 30% 0 0 398,6/24,91 2191,6/
214,90

[0187] Все схемы лечения приемлемо переносились без смертей, связанных с лечением. Единственным случаем смерти животного была вызванная метастазами смерть, которая не была связана с лечением. Анализ тенденции для значений TGI (%) указывал на достоверность (P>0,05, критерий Манна-Уитни) для группы 5 мкг/г (группа 2) и 10 мкг/г (группа 3). Анализ тенденции для ингибирования (%) указывал на достоверность (P>0,05, дисперсионный анализ и критерий Даннетта) для группы лечения 5 мкг/г. Ингибирование (%) было статистически достоверным (P≤0,01, дисперсионный анализ и критерий Даннетта) для группы лечения 10 мкг/г. Анализ тенденции для способности антитела к карбоксиметиллизину лечить кахексию указывал на достоверные отличия (P>0,05, дисперсионный анализ) на основании сравнения массы легких и икроножных мышц между группами лечения и контрольной группой. Результаты указывают на то, что введение моноклонального антитела к карбоксиметиллизину способно уменьшить метастазы рака.

[0188] Пример 7: Диагностика метастатического рака (возможное применение)

[0189] Пациентка с раком молочной железы имеет увеличенные лимфатические узлы. Онколог подозревает, что рак молочной железы образовал метастазы в ее лимфатических узлах. Онколог получает образец крови, а также биопсию из одного ее увеличенного лимфатического узла. Клетки из образца крови и биопсии исследуют для определения присутствия AGE-модифицированных раковых клеток с применением набора, содержащего флуоресцентномеченое антитело к AGE и контроль. Результаты диагностического теста указывают на присутствие циркулирующих AGE-модифицированных раковых клеток в крови пациентки, а также присутствие метастатических клеток рака молочной железы в лимфатических узлах. Второе окрашивание клеток для выявления поверхностного клеточного нуклеолина, известного маркера рака, как описано в патенте США №7541150 Miller et al., подтверждает присутствие раковых клеток.

[0190] СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

[0191] 1. Публикация международной заявки на патент WO 2009/143411, Gruber (26.11.2009).

[0192] 2. Патент США № 5,702,704, Bucala (дата выдачи 30.12.1997).

[0193] 3. Патент США № 6,380,165, Al-Abed et al. (дата выдачи 30.04.2002).

[0194] 4. Патент США № 6,387,373, Wright et al. (дата выдачи 14.05.2002).

[0195] 5. Патент США № 4,217,344, Vanlerberghe et al. (дата выдачи 12.08.1980).

[0196] 6. Патент США № 4,917,951, Wallach (дата выдачи 17.04.1990).

[0197] 7. Патент США № 4,911,928, Wallach (дата выдачи 27.05.1990).

[0198] 8. Заявка на патент США № US 2010/226932, Smith et al. (09.09.2010).

[0199] 9. Ando K, et al., ʺMembrane Proteins of Human Erythrocytes Are Modified by Advanced Glycation End Products During Aging in the Circulation,ʺ Biochemical and Biophysical Research Communications, Vol. 258, 123-27 (1999).

[0200] 10. Lindsey JB, et al., ʺReceptor For Advanced Glycation End-Products (RAGE) and soluble RAGE (sRAGE): Cardiovascular Implications,ʺ Diabetes Vascular Disease Research, Vol. 6(1), 7-14, (2009).

[0201] 11. Bierhaus A, ʺAGEs and their interaction with AGE-receptors in vascular disease and diabetes mellitus. I. The AGE concept,ʺ Cardiovasc Res, Vol. 37(3), 586-600 (1998).

[0202] 12. Meuter A., et al. ʺMarkers of cellular senescence are elevated in murine blastocysts cultured in vitro: molecular consequences of culture in atmospheric oxygenʺ J Assist Reprod Genet. 2014 Aug 10. [предпечатная электронная публикация].

[0203] 13. Baker, D.J. et al., ʺClearance of p16Ink4a-positive senescent cells delays ageing-associated disordersʺ, Nature, vol. 479, pp. 232-236, (2011).

[0204] 14. Jana Hadrabová, et al. ʺChicken immunoglobulins for prophylaxis: Effect of inhaled antibodies on inflammatory parameters in rat airwaysʺ Journal of Applied Biomedicine (в печати; доступно онлайн 05.05.2014).

[0205] 15. Vlassara, H. et al., ʺHigh-affinity-receptor-mediated Uptake and Degradation of Glucose-modified Proteins: A Potential Mechanism for the Removal of Senescent Macromoleculesʺ, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 82, 5588, 5591 (1985).

[0206] 16. Roll, P. et al., ʺAnti-CD20 Therapy in Patients with Rheumatoid Arthritisʺ, Arthritis & Rheumatism, Vol. 58, No. 6, 1566-1575 (2008).

[0207] 17. Kajstura, J. et al., ʺMyocite Turnover in the Aging Human Heartʺ, Circ. Res., Vol. 107(11), 1374-86, (2010).

[0208] 18. de Groot, K. et al., ʺVascular Endothelial Damage and Repair in Antineutrophil Cytoplasmic Antibody-Associated Vasculitisʺ, Arthritis and Rheumatism, Vol. 56(11), 3847, 3847 (2007).

[0209] 19. Manesso, E. et al., ʺDynamics of β-Cell Turnover: Evidence for β-Cell Turnover and Regeneration from Sources of β-Cells other than β-cell Replication in the HIP Ratʺ, Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab., Vol. 297, E323, E324 (2009).

[0210] 20. Kirstein, M. et al., ʺReceptor-specific Induction of Insulin-like Growth Factor I in Human Monocytes by Advanced Glycosylation End Product-modified Proteinsʺ, J. Clin. Invest., Vol. 90, 439, 439-440 (1992).

[0211] 21. Murphy, J. F., ʺTrends in cancer immunotherapyʺ, Clinical Medical Insights: Oncology, Vol. 14(4), 67-80 (2010).

[0212] 22. Virella, G. et al., ʺAutoimmune Response to Advanced Glycosylation End-Products of Human LDLʺ, Journal of Lipid Research, Vol. 44, 487-493 (2003).

[0213] 23. Ameli, S. et al., ʺEffect of Immunization With Homologous LDL and Oxidized LDL on Early Atherosclerosis in Hypercholesterolemic Rabbitsʺ, Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology, Vol. 16, 1074 (1996).

