АНТИГЕНСВЯЗЫВАЮЩАЯ МОЛЕКУЛА, СОДЕРЖАЩАЯ ДВА АНТИГЕНСВЯЗЫВАЮЩИХ ДОМЕНА, КОТОРЫЕ СВЯЗАНЫ ДРУГ С ДРУГОМ Российский патент 2025 года по МПК C07K16/46 C07K16/28 C12N15/63 A61K39/395 A61P43/00 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к антигенсвязывающим молекулам, которые содержат первый антигенсвязывающий домен и второй антигенсвязывающий домен, которые сцеплены друг с другом, способам получения указанной антигенсвязывающей молекулы, способам применения указанной антигенсвязывающей молекулы и фармацевтическим композициям, содержащим указанную антигенсвязывающую молекулу. Настоящее изобретение относится также к способам повышения устойчивости антигенсвязывающей молекулы к расщеплению протеазой.

Предпосылки создания изобретения

Антитела представляют собой белки, которые специфически связываются с антигеном с высокой аффинностью. Известно, что антигены могут представлять собой различные молекулы, варьирующиеся от низкомолекулярных соединений для белков. После разработки методики получения моноклональных антител были усовершенствованы методики модификации, позволяющие легко получать антитела, которые распознают конкретную молекулу. В настоящее время методики модификации антител предназначены не только для модификации самих белков, но они распространяются также на область, включающую добавление новых функций, в которой предусматривается конъюгация с низкомолекулярными соединениями. Например, сконструированные с использованием цистеина антитела, которые содержат свободную аминокислоту цистеин в тяжелой цепи или легкой цепи, применяют в качестве конъюгатов антитело - лекарственное средство (ADC) для медицинских целей (PTL 1).

При этом, методики модификации антител способствуют не только развитию инжиниринга антител в качестве инструментов для обнаружения, анализа и очистки белков, но также и развитию инжиниринга белков в целом, например, улучшению функции белка, не являющегося антителом, с использованием молекулы самого антитела в качестве белка-модели.

Антитела привлекают внимание в качестве фармацевтических средств благодаря их высокой стабильности в плазме крови и небольшому количеству побочных действий. Антитела не только связываются с антигеном и проявляют агонистические или антагонистические действия, но они индуцируют также цитотоксическую активность, опосредуемую эффекторными клетками (что обозначают также как эффекторные функции), включая ADCC (антитело-обусловленная клеточнозависимая цитотоксичность), ADCP (антителозависимый клеточный фагоцитоз) и CDC (комплементзависимая цитотоксичность). С учетом преимущества указанных функций антител разработаны фармацевтические средства для лечения рака, иммунных заболеваний, хронического заболевания, инфекций и т.д. (NPL 1).

Например, в качестве противораковых агентов разработаны фармацевтические средства на основе агонистического антитела против костимуляторной молекулы, которая способствует активации цитотоксических Т-клеток (NPL 2). В настоящее время обнаружено, что антитела, ингибирующие иммунные чекпоинты, с антагонистической активностью в отношении коингибирующих молекул, могут быть ценными в качестве противораковых агентов. Эти сведения привели к открытию серии фармацевтических средств на основе антител, ингибирующих взаимодействие CTLA4/CD80 или PD-1/PD-L1: таких как ипилимумаб, ниволумаб, пембролизумаб и атезолизумаб (NPL 1).

Однако указанные антитела иногда не проявляют в достаточной степени ожидаемое действие в их исходной нативной IgG-форме. По этой причине разработаны фармацевтические средства на основе второго поколения антител, у которых функции нативного антитела IgG-типа искусственно усилены или добавлены, или ослаблены или удалены в зависимости от цели применения. Фармацевтические средства на основе второго поколения антител включают, например, антитела с усиленными или элиминированными эффекторными функциями (NPL 3), антитела, которые связываются с антигеном рН-зависимым образом (NPL 4), и антитела, которые связываются с двумя или большим количеством различных антигенов на молекулу (антитела, которые связываются с двумя различными антигенами, как правило, обозначают как «биспецифические антитела») (NPL 5).

Ожидается, что биспецифические антитела должны являться более эффективными фармацевтическими средствами. Например, разработаны антитела с повышенной противоопухолевой активностью, которые обеспечивают перекрестное сшивание цитотоксической Т-клетки с раковой клеткой путем связывания с белком, который экспрессируется на клеточной мембране Т-клетки, в качестве одного антигена и раковым антигеном в качестве другого антигена (NPL 7, NPL 8 и PTL 2). Ранее описанные биспецифические антитела включают молекулы с двумя Fab-доменами антитела, каждый из которых имеет отличную от другого последовательность (биспецифические антитела с общей легкой цепью и гибридные гибридомы), молекулы с дополнительным антигенсвязывающим сайтом, присоединенным к N- или С-концу антитела (DVD-Ig и scFv-IgG), молекулы с одним Fab-доменом, связывающимся с двумя антигенами (IgG «два-в-одном»), молекулы, в которых петлевые области СН3-домена сконструированы так, чтобы они образовывали новые антигенсвязывающие сайты (Fcab) (NPL 9), и молекулы с тандемом Fab-Fab (NPL 10).

При этом антитела с эффекторными функциями часто вызывают побочные действия в результате воздействия даже на здоровые клетки, которые экспрессируют низкие уровни антигена-мишени. Таким образом, были предприняты попытки создания фармацевтических средств на основе антител, которые проявляют свои эффекторые функции специфически в отношении ткани-мишени. Описанными ранее примерами являются антитела, связывающая активность которых изменяется при связывании с клеточным метаболитом (PTL 3), антитела, которые приобретают способность связываться с антигеном после расщепления протеазами (PTL 4), и технология, которая регулирует антитело-обусловленное перекрестное сшивание между несущими химерный антигенный рецептор Т-клеток и раковыми клетками путем добавления соединения (АВТ-737) (NPL 11).

Получение агонистических антител может быть сложным в зависимости от мишени. В частности, для мембранных белков, таких как сопряженные с G-белком рецепторы, разработаны многочисленные различные технологии (NPL 12). Таким образом, существует потребность в простых методах для повышения агонистического действия антител на указанные мишени. Известные в настоящее время методы включают, например, метод перекрестного сшивания антитела к DR4 (рецептор смерти 4) или к DR5 (рецептор смерти 5) (NPL13), метод мультимеризации анти-DR5-нанотел (рецептор смерти 5) (NPL 14), метод превращения антитела к рецептору тромбопоэтина в ковалентное димерное антитело (диабоди), sc(Fv)₂ (NP115), метод изменения IgG-подкласса антитела к CD40 (NPL 16), метод гексамеризации антитела к CD20 (NPL 17) и метод получения кольцевой антитело подобной молекулы (PTL 5). Кроме того, опубликованные методы применения биспецифических антител включают, например, метод, в котором используют комбинацию двух соответствующих антител к эритропоэтину к двум различным эпитопам в качестве биспецифического антитела (NPL 18), метод, в котором используют комбинацию антитела с направляющими функциями и антитела с эффекторными функциями в качестве биспецифического антитела (NPL 19), и метод интродукции остатков Cys в несколько фрагментов антител, специфических в отношении различных эпитопов, и их конъюгации (NPL 20, NPL 21 и PTL 6).

Перечень процитированных документов

Патентная литература

[PTL 1] WO 2016/040856;

[PTL 2] WO 2008/157379;

[PTL 3] WO 2013/180200;

[PTL 4] WO 2009/025846;

[PTL 5] WO 2017/191101;

[PTL 6] WO 2018/027204.

Непатентная литература

[NPL 1] Nature Reviews Drug Discovery 17, 2018, cc. 197-223;

[NPL 2] Clinical and Experimental Immunology 157, 2009, cc. 9-19;

[NPL 3] Current Pharmaceutical Biotechnology 17, 2016, cc. 1298-1314;

[NPL 4] Nature Biotechnology 28, 2010, cc. 1203-1208;

[NPL 5] MAbs 4, 2012, cc. 182-197;

[NPL 6] Nature Reviews Immunology 10, 2010, cc. 301-316;

[NPL 7] Sci Transl Med 9(410), 2017, eaal4291;

[NPL 8] Blood 117(17), 2011, cc. 4403-4404;

[NPL 9] Protein Eng Des Sel 23(4), 2010, cc. 289-297;

[NPL 10] J Immunol 196(7), 2016, cc. 3199-3211;

[NPL 11] Nature Chemical Biology 14, 2018, cc. 112-117;

[NPL 12] Exp Mol Med 48(2), 2016, e207;

[NPL 13] Nature Reviews Drug Discovery 7, 2008, cc. 1001-1012;

[NPL 14] MAbs 6(6), 2014, cc. 1560-1570;

[NP115] Blood 105(2), 2005, cc. 562-566;

[NPL 16] J Biol Chem 283(23), 2008, cc. 16206-16215;

[NPL 17] PLoS Biol 14(1), 2016, с. е1002344;

[NPL 18] Proc Nail Acad Sci USA 109(39), 2012, cc. 15728-15733;

[NPL 19] Scientific Reports 8, 2018, номер статьи: 766;

[NPL 20] PLoS One 7(12), 2012, e51817;

[NPL 21] Nucleic Acids Res. 38(22), 2010, cc. 8188-8195.

Краткое изложение сущности изобретения

Задача, положенная в основу изобретения

Указанные выше попытки повышать или уменьшать агонистическое действие или эффекторную функцию фармацевтических средств на основе антител все еще находятся в процессе разработки, и ожидается, что будут предприняты еще большие усилия в этом направлении. Настоящее изобретение было создано с учетом вышеуказанных обстоятельств. В основу настоящего изобретения была положена задача, создать новые антигенсвязывающие молекулы, которые обладают активностью, регулирующей взаимодействие между двумя или большим количеством антигенных молекул, или способы получения или применения указанных антигенсвязывающих молекул. Настоящее изобретение может найти применение для скрининга и создания фармацевтических средств на основе антител и его можно использовать в других технологиях инжиниринга белков.

Решение задачи

Согласно одному из не ограничивающих объем изобретения объектов при создании настоящего изобретения разработаны модифицированные антигенсвязывающие молекулы (например, антитела), обладающие агонистической активностью и содержащие два антигенсвязывающих домена (например, Fab-фрагменты), путем интродукции аминокислотных мутаций в антигенсвязывающие домены и получены молекулы, в которых антигенсвязывающие домены сцеплены друг с другом. В результате при создании изобретения было установлено, что агонистическая активность молекул значительно повышалась. Кроме того, согласно одному из не ограничивающих объем изобретения объектов при создании настоящего изобретения были обнаружены антигенсвязывающие молекулы с приобретенной устойчивостью к расщеплению протеазой благодаря связи между антигенсвязывающими доменами.

Настоящее изобретение базируется на указанных выше данных и в нем представлены конкретные примеры вариантов осуществления изобретения, которые описаны ниже.

[1] Антигенсвязывающая молекула, содержащая первый антигенсвязывающий домен и второй антигенсвязывающий домен, в которой два антигенсвязывающих домена сцеплены друг с другом с помощью одной или нескольких связей.

[2] Антигенсвязывающая молекула по п. [1], в которой по меньшей мере одна из связей, соединяющих два антигенсвязывающих домена, представляет собой ковалентную связь.

[3] Антигенсвязывающая молекула по п. [2], в которой ковалентная связь образуется путем непосредственного перекрестного сшивания аминокислотного остатка в первом антигенсвязывающем домене с аминокислотным остатком во втором антигенсвязывающем домене.

[4] Антигенсвязывающая молекула по п. [3], в которой перекрестно сшитые аминокислотные остатки представляют собой цистеин.

[5] Антигенсвязывающая молекула по п. [4], в которой образовавшаяся ковалентная связь представляет собой дисульфидную связь.

[6] Антигенсвязывающая молекула по п. [2], в которой ковалентная связь образована путем перекрестного сшивания аминокислотного остатка в первом антигенсвязывающем домене с аминокислотным остатком во втором антигенсвязывающем домене через перекрестносшивающий агент.

[7] Антигенсвязывающая молекула по п. [6], в которой перекрестносшивающий агент представляет собой аминореактивный перекрестносшивающий агент.

[8] Антигенсвязывающая молекула по п. [7], в которой перекрестно сшитые аминокислотные остатки представляют собой лизин.

[9] Антигенсвязывающая молекула по п. [1], в которой по меньшей мере одна из связей, соединяющих два антигенсвязывающих домена, представляет собой нековалентную связь.

[10] Антигенсвязывающая молекула по п. [9], в которой нековалентная связь представляет собой ионную связь, водородную связь или гидрофобную связь.

[11] Антигенсвязывающая молекула по п. [10], в которой ионная связь образуется между кислой аминокислотой и основной аминокислотой.

[12] Антигенсвязывающая молекула по п. [11], в которой кислая аминокислота представляет собой аспарагиновую кислоту (Asp) или глутаминовую аминокислоту (Glu), а основная аминокислота представляет собой гистидин (His), лизин (Lys) или аргинин (Arg).

[13] Антигенсвязывающая молекула по одному из п.п. [1]-[12], в которой по меньшей мере один из аминокислотных остатков, из которых создаются связи между антигенсвязывающими доменами, представляет собой искусственно интродуцированный мутантный аминокислотный остаток.

[14] Антигенсвязывающая молекула по п. [13], в которой мутантный аминокислотный остаток представляет собой остаток цистеина.

[15] Антигенсвязывающая молекула по одному из п.п. [1]-[14], в которой по меньшей мере один из первого и второго антигенсвязывающих доменов сам обладает способностью связываться с антигеном.

[16] Антигенсвязывающая молекула по одному из п.п. [1]-[15], в которой первый и второй антигенсвязывающие домены оба представляют собой антигенсвязывающие домены одного и того же типа.

[17] Антигенсвязывающая молекула по одному из п.п. [1]-[16], в которой по меньшей мере одна из связей, соединяющих два антигенсвязывающих домена друг с другом, образуется путем сцепления аминокислотных остатков, присутствующих в одном и том же положении в первом антигенсвязывающем домене и втором антигенсвязывающем домене.

[18] Антигенсвязывающая молекула по одному из п.п. [1]-[16], в которой по меньшей мере одна из связей, соединяющих два антигенсвязывающих домена друг с другом, образуется путем сцепления аминокислотных остатков, присутствующих в отличающихся друг от друга положениях на первом антигенсвязывающем домене и втором антигенсвязывающем домене.

[19] Антигенсвязывающая молекула по одному из п.п. [1]-[18], в которой по меньшей мере один из первого и второго антигенсвязывающих доменов содержит фрагмент антитела, который связывается с конкретным антигеном.

[20] Антигенсвязывающая молекула по п. [19], в которой фрагмент антитела представляет собой Fab, Fab', scFab, Fv, scFv или однодоменное антитело.

[21] Антигенсвязывающая молекула по п. [19] или п. [20], в которой по меньшей мере один из аминокислотных остатков, из которых создаются связи между антигенсвязывающими доменами, присутствует во фрагменте антитела.

[22] Антигенсвязывающая молекула по п. [21], в которой аминокислотный остаток, из которого создаются связи между антигенсвязывающими доменами, присутствует в константной области.

[23] Антигенсвязывающая молекула по п. [22], в которой константная область имеет человеческое происхождение.

[24] Антигенсвязывающая молекула по п. [22] или п. [23], в которой аминокислотный остаток, из которого создаются связи между антигенсвязывающими доменами, присутствует в CH1-участке.

[25] Антигенсвязывающая молекула по п. [24], в которой CH1-участок относится к подклассу γ1, γ2, γ3, γ4, α1, α2, μ, δ или ε.

[26] Антигенсвязывающая молекула по п. [24] или п. [25], в которой аминокислотный остаток, из которого создаются связи между антигенсвязывающими доменами, присутствует в СН1-участке в любом из положений 119-123, 131-140, 148-150, 155-167, 174-178, 188-197, 201-214 и 218-219 согласно EU-нумерации.

[27] Антигенсвязывающая молекула по п. [26], в которой аминокислотный остаток, из которого создаются связи между антигенсвязывающими доменами, присутствует в СН1-участке в положении, выбранном из группы, которая состоит из положений 119, 122, 123, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 148, 150, 155, 156, 157, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 167, 174, 176, 177, 178, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 201, 203, 205, 206, 207, 208, 211, 212, 213, 214, 218 и 219 согласно EU-нумерации.

[28] Антигенсвязывающая молекула по п. [27], в которой аминокислотный остаток, из которого создаются связи между антигенсвязывающими доменами, присутствует в CH1-участке в положении 134, 135, 136, 137, 191, 192, 193, 194, 195 или 196 согласно EU-нумерации.

[29] Антигенсвязывающая молекула по п. [28], в которой аминокислотный остаток, из которого создаются связи между антигенсвязывающими доменами, присутствует в CH1-участке в положении 135, 136 или 191 согласно EU-нумерации.

[30] Антигенсвязывающая молекула по одному из п.п. [24]- [29], в которой по меньшей мере одна из связей, соединяющих два антигенсвязывающих домена, образуется путем сцепления аминокислотного остатка в СН1-участке первого антигенсвязывающего домена с аминокислотным остатком в СН1-участке второго антигенсвязывающего домена.

[31] Антигенсвязывающая молекула по п. [30], в которой аминокислотные остатки в первом антигенсвязывающем домене и втором антигенсвязывающем домене каждый независимо выбирают из группы, состоящей из положений 119, 120, 121, 122 и 123 согласно EU-нумерации.

[32] Антигенсвязывающая молекула по п. [30], в которой аминокислотные остатки в первом антигенсвязывающем домене и втором антигенсвязывающем домене каждый независимо выбирают из группы, состоящей из положений 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139 и 140 согласно EU-нумерации.

[33] Антигенсвязывающая молекула по п. [30], в которой аминокислотные остатки в первом антигенсвязывающем домене и втором антигенсвязывающем домене каждый независимо выбирают из группы, состоящей из положений 148, 149 и 150 согласно EU-нумерации.

[34] Антигенсвязывающая молекула по п. [30], в которой аминокислотные остатки в первом антигенсвязывающем домене и втором антигенсвязывающем домене каждый независимо выбирают из группы, состоящей из положений 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166 и 167 согласно EU-нумерации.

[35] Антигенсвязывающая молекула по п. [30], в которой аминокислотные остатки в первом антигенсвязывающем домене и втором антигенсвязывающем домене каждый независимо выбирают из группы, состоящей из положений 174, 175, 176, 177 и 178 согласно EU-нумерации.

[36] Антигенсвязывающая молекула по п. [30], в которой аминокислотные остатки в первом антигенсвязывающем домене и втором антигенсвязывающем домене каждый независимо выбирают из группы, состоящей из положений 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196 и 197 согласно EU-нумерации.

[37] Антигенсвязывающая молекула по п. [30], в которой аминокислотные остатки в первом антигенсвязывающем домене и втором антигенсвязывающем домене каждый независимо выбирают из группы, состоящей из положений 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213 и 214 согласно EU-нумерации.

[38] Антигенсвязывающая молекула по п. [30], в которой аминокислотные остатки в первом антигенсвязывающем домене и втором антигенсвязывающем домене каждый независимо выбирают из группы, состоящей из положений 218 и 219 согласно EU-нумерации.

[39] Антигенсвязывающая молекула по одному из п.п. [30]-[38], в которой разница между положениями аминокислотных остатков в первом антигенсвязывающем домене и втором антигенсвязывающем домене составляет три аминокислоты или менее.

[40] Антигенсвязывающая молекула по п. [39], в которой по меньшей мере одна из связей, соединяющих два антигенсвязывающих домена, образуется путем сцепления аминокислотного остатка в положении 135 согласно EU-нумерации в CH1-участке первого антигенсвязывающего домена с аминокислотным остатком в любом из положений 132-138 согласно EU-нумерации в CH1-участке второго антигенсвязывающего домена.

[41] Антигенсвязывающая молекула по п. [39], в которой по меньшей мере одна из связей, соединяющих два антигенсвязывающих домена, образуется путем сцепления аминокислотного остатка в положении 136 согласно EU-нумерации в CH1-участке первого антигенсвязывающего домена с аминокислотным остатком в любом из положений 133-139 согласно EU-нумерации в CH1-участке второго антигенсвязывающего домена.

[42] Антигенсвязывающая молекула по п. [39], в которой по меньшей мере одна из связей, соединяющих два антигенсвязывающих домена, образуется путем сцепления аминокислотного остатка в положении 191 согласно EU-нумерации в CH1-участке первого антигенсвязывающего домена с аминокислотным остатком в любом из положений 188-194 согласно EU-нумерации в CH1-участке второго антигенсвязывающего домена.

[43] Антигенсвязывающая молекула по п. [40], в которой по меньшей мере одна из связей, соединяющих два антигенсвязывающих домена, образуется путем сцепления друг с другом аминокислотных остатков в положении 135 согласно EU-нумерации в CH1-участке двух антигенсвязывающих доменов.

[44] Антигенсвязывающая молекула по п. [41], в которой по меньшей мере одна из связей, соединяющих два антигенсвязывающих домена, образуется путем сцепления друг с другом аминокислотных остатков в положении 136 согласно EU-нумерации в CH1-участке двух антигенсвязывающих доменов.

[45] Антигенсвязывающая молекула по п. [42], в которой по меньшей мере одна из связей, соединяющих два антигенсвязывающих домена, образуется путем сцепления друг с другом аминокислотных остатков в положении 191 согласно EU-нумерации в CH1-участке двух антигенсвязывающих доменов.

[46] Антигенсвязывающая молекула по п. [22] или п. [23], в которой аминокислотный остаток, из которого создаются связи между антигенсвязывающими доменами, присутствует в CL-области.

[47] Антигенсвязывающая молекула по п. [46], в которой CL-область относится к подклассу κ или λ.

[48] Антигенсвязывающая молекула по п. [46] или п. [47], в которой аминокислотный остаток, из которого создаются связи между антигенсвязывающими доменами, присутствует в CL-области в любом из положений 108-112, 121-128, 151-156, 184-190, 195-196, 200-203 и 208-213 согласно нумерации по Кэботу.

[49] Антигенсвязывающая молекула по п. [48], в которой аминокислотный остаток, из которого создаются связи между антигенсвязывающими доменами, присутствует в CL-области в положении, выбранном из группы, которая состоит из положений 108, 109, 112, 121, 123, 126, 128, 151, 152, 153, 156, 184, 186, 188, 189, 190, 195, 196, 200, 201, 202, 203, 208, 210, 211, 212 и 213 согласно нумерации по Кэботу.

[50] Антигенсвязывающая молекула по п. [49], в которой аминокислотный остаток, из которого образуются связи между антигенсвязывающими доменами, присутствует в CL-области в положении 126 согласно нумерации по Кэботу.

[51] Антигенсвязывающая молекула по одному из п.п. [46]-[50], в которой по меньшей мере одна из связей, соединяющих два антигенсвязывающих домена, образуется путем сцепления аминокислотного остатка в CL-области первого антигенсвязывающего домена с аминокислотным остатком в CL-области второго антигенсвязывающего домена.

[52] Антигенсвязывающая молекула по п. [51], в которой аминокислотные остатки в первом антигенсвязывающем домене и втором антигенсвязывающем домене каждый независимо выбирают из группы, состоящей из положений 108, 109, 110, 111 и 112 согласно нумерации по Кэботу.

[53] Антигенсвязывающая молекула по п. [51], в которой аминокислотные остатки в первом антигенсвязывающем домене и втором антигенсвязывающем домене каждый независимо выбирают из группы, состоящей из положений 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127 и 128 согласно нумерации по Кэботу.

[54] Антигенсвязывающая молекула по п. [51], в которой аминокислотные остатки в первом антигенсвязывающем домене и втором антигенсвязывающем домене каждый независимо выбирают из группы, состоящей из положений 151, 152, 153, 154, 155 и 156 согласно нумерации по Кэботу.

[55] Антигенсвязывающая молекула по п. [51], в которой аминокислотные остатки в первом антигенсвязывающем домене и втором антигенсвязывающем домене каждый независимо выбирают из группы, состоящей из положений 184, 185, 186, 187, 188, 189 и 190 согласно нумерации по Кэботу.

[56] Антигенсвязывающая молекула по п. [51], в которой аминокислотные остатки в первом антигенсвязывающем домене и втором антигенсвязывающем домене каждый независимо выбирают из группы, состоящей из положений 195 и 196 согласно нумерации по Кэботу.

[57] Антигенсвязывающая молекула по п. [51], в которой аминокислотные остатки в первом антигенсвязывающем домене и втором антигенсвязывающем домене каждый независимо выбирают из группы, состоящей из положений 200, 201, 202 и 203 согласно нумерации по Кэботу.

[58] Антигенсвязывающая молекула по п. [51], в которой аминокислотные остатки в первом антигенсвязывающем домене и втором антигенсвязывающем домене каждый независимо выбирают из группы, состоящей из положений 208, 209, 210, 211, 212 и 213 согласно нумерации по Кэботу.

[59] Антигенсвязывающая молекула по одному из п.п. [51]-[58], в которой разница между положениями аминокислотных остатков в первом антигенсвязывающем домене и втором антигенсвязывающем домене составляет три аминокислоты или менее.

[60] Антигенсвязывающая молекула по п. [59], в которой по меньшей мере одна из связей, соединяющих два антигенсвязывающих домена, образуется путем сцепления друг с другом аминокислотных остатков в положении 126 согласно нумерации по Кэботу в CL-области двух антигенсвязывающих доменов.

[61] Антигенсвязывающая молекула по одному из п.п. [24]-[29] и [46]-[50], в которой по меньшей мере одна из связей, соединяющих два антигенсвязывающих домена, образуется путем сцепления аминокислотного остатка в СН1-участке первого антигенсвязывающего домена с аминокислотным остатком в CL-области второго антигенсвязывающего домена.

[62] Антигенсвязывающая молекула по п. [61], в которой аминокислотный остаток в СН1-участке выбирают из группы, состоящей из положений 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196 и 197 согласно EU-нумерации, и аминокислотный остаток в CL-области выбирают из группы, состоящей из положений 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127 и 128 согласно нумерации по Кэботу.

[63] Антигенсвязывающая молекула по п. [62], в которой по меньшей мере одна из связей, соединяющих два антигенсвязывающих домена, образуется путем сцепления аминокислотного остатка в положении 191 согласно EU-нумерации в CH1-участке первого антигенсвязывающего домена с аминокислотным остатком в положении 126 согласно нумерации по Кэботу в CL-области второго антигенсвязывающего домена.

[64] Антигенсвязывающая молекула по п. [21], в которой аминокислотный остаток, из которого создаются связи между антигенсвязывающими доменами, присутствует в вариабельной области.

[65] Антигенсвязывающая молекула по п. [64], в которой аминокислотный остаток, из которого создаются связи между антигенсвязывающими доменами, присутствует в VH-области.

[66] Антигенсвязывающая молекула по п. [65], в которой аминокислотный остаток, из которого создаются связи между антигенсвязывающими доменами, присутствует в VH-области в положении, выбранном из группы, которая состоит из положений 6, 8, 16, 20, 25, 26, 28, 74 и 82b согласно нумерации по Кэботу.

[67] Антигенсвязывающая молекула по п. [64], в которой аминокислотный остаток, из которого создаются связи между антигенсвязывающими доменами, присутствует в VL-области.

[68] Антигенсвязывающая молекула по п. [67], в которой аминокислотный остаток, из которого создаются связи между антигенсвязывающими доменами, присутствует в VL-области (подкласс к) в положении, выбранном из группы, которая состоит из положений 21, 27, 58, 77, 100, 105 и 107 согласно нумерации по Кэботу.

[69] Антигенсвязывающая молекула по п. [67], в которой аминокислотный остаток, из которого создаются связи между антигенсвязывающими доменами, присутствует в VL-области (подкласс к) в положении, выбранном из группы, которая состоит из положений 6, 19, 33 и 34 согласно нумерации по Кэботу.

[70] Антигенсвязывающая молекула по п. [64], в которой аминокислотный остаток, из которого создаются связи между антигенсвязывающими доменами, присутствует в VHH-области.

[71] Антигенсвязывающая молекула по п. [70], в которой аминокислотный остаток, из которого создаются связи между антигенсвязывающими доменами, присутствует в VHH-области в положении, выбранном из группы, состоящей из положений 4, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15, 17, 20, 24, 27, 29, 38, 39, 40, 41, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 67, 69, 71, 78, 80, 82, 82с, 85, 88, 91, 93, 94 и 107 согласно нумерации по Кэботу.

[72] Антигенсвязывающая молекула по одному из п.п. [1]-[18], в которой по меньшей мере один из первого и второго антигенсвязывающих доменов содержит не являющийся антителом белок, который связывается с конкретным антигеном, или его фрагмент.

[73] Антигенсвязывающая молекула по п. [72], в которой не являющийся антителом белок представляет собой любой из пары лиганд и рецептор, которые специфически связываются друг с другом.

[74] Антигенсвязывающая молекула по одному из п.п. [1]-[73], в которой антигенсвязывающие домены содержат шарнирную область.

[75] Антигенсвязывающая молекула по п. [74], в которой по меньшей мере один из остатков цистеина, присутствующих в шарнирной области дикого типа, заменен на другой аминокислотный остаток.

[76] Антигенсвязывающая молекула по п. [75], в которой остаток цистеина присутствует в шарнирной области в положениях 226 и/или 229 согласно EU-нумерации.

[77] Антигенсвязывающая молекула по п. [74] или п. [76], в которой по меньшей мере один из аминокислотных остатков, из которых создаются связи между антигенсвязывающими доменами, присутствует в шарнирной области.

[78] Антигенсвязывающая молекула по п. [77], в которой аминокислотный остаток, из которого создаются связи между антигенсвязывающими доменами, присутствует в шарнирной области в положении, выбранном из группы, которая состоит из положений 216, 218 и 219 согласно EU-нумерации.

[79] Антигенсвязывающая молекула по одному из п.п. [1]-[78], в которой первый антигенсвязывающий домен и второй антигенсвязывающий домен сцеплены друг с другом через две или большее количество связей.

[80] Антигенсвязывающая молекула по п. [79], в которой по меньшей мере один из аминокислотных остатков, из которых создаются связи между антигенсвязывающими доменами, присутствует в последовательности дикого типа.

[81] Антигенсвязывающая молекула по п. [80], в которой аминокислотный остаток, из которого создаются связи между антигенсвязывающими доменами, присутствует в шарнирной области.

[82] Антигенсвязывающая молекула по п. [81], в которой аминокислотный остаток, из которого создаются связи между антигенсвязывающими доменами, представляет собой остаток цистеина в шарнирной области.

[83] Антигенсвязывающая молекула по одному из п.п. [80]-[82], в которой по меньшей мере одна из связей, соединяющих два антигенсвязывающих домена, представляет собой дисульфидную связь, образовавшуюся путем перекрестного сшивания друг с другом остатков цистеина, которые присутствуют в шарнирной области.

[84] Антигенсвязывающая молекула по п. [83], в которой остатки цистеина присутствуют в шарнирной области в положениях 226 и/или 229 согласно EU-нумерации.

[85] Антигенсвязывающая молекула по одному из п.п. [79]-[84], в которой по меньшей мере один из аминокислотных остатков, из которых создаются связи между антигенсвязывающими доменами, присутствует во фрагменте антитела, и по меньшей мере один из аминокислотных остатков присутствует в шарнирной области.

[86] Антигенсвязывающая молекула по п. [85], в которой первый и второй антигенсвязывающие домены каждый содержит Fab и шарнирную область, и антигенсвязывающая молекула, содержащая два антигенсвязывающих домена, представляет собой F(ab')2.

[87] Антигенсвязывающая молекула по одному из п.п. [1]-[86], в которой антигенсвязывающие домены содержат Fc-область.

[88] Антигенсвязывающая молекула по п. [87], в которой в Fc-область интродуцирована(ы) одна или несколько аминокислотная(ых) мутация(й), способствующая(их) мультимеризации Fc-областей.

[89] Антигенсвязывающая молекула по п. [88], в которой аминокислотные мутации, способствующие мультимеризации, содержат аминокислотную мутацию по меньшей мере в одном из положений, выбранных из группы, которая состоит из положений 247, 248, 253, 254, 310, 311, 338, 345, 356, 359, 382, 385, 386, 430, 433, 434, 436, 437, 438, 439, 440 и 447 согласно EU-нумерации.

[90] Антигенсвязывающая молекула по п. [88] или п. [89], в которой мультимеризация представляет собой гексамеризацию.

[91] Антигенсвязывающая молекула по одному из п.п. [87]-[90], которая представляет собой полноразмерное антитело.

[92] Антигенсвязывающая молекула по одному из п.п. [1]-[91], в которой и первый, и второй антигенсвязывающие домены связываются с одним и тем же антигеном.

[93] Антигенсвязывающая молекула по п. [92], в которой и первый, и второй антигенсвязывающие домены связываются с одним и тем же эпитопом указанного антигена.

[94] Антигенсвязывающая молекула по п. [92], в которой первый и второй антигенсвязывающие домены каждый связывается с эпитопом указанного антигена, отличным от эпитопа, с которым связывается другой домен.

[95] Антигенсвязывающая молекула по одному из п.п. [1]-[91], в которой первый и второй антигенсвязывающие домены каждый связывается с эпитопом указанного антигена, отличным от эпитопа, с которым связывается другой домен.

[96] Антигенсвязывающая молекула по п. [93], в которой и первый, и второй антигенсвязывающие домены имеют одинаковую аминокислотную последовательность.

[97] Антигенсвязывающая молекула по одному из п.п. [93]-[95], в которой первый и второй антигенсвязывающие домены каждый имеет отличную от другого аминокислотную последовательность.

[98] Антигенсвязывающая молекула по одному из п.п. [1]-[91], в которой по меньшей мере один из двух антигенов, с которыми связываются первый и второй антигенсвязывающие домены, представляет собой растворимый белок.

[99] Антигенсвязывающая молекула по одному из п.п. [1]-[91], в которой по меньшей мере один из двух антигенов, с которыми связываются первый и второй антигенсвязывающие домены, представляет собой мембранный белок.

[100] Антигенсвязывающая молекула по одному из п.п. [1]-[99], которая обладает активностью, регулирующей взаимодействие между двумя антигенными молекулами.

[101] Антигенсвязывающая молекула по п. [100], которая обладает способностью повышать или понижать взаимодействие между двумя антигенными молекулами по сравнению с контрольной антигенсвязывающей молекулой, где контрольная антигенсвязывающая молекула отличается от антигенсвязывающей молекулы по п. [100] только тем, что контрольная антигенсвязывающая молекула имеет на одну связь меньше между двумя антигенсвязывающими доменами.

[102] Антигенсвязывающая молекула по п. [100] или п. [101], где две антигенные молекулы представляют собой лиганд и его рецептор соответственно, и где антигенсвязывающая молекула обладает активностью, способствующей активации рецептора лигандом.

[103] Антигенсвязывающая молекула по п. [100] или п. [101], где две антигенные молекулы представляют собой фермент и его субстрат соответственно, и где антигенсвязывающая молекула обладает активностью, способствующей осуществлению каталитической реакции фермента с субстратом.

[104] Антигенсвязывающая молекула по п. [100] или п. [101], где две антигенные молекулы обе представляют собой белки, присутствующие на клеточных поверхностях, и где антигенсвязывающая молекула обладает активностью, способствующей взаимодействию между клеткой, которая экспрессирует первый антиген, и клеткой, которая экспрессирует второй антиген.

[105] Антигенсвязывающая молекула по п. [104], где клетка, экспрессирующая первый антиген, представляет собой клетку с цитотоксической активностью, а клетка, экспрессирующая второй антиген, представляет собой ее клетку-мишень, и где антигенсвязывающая молекула усиливает повреждение указанной клетки-мишени указанной клеткой с цитотоксической активностью.

[106] Антигенсвязывающая молекула по п. [105], где клетка с цитотоксической активностью представляет собой Т-клетку, NK-клетку, моноцит или макрофаг.

[107] Антигенсвязывающая молекула по одному из п.п. [1]-[99], которая обладает активностью, регулирующей активацию двух антигенных молекул, которые активируются путем ассоциации друг с другом.

[108] Антигенсвязывающая молекула по п. [107], которая повышает или понижает активацию двух антигенных молекул по сравнению с контрольной антигенсвязывающей молекулой, где контрольная антигенсвязывающая молекула отличается от антигенсвязывающей молекулы по п. [107] только тем, что контрольная антигенсвязывающая молекула имеет на одну связь меньше между двумя антигенсвязывающими доменами.

[109] Антигенсвязывающая молекула по п. [107] или п. [108], где антигенные молекулы выбраны из группы, которая состоит из рецепторов, принадлежащих к суперсемействам рецепторов цитокинов, сопряженных с G-белком рецепторов, рецепторов ионных каналов, тирозинкиназных рецепторов, рецепторов иммунных чекпоинтов, рецепторов антигенов, CD-антигенов, костимуляторных молекул и молекул клеточной адгезии.

[110] Антигенсвязывающая молекула по одному из п.п. [1]-[99], которая обладает активностью, удерживающей две антигенные молекулы в пространственно близких положениях.

[111] Антигенсвязывающая молекула по п. [110], которая обладает способностью удерживать две антигенные молекулы в более близких положениях по сравнению с контрольной антигенсвязывающей молекулой, где контрольная антигенсвязывающая молекула отличается от антигенсвязывающей молекулы по п. [110] только тем, что контрольная антигенсвязывающая молекула имеет на одну связь меньше между двумя антигенсвязывающими доменами.

[112] Антигенсвязывающая молекула по одному из п.п. [1]-[99], в которой два антигенсвязывающих домена находятся в пространственно близких положениях и/или подвижность двух антигенсвязывающих доменов уменьшена.

[113] Антигенсвязывающая молекула по п. [112], в которой два антигенсвязывающих домена находятся в пространственно более близких положениях и/или два антигенсвязывающих домена обладают меньшей мобильностью по сравнению с контрольной антигенсвязывающей молекулой, где контрольная антигенсвязывающая молекула отличается от антигенсвязывающей молекулы по п. [112] только тем, что контрольная антигенсвязывающая молекула имеет на одну связь меньше между двумя антигенсвязывающими доменами.

[114] Антигенсвязывающая молекула по одному из п.п. [1]-[99], которая обладает устойчивостью к расщеплению протеазой.

[115] Антигенсвязывающая молекула по п. [114], которая обладает повышенной устойчивостью к расщеплению протеазой по сравнению с контрольной антигенсвязывающей молекулой, где контрольная антигенсвязывающая молекула отличается от антигенсвязывающей молекулы по п. [114] только тем, что контрольная антигенсвязывающая молекула имеет на одну связь меньше между двумя антигенсвязывающими доменами.

[116] Антигенсвязывающая молекула по п. [115], в которой доля полноразмерной молекулы, сохраняющейся после обработки протеазой, увеличивается по сравнению с контрольной антигенсвязывающей молекулой.

[117] Антигенсвязывающая молекула по п. [115] или п. [116], в которой доля конкретного фрагмента, образовавшегося после обработки протеазой, уменьшается по сравнению с контрольной антигенсвязывающей молекулой.

[118] Антигенсвязывающая молекула по одному из п.п. [1]-[99], в которой после обработки молекулы протеазой вырезается димер антигенсвязывающих доменов или их фрагментов.

[119] Антигенсвязывающая молекула по п. [118], в которой после обработки контрольной молекулы указанной протеазой вырезаются мономеры антигенсвязывающих доменов или их фрагментов, и где контрольная антигенсвязывающая молекула отличается от антигенсвязывающей молекулы по п. [118] только тем, что контрольная антигенсвязывающая молекула имеет на одну связь меньше между двумя антигенсвязывающими доменами.

[120] Антигенсвязывающая молекула по п. [118] или п. [119], в которой протеаза расщепляет шарнирную область.

[121] Антигенсвязывающая молекула по одному из п.п. [101]-[106], [108]-[109], [111], [113], [115]-[117] и [119]-[120], в которой одна связь, на которую уменьшено количество связей, представляет собой связь, исходно созданную мутантным аминокислотным остатком.

[122] Антигенсвязывающая молекула по п. [121], в которой мутантный аминокислотный остаток представляет собой остаток цистеина.

[123] Фармацевтическая композиция, содержащая антигенсвязывающую молекулу по одному из п.п. [1]-[122] и фармацевтически приемлемый носитель.

[124] Способ регуляции взаимодействия между двумя антигенными молекулами, включающий:

(а) получение антигенсвязывающей молекулы, содержащей два антигенсвязывающих домена,

(б) добавление к антигенсвязывающей молекуле по меньшей мере одной связи, которая соединяет два антигенсвязывающих домена друг с другом, и

(в) приведение в контакт антигенсвязывающей молекулы, полученной в подпункте (б), с двумя антигенными молекулами.

[125] Способ регуляции активности двух антигенных молекул, которые активируются путем ассоциации друг с другом, включающий:

(а) получение антигенсвязывающей молекулы, содержащей два антигенсвязывающих домена,

(б) добавление к антигенсвязывающей молекуле по меньшей мере одной связи, которая соединяет два антигенсвязывающих домена друг с другом, и

(в) приведение в контакт антигенсвязывающей молекулы, полученной в подпункте (б), с двумя антигенными молекулами.

[126] Способ удерживания двух антигенных молекул в пространственно близких положениях, включающий:

(а) получение антигенсвязывающей молекулы, содержащей два антигенсвязывающих домена,

(б) добавление к антигенсвязывающей молекуле по меньшей мере одной связи, которая соединяет два антигенсвязывающих домена друг с другом, и

(в) приведение в контакт антигенсвязывающей молекулы, полученной в подпункте (б), с двумя антигенными молекулами.

[127] Способ размещения двух антигенсвязывающих доменов в пространственно близких положениях и/или уменьшения подвижности двух антигенсвязывающих доменов, включающий:

(а) получение антигенсвязывающей молекулы, содержащей два антигенсвязывающих домена, и

(б) добавление к антигенсвязывающей молекуле по меньшей мере одной связи, которая соединяет два антигенсвязывающих домена друг с другом.

[128] Способ повышения устойчивости антигенсвязывающей молекулы к расщеплению протеазой, включающий:

(а) получение антигенсвязывающей молекулы, содержащей два антигенсвязывающих домена, и

(б) добавление к антигенсвязывающей молекуле по меньшей мере одной связи, которая соединяет два антигенсвязывающих домена друг с другом.

[129] Способ получения антигенсвязывающей молекулы, которая обладает активностью, регулирующей взаимодействие между двумя антигенными молекулами, включающий

(а) получение нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, который содержит первый антигенсвязывающий домен, и нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, который содержит второй антигенсвязывающий домен,

(б) интродукцию мутации в нуклеиновые кислоты, которые кодируют два антигенсвязывающих домена, таким образом, чтобы происходило добавление по меньшей мере одной связи, соединяющей два антигенсвязывающих домена,

(в) интродукцию нуклеиновых кислот, полученных в подпункте (б), в клетку-хозяина,

(г) культивирование клетки-хозяина таким образом, чтобы происходила экспрессия двух полипептидов, и

(д) получение антигенсвязывающей молекулы, которая представляет собой полипептид, содержащий первый и второй антигенсвязывающие домены, в котором два антигенсвязывающих домена сцеплены друг с другом через одну или несколько связей.

[130] Способ получения антигенсвязывающей молекулы, которая обладает активностью, регулирующей активацию двух антигенных молекул, которые активируется путем ассоциации друг с другом, включающий:

(а) получение нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, который содержит первый антигенсвязывающий домен, и нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, который содержит второй антигенсвязывающий домен,

(б) интродукцию мутации в нуклеиновые кислоты, которые кодируют два антигенсвязывающих домена, таким образом, чтобы происходило добавление по меньшей мере одной связи, соединяющей два антигенсвязывающих домена,

(в) интродукцию нуклеиновых кислот, полученных в подпункте (б), в клетку-хозяина,

(г) культивирование клетки-хозяина таким образом, чтобы происходила экспрессия двух полипептидов, и

(д) получение антигене вязывающей молекулы, которая представляет собой полипептид, содержащий первый и второй антигенсвязывающие домены, в котором два антигенсвязывающих домена сцеплены друг с другом через одну или несколько связей.

[131] Способ получения антигенсвязывающей молекулы, которая обладает активностью, удерживающей две антигенные молекулы в пространственно близких положениях, включающий:

(а) получение нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, который содержит первый антигенсвязывающий домен, и нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, который содержит второй антигенсвязывающий домен,

(б) интродукцию мутации в нуклеиновые кислоты, которые кодируют два антигенсвязывающих домена, таким образом, чтобы происходило добавление по меньшей мере одной связи, соединяющей два антигенсвязывающих домена,

(в) интродукцию нуклеиновых кислот, полученных в подпункте (б), в клетку-хозяина,

(г) культивирование клетки-хозяина таким образом, чтобы происходила экспрессия двух полипептидов, и

(д) получение антигенсвязывающей молекулы, которая представляет собой полипептид, содержащий первый и второй антигенсвязывающие домены, в котором два антигенсвязывающих домена сцеплены друг с другом через одну или несколько связей.

[132] Способ получения антигенсвязывающей молекулы, в которой два антигенсвязывающих домена находятся в пространственно близких положениях и/или подвижность двух антигенсвязывающих доменов уменьшена, включающий:

(а) получение нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, который содержит первый антигенсвязывающий домен, и нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, который содержит второй антигенсвязывающий домен,

(б) интродукцию мутации в нуклеиновые кислоты, которые кодируют два антигенсвязывающих домена, таким образом, чтобы происходило добавление по меньшей мере одной связи, соединяющей два антигенсвязывающих домена,

(в) интродукцию нуклеиновых кислот, полученных в подпункте (б), в клетку-хозяина,

(г) культивирование клетки-хозяина таким образом, чтобы происходила экспрессия двух полипептидов, и

(д) получение антигенсвязывающей молекулы, которая представляет собой полипептид, содержащий первый и второй антигенсвязывающие домены, в котором два антигенсвязывающих домена сцеплены друг с другом через одну или несколько связей.

[133] Способ получения антигенсвязывающей молекулы, которая обладает повышенной устойчивостью к расщеплению протеазой, включающий:

(а) получение нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, который содержит первый антигенсвязывающий домен, и нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, который содержит второй антигенсвязывающий домен,

(б) интродукцию мутации в нуклеиновые кислоты, которые кодируют два антигенсвязывающих домена, таким образом, чтобы происходило добавление по меньшей мере одной связи, соединяющей два антигенсвязывающих домена,

(в) интродукцию нуклеиновых кислот, полученных в подпункте (б), в клетку-хозяина,

(г) культивирование клетки-хозяина таким образом, чтобы происходила экспрессия двух полипептидов, и

(д) получение антигенсвязывающей молекулы, которая представляет собой полипептид, содержащий первый и второй антигенсвязывающие домены, в котором два антигенсвязывающих домена сцеплены друг с другом через одну или несколько связей.

[134] Способ идентификации новой пары белковых молекул, которые активируются путем ассоциации друг с другом, включающей:

(а) получение двух произвольных белковых молекул,

(б) получение с помощью способа по одному из п.п. [129]-[133] антигенсвязывающей молекулы, содержащей два антигенсвязывающих домена, которые связываются соответственно с двумя белковыми молекулами,

(в) приведение в контакт антигенсвязывающей молекулы, полученной в подпункте (б), с двумя белковыми молекулами и

(г) оценка того, происходит или нет активация двух белковых молекул.

[135] Способ по п. [134], в котором по меньшей мере одну из белковых молекул выбирают из группы, состоящей из рецепторов, принадлежащих к суперсемействам рецепторов цитокинов, сопряженных с G-белком рецепторов, рецепторов ионных каналов, тирозинкиназных рецепторов, рецепторов иммунных чекпоинтов, рецепторов антигенов, CD-антигенов, костимуляторных молекул и молекул клеточной адгезии.

Краткое описание чертежей

На чертежах показано:

на фиг.1 - примеры модифицированных антител, в которых Fab-фрагменты перекрестно сшиты друг с другом согласно методу, описанному в примере 1. На чертеже схематически показаны структурные различия между антителом дикого типа (WT) и модифицированным антителом, в котором CH1-участки Н-цепи антитела перекрестно сшиты друг с другом (НН-тип), модифицированным антителом, в котором CL-области L-цепи антитела перекрестно сшиты друг с другом (LL-тип), и модифицированным антителом, в котором СН1-участок Н-цепи антитела перекрестно сшит с CL-областью L-цепи антитела (HL- или LH-тип);

на фиг.2 - результаты анализа опосредуемой CD3 агонистической активности молекулы антитела к CD3ε дикого типа (CD3-G4s) и молекул модифицированных антител, полученных путем сцепления Fab-Fab молекулы дикого типа через дополнительную дисульфидную связь (CD3-G4sLL, CD3-G4sHH) согласно методу, описанному в примере 4-3;

на фиг.3 - результаты анализа опосредуемой CD3 агонистической активности молекулы антитела к CD3ε дикого типа (OKT3-G1s) и молекул модифицированных антител, полученных путем сцепления Fab-Fab молекулы дикого типа через дополнительную дисульфидную связь (OKT3-G1sLL, OKT3-G1sHH) согласно методу, описанному в примере 4-3;

на фиг.4 - результаты анализа опосредуемой CD3 и/или CD28 агонистической активности молекулы антитела к CD3ε дикого типа (CD3-G1s), молекулы антитела к CD28 (CD28-G1s) и биспецифического антитела анти-CD3ε × анти-CD28 (CD3//CD28-G1s) и молекул модифицированных антител, полученных путем сцепления Fab-Fab биспецифического антитела через дополнительную дисульфидную связь (CD3//CD28-G1sLL, CD3//CD28-G1sHH, CD3//CD28-G1sLH, CD3//CD28-G1sHL) согласно методу, описанному в примере 4-3;

на фиг.5 - результаты анализа опосредуемой CD3 и/или CD28 агонистической активности молекулы антитела к CD3ε дикого типа (OKT3-G1s), молекулы антитела к CD28 (CD28-G1s) и биспецифического антитела анти-CD3ε × анти-CD28 (OKT3//CD28-G1s) и молекул модифицированных антител, полученных путем сцепления Fab-Fab биспецифического антитела через дополнительную дисульфидную связь (OKT3//CD28-G1sHH, OKT3//CD28-G1sHL) согласно методу, описанному в примере 4-3;

на фиг.6 - результаты обработки протеазой антитела к IL6R (MRA), модифицированных антител, полученных путем интродукции замены на цистеин в вариабельную область тяжелой цепи антитела к IL6R (MRAH.xxx-G1T4), и модифицированных антител, полученных путем интродукции замены на цистеин в константную область тяжелой цепи антитела к IL6R (MRAH-G1T4.xxx) согласно методу, описанному в примере 5-2 (1/8). Каждое обработанное протеазой антитело подвергали капиллярному электрофорезу в невосстанавливающих условиях с последующей детекцией полос с помощью антитела к каппа-цепи;

на фиг.7 - результаты обработки протеазой антитела к IL6R (MRA), модифицированных антител, полученных путем интродукции замены на цистеин в вариабельную область тяжелой цепи антитела к IL6R (MRAH.xxx-G1T4), и модифицированных антител, полученных путем интродукции замены на цистеин в константную область тяжелой цепи антитела к IL6R (MRAH-G1T4.xxx) согласно методу, описанному в примере 5-2 (2/8). Каждое обработанное протеазой антитело подвергали капиллярному электрофорезу в невосстанавливающих условиях с последующей детекцией полос с помощью антитела к каппа-цепи;

на фиг.8 - результаты обработки протеазой антитела к IL6R (MRA), модифицированных антител, полученных путем интродукции замены на цистеин в вариабельную область тяжелой цепи антитела к IL6R (MRAH.xxx-G1T4), и модифицированных антител, полученных путем интродукции замены на цистеин в константную область тяжелой цепи антитела к IL6R (MRAH-G1T4.xxx) согласно методу, описанному в примере 5-2 (3/8). Каждое обработанное протеазой антитело подвергали капиллярному электрофорезу в невосстанавливающих условиях с последующей детекцией полос с помощью антитела к каппа-цепи;

на фиг.9 - результаты обработки протеазой антитела к IL6R (MRA), модифицированных антител, полученных путем интродукции замены на цистеин в вариабельную область тяжелой цепи антитела к IL6R (MRAH.xxx-G1T4), и модифицированных антител, полученных путем интродукции замены на цистеин в константную область тяжелой цепи антитела к IL6R (MRAH-G1T4.xxx) согласно методу, описанному в примере 5-2 (4/8). Каждое обработанное протеазой антитело подвергали капиллярному электрофорезу в невосстанавливающих условиях с последующей детекцией полос с помощью антитела к каппа-цепи;

на фиг.10 - результаты обработки протеазой антитела к IL6R (MRA), модифицированных антител, полученных путем интродукции замены на цистеин в вариабельную область тяжелой цепи антитела к IL6R (MRAH.xxx-G1T4), и модифицированных антител, полученных путем интродукции замены на цистеин в константную область тяжелой цепи антитела к IL6R (MRAH-G1T4.xxx) согласно методу, описанному в примере 5-2 (5/8). Каждое обработанное протеазой антитело подвергали капиллярному электрофорезу в невосстанавливающих условиях с последующей детекцией полос с помощью антитела к каппа-цепи;

на фиг.11 - результаты обработки протеазой антитела к IL6R (MRA), модифицированных антител, полученных путем интродукции замены на цистеин в вариабельную область тяжелой цепи антитела к IL6R (MRAH.xxx-G1T4), и модифицированных антител, полученных путем интродукции замены на цистеин в константную область тяжелой цепи антитела к IL6R (MRAH-G1T4.xxx) согласно методу, описанному в примере 5-2 (6/8). Каждое обработанное протеазой антитело подвергали капиллярному электрофорезу в невосстанавливающих условиях с последующей детекцией полос с помощью антитела к каппа-цепи;

на фиг.12 - результаты обработки протеазой антитела к IL6R (MRA), модифицированных антител, полученных путем интродукции замены на цистеин в вариабельную область тяжелой цепи антитела к IL6R (MRAH.xxx-G1T4), и модифицированных антител, полученных путем интродукции замены на цистеин в константную область тяжелой цепи антитела к IL6R (MRAH-G1T4.xxx) согласно методу, описанному в примере 5-2 (7/8). Каждое обработанное протеазой антитело подвергали капиллярному электрофорезу в невосстанавливающих условиях с последующей детекцией полос с помощью антитела к каппа-цепи;

на фиг.13 - результаты обработки протеазой антитела к IL6R (MRA), модифицированных антител, полученных путем интродукции замены на цистеин в вариабельную область тяжелой цепи антитела к IL6R (MRAH.xxx-G1T4), и модифицированных антител, полученных путем интродукции замены на цистеин в константную область тяжелой цепи антитела к IL6R (MRAH-G1T4.xxx) согласно методу, описанному в примере 5-2 (8/8). Каждое обработанное протеазой антитело подвергали капиллярному электрофорезу в невосстанавливающих условиях с последующей детекцией полос с помощью антитела к каппа-цепи;

на фиг.14 - результаты обработки протеазой антитела к IL6R (MRA), модифицированных антител, полученных путем интродукции замены на цистеин в вариабельную область легкой цепи антитела к IL6R (MRAL.xxx-k0), и модифицированных антител, полученных путем интродукции замены на цистеин в константную область легкой цепи антитела к IL6R (MRAL-k0.xxx) согласно методу, описанному в примере 6-2 (1/10). Каждое обработанное протеазой антитело подвергали капиллярному электрофорезу в невосстанавливающих условиях с последующей детекцией полос с помощью антитела к каппа-цепи;

на фиг.15 - результаты обработки протеазой антитела к IL6R (MRA), модифицированных антител, полученных путем интродукции замены на цистеин в вариабельную область легкой цепи антитела к IL6R (MRAL.xxx-k0), и модифицированных антител, полученных путем интродукции замены на цистеин в константную область легкой цепи антитела к IL6R (MRAL-k0.xxx) согласно методу, описанному в примере 6-2 (2/10). Каждое обработанное протеазой антитело подвергали капиллярному электрофорезу в невосстанавливающих условиях с последующей детекцией полос с помощью антитела к каппа-цепи;

на фиг.16 - результаты обработки протеазой антитела к IL6R (MRA), модифицированных антител, полученных путем интродукции замены на цистеин в вариабельную область легкой цепи антитела к IL6R (MRAL.xxx-k0), и модифицированных антител, полученных путем интродукции замены на цистеин в константную область легкой цепи антитела к IL6R (MRAL-k0.xxx) согласно методу, описанному в примере 6-2 (3/10). Каждое обработанное протеазой антитело подвергали капиллярному электрофорезу в невосстанавливающих условиях с последующей детекцией полос с помощью антитела к каппа-цепи;

на фиг.17 - результаты обработки протеазой антитела к IL6R (MRA), модифицированных антител, полученных путем интродукции замены на цистеин в вариабельную область легкой цепи антитела к IL6R (MRAL.xxx-k0), и модифицированных антител, полученных путем интродукции замены на цистеин в константную область легкой цепи антитела к IL6R (MRAL-k0.xxx) согласно методу, описанному в примере 6-2 (4/10). Каждое обработанное протеазой антитело подвергали капиллярному электрофорезу в невосстанавливающих условиях с последующей детекцией полос с помощью антитела к каппа-цепи;

на фиг.18 - результаты обработки протеазой антитела к IL6R (MRA), модифицированных антител, полученных путем интродукции замены на цистеин в вариабельную область легкой цепи антитела к IL6R (MRAL.xxx-k0), и модифицированных антител, полученных путем интродукции замены на цистеин в константную область легкой цепи антитела к IL6R (MRAL-k0.xxx) согласно методу, описанному в примере 6-2 (5/10). Каждое обработанное протеазой антитело подвергали капиллярному электрофорезу в невосстанавливающих условиях с последующей детекцией полос с помощью антитела к каппа-цепи;

на фиг.19 - результаты обработки протеазой антитела к IL6R (MRA), модифицированных антител, полученных путем интродукции замены на цистеин в вариабельную область легкой цепи антитела к IL6R (MRAL.xxx-k0), и модифицированных антител, полученных путем интродукции замены на цистеин в константную область легкой цепи антитела к IL6R (MRAL-k0.xxx) согласно методу, описанному в примере 6-2 (6/10). Каждое обработанное протеазой антитело подвергали капиллярному электрофорезу в невосстанавливающих условиях с последующей детекцией полос с помощью антитела к каппа-цепи;

на фиг.20 - результаты обработки протеазой антитела к IL6R (MRA), модифицированных антител, полученных путем интродукции замены на цистеин в вариабельную область легкой цепи антитела к IL6R (MRAL.xxx-k0), и модифицированных антител, полученных путем интродукции замены на цистеин в константную область легкой цепи антитела к IL6R (MRAL-k0.xxx) согласно методу, описанному в примере 6-2 (7/10). Каждое обработанное протеазой антитело подвергали капиллярному электрофорезу в невосстанавливающих условиях с последующей детекцией полос с помощью антитела к каппа-цепи;

на фиг.21 - результаты обработки протеазой антитела к IL6R (MRA), модифицированных антител, полученных путем интродукции замены на цистеин в вариабельную область легкой цепи антитела к IL6R (MRAL.xxx-k0), и модифицированных антител, полученных путем интродукции замены на цистеин в константную область легкой цепи антитела к IL6R (MRAL-k0.xxx) согласно методу, описанному в примере 6-2 (8/10). Каждое обработанное протеазой антитело подвергали капиллярному электрофорезу в невосстанавливающих условиях с последующей детекцией полос с помощью антитела к каппа-цепи;

на фиг.22 - результаты обработки протеазой антитела к IL6R (MRA), модифицированных антител, полученных путем интродукции замены на цистеин в вариабельную область легкой цепи антитела к IL6R (MRAL.xxx-k0), и модифицированных антител, полученных путем интродукции замены на цистеин в константную область легкой цепи антитела к IL6R (MRAL-k0.xxx) согласно методу, описанному в примере 6-2 (9/10). Каждое обработанное протеазой антитело подвергали капиллярному электрофорезу в невосстанавливающих условиях с последующей детекцией полос с помощью антитела к каппа-цепи;

на фиг.23 - результаты обработки протеазой антитела к IL6R (MRA), модифицированных антител, полученных путем интродукции замены на цистеин в вариабельную область легкой цепи антитела к IL6R (MRAL.xxx-k0), и модифицированных антител, полученных путем интродукции замены на цистеин в константную область легкой цепи антитела к IL6R (MRAL-k0.xxx) согласно методу, описанному в примере 6-2 (10/10). Каждое обработанное протеазой антитело подвергали капиллярному электрофорезу в невосстанавливающих условиях с последующей детекцией полос с помощью антитела к каппа-цепи;

на фиг.24 - результаты обработки протеазой антитела к IL6R (MRA) и модифицированного антитела, полученного путем интродукции замены на цистеин в константную область легкой цепи антитела к IL6R (MRAL-k0.K126C) согласно методу, описанному в примере 7-2. Каждое обработанное протеазой антитело подвергали капиллярному электрофорезу в невосстанавливающих условиях с последующей детекцией полос с помощью антитела к каппа-цепи или антитела к человеческой Fc-области;

на фиг.25 - данные о соответствии между молекулярной массой каждой полосы, полученной расщеплением протеазой образца антитела, и его предполагаемой структурой, полученные согласно методу, описанному в примере 7-2. Также под структурой каждой молекулы указано, может ли молекула вступать в реакцию с антителом к каппа-цепи или с антителом к Fc (если полоса обнаружена при осуществлении электрофореза, результаты которого представлены на фиг.24);

на фиг.26 - результаты анализа опосредуемой CD3 агонистической активности молекулы антитела к CD3 (OKT3), молекул модифицированных антител, полученных путем сцепления Fab-Fab указанной молекулы антитела через дополнительную дисульфидную связь (Н_Т135С, Н_S136C, Н_S191C и L_K126C), и молекулы антитела к KLH (IC17) (отрицательный контроль) согласно методу, описанному в примере 13-4;

на фиг.27 - результаты анализа опосредуемой CD3 агонистической активности молекулы антитела к CD3 (OKT3), молекулы модифицированного антитела, полученного путем интродукции модификаций «Knobs-into-Holes» («выступы-во-впадины») (KiH), которые облегчают гетеродимеризацию, в константную область тяжелой цепи OKT3 (OKT3_KiH), молекул модифицированных антител, полученных путем сцепления Fab-Fab указанной молекулы антитела через дополнительную дисульфидную связь (Н_S191C_KiH, Н_S191C/V188C_KiH, Н_S191C/P189C_KiH, Н_S191C/S190C_KiH, H_S191C/S192C_KiH, H_S191C/L193C_KiH, H_S191C/G194C_KiH), и антитела к KLH (IC17) (отрицательный контроль) согласно методу, описанному в примере 14-4;

на фиг.28 - результаты анализа опосредуемой CD3 агонистической активности молекулы антитела к CD3 (OKT3), молекулы модифицированного антитела, полученного путем сцепления Fab-Fab указанной молекулы антитела через дополнительную дисульфидную связь (H_S191C), молекулы модифицированного антитела, полученной путем интродукции модификаций «Knobs-into-Holes» (KiH), которые облегчают гетеродимеризацию, в константную область тяжелой цепи OKT3 (OKT3_KiH), модифицированной молекулы антитела, полученного путем сцепления Fab-Fab указанной молекулы антитела через дополнительную дисульфидную связь (H_S191C_KiH), молекул модифицированных антител, полученных путем интродукции замены на положительно заряженную аминокислоту в одну из константных областей тяжелых цепей OKT3_KiH, и интродукции замены на отрицательно заряженную аминокислоту в константную область другой тяжелой цепи (0004//0004, 0004//0006), молекул модифицированных антител, полученных путем интродукции замены на положительно или отрицательно заряженную аминокислоту в одну из константных областей тяжелых цепей OKT3_KiH (0004//OKT3, OKT3//0004, OKT3//0006), и молекулы антитела к KLH (IC17) (отрицательный контроль) согласно методу, описанному в примере 15-4;

на фиг.29 - результаты анализа опосредуемой CD3 агонистической активности молекулы антитела к CD3 (OKT3), молекул модифицированных антител, полученных путем удаления дисульфидной связи в шарнирной области в указанной молекуле антитела (dh1, dh2, dh3), молекул модифицированных антител, полученных путем сцепления Fab-Fab указанных молекул через дополнительную дисульфидную связь (H_S191C_dhl, H_S191C_dh2, Н_S191C_dh3), и молекулы антитела к KLH (IC17) (отрицательный контроль) согласно методу, описанному в примере 16-4;

на фиг.30 - результаты анализа опосредуемой CD3 агонистической активности молекулы моноспецифического антитела к CD3 (OKT3-G1s), молекулы модифицированного антитела, полученного путем сцепления Fab-Fab указанной молекулы антитела через дополнительную дисульфидную связь (OKT3-G1sHH), молекулы модифицированного антитела, полученного путем сцепления Fab-Fab моноспецифического антитела к CD3 (CD3-G1s) через дополнительную дисульфидную связь (CD3-G1sLL), молекулы бипаратопного антитела к CD3 (CD3//OKT3-G1s), молекул модифицированных антител, полученных путем сцепления Fab-Fab указанной молекулы антитела через дополнительную дисульфидную связь (CD3//OKT3-G1sHH, CD3//OKT3-G1sLH), и комбинации CD3-G1sLL и OKT3-G1s (CD3-G1sLL+OKT3-G1s) согласно методу, описанному в примере 20;

на фиг.31А-Г - результаты анализа опосредуемой CD3 и/или PD1 агонистической активности биспецифических антител анти-CD3 × анти-PD1 и молекул модифицированных антител, полученных путем сцепления Fab-Fab указанных антител через дополнительную дисульфидную связь согласно методу, описанному в примере 22-1. На фиг.31А показана агонистическая активность молекулы биспецифического антитела анти-CD3 × анти-PD1 (OKT3//117-G1silent), которое состоит из антитела к CD3 (OKT3) и антитела к PD1 (117), и молекул модифицированных антител, полученных путем сцепления Fab-Fab указанной молекулы антитела через дополнительную дисульфидную связь (OKT3//117-G1silentHH, OKT3//117-G1silentHL, OKT3//117-G1silentLL);

на фиг.31Б - агонистическая активность молекулы биспецифического антитела анти-CD3 × анти-PD1 (OKT3//10-G1silent), которое состоит из антитела к CD3 (OKT3) и антитела к PD1 (10), и молекул модифицированных антител, полученных путем сцепления Fab-Fab указанной молекулы антитела через дополнительную дисульфидную связь (OKT3//10-G1silentHH, OKT3//10-G1silentHL);

на фиг.31В - агонистическая активность молекулы биспецифического антитела анти-CD3 × анти-PD1 (OKT3 /7949-G1silent), которое состоит из антитела к CD3 (OKT3) и антитела к PD1 (949), и молекул модифицированных антител, полученных путем сцепления Fab-Fab указанной молекулы антитела через дополнительную дисульфидную связь (CD3//949-G1silentLH, CD3//949-G1silentHH, CD3//949-G1silentLL, CD3//949-G1silentHL);

на фиг.31Г - агонистическая активность молекулы биспецифического антитела анти-CD3 × анти-PD1 (OKT3//949-G1silent), которое состоит из антитела к CD3 (OKT3) и антитела к PD1 (949), и молекул модифицированных антител, полученных путем сцепления Fab-Fab указанной молекулы антитела через дополнительную дисульфидную связь (OKT3//949-G1silentHL, OKT3//949-G1silentHH, OKT3//949-G1silentLL);

на фиг.32 - результаты анализа опосредуемой CD3 и/или PD1 агонистической активности молекулы биспецифического антитела анти-CD3 × анти-PD1, которое состоит из антитела к CD3 (OKT3) и антитела к PD1 (949), и молекул модифицированных антител, полученных путем сцепления Fab-Fab указанной молекулы антитела через дополнительную дисульфидную связь (OKT3//949-G1silentHH, OKT3//949-G1silentHL, OKT3//949-G1silentLH, OKT3//949-G1silentLL) согласно методу, описанному в примере 22-2;

на фиг.33А и Б - результаты оценки зависимого от Т-клеток ингибирующего действия на рост раковых клеток при применении в комбинации биспецифического CD28/CD3-«прижимающего» антитела и биспецифического GPC3/C ослабленным связыванием с CD3 антитела согласно методу, описанному в примере 23-1. Когда указанные биспецифическое CD28/CD3-«прижимающее» антитело и биспецифическое GPC3/C ослабленным связыванием с CD3 антитело объединяют и дают им действовать в присутствии клеток-мишеней (экспрессирующие GPC3 раковые клетки) и эффекторных клеток (Т-клетки), то биспецифическое GPC3/C ослабленным связыванием с CD3 антитело обеспечивало близость друг к другу клетки-мишени и эффекторной клетки, а биспецифическое CD28/CD3-«прижимающее» антитело активировало эффекторную клетку. На фиг.33А продемонстрировано ингибирующее действие на рост раковых клеток, когда молекулу биспецифического GPC3/C ослабленным связыванием с CD3 антитела (GPC3/attCE115) применяли в качестве антитела для таргетинга Т-клеток к раковым клеткам, а молекулу биспецифического GPC3/CD3-«прижимающего» антитела (GPC3/clamp CD3), молекулу биспецифического KLH/CD3-«прижимающего» антитела (KLH/clamp CD3), молекулу биспецифического CD28/CD3-«прижимающего» антитела (CD28/clamp CD3) или молекулу модифицированного антитела, полученного путем сцепления Fab-Fab указанной молекулы антитела через дополнительную дисульфидную связь (CD28/clamp CD3_НН), применяли в качестве антитела для активации Т-клеток;

на фиг.33Б - ингибирующее действие на рост раковых клеток, когда модифицированную молекулу антитела, полученного путем сцепления Fab-Fab биспецифического GPC3/C ослабленным связыванием CD3 антитела через дополнительную дисульфидную связь (GPC3/attCE115_LL), применяли в качестве антитела для таргетинга Т-клеток к раковым клеткам, а молекулу биспецифического GPC3/CD3-«прижимающего» антитела (GPC3/clamp CD3), молекулу биспецифического KLH/CD3-«прижимающего» антитела (KLH/clamp CD3), молекулу биспецифического CD28/CD3-«прижимающего» антитела (CD28/clamp CD3) или молекулу модифицированного антитела, полученного путем сцепления Fab-Fab указанной молекулы антитела через дополнительную дисульфидную связь (CD28/clamp CD3_HH), применяли в качестве антитела для активации Т-клеток;

на фиг.34А-В - результаты оценки производства цитокинов Т-клетками, когда биспецифическое CD28/CD3-«прижимающее» антитело и биспецифическое GPC3/C ослабленным связыванием CD3 антитело применяли в комбинации, описанной в примере 23-2. Когда указанные выше биспецифическое CD28/CD3-«прижимающее» антитело и биспецифическое GPC3/с ослабленным связыванием CD3 антитело применяли в комбинации в присутствии клеток-мишеней (экспрессирующие GPC3 раковые клетки) и эффекторных клеток (Т-клетки), то биспецифическое GPC3/C ослабленным связыванием с CD3 антитело обеспечивало близость друг к другу клетки-мишени и эффекторной клетки, а биспецифическое CD28/CD3-«прижимающее» антитело активировало эффекторную клетку. На фиг.34А продемонстрирован уровень производства IL-6, когда молекулу биспецифического GPC3/C ослабленным связыванием CD3 антитела (GPC3/attCE115) и молекулу модифицированного антитела, полученного путем сцепления Fab-Fab биспецифического CD28/CD3-«прижимающее» антитела через дополнительную дисульфидую связь (CD28/clamp CD3_HH), применяли каждое индивидуально или в комбинации в присутствии клеток-мишеней (экспрессирующие GPC3 раковые клетки) и эффекторных клеток (Т-клетки);

на фиг.34Б - уровень производства IL-6, когда молекулу биспецифического GPC3/C ослабленным связыванием CD3 антитела (GPC3/attCE115) и молекулу модифицированного антитела, полученного путем сцепления Fab-Fab биспецифического CD28/CD3-«прижимающего» антитела через дополнительную дисульфидную связь (CD28/clamp CD3_HH), применяли каждое индивидуально или в комбинации в присутствии только эффекторных клеток (Т-клетки);

на фиг.34В - ингибирующее действие на рост раковых клеток, когда молекулу биспецифического GPC3/C ослабленным связыванием CD3 антитела (GPC3/attCE115) и молекулу модифицированного антитела, полученного путем сцепления Fab-Fab биспецифического CD28/CD3-«прижимающего» антитела через дополнительную дисульфидную связь (CD28/clamp CD3_НН), применяли каждое индивидуально или в комбинации в присутствии клеток-мишеней (экспрессирующие GPC3 раковые клетки) и эффекторных клеток (Т-клетки);

на фиг.35А и Б - схематические диаграммы, демонстрирующие механизм действия зависящего от Т-клеток ингибирования роста раковых клеток, когда биспецифическое CD28/CD3-«прижимающее» антитело и биспецифическое GPC3/C ослабленным связыванием CD3 антитело применяли в комбинации, согласно методу, описанному в примере 23-1 («б» на диаграммах обозначает CD3ε). На фиг.35А продемонстрирован механизм действия ингибирования роста раковых клеток, когда биспецифическое CD28/CD3-«прижимающее» антитело и биспецифическое GPC3/C ослабленным связыванием CD3 антитело применяли в комбинации в присутствии клеток-мишеней (экспрессирующие GPC3 раковые клетки) и эффекторных клеток (Т-клетки); на фиг.35Б - механизм действия ингибирования роста раковых клеток, когда молекулу модифицированного антитела, которое модифицировано путем интродукции дополнительной дисульфидной связи в Fab-Fab биспецифического CD28/CD3-«прижимающего» антитела, и биспецифическое GPC3/C ослабленным связыванием CD3 антитело применяли в комбинации в присутствии клеток-мишеней (экспрессирующие GPC3 раковые клетки) и эффекторных клеток (Т-клетки); действия производства цитокинов Т-клетками, когда биспецифическое CD28/CD3-«прижимающее» антитело и биспецифическое GPC3/C ослабленным связыванием CD3 антитело применяли в комбинации, согласно методу, описанному в примере 23-2 («б» на диаграммах обозначает CD3ε). На фиг.36А продемонстрирован механизм действия производства цитокинов, когда молекулу модифицированного антитела, которое модифицировано путем интродукции дополнительной дисульфидной связи в Fab-Fab биспецифического CD28/CD3-«прижимающего» антитела, и биспецифическое GPC3/C ослабленным связыванием CD3 антитело применяли в комбинации в присутствии клеток-мишеней (экспрессирующие GPC3 раковые клетки) и эффекторных клеток (Т-клетки);

на фиг.36Б - механизм действия производства цитокинов, когда молекулу модифицированного антитела, которое модифицировано путем интродукции дополнительной дисульфидной связи в Fab-Fab биспецифического CD28/CD3-«прижимающего» антитела, и биспецифическое GPC3/C ослабленным связыванием CD3 антитело применяли в комбинации в присутствии только эффекторных клеток (Т-клетки);

на фиг.37А и Б - результаты анализа агонистической активности молекулы биспецифического CD8/CD28 антитела (CD8/CD28-P587) и молекул модифицированных антител, полученных путем сцепления Fab-Fab указанного антитела через дополнительную дисульфидную связь (CD8/CD28-P587(HH), CD8/CD28-P587(LL), CD8/CD28-P587(HL), CD8/CD28-P587(LH)) согласно методу, описанному в примере 24. Молекулу антитела к KLH (KLH-P587) применяли в качестве отрицательного контроля. Представлены результаты, полученные с использованием мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС) двух различных доноров (верхняя панель: донор А, нижняя панель: донор Б). На фиг.37А показана доля делящихся регуляторных Т-клеток (Treg) в популяции РВМС;

на фиг.37Б - доля делящихся CD8α-позитивных Т-клеток в популяции РВМС.

Подробное описание изобретения

I. Определения

В контексте настоящего описания понятие «антигенсвязывающая молекула» в наиболее широком смысле относится к молекуле, которая специфически связывается с антигенной детерминантой (эпитопом). В одном из вариантов осуществления изобретения антигенсвязывающая молекула представляет собой антитело, фрагмент антитела или производное антитела. В одном из вариантов осуществления изобретения антигенсвязывающая молекула представляет собой белок, не являющийся антителом, или его фрагмент или производное.

В контексте настоящего описания понятие «антигенсвязывающий домен» относится к области, которая специфически связывается и является комплементарной полному антигену или его части. В контексте настоящего описания антигенсвязывающая молекула содержит антигенсвязывающий домен. Когда молекулярная масса антигена является большой, то антигенсвязывающий домен может связываться лишь с конкретной частью антигена. Конкретную часть называют «эптопом». В одном из вариантов осуществления изобретения антигенсвязывающий домен содержит фрагмент антитела; который связывается с конкретным антигеном. Антигенсвязывающий домен может быть образован из одного или нескольких вариабельных доменов антитела. В одном из вариантов осуществления изобретения, не ограничивающих его объем, антигенсвязывающие домены содержат как вариабельную область легкой цепи антитела (VL), так и вариабельную область тяжелой цепи антитела (VH).

Примеры указанных антигенсвязывающих доменов включают «одноцепочечный Fv (scFv)», «одноцепочечное антитело», «Fv», «одноцепочечный Fv2 (scFv2)», «Fab» и «Fab'». В других вариантах осуществления изобретения антигенсвязывающий домен содержит белок, не являющийся антителом, который связывается с конкретным антигеном, или его фрагмент.В конкретном варианте осуществления изобретения антигенсвязывающий домен содержит шарнирную область.

В настоящем изобретении понятие «специфически связывается» означает такой статус связывания, при котором одна из молекул, участвующих в специфическом связывании, не обладает какой-либо значимой способностью связываться с молекулами, отличными от одной или нескольких молекул-партнеров по связыванию. Кроме того, понятие используют также, когда антигенсвязывающий домен является специфическим в отношении конкретного эпитопа из нескольких эпитопов, входящих в антиген. Когда эпитоп, с которым связывается антигенсвязывающий домен, входит в несколько различных антигенов, то антигенсвязывающие молекулы, которые содержат антигенсвязывающий домен, могут связываться с различными антигенами, которые содержат указанный эпитоп.

В контексте настоящего описания понятие «связывается с тем же самым эпитопом» означает, что эпитопы, с которыми связываются два антигенсвязывающих домена, по меньшей мере частично перекрываются друг с другом. Степень перекрытия составляет (но, не ограничиваясь только указанным) 10% или более, предпочтительно 20% или более, 30% или более, 40% или более, 50% или более, 60% или более, 70% или более и 80% или более, особенно предпочтительно 90% или более и наиболее предпочтительно 100%.

В контексте настоящего описания понятие «антитело» используется в его наиболее широком смысле, и оно относится к различным структурам антител, включая (но, не ограничиваясь только ими) моноклональные антитела, поликлональные антитела, мультиспецифические антитела (например, биспецифические антитела) и фрагменты антител, при условии, что они обладают требуемой антигенсвязывающей активностью.

Понятие «моноклональное антитело» в контексте настоящего описания относится к антителу, полученному из популяции практически гомогенных антител, т.е. индивидуальные антитела, входящие в популяцию, идентичны и/или связываются с одним и тем же эпитопом, за исключением возможных вариантов антител, например, содержащих мутации, встречающиеся в естественных условиях или возникающие в процессе производства препарата моноклонального антитела, указанные варианты, как правило, присутствуют в минорных количествах. В отличие от препаратов поликлональных антител, которые, как правило, включают различные антитела к различным детерминантам (эпитопам), каждое моноклональное антитело из препарата моноклонального антитела направлено против одной детерминанты на антигене. Таким образом, прилагательное «моноклональный» относится к характеристике антитела, указывающей на получение из практически гомогенной популяции антител, и его не следует рассматривать как требование, ограничивающее получение антитела с помощью какого-либо конкретного метода. Например, моноклональные антитела, предназначенные для применения согласно настоящему изобретению, можно получать различными методиками, включая (но, не ограничиваясь только ими) метод гибридом, методы рекомбинантной ДНК, методы фагового дисплея и методы, включающие применение трансгенных животных, содержащих весь локус человеческого иммуноглобулина или его часть, указанные методы и другие, приведенные в качестве примера методы создания моноклональных антител, представлены в настоящем описании.

Понятие «нативные антитела» относится к встречающимся в естественных условиях молекулам иммуноглобулинов с различными структурами. Например, нативные антитела IgG-класса представляют собой гетеротетрамерные гликопротеины с молекулярной массой примерно 150000 Да, состоящие из двух идентичных легких цепей и двух идентичных тяжелых цепей, связанных дисульфидными мостиками. Начиная с N- конца к С-концу, каждая тяжелая цепь имеет вариабельную область (VH), которую называют также вариабельным тяжелым доменом или вариабельным доменом тяжелой цепи, за которой следует три константных домена (СН1, СН2 и СН3). Аналогично этому, начиная с N-конца к С-концу, каждая легкая цепь имеет вариабельную область (VL), которую называют также вариабельным легким доменом или вариабельным доменом легкой цепи, за которой следует константный домен легкой цепи (CL). Легкая цепь антитела может принадлежать к одному из двух типов, называемых каппа (κ) и лямбда (λ), в зависимости от аминокислотной последовательности ее константного домена.

Понятие «химерное» антитело относится к антителу, в котором часть тяжелой и/или легкой цепи имеет происхождение из конкретного источника или вида, а остальная часть тяжелой и/или легкой цепи имеет происхождение из другого источника или вида.

Понятие «класс» антитела относится к типу константного домена или константной области, входящего/входящей в тяжелую цепь. Существует пять основных классов антител: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, а некоторые из них можно дополнительно подразделять на подклассы (изотипы), например, IgG₁, IgG₂, IgG₃, IgG₄, IgA₁ и IgA₂. Константные домены тяжелых цепей, соответствующие различным классам иммуноглобулинов, обозначают как альфа, дельта, эпсилон, гамма и мю соответственно.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения константные области предпочтительно представляют собой константные области антитела, более предпочтительно константные области антитела IgG1-, IgG2-, IgG3- и IgG4-типа и еще более предпочтительно константные области человеческого антитела IgG1-, IgG2-, IgG3- и IgG4-типа. Кроме того, в другом варианте осуществления настоящего изобретения константные области предпочтительно представляют собой константные области тяжелых цепей, предпочтительно константные области тяжелых цепей IgG1-, IgG2-, IgG3- и IgG4-типа и еще более предпочтительно константные области тяжелых цепей человеческого антитела IgG1-, IgG2-, IgG3- и IgG4-типа. Аминокислотные последовательности константной области человеческого IgG1, константной области человеческого IgG2, константной области человеческого IgG3 и константной области человеческого IgG4 известны. Для константных областей человеческого IgG1, человеческого IgG2, человеческого IgG3 и человеческого IgG4 множество последовательностей аллотипов с генетическим полиморфизмом описаны в «Sequences of proteins of immunological interest», публикация NIH №91-3242, и любую из них можно применять согласно настоящему изобретению.

Модифицированные аминокислотами константные области, предлагаемые в настоящем изобретении, могут содержать другие аминокислотные мутации или модификации, если они включают аминокислотную мутацию, предлагаемую в настоящем изобретении.

Понятие «шарнирная область» означает часть полипептида тяжелой цепи антитела в тяжелой цепи антитела дикого типа, которая соединяет СН1-домен и СН2-домен, например, простирающуюся от примерно положения 216 до примерно положения 230 согласно системе EU-нумерации или от примерно положения 226 до примерно положения 243 согласно системе нумерации Кэбота. Известно, что в нативном антителе IgG-типа остаток цистеина в положении 220 согласно EU-нумерации в шарнирной области образует дисульфидную связь с остатком цистеина в положении 214 в легкой цепи антитела. Известно также, что между двумя тяжелыми цепями антитела образуются дисульфидные связи между остатками цистеина в положении 226 и между остатками цистеина в положении 229 согласно EU-нумерации в шарнирной области. В контексте настоящего описания шарнирная область включает шарнирные области дикого типа, а также варианты, в которых аминокислотный(ые) остаток(ки) в шарнирной области дикого типа изменен(ы) путем замены, добавления или делеции.

В настоящем описании понятие «Fc-область» применяют для обозначения С-концевой области тяжелой цепи иммуноглобулина, которая содержит по меньшей мере часть константной области. Под понятие подпадают имеющие нативную последовательность Fc-области и варианты Fc-областей. В одном из вариантов осуществления изобретения Fc-область тяжелой цепи человеческого IgG простирается от Cys226 или от Pro230 до карбоксильного конца тяжелой цепи. Однако С-концевой лизин (Lys447) или глицин-лизин (Gly446-Lys447) Fc-области может присутствовать или отсутствовать. Если специально не указано иное, то в настоящем описании нумерация аминокислотных остатков в Fc-области или константной области соответствует системе нумерации EU (которую обозначают также как EU-индекс), описанной у Kabat и др., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5-ое изд., изд-во Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991.

Понятие «эффекторные функции» относится к видам биологической активности, присущим Fc-области антитела, которые варьируются в зависимости от изотипа антитела. Примерами эффекторных функций антитела являются: способность связываться с C1q и комплементзависимая цитотоксичность (CDC); способность связываться с Fc-рецептором; антитело-обусловленная клеточнозависимая цитотоксичность (ADCC); фагоцитоз; понижающая регуляция рецепторов клеточной поверхности (например, В-клеточного рецептора)и активация В-клеток.

Понятие «Fc-рецептор» или «FcR» относится к рецептору, который связывается с Fc-область антитела. В некоторых вариантах осуществления изобретения FcR представляет собой нативный человеческий FcR. В некоторых вариантах осуществления изобретения FcR представляет собой рецептор, который связывается с антителом IgG-типа (гамма-рецептор) и включает рецепторы подклассов Fc-гамма RI, Fc-гамма RII и Fc-гамма RIII, включая аллельные варианты и полученные в результате альтернативного сплайсинга формы этих рецепторов. Рецепторы Fc-гамма RII включают Fc-гамма RIIA («активирующий рецептор») и Fc-гамма RIIB («ингибирующий рецептор»), которые имеют сходные аминокислотные последовательности, отличающиеся прежде всего их цитоплазматическими доменами. Активирующий рецептор Fc-гамма RIIA содержит активирующие мотивы на основе тирозина иммунорецептора (ITAM) в его цитоплазматическом домене. Ингибирующий рецептор Fc-гамма RIIB содержит ингибирующий мотив на основе рецептора тирозина иммунорецептора (ITIM) в его цитоплазматическом домене (см., например, , Annu. Rev. Immunol. 15, 1997, cc. 203-234). Обзор сведений о FcR представлен, например, у Ravetch и Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9, 1991, cc. 457-492; Capel и др., Immunomethods 4, 1994, cc. 25-34 и de Haas и др., J. Lab. Clin. Med. 126, 1995, cc. 330-341. Под понятие «FcR», указанное в настоящем описании, подпадают и другие FcR, включая те, которые будут идентифицированы в будущем.

Понятие «Fc-рецептор» или «FcR» включает также неонатальный рецептор, FcRn, который ответствен за перенос материнских IgG эмбриону (Guyer и др., J. Immunol. 117, 1976, с. 587 и Kim и др., J. Immunol. 24, 1994, с. 249) и регулирует гомеостаз иммуноглобулинов. Известны методы измерения связывания с FcRn (см., например, Ghetie и Ward., Immunol. Today 18(12), 1997, cc.592-598; Ghetie и др., Nature Biotechnology 15(7), 1997, cc. 637-640; Hinton и др., J. Biol. Chem. 279(8), 2004, cc. 6213-6216; WO 2004/92219 (Hinton и др.).

Понятие «вариабельная область» или «вариабельный домен» относится к домену тяжелой или легкой цепи антитела, который участвует в связывании антитела с антигеном. Вариабельные домены тяжелой цепи и легкой цепи (VH и VL соответственно) нативного антитела, как правило, имеют сходные структуры, при этом каждый домен содержит четыре консервативных каркасных участка (FR) и три гипервариабельных участка (HVR) (см., например, Kindt и др., Kuby Immunology, 6-ое изд., изд-во W.H. Freeman and Co., 2007, с. 91).

Одного VH- или VL-домена может быть достаточно для обеспечения специфичности связывания антигена. Кроме того, антитела, которые связываются с конкретным антигеном, можно выделять, используя VH- или VL-домен из антитела, которое связывается с антигеном, для скрининга библиотеки комплементарных VL- или VH-доменов соответственно (см., например, Portolano и др., J. Immunol. 150, 1993, cc. 880-887; Clarkson и др., Nature 352, 1991, cc. 624-628).

Понятие «гипервариабельный участок» или «HVR» в контексте настоящего описания относится к каждому из участков вариабельного домена антитела, последовательности которых являются гипервариабельными («определяющие комплементарность участки» или «CDR») и/или формируют петли определенной структуры («гипервариабельные петли»), и/или содержат контактирующие с антигеном остатки («контакты с антигеном»). Как правило, антитела содержат шесть HVR; три в VH (H1, Н2, Н3) и три в VL (L1, L2, L3). Согласно настоящему описанию примеры HVR включают

(а) гипервариабельные петли, включающие аминокислотные остатки 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (H2) и 96-101 (Н3) (Chothia и Lesk, J. Mol. Biol. 196, 1987, cc. 901-917);

(6) CDR, включающие аминокислотные остатки 24-34 (L1), 50-56 (L2), 89-97 (L3), 31-35b (H1), 50-65 (H2) и 95-102 (Н3) (Kabat и др.. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5-ое изд., изд-во Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD.1991, публикация NIH 91-3242);

(в) области контакта с антигеном, включающие аминокислотные остатки 27 с-36 (L1), 46-55 (L2), 89-96 (L3), 30-35b (H1), 47-58 (H2) и 93-101 (Н3) (MacCallum и др., J. Mol. Biol. 262, 1996, cc. 732-745); и

(г) комбинации остатков, указанных в подпунктах (а), (б) и/или (в), включающие аминокислотные остатки HVR 46-56 (L2), 47-56 (L2), 48-56 (L2), 49-56 (L2), 26-35 (H1), 26-35b (H1), 49-65 (H2), 93-102 (Н3) и 94-102 (Н3).

Если специально не указано иное, то остатки в HVR и другие остатки в вариабельном домене (например, остатки в FR) нумеруют согласно Kabat и др., выше.

«Каркасный участок» или «FR», означает остатки вариабельного домена, отличные от остатков гипервариабельного участка (HVR). FR вариабельного домена, как правило, состоит из четырех FR-доменов: FR1, FR2, FR3 и FR4. Таким образом, последовательности HVR и FR, как правило, имеют следующее расположение в VH (или VL): FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.

Понятия «полноразмерное антитело», «интактное антитело» и «цельное антитело» в контексте настоящего описания используют взаимозаменяемо для обозначения антитела, имеющего структуру, практически сходную с нативной структурой антитела, или имеющего тяжелые цепи, которые содержат представленную в настоящем описании Fc-область.

Понятия «клетка-хозяин», «линия клеток-хозяев» и «культура клеток-хозяев» используют взаимозаменяемо, и они относятся к клеткам, в которые интродуцирована экзогенная нуклеиновая кислота, включая потомство указанных клеток. К клеткам-хозяевам относятся «трансформанты» и «трансформированные клетки», которые включают первично трансформированную клетку и полученное из нее потомство безотносительно к количеству пересевов. Потомство может не быть полностью идентичным по составу нуклеиновых кислот родительской клетке, но может содержать мутации. Под объем изобретения подпадает мутантное потомство, которое обладает такой же функцией или биологической активностью, которая обнаружена в результате скрининга или отобрана у исходной трансформированной клетки.

Понятие «вектор» в контексте настоящего описания относится к молекуле нуклеиновой кислоты, которая может осуществлять размножение другой нуклеиновой кислоты, с которой она связана. Понятие включает вектор в виде самореплицирующейся структуры нуклеиновой кислоты, а также вектор, включенный в геном клетки-хозяина, в которую он интродуцирован. Некоторые векторы обладают способностью контролировать экспрессию нуклеиновых кислот, с которыми они функционально связаны. Указанные векторы в контексте настоящего описания обозначают как «экспрессионные векторы».

«Человеческое антитело» представляет собой антитело, имеющее аминокислотную последовательность, которая соответствует последовательности антитела, продуцируемого в организме человека или человеческими клетками, или имеющее происхождение из нечеловеческого источника, в котором использован спектр человеческих антител или другие кодирующие человеческое антитело последовательности. Из указанного определения человеческого антитела специально исключено гуманизированное антитело, содержащее нечеловеческие антигенсвязывающие остатки.

Понятие «гуманизированное» антитело относится к химерному антителу, которое содержит аминокислотные остатки из нечеловеческих HVR и аминокислотные остатки из человеческих FR. В некоторых вариантах осуществления изобретения гуманизированное антитело может содержать практически все из по меньшей мере одного и, как правило, двух вариабельных доменов, в которых все или практически все HVR (например, CDR) соответствуют участкам нечеловеческого антитела, а все или практически все FR соответствуют участкам человеческого антитела. Гуманизированное антитело необязательно может содержать по меньшей мере часть константной области антитела, имеющей происхождение из человеческого антитела. Понятие «гуманизированная форма» антитела, например, нечеловеческого антитела, относится к антителу, которое подвергли гуманизации.