[0214] 24. ʺSarcopeniaʺ, доступно онлайн на en.wikipedia.org/wiki/Sarcopenia (14.11.2014).

[0215] 25. ʺWhat is sarcopenia?ʺ, доступно онлайн на www.iofbonehealth.org/what-sarcopenia (2014).

[0216] 26. Blahd, W., ʺSarcopenia with agingʺ, доступно онлайн на www.webmd.com/healthy-aging/sarcopenia-with-aging (03.08.2014).

[0217] 27. ʺKeyhole limpet hemocyaninʺ, доступно онлайн на en.wikipedia.org/wiki/Keyhole_limpet_hemocyanin (18.04.2014).

[0218] 28. ʺCML-BSA Product Data Sheetʺ, доступно онлайн на www.cellbiolabs.com/sites/default/files/STA-314-cml-bsa.pdf (2010).

[0219] 29. ʺCML (N-epsilon-(Carboxymethyl)Lysine) Assays and Reagentsʺ, доступно онлайн на www.cellbiolabs.com/cml-assays (доступ был получен 15.12.2014).

[0220] 30. Cruz-Jentoft, A. J. et al., ʺSarcopenia: European consensus on definition and diagnosisʺ, Age and Ageing, Vol. 39, pp. 412-423 (13.04.2010).

[0221] 31. Rolland, Y. et al., ʺSarcopenia: its assessment, etiology, pathogenesis, consequences and future perspectivesʺ, J. Nutr. Health Aging, Vol. 12(7), pp. 433-450 (2008).

[0222] 32. Mera, K. et al., ʺAn autoantibody against N^ε-(carboxyethyl)lysine (CEL): Possible involvement in the removal of CEL-modified proteins by macrophagesʺ, Biochemical and Biophysical Research Communications, Vol. 407, pp. 420-425 (12.03.2011).

[0223] 33. Reddy, S. et al., ʺN^ε-(carboxymethyl)lysine is a dominant advanced glycation end product (AGE) antigen in tissue proteinsʺ, Biochemistry, Vol. 34, pp. 10872-10878 (01.08.1995).

[0224] 34. Naylor, R. M. et al., ʺSenescent cells: a novel therapeutic target for aging and age-related diseasesʺ, Clinical Pharmacology & Therapeutics, Vol. 93(1), pp.105-116 (05.12.2012).

[0225] 35. Katcher, H. L., ʺStudies that shed new light on agingʺ, Biochemistry (Moscow), Vol. 78(9), pp. 1061-1070 (2013).

[0226] 36. Ahmed, E. K. et al., ʺProtein Modification and Replicative Senescence of WI-38 Human Embryonic Fibroblastsʺ, Aging Cells, Vol. 9, 252, 260 (2010).

[0227] 37. Vlassara, H. et al., ʺAdvanced Glycosylation Endproducts on Erythrocyte Cell Surface Induce Receptor-Mediated Phagocytosis by Macrophagesʺ, J. Exp. Med., Vol. 166, 539, 545 (1987).

[0228] 38. Fielding, R. A., et al., ʺSarcopenia: an undiagnosed condition in older adults. Current consensus definition: prevalence, etiology, and consequencesʺ, Journal of the American Medical Directors Association, Vol. 12(4), pp. 249-256 (Май 2011).

[0229] 39. Maass, D. R. et al., ʺAlpaca (Lama pacos) as a convenient source of recombinant camelid heavy chain antibodies (VHHs)ʺ, Journal of Immunological Methods, Vol. 324, No. 1-2, pp. 13-25 (31.07.2007).

[0230] 40. Strietzel, C.J. et al., ʺin vitro functional characterization of feline IgGsʺ, Veterinary Immunology and Immunopathology, Vol. 158, pp. 214-223 (2014).

[0231] 41. Patel, M. et al., ʺSequence of the dog immunoglobulin alpha and epsilon constant region genesʺ, Immunogenetics, Vol. 41, pp. 282-286 (1995).

[0232] 42. Wagner, B. et al., ʺThe complete map of the Ig heavy chain constant gene region reveals evidence for seven IgG isotypes and for IgD in the horseʺ, The Journal of Immunology, Vol. 173, pp. 3230-3242 (2004).

[0233] 43. Hamers-Casterman, C. et al., ʺNaturally occurring antibodies devoid of light chainsʺ, Nature, Vol. 363, pp. 446-448 (03.06.1993).

[0234] 44. De Genst, E. et al., ʺAntibody repertoire development in camelidsʺ, Developmental & Comparative Immunology, Vol. 30, pp. 187-198 (досутпно онлайн 11.07.2005).

[0235] 45. Griffin, L.M. et al., ʺAnalysis of heavy and light chain sequences of conventional camelid antibodies from Camelus dromedarius and Camelus bactrianus speciesʺ, Journal of Immunological Methods, Vol. 405, pp. 35-46 (доступно онлайн 18.01.2014).

[0236] 46. Nguyen, V.K. et al., ʺCamel heavy-chain antibodies: diverse germline V_HH and specific mechanisms enlarge the antigen-binding repertoireʺ, The European Molecular Biology Organization Journal, Vol. 19, No, 5, pp. 921-930 (2000).

47. Muyldermans, S. et al., ʺSequence and structure of V_H domain from naturally occurring camel heavy chain immunoglobulins lacking light chainsʺ, Protein Engineering, Vol. 7, No. 9, pp. 1129-1135 (1994).

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> ГРУБЕР, Льюис, С.

<120> СПОСОБ И КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ РАКА, УНИЧТОЖЕНИЯ МЕТАСТАТИЧЕСКИХ РАКОВЫХ КЛЕТОК И ПРОФИЛАКТИКИ МЕТАСТАЗОВ РАКА, ИСПОЛЬЗУЯ АНТИТЕЛА К КОНЕЧНЫМ ПРОДУКТАМ ПОВЫШЕННОГО ГЛИКИРОВАНИЯ (AGE)

<130> SIW01-013-WO

<160> 66

<210> 1

<211> 463

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Модифицированная тяжелая цепь иммуноглобулина G1 Homo sapiens

<400> 1

Met Asn Leu Leu Leu Ile Leu Thr Phe Val Ala Ala Ala Val Ala Gln

1 5 10 15

Val Gln Leu Leu Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser

20 25 30

Val Lys Leu Ala Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Leu Phe Thr Thr Tyr Trp

35 40 45

Met His Trp Leu Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly

50 55 60

Glu Ile Ser Pro Thr Asn Gly Arg Ala Tyr Tyr Asn Ala Arg Phe Lys

65 70 75 80

Ser Glu Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr Met

85 90 95

Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Ala Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

100 105 110

Arg Ala Tyr Gly Asn Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

115 120 125

Val Thr Val Ser Val Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu

130 135 140

Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys

145 150 155 160

Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser

165 170 175

Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser

180 185 190

Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser

195 200 205

Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn

210 215 220

Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His

225 230 235 240

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val

245 250 255

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

260 265 270

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

275 280 285

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

290 295 300

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

305 310 315 320

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

325 330 335

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

340 345 350

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

355 360 365

Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

370 375 380

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

385 390 395 400

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

405 410 415

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

420 425 430

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

435 440 445

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

450 455 460

<210> 2

<211> 118

<212> Белок

<213> Mus musculus

<400> 2

Gln Val Gln Leu Leu Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ala Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Leu Phe Thr Thr Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Leu Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Ser Pro Thr Asn Gly Arg Ala Tyr Tyr Asn Ala Arg Phe

50 55 60

Lys Ser Glu Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Ala Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ala Tyr Gly Asn Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Val

115

<210> 3

<211> 234

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Модифицированная легкая каппа-цепь иммуноглобулина G1 Homo sapiens

<400> 3

Met Asn Leu Leu Leu Ile Leu Thr Phe Val Ala Ala Ala Val Ala Asp

1 5 10 15

Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp

20 25 30

Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Arg Gln Ser Leu Val Asn Ser Asn

35 40 45

Gly Asn Thr Phe Leu Gln Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro

50 55 60

Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Leu Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp

65 70 75 80

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser

85 90 95

Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Leu Tyr Phe Cys Ser Gln Ser Thr

100 105 110

His Val Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

115 120 125

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

130 135 140

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

145 150 155 160

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

165 170 175

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

180 185 190

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

195 200 205

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

210 215 220

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

225 230

<210> 4

<211> 113

<212> Белок

<213> Mus musculus

<400> 4

Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Arg Gln Ser Leu Val Asn Ser

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Phe Leu Gln Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Leu Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Leu Tyr Phe Cys Ser Gln Ser

85 90 95

Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

Arg

<210> 5

<211> 327

<212> Белок

<213> Equus caballus

<400> 5

Ala Ser Thr Thr Ala Pro Lys Val Phe Pro Leu Ala Ser His Ser Ala

1 5 10 15

Ala Thr Ser Gly Ser Thr Val Ala Leu Gly Cys Leu Val Ser Ser Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ser Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Met Val Thr Val Pro Ala Ser Ser Leu Lys Ser Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Ile Val Ile Lys Glu Cys Asn Gly Gly Cys Pro Ala Glu Cys Leu

100 105 110

Gln Val Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val

115 120 125

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Thr Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

130 135 140

Gly His Asp Phe Pro Asp Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

145 150 155 160

Glu Thr His Thr Ala Thr Thr Glu Pro Lys Gln Glu Gln Phe Asn Ser

165 170 175

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile Gln His Lys Asp Trp Leu

180 185 190

Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Ala Leu Pro Ala

195 200 205

Pro Val Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Thr Gly Gln Pro Arg Glu Pro

210 215 220

Gln Val Tyr Val Leu Ala Pro His Arg Asp Glu Leu Ser Lys Asn Lys

225 230 235 240

Val Ser Val Thr Cys Leu Val Lys Asp Phe Tyr Pro Thr Asp Ile Asp

245 250 255

Ile Glu Trp Lys Ser Asn Gly Gln Pro Glu Pro Glu Thr Lys Tyr Ser

260 265 270

Thr Thr Pro Ala Gln Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser

275 280 285

Lys Leu Thr Val Glu Thr Asn Arg Trp Gln Gln Gly Thr Thr Phe Thr

290 295 300

Cys Ala Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Glu Lys Ser

305 310 315 320

Val Ser Lys Ser Pro Gly Lys

325

<210> 6

<211> 415

<212> Белок

<213> Equus caballus

<400> 6

Ser Leu Glu Asp Thr Ala Val Ile Pro Leu Phe Ser Glu Cys Lys Ala

1 5 10 15

Pro Lys Glu Asp Asp Val Val Ser Leu Ala Cys Leu Val Lys Gly Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Gln Val Thr Trp Glu Pro Glu Met Gln Asn Gln