Понятие «фрагмент антитела» относится к молекуле, отличной от интактного антитела, которая содержит часть интактного антитела, связывающуюся с антигеном, с которым связывается интактное антитело. Примеры фрагментов антитела включают (но, не ограничиваясь только ими) Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')₂; димерные антитела (диабоди); линейные антитела; молекулы одноцепочечных антител (например, scFv), одноцепочечные Fab (scFab); однодоменные антитела и мультиспецифические антитела, образованные из фрагментов антител.

Вариабельный фрагмент (Fv)

В контексте настоящего описания понятие «вариабельный фрагмент (Fv)» относится к минимальному компоненту имеющего происхождение из антитела антигенсвязывающего домена, который состоит из пары, включающей вариабельную область легкой цепи антитела (VL) и вариабельную область тяжелой цепи антитела (VH). В 1988 г. Skerra и Pluckthun обнаружили, что гомогенные и активные антитела можно получать из периплазматической фракции Е. coli путем инсерции гена антитела в прямом направлении относительно бактериальной сигнальной последовательности и индукции инсерции гена в Е. coli (Science 240(4855), 1988, cc. 1038-1041). В Fv полученном из периплазматической фракции, ассоциация VH с VL происходила таким образом, чтобы имело место связывание с антигеном.

scFv, одноцепочечное антитело и sc(Fv)2

В контексте настоящего описания понятия «scFv», «одноцепочечное антитело» и «sc(Fv)2» все относятся к фрагменту антитела, состоящему из одной полипептидной цепи, которая содержит вариабельные области, имеющие происхождение из тяжелой и легкой цепей, но не содержит константную область. В целом, одноцепочечное антитело содержит также полипептидный линкер между VH - и VL-доменами, который обладает способностью образовывать требуемую структуру, которая, как считается, должна обеспечивать связывание с антигеном. Детали, касающиеся одноцепочечного антитела, обсуждены у Pluckthun в: «The Pharmacology of Monoclonal Antibodies», т.113, под ред. Rosenburg и Moore, изд-во Springer- Verlag, New York, 1994, cc. 269-315 (см. также публикацию международной заявки на патент WO 1988/001649; патентов США№№. 4946778 и 5260203). В конкретном варианте осуществления изобретения одноцепочечное антитело может быть биспецифическим и/или гуманизированным.

scFv представляет собой антигенсвязывающий домен, в котором VH и VL, образующие Fv, сцеплены друг с другом с помощью пептидного линкера (Proc.Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85(16), 1988, cc. 5879-5883). VH и VL могут удерживаться в непосредственной близости с помощью пептидного линкера.

sc(Fv)2 представляет собой одноцепочечное антитело, в котором четыре вариабельные области двух VL и двух VH сцеплены с помощью линкеров, таких как пептидные линкеры, с образованием одной цепи (J Immunol. Methods 231(1-2), 1999, cc. 177-189). Две VH и две VL могут иметь происхождение из различных моноклональных антител. Указанная молекула sc(Fv)2 предпочтительно включает, например, биспецифическую молекулу sc(Fv)2, распознающую два эпитопа, которые присутствуют в одном антигене, что описано в Journal of Immunology 152(11), 1994, cc. 5368-5374. sc(Fv)2 можно получать методами, известными специалистам в данной области. Например, sc(Fv)2 можно получать путем сцепления scFv с помощью линкера, такого как пептидный линкер.

В контексте настоящего описания форма антигенсвязывающего домена, образующего sc(Fv)2, включает антитело, в котором два VH-компонента и два VL-компонента упорядочены следующим образом: VH, VL, VH и VL ([VH]-линкер-[VL]-линкер-[VH]-линкер-[VL]), начиная с N-конца одноцепочечного полипептида. Порядок расположения двух VH-компонентов и двух VL-компонентов не ограничен указанной выше формой, и они могут располагаться любым образом. Пример порядка расположения формы представлен ниже.

[VL]-линкер-[VH]-линкер-[VH]-линкер-[VL],

[VH]-линкер-[VL]-линкер-[VL]-линкер-[VH],

[VH]-линкер-[VH]-линкер-[VL]-линкер-[VL],

[VL]-линкер-[VL]-линкер-[VH]-линкер-[VH],

[VL]-линкер-[VH]-линкер-[VL]-линкер-[VH].

Fab, F(ab')2 и Fab'

«Fab» состоит из одной легкой цепи и CH1-участка и вариабельной области одной тяжелой цепи. Тяжелая цепь молекулы Fab дикого типа не может образовывать дисульфидные связи с другой молекулой тяжелой цепи. В контексте настоящего описания помимо молекул Fab дикого типа под указанное понятие подпадают также варианты Fab, в которых аминокислотный(ые) остаток(ки) в молекуле Fab дикого типа изменены путем замены, добавления или делеции. В конкретном варианте осуществления изобретения мутантный(ые) аминокислотный(ые) остаток(ки), содержащиеся в вариантах Fab (например, остаток(ки) цистеина или остаток(ки) лизина после замены, добавления или инсерции) могут образовывать дисульфидную(ые) связь(и) с другой молекулой тяжелой цепи или ее частью (например, молекулой Fab).

scFab представляет собой антигенсвязывающий домен, в котором одна легкая цепь и СН1-участок и вариабельная область одной тяжелой цепи, которые образуют Fab, сцеплены друг с другом с помощью пептидного линкера. Легкая цепь и СН1-участок и вариабельная область тяжелой цепи могут удерживаться в непосредственной близости с помощью пептидного линкера.

«F(ab')2» или «Fab» получают обработкой иммуноглобулина (моноклонального антитела) протеазой, такой как пепсин и папаин, и понятие относится к фрагменту антитела, созданному путем расщепления иммуноглобулина (моноклонального антитела) вблизи дисульфидных связей, присутствующих между шарнирными областями в каждой из двух Н-цепей. Например, папаин расщепляет IgG в обратном направлении относительно дисульфидных связей, присутствующих между шарнирными областями в каждой из двух Н -цепей, с образованием двух гомологичных фрагментов антител, в которых L-цепь, содержащая VL (вариабельную область L-цепи) и CL (константную область L-цепи), сцеплена с фрагментом Н-цепи, содержащим VH (вариабельную область Н-цепи) и CHγ1 (γ1-участок в константной области Н-цепи) через дисульфидную связь в их С-концевых областях. Каждый из указанных двух гомологичных фрагментов антитела обозначают как Fab'.

«F(ab')2» состоит из двух легких цепей и двух тяжелых цепей, содержащих константную область СН1-домена и часть СН2-доменов, в результате чего между двумя тяжелыми цепями образуются дисульфидные связи. F(ab')2, указанный в настоящем описании, предпочтительно можно получать следующим методом. Цельное моноклональное антитело или подобную молекулу, содержащую требуемый антигенсвязывающий домен, частично расщепляют протеазой, такой как пепсин; и Fc-фрагменты удаляют путем адсорбции на колонке с белком А. Протеаза не ограничена конкретной протеазой, если она обладает способностью расщеплять цельное антитело избирательным образом с образованием F(ab')2 в соответствующих требуемых условиях ферментативной реакции, таких как рН. Указанные протеазы включают, например, пепсин и фицин.

Однодоменные антитела

В контексте настоящего описания понятие «однодоменные антитела» не ограничено конкретной структурой, если домен сам может проявлять антигенсвязывающую активность. Канонические антитела, примером которых являются антитела IgG-типа, проявляют антигенсвязывающую активность в состоянии, в котором вариабельная область формируется путем спаривания VH и VL. В противоположность этому, известно, что однодоменное антитело обладает способностью проявлять антигенсвязывающую активность посредством только его собственной доменной структуры без спаривания с другим доменом. Однодоменные антитела, как правило, имеют относительно низкую молекулярную массу и находятся в форме мономера.

Примеры однодоменного антитела включают (но, не ограничиваясь только ими) антигенсвязывающие молекулы, в которых в естественных условиях отсутствуют легкие цепи, такие как VHH животных семейства верблюдовых (Camelidae) и vnar акул, и фрагменты антител, которые содержат цельный VH-домен антитела или его часть или цельный VL-домен антитела или его часть. Примеры однодоменного антитела, которое представляет собой фрагмент антитела, содержащий цельный VH/VL-домен или его часть, включают (но, не ограничиваясь только ими) искусственно полученные однодоменные антитела, имеющие происхождение из VH человеческого антитела или VL человеческого антитела, которые описаны, например, в патенте США №6248516 В1. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения одно однодоменное антитело имеет три CDR (CDR1, CDR2 и CDR3).

Однодоменные антитела можно получать из животных, которые обладают способностью продуцировать однодоменные антитела, или путем иммунизации животных, которые обладают способностью продуцировать однодоменные антитела. Примеры животных, которые обладают способностью продуцировать однодоменные антитела, включают (но, не ограничиваясь только ими) верблюдовых и трансгенных животных, в которых интродуцирован(ы) ген(ы) для придания способности продуцировать однодоменные антитела. К верблюдовым относятся верблюды, ламы, альпаки, дромедары, гуанако и т.п. Примеры трансгенных животных, в которых интродуцирован(ы) ген(ы) для придания способности продуцировать однодоменные антитела, включают (но, не ограничиваясь только ими) трансгенных животных, которые описаны в международной публикации WO 2015/143414 или публикации патента США 2011/0123527 А1. Гуманизированные однодоменные антитела можно получать также путем замены последовательностей каркасных участков однодоменного антитела, полученного из животного на последовательности человеческой зародышей линии или сходные последовательности. Гуманизированное однодоменное антитело (например, гуманизированное VHH) является одним из вариантов однодоменного антитела, предлагаемого в настоящем изобретении.

Альтернативно этому, однодоменные антитела можно получать из полипептидных библиотек, содержащих однодоменные антитела, с помощью ELISA, пэннинга и т.п. Примеры полипептидных библиотек, содержащих однодоменные антитела, включают (но, не ограничиваясь только ими) библиотеки наивных антител, полученные из различных животных или людей (см., например, Methods in Molecular Biology 911, 2012, cc. 65-78 и Biochimica et Biophysica Acta - Proteins and Proteomics 1764, 8, 2006, cc. 1307-1319), библиотеки антител, полученные путем иммунизации различных животных (см., например. Journal of Applied Microbiology 117, 2, 2014, cc. 528-536), и библиотеки синтетических антител, полученных из генов антител различных животных или людей (см., например. Journal of Biomolecular Screening 21,1, 2016, cc. 35-43, Journal of Biological Chemistry 291, 24, 2016, cc. 12641-12657) и AIDS 30, 11, 2016, cc. 691-1701).

Понятие «связывающая активность» относится к суммарной силе всех нековалентных взаимодействий между одним или несколькими сайтами связывания молекулы (например, антитела) и ее партнером по связыванию (например, антигеном). В контексте настоящего описания связывающая активность не ограничена строго взаимодействием по типу 1:1 между компонентами связывающейся пары (например, антителом антигеном). Например, когда для компонентов связывающейся пары характерно одновалентное взаимодействие по типу 1:1, то связывающая активность отражает присущую аффинность связывания (аффинность). Когда компонент связывающейся пары обладает способностью и к одновалентному связыванию, и к многовалентному связыванию, то связывающая активность представляет собой сумму каждой силы связывания. Связывающую активность молекулы Х в отношении ее партнера Y, как правило, можно характеризовать с помощью константы диссоциации (KD) или «количества связанного аналита на одну единицу количества лиганда». Связывающую активность можно оценивать с помощью общепринятых методов, известных в данной области, включая те, которые представлены в настоящем описании.

В контексте настоящего описания понятие «агонистическая» антигенсвязывающая молекула или «агонистическое» антитело означает антигенсвязывающую молекулу или антитело, которая/которое существенно потенцирует биологическую активность антигена, с которым связывается.

В контексте настоящего описания понятие «блокирующая» антигенсвязывающая молекула или «блокирующее» антитело или «антагонистическая» антигенсвязывающая молекула или «антагонистическое» антитело означает антигенсвязывающую молекулу или антитело, которая/которое существенно ингибирует (либо частично, либо полностью) биологическую активность антигена, с которым она связывается.

В контексте настоящего описания фраза «существенно пониженный» или «существенно отличающийся» относится к достаточно высокой степени различия между двумя численными значениями (как правило, одно из которых связано с молекулой, а другое связано с референс-молекулой/с молекулой, с которой проводится сравнение), такой, что специалист в данной области может рассматривать это различие между двумя значениями как статистически значимое в контексте биологической характеристики, измеряемой указанными значениями (например, величины KD).

В контексте настоящего описания понятие «практически сходный» или «практически такой же» относится к достаточно высокой степени сходства между двумя численными значениями (как правило, одно из которых связано с антителом, предлагаемым в изобретении, а другое связано с референс-антителом/с антителом, с которым проводится сравнение), такой, что специалист в данной области может считать, что различие между двумя значениями является малым или не является биологически и/или статистически значимым в контексте биологической характеристики, измеряемой указанными значениями (например, величины KD).

Понятия « фармацевтическая препаративная форма» или «фармацевтическая композиция» относится к препарату, который находится в такой форме, что он обеспечивает биологическую активность входящего в его состав действующего вещества, которое должно обладать эффективностью, и которая не содержит дополнительных компонентов, обладающих неприемлемой токсичностью для индивидуума, которому следует вводить композицию.

«Фармацевтически приемлемый носитель» относится к ингредиенту в фармацевтической композиции, отличному от действующего вещества, который является нетоксичным для индивидуума. Фармацевтически приемлемые носители включают (но, не ограничиваясь только ими) буфер, эксципиент, стабилизатор или консервант.

«Индивидуум» или «субъект» представляет собой млекопитающсс. К млекопитающим относятся (но, не ограничиваясь только ими) одомашненные животные (например, коровы, овцы, кошки, собаки и лошади), приматы (например, человек и приматы кроме человека, такие как обезьяны), кролики и грызуны (например, мыши и крысы). В некоторых вариантах осуществления изобретения индивидуум или субъект представляет собой человека.

II. Антигенсвязывающая молекула

Согласно одному из объектов настоящего изобретения оно основано, в частности, на открытии того факта, что различные виды активности антигенсвязывающей молекулы, которая содержит первый антигенсвязывающий домен и второй антигенсвязывающий домен, в которой антигенсвязывающие домены сцеплены друг с другом через одну или несколько связей, повышены или понижены по сравнению с контрольной антигенсвязывающей молекулой, содержащей антигенсвязывающие домены, которые не сцеплены или сцеплены через меньшее количество связей. В некоторых вариантах осуществления изобретения предложена антигенсвязывающая молекула, которая обладает активностью, удерживающей две антигенные молекулы в пространственно близких положениях. Антигенсвязывающая молекула, представленная в настоящем описании, является ценной, например, поскольку она может регулировать активацию двух антигенных молекул, которые активируются путем ассоциации друг с другом. В некоторых других вариантах осуществления изобретения предложена антигенсвязывающая молекула, которая имеет приобретенную устойчивость к расщеплению протеазой в результате сцепления между антигенсвязывающими доменами.

А. Приведенные в качестве примера антигенсвязывающие молекулы

Структуры антигенсвязывающих молекул

Одним из объектов настоящего изобретения является антигенсвязывающая молекула, которая содержит первый антигенсвязывающий домен и второй антигенсвязывающий домен и в которой антигенсвязывающие домены сцеплены друг с другом через одну или несколько связей.

Согласно одному из вариантов осуществления указанных выше объектов изобретения по меньшей мере одна или несколько связей, соединяющих два антигенсвязывающих домена, представляет(ют) собой ковалентную связь. В некоторых вариантах осуществления изобретения ковалентная связь образуется путем непосредственного перекрестного сшивания аминокислотного остатка в первом антигенсвязывающем домене и аминокислотного остатка во втором антигенсвязывающем домене. Перекрестно сшитые аминокислотные остатки представляют собой, например цистеин, а образовавшаяся ковалентная связь представляет собой, например, дисульфидную связь.

В некоторых других вариантах осуществления изобретения ковалентная связь образуется путем перекрестного сшивания аминокислотного остатка в первом антигенсвязывающем домене и аминокислотного остатка во втором антигенсвязывающем домене через перекрестносшивающий агент.

Перекрестносшивающий агент представляет собой, например, аминореактивный перекрестносшивающий агент, а перекрестно сшитые аминокислотные остатки представляют собой, например, лизин.

Согласно одному из вариантов осуществления указанных выше объектов изобретения по меньшей мере одна из одной или нескольких связей, соединяющих антигенсвязывающие домены, представляет собой нековалентную связь. В некоторых вариантах осуществления изобретения нековалентная связь представляет собой ионную связь, водородную связь или гидрофобную связь.

Ионная связь образуется, например, между кислой аминокислотой и основной аминокислотой. Кислая аминокислота представляет собой, например, аспарагиновую кислоту (Asp) или глутаминовую кислоту (Glu). аминокислота представляет собой, например, гистидин (His), лизин (Lys) или аргинин (Arg).

Аминокислотные остатки, из которых создаются связи между антигенсвязывающими доменами (связи, которые соединяют два антигенсвязывающих домена) соответственно, присутствуют в первом и втором антигенсвязывающих доменах, и связи между антигенсвязывающими доменами образуются путем сцепления указанных аминокислотных остатков. Согласно одному из вариантов осуществления указанных выше объектов изобретения по меньшей мере один из аминокислотных остатков, из которого создается связь между антигенсвязывающими доменами, представляет собой искусственно интродуцированный мутантный аминокислотный остаток, например, представляют собой искусственно интродуцированный остаток цистеина. Указанный мутантный аминокислотный остаток можно интродуцировать в антигенсвязывающий домен дикого типа, например, методом аминокислотной замены. В настоящем описании указаны сайты аминокислотных остатков, из которых может создаваться связь между антигенсвязывающими доменами, для каждого из следующих компонентов: СН1, CL и шарнирные области в качестве константных областей и VH-, VL- и VHH-области в качестве вариабельных областей, когда антигенсвязывающие домены содержат, например, фрагмент антитела, и, например, остатки цистеина можно интродуцировать в указанные сайты.

Согласно одному из вариантов осуществления указанных выше объектов изобретения по меньшей мере один из первого и второго антигенсвязывающих доменов сам по себе обладает способностью связываться с антигеном (т.е. один антигенсвязывающий домен независимо от другого обладает антигенсвязывающей активностью). В некоторых вариантах осуществления изобретения каждый из первого и второго антигенсвязывающих домен сам по себе обладает способностью связываться с антигеном.

Согласно одному из вариантов осуществления указанных выше объектов изобретения первый и второй антигенсвязывающие домены оба представляют собой антигенсвязывающие домены одного типа. Как указано ниже, примеры белков, которые образуют антигенсвязывающие домены, включают полипептиды, имеющие происхождение из антитела или белка, не являющегося антителом, и их фрагменты (например, Fab, Fab', scFab, Fv, scFv и однодоменное антитело). С учетом указанных молекулярных форм, когда структуры белков, образующих первый и второй антигенсвязывающие домены, являются идентичными, антигенсвязывающие домены рассматриваются как относящиеся к одному и тому же типу.

Согласно одному из вариантов осуществления указанных выше объектов изобретения по меньшей мере одна связь, которая соединяет первый антигенсвязывающий домен и второй антигенсвязывающий домен, может образовываться путем сцепления друг с другом аминокислотных остатков, присутствующих в одном и том же положении в первом антигенсвязывающем домене и во втором антигенсвязывающем домене, или она может образовываться путем сцепления друг с другом аминокислотных остатков, присутствующих соответственно в различных положениях.

Положения аминокислотных остатков в антигенсвязывающем домене можно указывать согласно нумерации по Кэботу или системе EU-нумерации (которую обозначают также как EU-индекс), описанной у Kabat и др., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5-ое изд., изд-во Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991. Например, если аминокислотные остатки, из которых создается связи между первым и вторым антигенсвязывающими доменами, присутствуют в идентичном положении в антигенсвязывающих доменах соответственно, то положение указанных аминокислотных остатков может быть обозначено под одинаковым номером согласно нумерации по Кэботу или системе EU-нумерации. Альтернативно этому, если аминокислотные остатки, из которых создается связи между первым и вторым антигенсвязывающими доменами, присутствуют в различных положениях в антигенсвязывающих доменах соответственно, то положения указанных аминокислотных остатков могут быть обозначены под различными номерами согласно нумерации по Кэботу или системе EU-нумерации.

Согласно одному из вариантов осуществления указанных выше объектов изобретения по меньшей мере один из первого и второго антигенсвязывающих доменов содержит фрагмент антитела, который связывается с конкретным антигеном. В некоторых вариантах осуществления изобретения фрагмент антитела представляет собой Fab, Fab', scFab, Fv, scFv или однодоменное антитело. В некоторых вариантах осуществления изобретения по меньшей мере один из аминокислотных остатков, из которых создаются связи между антигенсвязывающими доменами, присутствует во фрагменте антитела.

Согласно одному из вариантов осуществления указанных выше объектов изобретения по меньшей мере один из аминокислотных остатков, из которых создаются связи между антигенсвязывающими доменами, присутствует в константной области. В некоторых вариантах осуществления изобретения аминокислотный остаток присутствует в CH1-участке, и, например, он присутствует в CH1-участке в любом из положений от 119 до 123, от 131 до 140, от 148 до 150, от 155 до 167, от 174 до 178, от 188 до 197, от 201 до 214 и от 218 до 219 согласно EU-нумерации. В некоторых вариантах осуществления изобретения аминокислотный остаток присутствует в СН1-участке в положении, выбранном из группы, которая состоит из положений 119, 122, 123, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 148, 150, 155, 156, 157, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 167, 174, 176, 177, 178, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 201, 203, 205, 206, 207, 208, 211, 212, 213, 214, 218 и 219 согласно EU-нумерации. В некоторых вариантах осуществления изобретения аминокислотный остаток присутствует в CH1-участке в положении 134, 135, 136, 137, 191, 192, 193, 194, 195 или 196 согласно EU-нумерации. В некоторых вариантах осуществления изобретения аминокислотный остаток присутствует в CH1-участке в положении 135, 136 или 191 согласно EU-нумерации.

Согласно одному из вариантов осуществления указанных выше объектов изобретения константная область имеет происхождение из человеческого антитела. В некоторых вариантах осуществления изобретения константная область тяжелой цепи относится к любому из подклассов IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgM, IgD и IgE. В некоторых вариантах осуществления изобретения CH1-участок относится к любому из подклассов γ1, γ2, γ3, γ4, α1, α2, μ, δ и λ.

Согласно одному из вариантов осуществления указанных выше объектов изобретения по меньшей мере одна связь, которая соединяет первый антигенсвязывающий домен и второй антигенсвязывающий домен, образуется путем сцепления аминокислотного остатка в СН1-участке первого антигенсвязывающего домена и аминокислотного остатка в СН1-участке второго антигенсвязывающего домена. В некоторых вариантах осуществления изобретения аминокислотные остатки в первом антигенсвязывающем домене и втором антигенсвязывающем домене выбраны каждый независимо друг от друга группы, состоящей из положений 119, 120, 121, 122 и 123 согласно EU-нумерации. В некоторых вариантах осуществления изобретения аминокислотные остатки в первом антигенсвязывающем домене и втором антигенсвязывающем домене выбраны каждый независимо друг от друга из группы, состоящей из положений 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139 и 140 согласно EU-нумерации. В некоторых вариантах осуществления изобретения аминокислотные остатки в первом антигенсвязывающем домене и втором антигенсвязывающем домене выбраны каждый независимо друг от друга из группы, состоящей из положений 148, 149 и 150 согласно EU-нумерации. В некоторых вариантах осуществления изобретения аминокислотные остатки в первом антигенсвязывающем домене и втором антигенсвязывающем домене выбраны каждый независимо друг от друга из группы, состоящей из положений 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166 и 167 согласно EU-нумерации. В некоторых вариантах осуществления изобретения аминокислотные остатки в первом антигенсвязывающем домене и втором антигенсвязывающем домене выбраны каждый независимо друг от друга из группы, состоящей из положений 174, 175, 176, 177 и 178 согласно EU-нумерации. В некоторых вариантах осуществления изобретения аминокислотные остатки в первом антигенсвязывающем домене и втором антигенсвязывающем домене выбраны каждый независимо друг от друга из группы, состоящей из положений 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196 и 197 согласно EU-нумерации. В некоторых вариантах осуществления изобретения аминокислотные остатки в первом антигенсвязывающем домене и втором антигенсвязывающем домене выбраны каждый независимо друг от друга из группы, состоящей из положений 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213 и 214 согласно EU-нумерации. В некоторых вариантах осуществления изобретения аминокислотные остатки в первом антигенсвязывающем домене и втором антигенсвязывающем домене выбраны каждый независимо друг от друга из группы, состоящей из положений 218 и 219 согласно EU-нумерации.

Согласно одному из вариантов осуществления указанных выше объектов изобретения разница между положениями аминокислотных остатков, из которых создаются связи, в каждом из первого антигенсвязывающего домена и второго антигенсвязывающего домена составляет три аминокислоты или менее. Это означает, что, когда положение аминокислотного остатка, из которого создается связь в CH1-участке первого антигенсвязывающего домена, и положение аминокислотного остатка, из которого создается связь в СН1-участке второго антигенсвязывающего домена, сравнивают соответственно согласно EU-нумерации, то они отличаются на три аминокислоты или менее. В некоторых вариантах осуществления изобретения по меньшей мере одна связь, которая соединяет первый антигенсвязывающий домен и второй антигенсвязывающий домен, образуется путем сцепления аминокислотного остатка в положении 135 согласно EU-нумерации в CH1-участке первого антигенсвязывающего домена и аминокислотного остатка в любом из положений 132-138 согласно EU-нумерации в СН1-участке второго антигенсвязывающего домена. В некоторых вариантах осуществления изобретения по меньшей мере одна связь, которая соединяет первый антигенсвязывающий домен и второй антигенсвязывающий домен, образуется путем сцепления аминокислотного остатка в положении 136 согласно EU-нумерации в CH1-участке первого антигенсвязывающего домена и аминокислотного остатка в любом из положений 133-139 согласно EU-нумерации в CH1-участке второго антигенсвязывающего домена.

В некоторых вариантах осуществления изобретения по меньшей мере одна связь, которая соединяет первый антигенсвязывающий домен и второй антигенсвязывающий домен, образуется путем сцепления аминокислотного остатка в положении 191 согласно EU-нумерации в СН1-участке первого антигенсвязывающего домена и аминокислотного остатка в любом из положений 188-194 согласно EU-нумерации в CH1-участке второго антигенсвязывающего домена.

В приведенном в качестве примера варианте осуществления изобретения по меньшей мере одна связь, которая соединяет первый антигенсвязывающий домен и второй антигенсвязывающий домен, образуется путем сцепления друг с другом аминокислотных остатков в положении 135 согласно EU-нумерации в СН1-участках двух антигенсвязывающих доменов. В приведенном в качестве примера варианте осуществления изобретения по меньшей мере одна связь, которая соединяет первый антигенсвязывающий домен и второй антигенсвязывающий домен, образуется путем сцепления друг с другом аминокислотных остатков в положении 136 согласно EU-нумерации в СН1-участках двух антигенсвязывающих доменов. В приведенном в качестве примера варианте осуществления изобретения по меньшей мере одна связь, которая соединяет первый антигенсвязывающий домен и второй антигенсвязывающий домен, образуется путем сцепления друг с другом аминокислотных остатков в положении 191 согласно EU-нумерации в CH1-участках двух антигенсвязывающих доменов.

Согласно одному из вариантов осуществления указанных выше объектов изобретения по меньшей мере один из аминокислотных остатков, из которых создаются связи между антигенсвязывающими доменами, присутствует в CL-области и, например, присутствует в CL-области. в любом из положений 108-112, 121-128, 151- 156, 184-190, 195-196, 200-203 и 208-213 согласно нумерации по Кэботу. В некоторых вариантах осуществления изобретения аминокислотный остаток присутствует в CL-области в положении, выбранном из группы, которая состоит из положений 108, 109, 112, 121, 123, 126, 128, 151, 152, 153, 156,184, 186, 188, 189, 190, 195, 196, 200, 201, 202, 203, 208, 210, 211, 212 и 213 согласно нумерации по Кэботу. В некоторых вариантах осуществления изобретения аминокислотный остаток присутствует в CL-области в положении 126 согласно нумерации по Кэботу.

Согласно одному из вариантов осуществления указанных выше объектов изобретения константная область имеет происхождение из человеческого антитела. В некоторых вариантах осуществления изобретения CL-область относится к подклассу к или X.

Согласно одному из вариантов осуществления указанных выше объектов изобретения по меньшей мере одна связь, которая соединяет первый антигенсвязывающий домен и второй антигенсвязывающий домен, образуется путем сцепления аминокислотного остатка в CL-области первого антигенсвязывающего домена и аминокислотного остатка в CL-области второго антигенсвязывающего домена. В некоторых вариантах осуществления изобретения аминокислотные остатки в первом антигенсвязывающем домене и втором антигенсвязывающем домене выбраны каждый независимо друг от друга из группы, состоящей из положений 108, 109, 110, 111 и 112 согласно нумерации по Кэботу. В некоторых вариантах осуществления изобретения аминокислотные остатки в первом антигенсвязывающем домене и втором антигенсвязывающем домене выбраны каждый независимо друг от друга из группы, состоящей из положений 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127 и 128 согласно нумерации по Кэботу. В некоторых вариантах осуществления изобретения аминокислотные остатки в первом антигенсвязывающем домене и втором антигенсвязывающем домене выбраны каждый независимо друг от друга из группы, состоящей из положений 151, 152, 153, 154, 155 и 156 согласно нумерации по Кэботу. В некоторых вариантах осуществления изобретения аминокислотные остатки в первом антигенсвязывающем домене и втором антигенсвязывающем домене выбраны каждый независимо друг от друга из группы, состоящей из положений 184, 185, 186, 187, 188, 189 и 190 согласно нумерации по Кэботу. В некоторых вариантах осуществления изобретения аминокислотные остатки в первом антигенсвязывающем домене и втором антигенсвязывающем домене выбраны каждый независимо друг от друга из группы, состоящей из положений 195 и 196 согласно нумерации по Кэботу. В некоторых вариантах осуществления изобретения аминокислотные остатки в первом антигенсвязывающем домене и втором антигенсвязывающем домене выбраны каждый независимо друг от друга из группы, состоящей из положений 200, 201, 202 и 203 согласно нумерации по Кэботу. В некоторых вариантах осуществления изобретения аминокислотные остатки в первом антигенсвязывающем домене и втором антигенсвязывающем домене выбраны каждый независимо друг от друга из группы, состоящей из положений 208, 209, 210, 211, 212 и 213 согласно нумерации по Кэботу.

Согласно одному из вариантов осуществления указанных выше объектов изобретения разница между положениями аминокислотных остатков, из которых создаются связи, в каждом из первого антигенсвязывающего домена и второго антигенсвязывающего домена составляет три аминокислоты или менее. Это означает, что, когда положение аминокислотного остатка, из которого создаются связи в CL-области первого антигенсвязывающего домена, и положение аминокислотного остатка, из которого создаются связи в CL-области второго антигенсвязывающего домена, сравнивают соответственно согласно EU-нумерации, то различие составляет три аминокислоты или менее. В приведенном в качестве примера варианте осуществления изобретения по меньшей мере одна связь, которая соединяет первый антигенсвязывающий домен и второй антигенсвязывающий домен, образуется путем сцепления друг с другом аминокислотных остатков в положении 126 согласно нумерации по Кэботу в CL-областях двух антигенсвязывающих доменов.

Согласно одному из вариантов осуществления указанных выше объектов изобретения по меньшей мере одна связь, которая соединяет первый антигенсвязывающий домен и второй антигенсвязывающий домен, образуется путем сцепления аминокислотного остатка в СН1-участке первого антигенсвязывающего домена и аминокислотного остатка в CL-области второго антигенсвязывающего домена. В некоторых вариантах осуществления изобретения аминокислотные остатки в СН1-участке первого антигенсвязывающего домена выбраны из группы, которая состоит из положений 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196 и 197 согласно EU-нумерации, а аминокислотные остатки в CL-области второго антигенсвязывающего домена выбраны из группы, которая состоит из положений 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127 и 128 согласно нумерации по Кэботу. В приведенном в качестве примера варианте осуществления изобретения по меньшей мере одна связь, которая соединяет первый антигенсвязывающий домен и второй антигенсвязывающий домен, образуется путем сцепления аминокислотного остатка в положении 191 согласно EU-нумерации в СН1-участке первого антигенсвязывающего домена и аминокислотного остатка в положении 126 согласно нумерации по Кэботу в CL-области второго антигенсвязывающего домена.

Согласно одному из вариантов осуществления указанных выше объектов изобретения по меньшей мере один из аминокислотных остатков, из которых создаются связи между антигенсвязывающими доменами, присутствует в вариабельной области. В некоторых вариантах осуществления изобретения аминокислотный остаток присутствует в VH-области, и, например, присутствует в VH-области в положении, выбранном из группы, которая состоит из положений 6, 8, 16, 20, 15, 26, 28, 74 и 82b согласно нумерации по Кэботу. В некоторых вариантах осуществления изобретения аминокислотный остаток присутствует в VL-области, и, например, присутствует в VL-области (подкласса к) в положениях, выбранных из группы, которая состоит из положений 21, 27, 58, 77, 100, 105 и 107 согласно нумерации по Кэботу, и VL-области (подкласса 7,) в положениях 6, 19, 33 и 34 согласно нумерации по Кэботу. В некоторых вариантах осуществления изобретения аминокислотный остаток присутствует в VHH-области, и, например, присутствует в VHH-области в положении, выбранном из группы, которая состоит из положений 4, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15, 17, 20, 24, 27, 29, 38, 39, 40, 41, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 67, 69, 71, 78, 80, 82, 82с, 85, 88, 91, 93, 94 и 107 согласно нумерации по Кэботу.

Согласно одному из вариантов осуществления указанных выше объектов изобретения по меньшей мере один из первого и второго антигенсвязывающих доменов содержит не являющийся антителом белок, связывающийся с конкретным антигеном, или его фрагмент. В некоторых вариантах осуществления изобретения не являющийся антителом белок представляет собой любой из пары лиганд и рецептор, которые специфически связываются друг с другом. Указанные рецепторы включают, например, рецепторы, принадлежащие к суперсемействам рецепторов цитокинов, рецепторов, сопряженных с G-белком, рецепторов ионных каналов, тирозинкиназных рецепторов, рецепторов иммунных чекпоинтов, рецепторов антигенов, CD-антигенов, костимуляторных молекул и молекул клеточной адгезии.

Согласно одному из вариантов осуществления указанных выше объектов изобретения первый и/или второй антигенсвязывающие домены содержат шарнирную область. В некоторых вариантах осуществления изобретения по меньшей мере один из остатков цистеина, присутствующих в шарнирной области дикого типа, замене на другой аминокислотный остаток. Указанные остатки цистеина присутствуют в шарнирной области дикого типа, например, в положениях 226 и/или 229 согласно EU-нумерации. В некоторых вариантах осуществления изобретения по меньшей мере один из аминокислотных остатков, из которых создаются связи между антигенсвязывающими доменами, присутствует в шарнирной области, и, например, присутствует в шарнирной области в положении, выбранном из группы, которая состоит из положений 216, 218 и 219 согласно EU-нумерации.

Согласно одному из вариантов осуществления указанных выше объектов изобретения первый антигенсвязывающий домен и второй антигенсвязывающий домен сцеплены друг с другом через две или большее количество связей.

В некоторых вариантах осуществления изобретения по меньшей мере один из аминокислотных остатков, из которых создаются связи между антигенсвязывающими доменами, представляет собой аминокислотный остаток, который присутствует в последовательности дикого типа, и, например, представляет собой остаток цистеина в шарнирной области дикого типа. В некоторых вариантах осуществления изобретения по меньшей мере одна из связей, которая соединяет друг с другом первый антигенсвязывающий домен и второй антигенсвязывающий домен, представляет собой дисульфидную связь, образованную путем перекрестного сшивания друг с другом остатков цистеина, которые присутствуют в шарнирных областях дикого типа. Указанные остатки цистеина в шарнирной области дикого типа присутствуют, например, в положениях 226 и/или 229 согласно EU-нумерации.

В некоторых вариантах осуществления изобретения по меньшей мере один из аминокислотных остатков, из которых создаются связи между антигенсвязывающими доменами, присутствует во фрагменте антитела, и по меньшей мере один присутствует в шарнирной области. В приведенном в качестве примера варианте осуществления изобретения антигенсвязывающая молекула, указанная в настоящем описании, представляет собой F(ab')2, в которой и первый, и второй антигенсвязывающие домены содержат Fab и шарнирную область.

Согласно одному из вариантов осуществления указанных выше объектов изобретения антигенсвязывающая молекула, указанная в настоящем описании, дополнительно содержит Fc-область и, например, представляет собой полноразмерное антитело. В некоторых вариантах осуществления изобретения одна или несколько мутаций, способствующих мультимеризации Fc-областей, интродуцированы в Fc-область антигенсвязывающей молекулы, указанной в настоящем описании. Указанные аминокислотные мутации включают, например, аминокислотные мутации по меньшей мере в одном положении, выбранном из группы, которая состоит из положений 247, 248, 253, 254, 310, 311, 338, 345, 356, 359, 382, 385, 386, 430, 433, 434, 436, 437, 438, 439, 440 и 447 согласно EU-нумерации (см., например, WO 2016/164480). В некоторых вариантах осуществления изобретения мультимеризация представляет собой гексамеризацию.

Антигены, которые связываются антигенсвязывающими молекулами

Согласно одному из вариантов осуществления указанных выше объектов изобретения и первый, и второй антигенсвязывающие домены оба связываются с одним и тем же антигеном. В некоторых вариантах осуществления изобретения и первый, и второй антигенсвязывающие домены оба связываются с одним и тем же эпитопом на одном и том же антигене. В некоторых других вариантах осуществления изобретения первый и второй антигенсвязывающие домены каждый связывается с отличающимся от другого эпитопом на одном и том же антигене. В некоторых вариантах осуществления изобретения антигенсвязывающая молекула, указанная в настоящем описании, представляет собой бипаратопную антигенсвязывающую молекулу (например, бипаратопное антитело), мишенью которой является один конкретный антиген.

Согласно другому варианту осуществления указанных выше объектов изобретения первый и второй антигенсвязывающие домены каждый связывается с отличающимся от другого антигеном.

Согласно другому варианту осуществления указанных выше объектов изобретения антигенсвязывающая молекула, указанная в настоящем описании, представляет собой «прижимающую» антигенсвязывающую молекулу (например, «прижимающее» антитело). В контексте настоящего описания «прижимающая» антигенсвязывающая молекула означает антигенсвязывающую молекулу, которая связывается с комплексом антиген/антигенсвязывающая молекула, сформированным между данным антигеном А и антигенсвязывающей молекулой, связывающейся с антигеном А, и которая тем самым повышает связывающую активность в отношении антигена А антигенсвязывающей молекулы, которая связывается с антигеном А (или альтернативно этому стабилизирует комплекс антиген/антигенсвязывающая молекула, сформированный антигеном А и антигенсвязывающей молекулой, которая связывается с антигеном А). Например, CD3-«прижимающее» антитело специфически связывается с комплексом антиген-антитело, сформированным между CD3 и антителом с пониженной связывающей способностью в отношении CD3 (антитело с ослабленным связыванием CD3), и тем самым может повышать связывающую активность антитела с ослабленным связыванием CD3 в отношении CD3 (или альтернативно этому стабилизирует комплекс антиген-антитело, сформированный CD3 и антителом с ослабленным связыванием CD3). В некоторых вариантах осуществления изобретения первый и/или второй антигенсвязывающие домены в антигенсвязывающей молекуле, указанной в настоящем описании, могут представлять собой антигенсвязывающие домены («прижимающие» антигенсвязывающие домены) из «прижимающих» антигенсвязывающих молекул.

Согласно одному из вариантов осуществления указанных выше объектов изобретения и первый, и второй антигенсвязывающие домены оба имеют одинаковую аминокислотную последовательность. В другом варианте осуществления изобретения первый и второй антигенсвязывающие домены каждый имеет отличающуюся от другого аминокислотную последовательность.

Согласно одному из вариантов осуществления указанных выше объектов изобретения по меньшей мере один из двух антигенов, с которыми связываются первый и второй антигенсвязывающие домены, представляет собой растворимый белок или мембранный белок.

Функции антигенсвязывающих молекул

Согласно одному из вариантов осуществления указанных выше объектов изобретения антигенсвязывающая молекула, указанная в настоящем описании, обладает активностью, удерживающей две антигенные молекулы в пространственно близких положениях. В некоторых вариантах осуществления изобретения антигенсвязывающая молекула, указанная в настоящем описании, обладает способностью удерживать две антигенные молекулы в более близких положениях, чем контрольная антигенсвязывающая молекула, и контрольная антигенсвязывающая молекула отличается от антигенсвязывающей молекулы, указанной в настоящем описании, только тем, что контрольная антигенсвязывающая молекула имеет на одну связь меньше между двумя антигенсвязывающими доменами. В другом варианте осуществления изобретения указанную одну связь, на которую уменьшено количество связей, можно выбирать из связей, в которых аминокислотные остатки, из которых создаются связи между антигенсвязывающими доменами, имеют происхождение из мутантных аминокислотных остатков, которые не присутствуют в Fab или шарнирной области дикого типа (например, остатков цистеина, которые не присутствуют Fab или шарнирной области дикого типа).

В другом варианте осуществления указанных выше объектов изобретения антигенсвязывающая молекула, указанная в настоящем описании, обладает активностью, регулирующей взаимодействие между двумя антигенными молекулами. Не вдаваясь в конкретную теорию, можно предположить, что активность, регулирующая взаимодействие, является результатом удерживания двух антигенных молекул в пространственно более близких положениях с помощью антигенсвязывающей молекулы, указанной в настоящем описании. В некоторых вариантах осуществления изобретения антигенсвязывающая молекула, указанная в настоящем описании, обладает способностью усиливать или ослаблять взаимодействие между двумя антигенными молекулами по сравнению с контрольной антигенсвязывающей молекулой, и контрольная антигенсвязывающая молекула отличается от антигенсвязывающей молекулы, указанной в настоящем описании, только тем, что контрольная антигенсвязывающая молекула имеет на одну связь меньше между двумя антигенсвязывающими доменами. В другом варианте осуществления изобретения указанную одну связь, на которую уменьшено количество связей, можно выбирать из связей, в которых аминокислотные остатки, из которых создаются связи между антигенсвязывающими доменами, имеют происхождение из мутантных аминокислотных остатков, которые не присутствуют в Fab или шарнирной области дикого типа (например, остатков цистеина, которые не присутствуют в Fab или шарнирной области дикого типа).

В некоторых вариантах осуществления изобретения две антигенные молекулы, связанные с помощью антигенсвязывающей молекулы, указанной в настоящем описании, представляют собой лиганд и его рецептор соответственно, и антигенсвязывающая молекула, указанная в настоящем описании, обладает активностью, способствующей активации рецептора лигандом. В другом конкретном варианте осуществления изобретения две антигенные молекулы, связанные с помощью антигенсвязывающей молекулы, указанной в настоящем описании, представляют собой фермент и его субстрат соответственно, и антигенсвязывающая молекула, указанная в настоящем описании, обладает активностью, способствующей каталитической реакции фермента с его субстратом.

Кроме того, в других конкретных вариантах осуществления изобретения две антигенные молекулы, связанные с помощью антигенсвязывающей молекулы, указанной в настоящем описании, обе представляют собой антигены (например, белки), присутствующие на клеточных поверхностях, и антигенсвязывающая молекула, указанная в настоящем описании, обладает активностью, способствующей взаимодействию между клеткой, которая экспрессирует первый антиген, и клеткой, которая экспрессирует второй антиген. Например, клетка, экспрессирующая первый антиген, и клетка, экспрессирующая второй антиген, представляют собой клетку с цитотоксической активностью и ее клетку-мишень соответственно, и антигенсвязывающая молекула, указанная в настоящем описании, усиливает повреждение клетки-мишени клеткой с цитотоксической активностью. Клетка с цитотоксической активностью представляет собой, например, Т-клетку, NK-клетку, моноцит или макрофаг.

Согласно одному из вариантов осуществления указанных выше объектов изобретения антигенсвязывающая молекула, указанная в настоящем описании, обладает активностью, регулирующей активацию двух антигенных молекул, которые активируются путем ассоциации друг с другом. Не вдаваясь в конкретную теорию, можно предположить, что активность, регулирующая активацию, является результатом удерживания двух антигенных молекул в пространственно более близких положениях с помощью антигенсвязывающей молекулы, указанной в настоящем описании. В некоторых вариантах осуществления изобретения антигенсвязывающая молекула, указанная в настоящем описании, может обладать способностью усиливать или ослаблять активацию двух антигенных молекул по сравнению с контрольной антигенсвязывающей молекулой, и контрольная антигенсвязывающая молекула отличается от антигенсвязывающей молекулы, указанной в настоящем описании, только тем, что контрольная антигенсвязывающая молекула имеет на одну связь меньше между двумя антигенсвязывающими доменами. В другом варианте осуществления изобретения указанную одну связь, на которую уменьшено количество связей, можно выбирать из связей, в которых аминокислотные остатки, из которых создаются связи между антигенсвязывающими доменами, имеют происхождение из мутантных аминокислотных остатков, которые не присутствуют в Fab или шарнирной области дикого типа (например, остатков цистеина, которые не присутствуют в Fab или шарнирной области дикого типа). Например, указанные антигенные молекулы выбирают из группы, которая состоит из рецепторов, принадлежащих к суперсемействам рецепторов цитокинов, рецепторов, сопряженных с G-белком, рецепторов ионных каналов, тирозинкиназных рецепторов, рецепторов иммунных чекпоинтов, рецепторов антигенов, CD-антигенов, костимуляторных молекул и молекул клеточной адгезии.