35 40 45

Lys Pro Trp Thr Phe Pro Ala Met Lys Lys Gly Gln Glu Tyr Ile His

50 55 60

Val Phe Ser Leu Thr Thr Trp Trp Lys Pro Gly Ser His Ser Cys Thr

65 70 75 80

Val His His Lys Ala Ser Ser Phe Arg Lys Lys Met Thr Phe Gln Glu

85 90 95

Pro Ala Ser Trp Ala Pro Gln Arg Thr Ser Ala Leu Pro Val Thr Ser

100 105 110

Lys Glu Pro Thr Pro Ala Pro Thr Thr Leu Arg Lys Ser Glu Pro Ser

115 120 125

Thr Arg His Thr Gln Pro Glu Thr Gln Lys Pro Arg Ile Pro Val Asp

130 135 140

Thr Pro Leu Lys Glu Cys Gln Ser His Thr His Pro Pro Ser Ile Tyr

145 150 155 160

Leu Leu His Pro Pro Leu Gln Gly Leu Trp Leu Lys Gly Glu Ala Thr

165 170 175

Phe Thr Cys Leu Val Val Gly Asp Asp Leu Lys Asp Ala His Leu Ser

180 185 190

Trp Glu Leu Ser Glu Arg Ser Asn Gly Met Phe Val Glu Ser Gly Pro

195 200 205

Leu Glu Lys His Thr Asn Gly Ser Gln Ser Arg Ser Ser Arg Leu Ala

210 215 220

Leu Pro Arg Ser Ser Trp Ala Met Gly Thr Ser Val Thr Cys Lys Leu

225 230 235 240

Ser Tyr Pro Asn Leu Leu Ser Ser Met Glu Val Val Gly Leu Lys Glu

245 250 255

His Ala Ala Ser Ala Pro Arg Ser Leu Thr Val His Ala Leu Thr Thr

260 265 270

Pro Gly Leu Asn Ala Ser Pro Gly Ala Thr Ser Trp Leu Gln Cys Lys

275 280 285

Val Ser Gly Phe Ser Pro Pro Glu Ile Val Leu Thr Trp Leu Glu Gly

290 295 300

Gln Arg Glu Val Asp Pro Ser Trp Phe Ala Thr Ala Arg Pro Thr Ala

305 310 315 320

Gln Pro Gly Asn Thr Thr Phe Gln Thr Trp Ser Ile Leu Leu Val Pro

325 330 335

Thr Ile Pro Gly Pro Pro Thr Ala Thr Tyr Thr Cys Val Val Gly His

340 345 350

Glu Ala Ser Arg Gln Leu Leu Asn Thr Ser Trp Ser Leu Asp Thr Gly

355 360 365

Gly Leu Ala Met Thr Pro Glu Ser Lys Asp Glu Asn Ser Asp Asp Tyr

370 375 380

Ala Asp Leu Asp Asp Ala Gly Ser Leu Trp Leu Thr Phe Met Ala Leu

385 390 395 400

Phe Leu Ile Thr Leu Leu Tyr Ser Gly Phe Val Thr Phe Ile Lys

405 410 415

<210> 7

<211> 334

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 7

Ser Lys Thr Ser Pro Ser Val Phe Pro Leu Ser Leu Cys His Gln Glu

1 5 10 15

Ser Glu Gly Tyr Val Val Ile Gly Cys Leu Val Gln Gly Phe Phe Pro

20 25 30

Pro Glu Pro Val Asn Val Thr Trp Asn Ala Gly Lys Asp Ser Thr Ser

35 40 45

Val Lys Asn Phe Pro Pro Met Lys Ala Ala Thr Gly Ser Leu Tyr Thr

50 55 60

Met Ser Ser Gln Leu Thr Leu Pro Ala Ala Gln Cys Pro Asp Asp Ser

65 70 75 80

Ser Val Lys Cys Gln Val Gln His Ala Ser Ser Pro Ser Lys Ala Val

85 90 95

Ser Val Pro Cys Lys Asp Asn Ser His Pro Cys His Pro Cys Pro Ser

100 105 110

Cys Asn Glu Pro Arg Leu Ser Leu Gln Lys Pro Ala Leu Glu Asp Leu

115 120 125

Leu Leu Gly Ser Asn Ala Ser Leu Thr Cys Thr Leu Ser Gly Leu Lys

130 135 140

Asp Pro Lys Gly Ala Thr Phe Thr Trp Asn Pro Ser Lys Gly Lys Glu

145 150 155 160

Pro Ile Gln Lys Asn Pro Glu Arg Asp Ser Cys Gly Cys Tyr Ser Val

165 170 175

Ser Ser Val Leu Pro Gly Cys Ala Asp Pro Trp Asn His Gly Asp Thr

180 185 190

Phe Ser Cys Thr Ala Thr His Pro Glu Ser Lys Ser Pro Ile Thr Val

195 200 205

Ser Ile Thr Lys Thr Thr Glu His Ile Pro Pro Gln Val His Leu Leu

210 215 220

Pro Pro Pro Ser Glu Glu Leu Ala Leu Asn Glu Leu Val Thr Leu Thr

225 230 235 240

Cys Leu Val Arg Gly Phe Lys Pro Lys Asp Val Leu Val Arg Trp Leu

245 250 255

Gln Gly Thr Gln Glu Leu Pro Gln Glu Lys Tyr Leu Thr Trp Glu Pro

260 265 270

Leu Lys Glu Pro Asp Gln Thr Asn Met Phe Ala Val Thr Ser Met Leu

275 280 285

Arg Val Thr Ala Glu Asp Trp Lys Gln Gly Glu Lys Phe Ser Cys Met

290 295 300

Val Gly His Glu Ala Leu Pro Met Ser Phe Thr Gln Lys Thr Ile Asp

305 310 315 320

Arg Leu Ala Gly Lys Pro Thr His Val Asn Val Ser Val Val

325 330

<210> 8

<211> 426

<212> Белок

<213> Canis familiaris

<400> 8

Thr Ser Gln Asp Leu Ser Val Phe Pro Leu Ala Ser Cys Cys Lys Asp

1 5 10 15

Asn Ile Ala Ser Thr Ser Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Thr Gly Tyr

20 25 30

Leu Pro Met Ser Thr Thr Val Thr Trp Asp Thr Gly Ser Leu Asn Lys

35 40 45

Asn Val Thr Thr Phe Pro Thr Thr Phe His Glu Thr Tyr Gly Leu His

50 55 60

Ser Ile Val Ser Gln Val Thr Ala Ser Gly Lys Trp Ala Lys Gln Arg

65 70 75 80

Phe Thr Cys Ser Val Ala His Ala Glu Ser Thr Ala Ile Asn Lys Thr

85 90 95

Phe Ser Ala Cys Ala Leu Asn Phe Ile Pro Pro Thr Val Lys Leu Phe

100 105 110

His Ser Ser Cys Asn Pro Val Gly Asp Thr His Thr Thr Ile Gln Leu

115 120 125

Leu Cys Leu Ile Ser Gly Tyr Val Pro Gly Asp Met Glu Val Ile Trp

130 135 140

Leu Val Asp Gly Gln Lys Ala Thr Asn Ile Phe Pro Tyr Thr Ala Pro

145 150 155 160

Gly Thr Lys Glu Gly Asn Val Thr Ser Thr His Ser Glu Leu Asn Ile

165 170 175

Thr Gln Gly Glu Trp Val Ser Gln Lys Thr Tyr Thr Cys Gln Val Thr

180 185 190

Tyr Gln Gly Phe Thr Phe Lys Asp Glu Ala Arg Lys Cys Ser Glu Ser

195 200 205

Asp Pro Arg Gly Val Thr Ser Tyr Leu Ser Pro Pro Ser Pro Leu Asp

210 215 220

Leu Tyr Val His Lys Ala Pro Lys Ile Thr Cys Leu Val Val Asp Leu

225 230 235 240

Ala Thr Met Glu Gly Met Asn Leu Thr Trp Tyr Arg Glu Ser Lys Glu

245 250 255

Pro Val Asn Pro Gly Pro Leu Asn Lys Lys Asp His Phe Asn Gly Thr

260 265 270

Ile Thr Val Thr Ser Thr Leu Pro Val Asn Thr Asn Asp Trp Ile Glu

275 280 285

Gly Glu Thr Tyr Tyr Cys Arg Val Thr His Pro His Leu Pro Lys Asp

290 295 300

Ile Val Arg Ser Ile Ala Lys Ala Pro Gly Lys Arg Ala Pro Pro Asp

305 310 315 320

Val Tyr Leu Phe Leu Pro Pro Glu Glu Glu Gln Gly Thr Lys Asp Arg

325 330 335

Val Thr Leu Thr Cys Leu Ile Gln Asn Phe Phe Pro Ala Asp Ile Ser

340 345 350

Val Gln Trp Leu Arg Asn Asp Ser Pro Ile Gln Thr Asp Gln Tyr Thr

355 360 365

Thr Thr Gly Pro His Lys Val Ser Gly Ser Arg Pro Ala Phe Phe Ile

370 375 380

Phe Ser Arg Leu Glu Val Ser Arg Val Asp Trp Glu Gln Lys Asn Lys

385 390 395 400

Phe Thr Cys Gln Val Val His Glu Ala Leu Ser Gly Ser Arg Ile Leu

405 410 415

Gln Lys Trp Val Ser Lys Thr Pro Gly Lys

420 425

<210> 9

<211> 335

<212> Белок

<213> Felis catus

<400> 9

Ala Ser Thr Thr Ala Ser Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Cys Gly

1 5 10 15

Thr Thr Ser Gly Ala Thr Val Ala Leu Ala Cys Leu Val Leu Gly Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ser Val Leu Gln Ala Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Met Val Thr Val Pro Ser Ser Arg Trp Leu Ser Asp Thr

65 70 75 80

Phe Thr Cys Asn Val Ala His Arg Pro Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Thr Val Pro Lys Thr Ala Ser Thr Ile Glu Ser Lys Thr Gly Glu Gly

100 105 110

Pro Lys Cys Pro Val Pro Glu Ile Pro Gly Ala Pro Ser Val Phe Ile

115 120 125

Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Ser Ile Ser Arg Thr Pro Glu

130 135 140

Val Thr Cys Leu Val Val Asp Leu Gly Pro Asp Asp Ser Asn Val Gln

145 150 155 160

Ile Thr Trp Phe Val Asp Asn Thr Glu Met His Thr Ala Lys Thr Arg

165 170 175

Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu

180 185 190

Pro Ile Leu His Gln Asp Trp Leu Lys Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys

195 200 205

Val Asn Ser Lys Ser Leu Pro Ser Ala Met Glu Arg Thr Ile Ser Lys

210 215 220

Ala Lys Gly Gln Pro His Glu Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Thr

225 230 235 240

Gln Glu Glu Leu Ser Glu Asn Lys Val Ser Val Thr Cys Leu Ile Lys

245 250 255

Gly Phe His Pro Pro Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ile Thr Gly Gln

260 265 270

Pro Glu Pro Glu Asn Asn Tyr Gln Thr Thr Pro Pro Gln Leu Asp Ser

275 280 285

Asp Gly Thr Tyr Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Ser Val Asp Arg Ser His

290 295 300

Trp Gln Arg Gly Asn Thr Tyr Thr Cys Ser Val Ser His Glu Ala Leu

305 310 315 320

His Ser His His Thr Gln Lys Ser Leu Thr Gln Ser Pro Gly Lys

325 330 335

<210> 10

<211> 96

<212> Белок

<213> Camelus dromedarius

<400> 10

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Arg Glu Arg Glu Gly Val

35 40 45

Ala Ala Ile Asn Ser Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

<210> 11

<211> 96

<212> Белок

<213> Camelus dromedarius

<400> 11

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Trp Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Thr Ile Asn Ser Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Met Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

<210> 12

<211> 1434

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Тяжелая цепь IgG2b мыши к AGE

<400> 12

atggacccca agggcagcct gagctggaga atcctgctgt tcctgagcct ggccttcgag 60

ctgagctacg gccaggtgca gctgctgcag ccaggtgccg agctcgtgaa acctggcgcc 120

tctgtgaagc tggcctgcaa ggcttccggc tacctgttca ccacctactg gatgcactgg 180

ctgaagcaga ggccaggcca gggcctggaa tggatcggcg agatctcccc caccaacggc 240

agagcctact acaacgcccg gttcaagtcc gaggccaccc tgaccgtgga caagtcctcc 300

aacaccgcct acatgcagct gtcctccctg acctctgagg cctccgccgt gtactactgc 360

gccagagctt acggcaacta cgagttcgcc tactggggcc agggcaccct cgtgacagtg 420

tctgtggcta agaccacccc tccctccgtg taccctctgg ctcctggctg tggcgacacc 480

accggatcct ctgtgaccct gggctgcctc gtgaagggct acttccctga gtccgtgacc 540

gtgacctgga actccggctc cctgtcctcc tccgtgcaca cctttccagc cctgctgcag 600

tccggcctgt acaccatgtc ctccagcgtg acagtgccct cctccacctg gccttcccag 660

accgtgacat gctctgtggc ccaccctgcc tcttccacca ccgtggacaa gaagctggaa 720

ccctccggcc ccatctccac catcaaccct tgccctccct gcaaagaatg ccacaagtgc 780

cctgccccca acctggaagg cggcccttcc gtgttcatct tcccacccaa catcaaggac 840

gtgctgatga tctccctgac ccccaaagtg acctgcgtgg tggtggacgt gtccgaggac 900

gaccctgacg tgcagatcag ttggttcgtg aacaacgtgg aagtgcacac cgcccagacc 960

cagacacaca gagaggacta caacagcacc atcagagtgg tgtctaccct gcccatccag 1020

caccaggact ggatgtccgg caaagaattc aagtgcaaag tgaacaacaa ggacctgccc 1080

agccccatcg agcggaccat ctccaagatc aagggcctcg tgcgggctcc ccaggtgtac 1140

attctgcctc caccagccga gcagctgtcc cggaaggatg tgtctctgac atgtctggtc 1200

gtgggcttca accccggcga catctccgtg gaatggacct ccaacggcca caccgaggaa 1260

aactacaagg acaccgcccc tgtgctggac tccgacggct cctacttcat ctactccaag 1320

ctgaacatga agacctccaa gtgggaaaag accgactcct tctcctgcaa cgtgcggcac 1380

gagggcctga agaactacta cctgaagaaa accatctccc ggtcccccgg ctag 1434

<210> 13

<211> 1416

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Химерная тяжелая цепь антитела IgG1 человека к AGE