Согласно одному из вариантов осуществления указанных выше объектов изобретения в антигенсвязывающей молекуле, указанной в настоящем описании, два антигенсвязывающих домена присутствуют в пространственно близких положениях и/или подвижность двух антигенсвязывающих доменов уменьшена. В некоторых вариантах осуществления изобретения по сравнению с контрольной антигенсвязывающей молекулой антигенсвязывающая молекула, указанная в настоящем описании, имеет два антигенсвязывающих домена, которые присутствуют в более близких положениях, и/или подвижность двух антигенсвязывающих доменов является более низкой, и контрольная антигенсвязывающая молекула отличается от антигенсвязывающей молекулы, указанной в настоящем описании, только тем, что она имеет на одну связь меньше между двумя антигенсвязывающими доменами. В другом варианте осуществления изобретения указанную одну связь, на которую уменьшено количество связей, можно выбирать из связей, в которых аминокислотные остатки, из которых создаются связи между антигенсвязывающими доменами, имеют происхождение из мутантных аминокислотных остатков, которые не присутствуют в Fab или шарнирной области дикого типа (например, остатков цистеина, которые не присутствуют в Fab или шарнирной области дикого типа).

Согласно одному из вариантов осуществления указанных выше объектов изобретения антигенсвязывающая молекула, указанная в настоящем описании, обладает устойчивостью к расщеплению протеазой. В некоторых вариантах осуществления изобретения антигенсвязывающая молекула, указанная в настоящем описании, обладает более высокой устойчивостью к расщеплению протеазой по сравнению с контрольной антигенсвязывающей молекулой, и контрольная антигенсвязывающая молекула отличается от антигенсвязывающей молекулы, указанной в настоящем описании, только тем, что контрольная антигенсвязывающая молекула имеет на одну связь меньше между двумя антигенсвязывающими доменами. В другом варианте осуществления изобретения указанную одну связь, на которую уменьшено количество связей, можно выбирать из связей, в которых аминокислотные остатки, из которых создаются связи между антигенсвязывающими доменами, имеют происхождение из мутантных аминокислотных остатков, которые не присутствуют в Fab или шарнирной области дикого типа (например, остатков цистеина, которые не присутствуют в Fab или шарнирной области дикого типа). В некоторых вариантах осуществления изобретения в антигенсвязывающей молекуле, указанной в настоящем описании, доля полноразмерной молекулы (например, полноразмерной IgG-молекулы), сохраняющейся после обработки протеазой, возрастает по сравнению с контрольной антигенсвязывающей молекулой. В некоторых вариантах осуществления изобретения в антигенсвязывающей молекуле, указанной в настоящем описании, доля конкретного фрагмента (например, Fab-мономера), образовавшегося после обработки протеазой, снижается по сравнению с контрольной антигенсвязывающей молекулой.

Согласно одному из вариантов осуществления указанных выше объектов изобретения, когда антигенсвязывающую молекулу, указанную в настоящем описании, обрабатывают протеазой, то вырезается димер антигенсвязывающих доменов или их фрагментов (например, перекрестно сшитый Fab-димер). В некоторых вариантах осуществления изобретения, когда контрольную антигенсвязывающую молекулу, которая отличается от антигенсвязывающей молекулы, указанной в настоящем описании, только тем, что она имеет на одну связь меньше между двумя антигенсвязывающими доменами, обрабатывают протеазой, то вырезаются мономеры антигенсвязывающих доменов или их фрагментов. В другом варианте осуществления изобретения указанную одну связь, на которую уменьшено количество связей, можно выбирать из связей, в которых аминокислотные остатки, из которых создаются связи между антигенсвязывающими доменами, имеют происхождение из мутантных аминокислотных остатков, которые не присутствуют в Fab или шарнирной области дикого типа (например, остатков цистеина, которые не присутствуют в Fab или шарнирной области дикого типа). В указанных вариантах осуществления изобретения протеаза может расщеплять шарнирную область антигенсвязывающей молекулы.

В другом варианте осуществления изобретения контрольная антигенсвязывающая молекула отличается от антигенсвязывающей молекулы, указанной в настоящем описании, только тем, что она имеет на одну связь меньше между двумя антигенсвязывающими доменами, и одна связь, на которую уменьшено количество связей, представляет собой связь, которая исходно образуется из мутантных аминокислотных остатков. Мутантные аминокислотные остатки представляют собой, например, искусственно интродуцированные остатки цистеина.

Фармацевтические композиции

Одним из объектов настоящего изобретения является фармацевтическая композиция, которая содержит антигенсвязывающую молекулу, указанную в настоящем описании, и фрамацевтически приемлемый носитель.

Применение антигенсвязывающих молекул

Одним из объектов настоящего изобретения является способ удерживания двух антигенных молекул в пространственно близких положениях, включающий

(а) получение антигенсвязывающей молекулы, содержащей два антигенсвязывающих домена,

(б) добавление к антигенсвязывающей молекуле по меньшей мере одной связи, которая соединяет два антигенсвязывающих домена друг с другом, и

(в) приведение в контакт антигенсвязывающей молекулы, полученной в подпункте (б), с двумя антигенными молекулами. В некоторых вариантах осуществления изобретения два антигенсвязывающих домена в антигенсвязывающей молекуле, указанной выше в подпункте (а), могут быть сцеплены друг с другом через одну или несколько связей, и в этом случае некоторые или все из одной или нескольких связей представляют собой связи, в которых аминокислотные остатки, из которых создаются связи между антигенсвязывающими доменами, получают из аминокислотных остатков, которые присутствуют в Fab или шарнирной области дикого типа (например, остатков цистеина в шарнирной области). В другом варианте осуществления изобретения по меньшей одна связь, указанная выше в подпункте (б), представляет собой связь, в которой аминокислотные остатки, из которых создается связь между антигенсвязывающими доменами, получают из мутантных аминокислотных остатков; которые не присутствуют в Fab или шарнирной области дикого типа (например, остатков цистеина, которые не присутствуют Fab или шарнирной области дикого типа). В настоящем описании представлен также способ удерживания двух антигенных молекул в пространственно близких положениях, включающий приведение в контакт двух антигенных молекул с антигенсвязывающей молекулой или фармацевтической композицией, представленной в настоящем описании. В настоящем описании представлена также антигенсвязывающая молекула или фармацевтическая композиция, указанная в настоящем описании, предназначенная для применения для удерживания двух антигенных молекул в пространственно близких положениях.

Другим объектом настоящего изобретения является способ регуляции взаимодействия между двумя антигенными молекулами, включающий

(а) получение антигенсвязывающей молекулы, содержащей два антигенсвязывающих домена,

(б) добавление к антигенсвязывающей молекуле по меньшей мере одной связи, которая соединяет два антигенсвязывающих домена друг с другом, и

(в) приведение в контакт антигенсвязывающей молекулы, полученной в подпункте (б), с двумя антигенными молекулами. В некоторых вариантах осуществления изобретения два антигенсвязывающих домена в антигенсвязывающей молекуле, указанной выше в подпункте (а), могут быть сцеплены друг с другом через одну или несколько связей, и в этом случае некоторые или все из одной или нескольких связей представляют собой связи, в которых аминокислотные остатки, из которых создаются связи между антигенсвязывающими доменами, получены из аминокислотных остатков, которые присутствуют в Fab или шарнирной области дикого типа (например, остатков цистеина в шарнирной области). В другом варианте осуществления изобретения по меньшей одна связь, указанная выше в подпункте (б), представляет собой связь, в которой аминокислотные остатки, из которых создается связь между антигенсвязывающими доменами, получены из мутантных аминокислотных остатков, которые не присутствуют в Fab или шарнирной области дикого типа (например, остатков цистеина, которые не присутствуют в Fab или шарнирной области дикого типа). В настоящем описании представлен также способ регуляции взаимодействия между двумя антигенными молекулами, включающий приведение в контакт двух антигенных молекул с антигенсвязывающей молекулой или фармацевтической композицией, представленной в настоящем описании. В настоящем описании представлена также антигенсвязывающая молекула или фармацевтическая композиция, указанная в настоящем описании, предназначенная для применения для регуляции взаимодействия между двумя антигенными молекулами.

Другим объектом настоящего изобретения является способ регуляции активности двух антигенных молекул, которые активируется путем ассоциации друг с другом, включающий:

(а) получение антигенсвязывающей молекулы, содержащей два антигенсвязывающих домена,

(б) добавление к антигенсвязывающей молекуле по меньшей мере одной связи, которая соединяет два антигенсвязывающих домена друг с другом, и

(в) приведение в контакт антигенсвязывающей молекулы, полученной в подпункте (б), с двумя антигенными молекулами. В некоторых вариантах осуществления изобретения два антигенсвязывающих домена в антигенсвязывающей молекуле, указанной выше в подпункте (а), могут быть сцеплены друг с другом через одну или несколько связей, и в этом случае некоторые или все из одной или нескольких связей представляют собой связи, в которых аминокислотные остатки, из которых создаются связи между антигенсвязывающими доменами, получены из аминокислотных остатков, которые присутствуют в Fab или шарнирной области дикого типа (например, остатков цистеина в шарнирной области). В другом варианте осуществления изобретения по меньшей одна связь, указанная выше в подпункте (б), представляет собой связь, в которой аминокислотные остатки, из которых создается связь между антигенсвязывающими доменами, получены из мутантных аминокислотных остатков, которые не присутствуют в Fab или шарнирной области дикого типа (например, остатков цистеина, которые не присутствуют Fab или шарнирной области дикого типа). В настоящем описании представлен также способ регуляции активности двух антигенных молекул, которые активируется путем ассоциации друг с другом, включающий приведение в контакт двух антигенных молекул с антигенсвязывающей молекулой или фармацевтической композицией, представленной в настоящем описании. В настоящем описании представлена также антигенсвязывающая молекула или фармацевтическая композиция, активности двух антигенных молекул, которые активируется путем ассоциации друг с другом.

Следующим объектом настоящего изобретения является способ размещения двух антигенсвязывающих доменов в пространственно близких положениях и/или уменьшения подвижности двух антигенсвязывающих доменов, включающий:

(а) получение антигенсвязывающей молекулы, содержащей два антигенсвязывающих домена, и

(б) добавление к антигенсвязывающей молекуле по меньшей мере одной связи, которая соединяет два антигенсвязывающих домена друг с другом. В некоторых вариантах осуществления изобретения два антигенсвязывающих домена в антигенсвязывающей молекуле, указанной выше в подпункте (а), могут быть сцеплены друг с другом через одну или несколько связей, и в этом случае некоторые или все из одной или нескольких связей представляют собой связи, в которых аминокислотные остатки, из которых создаются связи между антигенсвязывающими доменами, получены из аминокислотных остатков, которые присутствуют в Fab или шарнирной области дикого типа (например, остатков цистеина в шарнирной области). В другом варианте осуществления изобретения по меньшей одна связь, указанная выше в подпункте (б), представляет собой связь, в которой аминокислотные остатки, из которых создается связь между антигенсвязывающими доменами, получены из мутантных аминокислотных остатков, которые не присутствуют в Fab или шарнирной области дикого типа (например, остатков цистеина, которые не присутствуют в Fab или шарнирной области дикого типа).

Кроме того, другим объектом настоящего изобретения является способ повышения устойчивости антигенсвязывающей молекулы к расщеплению протеазой, включающий:

(а) получение антигенсвязывающей молекулы, содержащей два антигенсвязывающих домена, и

(б) добавление к антигенсвязывающей молекуле по меньшей мере одной связи, которая соединяет два антигенсвязывающих домена друг с другом. В некоторых вариантах осуществления изобретения два антигенсвязывающих домена в антигенсвязывающей молекуле, указанной выше в подпункте (а), могут быть сцеплены друг с другом через одну или несколько связей, и в этом случае некоторые или все из одной или нескольких связей представляют собой связи, в которых аминокислотные остатки, из которых создаются связи между антигенсвязывающими доменами, получены из аминокислотных остатков, которые присутствуют в Fab или шарнирной области дикого типа (например, остатков цистеина в шарнирной области). В другом варианте осуществления изобретения по меньшей одна связь, указанная выше в подпункте (б), представляет собой связь, в которой аминокислотные остатки, из которых создается связь между антигенсвязывающими доменами, получены из мутантных аминокислотных остатков, которые не присутствуют в Fab или шарнирной области дикого типа (например, остатков цистеина, которые не присутствуют в Fab или шарнирной области дикого типа).

Антигенсвязывающая молекула, применяемая в указанных различных способах, может обладать характеристиками антигенсвязывающих молекул, указанными в настоящем описании.

Способ получения антигенсвязывающих молекул

Одним из объектов настоящего изобретения является способ получения антигенсвязывающей молекулы, которая обладает активностью, удерживающей две антигенные молекулы в пространственно близких положениях, включающий:

(а) получение нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, который содержит первый антигенсвязывающий домен, и нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, который содержит второй антигенсвязывающий домен,

(б) интродукцию мутации в нуклеиновые кислоты, которые кодируют два антигенсвязывающих домена, таким образом, чтобы происходило добавление по меньшей мере одной связи, соединяющей два антигенсвязывающих домена,

(в) интродукцию нуклеиновых кислот, полученных в подпункте (б), в клетку-хозяина,

(г) культивирование клетки-хозяина таким образом, чтобы происходила экспрессия двух полипептидов, и

(д) получение антигенсвязывающей молекулы, которая представляет собой полипептид, содержащий первый и второй антигенсвязывающие домены, в котором два антигенсвязывающих домена сцеплены друг с другом через одну или несколько связей. В некоторых вариантах осуществления изобретения каждый из двух антигенсвязывающих доменов, указанных выше в подпункте (а), может содержать один или несколько аминокислотных остатков, из которых создаются связи для сцепления двух антигенсвязывающих доменов, и в этом случае некоторые или все из одного или нескольких аминокислотных остатков, из которых создается связь между антигенсвязывающими доменами, представляют собой аминокислотные остатки, которые присутствуют в Fab или шарнирной области дикого типа (например, остатков цистеина в шарнирной области). В другом варианте осуществления изобретения по меньшей одна связь, указанная выше в подпункте (б), представляет собой связь, в которой аминокислотные остатки, из которых создается связь между антигенсвязывающими доменами, получены из мутантных аминокислотных остатков, которые не присутствуют в Fab или шарнирной области дикого типа (например, остатков цистеина, которые не присутствуют в Fab или шарнирной области дикого типа).

Другим объектом настоящего изобретения является способ получения антигенсвязывающей молекулы, которая обладает активностью, регулирующей взаимодействие между двумя антигенными молекулами, включающий:

(а) получение нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, который содержит первый антигенсвязывающий домен, и нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, который содержит второй антигенсвязывающий домен,

(б) интродукцию мутации в нуклеиновые кислоты, которые кодируют два антигенсвязывающих домена, таким образом, чтобы происходило добавление по меньшей мере одной связи, соединяющей два антигенсвязывающих домена,

(в) интродукцию нуклеиновых кислот, полученных в подпункте (б), в клетку-хозяина,

(г) культивирование клетки-хозяина таким образом, чтобы происходила экспрессия двух полипептидов, и

(д) получение антигенсвязывающей молекулы, которая представляет собой полипептид, содержащий первый и второй антигенсвязывающие домены, в котором два антигенсвязывающих домена сцеплены друг с другом через одну или несколько связей. В некоторых вариантах осуществления изобретения каждый из двух антигенсвязывающих доменов, указанных выше в подпункте (а), может содержать один или несколько аминокислотных остатков, из которых создаются связи для сцепления двух антигенсвязывающих доменов, и в этом случае некоторые или все из одного или нескольких аминокислотных остатков, из которых создается связь между антигенсвязывающими доменами, представляют собой аминокислотные остатки, которые присутствуют в Fab или шарнирной области дикого типа (например, остатков цистеина в шарнирной области). В другом варианте осуществления изобретения по меньшей одна связь, указанная выше в подпункте (б), представляет собой связь, в которой аминокислотные остатки, из которых создается связь между антигенсвязывающими доменами, получены из мутантных аминокислотных остатков, которые не присутствуют в Fab или шарнирной области дикого типа (например, остатков цистеина, которые не присутствуют в Fab или шарнирной области дикого типа).

Кроме того, другим объектом настоящего изобретения является способ получения антигенсвязывающей молекулы, которая обладает активностью, регулирующей активацию двух антигенных молекул, которые активируются путем ассоциации друг с другом, включающий:

(а) получение нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, который содержит первый антигенсвязывающий домен, и нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, который содержит второй антигенсвязывающий домен,

(б) интродукцию мутации в нуклеиновые кислоты, которые кодируют два антигенсвязывающих домена, таким образом, чтобы происходило добавление по меньшей мере одной связи, соединяющей два антигенсвязывающих домена,

(в) интродукцию нуклеиновых кислот, полученных в подпункте (б), в клетку-хозяина,

(г) культивирование клетки-хозяина таким образом, чтобы происходила экспрессия двух полипептидов, и

(д) получение антигенсвязывающей молекулы, которая представляет собой полипептид, содержащий первый и второй антигенсвязывающие домены, в котором два антигенсвязывающих домена сцеплены друг с другом через одну или несколько связей. В некоторых вариантах осуществления изобретения каждый из двух антигенсвязывающих доменов, указанных выше в подпункте (а), может содержать один или несколько аминокислотных остатков, из которых создаются связи для сцепления двух антигенсвязывающих доменов, и в этом случае некоторые или все из одного или нескольких аминокислотных остатков, из которых создается связь между антигенсвязывающими доменами, представляют собой аминокислотные остатки, которые присутствуют в Fab или шарнирной области дикого типа (например, остатков цистеина в шарнирной области). В другом варианте осуществления изобретения по меньшей одна связь, указанная выше в подпункте (б), представляет собой связь, в которой аминокислотные остатки, из которых создается связь между антигенсвязывающими доменами, получены из мутантных аминокислотных остатков, которые не присутствуют в Fab или шарнирной области дикого типа (например, остатков цистеина, которые не присутствуют в Fab или шарнирной области дикого типа).

Кроме того, другим объектом настоящего изобретения является способ получения антигенсвязывающей молекулы, в которой два антигенсвязывающих домена присутствуют в пространственно близких положениях и/или подвижность двух антигенсвязывающих доменов понижена, включающий:

(а) получение нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, который содержит первый антигенсвязывающий домен, и нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, который содержит второй антигенсвязывающий домен,

(б) интродукцию мутации в нуклеиновые кислоты, которые кодируют два антигенсвязывающих домена, таким образом, чтобы происходило добавление по меньшей мере одной связи, соединяющей два антигенсвязывающих домена,

(в) интродукцию нуклеиновых кислот, полученных в подпункте (б), в клетку-хозяина,

(г) культивирование клетки-хозяина таким образом, чтобы происходила экспрессия двух полипептидов, и

(д) получение антигенсвязывающей молекулы, которая представляет собой полипептид, содержащий первый и второй антигенсвязывающие домены, в котором два антигенсвязывающих домена сцеплены друг с другом через одну или несколько связей. В некоторых вариантах осуществления изобретения каждый из двух антигенсвязывающих доменов, указанных выше в подпункте (а), может содержать один или несколько аминокислотных остатков, из которых создаются связи для сцепления двух антигенсвязывающих доменов, и в этом случае некоторые или все из одного или нескольких аминокислотных остатков, из которых создается связь между антигенсвязывающими доменами, представляют собой аминокислотные остатки, которые присутствуют в Fab или шарнирной области дикого типа (например, остатков цистеина в шарнирной области). В другом варианте осуществления изобретения по меньшей одна связь, указанная выше в подпункте (б), представляет собой связь, в которой аминокислотные остатки, из которых создается связь между антигенсвязывающими доменами, получены из мутантных аминокислотных остатков, которые не присутствуют в Fab или шарнирной области дикого типа (например, остатков цистеина, которые не присутствуют в Fab или шарнирной области дикого типа).

Кроме того, другим объектом настоящего изобретения является способ получения антигенсвязывающей молекулы, которая обладает повышенной устойчивостью к расщеплению протеазой, включающий:

(а) получение нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, который содержит первый антигенсвязывающий домен, и нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, который содержит второй антигенсвязывающий домен,

(б) интродукцию мутации в нуклеиновые кислоты, которые кодируют два антигенсвязывающих домена, таким образом, чтобы происходило добавление по меньшей мере одной связи, соединяющей два антигенсвязывающих домена,

(в) интродукцию нуклеиновых кислот, полученных в подпункте (б), в клетку-хозяина,

(г) культивирование клетки-хозяина таким образом, чтобы происходила экспрессия двух полипептидов, и

(д) получение антигенсвязывающей молекулы, которая представляет собой полипептид, содержащий первый и второй антигенсвязывающие домены, в котором два антигенсвязывающих домена сцеплены друг с другом через одну или несколько связей. В некоторых вариантах осуществления изобретения каждый из двух антигенсвязывающих доменов, указанных выше в подпункте (а), может содержать один или несколько аминокислотных остатков, из которых создаются связи для сцепления двух антигенсвязывающих доменов, и в этом случае некоторые или все из одного или нескольких аминокислотных остатков, из которых создается связь между антигенсвязывающими доменами, представляют собой аминокислотные остатки, которые присутствуют в Fab или шарнирной области дикого типа (например, остатков цистеина в шарнирной области). В другом варианте осуществления изобретения по меньшей одна связь, указанная выше в подпункте (б), представляет собой связь, в которой аминокислотные остатки, из которых создается связь между антигенсвязывающими доменами, получены из мутантных аминокислотных остатков, которые не присутствуют в Fab или шарнирной области дикого типа (например, остатков цистеина, которые не присутствуют в Fab или шарнирной области дикого типа).

Антигенсвязывающая молекула, полученная согласно указанным различным объектам изобретения, может обладать характеристиками антигенсвязывающих молекул, указанными в настоящем описании.

Способы скрининга антигенсвязывающих молекул

Другим объектом настоящего изобретения является способ идентификации новой пары белковых молекул, которые активируются путем ассоциации друг с другом, включающей:

(а) получение двух произвольных белковых молекул,

(б) получение с помощью способа получения, указанного в настоящем описании, антигенсвязывающей молекулы, содержащей два антигенсвязывающих домена, которые связываются соответственно с двумя белковыми молекулами,

(в) приведение в контакт антигенсвязывающей молекулы, полученной в подпункте (б), с двумя белковыми молекулами и

(г) оценка того, происходит или нет активация двух белковых молекул.

В некоторых вариантах осуществления изобретения по меньшей мере одну из двух белковых молекул выбирают из группы, состоящей из рецепторов, которые принадлежат к суперсемействам рецепторов цитокинов, сопряженных с G-белком рецепторов, рецепторов ионных каналов, тирозинкиназных рецепторов, рецепторов иммунных чекпоинтов, рецепторов антигенов, CD-антигенов, костимуляторных молекул и молекул клеточной адгезии.

А. Приведенные в качестве примера антигенсвязывающие молекулы

Структуры антигенсвязывающих молекул

Одним из объектов настоящего изобретения является антигенсвязывающая молекула, которая содержит первый антигенсвязывающий домен и второй антигенсвязывающий домен и в которой антигенсвязывающие домены сцеплены друг с другом через две или большее количество связей. В одном из вариантов осуществления изобретения по меньшей мере один из первого и второго антигенсвязывающих доменов сам по себе обладает способностью связываться с антигеном (т.е. один антигенсвязывающий домен независимо от другого обладает антигенсвязывающей активностью). В некоторых вариантах осуществления изобретения каждый из первого и второго антигенсвязывающих доменов сам по себе обладает способностью связываться с антигеном.

Согласно одному из вариантов осуществления указанных выше объектов изобретения по меньшей мере один из первого и второго антигенсвязывающих доменов содержит фрагмент антитела, который связывается с конкретным антигеном. В некоторых вариантах осуществления изобретения первый и/или второй антигенсвязывающие домены содержат шарнирную область. Аминокислотные остатки, из которых создаются связи между антигенсвязывающими доменами, присутствуют в первом и втором антигенсвязывающих доменах соответственно, и связи между антигенсвязывающими доменами образуются путем сцепления указанных аминокислотных остатков. В некоторых вариантах осуществления изобретения по меньшей мере один из аминокислотных остатков, из которых создаются связи между антигенсвязывающими доменами, присутствует во фрагменте антитела. В некоторых вариантах осуществления изобретения по меньшей мере один из аминокислотных остатков, из которых создаются связи между антигенсвязывающими доменами, присутствует в шарнирной области. В некоторых вариантах осуществления изобретения по меньшей мере один из аминокислотных остатков, из которых создаются связи между антигенсвязывающими доменами, присутствует во фрагменте антитела и по меньшей мере один из аминокислотных остатков присутствует в шарнирной области.

Согласно одному из вариантов осуществления указанных выше объектов изобретения по меньшей мере в одном из первого и второго антигенсвязывающих доменов множество аминокислотных остатков, из которых создаются связи между антигенсвязывающими доменами, присутствуют в положениях на расстоянии семи аминокислот друг от друга в первичной структуре. Это означает, что между любыми двумя аминокислотными остатками из указанного выше множества аминокислотных остатков присутствует шесть или большее количество аминокислотных остатков, которые не относятся к указанным аминокислотным остаткам. В некоторых вариантах осуществления изобретения комбинации множества аминокислотных остатков, из которых создаются связи между антигенсвязывающими доменами, включают пару аминокислотных остатков, которые присутствуют в положениях на расстоянии менее семи аминокислот в первичной структуре. В некоторых вариантах осуществления изобретения, если первый и второй антигенсвязывающие домены сцеплены друг с другом через три или большее количество связей, то связи между антигенсвязывающими доменами могут создаваться из трех или большего количества аминокислотных остатков, включая пару аминокислотных остатков, которые присутствуют в положениях на расстоянии семи или более аминокислот в первичной структуре.

В некоторых вариантах осуществления изобретения аминокислотные остатки, присутствующие в одном и том же положении в первом антигенсвязывающем домене и втором антигенсвязывающем домене, сцеплены друг с другом с образованием связи. В некоторых вариантах осуществления изобретения аминокислотные остатки, присутствующие в различных положениях в первом антигенсвязывающем домене и втором антигенсвязывающем домене, сцеплены друг с другом с образованием связи.

Положения аминокислотных остатков в антигенсвязывающем домене можно указывать согласно нумерации по Кэботу или системе EU-нумерации (которую обозначают также как EU-индекс), описанной у Kabat и др., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5-ое изд., изд-во Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991. Например, если аминокислотные остатки, из которых создаются связи между первым и вторым антигенсвязывающими доменами, присутствуют в идентичном положении в антигенсвязывающих доменах соответственно, то положение указанных аминокислотных остатков может быть обозначено под одинаковым номером согласно нумерации по Кэботу или системе EU-нумерации. Альтернативно этому, если аминокислотные остатки, из которых создаются связи между первым и вторым антигенсвязывающими доменами, присутствуют в различных положениях в антигенсвязывающих доменах соответственно, то положения указанных аминокислотных остатков могут быть обозначены под различными номерами согласно нумерации по Кэботу или системе EU-нумерации.

Согласно одному из вариантов осуществления указанных выше объектов изобретения по меньшей мере одна из двух или большего количества связей, соединяющих антигенсвязывающие домены, представляет собой ковалентную связь. В некоторых вариантах осуществления изобретения ковалентная связь образуется путем непосредственного перекрестного сшивания аминокислотного остатка в первом антигенсвязывающем домене и аминокислотного остатка во втором антигенсвязывающем домене. Перекрестно сшитые аминокислотные остатки представляют собой, например, цистеин, и образовавшаяся ковалентная связь представляет собой, например, дисульфидную связь. По меньшей мере один из перекрестно сшитых остатков цистеина может присутствовать в шарнирной области.

В некоторых других вариантах осуществления изобретения ковалентная связь образуется путем перекрестного сшивания аминокислотного остатка в первом антигенсвязывающем домене и аминокислотного остатка во втором антигенсвязывающем домене через перекрестносшивающий агент. Перекрестносшивающий агент представляет собой, например, аминореактивный перекрестносшивающий агент, и перекрестно сшитые аминокислотные остатки представляют собой, например, лизин.

Согласно одному из вариантов осуществления указанных выше объектов изобретения по меньшей мере одна из двух или большего количества связей, соединяющих антигенсвязывающие домены, представляет собой нековалентную связь. В некоторых вариантах осуществления изобретения нековалентная связь представляет собой ионную связь, водородную связь или гидрофобную связь.

Согласно одному из вариантов осуществления указанных выше объектов изобретения фрагмент антитела представляет собой Fab, Fab', scFab, Fv, scFv или однодоменное антитело.

Согласно одному из вариантов осуществления указанных выше объектов изобретения по меньшей мере один из аминокислотных остатков, из которого создаются связи между антигенсвязывающими доменами, присутствует в константной области. В некоторых вариантах осуществления изобретения аминокислотный остаток присутствует в CH1-участке, и, например, он присутствует в CH1-участке в положении, выбранном из группы, которая состоит из положений 119, 122, 123, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 139, 140, 148, 150, 155, 156, 157, 159, 160, 161, 162, 163, 165, 167, 174, 176, 177, 178, 190, 191, 192, 194, 195, 197, 213 и 214 согласно EU-нумерации. В приведенном в качестве примера варианте осуществления изобретения аминокислотный остаток в CH1-участке в положении 191 согласно EU-нумерации и аминокислотный остаток в СН1-участке в положении 191 согласно EU-нумерации в двух антигенсвязывающих доменах сцеплены друг с другом с образованием связи.

В некоторых вариантах осуществления изобретения по меньшей мере один из аминокислотных остатков, из которых создаются связи между антигенсвязывающими доменами, присутствует в шарнирной области, и, например, он присутствует в шарнирной области в положении, выбранном из группы, которая состоит из положений 216, 218 и 219 согласно EU-нумерации.

В некоторых вариантах осуществления изобретения по меньшей мере один из аминокислотных остатков, из которых создаются связи между антигенсвязывающими доменами, присутствует в CL-области, и, например, он присутствует в CL-области в положении, выбранном из группы, которая состоит из положений 109, 112, 121, 126, 128, 151, 152, 153, 156, 184, 186, 188, 190, 200, 201, 202, 203, 208, 210, 211, 212 и 213 согласно EU-нумерации. В приведенном в качестве примера варианте осуществления изобретения аминокислотный остаток в CL-области в положении 126 согласно EU-нумерации и аминокислотный остаток в CL-области в положении 126 согласно EU-нумерации в двух антигенсвязывающих доменах сцеплены друг с другом с образованием связи.

В некоторых вариантах осуществления изобретения аминокислотный остаток в СН1-участке первого антигенсвязывающего домена и аминокислотный остаток в CL-области второго антигенсвязывающего домена сцеплены с образованием связи. В приведенном в качестве примера варианте осуществления изобретения аминокислотный остаток в положении 191 согласно EU-нумерации в СН1-участке первого антигенсвязывающего домена и аминокислотный остаток в положении 126 согласно EU-нумерации в CL-области второго антигенсвязывающего домена сцеплены друг с другом с образованием связи.

Согласно одному из вариантов осуществления указанных выше объектов изобретения константная область имеет происхождение из человеческого антитела. В некоторых вариантах осуществления изобретения константная область тяжелой цепи относится к любому из подклассов IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgM, IgD и IgE. В некоторых вариантах осуществления изобретения CH1-участок относится к любому из подклассов γ1, γ2, γ3, γ4, α1, α2, μ, δ и ε. В некоторых вариантах осуществления изобретения CL-область относится к подклассу κ или λ.

Согласно одному из вариантов осуществления указанных выше объектов изобретения по меньшей мере один из аминокислотных остатков, из которых создаются связи между антигенсвязывающими доменами, присутствует в вариабельной области. В некоторых вариантах осуществления изобретения аминокислотный остаток присутствует в VH-области, и, например, он присутствует в положении в VH-области, выбранном из группы, которая состоит из положений 8, 16, 28, 74 и 82b согласно нумерации по Кэботу. В некоторых вариантах осуществления изобретения аминокислотный остаток присутствует в VL-области, и, например, он присутствует в положении в VL-области, выбранном из группы, которая состоит из положений 100, 105 и 107 согласно нумерации по Кэботу.

Согласно одному из вариантов осуществления указанных выше объектов изобретения и первый, и второй антигенсвязывающие домены содержат Fab и шарнирную область.

В некоторых вариантах осуществления изобретения по меньшей мере один из аминокислотных остатков, из которых создаются связи между антигенсвязывающими доменами, представляет собой аминокислотный остаток, присутствующий в Fab или шарнирной области дикого типа, и, например, он представляет собой остаток цистеина в шарнирной области. Примеры указанных остатков цистеина включают остатки цистеина в положениях 226 и 229 согласно EU-нумерации.

В некоторых других вариантах осуществления изобретения по меньшей мере один из аминокислотных остатков, из которых создаются связи между антигенсвязывающими доменами, представляет собой мутантный аминокислотный остаток, который не присутствует в Fab или шарнирной области дикого типа, и, например, он представляет собой остаток цистеина, который не присутствует в Fab или шарнирной области дикого типа. Указанный мутантный аминокислотный остаток можно интродуцировать в Fab или шарнирную область дикого типа, например, с помощью метода аминокислотной замены. В настоящем описании представлены сайты аминокислотных остатков, из которых могут создаваться связи между антигенсвязывающими доменами, для каждого из следующих компонентов: СН1, шарнир, CL-, VH- и VL-области, и, например, остатки цистеина можно интродуцировать в указанные сайты.

Альтернативно этому, в другом варианте осуществления изобретения аминокислотный остаток, который присутствует в Fab или шарнирной области дикого типа и который участвует в образовании связи между антигенсвязывающими доменами (например, остаток цистеина), можно заменять на другую аминокислоту или удалять путем делеции. Примеры таких остатков цистеина включают остатки цистеина в положениях 220, 226 и 229 согласно EU-нумерации в шарнирной области и остаток цистеина в положении 214 в CL-области.

В некоторых вариантах осуществления изобретения антигенсвязывающая молекула, указанная в настоящем описании, представляет собой F(ab')2, в которой и первый, и второй антигенсвязывающие домены содержат Fab и шарнирную область.

Согласно одному из вариантов осуществления указанных выше объектов изобретения по меньшей мере один из первого и второго антигенсвязывающих доменов содержит не являющийся антителом белок, который связывается с конкретным антигеном, или его фрагмент. В некоторых вариантах осуществления изобретения не являющийся антителом белок представляет собой любой из пары лиганд и рецептор, которые специфически связываются друг с другом. Указанные рецепторы включают, например, рецепторы, которые принадлежат к суперсемействам рецепторов цитокинов, сопряженных с G-белком рецепторов, рецепторов ионных каналов, тирозинкиназных рецепторов, рецепторов иммунных чекпоинтов, рецепторов антигенов, CD-антигенов, костимуляторных молекул и молекул клеточной адгезии.

Согласно одному из вариантов осуществления указанных выше объектов изобретения антигенсвязывающая молекула, указанная в настоящем описании, содержит также Fc-область, и, например, она представляет собой полноразмерное антитело. В некоторых вариантах осуществления изобретения одна или несколько аминокислотных мутаций, способствующих мультимеризации Fc-областей, интродуцированы в Fc-область антигенсвязывающей молекулы, указанной в настоящем описании. Указанные аминокислотные мутации включают, например, аминокислотные мутации по меньшей мере в одном из положений, выбранных из группы, которая состоит из положений 247, 248, 253, 254, 310, 311, 338, 345, 356, 359, 382, 385, 386, 430, 433, 434, 436, 437, 438, 439, 440 и 447 согласно EU-нумерации (см., например, WO 2016/164480). В некоторых вариантах осуществления изобретения мультимеризация представляет собой гексамеризацию.

Антигены, которые связываются антигенсвязывающими молекулами

Согласно одному из вариантов осуществления указанных выше объектов изобретения и первый, и второй антигенсвязывающие домены связываются с одним и тем же антигеном. В некоторых вариантах осуществления изобретения и первый, и второй антигенсвязывающие домены связываются с одним и тем же эпитопом на одном и том же антигене. В некоторых других вариантах осуществления изобретения первый и второй антигенсвязывающие домены каждый связывается с отличающимся от другого эпитопом на одном и том же антигене. В некоторых вариантах осуществления изобретения антигенсвязывающая молекула, указанная в настоящем описании, представляет собой бипаратопную антигенсвязывающую молекулу (например, бипаратопное антитело), мишенью которой является один конкретный антиген.

Согласно другому варианту осуществления указанных выше объектов изобретения первый и второй антигенсвязывающие домены каждый связывается с отличающимся от другого антигеном.

Согласно другому варианту осуществления указанных выше объектов изобретения антигенсвязывающая молекула, указанная в настоящем описании, представляет собой «прижимающую» антигенсвязывающую молекулу (например, «прижимающее» антитело). В контексте настоящего описания «прижимающая» антигенсвязывающая молекула означает антигенсвязывающую молекулу, которая специфически связывается с комплексом антиген/антигенсвязывающая молекула, сформированным между данным антигеном А и антигенсвязывающей молекулой, связывающейся с антигеном А, и которая тем самым повышает связывающую активность в отношении антигена А антигенсвязывающей молекулы, которая связывается с антигеном А (или стабилизирует комплекс антиген/антигенсвязывающая молекула, сформированный антигеном А и антигенсвязывающей молекулой, которая связывается с антигеном А). Например, CD3-«прижимающее» антитело специфически связывается с комплексом антиген-антитело, сформированным между CD3 и антителом с пониженной связывающей способностью в отношении CD3 (антитело с ослабленным связыванием CD3), и тем самым повышает связывающую активность антитела с ослабленным связыванием CD3 в отношении CD3 (или стабилизирует комплекс антиген-антитело, сформированный CD3 и антителом с ослабленным связыванием CD3). В некоторых вариантах осуществления изобретения первый и/или второй антигенсвязывающие домены в антигенсвязывающей молекуле, указанной в настоящем описании, могут представлять собой антигенсвязывающие домены («прижимающие» антигенсвязывающие домены), полученные из «прижимающих» антигенсвязывающих молекул.

Согласно одному из вариантов осуществления указанных выше объектов изобретения и первый, и второй антигенсвязывающие домены имеют одинаковую аминокислотную последовательность. В другом варианте осуществления изобретения первый и второй антигенсвязывающие домены каждый имеет отличающуюся от другого аминокислотную последовательность.

Согласно одному из вариантов осуществления указанных выше объектов изобретения по меньшей мере один из двух антигенов, с которыми связываются первый и второй антигенсвязывающие домены, представляет собой растворимый белок или мембранный белок.

Функции антигенсвязывающих молекул

Согласно одному из вариантов осуществления указанных выше объектов изобретения антигенсвязывающая молекула, указанная в настоящем описании, обладает активностью, удерживающей две антигенные молекулы в пространственно близких положениях. В некоторых вариантах осуществления изобретения антигенсвязывающая молекула, указанная в настоящем описании, обладает способностью удерживать две антигенные молекулы в более близких положениях, чем контрольная антигенсвязывающая молекула, и контрольная антигенсвязывающая молекула отличается от антигенсвязывающей молекулы, указанной в настоящем описании, только тем, что контрольная антигенсвязывающая молекула имеет на одну связь меньше между двумя антигенсвязывающими доменами. В другом варианте осуществления изобретения указанную одну связь, на которую уменьшено количество связей, можно выбирать из связей, в которых аминокислотные остатки, из которых создаются связи между антигенсвязывающими доменами, имеют происхождение из мутантных аминокислотных остатков, которые не присутствуют в Fab или шарнирной области дикого типа (например, остатков цистеина, которые не присутствуют Fab или шарнирной области дикого типа).

В другом варианте осуществления указанных выше объектов изобретения антигенсвязывающая молекула, указанная в настоящем описании, обладает активностью, регулирующей взаимодействие между двумя антигенными молекулами. Не вдаваясь в конкретную теорию, можно предположить, что активность, регулирующая взаимодействие, является результатом удерживания двух антигенных молекул в пространственно более близких положениях с помощью антигенсвязывающей молекулы, указанной в настоящем описании. В некоторых вариантах осуществления изобретения антигенсвязывающая молекула, указанная в настоящем описании, обладает способностью усиливать или ослаблять взаимодействие между двумя антигенными молекулами по сравнению с контрольной антигенсвязывающей молекулой, и контрольная антигенсвязывающая молекула отличается от антигенсвязывающей молекулы, указанной в настоящем описании, только тем, что контрольная антигенсвязывающая молекула имеет на одну связь меньше между двумя антигенсвязывающими доменами. В другом варианте осуществления изобретения указанную одну связь, на которую уменьшено количество связей, можно выбирать из связей, в которых аминокислотные остатки, из которых создаются связи между антигенсвязывающими доменами, имеют происхождение из мутантных аминокислотных остатков, которые не присутствуют в Fab или шарнирной области дикого типа (например, остатков цистеина, которые не присутствуют Fab или шарнирной области дикого типа).

В некоторых вариантах осуществления изобретения две антигенные молекулы, связанные с помощью антигенсвязывающей молекулы, указанной в настоящем описании, представляют собой лиганд и его рецептор соответственно, и антигенсвязывающая молекула, указанная в настоящем описании, обладает активностью, способствующей активации рецептора лигандом. В другом конкретном варианте осуществления изобретения две антигенные молекулы, связанные с помощью антигенсвязывающей молекулы, указанной в настоящем описании, представляют собой фермент и его субстрат соответственно, и антигенсвязывающая молекула, указанная в настоящем описании, обладает активностью, способствующей каталитической реакции фермента с его субстратом.

Кроме того, в других конкретных вариантах осуществления изобретения две антигенные молекулы, связанные с помощью антигенсвязывающей молекулы, указанной в настоящем описании, обе представляют собой антигены (например, белки), присутствующие на клеточных поверхностях, и антигенсвязывающая молекула, указанная в настоящем описании, обладает активностью, способствующей взаимодействию между клеткой, которая экспрессирует первый антиген, и клеткой, которая экспрессирует второй антиген. Например, клетка, экспрессирующая первый антиген, и клетка, экспрессирующая второй антиген, представляют собой клетку с цитотоксической активностью и ее клетку-мишень соответственно, и антигенсвязывающая молекула, указанная в настоящем описании, усиливает повреждение клетки-мишени клеткой с цитотоксической активностью. Клетка с цитотоксической активностью представляет собой, например, Т-клетку, NK-клетку, моноцит или макрофаг.

Согласно одному из вариантов осуществления указанных выше объектов изобретения антигенсвязывающая молекула, указанная в настоящем описании, обладает активностью, регулирующей активацию двух антигенных молекул, которые активируются путем ассоциации друг с другом. Не вдаваясь в конкретную теорию, можно предположить, что активность, регулирующая активацию, является результатом удерживания двух антигенных молекул в пространственно более близких положениях с помощью антигенсвязывающей молекулы, указанной в настоящем описании. В некоторых вариантах осуществления изобретения антигенсвязывающая молекула, указанная в настоящем описании, может обладать способностью усиливать или ослаблять активацию двух антигенных молекул по сравнению с контрольной антигенсвязывающей молекулой, и контрольная антигенсвязывающая молекула отличается от антигенсвязывающей молекулы, указанной в настоящем описании, только тем, что контрольная антигенсвязывающая молекула имеет на одну связь меньше между двумя антигенсвязывающими доменами. В другом варианте осуществления изобретения указанную одну связь, на которую уменьшено количество связей, можно выбирать из связей, в которых аминокислотные остатки, из которых создаются связи между антигенсвязывающими доменами, имеют происхождение из мутантных аминокислотных остатков, которые не присутствуют в Fab или шарнирной области дикого типа (например, остатков цистеина, которые не присутствуют Fab или шарнирной области дикого типа). Например, указанные антигенные молекулы выбирают из группы, которая состоит из рецепторов, принадлежащих к суперсемействам рецепторов цитокинов, рецепторов, сопряженных с G-белком, рецепторов ионных каналов, тирозинкиназных рецепторов, рецепторов иммунных чекпоинтов, рецепторов антигенов, CD-антигенов, костимуляторных молекул и молекул клеточной адгезии.

Согласно одному из вариантов осуществления указанных выше объектов изобретения антигенсвязывающая молекула, указанная в настоящем описании, обладает устойчивость к расщеплению протеазой. В некоторых вариантах осуществления изобретения антигенсвязывающая молекула, указанная в настоящем описании, обладает более высокой устойчивостью к расщеплению протеазой по сравнению с контрольной антигенсвязывающей молекулой, и контрольная антигенсвязывающая молекула отличается от антигенсвязывающей молекулы, указанной в настоящем описании, только тем, что контрольная антигенсвязывающая молекула имеет на одну связь меньше между двумя антигенсвязывающими доменами. В другом варианте осуществления изобретения указанную одну связь, на которую уменьшено количество связей, можно выбирать из связей, в которых аминокислотные остатки, из которых создаются связи между антигенсвязывающими доменами, имеют происхождение из мутантных аминокислотных остатков, которые не присутствуют в Fab или шарнирной области дикого типа (например, остатков цистеина, которые не присутствуют Fab или шарнирной области дикого типа). В некоторых вариантах осуществления изобретения в антигенсвязывающей молекуле, указанной в настоящем описании, доля полноразмерной молекулы (например, полноразмерной IgG-молекулы), сохраняющейся после обработки протеазой, возрастает по сравнению с контрольной антигенсвязывающей молекулой. В некоторых вариантах осуществления изобретения в антигенсвязывающей молекуле, указанной в настоящем описании, доля конкретного фрагмента (например, Fab-мономера), образовавшегося после обработки протеазой, снижается по сравнению с контрольной антигенсвязывающей молекулой.

Согласно одному из вариантов осуществления указанных выше объектов изобретения, когда антигенсвязывающую молекулу, указанную в настоящем описании, обрабатывают протеазой, то вырезается димер антигенсвязывающих доменов или их фрагментов (например, перекрестно сшитый Fab-димер). В некоторых вариантах осуществления изобретения, когда контрольную антигенсвязывающую молекулу, которая отличается от антигенсвязывающей молекулы, указанной в настоящем описании, только тем, что она имеет на одну связь меньше между двумя антигенсвязывающими доменами, обрабатывают протеазой, то вырезаются мономеры антигенсвязывающих доменов или их фрагментов. В другом варианте осуществления изобретения указанную одну связь, на которую уменьшено количество связей, можно выбирать из связей, в которых аминокислотные остатки, из которых создаются связи между антигенсвязывающими доменами, имеют происхождение из мутантных аминокислотных остатков, которые не присутствуют в Fab или шарнирной области дикого типа (например, остатков цистеина, которые не присутствуют Fab или шарнирной области дикого типа). В указанных вариантах осуществления изобретения протеаза может расщеплять шарнирную область антигенсвязывающей молекулы.

Фармацевтические композиции

Одним из объектов настоящего изобретения является фармацевтическая композиция, которая содержит антигенсвязывающую молекулу, указанную в настоящем описании, и фармацевтически приемлемый носитель.

Применение антигенсвязывающих молекул

Одним из объектов настоящего изобретения является способ удерживания двух антигенных молекул в пространственно близких положениях, включающий

(а) получение антигенсвязывающей молекулы, содержащей два антигенсвязывающих домена, в которой два антигенсвязывающих домена сцеплены друг с другом через одну или несколько связей,

(б) добавление к антигенсвязывающей молекуле другой связи, которая соединяет два антигенсвязывающих домена друг с другом, и

(в) приведение в контакт антигенсвязывающей молекулы, полученной в подпункте (б), с двумя антигенсвязывающими молекулами.

В некоторых вариантах осуществления изобретения некоторые или все из одной или нескольких связей, указанных выше в подпункте (а), представляют собой связи, в которых аминокислотные остатки, из которых создаются связи между антигенсвязывающими доменами, получают из аминокислотных остатков, которые присутствуют в Fab или шарнирной области дикого типа (например, остатков цистеина в шарнирной области). В другом варианте осуществления изобретения по меньшей одна связь, указанная выше в подпункте (б), представляет собой связь, в которой аминокислотные остатки, из которых создается связь между антигенсвязывающими доменами, получают из мутантных аминокислотных остатков, которые не присутствуют в Fab или шарнирной области дикого типа (например, остатков цистеина, которые не присутствуют в Fab или шарнирной области дикого типа). В настоящем описании представлен также способ удерживания двух антигенных молекул в пространственно близких положениях, включающий приведение в контакт двух антигенных молекул с антигенсвязывающей молекулой или фармацевтической композицией, представленной в настоящем описании. В настоящем описании представлена также антигенсвязывающая молекула или фармацевтическая композиция, указанная в настоящем описании, предназначенная для применения для удерживания двух антигенных молекул в пространственно близких положениях.

Другим объектом настоящего изобретения является способ регуляции взаимодействия между двумя антигенными молекулами, включающий:

(а) получение антигенсвязывающей молекулы, содержащей два антигенсвязывающих домена, в которой два антигенсвязывающих домена сцеплены друг с другом через одну или несколько связей,

(б) добавление к антигенсвязывающей молекуле другой связи, которая соединяет два антигенсвязывающих домена друг с другом, и

(в) приведение в контакт антигенсвязывающей молекулы, полученной в подпункте (б), с двумя антигенсвязывающими молекулами.

В некоторых вариантах осуществления изобретения некоторые или все из одной или нескольких связей, указанных выше в подпункте (а), представляют собой связи, в которых аминокислотные остатки, из которых создаются связи между антигенсвязывающими доменами, получают из аминокислотных остатков, которые присутствуют в Fab или шарнирной области дикого типа (например, остатков цистеина в шарнирной области). В другом варианте осуществления изобретения эта другая связь, указанная выше в подпункте (б), представляет собой связь, в которой аминокислотные остатки, из которых создается связь между антигенсвязывающими доменами, получают из мутантных аминокислотных остатков, которые не присутствуют в Fab или шарнирной области дикого типа (например, остатков цистеина, которые не присутствуют в Fab или шарнирной области дикого типа). В настоящем описании представлен также способ регуляции взаимодействия двух антигенных молекул, включающий приведение в контакт двух антигенных молекул с антигенсвязывающей молекулой или фармацевтической композицией, представленной в настоящем описании. В настоящем описании представлена также антигенсвязывающая молекула или фармацевтическая композиция, указанная в настоящем описании, предназначенная для применения для регуляции взаимодействия между двумя антигенными молекулами.

Кроме того, другим объектом настоящего изобретения является способ регуляции активности двух антигенных молекул, которые активируются путем ассоциации друг с другом, включающий:

(а) получение антигенсвязывающей молекулы, содержащей два антигенсвязывающих домена, в которой два антигенсвязывающих домена сцеплены друг с другом через одну или несколько связей,

(б) добавление к антигенсвязывающей молекуле другой связи, которая соединяет два антигенсвязывающих домена друг с другом, и

(в) приведение в контакт антигенсвязывающей молекулы, полученной в подпункте (б), с двумя антигенсвязывающими молекулами.

В некоторых вариантах осуществления изобретения некоторые или все из одной или нескольких связей, указанных выше в подпункте (а), представляют собой связи, в которых аминокислотные остатки, из которых создаются связи между антигенсвязывающими доменами, получают из аминокислотных остатков, которые присутствуют в Fab или шарнирной области дикого типа (например, остатков цистеина в шарнирной области). В другом варианте осуществления изобретения эта другая связь, указанная выше в подпункте (б), представляет собой связь, в которой аминокислотные остатки, из которых создается связь между антигенсвязывающими доменами, получают из мутантных аминокислотных остатков, которые не присутствуют в Fab или шарнирной области дикого типа (например, остатков цистеина, которые не присутствуют в Fab или шарнирной области дикого типа). В настоящем описании представлен также способ регуляции активности двух антигенных молекул, которые активируются путем ассоциации друг с другом, включающий приведение в контакт двух антигенных молекул с антигенсвязывающей молекулой или фармацевтической композицией, представленной в настоящем описании. В настоящем описании представлена также антигенсвязывающая молекула или фармацевтическая композиция, указанная в настоящем описании, предназначенная для применения для регуляции активности двух антигенных молекул, которые активируется путем ассоциации друг с другом.

Кроме того, другим объектом настоящего изобретения является способ повышения устойчивости антигенсвязывающей молекулы к расщеплению протеазой, включающий:

(а) получение антигенсвязывающей молекулы, содержащей два антигенсвязывающих домена, в которой два антигенсвязывающих домена сцеплены друг с другом через одну или несколько связей,

(б) добавление к антигенсвязывающей молекуле другой связи, которая соединяет два антигенсвязывающих домена друг с другом.

В некоторых вариантах осуществления изобретения некоторые или все из одной или нескольких связей, указанных выше в подпункте (а), представляют собой связи, в которых аминокислотные остатки, из которых создаются связи между антигенсвязывающими доменами, получают из аминокислотных остатков, которые присутствуют в Fab или шарнирной области дикого типа (например, остатков цистеина в шарнирной области). В другом варианте осуществления изобретения эта другая связь, указанная выше в подпункте (б), представляет собой связь, в которой аминокислотные остатки, из которых создается связь между антигенсвязывающими доменами, получают из мутантных аминокислотных остатков, которые не присутствуют в Fab или шарнирной области дикого типа (например, остатков цистеина, которые не присутствуют в Fab или шарнирной области дикого типа).

Антигенсвязывающая молекула, применяемая в указанных различных способах, может обладать характеристиками антигенсвязывающих молекул, указанными в настоящем описании.

Способы получения антигенсвязывающих молекул

Объектом настоящего изобретения является способ получения антигенсвязывающей молекулы, которая обладает активностью, удерживающей две антигенные молекулы в пространственно близких положениях, включающий

(а) получение нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, который содержит первый антигенсвязывающий домен, и нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, который содержит второй антигенсвязывающий домен, где каждый из двух антигенсвязывающих доменов содержит один или несколько аминокислотных остатков, из которых создается связь для соединения двух антигенсвязывающих доменов,

(б) интродукцию мутации в нуклеиновые кислоты, которые кодируют два антигенсвязывающих домена, таким образом, чтобы происходило добавление другой связи, соединяющей два антигенсвязывающих домена,

(в) интродукцию нуклеиновых кислот, полученных в подпункте (б), в клетку-хозяина,

(г) культивирование клетки-хозяина таким образом, чтобы происходила экспрессия двух полипептидов, и

(д) получение антигенсвязывающей молекулы, которая представляет собой полипептид, содержащий первый и второй антигенсвязывающие домены, в котором два антигенсвязывающих домена сцеплены друг с другом через две или большее количество связей.

В некоторых вариантах осуществления изобретения один или несколько из аминокислотных остатков, указанных выше в подпункте (а), из которых создается связь между антигенсвязывающими доменами, представляют собой аминокислотные остатки, которые присутствуют в Fab или шарнирной области дикого типа (например, остатки цистеина в шарнирной области). В другом варианте осуществления изобретения эта другая связь, указанная выше в подпункте (б), представляет собой связь, в которой аминокислотные остатки, из которых создается связь между антигенсвязывающими доменами, получены из мутантных аминокислотных остатков, которые не присутствуют в Fab или шарнирной области дикого типа (например, остатков цистеина, которые не присутствуют в Fab или шарнирной области дикого типа).

Другим объектом настоящего изобретения является способ получения антигенсвязывающей молекулы, которая обладает активностью, регулирующей взаимодействие между двумя антигенными молекулами, включающий:

(а) получение нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, который содержит первый антигенсвязывающий домен, и нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, который содержит второй антигенсвязывающий домен, где каждый из двух антигенсвязывающих доменов содержит один или несколько аминокислотных остатков, из которых создается связь для соединения двух антигенсвязывающих доменов,

(б) интродукцию мутации в нуклеиновые кислоты, которые кодируют два антигенсвязывающих домена, таким образом, чтобы происходило добавление другой связи, соединяющей два антигенсвязывающих домена,

(в) интродукцию нуклеиновых кислот, полученных в подпункте (б), в клетку-хозяина,

(г) культивирование клетки-хозяина таким образом, чтобы происходила экспрессия двух полипептидов, и

(д) получение антигенсвязывающей молекулы, которая представляет собой полипептид, содержащий первый и второй антигенсвязывающие домены, в котором два антигенсвязывающих домена сцеплены друг с другом через две или большее количество связей.

В некоторых вариантах осуществления изобретения один или несколько из аминокислотных остатков, указанных выше в подпункте (а), из которых создается связь между антигенсвязывающими доменами, представляют собой аминокислотные остатки, которые присутствуют в Fab или шарнирной области дикого типа (например, остатки цистеина в шарнирной области). В другом варианте осуществления изобретения эта другая связь, указанная выше в подпункте (б), представляет собой связь, в которой аминокислотные остатки, из которых создается связь между антигенсвязывающими доменами, получены из мутантных аминокислотных остатков, которые не присутствуют в Fab или шарнирной области дикого типа (например, остатков цистеина, которые не присутствуют в Fab или шарнирной области дикого типа).

Другим объектом настоящего изобретения является способ получения антигенсвязывающей молекулы, которая обладает активностью, регулирующей активацию двух антигенных молекул, которые активируется путем ассоциации друг с другом, включающий:

(а) получение нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, который содержит первый антигенсвязывающий домен, и нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, который содержит второй антигенсвязывающий домен, где каждый из двух антигенсвязывающих доменов содержит один или несколько аминокислотных остатков, из которых создается связь для соединения двух антигенсвязывающих доменов,

(б) интродукцию мутации в нуклеиновые кислоты, которые кодируют два антигенсвязывающих домена, таким образом, чтобы происходило добавление другой связи, соединяющей два антигенсвязывающих домена,

(в) интродукцию нуклеиновых кислот, полученных в подпункте (б), в клетку-хозяина,

(г) культивирование клетки-хозяина таким образом, чтобы происходила экспрессия двух полипептидов, и

(д) получение антигенсвязывающей молекулы, которая представляет собой полипептид, содержащий первый и второй антигенсвязывающие домены, в котором два антигенсвязывающих домена сцеплены друг с другом через две или большее количество связей.

В некоторых вариантах осуществления изобретения один или несколько из аминокислотных остатков, указанных выше в подпункте (а), из которых создается связь между антигенсвязывающими доменами, представляют собой аминокислотные остатки, которые присутствуют в Fab или шарнирной области дикого типа (например, остатки цистеина в шарнирной области). В другом варианте осуществления изобретения эта другая связь, указанная выше в подпункте (б), представляет собой связь, в которой аминокислотные остатки, из которых создается связь между антигенсвязывающими доменами, получены из мутантных аминокислотных остатков, которые не присутствуют в Fab или шарнирной области дикого типа (например, остатков цистеина, которые не присутствуют в Fab или шарнирной области дикого типа).

Другим объектом настоящего изобретения является способ получения антигенсвязывающей молекулы, которая обладает повышенной устойчивостью к расщеплению протеазой, включающий:

(а) получение нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, который содержит первый антигенсвязывающий домен, и нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, который содержит второй антигенсвязывающий домен, где каждый из двух антигенсвязывающих доменов содержит один или несколько аминокислотных остатков, из которых создается связь для соединения двух антигенсвязывающих доменов,

(б) интродукцию мутации в нуклеиновые кислоты, которые кодируют два антигенсвязывающих домена, таким образом, чтобы происходило добавление другой связи, соединяющей два антигенсвязывающих домена,

(в) интродукцию нуклеиновых кислот, полученных в подпункте (б), в клетку-хозяина,

(г) культивирование клетки-хозяина таким образом, чтобы происходила экспрессия двух полипептидов, и

(д) получение антигенсвязывающей молекулы, которая представляет собой полипептид, содержащий первый и второй антигенсвязывающие домены, в котором два антигенсвязывающих домена сцеплены друг с другом через две или большее количество связей.

В некоторых вариантах осуществления изобретения один или несколько из аминокислотных остатков, указанных выше в подпункте (а), из которых создается связь между антигенсвязывающими доменами, представляют собой аминокислотные остатки, которые присутствуют в Fab или шарнирной области дикого типа (например, остатки цистеина в шарнирной области). В другом варианте осуществления изобретения эта дополнительная связь, указанная выше в подпункте (б), представляет собой связь, в которой аминокислотные остатки, из которых создается связь между антигенсвязывающими доменами, получены из мутантных аминокислотных остатков, которые не присутствуют в Fab или шарнирной области дикого типа (например, остатков цистеина, которые не присутствуют в Fab или шарнирной области дикого типа).

Антигенсвязывающая молекула, применяемая в указанных различных способах, может обладать характеристиками антигенсвязывающих молекул, указанными в настоящем описании.

Способы скрининга антигенсвязывающих молекул

Другим объектом настоящего изобретения является способ идентификации новой пары белковых молекул, которые активируются путем ассоциации друг с другом, включающей:

(а) получение двух произвольных белковых молекул,

(б) получение с помощью способа получения, указанного в настоящем описании, антигенсвязывающей молекулы, содержащей два антигенсвязывающих домена, которые связываются соответственно с двумя белковыми молекулами, где антигенсвязывающая молекула обладает активностью, удерживающей две белковые молекулы в близких положениях,

(в) приведение в контакт антигенсвязывающей молекулы, полученной в подпункте (б), с двумя белковыми молекулами и

(г) оценка того, происходит или нет активация двух белковых молекул.

В некоторых вариантах осуществления изобретения по меньшей мере одну из белковых молекул выбирают из группы, которая состоит из рецепторов, принадлежащих к суперсемействам рецепторов цитокинов, рецепторов, сопряженных с G-белком, рецепторов ионных каналов, тирозинкиназных рецепторов, рецепторов иммунных чекпоинтов, рецепторов антигенов, CD-антигенов, костимуляторных молекул и молекул клеточной адгезии.

Сцепление антигенсвязывающих доменов

В варианте осуществления изобретения, не ограничивающем его объем, два или более количество антигенсвязывающих доменов, содержащихся в антигенсвязывающей молекуле, указанной в настоящем описании, сцеплены друг с другом через одну или несколько связей. В предпочтительном варианте осуществления изобретения антигенсвязывающий домен, содержащийся в антигенсвязывающей молекуле, указанной в настоящем описании, сам по себе обладает способностью связываться с антигеном. В указанном варианте осуществления изобретения антигенсвязывающая молекула, указанная в настоящем описании, которая содержит два антигенсвязывающих домена, может связываться с двумя или большим количеством антигенных молекул; антигенсвязывающая молекула, указанная в настоящем описании, которая содержит три антигенсвязывающих домена, может связываться с тремя или большим количеством антигенных молекул; антигенсвязывающая молекула, указанная в настоящем описании, которая содержит четыре антигенсвязывающих домена, может связываться с четырьмя или большим количеством антигенных молекул; и антигенсвязывающая молекула, указанная в настоящем описании, которая содержит N антигенсвязывающих доменов, может связываться с N или большим количеством антигенных молекул.

В некоторых вариантах осуществления изобретения по меньшей мере одна из связей между антигенсвязывающими доменами, содержащимися в антигенсвязывающей молекуле, указанной в настоящем описании, отличается от связи, присутствующей во встречающемся в естественных условиях антителе (например, в Fab или шарнирной области дикого типа). Примеры связей между антигенсвязывающими доменами встречающегося в естественных условиях антитела (например, встречающегося в естественных условиях антитела IgG-типа) включают дисульфидные связи в шарнирной области. Связи между аминокислотными остатками, которые расположены в области, отличной от шарнирной области, могут представлять собой связи между аминокислотными остатками во фрагменте антитела (например. Fab), и они включают связи между тяжелыми цепями (НН), связи между легкими цепями (LL) и связи между тяжелой и легкой цепями (HL или LH) (см. фиг.1). Примеры аминокислотных остатков в тяжелой или легкой цепи, из которых создаются связи между антигенсвязывающими доменами, включают аминокислотные остатки в указанных выше положениях в вариабельной области (VH-область или VL-область) или в константной области (CH1-участок, шарнирная область или CL-область).

В варианте осуществления изобретения, не ограничивающем его объем, связи между антигенсвязывающими доменами могут создаваться из множества аминокислотных остатков, присутствующих в положениях, отделенных друг от друга в первичной структуре, по меньшей мере в одном из двух или большего количества антигенсвязывающих доменов, содержащихся в антигенсвязывающей молекуле, указанной в настоящем описании. Расстояние между множеством аминокислотных остатков представляет собой расстояние, позволяющее получать структуры из двух или большего количества находящихся в достаточной близости антигенсвязывающих доменов в результате сцепления между антигенсвязывающими доменами с помощью связей, созданных из аминокислотных остатков. Расстояние между множеством аминокислотных остатков может составлять, например, 4 аминокислоты или более, 5 аминокислот или более, 6 аминокислот или более, 7 аминокислот или более, 8 аминокислот или более, 9 аминокислот или более, 10 аминокислот или более, 11 аминокислот или более, 12 аминокислот или более, 13 аминокислот или более, 14 аминокислот или более, 15 аминокислот или более, 20 аминокислот или более, 25 аминокислот или более, 30 аминокислот или более, 35 аминокислот или более, 40 аминокислот или более, 45 аминокислот или более, 50 аминокислот или более, 60 аминокислот или более, 70 аминокислот или более, 80 аминокислот или более, 90 аминокислот или более, 100 аминокислот или более, 110 аминокислот или более, 120 аминокислот или более, 130 аминокислот или более, 140 аминокислот или более, 150 аминокислот или более, 160 аминокислот или более, 170 аминокислот или более, 180 аминокислот или более, 190 аминокислот или более, 200 аминокислот или более, 210 аминокислот или более или 220 аминокислот или более.

Кроме того, количество связей между антигенсвязывающими доменами и количество аминокислотных остатков, из которых создаются связи, представляет собой количество, позволяющее получать структуры из двух или большего количества находящихся в достаточной близости антигенсвязывающих доменов в результате сцепления между антигенсвязывающими доменами с помощью связей. Количество может представлять собой, например, два или более, три или более, четыре или более, пять или более, шесть или более, семь или более, восемь или более, девять или более или десять или более.

В некоторых вариантах осуществления изобретения в случае, когда получают структуры из двух или большего количества находящихся в достаточной близости антигенсвязывающих доменов в результате сцепления между антигенсвязывающими доменами с помощью трех или большего количества связей, которые соответственно создаются из трех или большего количества аминокислотных остатков в антигенсвязывающих доменах, расстояние в первичной структуре между любыми двумя аминокислотными остатками, выбранными из трех аминокислотных остатков, может составлять семь аминокислот или более по меньшей для одной пары аминокислотных остатков и может составлять менее семи аминокислотных остатков для остальных пар аминокислотных остатков.

Касательно антигенсвязывающих доменов, содержащихся в антигенсвязывающих молекулах, указанных в настоящем описании, «в достаточной близости» означает, что два или большее количество антигенсвязывающих доменов находятся в столь близкой степени, что это является достаточным для достижения требуемых функций (видов активности) антигенсвязывающей молекулы, указанной в настоящем описании. Примеры требуемых функций (видов активности) включают активность, удерживающую две антигенные молекулы в пространственно близких положениях; активность, регулирующую взаимодействие между двумя антигенными молекулами; активность, способствующую активации рецептора лигандом; активность, способствующую каталитической реакции фермента с субстратом; активность, способствующую взаимодействию между клеткой, которая экспрессирует первый антиген, и клеткой, которая экспрессирует второй антиген; активность, усиливающую повреждение клетки-мишени клеткой с цитотоксической активностью (такой как Т-клетка, NK-клетка, моноцит, макрофаг); активность, регулирующую активацию двух антигенных молекул, которые активируются путем ассоциации друг с другом; и устойчивость к расщеплению протеазой антигенсвязывающих молекул.

В варианте осуществления изобретения, не ограничивающем его объем, связь между антигенсвязывающими доменами, содержащимися в антигенсвязывающей молекуле, указанной в настоящем описании, может представлять собой ковалентную связь или нековалентную связь. Ковалентная связь может представлять собой ковалентную связь, которая образуется непосредственно путем перекрестного сшивания аминокислотного остатка в первом антигенсвязывающем домене и аминокислотного остатка во втором антигенсвязывающем домене, например, дисульфидную связь между остатками цистеина. Непосредственно перекрестно сшитый аминокислотный остаток может присутствовать во фрагменте антитела, таком как Fab, или в шарнирной области.

В другом варианте осуществления изобретения ковалентная связь образуется путем перекрестного сшивания аминокислотного остатка в первом антигенсвязывающем домене и аминокислотного остатка во втором антигенсвязывающем домене через перекрестносшивающий агент. Например, когда аминореактивный перекрестносшивающий агент применяют для перекрестного сшивания, то перекрестное сшивание может происходить через свободную аминогруппу N-концевой аминокислоты антигенсвязывающего домена или первичный амин боковой цепи остатка лизина в антигенсвязывающем домене. Аминореактивные перекрестносшивающие агенты включают функциональную группу, которая образует химическую связь с первичным амином, такую как изотиоцианат, изоцианат, ацилазид, сложный NHS-эфир, сульфонилхлорид, альдегид, глиоксаль, эпоксид, оксиран, карбонат, арилгалид, сложный эфир имида, карбодиимид, ангидрид и сложный фторэфир. Репрезентативные примеры включают DSG (дисукцинимидилглутарат), DSS (дисукцинимидилсуберат), BS3 (бис(сульфосукцинимидил)суберат), DSP (дитиобис(сукцинимидилпропионат)), DTSSP (3,3'-дитиобис(сульфосукцинимидилпропионат)), DST (дисукцинимидилтартрат), BSOCOES (бис(2-(сукцинимидоксикарбонилокси)этил)сульфон), EGS (этиленгликольбис(сукцинимидилсукцинат)), сульфо-EGS (этиленгликольбис (сульфосукцинимидилсукцинат)), DMA (диметиладипимидат), DMP (диметилпимелимидат), DMS (диметилсуберимидат) и DFDNB (1,5-дифтор-2,4-динитробензол). Примеры других перекрестносшивающих агентов включают карбоксил/аминореактивный агент, сульфгидрилреактивный агент, альдегидреактивный агент и реагирующий на свет перекрестносшивающий агент.

Нековалентная связь для сцепления антигенсвязывающих доменов может представлять собой ионную связь, водородную связь или гидрофобную связь.

Является ли количество связей между антигенсвязывающими доменами большим, чем в контрольной антигенсвязывающей молекуле (например, антигенсвязывающей молекуле, которая имеет структуру в достаточной степени сходную со структурой встречающегося в естественных условиях антитела), можно оценивать, например, следующим методом. Сначала представляющую интерес антигенсвязывающую молекулу и контрольную антигенсвязывающую молекулу обрабатывают протеазой, которая отрезает антигенсвязывающий домен (например, протеазой, которая расщепляет N-концевую сторону сайт перекрестного сшивания шарнирной области, такой как папаин и Lys-C), а затем подвергают электрофорезу в невосстанавливающих условиях. Затем применяют антитело, которое распознает часть антигенсвязывающего домена (например, антитело к каппа-цепи, меченное HRP), для идентификации фрагментов, которые присутствуют после обработки протеазой. Когда в контрольной антигенсвязывающей молекуле выявляется только мономер антигенсвязывающего домена (например, мономер Fab), а в представляющей интерес антигенсвязывающей молекуле выявляется мультимер антигенсвязывающего домена (например, димер Fab), то можно считать, что количество связей между антигенсвязывающими доменами в представляющей интерес антигенсвязывающей молекуле больше, чем в контрольной антигенсвязывающей молекуле.

Образование дисульфидной связи между цистеинами в модифицированной антигенсвязывающей молекуле, полученной путем интродукции цистеинов в контрольную антигенсвязывающую молекулу можно оценивать, например, следующим методом. Сначала представляющую интерес антигенсвязывающую молекулу инкубируют с химотрипсином в 20 мМ фосфатном буфере (рН 7,0), а затем определяют с помощью ЖХ/МС массу пептидов, которые, как ожидается, должны создаваться из аминокислотной последовательности каждого антитела. Если идентифицирован компонент, соответствующий теоретической массе пептида, который должен создаваться, когда вновь интродуцированные цистеины образуют дисульфидную связь, то интродуцированные цистеины можно рассматривать как формирующие дисульфидную связь. Кроме того, если указанный компонент не поддается обнаружению, когда образец, содержащий указанную выше антигенсвязывающую молекулу, анализируют после добавления к образцу агента для восстановления дисульфидных связей (например, трис(2-карбоксиэтил)фосфин), то правильность вышеуказанной оценки должна быть дополнительно подвергнута строй верификации.

Устойчивость к расщеплению протеазой

В не ограничивающем объем изобретения варианте осуществления изобретения антигенсвязывающая молекула, указанная в настоящем описании, обладает устойчивостью к расщеплению протеазой. В некоторых вариантах осуществления изобретения устойчивость к расщеплению протеазой антигенсвязывающей молекулы, указанной в настоящем описании, повышается по сравнению с контрольной антигенсвязывающей молекулой (например, антигенсвязывающей молекулой, которая имеет структуру, практически сходную со структурой встречающегося в естественных условиях антитела), в которой количество связей между антигенсвязывающими доменами меньше на одну или несколько по сравнению с антигенсвязывающей молекулой. В другом варианте осуществления изобретения одну связь, на которую уменьшено количество связей, можно выбирать из связей, в которых аминокислотные остатки, из которых создаются связи между антигенсвязывающими доменами, имеют происхождение из мутантных аминокислотных остатков, которые не присутствуют в Fab или шарнирной области дикого типа (например, остатков цистеина, которые не присутствуют в Fab или шарнирной области дикого типа). Если доля полноразмерной молекулы (например, полноразмерной молекулы IgG), сохранившейся после расщепления протеазой, увеличивается или доля конкретного фрагмента (например, мономера Fab), полученного после расщепления протеазой, снижается в антигенсвязывающей молекуле по сравнению с контрольной антигенсвязывающей молекулой, то это можно рассматривать как повышение устойчивости к расщеплению протеазой (повышение устойчивости к протеазе).

В некоторых вариантах осуществления изобретения доля полноразмерной молекулы, сохранившейся после расщепления протеазой, может составлять относительно всех антигенсвязывающих молекул, например, 0,5% или более, 1% или более, 1,5% или более, 2% или более, 2,5% или более, 3% или более, 3,5% или более, 4% или более, 4,5% или более, 5% или более, 7,5% или более, 10% о или более, 12,5% или более, 15% или более, 20% или более, 25% или более, 30% или более, 35% или более, 40% или более, 45% или более, или 50% или более. В некоторых других вариантах осуществления изобретения доля мономера антигенсвязывающего домена (например, Fab), образовавшегося после обработки протеазой, может составлять относительно всех антигенсвязывающих молекул, например, 99% или менее, 98% или менее, 97% или менее, 96% или менее, 95% или менее, 94% или менее, 93% или менее, 92% или менее, 91% или менее, 90% или менее, 85% или менее, 80% или менее, 75% или менее, 70% или менее, 60% или менее, 50% или менее, 40% или менее, 30% или менее, 20% или менее или 10% или менее. В некоторых других вариантах осуществления изобретения доля димера антигенсвязывающего домена (например, Fab), образовавшегося после обработки протеазой, может составлять относительно всех антигенсвязывающих молекул, например, 0,5% или более, 1% или более, 1.5% или более, 2% или более, 2.5% или более, 3% или более, 3.5% или более, 4% или более, 4.5% или более, 5% или более, 7.5% или более, 10% или более, 12.5% или более, 15% или более, 20% или более, 25% или более, 30% или более, 35% или более, 40% или более, 45% или более или 50% или более.

Примеры протеаз включают (но, не ограничиваясь только ими) Lys-C, плазмин, человеческую нейтрофильную эластазу (HNE) и папаин.

В дополнительном объекте изобретения антигенсвязывающая молекула, указанная в любом из приведенных выше вариантов осуществления изобретения, может обладать любыми особенностями, индивидуально или в комбинации, описанными ниже в разделах 1-7:

1. Аффинность антигенсвязывающих молекул

В некоторых вариантах осуществления изобретения антигенсвязывающая молекула, предлагаемая в изобретении, имеет величину константы диссоциации (Kd), составляющую 1 мкМ или менее, 100 нМ или менее, 10 нМ или менее, 1 нМ или менее, 0,1 нМ или менее, 0,01 нМ или менее или 0,001 нМ или менее (например, 10^-8 М или менее, например, от 10^-8 М до 10^-13 М, например, от 10^-9 М до 10^-13 M).

2. Фрагменты антител

В некоторых вариантах осуществления изобретения антигенсвязывающая молекула, представленная в настоящем описании, представляет собой фрагмент антитела. Фрагменты антител включают (но, не ограничиваясь только ими) такие фрагменты как Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')₂, Fv и scFv и другие фрагменты, указанные в настоящем описании. Обзор некоторых фрагментов антител см. у Hudson и др., Nat. Med. 9, 2003, cc. 129-134. Обзор scFv-фрагментов см., например, у в: The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, под ред. Rosenburg и Moore, изд-во Springer, New York, т.113, 1994, cc. 269-315; см. также WO 93/16185; и US №№5571894 и 5587458. Обсуждение, касающееся Fab- и F(ab')₂-фрагментов, которые содержат остатки эпитопа, связывающегося с рецептором спасения, и обладают удлиненным временем полужизни in vivo, см. в US №5869046.

Димерные антитела представляют собой фрагменты антител с двумя антигенсвязывающими сайтами, которые могут быть двухвалентными или биспецифическими (см., например, ЕР 0404097; WO 1993/01161; Hudson и др., Nat. Med. 9, 2003, cc. 129-134; и Holliger и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 1993, cc. 6444-6448). Тримерные и тетрамерные антитела описаны также у Hudson и др., Nat. Med. 9, 2003, cc. 129-134).

3. Химерные и гуманизированные антитела

В некоторых вариантах осуществления изобретения антигенсвязывающая молекула, указанная в настоящем описании, представляет собой химерное антитело. Некоторые химерные антитела описаны, например, в US №4816567; и у Morrison и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 1984, cc. 6851-6855. В одном из примеров химерное антитело содержит нечеловеческую вариабельную область (например, вариабельную область из антитела мышей, крыс, хомяков, кроликов или приматов кроме человека, таких как обезьяны) и человеческую константную область. В другом примере химерное антитело представляет собой антитело «переключенного класса», класс или подкласс которого был изменен относительно родительского антитела. Химерные антитела включают их антигенсвязывающие фрагменты.

В некоторых вариантах осуществления изобретения химерное антитело представляет собой гуманизированное антитело. Как правило, нечеловеческое антитело гуманизируют для снижения иммуногенности для людей, сохраняя при этом специфичность и аффинность родительского нечеловеческого антитела. Как правило, гуманизированное антитело содержит один или несколько вариабельных доменов, в которых HVR, например, CDR (или их участки), получают из нечеловеческого антитела, a FR (или их участки) получают из последовательностей человеческого антитела. Гуманизированное антитело необязательно может содержать по меньшей мере часть человеческой константной области. В некоторых вариантах осуществления изобретения некоторые остатки FR в гуманизированном антителе заменены на соответствующие остатки из нечеловеческого антитела (например, антитела, из которого имеют происхождение HVR), например, для сохранения или улучшения специфичности или аффинности антитела.

4. Человеческие антитела

В некоторых вариантах осуществления изобретения антигенсвязывающая молекула, указанная в настоящем описании, представляет собой представляет собой человеческое антитело. Человеческие антитела можно получать, используя различные методики, известные в данной области. Человеческие антитела описаны в целом у van Dijk и van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5, 2001, cc. 368-374 и Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20, 2008. cc. 450-459.

5. Антигенсвязывающие молекулы, полученные из библиотек

Антигенсвязывающие молекулы, предлагаемые в изобретении, можно выделять путем скрининга комбинаторных библиотек антигенсвязывающих молекул с требуемой активностью или видами активности. Например, в данной области известны разнообразные методы для создания фаговых дисплейных библиотек и скрининга указанных библиотек в отношении антигенсвязывающих молекул, обладающих требуемыми характеристиками связывания. Указанные методы обобщены, например, у Hoogenboom и др., в: Methods in Molecular Biology 178, 2001, cc. 1-37 (под ред. O'Brien и др., изд-во Human Press, Totowa, NJ), и описаны также, например, у McCafferty и др., Nature 348, 1990, cc. 552-554; Clackson и др.. Nature 352, 1991, cc. 624-628; Marks и др., J. Mol. Biol. 222, 1992, cc. 581-597; Marks и Bradbury, в: Methods in Molecular Biology 248, 2003, cc. 161-175 (под ред. Lo., изд-во Human Press, Totowa, NJ); Sidhu и др., J. Mol. Biol. 338, 2004, cc. 299-310; Lee и др., J. Mol. Biol. 340, 2004, cc. 1073-1093; Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101, 2004, cc. 12467-12472 и Lee и др., J. Immunol. Methods 284, 2004, cc. 119-132.

6. Мультиспецифические антигенсвязывающие молекулы

В некоторых вариантах осуществления изобретения антигенсвязывающая молекула, указанная в настоящем описании, представляет собой мультиспецифическую антигенсвязывающую молекулу, например, биспецифическую антигенсвязывающую молекулу. Мультиспецифические антигенсвязывающие молекулы представляют собой моноклональные антигенсвязывающие молекулы, которые имеют специфичности, связывающиеся по меньшей мере с двумя различными сайтами. В некоторых вариантах осуществления изобретения одна из связывающих специфичностей обеспечивает связывание с конкретным антигеном (например, CD3), а другая с любым другим антигеном (например, CD28 или раковым антигеном). В некоторых вариантах осуществления изобретения биспецифические антигенсвязывающие молекулы могут связываться с двумя различными эпитопами одного антигена. Биспецифические антигенсвязывающие молекулы можно получать в виде полноразмерных антител или фрагментов антител.

Методики создания мультиспецифических антигенсвязывающих молекул включают (но, не ограничиваясь только ими) рекомбинантную совместную экспрессию двух пар тяжелых цепей-легких цепей иммуноглобулинов, обладающих различными специфичностями (см. Milstein и Cuello, Nature 305, 1983, cc. 537-540, WO 93/08829 и Traunecker и др., ЕМВО J. 10,1991, cc. 3655-3659), и технологию «knob-in-hole» (обеспечение взаимодействия по типу «выступ-во-впадину», см., например, US №5731168). Мультиспецифические антигенсвязывающие молекулы можно получать также путем создания регулируемых электростатических воздействий для получения молекул антитела с гетеродимерными Fc (WO 2009/089004); перекрестного связывания двух или большего количества антител или фрагментов (см., например, US №4676980 и Brennan и др.. Science 229, 1985, cc. 81-83); применения лейциновых молний для получения биспецифических антител (см., например, Kostelny и др., J. Immunol. 148, 1992, cc. 1547-1553); применения технологии «димерных антител (диабоди)» для создания фрагментов биспецифических антител (см., например, Holliger и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 1993, cc. 6444-6448); и применения димеров одноцепочечных Fv (sFv) (см., например, Gruber и др., J. Immunol. 152, 1994, cc. 5368-5374); и получения триспецифических антител согласно методу, описанному, например, у Tutt и др., J. Immunol. 147, 1991, cc. 60-69).

Под объем настоящего изобретения подпадают также сконструированные антитела с тремя или большим количеством функциональных антигенсвязывающих сайтов, включая «антитела-осьминоги» (см., например, US 2006/0025576А1).

7. Варианты антигенсвязывающих молекул

Некоторые варианты осуществления изобретения относятся к вариантам аминокислотных последовательностей антигенсвязывающих молекул, указанных в настоящем описании. Например, может требоваться повышать аффинность связывания и/или другие биологические свойства антигенсвязывающей молекулы. Варианты аминокислотной последовательности антигенсвязывающей молекулы можно получать путем интродукции соответствующих модификаций в нуклеотидную последовательность, кодирующую антигенсвязывающую молекулу, или путем синтеза пептидов. Указанные модификации включают, например, делеции и/или инсерции, и/или замены остатков в аминокислотных последовательностях антигенсвязывающей молекулы. Для получения конечной конструкции можно использовать любую комбинацию делеций, инсерций и замен при условии, что конечная конструкция обладает требуемыми характеристиками, например, способностью связываться с антигеном.

а) Варианты полученные путем замены, инсерций и делеции

Некоторыми вариантами осуществления изобретения являются варианты антигенсвязывающих молекул, которые имеют одну или несколько аминокислотных замен. Сайты, представляющие интерес для замещающего мутагенеза, включают HVR и FR. Консервативные замены представлены ниже в таблице под заголовком «предпочтительные замены». Более важные замены представлены ниже в таблице под заголовком «приведенные в качестве примера замены», и они дополнительно описаны ниже со ссылкой на классы боковых цепей аминокислот. Аминокислотные замены можно интродуцировать в представляющую интерес антигенсвязывающую молекулу и продукты подвергать скринингу в отношении требуемой активности, например, сохранения/повышения способности к связыванию антигена, пониженной иммуногенности или повышенной ADCC или CDC.

Аминокислоты можно группировать на основе общих свойств боковых цепей следующим образом:

(1) гидрофобные: норлейцин, Met, Ala, Val, Leu, Ile;

(2) нейтральные гидрофильные: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;

(3) кислые: Asp, Glu;

(4) основные: His, Lys, Arg;

(5) остатки, которые влияют на ориентацию цепи: Gly, Pro;

(6) ароматические: Trp, Tyr, Phe.

Под неконсервативными заменами подразумевают замену представителя одного из указанных классов на представителя из другого класса.

Один из типов полученного в результате замены варианта включает замену одного или нескольких остатков гипервариабельного участка родительской антигенсвязывающей молекулы (например, гуманизированного или человеческого антитела). Как правило, полученный(ые) в результате вариант(ы), отобранный(ые) для дополнительного исследования, должен(ы) иметь модификации (например, улучшения) некоторых биологических свойств (например, повышенную аффинность, пониженную иммуногенность) относительно родительской антигенсвязывающей молекулы и/или должен(ны) иметь практически сохраненные определенные биологические свойства родительской антигенсвязывающей молекулы. Примером полученного в результате замены варианта является антитело с созревшей аффинностью, которое можно создавать, например, с использованием технологий созревания аффинности на основе фагового дисплея, например, указанных в настоящем описании. В целом, метод состоит в следующем: один или несколько остатков HVR подвергают мутации и варианты антител экспонируют на фаге и подвергают скринингу в отношении конкретной биологической активности (например, аффинности связывания).

Изменения (например, замены) можно осуществлять в HVR, например, для повышения аффинности антигенсвязывающей молекулы. Указанные изменения можно делать в «горячих (активных) точках» в HVR, т.е. остатках, кодируемых кодонами, которые с высокой частотой подвергаются мутации в процессе соматического созревания (см., например, Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207, 2008, cc. 179-196), и/или в остатках, которые контактируют с антигеном, с последующим тестированием варианта VH или VL в отношении аффинности связывания. Созревание аффинности путем создания вторичных библиотек и их повторной селекции описано, например, у Hoogenboom и др., Methods in Molecular Biology, 178, под ред. O'Brien и др., изд-во Human Press, Totowa, NJ, 2002, cc. 1-37. В некоторых вариантах осуществления процесса созревания аффинности интродуцируют разнообразие в гены вариабельной области, выбранные для созревания, с помощью любого из широкого разнообразия методов (например, ПЦР пониженной точности, перестановка цепи или сайт направленный мутагенез с использованием олигонуклеотидов). Затем создают вторичную библиотеку. После этого библиотеку подвергают скринингу для идентификации любых вариантов антигенсвязывающих молекул с требуемой аффинностью. Другой метод, применяемый для интродукции разнообразия, включает подходы, мишенью которых является HVR, при которых рандомизируют несколько остатков HVR (например, одновременно 4-6 остатков). Остатки HVR, участвующие в связывании антигена, можно специфически идентифицировать, например, используя аланин-сканирующий мутагенез или моделирование. Часто мишенями являются, прежде всего, CDR-Н3 и CDR-L3.

В некоторых вариантах осуществления изобретения замены, инсерции или делеции могут затрагивать один или несколько HVR, если указанные изменения не снижают существенно способность антигенсвязывающей молекулы связываться с антигеном. Например, в HVR могут быть сделаны консервативные изменения (например, консервативные замены, указанные в настоящем описании), которые не снижают существенно аффинность связывания. Указанные изменения, например, могут находиться вне принимающих участие в контактировании с антигеном остатков HVR. В некоторых вариантах осуществления изобретения в последовательностях вариантов VH и VL, указанных выше, каждый HVR либо является неизмененным, либо содержит не более одной, двух или трех аминокислотных замен.

Ценным методом идентификации остатков или областей антигенсвязывающей молекулы, которые можно подвергать мутагенезу, является так называемый «аланин-сканирующий мутагенез», описанный у Cunningham и Wells, Science 244, 1989, cc. 1081-1085. При осуществлении этого метода остаток или группу остатков-мишеней (например, заряженные остатки, такие как arg, asp, his, lys и glu) идентифицируют и заменяют на нейтральную или отрицательно заряженную аминокислоту (например, аланин или полиаланин) для решения вопроса о том, будет ли это влиять на взаимодействие антигенсвязывающей молекулы с антигеном. Дополнительные замены можно интродуцировать в те положения аминокислот, для которых продемонстрирована функциональная чувствительность к начальным заменам. В альтернативном или дополнительном варианте можно анализировать кристаллическую структуру комплекса антигенов и антигенсвязывающей молекулы для идентификации точек контакта между антигенсвязывающей молекулой и антигеном. Указанные контактирующие остатки и соседние остатки можно рассматривать в качестве мишеней или исключать из рассмотрения в качестве кандидатов для замены. Варианты можно подвергать скринингу для решения вопроса о том, обладают ли они требуемыми свойствами.

Инсерции в аминокислотные последовательности включают амино- и/или карбоксиконцевые слияния, варьирующиеся по длине от одного остатка до полипептидов, содержащих сто или большее количество остатков, а также инсерции одного или нескольких аминокислотных остатков внутрь последовательности. Примером результата осуществления концевых инсерции является антигенсвязывающая молекула с N-концевым метионильным остатком. Другие инсерционные варианты антигенсвязывающей молекулы включают слияние N- или С-концов антигенсвязывающей молекулы с ферментом (например, для ADEPT) или полипептидом, который удлиняет время полужизни антигенсвязывающей молекулы в плазме.

б) Варианты гликозилирования

В некоторых вариантах осуществления изобретения антигенсвязывающую молекулу, указанную в настоящем описании, изменяют с целью повышения или понижения степени гликозилирования антигенсвязывающей молекулы. Добавление или делецию сайтов гликозилирования в антигенсвязывающей молекуле можно легко осуществлять путем такого изменения аминокислотной последовательности, которое позволяет создавать или удалять один или несколько сайтов гликозилирования.

Если антигенсвязывающая молекула содержит Fc-область, то можно изменять присоединенный к ней углевод. Нативные антитела, которые продуцируются клетками млекопитающих, как правило; содержат разветвленный биантенный олигосахарид, который, как правило, присоединен с помощью N-связи к Asn297 СН2-домена Fc-области (см., например, Wright и др., TIBTECH 15, 1997, cc. 26-32). Олигосахарид может включать различные углеводы, например, маннозу, N-ацетилглюкозамин (GlcNAc), галактозу и сиаловую кислоту, а также фукозу, присоединенную к GlcNAc в «стебле» биантенной олигосахаридной структуры. В некоторых вариантах осуществления изобретения модификации олигосахарида в антигенсвязывающей молекуле, предлагаемой в изобретении, можно осуществлять для создания вариантов антигенсвязывающих молекул с определенными улучшенными свойствами.

Одним из вариантов осуществления изобретения являются варианты антигенсвязывающих молекул, имеющие углеводную структуру, в которой снижено содержание фукозы, присоединенной (прямо или косвенно) к Fc-области. Например, содержание фукозы в указанной антигенсвязывающей молекуле может составлять от 1% до 80%, от 1% до 65%, от 5% до 65% или от 20% до 40%. Содержание фукозы определяют путем расчета среднего содержания фукозы в сахарной цепи на Asn297 относительно суммы всех гликоструктур, присоединенных к Asn297 (например, комплексных, гибридных структур и структур с высоким содержанием маннозы), которое измеряют с помощью MALDI-TOF-масс-спектрометрии согласно методу, описанному, например, в WO 2008/077546. Asn297 обозначает остаток аспарагина, присутствующий примерно в положении 297 в Fc-области (EU-нумерация остатков Fc-области); однако вследствие минорных вариаций антигенсвязывающих молекул Asn297 может располагаться также в положении, находящемся на расстоянии примерно ±3 аминокислоты в прямом или обратном направлении от положения 297, т.е. между положениями 294 и 300. Указанные фукозилированные варианты могут обладать улучшенной ADCC-функцией (см., например, US 2003/0157108 (Presta L.); US 2004/0093621 (фирма Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd). Примерами публикаций, касающихся «дефукозилированных» или «с дефицитом фукозы» антигенсвязывающих молекул, являются: US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO 2005/053742; WO 2002/031140; Okazaki и др., J. Mol. Biol. 336, 2004, cc. 1239-1249; Yamane-Ohnuki и др., Biotech. Bioeng. 87, 2004, с. 614. Примерами клеточных линий, которые обладают способностью продуцировать дефукозилированные антигенсвязывающие молекулы, являются Lec13 СНО-клетки с дефицитом белкового фукозилирования (Ripka и др., Arch. Biochem. Biophys. 249, 1986, cc. 533-545; US 2003/0157108 (Presta L.) и WO 2004/056312 (Adams и др., см., прежде всего, пример 11), и клеточные линии с «выключенным» геном, например, СНО-клетки с «выключенным» геном альфа-1,6-фукозилтрансферазы, FUT8 (см., например, Yamane-Ohnuki и др., Biotech. Bioeng. 87, 2004, cc. 614-622); Kanda и др., Biotechnol. Bioeng., 94(4), 2006, cc. 680-688; и WO 2003/085107).