<400> 13

atggacccca agggcagcct gagctggaga atcctgctgt tcctgagcct ggccttcgag 60

ctgagctacg gccaggtgca gctgctgcag ccaggtgccg agctcgtgaa acctggcgcc 120

tctgtgaagc tggcctgcaa ggcttccggc tacctgttca ccacctactg gatgcactgg 180

ctgaagcaga ggccaggcca gggcctggaa tggatcggcg agatctcccc caccaacggc 240

agagcctact acaacgcccg gttcaagtcc gaggccaccc tgaccgtgga caagtcctcc 300

aacaccgcct acatgcagct gtcctccctg acctctgagg cctccgccgt gtactactgc 360

gccagagctt acggcaacta cgagttcgcc tactggggcc agggcaccct cgtgacagtg 420

tctgtggcta gcaccaaggg ccccagcgtg ttccctctgg cccccagcag caagagcacc 480

agcggcggaa ccgccgccct gggctgcctg gtgaaggact acttccccga gcccgtgacc 540

gtgtcctgga acagcggcgc tctgaccagc ggagtgcaca ccttccctgc cgtgctgcag 600

agcagcggcc tgtactccct gagcagcgtg gtgaccgtgc ccagcagcag cctgggcacc 660

cagacctaca tctgcaacgt gaaccacaag ccctccaaca ccaaggtgga caagaaggtg 720

gagcctaaga gctgcgacaa gacccacacc tgccctccct gccccgcccc cgagctgctg 780

ggcggaccca gcgtgttcct gttccctccc aagcccaagg acaccctgat gatcagccgc 840

acccccgagg tgacctgcgt ggtggtggac gtgagccacg aggaccccga ggtgaagttc 900

aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcac aacgccaaga ccaagcctcg ggaggagcag 960

tacaactcca cctaccgcgt ggtgagcgtg ctgaccgtgc tgcaccagga ctggctgaac 1020

ggcaaggagt acaagtgcaa ggtgagcaac aaggccctgc ccgctcccat cgagaagacc 1080

atcagcaagg ccaagggcca gccccgggag cctcaggtgt acaccctgcc ccccagccgc 1140

gacgagctga ccaagaacca ggtgagcctg acctgcctgg tgaagggctt ctacccctcc 1200

gacatcgccg tggagtggga gagcaacggc cagcctgaga acaactacaa gaccacccct 1260

cccgtgctgg acagcgacgg cagcttcttc ctgtacagca agctgaccgt ggacaagtcc 1320

cggtggcagc agggcaacgt gttcagctgc agcgtgatgc acgaggccct gcacaaccac 1380

tacacccaga agagcctgag cctgagcccc ggatag 1416

<210> 14

<211> 720

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Легкая каппа-цепь мышиного антитела к AGE

<400> 14

atggagaccg acaccctgct gctctgggtg ctgctgctct gggtgcccgg ctccaccgga 60

gacgtcgtga tgacccagac ccctctgtcc ctgcctgtgt ctctgggcga ccaggcctcc 120

atctcctgcc ggtctagaca gtccctcgtg aactccaacg gcaacacctt cctgcagtgg 180

tatctgcaga agcccggcca gtcccccaag ctgctgatct acaaggtgtc cctgcggttc 240

tccggcgtgc ccgacagatt ttccggctct ggctctggca ccgacttcac cctgaagatc 300

tcccgggtgg aagccgagga cctgggcctg tacttctgca gccagtccac ccacgtgccc 360

cctacatttg gcggaggcac caagctggaa atcaaacggg cagatgctgc accaactgta 420

tccatcttcc caccatccag tgagcagtta acatctggag gtgcctcagt cgtgtgcttc 480

ttgaacaact tctaccccaa agacatcaat gtcaagtgga agattgatgg cagtgaacga 540

caaaatggcg tcctgaacag ttggactgat caggacagca aagacagcac ctacagcatg 600

agcagcaccc tcacgttgac caaggacgag tatgaacgac ataacagcta tacctgtgag 660

gccactcaca agacatcaac ttcacccatt gtcaagagct tcaacaggaa tgagtgttga 720

<210> 15

<211> 720

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Химерная легкая каппа-цепь антитела человека к AGE

<400> 15

atggagaccg acaccctgct gctctgggtg ctgctgctct gggtgcccgg ctccaccgga 60

gacgtcgtga tgacccagac ccctctgtcc ctgcctgtgt ctctgggcga ccaggcctcc 120

atctcctgcc ggtctagaca gtccctcgtg aactccaacg gcaacacctt cctgcagtgg 180

tatctgcaga agcccggcca gtcccccaag ctgctgatct acaaggtgtc cctgcggttc 240

tccggcgtgc ccgacagatt ttccggctct ggctctggca ccgacttcac cctgaagatc 300

tcccgggtgg aagccgagga cctgggcctg tacttctgca gccagtccac ccacgtgccc 360

cctacatttg gcggaggcac caagctggaa atcaagcgga ccgtggccgc ccccagcgtg 420

ttcatcttcc ctcccagcga cgagcagctg aagtctggca ccgccagcgt ggtgtgcctg 480

ctgaacaact tctacccccg cgaggccaag gtgcagtgga aggtggacaa cgccctgcag 540

agcggcaaca gccaggagag cgtgaccgag caggactcca aggacagcac ctacagcctg 600

agcagcaccc tgaccctgag caaggccgac tacgagaagc acaaggtgta cgcctgcgag 660

gtgacccacc agggactgtc tagccccgtg accaagagct tcaaccgggg cgagtgctaa 720

<210> 16

<211> 477

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Тяжелая цепь мышиного антитела IgG2b к AGE

<400> 16

Met Asp Pro Lys Gly Ser Leu Ser Trp Arg Ile Leu Leu Phe Leu Ser

1 5 10 15

Leu Ala Phe Glu Leu Ser Tyr Gly Gln Val Gln Leu Leu Gln Pro Gly

20 25 30

Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ala Cys Lys Ala

35 40 45

Ser Gly Tyr Leu Phe Thr Thr Tyr Trp Met His Trp Leu Lys Gln Arg

50 55 60

Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu Ile Ser Pro Thr Asn Gly

65 70 75 80

Arg Ala Tyr Tyr Asn Ala Arg Phe Lys Ser Glu Ala Thr Leu Thr Val

85 90 95

Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser

100 105 110

Glu Ala Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala Tyr Gly Asn Tyr Glu