Кроме того, описаны варианты антигенсвязывающих молекул с бисекционными олигосахаридами, например, в которых биантенный олигосахарид, присоединенный к Fc-области антигенсвязывающей молекулы, бисекционируется с помощью GlcNAc. Указанные варианты антигенсвязывающих молекул могут отличаться пониженным фукозилированием и/или повышенной ADCC-функцией. Примеры указанных вариантов антител описаны, например, в WO 2003/011878 (Jean-Mairet и др.); US №6602684 (Umana и др.) и US 2005/0123546 (Umana и др.). Предложены также варианты антигенсвязывающих молекул по меньшей мере с одним остатком галактозы в олигосахариде, присоединенном к Fc-области. Указанные варианты антигенсвязывающих молекул могут обладать повышенной CDC-функцией. Указанные варианты антигенсвязывающих молекул описаны, например, в WO 1997/30087 (Patel и др.); WO 1998/58964 (Raju S.); и WO 1999/22764 (Raju S.).

в) Варианты Fc-области

Согласно конкретным вариантам осуществления изобретения можно интродуцировать в Fc-область антигенсвязывающей молекулы, указ-анной в настоящем описании, одну или несколько аминокислотных модификаций, создавая тем самым вариант Fc-области. Вариант Fc-области может содержать последовательность человеческой Fc-области (например, Fc-области человеческого IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4), включающую аминокислотную модификацию (например, замену) в одном или нескольких аминокислотных положениях.

Некоторые варианты осуществления изобретения относятся к варианту антигенсвязывающей молекулы, который обладает некоторыми, но не всеми эффекторными функциями, что делает его перспективным кандидатом для путей применения, для которых является важным время полужизни антигенсвязывающей молекулы in vivo, однако некоторые эффекторные функции (такие как CDC и ADCC) не являются необходимыми или являются вредными. Можно осуществлять анализы цитотоксичности in vitro и/или in vivo для подтверждения снижения/истощения CDC- и/или ADCC-активности. Например, можно осуществлять анализы связывания Fc-рецептора (FcR) для гарантии того, что у антигенсвязывающей молекулы отсутствует способность к связыванию с Fc-гамма R (и поэтому, вероятно, отсутствует ADCC-активность), но сохраняется способность связываться с FcRn. Первичные клетки, опосредующие ADCC, т.е. NK-клетки, экспрессируют только Fc-гамма RIII, в то время как моноциты экспрессируют Fc-гамма RI, Fc-гамма RII и Fc-гамма RIII. Данные об экспрессии FcR на гематопоэтических клетках обобщены в таблице 3 на с. 464 у Ravetch и Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9, 1991, cc. 457-492. Примерами анализов in vitro ADCC-активности представляющей интерес молекулы являются (но, не ограничиваясь только ими) анализы, описанные в US №5500362 (см., например, Hellstrom и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 1986, cc. 7059-7063 и Hellstrom и др., Proc. Nat'1 Acad. Sci. USA 82, 1985, cc. 1499-1502); US №5821337 (см. Bruggemann и др., J. Exp. Med. 166, 1987, cc. 1351-1361). В альтернативном варианте можно применять нерадиоактивные методы анализа (см., например, нерадиоактивный анализ цитотоксичности АСТ1™ на основе проточной цитометрии (фирма CellTechnology, Inc. Маунтин-Вью, шт. Калифорния); и нерадиоактивный анализ цитотоксичности CytoTox 96® (фирма Promega, Мэдисон, шт. Висконсин). Пригодными для таких анализов эффекторными клетками являются мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) и естественные клетки-киллеры (NK). В альтернативном или дополнительном варианте ADCC-активность представляющей интерес молекулы можно оценивать in vivo, например, на животной модели, например, как описано у Clynes и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 1998, cc. 652-656. Можно осуществлять также анализы связывания C1q для подтверждения того, что антигенсвязывающая молекула не может связывать C1q и поэтому у нее отсутствует CDC-активность (см., например, описание ELISA для оценки связывания C1q и С3 с в WO 2006/029879 и WO 2005/100402). Для оценки активации комплемента можно осуществлять анализ CDC (см., например, Gazzano-Santoro и др., J. Immunol. Methods 202, 1996, cc. 163-171; Cragg и др., Blood 101, 2003, cc. 1045-1052; и Cragg, Blood 103, 2004, cc. 2738-2743). Определение FcRn-связывания и клиренса/времени полужизни in vivo можно осуществлять также с использованием методов, известных в данной области (см., например, Petkova и др., Int'1. Immunol. 18(12), 2006, cc. 1759-1769).

Антигенсвязывающие молекулы с пониженной эффекторной функцией включают молекулы с заменой одного или нескольких из следующих остатков Fc-области, таких как 238, 265, 269, 270, 297, 327 и 329 (см., например, US №6737056). К указанным мутантам Fc относятся мутанты Fc с заменами в двух или большем количестве из следующих аминокислотных положений: 265, 269, 270, 297 и 327, включая так называемый мутант «DANA» Fc-области, несущий замену остатков 265 и 297 на аланин (US №7332581).

Описаны некоторые варианты антигенсвязывающих молекул с повышенной или пониженной способностью связываться с FcR (см., например, US №6737056; WO 2004/056312 и Shields и др., J. Biol. Chem. 276, 2001, cc. 6591-6604).

В некоторых вариантах осуществления изобретения вариант антигенсвязывающей молекулы содержит Fc-область с одной или несколькими аминокислотными заменами, которые повышают ADCC, например, замены в положениях 298, 333 и/или 334 Fc-области (EU-нумерация остатков).

В некоторых вариантах осуществления изобретения в Fc-области осуществляют изменения, которые приводят к измененной (т.е. либо повышенной, либо пониженной) способности связывать C1q и/или комплементзависимой цитотоксичности (CDC), что описано, например, в US №6194551, WO 1999/51642 и у Idusogie и др., J. Immunol. 164, 2000, cc. 4178-4184.

Антитела с удлиненным временем полужизни и повышенной способностью к связыванию с неонатальным Fc-рецептором (FcRn), который ответствен за перенос материнских IgG эмбриону (Guyer и др., J. Immunol. 117, 1976, cc. 587-593 и Kim и др., J. Immunol. 24, 1994, cc. 2429-2434), описаны в US 2005/0014934А1 (Hinton и др.). Эти антитела содержат Fc-область с одной или несколькими заменами, которые повышают связывание Fc-области с FcRn. Указанные варианты Fc-области включают варианты с заменами одного или нескольких из следующих остатков Fc-области: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 или 434, например, замену остатка 434 в Fc-области (US №7371826). Дополнительные примеры, касающиеся других вариантов Fc-области, описаны также у Duncan, Nature 322, 1988, cc. 738-740; в US №№5648260 и 5624821 и в WO 1994/29351.

г) Варианты антигенсвязывающих молекул, сконструированные с помощью цистеина

В некоторых вариантах осуществления изобретения может оказаться желательным создавать антигенсвязывающие молекулы, сконструированные с помощью цистеина, например, «тиоМАт», в которых один или несколько остатков в антигенсвязывающей молекуле заменены на остатки цистеина. В конкретных вариантах осуществления изобретения замененные остатки находятся в доступных сайтах антигенсвязывающей молекулы. Путем замены этих остатков на цистеин реакционноспособные тиольные группы помещаются в доступные сайты антигенсвязывающей молекулы и могут использоваться для конъюгации антигенсвязывающей молекулы с другими фрагментами, такими как фрагменты, представляющие собой лекарственное средство, или фрагменты, представляющие собой линкер, связанный с лекарственным средством, с созданием иммуноконъюгата, указанного ниже в настоящем описании. В некоторых вариантах осуществления изобретения любой(ые) один или несколько из следующих остатков может(гут) быть заменен(ы) на цистеин: V205 (нумерация по Кэботу) легкой цепи; А118 (EU-нумерация) тяжелой цепи и S400 (EU-нумерация) Fc-области тяжелой цепи. Антигенсвязывающие молекулы, сконструированные с помощью цистеина, можно создавать согласно методу, например, описанному в US №7521541.

д) Производные антигенсвязывающих молекул

В некоторых вариантах осуществления изобретения антигенсвязывающую молекулу, указанную в настоящем описании, можно дополнительно модифицировать таким образом, чтобы она содержала дополнительные небелковые фрагменты, известные в данной области и легкодоступные.) Фрагменты, пригодные для дериватизации антигенсвязывающей молекулы (но, не ограничиваясь только ими), водорастворимые полимеры. Примерами водорастворимых полимеров являются (но, не ограничиваясь только ими) полиэтиленгликоль (ПЭГ), сополимеры этиленгликоля/пропиленгликоля, карбоксиметилцеллюлоза, декстран, поливиниловый спирт, поливинилпирролидон, поли-1,3-диоксолан, поли-1,3,6-триоксан, сополимер этилена/малеинового ангидрида, поли аминокислоты (либо гомополимеры, либо статистические сополимеры) и декстран- или поли(н-винилпиролидон)полиэтиленгликоль, гомополимеры пропиленгликоля, сополимеры пропиленоксида/этиленоксида, полиоксиэтилированные полиолы (например, глицерин), поливиниловый спирт и их смеси.

Полиэтиленгликольпропиональдегид может иметь преимущество при производстве благодаря его стабильности в воде. Полимер может иметь любую молекулярную массу и может быть разветвленным или неразветвленным. Количество полимеров, присоединенных к антигенсвязывающей молекуле, может варьироваться и, если присоединено более одного полимера, то они могут представлять собой одинаковые или различные молекулы. В целом, количество и/или тип полимеров, применяемых для дериватизации, можно определять с учетом таких особенностей (но, не ограничиваясь только ими), как конкретные свойства или функции антигенсвязывающей молекулы, подлежащие усовершенствованию, предполагается ли применение производного антигенсвязывающей молекулы в терапии в определенных условиях, и т.д.

Касательно антигенсвязывающей молекулы, указанной в настоящем описании, примеры требуемого свойства (вида активности) могут включать (но, не ограничиваясь только ими) связывающую активность, нейтрализующую активность, цитотоксическую активность, агонистическую активность, антагонистическую активность и ферментативную активность. Агонистическая активность представляет собой активность внутриклеточной трансдукции сигналов, например, посредством связывания антитела с антигеном, таким как рецептор, для индукции изменения в некоторые виды физиологической активности. Примеры физиологической активности могут включать (но, не ограничиваясь только ими) пролиферативную активность, влияющую на выживание активность, активность дифференцировки, активность транскрипции, активность мембранного транспорта, связывающую активность, протеолитическую активность, фосфорилирующую/дефосфорилирующую активность, окислительно-восстановительную активность, активность переноса, нуклеолитическую активность, активность дегидратации, индуцирующую гибель клеток активность и индуцирующую апоптоз активность.

Другим вариантом осуществления изобретения являются конъюгаты антигенсвязывающей молекулы и небелкового фрагмента, которые можно избирательно нагревать, воздействуя на него излучением. В одном из вариантов осуществления изобретения небелковый фрагмент представляет собой углеродную нанотрубку (Kam и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102, 2005, cc. 11600-11605). Излучение может иметь любую длину волны и включает (но, не ограничиваясь только ими) длины волн, которые не повреждают обычные клетки, но которые нагревают небелковый фрагмент до температуры, при которой уничтожаются клетки, ближайшие к конъюгату: антигенсвязывающая молекула-небелковый фрагмент.

Б. Методы рекомбинации и композиции

Антигенсвязывающие молекулы можно получать, используя методы рекомбинации и композиции, например, описанные в US №4816567. Одним из вариантов осуществления изобретения является выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая антигенсвязывающую молекулу, указанную в настоящем описании (полипептид, содержащий антигенсвязывающий домен, указанный в настоящем описании. Указанная нуклеиновая кислота может кодировать аминокислотную последовательность, содержащую VL, и/или аминокислотную последовательность, содержащую VH антигенсвязывающей молекулы (например, легкие и/или тяжелые цепи антигенсвязывающей молекулы). Следующим вариантом осуществления изобретения является(ются) один или несколько векторов (например, экспрессионных векторов), который(е) содержит(ат) указанную нуклеиновую кислоту. Еще одним вариантом осуществления изобретения является клетка-хозяин, которая содержит указанную нуклеиновую кислоту. В одном из указанных вариантов осуществления изобретения клетка-хозяин содержит (например, в результате трансформации указанными векторами): (1) вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, которая кодирует аминокислотную последовательность, содержащую VL антигенсвязывающей молекулы, и аминокислотную последовательность, содержащую VH антигенсвязывающей молекулы, или (2) первый вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, которая кодирует аминокислотную последовательность, содержащую VL антигенсвязывающей молекулы, и второй вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, которая кодирует аминокислотную последовательность, содержащую VH антигенсвязывающей молекулы. В одном из вариантов осуществления изобретения клетка-хозяин представляет собой эукариотическую клетку, например, клетку яичника китайского хомячка (СНО) или лимфоидную клетку (например, Y0-, NS0-, Sp20-клетку). Одним из вариантов осуществления изобретения является способ получения антигенсвязывающей молекулы, предлагаемой в изобретении, который включает культивирование клетки-хозяина, содержащей нуклеиновую кислоту, которая кодирует антигенсвязывающую молекулу, описанную выше, в условиях, пригодных для экспрессии антигенсвязывающей молекулы, и необязательно выделение антигенсвязывающей молекулы из клетки-хозяина (или среды для культивирования клетки-хозяина).

Для рекомбинантного получения антигенсвязывающей молекулы, указанной в настоящем описании, нуклеиновую кислоту, которая кодирует антигенсвязывающую молекулу, например, описанную выше, выделяют и встраивают в один или несколько векторов для дальнейшего клонирования и/или экспрессии в клетке-хозяине. Указанную нуклеиновую кислоту легко можно выделять и секвенировать с использованием общепринятых процедур (например, путем использования олигонуклеотидных зондов, которые обладают способностью специфически связываться с генами, кодирующими тяжелые и легкие цепи антигенсвязывающей молекулы).

Приемлемые клетки-хозяева для клонирования или экспрессии кодирующих антигенсвязывающую молекулу векторов включают прокариотические или эукариотические клетки, представленные в настоящем описании. Например, антигенсвязывающие молекулы можно получать в бактериях, в частности, когда не требуется гликозилирование и связанная с Fc эффекторная функция. Сведения об экспрессии фрагментов антитела и полипептидов в бактериях см. например, в US №№5648237, 5789199 и 5840523 (см. также у Charlton в: Methods in Molecular Biology, под ред. Lo В.K.С., изд-во Humana Press, Totowa, NJ, т.248, 2003, cc. 245-254 описание экспрессии фрагментов антител в Е. coli.) После экспрессии антигенсвязывающую молекулу можно выделять из пасты бактериальных клеток в виде растворимой фракции и можно дополнительно очищать.

Помимо прокариотических организмов в качестве хозяев, пригодных для клонирования или экспрессии плазмид, которые кодируют антигенсвязывающую молекулу, можно использовать эукариотические микроорганизмы, такие как нитчатые грибы или дрожжи, включая штаммы грибов и дрожжей, пути гликозилирования которых были «гуманизированы», что позволяет получать антигенсвязывающую молекулу с частично или полностью человеческой схемой гликозилирования (см. Gerngross, Nat. Biotech. 22, 2004, cc. 1409-1414 и Li и др., Nat. Biotech. 24, 2006, cc. 210-215).

Клетки-хозяева, которые можно использовать для экспрессии гликозилированной антигенсвязывающий молекулы, получают также из многоклеточных организмов (беспозвоночных и позвоночных животных). Примерами клеток беспозвоночных являются клетки насекомых, а также можно применять клетки растений. Были выявлены многочисленные штаммы бакуловирусов и соответствующие пригодные для них в качестве хозяев клетки насекомых, прежде всего для трансфекции клеток Spodoptera frugiper da.

В качестве хозяев можно применять также культуры растительных клеток (см., например, US №№5959177, 6040498, 6420548, 7125978 и 6417429 (описание технологии PLANTIBODIES для получения антигенсвязывающих молекул в трансгенных растениях).

В качестве хозяев можно применять также клетки позвоночных. Например, можно использовать клеточные линии млекопитающих, которые адаптированы к росту в суспензии. Другими примерами приемлемых линий клеток-хозяев млекопитающих являются линия клеток почки обезьяны CV1I, трансформированная с помощью ОВ40 (COS-7); линия клеток почки эмбриона человека (HEK 293-клетки или клетки линии 293, описанные, например, у Graham и др., J. Gen. Virol., 36, 1977, cc. 59-74); клетки почки детеныша хомяка (BHK); клетки Сертоли мыши (ТМ4-клетки, описанные, например, у Mather, Biol. Reprod., 23, 1980, cc. 243-251); клетки почки обезьяны (CV1); клетки почки африканской зеленой мартышки (VERO-76,); клетки карциномы шейки матки человека (HELA); клетки почки собаки (MDCK); клетки печени бычьей крысы (BRL 3А); клетки легкого человека (W138); клетки печени человека (Нер G2); клетки опухоли молочной железы мыши (ММТ 060562); клетки TRI, описанные, например, у Mather и др., Annals N.Y. Acad. Sci., 383, 1982, cc. 44-68); клетки MRC 5 и клетки FS4. Другими ценными линиями клеток-хозяев млекопитающих являются клетки яичника китайского хомячка (СНО), включая DHFR -СНО-клетки (Urlaub и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 1980, cc. 4216-4220); и клеточные линии миеломы, такие как Y0, NS0 и Sp2/0. Обзор конкретных линий клеток-хозяев млекопитающих, которые можно применять для производства антигенсвязывающих молекул, см., например, у Yazaki и Wu, в: Methods in Molecular Biology под ред. В.K.С.Lo, изд-во Humana Press, Totowa, NJ, т.248, 2003, cc. 255-268.

В. Анализы

Представленные в настоящем описании антигенсвязывающие молекулы можно идентифицировать, осуществлять их скрининг или характеризовать их физические/химические свойства и/или виды биологической активности с помощью различных анализов, известных в данной области.

1. Анализы связывания и другие анализы

Согласно одному из объектов изобретения антигенсвязывающую молекулу, предлагаемую в изобретении, тестируют в отношении антигенсвязывающей активности с использованием известных методов, таких как ELISA, Вестерн-блоттинг и т.д.

2. Анализы активности

Одним из объектов изобретения являются анализы, предназначенные для идентификации антигенсвязывающих молекул, обладающих биологической активностью. Биологическая активность может включать, например, активность, удерживающую две антигенные молекулы в пространственно близких положениях, активность, регулирующую взаимодействие между двумя антигенными молекулами, активность, способствующую активации рецептора лигандом, активность, способствующую каталитической реакции фермента с субстратом, активность, способствующую взаимодействию между клеткой, которая экспрессирует первый антиген, и клеткой, которая экспрессирует второй антиген, активность, усиливающую повреждению клетки-мишени клеткой с цитотоксической активностью (такой как Т-клетка, NK-клетка, моноцит или макрофаг), активность, регулирующую активацию двух антигенных молекул, которые активируются путем ассоциации друг с другом, и устойчивость к расщеплению протеазой. Предложены также антигенсвязывающие молекулы, которые обладают указанной биологической активностью in vivo и/или in vitro.

Кроме того, антигенсвязывающая молекула, предлагаемая в изобретении, может обладать различными видами биологической активности в зависимости от типа антигенной молекулы, с которой связывается антигенсвязывающая молекула. Примеры указанных антигенсвязывающих молекул включают антигенсвязывающую молекулу, которая связывается с комплексом Т-клеточного рецептора (TCR) (например, CD3) и обладает способностью индуцировать Т-клеточную активацию (агонистическая активность); и антигенсвязывающую молекулу, которая связывается с молекулой суперсемейства TNF-рецептора (например, OX40 или 4-1 ВВ) или другими костимуляторными молекулами (например, CD28 или ICOS) и обладает активностью, способствующей указанной выше активации (агонистическая активность). В некоторых вариантах осуществления изобретения указанная биологическая активность, которая проявляется посредством связывания с антигенной молекулой, повышается или понижается при связывании двух или большего количества антигенсвязывающих доменов, которые содержатся в антигенсвязывающей молекуле, указанной в настоящем описании. Не ограничиваясь какой-либо теорией можно считать, что в некоторых вариантах осуществления изобретения может достигаться указанное повышение или понижение, поскольку взаимодействие между двумя или большим количеством антигенных молекул регулируется посредством связывания с антигенсвязывающей молекулой, указанной в настоящем описании (например, усиливается ассоциация между двумя или большим количеством антигенных молекул).

В некоторых вариантах осуществления изобретения антигенсвязывающую молекулу, предлагаемую в изобретении, тестируют в отношении указанной биологической активности. Удерживаются ли две антигенные молекулы в пространственной близости, можно оценивать с использованием таких методик, как анализ кристаллической структуры, электронная микроскопия и структурный анализ на основе электронной томографии комплекса, состоящего из антигенов и антигенсвязывающей молекулы. С помощью указанных выше методик можно оценивать также удерживаются ли два антигенсвязывающих домена в пространственной близости друг с другом и снижается ли подвижность двух антигенсвязывающих доменов. В частности, описание методик анализа трехмерной структуры IgG-молекул с помощью электронной томографии см., например, у Zhang и др., Sci. Rep.5, 2015, с. 9803. При осуществлении электронной томографии частоту встречаемости структур, которые может образовывать изучаемая молекула, можно определять с помощью гистограмм, дающих возможность осуществлять дистрибутивную оценку структурных изменений, таких пониженная подвижность доменов. Например, когда на гистограммах видна взаимосвязь между величинами, которые можно использовать в качестве связанных со структурой параметров, такими как расстояние и угол между двумя доменами, и частота их встречаемости, то можно считать, что подвижность двух доменов снижается, если их площади распределения уменьшаются. Активность, которая проявляется посредством взаимодействия и т.п.двух антигенных молекул, можно оценивать путем выбора и применения соответствующей системы измерения активности из числа известных в зависимости от типа антигенных молекул-мишеней. Воздействие расщепления протеазой можно оценивать с помощью методов, известных специалистам в данной области, или методов, описанных ниже в разделе «Примеры».

Г. Фармацевтические препаративные формы (фармацевтические композиции)

Фармацевтические препаративные формы антигенсвязывающей молекулы, указанной в настоящем описании, получают путем смешения указанной антигенсвязывающей молекулы, имеющей необходимую степень чистоты, с одним или несколькими необязательными фармацевтически приемлемыми носителями (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16-е изд. под ред. Osol A., 1980) в форме лиофилизированных композиций или водных растворов.

Фармацевтически приемлемые носители, как правило, являются нетоксичными для реципиентов в используемых дозах и концентрациях, они включают (но, не ограничиваясь только ими): буферы, такие как фосфатный, цитратный буферы, а также буферы на основе других органических кислот; антиоксиданты, включая аскорбиновую кислоту и метионин; консерванты (такие как хлорид октадецилдиметилбензиламмония; хлорид гексаметония; хлорид бензалкония; хлорид бензетония; фенол; бутиловый или бензиловый спирт; алкилпарабены, такие как метил- или пропилпарабен; катехол; резорцинол; циклогексанол; 3-пентанол и мета-крезол); полипептиды с низкой молекулярной массой (содержащие менее приблизительно 10 остатков); белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поли(винилпирролидон); аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включая глюкозу, маннозу или декстрины; хелатирующие агенты, такие как ЭДТК; сахара, такие как сахароза, маннит, трегалоза или сорбит; солеобразующие противоионы, такие как натрий; содержащие металл комплексы (например, комплексы Zn-белок); и/или неионогенные поверхностно-активные вещества, такие как полиэтиленгликоль (ПЭГ). В контексте настоящего описания примеры фармацевтически приемлемых носителей включают также диспергирующие агенты интерстициальных лекарственных средств, такие как растворимые активные в нейтральной среде гликопротеины гиалуронидаз (sHASEGP), например, человеческие растворимые гликопротеины гиалуронидазы РН-20, такие как CR) rHuPH20 (HYLENEX®, фирма Baxter International, Inc.). Некоторые примеры sHASEGP и методы их применения, в том числе rHuPH20, описаны в публикациях патентов США №№2005/0260186 и 2006/0104968. Согласно одному из объектов изобретения sHASEGP объединяют с одним или несколькими дополнительными гликозаминогликаназами, такими как хондроитиназы.

Примеры лиофилизированных препаративных форм антигенсвязывающих молекул описаны в US №6267958. Водные препаративные формы антигенсвязывающих молекул включают описанные в US №6171586 и WO 2006/044908, последние препаративные формы включают гистидин-ацетатный буфер.

Препаративная форма, указанная в настоящем описании, может содержать также более одного действующего вещества, если это необходимо для конкретного подлежащего лечению показания, предпочтительно вещества с дополнительными видами активности, которые не оказывают отрицательного воздействия друг на друга. Такие действующие вещества должны присутствовать в комбинации в количествах, эффективных для достижения поставленной цели.

Действующие вещества можно включать также в микрокапсулы, например, полученные с помощью методов коацервации или межфазной полимеризации, например в гидроксиметилцеллюлозные или желатиновые микрокапсулы и поли(метилметакрилатные) микрокапсулы соответственно, в коллоидные системы введения лекарственного средства (например, в липосомы, альбуминовые микросферы, микроэмульсии, наночастицы и нанокапсулы) или в макроэмульсии. Такие методы описаны в Remington's Pharmaceutical Sciences, 16-е изд., под ред. Osol A., 1980.

Можно приготавливать препараты с замедленным высвобождением. Приемлемыми примерами препаратов с замедленным высвобождением являются полупроницаемые матрицы из твердых гидрофобных полимеров, включающие антигенсвязывающую молекулу, такие матрицы представляют собой изделия определенной формы, например, пленки или микрокапсулы.

Препаративные формы, предназначенные для применения in vivo, как правило, должны быть стерильными. Стерильность можно легко обеспечивать, например, путем фильтрации через стерильные фильтрующие мембраны.

Примеры

Ниже приведены примеры антигенсвязывающих молекул и методов, предлагаемых в изобретении. Как должно быть очевидно, различные другие варианты осуществления изобретения можно применять на практике с учетом общего описания изобретения, представленного выше.

Пример 1. Концепция антитела с перекрестно сшитыми Fab

Агонистические антитела превосходят по своим характеристикам, таким как стабильность, фармакокинетика, и по методам их получения встречающиеся в естественных условиях лиганды и соответствующие слитые белки, и их разработка для фармацевтических целей идет полным ходом. Однако, в целом, агонистические антитела с сильной активностью получать труднее, чем просто связывающиеся или нейтрализующие антитела. Следовательно, требуется решение этой задачи.

Свойства, необходимые для агонистического антитела, могут зависеть от типа лиганда. Для агонистических антител против суперсемейства TNF-рецептора, типичными примерами которых являются рецептор смерти (DR), OX40, 4-1 ВВ, CD40 и т.п., установлено, что мультимеризация антитела или лиганда способствует активации. В качестве методик для повышения этого воздействия описано применение встречающихся в естественных условиях лигандов, перекрестное сшивание с помощью антител к Fc, перекрестное сшивание через FcγR, мультимеризация связывающих доменов антитела, мультимеризация через Fc антитела и т.п. для усиления агонистической активности. Известно, что для некоторых типов антигенов корректировка расстояния между антигенсвязывающими сайтами с помощью Fab-структуры антитела или scFv приводит к усилению агонистической активности независимо от мультимеризации.

В качестве другой методики описано получение агонистического антитела против цитокинового рецептора, которое представляет собой биспецифическое антитело, обладающее способностью связываться с различными эпитопами одного и того же антигена. Кроме того, описан метод повышения агонистической активности с использованием химической конъюгации для перекрестного сшивания двух различных Fab одинаковым образом.

Существует необходимость в большем количестве методов помимо описанных выше для повышения активности агонистических антител. Однако к нестоящему времени не описан простой метод для достижения этого. Таким образом, при создании изобретения был разработан метод перекрестного сшивания Fab друг с другом посредством интродукции минимальных мутаций и было продемонстрировано; что таким путем фактически повышается агонистическая активность, что полностью решает задачу, положенную в основу изобретения. Приведенный в качестве примера вариант представлен на фиг.1.

Пример 2. Получение экспрессионных векторов для модифицированных антител и экспрессия, и очистка модифицированных антител

Ген антитела, встроенный в экспрессионный вектор для клеток животных, подвергали обработке для замены аминокислотных остатков в последовательности с помощью метода, известного специалистам в данной области, используя ПЦР, набор для клонирования In-Fusion Advantage PCR (фирма TAKARA) или т.п., для конструирования экспрессионного вектора для модифицированного антитела. Нуклеотидную последовательность полученного экспрессионного вектора определяли с помощью метода, известного специалисту в данной области. Полученный экспрессионный вектор кратковременно интродуцировали в клетки FreeStyle293® или Expi293® (фирма Invitrogen) и клеткам давали экспрессировать модифицированное антитело в супернатанте культуры. Модифицированное антитело очищали из полученного супернатанта культуры с помощью метода, известного специалисту в данной области, используя rProtein A Sepharose® Fast Flow (фирма GE Healthcare). Абсорбцию при 280 нм измеряли с помощью спектрофотометра. Коэффициент абсорбции рассчитывали на основе измеренной величины, применяя метод РАСЕ, и использовали для расчета концентрации антитела (Protein Science 4, 1995, cc. 2411-2423).

Количество агрегатов модифицированного антитела определяли с помощью метода, известного специалисту в данной области, используя Agilent 1260 Infinity® (фирма Agilent Technologies) для ЖХВР и G3000SWxL (фирма TOSOH) в качестве колонки для гель-фильтрации. Концентрация очищенного антитела составляла 0,1 мг/мл, и для инъекции использовали 10 мкл антитела.

Антитела, полученные с помощью указанного метода (антитела к CD3ε, антитела к CD28 и биспецифические антитела к CD3ε × CD28), представлены в таблице 1.

Пример 3. Получение биспецифических антител

Очищенное антитело подвергали диализу в TBS-буфере (фирма WAKO) и его концентрацию доводили до 1 мг/мл. В качестве 10-кратного реакционного буфера приготавливали 250 мМ 2-МЕА (фирма SIGMA). Два различных гомодимерных антитела, полученных согласно методу, описанному в примере 2, смешивали в равных количествах. К указанной смеси добавляли 1/10 объема 10-кратного реакционного буфера и смешивали. Смеси давали выстояться при 37°С в течение 90 мин. После осуществления реакции смесь подвергали диализу в TBS с получением раствора биспецифического антитела, в котором были гетеродимеризированы два указанных выше различных антитела. Концентрацию антитела измеряли с помощью указанного выше метода, и антитело использовали в последующих экспериментах.

Пример 4. Оценка агонистической активности

Пример 4-1. Получение суспензии клеток Jurkat

Клетки Jurkat (эффекторные TCR/CD3-клетки (NFAT, ядерный фактор активированных Т-клеток), фирма Promega) собирали из колб. Клетки промывали буфером для анализа (среда RPMI 1640 (фирма Gibco), 10% FBS (фирма HyClone), 1% среда MEM с заменимыми аминокислотами (фирма Invitrogen) и 1 мМ пируват натрия (фирма Invitrogen)), а затем суспендировали из расчета 3 × 10⁶ клеток/мл в буфере для анализа. Указанную суспензию клеток Jurkat использовали в последующих экспериментах.

Пример 4-2. Получение раствора люминесцентного реагента

100 мл буфера из системы для теста люциферазы Bio-Glo (фирма Promega) добавляли во флакон, содержащий субстрат из системы для теста люциферазы Bio-Glo (фирма Promega), и смешивали путем переворачивания. Флакон защищали от солнечного света и замораживали при -20°С. Указанный раствор люминесцентного реагента использовали в последующих экспериментах.

Пример 4-3. Анализ Т-клеточной активации

Т-клеточную активацию с помощью агонистической передачи сигнала оценивали по кратности изменения люминесценции люциферазы. Вышеуказанные клетки Jurkat представляют собой клетки, трансформированные репортерным геном люциферазы, имеющим NFAT-регулируемую последовательность. Когда клетки стимулируют антителом к TCR/CD3, то NFAT-путь активируется через внутриклеточную передачу сигнала, индуцируя тем самым экспрессию люциферазы. Суспензию клеток Jurkat, полученную согласно указанному выше методу, добавляли в 384-луночный плоскодонный белый планшет в количестве 10 мкл на лунку (3 × 10⁴ клеток/лунку). Затем добавляли раствор антитела, приготовленный для каждой из концентраций (150, 15, 1,5, 0,15, 0,015, 0,0015, 0,00015, 0,000015нМ), в количестве 20 мкл на лунку. Указанному планшету давали выстояться в инкубаторе с 5% CO₂ при 37°С в течение 24 ч. После инкубации люминесцентный реагент подвергали оттаиванию и в каждую лунку добавляли по 30 мкл раствора. Затем планшету давали выстояться при комнатной температуре в течение 10 мин. Люминесценцию люциферазы в каждой лунке планшета измеряли с помощью люминометра.

В результате установлено, что модифицированные молекулы с дополнительной дисульфидной связью, сцепляющей Fab-Fab антитела к CD3ε, обладали опосредуемой CD3 передачей сигнала, измененной по сравнению с молекулой дикого типа (немодифицированная молекула), что продемонстрировано на фиг.2 и 3. Кроме того, как продемонстрировано на фиг.4 и 5, модифицированные молекулы биспецифического антитела, состоящего из антитела к CD3ε и антитела к CD28, с дополнительной дисульфидной связью, сцепляющей Fab-Fab, также обладали в значительной степени измененной опосредуемой CD3 и/или CD28 передачей сигнала по сравнению с молекулой дикого типа. Эти результаты позволяют предположить, что интродукция модификаций, предлагаемых в настоящем изобретении, может повышать или понижать агонистическую активность, которой обладают антигенсвязывающие молекулы, такие как антитела.

Пример 5. Оценка антител, имеющих замену на цистеин в различных положениях в тяжелой цепи

Пример 5-1. Оценка антител, имеющих замену на цистеин в различных положениях в тяжелой цепи

Вариабельную область и константную область тяжелой цепи нейтрализующего антитела к человеческому IL6R, обозначенного MRA (тяжелая цепь: MRAH-G1T4 (SEQ ID NO: 15), легкая цепь: MRAL-k0 (SEQ ID NO: 16)), подвергали исследованию, в котором произвольный аминокислотный остаток, экспонированный на поверхности структуры, заменяли на цистеин.

Аминокислотные остатки в вариабельной области тяжелой цепи MRA (MRAH, SEQ ID NO: 17) заменяли на цистеин с получением вариантов вариабельной области тяжелой цепи MRA, которые представлены в таблице 2.

Указанные варианты вариабельной области тяжелой цепи MRA каждый сцепляли с константной областью тяжелой цепи MRA (G1T4, SEQ ID NO: 18) с получением вариантов тяжелой цепи MRA, и получали экспрессионные векторы, кодирующие соответствующие гены, с использованием метода, известного специалисту в данной области.

Кроме того, аминокислотные остатки в константной области тяжелой цепи MRA (G1T4, SEQ ID NO: 18) заменяли на цистеин с получением вариантов константной области тяжелой цепи MRA, которые представлены в таблице 3. Указанные варианты константной области тяжелой цепи MRA каждый сцепляли с вариабельной областью тяжелой цепи MRA (MRAH, SEQ ID NO: 17) с получением вариантов тяжелой цепи MRA, и получали экспрессионные векторы, кодирующие соответствующие гены, с использованием метода, известного специалисту в данной области.

Варианты тяжелой цепи MRA, полученные согласно описанному выше методу, объединяли с легкой цепью MRA. Полученные в результате варианты MRA, которые представлены в таблице 4, экспрессировали путем кратковременной экспрессии с использованием клеток FreeStyle293 (фирма Invitrogen) или клеток Expi293 (фирма Life technologies) с помощью метода, известного специалисту в данной области, и очищали с использованием белка А с помощью метода, известного специалисту в данной области.

Пример 5-2. Оценка опосредованной протеазой фрагментации Fab антител, имеющих замену на цистеин в различных положениях в тяжелой цепи

С использованием протеазы, расщепляющей шарнирную область тяжелой цепи антитела, для осуществления фрагментации Fab оценивали варианты MRA, полученные согласно методу, описанному в примере 5-1, в отношении того, приобретают ли они устойчивость к протеазе, в результате чего их фрагментация может ингибироваться. Применяемая протеаза представляла собой Lys-C (эндопротеиназа Lys-C, чистота, пригодная для секвенирования) (фирма SIGMA; 11047825001). Реакцию осуществляли в следующих условиях: протеаза в концентрации 2 нг/мкл, антитело в концентрации 100 мкг/мл, 80% 25 мМ Трис-HCl, рН 8,0, 20% ЗФР и 35°С в течение 2 ч или в следующих условиях: протеаза в концентрации 2 нг/мкл, антитело в концентрации 20 мкг/мл, 80% 25 мМ Трис-HCl, рН 8,0, 20% ЗФР и 35°С в течение 1 ч. Затем образец подвергали капиллярному электрофорезу в невосстанавливающих условиях. Для капиллярного электрофореза применяли систему Wes (фирма Protein Simple) и для детекции использовали меченное HRP антитело к каппа-цепи (фирма abeam; ab46527). Результаты представлены на фиг. 6-13. Обработка MRA с помощью Lys-C вызывала расщепление шарнирной области тяжелой цепи, что приводило к исчезновению полосы, соответствующей IgG с молекулярной массой примерно 150 кДа и появлению полосы, соответствующей Fab с молекулярной массой примерно 50 кДа. Для некоторых вариантов MRA, полученных с помощью метода, описанного в примере 5-1, после обработки протеазой обнаружено появление полосы, соответствующей димеру Fab с молекулярной массой примерно 96 кДа, и для некоторых вариантов обнаружена полоса, соответствующая нерасщепленному IgG с молекулярной массой примерно 150 кДа. Площадь каждой полосы, полученной после обработки протеазой, определяли с использованием программного обеспечения, предназначенного для системы Wes (Compass for SW; фирма Protein Simple), для расчета процента площадей полос нерасщепленного IgG, димера Fab и т.д. Рассчитанный процент для каждой полосы представлен в таблице 5.

На основе указанного результата было установлено, что замена на цистеин в вариабельной области тяжелой цепи или в константной области тяжелой цепи повышала устойчивость к протеазе шарнирной области тяжелой цепи вариантов MRA, которые представлены в таблице 6. Альтернативно этому, результат позволяет предположить, что димер Fab образуется с помощью ковалентной связи между Fab-Fab.

Пример 6. Оценка антител, имеющих замену на цистеин в различных положениях в легкой цепи

Пример 6-1. Оценка антител, имеющих замену на цистеин в различных положениях в легкой цепи

Вариабельную область и константную область легкой цепи нейтрализующего антитела к человеческому IL6R, обозначенного MRA (тяжелая цепь: MRAH-G1T4 (SEQ ID NO: 15), легкая цепь: MRAL-k0 (SEQ ID NO: 16)), подвергали исследованию, в котором произвольный аминокислотный остаток, экспонированный на поверхности структуры, заменяли на цистеин.

Аминокислотные остатки в вариабельной области легкой цепи MRA (MRAL, SEQ ID NO: 19) заменяли на цистеин с получением вариантов вариабельной области легкой цепи MRA, которые представлены в таблице 7. Указанные варианты вариабельной области легкой цепи MRA каждый сцепляли с константной областью легкой цепи MRA (k0, SEQ ID NO: 20) с получением вариантов легкой цепи MRA, и получали экспрессионные векторы, кодирующие соответствующие гены, с использованием метода, известного специалисту в данной области.

Кроме того, аминокислотные остатки в константной области легкой цепи MRA (k0, SEQ ID NO: 20) заменяли на цистеин с получением вариантов константной области легкой цепи MRA, которые представлены в таблице 8. Указанные варианты константной области легкой цепи MRA каждый сцепляли с вариабельной областью легкой цепи MRA (MRAL, SEQ ID NO: 19) с получением вариантов легкой цепи MRA, и получали экспрессионные векторы, кодирующие соответствующие гены, с использованием метода, известного специалисту в данной области.

Варианты легкой цепи MRA, полученные согласно описанному выше методу, объединяли с тяжелой цепью MRA. Полученные в результате варианты MRA, которые представлены в таблице 9, экспрессировали путем кратковременной экспрессии с использованием клеток FreeStyle293 (фирма Invitrogen) или клеток Expi293 (фирма Life technologies) с помощью метода, известного специалисту в данной области, и очищали с использованием белка А с помощью метода, известного специалисту в данной области.

Пример 6-2. Оценка опосредованной протеазой фрагментации Fab антител, имеющих замену на цистеин в различных положениях в тяжелой цепи

С использованием протеазы, расщепляющей шарнирную область тяжелой цепи антитела, для осуществления фрагментации Fab оценивали варианты MRA, полученные согласно методу, описанному в примере 6-1, в отношении того, приобретают ли они устойчивость к протеазе, в результате чего их фрагментация может ингибироваться. Применяемая протеаза представляла собой Lys-C (эндопротеиназа Lys-C, чистота, пригодная для секвенирования) (фирма SIGMA; 11047825001). Реакцию осуществляли в следующих условиях: протеаза в концентрации 2 нг/мкл, антитело в концентрации 100 мкг/мл, 80% 25 мМ Трис-HCl, рН 8,0, 20% ЗФР и 35°С в течение 2 ч или в следующих условиях: протеаза в концентрации 2 нг/мкл, антитело в концентрации 20 мкг/мл, 80% 25 мМ Трис-HCl, рН 8,0, 20% ЗФР и 35°С в течение 1 ч. Затем образец подвергали капиллярному электрофорезу в невосстанавливающих условиях. Для капиллярного электрофореза применяли систему Wes (фирма Protein Simple) и для детекции использовали меченное HRP антитело к каппа-цепи (фирма abeam; ab46527). Результаты представлены на фиг. 14-23. Обработка MRA с помощью Lys-C вызывала расщепление шарнирной области тяжелой цепи, что приводило к исчезновению полосы, соответствующей IgG с молекулярной массой примерно 150 кДа и появлению полосы, соответствующей Fab с молекулярной массой примерно 50 кДа. Для некоторых вариантов MRA, полученных с помощью метода, описанного в примере 6-1, после обработки протеазой обнаружено появление полосы, соответствующей димеру Fab с молекулярной массой примерно 96 кДа, и для некоторых вариантов обнаружена полоса, соответствующая нерасщепленному IgG с молекулярной массой примерно 150 кДа. Площадь каждой полосы, полученной после обработки протеазой, определяли с использованием программного обеспечения, предназначенного для системы Wes (Compass for SW; фирма Protein Simple), для расчета процента площадей полос нерасщепленного IgG, димера Fab и т.д. Рассчитанный процент для каждой полосы представлен в таблице 10.

На основе указанного результата было установлено, что замена на цистеин в вариабельной области легкой цепи или в константной области легкой цепи повышала устойчивость к протеазе шарнирной области тяжелой цепи вариантов MRA, которые представлены в таблице 11. Альтернативно этому, результат позволяет предположить, что димер Fab образуется с помощью ковалентной связи между Fab-Fab.

Пример 7. Исследование с помощью методов оценки антител, имеющих замену на цистеин

Пример 7-1. Получение антител, имеющих замену на цистеин в легкой цепи

Аминокислотный остаток в положении 126 согласно нумерации по Кэботу в константной области легкой цепи (k0, SEQ ID NO: 20) MRA, т.е. нейтрализующего антитела к человеческому IL6R (тяжелая цепь: MRAH-G1T4 (SEQ ID NO: 15), легкая цепь: MRAL-k0 (SEQ ID NO: 16)), заменяли на цистеин с получением варианта константной области легкой цепи MRA, k0.K126C (SEQ ID NO: 231). Указанный вариант константной области легкой цепи MRA сцепляли с вариабельной областью легкой цепи MRA (MRAL, SEQ ID NO: 19) с получением варианта легкой цепи MRA, и получали экспрессионный вектор, кодирующий соответствующий ген, с помощью метода, известного специалисту в данной области.

Вариант легкой цепи MRA, полученный согласно описанному выше методу, объединяли с тяжелой цепью MRA. Полученный в результате вариант MRA MRAL-k0.K126C (тяжелая цепь: MRAH-G1T4 (SEQ ID NO: 15), вариабельная область легкой цепи: MRAL (SEQ ID NO: 19), константная область легкой цепи: k0.K126C (SEQ ID NO: 231)) экспрессировали путем кратковременной экспрессии с использованием клеток FreeStyle293 (фирма Invitrogen) или клеток Expi293 (фирма Life technologies) с помощью метода, известного специалисту в данной области, и очищали с использованием белка А с помощью метода, известного специалисту в данной области.

Пример 7-2. Оценка с помощью капиллярного электрофореза опосредованного протеазой расщепления антител, имеющих замену на цистеин в легкой цепи

С использованием протеазы, расщепляющей шарнирную область тяжелой цепи антитела, для осуществления фрагментации Fab оценивали вариант легкой цепи MRA, полученный согласно методу, описанному в примере 7-1, в отношении того, приобретают ли он устойчивость к протеазе, в результате чего его фрагментация может ингибироваться. Применяемая протеаза представляла собой Lys-C (эндопротеиназа Lys-C, чистота, пригодная для секвенирования) (фирма SIGMA; 11047825001). Реакцию осуществляли в следующих условиях: протеаза в концентрации 0,1, 0,4, 1,6 или 6,42 нг/мкл, антитело в концентрации 100 мкг/мл, 80% 25 мМ Трис-HCl, рН 8,0, 20% ЗФР и 35°С в течение 2 ч. Затем образец подвергали капиллярному электрофорезу в невосстанавливающих условиях. Для капиллярного электрофореза применяли систему Wes (фирма Protein Simple) и для детекции использовали меченное HRP антитело к каппа-цепи (фирма abeam; ab46527) или меченное HRP антитело к человеческой Fc (фирма Protein Simple; 043-491ab46527). Результаты представлены на фиг. 24. В случае MRA, обработанного Lys-C, с применением для детекции антитела к каппа-цепи обнаружено исчезновение полосы, соответствующей молекулярной массе примерно 150 кДа, и появление новой полосы, соответствующей молекулярной массе примерно 50 кДа, а при применении низких концентраций Lys-C обнаружено также появление слабой полосы, соответствующей молекулярной массе 113 кДа. При детекции с помощью антитела к человеческой Fc обнаружено исчезновение полосы, соответствующей молекулярной массе примерно 150 кДа, и появление новой полосы, соответствующей молекулярной массе примерно 61 кДа, а при применении низких концентраций Lys-C обнаружено также появление слабой полосы, соответствующей молекулярной массе 113 кДа. С другой стороны, для варианта MRA, полученного согласно методу, описанному в примере 7-1, полоса, соответствующая молекулярной массе примерно 150 кДа, почти исчезала и появлялась новая полоса, соответствующая молекулярной массе примерно 96 кДа. При детекции с помощью антитела к человеческой Fc обнаружено, что полоса, соответствующая молекулярной массе примерно 150 кДа почти исчезала, и появлялась новая полоса, соответствующая молекулярной массе примерно 61 кДа, а при применении низких концентраций Lys-C обнаружено также появление слабой полосы, соответствующей молекулярной массе 113 кДа. Полученные результаты позволяют предположить, что, как продемонстрировано на фиг. 25, полоса с молекулярной массой примерно 150 кДа соответствовала IgG, полоса с молекулярной массой примерно 113 kDa соответствовала форме с одним плечом, в котором шарнирная область тяжелой цепи была расщеплена однократно, полоса с молекулярной массой примерно 96 кДа соответствовала димеру Fab, полоса с молекулярной массой примерно 61 кДа соответствовала Fc и полоса с молекулярной массой примерно 50 кДа соответствовала Fab.

Пример 8. Оценка антител, имеющих замену на цистеин в различных положениях в IgG1

Пример 8-1. Получение антител, имеющих замену на цистеин в различных положениях в IgG1

Тяжелую цепь и легкую цепь нейтрализующего антитела к человеческому IL6R MRA-IgG1 (тяжелая цепь: MRAH-G1T4 (SEQ ID NO: 15), легкая цепь: MRAL-k0 (SEQ ID NO: 16)), подвергали исследованию, в котором произвольный аминокислотный остаток, экспонированный на поверхности структуры, заменяли на цистеин.

Аминокислотные остатки в вариабельной области тяжелой цепи MRA-IgG1 (MRAH, SEQ ID NO: 17) заменяли на цистеин с получением вариантов вариабельной области тяжелой цепи MRA-IgG1, которые представлены в таблице 12. Указанные варианты вариабельной области тяжелой цепи MRA-IgG1 каждый сцепляли с константной областью тяжелой цепи MRA-IgG1 (G1T4, SEQ ID NO: 18) с получением вариантов тяжелой цепи MRA-IgG1, и получали экспрессионные векторы, кодирующие соответствующие гены, с помощью метода, известного специалисту в данной области. Кроме того, аминокислотные остатки в константной области тяжелой цепи MRA-IgG1 (G1T4, SEQ ID NO: 18) заменяли на цистеин с получением вариантов константной области тяжелой цепие MRA-IgG1, которые представлены в таблице 13. Указанные варианты константной области тяжелой цепи MRA-IgG1 каждый сцепляли с вариабельной областью тяжелой цепи MRA-IgG1 (MRAH, SEQ ID NO: 17) с получением вариантов тяжелой цепи MRA-IgG1, и получали экспрессионные векторы, кодирующие соответствующие гены, с помощью метода, известного специалисту в данной области.

Аналогичным образом аминокислотные остатки в вариабельной области легкой цепи MRA-IgG1 (MRAL, SEQ ID NO: 19) заменяли на цистеин с получением вариантов вариабельной области легкой цепи MRA-IgG1, которые представлены в таблице 14. Указанные варианты вариабельной области легкой цепи MRA-IgG1 каждый сцепляли с константной областью легкой цепи MRA-IgG1 (k0, SEQ ID NO: 20) с получением вариантов легкой цепи MRA-IgG1, и получали экспрессионные векторы, кодирующие соответствующие гены, с помощью метода, известного специалисту в данной области. Кроме того, аминокислотные остатки в константной области легкой цепи MRA-IgG1 (k0, SEQ ID NO: 20) заменяли на цистеин с получением вариантов константной области легкой цепи MRA-IgG1, которые представлены в таблице 15. Указанные варианты константной области легкой цепи MRA-IgG1 каждый сцепляли с вариабельной областью легкой цепи MRA-IgG1 (MRAL, SEQ ID NO: 19) с получением вариантов легкой цепи MRA-IgG1 и получали экспрессионные векторы, кодирующие соответствующие гены, с помощью метода, известного специалисту в данной области.

Полученные согласно описанному выше методу варианты тяжелой цепи MRA-IgG1 объединяли с легкой цепью MRA-IgG, или тяжелую цепь MRA-IgG1 объединяли с вариантами легкой цепи MRA-IgG1. Полученные в результате варианты тяжелой цепи MRA-IgG1 и варианты легкой цепи MRA-IgG1, которые представлены в таблицах 16 и 17, экспрессировали путем кратковременной экспрессии с использованием клеток FreeStyle293 (фирма Invitrogen) или клеток Expi293 (фирма Life technologies) с помощью метода, известного специалисту в данной области, и очищали с использованием белка А с помощью метода, известного специалисту в данной области.

Пример 8-2. Оценка электрофоретической подвижности в полиакриламидном геле антител, имеющих замену на цистеин в различных положениях в IgG1

С помощью ДСН-ПААГ в невосстанавливающих условиях оценивали, отличаются ли по электрофоретической подвижности варианты MRA-IgG1, полученные согласно методу, описанному в примере 8-1, от MRA-IgG1. Для получения образцов для электрофореза применяли раствор буфера для образца (2МЕ-) (×4) (фирма Wako; 198-13282), образцы обрабатывали в течение 10 мин с использованием изучаемого соединения в концентрации 50 мкг/мл и при 70°С, а затем подвергали ДСН-ПААГ в невосстанавливающих условиях. Электрофорез ДСН-ПААГ в невосстанавливающих условиях осуществляли в течение 90 мин при 125 В, применяя 4% SDS-PAGE mini, 15 лунок, 1,0 мм, 15 лунок (фирма TEFCO; каталожный №01-052-6). Затем гель окрашивали с помощью СВВ, изображение геля получали с помощью ChemiDocTouchMP (фирма BIORAD), и оцифровку полос осуществляли с помощью Image Lab (фирма BIORAD).

Используя полученные изображения геля, варианты подразделяли на 7 классов (групп) в зависимости от схемы полос, соответствующих каждому варианту MRA-IgG1: «однополосный» (одна полоса в области молекулярной массы, сходной с MRA-IgG1), «двухполосный» (две полосы в области молекулярной массой, сходной с MRA-IgG1), «трехполосный» (три полосы в области молекулярной массы, сходной с MRA-IgG1), многополосный (четыре или более полос в области молекулярной массы, сходной с MRA-IgG1), LMW (полоса(ы) в области молекулярной массы, более низкой по сравнению с MRA-IgG1), HMW (полоса(ы) в области молекулярной массы, более высокой по сравнению с MRA-IgG1), и «слабовыраженный» (полоса(ы) размытая(ые) и трудно поддающаяся(иеся) определению). Касательно вариантов MRA-IgG1, классифицированных как «двухполосные», для одной из двух полос характерна такая же электрофоретическая подвижность, что и для MRA-IgG1, а подвижность другой полосы является несколько более быстрой или медленной. Поэтому для вариантов MRA-IgG1, классифицированных как «двухполосные», рассчитывали также процент полос, имеющих отличную от MRA-IgG1 подвижность (процент новой полосы (%)). Группировка вариантов тяжелой цепи MRA-IgG1 и вариантов легкой цепи MRA-IgG1 на основе схем полос и результаты расчета процента полос представлены соответственно в таблицах 18 и 19. Варианты, классифицированные как «двухполосные» и «трехполосные» в таблицах 18 и 19, представлены в таблице 20. Для этих вариантов существует высокая вероятность того, что замена на цистеин, приводящая к структурным изменениям, таким как перекрестное сшивание Fab, приводит к изменению электрофоретической подвижности. Следует отметить, что хотя в таблице 19 для варианта MRAL.K107C-IgG1 указано, что «данные отсутствуют», положение 107 (нумерация по Кэботу), которое представляет собой положение, в котором происходит замена на цистеин у этого варианта, является положением, в котором остаток, экспонированный на поверхности структуры, присутствует в шарнирной области. Таким образом, в указанном варианте с высокой степенью вероятности замена на цистеин приводит к структурным изменениям, таким как перекрестное сшивание Fab, и в результате к изменению электрофоретической подвижности.

Пример 9. Оценка антител, имеющих замену на цистеин в различных положениях в IgG4

Пример 9-1. Получение антител, имеющих замену на цистеин в различных положениях в IgG4

Тяжелую цепь и легкую цепь нейтрализующего антитела к человеческому IL6R MRA-IgG4 (тяжелая цепь: MRAH-G4T1 (SEQ ID NO: 310), легкая цепь: MRAL-k0 (SEQ ID NO: 16)), подвергали исследованию, в котором произвольный аминокислотный остаток, экспонированный на поверхности структуры, заменяли на цистеин.

Аминокислотные остатки в вариабельной области тяжелой цепи MRA-IgG4 (MRAH, SEQ ID NO: 17) заменяли на цистеин с получением вариантов вариабельной области тяжелой цепи MRA-IgG4, которые представлены в таблице 21. Указанные варианты вариабельной области тяжелой цепи MRA-IgG4 каждый сцепляли с константной областью тяжелой цепи MRA-IgG4 (G4T1, SEQ ID NO: 311) с получением вариантов тяжелой цепи MRA-IgG4, и получали экспрессионные векторы, кодирующие соответствующие гены, с помощью метода, известного специалисту в данной области. Кроме того, аминокислотные остатки в константной области тяжелой цепи MRA-IgG4 (G4T1, SEQ ID NO: 311) заменяли на цистеин с получением вариантов константной области тяжелой цепи MRA-IgG4, которые представлены в таблице 22. Указанные варианты константной области тяжелой цепи MRA-IgG4 каждый сцепляли с вариабельной областью тяжелой цепи MRA-IgG4 (MRAH, SEQ ID NO: 17) с получением вариантов тяжелой цепи MRA-IgG4, и получали экспрессионные векторы, кодирующие соответствующие гены, с помощью метода, известного специалисту в данной области.

Полученные согласно описанному выше методу варианты тяжелой цепи MRA-IgG4 объединяли с легкой цепью MRA-IgG4, или тяжелую цепь MRA-IgG4 объединяли с вариантами легкой цепи MRA-IgG4, полученными согласно методу, описанному в примере 8-1. Полученные в результате варианты тяжелой цепи MRA-IgG4 и варианты легкой цепи MRA-IgG4, которые представлены в таблицах 23 и 24, экспрессировали путем кратковременной экспрессии с использованием клеток FreeStyle293 (фирма Invitrogen) или клеток Expi293 (фирма Life technologies) с помощью метода, известного специалисту в данной области, и очищали с использованием белка А с помощью метода, известного специалисту в данной области.

Пример 9-2. Оценка электрофоретической подвижности в полиакриламидном геле антител, имеющих замену на цистеин в различных положениях в IgG4

Аналогично методу, описанному в примере 8-2, варианты MRA-IgG4, которые получали согласно методу, описанному в примере 9-1, подвергали ДСН-ПААГ, получали изображения гелей и осуществляли количественную оценку полос.

Используя полученные изображения геля, варианты подразделяли на 7 классов (групп) в зависимости от схемы полос, соответствующих каждому варианту MRA-IgG4: «однополосный» (одна полоса в области молекулярной массы, сходной с MRA-IgG4), «двухполосный» (две полосы в области молекулярной массой, сходной с MRA-IgG4), «трехполосный» (три полосы в области молекулярной массы, сходной с MRA-IgG4), многополосный (четыре или более полос в области молекулярной массы, сходной с MRA-IgG4), LMW (полоса(ы) в области молекулярной массы, более низкой по сравнению с MRA-IgG4), HMW (полоса(ы) в области молекулярной массы, более высокой по сравнению с MRA-IgG4), и «слабовыраженный» (полоса(ы) размытая(ые) и трудно поддающаяся(иеся) определению). Касательно вариантов MRA-IgG4, классифицированных как «двухполосные», для одной из двух полос характерна такая же электрофоретическая подвижность, что и для MRA-IgG4, а подвижность другой полосы является несколько более быстрой или медленной. Поэтому для вариантов MRA-IgG4, классифицированных как «двухполосные», рассчитывали также процент полос, имеющих отличную от MRA-IgG1 подвижность (процент новой полосы (%)). Группировка на основе схем полос вариантов тяжелой цепи MRA-IgG4 и вариантов легкой цепи MRA-IgG4 и результаты расчета процента полос представлены соответственно в таблицах 25 и 26. Варианты, классифицированные как «двухполосные» и «трехполосные» в таблицах 25 и 26, представлены в таблице 27. Для этих вариантов существует высокая вероятность того, что замена на цистеин, приводящая к структурным изменениям, таким как перекрестное сшивание Fab, приводит к изменению электрофоретической подвижности. Следует отметить, что хотя в таблице 26 для варианта MRAL.K107C-IgG4 указано, что «данные отсутствуют», положение 107 (нумерация по Кэботу), представляющее собой положение, в котором происходит замена на цистеин у этого варианта, является положением, в котором остаток, экспонированный на поверхности структуры, присутствует в шарнирной области. Таким образом, в указанном варианте с высокой степенью вероятности замена на цистеин приводит к структурным изменениям, таким как перекрестное сшивание Fab, и в результате к изменению электрофоретической подвижности.

Пример 10. Оценка антител, имеющих замену на цистеин в различных положениях в IgG2

Пример 10-1. Получение антител, имеющих замену на цистеин в различных положениях в IgG2

Тяжелую цепь и легкую цепь нейтрализующего антитела к человеческому IL6R MRA-IgG2 (тяжелая цепь: MRAH-G2d (SEQ ID NO: 312), легкая цепь: MRAL-k0 (SEQ ID NO: 16)), подвергали исследованию, в котором произвольный аминокислотный остаток, экспонированный на поверхности структуры, заменяли на цистеин.

Аминокислотные остатки в вариабельной области тяжелой цепи MRA-IgG2 (MRAH, SEQ ID NO: 17) заменяли на цистеин с получением вариантов вариабельной области тяжелой цепи MRA-IgG2, которые представлены в таблице 28. Указанные варианты вариабельной области тяжелой цепи MRA-IgG2 каждый сцепляли с константной областью тяжелой цепи MRA-IgG2 (G2d, SEQ ID NO: 313) с получением вариантов тяжелой цепи MRA-IgG2, и получали экспрессионные векторы, кодирующие соответствующие гены, с помощью метода, известного специалисту в данной области. Кроме того, аминокислотные остатки в константной области тяжелой цепи MRA-IgG2 (G2d, SEQ ID NO: 313) заменяли на цистеин с получением вариантов константной области тяжелой цепи MRA-IgG2, которые представлены в таблице 29. Указанные варианты константной области тяжелой цепи MRA-IgG2 каждый сцепляли с вариабельной областью тяжелой цепи MRA-IgG2 (MRAH, SEQ ID NO: 17) с получением вариантов тяжелой цепи MRA-IgG2, и получали экспрессионные векторы, кодирующие соответствующие гены, с помощью метода, известного специалисту в данной области.

Полученные согласно описанному выше методу варианты тяжелой цепи MRA-IgG2 объединяли с легкой цепью MRA-IgG2, или тяжелую цепь MRA-IgG2 объединяли с вариантами легкой цепи MRA-IgG2, полученными согласно методу, описанному в примере 8-1. Полученные в результате варианты тяжелой цепи MRA-IgG2 и варианты легкой цепи MRA-IgG2, которые представлены в таблицах 30 и 31, экспрессировали путем кратковременной экспрессии с использованием клеток FreeStyle293 (фирма Invitrogen) или клеток Expi293 (фирма Life technologies) с помощью метода, известного специалисту в данной области, и очищали с использованием белка А с помощью метода, известного специалисту в данной области.

Пример 10-2. Оценка электрофоретической подвижности в полиакриламидном геле антител, имеющих замену на цистеин в различных положениях в IgG2

Аналогично методу, описанному в примере 8-2, варианты MRA-IgG2, которые получены согласно методу, описанному в примере 10-1, подвергали ДСН-ПААГ, получали изображения гелей и осуществляли количественную оценку полос.

Используя полученные изображения геля, варианты подразделяли на 7 классов (групп) в зависимости от схем полос, соответствующих каждому варианту MRA-IgG2: «однополосный» (одна полоса в области молекулярной массы, близкой 140 кДа), «двухполосный» (две полосы в области молекулярной массой, близкой 140 кДа), «трехполосный» (три полосы в области молекулярной массы, близкой 140 кДа), «многополосный» (четыре или более полос в области молекулярной массы, близкой 140 кДа), LMW (полоса(ы) в области молекулярной массы, более низкой чем примерно 140 кДа), HMW (полоса(ы) в области молекулярной массы, более высокой чем примерно 140 кДа), и «слабовыраженный» (полоса(ы) размытая(ые) и трудно поддающаяся(иеся) определению). Результаты группировки на основе схем полос вариантов тяжелой цепи MRA-IgG2 и вариантов легкой цепи MRA-IgG2 представлены соответственно в таблицах 32 и 33. Варианты, классифицированные как «двухполосные» и «трехполосные» в таблицах 32 и 33, представлены в таблице 34. Следует отметить, что хотя в таблице 33 для варианта MRAL.K107C-IgG2 указано, что «данные отсутствуют», положение 107 (нумерация по Кэботу), которое представляет собой положение, в котором происходит замена на цистеин у этого варианта, является положением, в котором остаток, экспонированный на поверхности структуры, присутствует в шарнирной области. Таким образом, указанный вариант можно классифицировать также как «двухполосный».

Пример 11. Оценка антител, имеющих замену на цистеин в различных положениях в лямбда-цепи

Пример 11-1. Получение антител, имеющих замену на цистеин в различных положениях в лямбда-цепи

Легкую цепь (лямбда-цепь) нейтрализующего антитела к человеческому CXCL10 G7-IgG1 (тяжелая цепь: G7H-G1T4 (SEQ ID NO: 314), легкая цепь: G7L-LT0 (SEQ ID NO: 316)), подвергали исследованию, в котором произвольный аминокислотный остаток, экспонированный на поверхности структуры, заменяли на цистеин.

Аминокислотные остатки в вариабельной области легкой цепи G7-IgG1 (G7L, SEQ ID NO: 317) заменяли на цистеин с получением вариантов вариабельной области легкой цепи G7-IgG1, которые представлены в таблице 35. Указанные варианты вариабельной области легкой цепи G7-IgG1 каждый сцепляли с константной областью легкой цепи G7-IgG1 (LT0, SEQ ID NO: 318) с получением вариантов легкой цепи G7-IgG1, и получали экспрессионные векторы, кодирующие соответствующие гены, с помощью метода, известного специалисту в данной области. Кроме того, аминокислотные остатки в константной области легкой цепи G7-IgG1 (LT0, SEQ ID NO: 318) заменяли на цистеин с получением вариантов константной области легкой цепи G7-IgG1, которые представлены в таблице 36. Указанные варианты константной области тяжелой цепи G7-IgG1 каждый сцепляли с вариабельной областью легкой цепи G7-IgG1 (G7L, SEQ ID NO: 317) с получением вариантов легкой цепи G7-IgG1, и получали экспрессионные векторы, кодирующие соответствующие гены, с помощью метода, известного специалисту в данной области.

Полученные согласно описанному выше методу варианты легкой цепи G7-IgG1 объединяли с тяжелой цепью G7-IgG1 и полученные в результате варианты легкой цепи G7-IgG1, которые представлены в таблице 37, экспрессировали путем кратковременной экспрессии с использованием клеток FreeStyle293 (фирма Invitrogen) или клеток Expi293 (фирма Life technologies) с помощью метода, известного специалисту в данной области, и очищали с использованием белка А с помощью метода; известного специалисту в данной области.

Пример 11-2. Оценка электрофоретической подвижности в полиакриламидном геле антител, имеющих замену на цистеин в различных положениях в лямбда-цепи

Аналогично методу, описанному в примере 8-2, варианты G7-IgG1, которые получали согласно методу, описанному в примере 11-1, подвергали ДСН-ПААГ, получали изображения гелей и осуществляли количественную оценку полос.

Используя полученные изображения геля, варианты подразделяли на 7 классов (групп) в зависимости от схем полос, соответствующих каждому варианту G7-IgG1: «однополосный» (одна полоса в области молекулярной массы, сходной с G7-IgG1), «двухполосный» (две полосы в области молекулярной массой, сходной с G7-IgG1), «трехполосный» (три полосы в области молекулярной массы, сходной с G7-IgG1), «многополосный» (четыре или более полос в области молекулярной массы, сходной с G7-IgG1), LMW (полоса(ы) в области молекулярной массы, более низкой по сравнению с G7-IgG1), HMW (полоса(ы) в области молекулярной массы, более высокой по сравнению с G7-IgG1), и «слабовыраженный» (полоса(ы) размытая(ые) и трудно поддающаяся(иеся) определению).

Касательно вариантов G7-IgG1, классифицированных как «двухполосные», для одной из двух полос характерна такая же электрофоретическая подвижность, что и для G7-IgG1, а подвижность другой полосы является несколько более быстрой или медленной. Поэтому для вариантов G7-IgG1, классифицированных как «двухполосные», рассчитывали также процент полос, имеющих отличную от G7-IgG1 подвижность (процент новой полосы (%)). Группировка на основе схем полос вариантов легкой цепи G7-IgG1 и результаты расчета процента полос представлены в таблице 38. Варианты, классифицированные как «двухполосные» и «трехполосные» в таблице 38, представлены в таблице 39. Для этих вариантов существует высокая вероятность, что замена на цистеин, приводящая к структурным изменениям, таким как перекрестное сшивание Fab, приводит к изменению электрофоретической подвижности. В этом примере вариант, в котором аминокислотный остаток в положении 107а (нумерация по Кэботу) заменяли на цистеин, не оценивали. Однако положение 107а (нумерация по Кэботу), представляет собой положение, в котором остаток, экспонированный на поверхности структуры, присутствует в шарнирной области. Таким образом, в указанном варианте с высокой степенью вероятности замена на цистеин приводит к структурным изменениям, таким как перекрестное сшивание Fab, и в результате к изменению электрофоретической подвижности.

Пример 12. Оценка антител, имеющих замену на цистеин в различных положениях в VHH

Пример 12-1. Получение антител, имеющих замену на цистеин в различных положениях в VHH

Нейтрализующее антитело в виде VHH к человеческому IL6R, IL6R90 (SEQ ID NO: 319), сливали с Fc-областью человеческого IgG1 (G1T3dCH1dC, SEQ ID NO: 320) с получением IL6R90-Fc (IL6R90-G1T3dCH1dC, SEQ ID NO: 321), и указанную конструкцию подвергали исследованию, в котором произвольный аминокислотный остаток из остатков в области IL6R90, экспонированный на поверхности структуры, заменяли на цистеин.

Аминокислотные остатки, присутствующие в области IL6R90, заменяли на цистеин, и экспрессионные векторы, кодирующие гены вариантов VHH-области IL6R90-Fc, представленные в таблице 40, получали с помощью метода, известного специалисту в данной области. Указанные варианты VHH-области IL6R90-Fc каждый сцепляли с Fc-областью человеческого IgG1 (G1T3dCH1dC, SEQ ID NO: 320) с получением вариантов IL6R90-Fc, и экспрессионные векторы, кодирующие соответствующие гены, получали с помощью метода, известного специалисту в данной области.

Варианты IL6R90-Fc, полученные согласно описанному выше методу и представленные в таблице 41, экспрессировали путем кратковременной экспрессии с использованием клеток FreeStyle293 (фирма Invitrogen) или клеток Expi293 (фирма Life technologies) с помощью метода, известного специалисту в данной области, и очищали с использованием белка А с помощью метода, известного специалисту в данной области.

Пример 12-2. Оценка электрофоретической подвижности в полиакриламидном геле антител, имеющих замену на цистеин в различных положениях в VHH

С помощью ДСН-ПААГ в невосстанавливающих условиях оценивали, отличаются ли по электрофоретической подвижности варианты IL6R90-Fc, полученные согласно методу, описанному в примере 12-1, от IL6R90-Fc. Для получения образцов для электрофореза применяли раствор буфера для образца (2МЕ-) (×4) (фирма Wako; 198-13282), образцы обрабатывали в течение 10 мин с использованием изучаемого соединения в концентрации 50 мкг/мл и при 70°С, а затем подвергали ДСН-ПААГ в невосстанавливающих условиях. Электрофорез ДСН-ПААГ в невосстанавливающих условиях осуществляли при 200 В в течение 2,5 ч, применяя систему Mini-PROTEAN TGX Precast, гель 4-20% 15 лунок (фирма BIORAD; 456-1096). Затем гель окрашивали с помощью СВВ, изображение геля получали с помощью ChemiDocTouchMP (фирма BIORAD), и оцифровку полос осуществляли с помощью Image Lab (фирма BIORAD).

Используя полученные изображения геля, варианты подразделяли на 7 групп в зависимости от схем полос, соответствующих каждому варианту IL6R90-Fc: «однополосный» (одна полоса в области молекулярной массы, сходной с IL6R90-Fc), «двухполосный» (две полосы в области молекулярной массой, сходной с IL6R90-Fc), «трехполосный» (три полосы в области молекулярной массы, сходной с IL6R90-Fc), «многополосный» (четыре или более полос в области молекулярной массы, сходной с IL6R90-Fc), LMW (полоса(ы) в области молекулярной массы, более низкой по сравнению с IL6R90-Fc), HMW (полоса(ы) в области молекулярной массы, более высокой по сравнению с IL6R90-Fc) и «слабовыраженный» (полоса(ы) размытая(ые) и трудно поддающаяся(иеся) определению). Касательно вариантов IL6R90-Fc, классифицированных как «двухполосные», для одной из двух полос характерна такая же электрофоретическая подвижность, что и для IL6R90-Fc, а электрофоретическая подвижность другой полоса является несколько более быстрой или медленной. Таким образом, для вариантов IL6R90-Fc, классифицированных как «двухполосные», рассчитывали также процент полос, имеющих отличную от IL6R90-Fc подвижность (процент новой полосы (%)). Группировка на основе схем полос вариантов легкой цепи IL6R90-Fc и результаты расчета процента полос представлены в таблице 42. Варианты, классифицированные как «двухполосные» и «трехполосные» в таблице 42, представлены в таблице 43. Для этих вариантов существует высокая вероятность того, что замена на цистеин, приводящая к структурным изменениям, таким как перекрестное сшивание VHH, приводит к изменению электрофоретической подвижности.

Пример 13. Оценка CD3-агонистической активности антител, имеющих замену на цистеин в Fab

Пример 13-1. Получение антител, имеющих замену на цистеин в константной области

Агонистическое антитело к человеческому CD3, OKT3 (тяжелая цепь: OKT3VH0000-G1T4 (SEQ ID NO: 1007), легкая цепь: OKT3VL0000-KT0 (SEQ ID NO: 1008)), подвергали исследованию, в котором произвольный аминокислотный остаток, экспонированный на поверхности структуры, заменяли на цистеин.

Аминокислотные остатки в константной области тяжелой цепи OKT3 (G1T4, SEQ ID NO: 1009) заменяли на цистеин с получением вариантов константной области тяжелой цепи OKT3, которые представлены в таблице 44. Указанные варианты константной области тяжелой цепи OKT3 каждый сцепляли с вариабельной областью тяжелой цепи OKT3 (OKT3VH0000, SEQ ID NO: 1010) с получением вариантов тяжелой цепи OKT3, и экспрессионные векторы, кодирующие соответствующие гены, получали с помощью метода, известного специалисту в данной области.

Аналогичным образом аминокислотный остаток в константной области легкой цепи OKT3 (KT0, SEQ ID NO: 1011) заменяли на цистеин в получением варианта константной области легкой цепи OKT3, представленного в таблице 45. Указанный вариант константной области легкой цепи OKT3 сцепляли с вариабельной областью легкой цепи OKT3 (OKT3VL0000, SEQ ID NO: 1012) с получением варианта легкой цепи OKT3, и экспрессионный вектор, кодирующий соответствующий ген, получали с помощью метода, известного специалисту в данной области.

Полученные согласно указанному выше методу варианты тяжелой цепи OKT3 и вариант легкой цепи OKT3 каждый объединяли с легкой цепью OKT3 и тяжелой цепью OKT3, и варианты OKT3, представленные в таблице 46, экспрессировали путем кратковременной экспрессии с использованием клеток FreeStyle293 (фирма Invitrogen) или клеток Expi293 (фирма Life technologies) с помощью метода, известного специалисту в данной области, и очищали с использованием белка А с помощью метода, известного специалисту в данной области.

Кроме того, аналогичным образом в качестве отрицательного контроля получали антитело к KLH, IC17 (тяжелая цепь: IC17HdK-G1T4 (SEQ ID NO: 1013), легкая цепь: IC17L-k0 (SEQ ID NO: 1014)).

Пример 13-2. Получение суспензии клеток Jurkat

Клетки Jurkat (эффекторные TCR/CD3-клетки (NFAT), фирма Promega) собирали из колб. Клетки промывали буфером для анализа (среда RPMI 1640 (фирма Gibco), 10% FBS (фирма HyClone), 1% среда MEM с заменимыми аминокислотами (фирма Invitrogen) и 1 мМ пируват натрия (фирма Invitrogen)), a затем суспендировали из расчета 3×10⁶ клеток/мл в буфере для анализа. Указанную суспензию клеток Jurkat использовали в последующих экспериментах.

Пример 13-3. Получение раствора люминесцентного реагента

100 мл буфера из системы для теста люциферазы Bio-Glo (фирма Promega) добавляли во флакон, содержащий субстрат из системы для теста люциферазы Bio-Glo (фирма Promega), и смешивали путем переворачивания. Флакон защищали от солнечного света и замораживали при -20°С. Указанный раствор люминесцентного реагента использовали в последующих экспериментах.

Пример 13-4. Оценка активации Т-клеток антителами, имеющими замену на цистеин в константной области

Активацию Т-клеток путем передачи агонистического сигнала оценивали по кратности изменения люминесценции люциферазы. Вышеуказанные клетки Jurkat представляют собой клетки, трансформированные репортерным геном люциферазы, имеющим NFAT-регулируемую последовательность. Когда клетки стимулируют антителом к TCR/CD3, то NFAT-путь активируется через внутриклеточную передачу сигнала, индуцируя тем самым экспрессию люциферазы. Суспензию клеток Jurkat, полученную согласно указанному выше методу, добавляли в 384-луночный плоскодонный белый планшет в количестве 10 мкл на лунку (3×10⁴ клеток/лунку). Затем добавляли раствор антитела, приготовленный для каждой из концентраций (10000, 1000, 100, 10, 1 и 0,1 нг/мл), в количестве 20 мкл на лунку. Указанному планшету давали выстояться в инкубаторе с 5% СО₂ при 37°С в течение 24 ч. После инкубации люминесцентный реагент подвергали оттаиванию и в каждую лунку добавляли по 30 мкл раствора. Затем планшету давали выстояться при комнатной температуре в течение 10 мин. Люминесценцию люциферазы в каждой лунке планшета измеряли с помощью люминометра. Уровень (кратность) люминесценции определяли путем деления уровня люминесценции в лунках, в которые добавляли антитело, на уровень люминесценции в лунках, в которых отсутствовало антитело.

В результате установлено, что среди вариантов OKT3, имеющих замену на цистеин в константной области, множество вариантов значительно повышали активированное состояние Т-клеток по сравнению с OKT3, что продемонстрировано на фиг. 26. Указанный результат свидетельствует о том, что существует множество связанных с цистеином модификаций, которые могут обеспечивать перекрестное сшивание Fab и повышать CD3-агонистическую активность.

Пример 14. Оценка CD3-агонистической активности антител, имеющих различные замены на цистеин в двух Fab

Пример 14-1. Получение антител, имеющих гетерологичную замену на цистеин в константной области

Агонистическое антитело к человеческому CD3, OKT3 (тяжелая цепь: OKT3VH0000-G1T4 (SEQ ID NO: 1007), легкая цепь: OKT3VL0000-KT0 (SEQ ID NO: 1008)), подвергали исследованию, в котором произвольный аминокислотный остаток, экспонированный на поверхности структуры, заменяли на цистеин.

Аминокислотный остаток в константной области 1 тяжелой цепи OKT3 (G1T4k, SEQ ID NO: 1015) заменяли на цистеин с получением варианта константной области тяжелой цепи OKT3, который представлен в таблице 47. Указанный вариант константной области тяжелой цепи OKT3 сцепляли с вариабельной областью тяжелой цепи OKT3 (OKT3VH0000, SEQ ID NO: 1010) с получением варианта 1 тяжелой цепи OKT3, и экспрессионный вектор, кодирующий соответствующий ген, получали с помощью метода, известного специалисту в данной области. Аналогичным образом аминокислотные остатки в константной области 2 тяжелой цепи OKT3 (G1T4h, SEQ ID NO: 1016) заменяли на цистеин с получением вариантов константной области тяжелой цепи OKT3, которые представлены в таблице 48. Указанные варианты константной области тяжелой цепи OKT3 каждый сцепляли с вариабельной областью тяжелой цепи OKT3 (OKT3VH0000, SEQ ID NO: 1010) с получением варианта 2 тяжелой цепи OKT3, и экспрессионные векторы кодирующие соответствующие гены, получали с помощью метода, известного специалисту в данной области. Следует отметить, что в СН3-участок константных областей 1 и 2 тяжелой цепи, указанных в этом примере, интродуцировали модификацию «knobs-into-holes» (KiH), способствующую гетеродимеризации.

Полученные согласно описанному выше методу вариант 1 тяжелой цепи и вариант 2 тяжелой цепи OKT3 объединяли с легкой цепью OKT3 и варианты OKT3, представленные в таблице 49, экспрессировали путем кратковременной экспрессии с использованием клеток FreeStyle293 (фирма Invitrogen) или клеток Expi293 (фирма Life technologies) с помощью метода, известного специалисту в данной области, и очищали с использованием белка А с помощью метода, известного специалисту в данной области.

Кроме того, аналогичным образом получали применяемое в качестве в качестве отрицательного контроля антитело к KLH, IC17 (тяжелая цепь: IC17HdK-G1T4 (SEQ ID NO: 1013), легкая цепь: IC17L-k0 (SEQ ID NO: 1014)).

Пример 14-2. Получение суспензии клеток Jurkat

Суспензию клеток Jurkat получали согласно методу, описанному в примере 13-2.

Пример 14-3. Получение раствора люминесцентного реагента

Раствор люминесцентного реагент получали согласно методу, описанному в примере 13-3.

Пример 14-4. Оценка активации Т-клеток антителами, имеющими гетерологичную замену на цистеин в константной области

Активацию Т-клеток оценивали согласно методу, описанному в примере 13-4.

В результате установлено, что варианты OKT3, имеющие различные замены на цистеин в двух константных областях антитела, значительно повышали активированное состояние Т-клеток по сравнению с OKT3, что продемонстрировано на фиг. 27. Указанный результат свидетельствует о том, что даже различные замены на цистеин в различных Fab могут обеспечивать перекрестное сшивание Fab и повышать CD3-агонистическую активность.

Пример 15. Оценка CD3-агонистической активности антител, имеющих модификацию в Fab

Пример 15-1. Получение антител, имеющих замену на заряженный аминокислотный остаток в константной области

Тяжелую цепь агонистического антитела к человеческому CD3, OKT3 (тяжелая цепь: OKT3VH0000-G1T4 (SEQ ID NO: 1007), легкая цепь: OKT3VL0000-KT0 (SEQ ID NO: 1008)), подвергали исследованию, в котором произвольный аминокислотный остаток, экспонированный на поверхности структуры, заменяли на заряженный аминокислотный остаток.

Аминокислотные остатки в константной области 1 тяжелой цепи OKT3 (G1T4k, SEQ ID NO: 1015) заменяли на аргинин (R) или лизин (K) с получением варианта константной области тяжелой цепи OKT3, который представлен в таблице 50. Указанный вариант константной области тяжелой цепи OKT3 сцепляли с вариабельной областью тяжелой цепи OKT3 (OKT3VH0000, SEQ ID NO: 1010) с получением варианта 1 тяжелой цепи OKT3, и экспрессионный вектор, кодирующий соответствующий ген, получали с помощью метода, известного специалисту в данной области. Аналогичным образом аминокислотные остатки в константной области 2 тяжелой цепи OKT3 2 (G1T4h, SEQ ID NO: 1016) заменяли на аспарагиновую кислоту (D) или глутаминовую кислоту (Е) с получением вариантов константной области тяжелой цепи OKT3, которые представлены в таблице 51. Указанные варианты константной области тяжелой цепи OKT3 каждый сцепляли с вариабельной областью тяжелой цепи OKT3 (OKT3VH0000, SEQ ID NO: 1010) с получением варианта 2 тяжелой цепи OKT3, и экспрессионный вектор, кодирующий соответствующий ген, получали с помощью метода, известного специалисту в данной области. Следует отметить, что в СН3-участки константных областей 1 и 2 тяжелой цепи, указанных в этом примере, интродуцировали модификацию «Knobs-into-Holes» (KiH), способствующую гетеродимеризации.

Полученные согласно описанному выше методу вариант 1 тяжелой цепи и вариант 2 тяжелой цепи OKT3 объединяли с легкой цепью OKT3 и варианты OKT3, представленные в таблице 52, экспрессировали путем кратковременной экспрессии с использованием клеток FreeStyle293 (фирма Invitrogen) или клеток Expi293 (фирма Life technologies) с помощью метода, известного специалисту в данной области, и очищали с использованием белка А с помощью метода, известного специалисту в данной области.

Кроме того, аналогичным образом в качестве отрицательного контроля получали антитело к KLH, IC17 (тяжелая цепь: IC17HdK-G1T4 (SEQ ID NO: 1013), легкая цепь: IC17L-k0 (SEQ ID NO: 1014)).

Пример 15-2. Получение суспензии клеток Jurkat

Суспензию клеток Jurkat получали согласно методу, описанному в примере 13-2.

Пример 15-3. Получение раствора люминесцентного реагента

Раствор люминесцентного реагент получали согласно методу, описанному в примере 13-3.

Пример 15-4. Оценка активации Т-клеток антителами, имеющими замену на аминокислоты, отличные от цистеина, в константной области

Активацию Т-клеток оценивали согласно методу, описанному в примере 13-4.

В результате установлено, что варианты OKT3 с интродуцированной заменой на положительно заряженную аминокислоту в одной константной области и замену на отрицательно заряженную аминокислоту в другой константной области значительно повышали активированное состояние Т-клеток по сравнению с OKT3, что продемонстрировано на фиг. 28. При этом, варианты OKT3 с интродуцированной заменой на положительно или отрицательно заряженную аминокислоту в одной константной области и без модификации другой константной области значительно изменяли активированное состояние Т-клеток по сравнению с OKT3. Указанный результат продемонстрировал, что не только замена на цистеин, но также и замена на заряженную аминокислоту могут обеспечивать перекрестное сшивание Fab с помощью нековалентной связи и повышать CD3-агонистическую активность.

Пример 16. Оценка CD3-агонистической активности антител, имеющих замену на цистеин в Fab и лишенных дисульфидных связей в шарнирной области

Пример 16-1. Получение антител, имеющих замену на цистеин в Fab и лишенных дисульфидных связей в шарнирной области

Тяжелую цепь агонистического антитела к человеческому CD3, OKT3 (тяжелая цепь: OKT3VH0000-G1T4 (SEQ ID NO: 1007), легкая цепь: OKT3VL0000-KT0 (SEQ ID NO: 1008)), подвергали исследованию, в котором дисульфидные связи с шарнирной области удаляли и аминокислотный остаток, экспонированный на поверхности структуры, заменяли на цистеин.

Цистеин в шарнирной области константной области тяжелой цепи OKT3 (G1T4, SEQ ID NO: 1009) заменяли на серии с получением вариантов константной области тяжелой цепи OKT3, которые представлены в таблице 53. Аминокислотный остаток в положении 191 (EU-нумерация) указанных вариантов константной области тяжелой цепи OKT3 заменяли на цистеин с получением вариантов константной области тяжелой цепи OKT3, которые представлены в таблице 54. Указанные варианты константной области тяжелой цепи OKT3 каждый сцепляли с вариабельной областью тяжелой цепи OKT3 (OKT3VH0000, SEQ ID NO: 1010) с получением вариантов тяжелой цепи OKT3, и экспрессионные векторы, кодирующие соответствующие гены, получали с помощью метода, известного специалисту в данной области.

Полученные согласно описанному выше методу варианты тяжелой цепи OKT3 объединяли с легкой цепью OKT3 и варианты OKT3, представленные в таблице 55, экспрессировали путем кратковременной экспрессии с использованием клеток FreeStyle293 (фирма Invitrogen) или клеток Expi293 (фирма Life technologies) с помощью метода, известного специалисту в данной области, и очищали с использованием белка А с помощью метода, известного специалисту в данной области. Кроме того, аналогичным образом в качестве отрицательного контроля получали антитело к KLH, IC17 (тяжелая цепь: IC17HdK-G1T4 (SEQ ID NO: 1013), легкая цепь: IC17L-k0 (SEQ ID NO: 1014)).

Пример 16-2. Получение суспензии клеток Jurkat

Суспензию клеток Jurkat получали согласно методу, описанному в примере 13-2.

Пример 16-3. Получение раствора люминесцентного реагента

Раствор люминесцентного реагент получали согласно методу, описанному в примере 13-3.

Пример 16-4. Оценка активации Т-клеток антителами, имеющими замену на цистеин в Fab и лишенными дисульфидных связей в шарнирной области

Активацию Т-клеток оценивали согласно методу, описанному в примере 13-4.

В результате установлено, что варианты OKT3 только с удаленными дисульфидными связями в шарнирной области снижали или значительно изменяли активированное состояние Т-клеток по сравнению с OKT3, что продемонстрировано на фиг. 29. С другой стороны, варианты OKT3, у которых удалены дисульфидные связи в шарнирной области и в которые интродуцирована замена на цистеин в константную область значительно повышали активированное состояние Т-клеток по сравнению с OKT3. Указанный результат продемонстрировал, что даже в отсутствии дисульфидной связи в шарнирной области замена на цистеин в Fab может обеспечивать перекрестное сшивание Fab и повышать CD3-агонистическую активность.

Пример 17. Получение экспрессионных векторов для модифицированных антител и экспрессия, и очистка модифицированных антител

Ген антитела, встроенный в экспрессионный вектор для клеток животных, подвергали обработке для замены аминокислотных остатков в последовательности с помощью метода, известного специалистам в данной области, используя ПЦР, набор для клонирования In-Fusion Advantage PCR (фирма TAKARA) или т.п. для конструирования экспрессионного вектора для модифицированного антитела. Нуклеотидную последовательность полученного экспрессионного вектора определяли с помощью метода, известного специалисту в данной области. Полученный экспрессионный вектор кратковременно интродуцировали в клетки FreeStyle293® или Expi293® (фирма Invitrogen) и клеткам давали экспрессировать модифицированное антитело в супернатанте культуры. Модифицированное антитело очищали из полученного супернатанта культуры с помощью метода, известного специалисту в данной области, используя белок А и т.п. Абсорбцию при 280 нм измеряли с помощью спектрофотометра. Коэффициент абсорбции рассчитывали на основе измеренной величины, применяя метод РАСЕ, и использовали для расчета концентрации антитела (Protein Science 4, 1995, сс. 2411-2423).

Пример 18. Получение биспецифических антител

Очищенное антитело подвергали диализу в TBS- или ЗФР-буфере и его концентрацию доводили до 1 мг/мл. В качестве 10-кратного реакционного буфера приготавливали 250 мМ 2-МЕА (фирма SIGMA). Два различных гомодимерных антитела, полученных согласно методу, описанному в примере 17, смешивали в равных количествах. К указанной смеси добавляли 1/10 объема 10-кратного реакционного буфера и смешивали. Смеси давали выстояться при 37°С в течение 90 мин. После осуществления реакции смесь подвергали диализу в TBS или ЗФР с получением раствора биспецифического антитела, в котором были гетеродимеризированы два указанных выше различных антитела. Концентрацию антитела измеряли с помощью указанного выше метода, и антитело использовали в приведенных ниже экспериментах.

Пример 19. Оценка агонистической активности

Пример 19-1. Получение суспензии клеток Jurkat

Клетки Jurkat (эффекторные TCR/CD3-клетки (NFAT), фирма Promega) собирали из колб. Клетки промывали буфером для анализа (среда RPMI 1640 (фирма Gibco), 10% FBS (фирма HyClone), 1% среда MEM с заменимыми аминокислотами (фирма Invitrogen) и 1 мМ пируват натрия (фирма In vitro gen)):, a затем суспендировали из расчета 3×10⁶ клеток/мл в буфере для анализа. Указанную суспензию клеток Jurkat использовали в последующих экспериментах.

Пример 19-2. Получение раствора люминесцентного реагента

100 мл буфера из системы для теста люциферазы Bio-Glo (фирма Promega) добавляли во флакон, содержащий субстрат из системы для теста люциферазы Bio-Glo (фирма Promega), и смешивали путем переворачивания. Флакон защищали от солнечного света и замораживали при -20°С. Указанный раствор люминесцентного реагента использовали в последующих экспериментах.

Пример 19-3. Анализ Т-клеточной активации

Т-клеточную активацию с помощью передачи агонистического сигнала оценивали по кратности изменения люминесценции люциферазы. Вышеуказанные клетки Jurkat представляют собой клетки, трансформированные репортерным геном люциферазы, имеющим NFAT-регулируемую последовательность. Когда клетки стимулируют антителом к TCR/CD3, то NFAT-путь активируется через внутриклеточную передачу сигнала, индуцируя тем самым экспрессию люциферазы. Суспензию клеток Jurkat, полученную согласно указанному выше методу, добавляли в 384-луночный плоскодонный белый планшет в количестве 10 мкл на лунку (3×10⁴ клеток/лунку). Затем добавляли раствор антитела, приготовленный для каждой из концентраций (150, 15, 1,5, 0,15, 0,015, 0,0015, 0,00015, 0,000015 нМ), в количестве 20 мкл на лунку. Указанному планшету давали выстояться в инкубаторе с 5% СО₂ при 37°С в течение 24 ч. После инкубации раствор люминесцентного реагента подвергали оттаиванию и в каждую лунку добавляли по 30 мкл раствора. Затем планшету давали выстояться при комнатной температуре в течение 10 мин. Люминесценцию люциферазы в каждой лунке планшета измеряли с помощью люминометра.