115 120 125

Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Val Ala Lys

130 135 140

Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Cys Gly Asp Thr

145 150 155 160

Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro

165 170 175

Glu Ser Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Ser Val

180 185 190

His Thr Phe Pro Ala Leu Leu Gln Ser Gly Leu Tyr Thr Met Ser Ser

195 200 205

Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Thr Val Thr Cys

210 215 220

Ser Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Thr Val Asp Lys Lys Leu Glu

225 230 235 240

Pro Ser Gly Pro Ile Ser Thr Ile Asn Pro Cys Pro Pro Cys Lys Glu

245 250 255

Cys His Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe

260 265 270

Ile Phe Pro Pro Asn Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Thr Pro

275 280 285

Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val

290 295 300

Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr

305 310 315 320

Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Ile Arg Val Val Ser Thr

325 330 335

Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys

340 345 350

Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ser Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser

355 360 365

Lys Ile Lys Gly Leu Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Ile Leu Pro Pro

370 375 380

Pro Ala Glu Gln Leu Ser Arg Lys Asp Val Ser Leu Thr Cys Leu Val

385 390 395 400

Val Gly Phe Asn Pro Gly Asp Ile Ser Val Glu Trp Thr Ser Asn Gly

405 410 415

His Thr Glu Glu Asn Tyr Lys Asp Thr Ala Pro Val Leu Asp Ser Asp

420 425 430

Gly Ser Tyr Phe Ile Tyr Ser Lys Leu Asn Met Lys Thr Ser Lys Trp

435 440 445

Glu Lys Thr Asp Ser Phe Ser Cys Asn Val Arg His Glu Gly Leu Lys

450 455 460

Asn Tyr Tyr Leu Lys Lys Thr Ile Ser Arg Ser Pro Gly

465 470 475

<210> 17

<211> 471

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Химерная тяжелая цепь IgG1 человека к AGE

<400> 17

Met Asp Pro Lys Gly Ser Leu Ser Trp Arg Ile Leu Leu Phe Leu Ser

1 5 10 15

Leu Ala Phe Glu Leu Ser Tyr Gly Gln Val Gln Leu Leu Gln Pro Gly

20 25 30

Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ala Cys Lys Ala

35 40 45

Ser Gly Tyr Leu Phe Thr Thr Tyr Trp Met His Trp Leu Lys Gln Arg

50 55 60

Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu Ile Ser Pro Thr Asn Gly

65 70 75 80

Arg Ala Tyr Tyr Asn Ala Arg Phe Lys Ser Glu Ala Thr Leu Thr Val

85 90 95

Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser

100 105 110

Glu Ala Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala Tyr Gly Asn Tyr Glu

115 120 125

Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Val Ala Ser

130 135 140

Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr

145 150 155 160

Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro

165 170 175

Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val

180 185 190

His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser

195 200 205

Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile

210 215 220

Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val

225 230 235 240

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala

245 250 255

Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

260 265 270

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

275 280 285

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val

290 295 300

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

305 310 315 320

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

325 330 335

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala

340 345 350

Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

355 360 365

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr

370 375 380

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

385 390 395 400

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

405 410 415

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

420 425 430

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe

435 440 445

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

450 455 460

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

465 470

<210> 18

<211> 239

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Легкая каппа-цепь мышиного антитела к AGE

<400> 18

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro

20 25 30

Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Arg Gln Ser

35 40 45

Leu Val Asn Ser Asn Gly Asn Thr Phe Leu Gln Trp Tyr Leu Gln Lys

50 55 60

Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Leu Arg Phe

65 70 75 80

Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe

85 90 95

Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Leu Tyr Phe

100 105 110

Cys Ser Gln Ser Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys

115 120 125

Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro

130 135 140

Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe

145 150 155 160

Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp

165 170 175

Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp

180 185 190

Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys

195 200 205

Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys

210 215 220

Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys

225 230 235

<210> 19

<211> 239

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Химерная легкая каппа-цепь антитела человека к AGE

<400> 19

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro

20 25 30

Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Arg Gln Ser

35 40 45

Leu Val Asn Ser Asn Gly Asn Thr Phe Leu Gln Trp Tyr Leu Gln Lys

50 55 60

Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Leu Arg Phe

65 70 75 80

Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe

85 90 95

Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Leu Tyr Phe

100 105 110

Cys Ser Gln Ser Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys

115 120 125

Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro

130 135 140

Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu

145 150 155 160

Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp

165 170 175

Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp

180 185 190

Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys

195 200 205

Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln

210 215 220

Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

225 230 235

<210> 20

<211> 118

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Тяжелая цепь IgG2b мыши к AGE (вариабельная область)

<400> 20

Gln Val Gln Leu Leu Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ala Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Leu Phe Thr Thr Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Leu Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Ser Pro Thr Asn Gly Arg Ala Tyr Tyr Asn Ala Arg Phe

50 55 60

Lys Ser Glu Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Ala Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ala Tyr Gly Asn Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Val

115

<210> 21

<211> 112

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Легкая каппа-цепь мышиного антитела к AGE (вариабельная область)

<400> 21

Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Arg Gln Ser Leu Val Asn Ser

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Phe Leu Gln Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Leu Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Leu Tyr Phe Cys Ser Gln Ser

85 90 95

Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 22

<211> 326

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Константная область человека

<400> 22

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg

1 5 10 15

Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

100 105 110

Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

115 120 125

Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp

130 135 140

Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly

145 150 155 160

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn

165 170 175

Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp

180 185 190

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro

195 200 205

Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu

210 215 220

Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn

225 230 235 240

Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile

245 250 255

Ser Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr

260 265 270

Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys

275 280 285

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys

290 295 300

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu

305 310 315 320

Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325

<210> 23

<211> 7

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR1H (тяжелая цепь)

<400> 23

Ser Tyr Thr Met Gly Val Ser

1 5

<210> 24

<211> 17

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2H (тяжелая цепь)

<400> 24

Thr Ile Ser Ser Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 25

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR3H (тяжелая цепь)

<220>

<221> misc_feature

<222> (10)..(10)

<223> Xaa может быть любой природной аминокислотой

<400> 25

Gln Gly Gly Trp Leu Pro Pro Phe Ala Xaa

1 5 10

<210> 26

<211> 17

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR1L (легкая цепь)

<400> 26

Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser Ser Arg Gly Tyr Ser Tyr Met

1 5 10 15

His

<210> 27

<211> 7

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2L (легкая цепь)

<400> 27

Leu Val Ser Asn Leu Glu Ser

1 5

<210> 28

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR3L (легкая цепь)

<400> 28

Gln His Ile Arg Glu Leu Thr Arg Ser

1 5

<210> 29

<211> 468

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Гуманизированная тяжелая цепь

<400> 29

Met Asp Pro Lys Gly Ser Leu Ser Trp Arg Ile Leu Leu Phe Leu Ser

1 5 10 15

Leu Ala Phe Glu Leu Ser Tyr Gly Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly

20 25 30

Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala

35 40 45

Ser Gly Tyr Leu Phe Thr Thr Tyr Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala

50 55 60

Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Glu Ile Ser Pro Thr Asn Gly

65 70 75 80

Arg Ala Tyr Tyr Asn Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Val

85 90 95

Asp Lys Ser Thr Asn Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser

100 105 110

Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala Tyr Gly Asn Tyr Phe

115 120 125

Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr

130 135 140

Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser

145 150 155 160

Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu

165 170 175

Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His

180 185 190

Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser

195 200 205

Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys

210 215 220

Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu

225 230 235 240

Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Pro Glu

245 250 255

Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

260 265 270

Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp

275 280 285

Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly

290 295 300

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn

305 310 315 320

Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp

325 330 335

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro

340 345 350

Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu

355 360 365

Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Lys Asn Gln

370 375 380

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

385 390 395 400

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

405 410 415

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu

420 425 430

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

435 440 445

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

450 455 460

Leu Ser Pro Gly

465

<210> 30

<211> 1408

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Гуманизированная легкая цепь

<400> 30

atggacccca agggcagcct gagctggaga atcctgctgt tcctgagcct ggccttcgag 60

ctgagctacg gccaggtgca gctggtgcag tctggcgccg aagtgaagaa acctggcgcc 120

tccgtgaggt gtcctgcaag gcttccggct acctgttcac cacctactgg atgcactggg 180

tgcgacaggc ccctggacag ggcctggaat ggatgggcga gatctcccct accaacggca 240

gagcctacta caacagaaat tccagggcag agtgaccatg accgtggaca agtccaccaa 300

caccgtgtac atggaactgt cctccctgcg gagcgaggac accgccgtgt actactgcgc 360

tagagcctac ggcaactacg attcgcctac tggggccagg gcaccctcgt gacagtgtcc 420

tctgctagca ccaagggccc cagcgtgttc cctctggccc ccagcagcaa gagcaccagc 480

ggcggaaccg ccgccctggg ctgcctggga aggactactt ccccgagccc gtgaccgtgt 540

cctggaacag cggcgctctg accagcggag tgcacacctt ccctgccgtg ctgcagagca 600

gcggcctgta ctccctgagc agcgtggtga ccgtgccagc agcagcctgg gcacccagac 660

ctacatctgc aacgtgaacc acaagccctc caacaccaag gtggacaaga aggtggagcc 720

taagagctgc gacaagaccc acacctgccc tccctgcccc gccccgagct gctgggcgga 780

cccagcgtgt tcctgttccc tcccaagccc aaggacaccc tgatgatcag ccgcaccccc 840

gaggtgacct gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaggacc ccgaggtgag ttcaactggt 900

acgtggacgg cgtggaggtg cacaacgcca agaccaagcc tcgggaggag cagtacaact 960

ccacctaccg cgtggtgagc gtgctgaccg tgctgcacca ggactggctg aacggcagga 1020

gtacaagtgc aaggtgagca acaaggccct gcccgctccc atcgagaaga ccatcagcaa 1080

ggccaagggc cagccccggg agcctcaggt gtacaccctg ccccccagcc gcgacgagct 1140

gacaagaacc aggtgagcct gacctgcctg gtgaagggct tctacccctc cgacatcgcc 1200

gtggagtggg agagcaacgg ccagcctgag aacaactaca agaccacccc tcccgtgctg 1260

gacagcgacg cagcttcttc ctgtacagca agctgaccgt ggacaagtcc cggtggcagc 1320

agggcaacgt gttcagctgc agcgtgatgc acgaggccct gcacaaccac tacacccaga 1380

agagcctgag cctgagcccg gatagtaa 1408

<210> 31

<211> 468

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Гуманизированная тяжелая цепь

<400> 31

Met Asp Pro Lys Gly Ser Leu Ser Trp Arg Ile Leu Leu Phe Leu Ser

1 5 10 15

Leu Ala Phe Glu Leu Ser Tyr Gly Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly

20 25 30

Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala

35 40 45

Ser Gly Tyr Leu Phe Thr Thr Tyr Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala

50 55 60

Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Glu Ile Ser Pro Thr Asn Gly

65 70 75 80

Arg Ala Tyr Tyr Asn Ala Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Val

85 90 95

Asp Lys Ser Thr Asn Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser

100 105 110

Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala Tyr Gly Asn Tyr Phe

115 120 125

Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr

130 135 140

Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser

145 150 155 160

Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu

165 170 175

Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His

180 185 190

Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser

195 200 205

Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys

210 215 220

Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu

225 230 235 240

Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Pro Glu

245 250 255

Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

260 265 270

Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp

275 280 285

Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly

290 295 300

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn

305 310 315 320

Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp

325 330 335

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro

340 345 350

Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu

355 360 365

Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Lys Asn Gln

370 375 380

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

385 390 395 400

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

405 410 415

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu

420 425 430

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

435 440 445

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

450 455 460

Leu Ser Pro Gly

465

<210> 32

<211> 1408

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Гуманизированная легкая цепь

<400> 32

atggacccca agggcagcct gagctggaga atcctgctgt tcctgagcct ggccttcgag 60

ctgagctacg gccaggtgca gctggtgcag tctggcgccg aagtgaagaa acctggcgcc 120

tccgtgaggt gtcctgcaag gcttccggct acctgttcac cacctactgg atgcactggg 180

tgcgacaggc ccctggacag ggcctggaat ggatgggcga gatctcccct accaacggca 240

gagcctacta caaccaaaat tccagggcag agtgaccatg accgtggaca agtccaccaa 300

caccgcttac atggaactgt cctccctgcg gagcgaggac accgccgtgt actactgcgc 360