Пример 20. Оценка агонистической активности анти-CD3 бипаратопных антител с использованием клеток Jurkat

Получали антитела и их активность оценивали согласно методам, указанным в примерах 17, 18 и 19. Применяемые в этом примере антитела представлены в таблице 56.

В результате установлено, что модифицированные молекулы с дополнительной дисульфидной связью, сцепляющей Fab-Fab двух типов анти-CD3 биспецифических антител, характеризовались опосредуемой CD3 агонистической активностью, отличающейся от биспецифических антител, лишенных дополнительной дисульфидной связи, что продемонстрировано на фиг. 30.

Этот результат позволяет предположить, что интродукция модификаций, предлагаемых в настоящем изобретении, может повышать или понижать агонистическую активность, которой обладают биспецифические антигенсвязывающие молекулы, имеющие различные эпитопы одной и той же мишени.

Пример 21. Оценка CD137-агонистической активности с использованием клеток Jurkat

Получали антитела и их активность оценивали согласно методам, указанным в примерах 17, 18 и 19. Применяемые в этом примере антитела представляли собой следующие конструкции: каноническое антитело к CD137, антитело с интродуцированной в константную область тяжелой цепи мутацией, способствующей ассоциации антител (гексамеризация), и модифицированные антитела, полученные путем сцепления Fab-Fab каждого из вышеуказанных антител с помощью дополнительных дисульфидных связей.

Активацию Т-клеток путем передачи агонистического сигнала оценивали по основе кратности изменения люминесценции люциферазы. Клетки GloResponseTM NF-KB-Luc2/4-1BB клеточной линии Jurkat (фирма Promega) представляют собой клетки, трансформированные репортерным геном люциферазы; имеющим NFAT-регулируемую последовательность. Когда клетки стимулируют антителом к CD137, то NFAT-путь активируется через внутриклеточную передачу сигнала, индуцируя тем самым экспрессию люциферазы. Суспензию клеток Jurkat, приготовленную в концентрации 2×10⁶ клеток/мл в среде для анализа (99% RPMI, 1% FBS), добавляли в 96-луночный плоскодонный белый планшет в количестве 25 мкл на лунку (5×10⁴ клеток/лунку). Затем раствор антитела, содержащий АТФ, или раствор антитела без АТФ, приготовленный для каждой концентрации антитела (конечная концентрация: 45, 15, 5, 1,667, 0,556, 0,185, 0.062 и 0,021 мкг/мл), добавляли из расчета 25 мкл на лунку. Конечная концентрация АТФ составляла 250 нМ. Указанному планшету давали выстояться в инкубаторе с 5% CO₂ при 37°С в течение 6 ч. После инкубации раствор люминесцентного реагента подвергали оттаиванию и в каждую лунку добавляли по 75 мкл раствора. Затем планшету давали выстояться при комнатной температуре в течение 10 мин. Люминесценцию люциферазы в каждой лунке планшета измеряли с помощью люминометра. Величина люминесценции в каждой лунке, деленная на величину люминесценции в лунке, в которую не добавляли антитело, представляла собой кратность изменения люминесценции, и она служила в качестве показателя при оценке активности каждого антитела.

В результате установлено, что антитела с интродуцированной модификацией, способствующей гексамеризации, характеризовались более высокой агонистической активностью по сравнению с каноническим антителом к CD137. Кроме того, для модифицированных антител, в каждое из которых интродуцировали дополнительные дисульфидные связи, обнаружена синергетически повышенная агонистическая активность.

Указанный результат позволяет предположить, что интродукция модификаций, предлагаемых в настоящем изобретении, может повышать активность анти-CD137 агонистического антитела.

Пример 22. Оценка агонистической активности анти-CD3//РР1 биспецифических антител с использованием клеток Jurkat

Пример 22-1

Получали антитела и оценивали их активность согласно методам, указанным в примерах 17, 18 и 19. Применяемые в этом примере антитела представлены в таблице 58.

В результате установлено, что многочисленные биспецифические антитела, состоящие из комбинации антитела к CD3 и антитела к PD1, т.е. модифицированных молекул с дополнительной дисульфидной связью, сцепляющей Fab-Fab, обладали значительно измененной CD3- и/или PD1-опосредуемой передачей сигнала по сравнению с биспецифическими антителами, лишенными дополнительной дисульфидной связи, что продемонстрировано на фиг. 31.

Указанный результат позволяет предположить, что интродукция мутаций, предлагаемых в настоящем изобретении, может повышать или понижать агонистическую активность, которой обладают антигенсвязывающие молекулы, такие как антитела.

Пример 22-2

Получали антитела и оценивали их активность согласно методам, указанным в примерах 2, 3 и 4. Применяемые в этом примере антитела представлены в таблице 59.

Присутствие или отсутствие PD-1-агонистической передачи сигнала оценивали по соотношению флуоресцентного BRET-сигнала (биолюминесцентный резонансный перенос энергии), когда PD-1 находился в окрестности SHP2 (фосфатаза с доменом гомологии Scr2) (618 нм), и люминесценции, исходящей от SHP2, являющейся донором (460 нм). За 1 день до анализа антигенпрезентирующие клетки, экспрессирующие PD-L1 (фирма Promega, №J109A), высевали в среду F-12, содержащую 10% FBS (фирма Gibco, 11765-054), в 96-луночный планшет (фирма Costar, №3917) из расчета 4,0×10⁴ клеток/100 мкл/лунку и клетки культивировали в СО₂-инкубаторе в течение 16-24 ч при 37°С. В день анализа лиганд HaloTag nanoBRET 618 (фирма Promega, №G980A) разводили в 250 раз средой Opti-MEM (фирма Gibco, №31985-062). Среду для культивирования экспрессирующих PD-L1 антигенпрезентирующих клеток удаляли и добавляли разведенный лиганд HaloTag nanoBRET 618 в количестве 25 мкл/лунку. Добавляли образец для оценки, разведенный средой Opti-MEM, который содержал 10 мкг/мл ингибирующих PD-L1 антител (40, 8 и 1,6 мкг/мл), в количестве 25 мкл/лунку. В указанный выше 96-луночный планшет добавляли РВ-1/SHP2-клетки Jurkat (фирма Promega, №CS2009A01) из расчета 5×10⁴ клеток/50 мкл/лунку, тщательно суспендировали и затем инкубировали в СО₂-инкубаторе в течение 2,5 ч при 37°С. Субстрат nanoBRET Nano-Glo (фирма Promega, №N157A) разводили в 100 раз средой Opti-MEM и после инкубации добавляли в количестве 25 мкл/лунку в 96-луночный планшет. Планшету давали выстояться при комнатной температуре в течение 30 мин и затем измеряли Em460 нМ и Em618 нм с помощью устройства Envision (фирма PerkinElmer, 2104 EnVision). Полученные величины использовали в приведенном ниже уравнении для расчета BRET-соотношения (mBU).

В результате установлено, что биспецифические антитела, состоящие из антитела к CD3 и антитела к PD1, т.е. модифицированные молекулы с дополнительной дисульфидной связью, сцепляющей Fab-Fab, обладали значительно измененной CD3- и/или PD1-опосредуемой передачей сигнала по сравнению с биспецифическими антителами, лишенными дополнительной дисульфидной связи, что продемонстрировано на фиг. 32.

Пример 23. Оценка агонистической активности биспецифических CD28/CD3-«прижимающих» антител

Пример 23-1. Анализ ингибирования клеточного роста в реальном времени (xCELLigence-анализ)

Антитела получали согласно методам, указанным в примерах 17 и 18. Применяемые в этом примере антитела представлены в таблице 60.

Зависящее от Т-клеток ингибирующее рост раковых клеток действие антител оценивали с помощью устройства xCELLigence RTCA МР (фирма АСЕА Biosciences). Линию клеток рака печени человека SK-Hep-1 с усиленной экспрессией глипикана-3 (GPC3) (SEQ ID NO: 1241) (SK-pca31a) применяли в качестве клеток-мишеней, а мононуклеарные клетки периферической крови человека (РВМС: фирма Cellular Technology Limited (CTL)) применяли в качестве эффекторных клеток. Высевали 1×10⁴ клеток SK-pca31a в Е-планшет 96 (фирма АСЕА Biosciences). На следующий день добавляли 2×10⁵ клеток РВМС и антитела до получения конечной концентрации 0,001, 0,01, 0,1, 1 или 10 мкг/мл. Осуществляли мониторинг роста клеток каждые 15 мин с помощью xCELLigence и культивирование продолжали в течение 72 ч. Ингибирующее рост клеток действие (CGI: %) рассчитывали с помощью следующего уравнения.

В указанном выше уравнении «СI_Aт» обозначает индекс роста клеток на лунку в течение 72 ч после добавления антитела (индекс роста клеток, измеренный с помощью xCELLigence). Кроме того, «СI_{без Ат}» обозначает индекс роста клеток на лунку в течение 72 ч без добавления антитела.

Пример 23-2. Анализ производства цитокинов

Производство цитокинов Т-клетками в присутствии антител оценивали согласно описанному ниже методу.

SK-pca31a применяли в качестве клетки-мишени, а РВМС (фирма Cellular Technology Limited (CTL)) применяли в качестве эффекторной клетки. 1×10⁴ клеток линии SK-pca31a высевали в 96-луночный планшет. На следующий день добавляли 2×10⁵ клеток РВМС и антитела до получения конечной концентрации 0,01, 0,1, 1 или 10 мкг/мл. Супернатант культуры собирали через 72 ч и измеряли человеческий IL-6 с использованием устройства AlphaLISA (фирма PerkinElmer).

Результаты

Совместное применение биспецифического CD28/CD3-«прижимающего» антитела и биспецифического GPC3/C ослабленным связыванием CD3 антитела не приводило к ингибирующим рост клеток действиям. Однако ингибирующие действия на рост раковых клеток обнаружены при применении модификаций, предназначенных для интродукции дополнительной дисульфидной связи между Fab-Fab биспецифического CD28/CD3-«прижимающего» антитела (фиг. 33 и 35). Кроме того, производство цитокинов обнаружено, когда в биспецифическое CD28/CD3-«прижимающее» антитело интродуцировали вышеуказанную модификацию, а биспецифическое GPC3/C ослабленным связыванием CD3 антитело совместно культивировали с экспрессирующей GPC3 линией клеток и РВМС; однако добавление к РВМС биспецифического CD28/CD3-«прижимающего» антитела с интродуцированной указанной выше модификацией и биспецифического GPC3/C ослабленным связыванием CD3 антитела не приводило к производству цитокинов (фиг. 34 и 36). Таким образом, можно предположить, что воздействие биспецифического CD28/CD3-«прижимающего» антитела с интродуцированной указанной выше модификацией и биспецифического GPC3/C ослабленным связыванием CD3 антитела на ингибирование роста раковых клеток и индукцию производства цитокинами Т-клетками зависит от экспрессии ракового антигена.

Пример 24. Оценка агонистической активности CD8/CD28 биспецифических антител

Антитела получали согласно методу, указанному в примерах 17 и 18. Применяемые в этом примере антитела представлены в таблице 61.

Для анализа полученных образцов конструкций применяли человеческие мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС):, выделенные из образцов крови здорового донора. Гепарин (0,5 мл) смешивали с 50 мл крови и дополнительно разводили 50 мл ЗФР. Человеческие РВМС выделяли с использованием двух стадий. На стадии 1 Leucosep (фирма greiner bio-one) с добавленным Фиколл-пак PLUS (фирма GE Healthcare) центрифугировали при 1000×g в течение 1 мин при комнатной температуре, затем добавляли кровь, разведенную ЗФР, и смесь центрифугировали при 400×g в течение 30 мин при комнатной температуре. На стадии 2 собирали из пробирки после центрифугирования лейкоцитарные пленки и затем промывали 60 мл ЗФР (фирма Wako). Клеточную плотность выделенных человеческих РВМС доводили до 1×10⁷ /мл с использованием среды (5% человеческой сыворотки (фирма SIGMA), 95% AIM-V (фирма Thermo Fischer Scientific)). Полученную в результате клеточную суспензию высевали в лунки 24-луночного планшета из расчета 1 мл/лунку и планшет инкубировали в инкубаторе с 5% СО₂ при 37°С.

Через 2 дня из высеянных клеток удаляли среду и клетки промывали 500 мкл ЗФР и собирали с использованием аккутазы (фирма nacalai tesque). Затем плотность клеток доводили до 1×10⁶ /мл с помощью раствора ViaFluor 405 (фирма Biotium), разведенного ЗФР до получения конечной концентрации 2 мкМ, а затем давали выстояться в течение 15 мин при 37°С. Затем клетки вновь суспендировали в среде и после этого высевали в лунки 96-луночного планшета из расчета 2×10⁵ клеток на лунку. К ним добавляли раствор антитела до получения конечной концентрации 0,1, 1 и 10 мкг/мл, а затем клетки культивировали в инкубаторе с 5% CO₂ в течение 4 дней при 37°С.

После окончания культивирования определяли процент роста клеток с использованием проточного цитометра (BD LSRFortessa™ X-20 (фирма BD Biosciences)) (FCM). Процент роста клеток рассчитывали на основе процента интенсивности флуоресценции восстановленного ViaFluor 405. Применяли флуоресцентномеченное антитело к CD8a, антитело к CD4, антитело к Foxp3 и т.п. для осуществления анализа CD8a-позитивных Т-клеток и регуляторных Т-клеток (Treg). В результате для некоторых образцов конструкций обнаружено повышение активности, что продемонстрировано на фиг. 37.

Пример 25. Изучение образования дисульфидной связи между интродуцированными цистеинами

Модифицированные антитела получали путем интродукции цистеина в легкие и тяжелые цепи гуманизированного модельного антитела, и изучали образование дисульфидной связи между новыми интродуцированными цистеинами. Изучение осуществляли путем инкубации образов антител в 20 мМ фосфатном буфере (рН 7,0) с химотрипсином и детекции массы пептидов, которые предположительно могут образовываться из аминокислотной последовательности каждого антитела, с использованием ЖХ/МС. Каждое антитело получали согласно методу, указанному в примере 17 и 18. Применяемые в этом примере антитела представлены в таблице 62.

Сначала анализировали модифицированные антитела различных подклассов (IgG1, IgG2 и IgG4), в которых лизин в положении 126 (нумерация по Кэботу) легкой цепи был заменен на цистеин. В результате установлено, что во всех проанализированных антителах обнаружены компоненты, которые соответствовали теоретической массе пептида, имеющего дисульфидную связь между цистеинами в положении 126, что продемонстрировано в таблице 63. Кроме того, указанный компонент исчезал, когда к образцу IgG1 добавляли три(2-карбоксиэтил)фосфин, который оказывает восстанавливающее действие на дисульфидные связи, что позволяет предположить образование дисульфидной связи между цистеинами в положении 126 в этом пептиде. Также можно предположить, что разница в подклассах не влияет на образование указанных дисульфидных связей.

Далее осуществляли анализ с использованием модифицированных антител, в которых аланин в положении 162 (EU-нумерация) или серии в положении 191 (EU-нумерация) тяжелой цепи IgG1 был заменен на цистеин. В результате установлено, что обнаружены компоненты, которые соответствовали теоретической массе пептида, имеющего дисульфидную связь между интродуцированными цистеинами, что продемонстрировано в таблицах 64 и 65 соответственно. Кроме того, указанный компонент исчезал, когда к модифицированному антителу с интродуцированным цистеином в положении 191 добавляли три(2-карбоксиэтил)фосфин (таблица 65). Исходя из вышеуказанного, можно предположить, что дисульфидная связь образуется также между цистеинами, интродуцированными в тяжелую цепь.

Хотя выше изобретение описано для лучшего понимания с указанием некоторых деталей с целью иллюстрации и примеров, описание и примеры не должны рассматриваться в качестве ограничивающих объем изобретения. Описание всей патентной и научной литературы, процитированной в настоящем описании, специально полностью включено в настоящее описание в качестве ссылки.

Промышленная применимость

Согласно не ограничивающему объем изобретения варианту осуществления изобретения антигенсвязывающая молекула, представленная в настоящем описании, является ценной, поскольку она может удерживать несколько антигенных молекула пространственно близких положениях, регулировать взаимодействие между несколькими антигенными молекулами и/или регулировать активацию нескольких антигенных молекул, которые активируются путем ассоциации друг с другом. Согласно другим вариантам осуществления изобретения антигенсвязывающая молекула, представленная в настоящем описании, является ценной, поскольку она повышает устойчивость к расщеплению протеазой по сравнению с каноническими антигенсвязывающими молекулами.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> ЧУГАИ СЕЙЯКУ КАБУСИКИ КАЙСЯ

<120> АНТИГЕНСВЯЗЫВАЮЩАЯ МОЛЕКУЛА, СОДЕРЖАЩАЯ ДВА АНТИГЕНСВЯЗЫВАЮЩИХ

ДОМЕНА, КОТОРЫЕ СЦЕПЛЕНЫ ДРУГ С ДРУГОМ

<130> C1-A1816P

<150> JP 2018-146929

<151> 2018-08-03

<160> 1241

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 447

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Hch

<400> 1

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ala

20 25 30

Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Gln Ile Lys Asp Lys Ser Gln Asn Tyr Ala Thr Tyr Val Ala Glu

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Ala Asp Ser Lys Asn Ser

65 70 75 80

Ile Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Arg Tyr Val His Tyr Ala Ala Gly Tyr Gly Val Asp Ile Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro

115 120 125

Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr

130 135 140

Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr

145 150 155 160

Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro

165 170 175

Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr

180 185 190

Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp

195 200 205

His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr

210 215 220

Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Arg Arg Gly Pro

225 230 235 240

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

245 250 255

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp

260 265 270

Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

275 280 285

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

290 295 300

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

305 310 315 320

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys

325 330 335

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

340 345 350

Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr

355 360 365

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

370 375 380

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

385 390 395 400

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys

405 410 415

Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

420 425 430

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

<210> 2

<211> 447

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Hch

<400> 2

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ala

20 25 30

Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Gln Ile Lys Asp Lys Ser Gln Asn Tyr Ala Thr Tyr Val Ala Glu

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Ala Asp Ser Lys Asn Ser

65 70 75 80

Ile Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Arg Tyr Val His Tyr Ala Ala Gly Tyr Gly Val Asp Ile Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro

115 120 125

Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr

130 135 140

Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr

145 150 155 160

Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro

165 170 175

Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr

180 185 190

Val Pro Ser Cys Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp

195 200 205

His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr

210 215 220

Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Arg Arg Gly Pro

225 230 235 240

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

245 250 255

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp

260 265 270

Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

275 280 285

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

290 295 300

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

305 310 315 320

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys

325 330 335

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

340 345 350

Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr

355 360 365

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

370 375 380

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

385 390 395 400

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys

405 410 415

Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

420 425 430

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

<210> 3

<211> 447

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Hch

<400> 3

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ala

20 25 30

Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Gln Ile Lys Asp Lys Ser Gln Asn Tyr Ala Thr Tyr Val Ala Glu

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Ala Asp Ser Lys Asn Ser

65 70 75 80

Ile Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Arg Tyr Val His Tyr Ala Ala Gly Tyr Gly Val Asp Ile Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro

115 120 125

Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr

130 135 140

Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr

145 150 155 160

Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro

165 170 175

Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr

180 185 190

Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp

195 200 205

His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr

210 215 220

Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Arg Arg Gly Pro

225 230 235 240

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

245 250 255

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp

260 265 270

Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

275 280 285

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

290 295 300

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

305 310 315 320

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys

325 330 335

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

340 345 350

Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr

355 360 365

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

370 375 380

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

385 390 395 400

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys

405 410 415

Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

420 425 430

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

<210> 4

<211> 450

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Hch

<400> 4

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ala

20 25 30

Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Gln Ile Lys Asp Lys Ser Gln Asn Tyr Ala Thr Tyr Val Ala Glu

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Ala Asp Ser Lys Asn Ser

65 70 75 80

Ile Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Arg Tyr Val His Tyr Ala Ala Gly Tyr Gly Val Asp Ile Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro

115 120 125

Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr

130 135 140

Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr

145 150 155 160

Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro

165 170 175

Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr

180 185 190

Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn

195 200 205

His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser

210 215 220

Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Arg

225 230 235 240

Gly Gly Pro Lys Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

245 250 255

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

260 265 270

His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

275 280 285

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr

290 295 300

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

305 310 315 320

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro

325 330 335

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

340 345 350

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Lys Glu Met Thr Lys Asn Gln Val

355 360 365

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

370 375 380

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

385 390 395 400

Pro Tyr Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr

405 410 415

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

420 425 430

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

435 440 445

Ser Pro

450

<210> 5

<211> 447

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Hch

<400> 5

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr

20 25 30

Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

115 120 125

Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu

130 135 140

Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

145 150 155 160

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

165 170 175

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

180 185 190

Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro

195 200 205

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys

210 215 220

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Arg Gly Gly Pro

225 230 235 240

Lys Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

245 250 255

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

260 265 270

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

275 280 285

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val

290 295 300

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

305 310 315 320

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys

325 330 335

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

340 345 350

Leu Pro Pro Ser Arg Lys Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr

355 360 365

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

370 375 380

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Tyr Leu

385 390 395 400

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

405 410 415

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

420 425 430

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

<210> 6

<211> 448

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Hch

<400> 6

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Cys Ile Tyr Pro Gly Asn Val Asn Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Thr Arg Ser His Tyr Gly Leu Asp Trp Asn Phe Asp Val Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Arg Gly Gly

225 230 235 240

Pro Lys Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Tyr

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Glu Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

<210> 7

<211> 450

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Hch

<400> 7

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ala

20 25 30

Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Gln Ile Lys Asp Lys Ser Gln Asn Tyr Ala Thr Tyr Val Ala Glu

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Ala Asp Ser Lys Asn Ser

65 70 75 80

Ile Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Arg Tyr Val His Tyr Ala Ala Gly Tyr Gly Val Asp Ile Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro

115 120 125

Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr

130 135 140

Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr

145 150 155 160

Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro

165 170 175

Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr

180 185 190

Val Pro Ser Cys Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn

195 200 205

His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser

210 215 220

Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Arg

225 230 235 240

Gly Gly Pro Lys Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

245 250 255

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

260 265 270

His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

275 280 285

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr

290 295 300

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

305 310 315 320

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro

325 330 335

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

340 345 350

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Lys Glu Met Thr Lys Asn Gln Val

355 360 365

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

370 375 380

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

385 390 395 400

Pro Tyr Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr

405 410 415

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

420 425 430

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

435 440 445

Ser Pro

450

<210> 8

<211> 447

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Hch

<400> 8

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr

20 25 30

Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

115 120 125

Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu

130 135 140

Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

145 150 155 160

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

165 170 175

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

180 185 190

Cys Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro

195 200 205

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys

210 215 220

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Arg Gly Gly Pro

225 230 235 240

Lys Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

245 250 255

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

260 265 270

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

275 280 285

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val

290 295 300

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

305 310 315 320

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys

325 330 335

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

340 345 350

Leu Pro Pro Ser Arg Lys Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr

355 360 365

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

370 375 380

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Tyr Leu

385 390 395 400

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

405 410 415

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

420 425 430

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

<210> 9

<211> 448

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Hch

<400> 9

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Cys Ile Tyr Pro Gly Asn Val Asn Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Thr Arg Ser His Tyr Gly Leu Asp Trp Asn Phe Asp Val Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Cys Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Arg Gly Gly

225 230 235 240

Pro Lys Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Tyr

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Glu Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

<210> 10

<211> 219

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Lch

<400> 10

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Pro Leu Val His Ser

20 25 30

Asn Arg Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala

35 40 45

Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gly Gln Gly

85 90 95

Thr Gln Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

115 120 125

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

130 135 140

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

145 150 155 160

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

165 170 175

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

180 185 190

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

195 200 205

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 11

<211> 219

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Lch

<400> 11

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Pro Leu Val His Ser

20 25 30

Asn Arg Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala

35 40 45

Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gly Gln Gly

85 90 95

Thr Gln Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

115 120 125

Gln Leu Cys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

130 135 140

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

145 150 155 160

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

165 170 175

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

180 185 190

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

195 200 205

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 12

<211> 213

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Lch

<400> 12

Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met

20 25 30

Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr

35 40 45

Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala His Phe Arg Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Gly Met Glu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr

85 90 95

Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Asn Arg Thr Val Ala Ala Pro

100 105 110

Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr

115 120 125

Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys

130 135 140

Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu

145 150 155 160

Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser

165 170 175

Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala

180 185 190

Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe

195 200 205

Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 13

<211> 214

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Lch

<400> 13

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys His Ala Ser Gln Asn Thr Tyr Val Trp

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Lys Ala Ser Asn Leu His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Gln Thr Tyr Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 14

<211> 214

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Lch

<400> 14

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys His Ala Ser Gln Asn Thr Tyr Val Trp

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Lys Ala Ser Asn Leu His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Gln Thr Tyr Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Cys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 15

<211> 447

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Hch

<400> 15

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp

20 25 30

His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp

35 40 45

Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu

50 55 60

Lys Ser Arg Val Thr Met Leu Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser

65 70 75 80

Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Ser Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

115 120 125

Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu

130 135 140

Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

145 150 155 160

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

165 170 175

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

180 185 190

Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro

195 200 205

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys

210 215 220

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Arg Arg Gly Pro

225 230 235 240

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

245 250 255

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

260 265 270

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

275 280 285

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

290 295 300

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

305 310 315 320

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys

325 330 335

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

340 345 350

Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr

355 360 365

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

370 375 380

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

385 390 395 400

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

405 410 415

Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

420 425 430

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

<210> 16

<211> 214

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Lch

<400> 16

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 17

<211> 119

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> VH

<400> 17

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp

20 25 30

His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp

35 40 45

Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu

50 55 60

Lys Ser Arg Val Thr Met Leu Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser

65 70 75 80

Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Ser Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 18

<211> 328

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CH

<400> 18

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Arg Arg Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

325

<210> 19

<211> 107

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> VL

<400> 19

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 20

<211> 107

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CL

<400> 20

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

1 5 10 15

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

20 25 30

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

35 40 45

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

50 55 60

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

65 70 75 80

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

85 90 95

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100 105

<210> 21

<211> 119

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> VH

<400> 21

Gln Val Gln Leu Cys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp

20 25 30

His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp

35 40 45

Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu

50 55 60

Lys Ser Arg Val Thr Met Leu Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser

65 70 75 80

Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Ser Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 22

<211> 119

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> VH

<400> 22

Gln Val Gln Leu Gln Cys Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp

20 25 30

His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp

35 40 45

Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu

50 55 60

Lys Ser Arg Val Thr Met Leu Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser

65 70 75 80

Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Ser Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 23

<211> 119

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> VH

<400> 23

Gln Val Gln Leu Gln Glu Cys Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp

20 25 30

His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp

35 40 45

Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu

50 55 60

Lys Ser Arg Val Thr Met Leu Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser

65 70 75 80

Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Ser Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 24

<211> 119

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> VH

<400> 24

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Cys Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp

20 25 30

His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp

35 40 45

Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu

50 55 60

Lys Ser Arg Val Thr Met Leu Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser

65 70 75 80

Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Ser Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 25

<211> 119

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> VH

<400> 25

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Cys Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp

20 25 30

His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp

35 40 45

Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu

50 55 60

Lys Ser Arg Val Thr Met Leu Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser

65 70 75 80

Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Ser Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 26

<211> 119

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> VH

<400> 26

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Cys Leu Val Arg Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp

20 25 30

His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp

35 40 45

Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu

50 55 60

Lys Ser Arg Val Thr Met Leu Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser

65 70 75 80

Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Ser Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 27

<211> 119

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> VH

<400> 27

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Cys Val Arg Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp

20 25 30

His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp

35 40 45

Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu

50 55 60

Lys Ser Arg Val Thr Met Leu Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser

65 70 75 80

Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Ser Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 28

<211> 119

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> VH

<400> 28

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Cys Arg Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp

20 25 30

His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp

35 40 45

Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu

50 55 60

Lys Ser Arg Val Thr Met Leu Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser

65 70 75 80

Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Ser Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 29

<211> 119

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> VH

<400> 29

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Cys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp

20 25 30

His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp

35 40 45

Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu

50 55 60

Lys Ser Arg Val Thr Met Leu Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser

65 70 75 80

Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Ser Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 30

<211> 119

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> VH

<400> 30

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Cys Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp

20 25 30

His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp

35 40 45

Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu

50 55 60

Lys Ser Arg Val Thr Met Leu Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser

65 70 75 80

Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Ser Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 31

<211> 119

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> VH

<400> 31

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Cys Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp

20 25 30

His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp

35 40 45

Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu

50 55 60

Lys Ser Arg Val Thr Met Leu Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser

65 70 75 80

Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Ser Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 32

<211> 119

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> VH

<400> 32

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Cys

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp

20 25 30

His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp

35 40 45

Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu

50 55 60

Lys Ser Arg Val Thr Met Leu Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser

65 70 75 80

Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Ser Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 33

<211> 119

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> VH

<400> 33

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln

1 5 10 15

Cys Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp

20 25 30

His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp

35 40 45

Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu

50 55 60

Lys Ser Arg Val Thr Met Leu Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser

65 70 75 80

Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Ser Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 34

<211> 119

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> VH

<400> 34

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Cys Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp

20 25 30

His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp

35 40 45

Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu

50 55 60

Lys Ser Arg Val Thr Met Leu Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser

65 70 75 80

Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Ser Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 35

<211> 119

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> VH

<400> 35

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Cys Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp

20 25 30

His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp

35 40 45

Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu

50 55 60

Lys Ser Arg Val Thr Met Leu Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser

65 70 75 80

Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Ser Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 36

<211> 119

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> VH

<400> 36

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Cys Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp

20 25 30

His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp

35 40 45

Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu

50 55 60

Lys Ser Arg Val Thr Met Leu Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser

65 70 75 80

Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Ser Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 37

<211> 119

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> VH

<400> 37

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Cys Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp

20 25 30

His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp

35 40 45

Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu

50 55 60

Lys Ser Arg Val Thr Met Leu Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser

65 70 75 80

Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Ser Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 38

<211> 119

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> VH

<400> 38

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Cys Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp

20 25 30

His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp

35 40 45

Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu

50 55 60

Lys Ser Arg Val Thr Met Leu Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser

65 70 75 80

Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Ser Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 39

<211> 119

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> VH

<400> 39

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Cys Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp

20 25 30

His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp

35 40 45

Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu

50 55 60

Lys Ser Arg Val Thr Met Leu Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser

65 70 75 80

Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Ser Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 40

<211> 119

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> VH

<400> 40

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Cys Tyr Ser Ile Thr Ser Asp

20 25 30

His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp

35 40 45

Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu

50 55 60

Lys Ser Arg Val Thr Met Leu Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser

65 70 75 80

Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Ser Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 41

<211> 119

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> VH

<400> 41

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Cys Ile Thr Ser Asp

20 25 30

His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp

35 40 45

Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu

50 55 60

Lys Ser Arg Val Thr Met Leu Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser

65 70 75 80

Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Ser Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 42

<211> 119

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> VH

<400> 42

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Cys Ser Asp

20 25 30

His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp

35 40 45

Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu

50 55 60

Lys Ser Arg Val Thr Met Leu Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser

65 70 75 80

Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Ser Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 43

<211> 119

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> VH

<400> 43

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp

20 25 30

His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp

35 40 45

Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu

50 55 60

Lys Ser Cys Val Thr Met Leu Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser

65 70 75 80

Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Ser Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 44

<211> 119

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> VH

<400> 44

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp

20 25 30

His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp

35 40 45

Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu

50 55 60

Lys Ser Arg Cys Thr Met Leu Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser

65 70 75 80

Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Ser Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 45

<211> 119

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> VH

<400> 45

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp

20 25 30

His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp

35 40 45

Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu

50 55 60

Lys Ser Arg Val Cys Met Leu Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser

65 70 75 80

Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Ser Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 46

<211> 119

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> VH

<400> 46

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp

20 25 30

His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp

35 40 45

Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu

50 55 60

Lys Ser Arg Val Thr Met Cys Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser

65 70 75 80

Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Ser Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 47

<211> 119

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> VH

<400> 47

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp

20 25 30

His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp

35 40 45

Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu

50 55 60

Lys Ser Arg Val Thr Met Leu Arg Cys Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser

65 70 75 80

Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Ser Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 48

<211> 119

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> VH

<400> 48

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp

20 25 30

His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp

35 40 45

Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu

50 55 60

Lys Ser Arg Val Thr Met Leu Arg Asp Cys Ser Lys Asn Gln Phe Ser

65 70 75 80

Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Ser Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 49

<211> 119

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> VH

<400> 49

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp

20 25 30

His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp

35 40 45

Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu

50 55 60

Lys Ser Arg Val Thr Met Leu Arg Asp Thr Cys Lys Asn Gln Phe Ser

65 70 75 80

Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Ser Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 50

<211> 119

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> VH

<400> 50

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp

20 25 30

His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp

35 40 45

Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu

50 55 60

Lys Ser Arg Val Thr Met Leu Arg Asp Thr Ser Cys Asn Gln Phe Ser

65 70 75 80

Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Ser Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 51

<211> 119

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> VH

<400> 51

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp

20 25 30

His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp

35 40 45

Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu

50 55 60

Lys Ser Arg Val Thr Met Leu Arg Asp Thr Ser Lys Cys Gln Phe Ser

65 70 75 80

Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Ser Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 52

<211> 119

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> VH

<400> 52

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp

20 25 30

His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp

35 40 45

Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu

50 55 60

Lys Ser Arg Val Thr Met Leu Arg Asp Thr Ser Lys Asn Cys Phe Ser

65 70 75 80

Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Ser Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 53

<211> 119

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> VH

<400> 53

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp

20 25 30

His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp

35 40 45

Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu

50 55 60

Lys Ser Arg Val Thr Met Leu Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Cys

65 70 75 80

Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Ser Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 54

<211> 119

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> VH

<400> 54

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp

20 25 30

His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp

35 40 45

Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu

50 55 60

Lys Ser Arg Val Thr Met Leu Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser

65 70 75 80

Cys Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Ser Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 55

<211> 119

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> VH

<400> 55

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp

20 25 30

His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp

35 40 45

Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu

50 55 60

Lys Ser Arg Val Thr Met Leu Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser

65 70 75 80

Leu Cys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Ser Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 56

<211> 119

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> VH

<400> 56

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp

20 25 30

His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp

35 40 45

Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu

50 55 60

Lys Ser Arg Val Thr Met Leu Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser

65 70 75 80

Leu Arg Cys Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Ser Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 57

<211> 119

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> VH

<400> 57

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp

20 25 30

His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp

35 40 45

Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu

50 55 60

Lys Ser Arg Val Thr Met Leu Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser

65 70 75 80

Leu Arg Leu Cys Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Ser Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 58

<211> 119

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> VH

<400> 58

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp

20 25 30

His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp

35 40 45

Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu

50 55 60

Lys Ser Arg Val Thr Met Leu Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser

65 70 75 80

Leu Arg Leu Ser Cys Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Ser Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 59

<211> 119

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> VH

<400> 59

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp

20 25 30

His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp

35 40 45

Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu

50 55 60

Lys Ser Arg Val Thr Met Leu Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser

65 70 75 80

Leu Arg Leu Ser Ser Cys Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Ser Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 60

<211> 119

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> VH

<400> 60

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp

20 25 30

His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp

35 40 45

Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu

50 55 60

Lys Ser Arg Val Thr Met Leu Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser

65 70 75 80

Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Ser Leu Val Thr Val Cys Ser

115

<210> 61

<211> 119

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> VH

<400> 61

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp

20 25 30

His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp

35 40 45

Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu

50 55 60

Lys Ser Arg Val Thr Met Leu Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser

65 70 75 80

Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Ser Leu Val Thr Val Ser Cys

115

<210> 62

<211> 119

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> VH

<400> 62

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Cys Asp

20 25 30

His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp

35 40 45

Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu

50 55 60

Lys Ser Arg Val Thr Met Leu Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser

65 70 75 80

Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Ser Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 63

<211> 119

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> VH

<400> 63

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp

20 25 30

His Ala Cys Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp

35 40 45

Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu

50 55 60

Lys Ser Arg Val Thr Met Leu Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser

65 70 75 80

Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Ser Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 64

<211> 119

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> VH

<400> 64

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp

20 25 30

His Ala Trp Cys Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp

35 40 45

Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu

50 55 60

Lys Ser Arg Val Thr Met Leu Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser

65 70 75 80

Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Ser Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 65

<211> 119

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> VH

<400> 65

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp

20 25 30

His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp

35 40 45

Ile Gly Cys Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu

50 55 60

Lys Ser Arg Val Thr Met Leu Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser

65 70 75 80

Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Ser Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 66

<211> 119

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> VH

<400> 66

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp

20 25 30

His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp

35 40 45

Ile Gly Tyr Cys Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu

50 55 60

Lys Ser Arg Val Thr Met Leu Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser

65 70 75 80

Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Ser Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 67

<211> 119

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> VH

<400> 67

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp

20 25 30

His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp

35 40 45

Ile Gly Tyr Ile Cys Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu

50 55 60

Lys Ser Arg Val Thr Met Leu Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser

65 70 75 80

Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Ser Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 68

<211> 119

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> VH

<400> 68

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp

20 25 30

His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp

35 40 45

Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Pro Cys Leu

50 55 60

Lys Ser Arg Val Thr Met Leu Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser

65 70 75 80

Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Ser Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 69

<211> 119

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> VH

<400> 69

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp

20 25 30

His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp

35 40 45

Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Cys

50 55 60

Lys Ser Arg Val Thr Met Leu Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser

65 70 75 80

Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Ser Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 70

<211> 119

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> VH

<400> 70

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp

20 25 30

His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp

35 40 45

Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu

50 55 60

Cys Ser Arg Val Thr Met Leu Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser

65 70 75 80

Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Ser Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 71

<211> 119

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> VH

<400> 71

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp

20 25 30

His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp

35 40 45

Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu

50 55 60

Lys Cys Arg Val Thr Met Leu Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser

65 70 75 80

Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Ser Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 72

<211> 119

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> VH

<400> 72

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp

20 25 30

His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp

35 40 45

Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu

50 55 60

Lys Ser Arg Val Thr Met Leu Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser

65 70 75 80

Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Cys Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Ser Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 73

<211> 119

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> VH

<400> 73

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp

20 25 30

His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp

35 40 45

Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu

50 55 60

Lys Ser Arg Val Thr Met Leu Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser

65 70 75 80

Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Cys Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Ser Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 74

<211> 328

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CH

<400> 74

Cys Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Arg Arg Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

325

<210> 75

<211> 328

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CH

<400> 75

Ala Cys Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Arg Arg Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

325

<210> 76

<211> 328

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CH

<400> 76

Ala Ser Cys Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Arg Arg Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

325

<210> 77

<211> 328

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CH

<400> 77

Ala Ser Thr Cys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Arg Arg Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

325

<210> 78

<211> 328

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CH

<400> 78

Ala Ser Thr Lys Cys Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Arg Arg Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

325

<210> 79

<211> 328

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CH

<400> 79

Ala Ser Thr Lys Gly Cys Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Arg Arg Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

325

<210> 80

<211> 328

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CH

<400> 80

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Cys Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Arg Arg Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

325

<210> 81

<211> 328

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CH

<400> 81

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Cys Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Arg Arg Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

325

<210> 82

<211> 328

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CH

<400> 82

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Cys Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Arg Arg Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

325

<210> 83

<211> 328

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CH

<400> 83

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Cys Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Arg Arg Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

325

<210> 84

<211> 328

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CH

<400> 84

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Arg Arg Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

325

<210> 85

<211> 328

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CH

<400> 85

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Cys Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Arg Arg Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

325

<210> 86

<211> 328

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CH

<400> 86

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Cys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Arg Arg Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

325

<210> 87

<211> 328

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CH

<400> 87

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Cys Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Arg Arg Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

325

<210> 88

<211> 328

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CH

<400> 88

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Cys Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Arg Arg Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

325

<210> 89

<211> 328

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CH

<400> 89

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Cys Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Arg Arg Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

325

<210> 90

<211> 328

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CH

<400> 90

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Cys Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Arg Arg Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

325

<210> 91

<211> 328

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CH

<400> 91

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Cys Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Arg Arg Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

325

<210> 92

<211> 328

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CH

<400> 92

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Cys Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Arg Arg Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

325

<210> 93

<211> 328

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CH

<400> 93

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Cys Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Arg Arg Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

325

<210> 94

<211> 328

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CH

<400> 94

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Cys Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Arg Arg Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

325

<210> 95

<211> 328

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CH

<400> 95

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Cys Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Arg Arg Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

325

<210> 96

<211> 328

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CH

<400> 96

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Cys

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Arg Arg Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

325

<210> 97

<211> 328

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CH

<400> 97

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Cys Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Arg Arg Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

325

<210> 98

<211> 328

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CH

<400> 98

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Cys Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Arg Arg Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

325

<210> 99

<211> 328

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CH

<400> 99

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Cys Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Arg Arg Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

325

<210> 100

<211> 328

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CH

<400> 100

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Cys Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Arg Arg Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

325

<210> 101

<211> 328

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CH

<400> 101

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Cys Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Arg Arg Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

325

<210> 102

<211> 328

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CH

<400> 102

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Cys Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Arg Arg Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

325

<210> 103

<211> 328

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CH

<400> 103

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Cys Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Arg Arg Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

325

<210> 104

<211> 328

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CH

<400> 104

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Cys Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Arg Arg Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

325

<210> 105

<211> 328

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CH

<400> 105

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Cys Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Arg Arg Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

325

<210> 106

<211> 328

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CH

<400> 106

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Cys Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Arg Arg Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

325

<210> 107

<211> 328

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CH

<400> 107

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Cys Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Arg Arg Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

325

<210> 108

<211> 328

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CH

<400> 108

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Cys Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Arg Arg Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

325

<210> 109

<211> 328

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CH

<400> 109

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Cys Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Arg Arg Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

325

<210> 110

<211> 328

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CH

<400> 110

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Cys Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Arg Arg Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

325

<210> 111

<211> 328

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CH

<400> 111

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Cys Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Arg Arg Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

325

<210> 112

<211> 328

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CH

<400> 112

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Cys

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Arg Arg Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

325

<210> 113

<211> 328

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CH

<400> 113

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Cys Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Arg Arg Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

325

<210> 114

<211> 328

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CH

<400> 114

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Cys His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Arg Arg Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

325

<210> 115

<211> 328

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CH

<400> 115

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Cys Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Arg Arg Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

325

<210> 116

<211> 328

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CH

<400> 116

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Cys Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Arg Arg Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

325

<210> 117

<211> 328

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CH

<400> 117

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Cys Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Arg Arg Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

325

<210> 118

<211> 328

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CH

<400> 118

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Cys Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Arg Arg Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

325

<210> 119

<211> 328

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CH

<400> 119

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Cys Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Arg Arg Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

325

<210> 120

<211> 328

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CH

<400> 120

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Cys Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Arg Arg Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

325

<210> 121

<211> 328

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CH

<400> 121

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Cys Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Arg Arg Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

325

<210> 122

<211> 328

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CH

<400> 122

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Cys Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Arg Arg Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

325

<210> 123

<211> 328

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CH

<400> 123

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Cys Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Arg Arg Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

325

<210> 124

<211> 328

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CH

<400> 124

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Cys Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Arg Arg Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

325

<210> 125

<211> 328

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CH

<400> 125

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Cys Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Arg Arg Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

325

<210> 126

<211> 328

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CH

<400> 126

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Cys Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Arg Arg Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

325

<210> 127

<211> 328

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CH

<400> 127

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Cys Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Arg Arg Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

325

<210> 128

<211> 328

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CH

<400> 128

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Cys Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Arg Arg Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

325

<210> 129

<211> 328

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CH

<400> 129

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Cys Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Arg Arg Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

325

<210> 130

<211> 328

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CH

<400> 130

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Cys Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Arg Arg Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

325

<210> 131

<211> 328

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CH

<400> 131

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Cys Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Arg Arg Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

325

<210> 132

<211> 328

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CH

<400> 132

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Cys Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Arg Arg Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

325

<210> 133

<211> 328

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CH

<400> 133

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Cys Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Arg Arg Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

325

<210> 134

<211> 328

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CH

<400> 134

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Cys

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Arg Arg Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

325

<210> 135

<211> 328

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CH

<400> 135

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Cys Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Arg Arg Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

325

<210> 136

<211> 328

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CH

<400> 136

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Cys Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Arg Arg Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

325

<210> 137

<211> 328

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CH

<400> 137

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Cys Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Arg Arg Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

325

<210> 138

<211> 328

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CH

<400> 138

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Cys Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Arg Arg Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

325

<210> 139

<211> 328

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CH

<400> 139

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Cys His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Arg Arg Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

325

<210> 140

<211> 328

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CH

<400> 140

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn Cys Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Arg Arg Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

325

<210> 141

<211> 328

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CH

<400> 141

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Cys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Arg Arg Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

325

<210> 142

<211> 328

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CH

<400> 142

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Cys Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Arg Arg Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

325

<210> 143

<211> 328

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CH

<400> 143

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Cys Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Arg Arg Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

325

<210> 144

<211> 328

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CH

<400> 144

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Cys Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Arg Arg Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

325

<210> 145

<211> 328

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CH

<400> 145

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Cys Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Arg Arg Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

325

<210> 146

<211> 328

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CH

<400> 146

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Cys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Arg Arg Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

325

<210> 147

<211> 328

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CH

<400> 147

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Cys Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Arg Arg Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

325

<210> 148

<211> 328

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CH

<400> 148

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Cys Lys

85 90 95

Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Arg Arg Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

325

<210> 149

<211> 328

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CH

<400> 149

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Cys

85 90 95

Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Arg Arg Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

325

<210> 150

<211> 328

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CH

<400> 150

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Cys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Arg Arg Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

325

<210> 151

<211> 328

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CH

<400> 151

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Cys Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Arg Arg Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

325

<210> 152

<211> 328

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CH

<400> 152

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Cys Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Arg Arg Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

325

<210> 153

<211> 328

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CH

<400> 153

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Cys Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Arg Arg Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

325

<210> 154

<211> 328

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CH

<400> 154

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Pro Cys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Arg Arg Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

325

<210> 155

<211> 328

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CH

<400> 155

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Pro Lys Cys Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Arg Arg Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

325

<210> 156

<211> 107

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> VL

<400> 156

Asp Ile Gln Met Cys Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 157

<211> 107

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> VL

<400> 157

Asp Ile Gln Met Thr Cys Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 158

<211> 107

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> VL

<400> 158

Asp Ile Gln Met Thr Gln Cys Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 159

<211> 107

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> VL

<400> 159

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Cys Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 160

<211> 107

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> VL

<400> 160

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Cys Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 161

<211> 107

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> VL

<400> 161

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Cys Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 162

<211> 107

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> VL

<400> 162

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Cys Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 163

<211> 107

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> VL

<400> 163

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Cys Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 164

<211> 107

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> VL

<400> 164

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Cys Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 165

<211> 107

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> VL

<400> 165

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Cys Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 166

<211> 107

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> VL

<400> 166

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Cys Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 167

<211> 107

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> VL

<400> 167

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Cys

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 168

<211> 107

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> VL

<400> 168

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Cys Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 169

<211> 107

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> VL

<400> 169

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Cys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 170

<211> 107

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> VL

<400> 170

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Cys Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 171

<211> 107

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> VL

<400> 171

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Cys Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 172

<211> 107

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> VL

<400> 172

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Cys Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 173

<211> 107

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> VL

<400> 173

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Cys Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 174

<211> 107

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> VL

<400> 174

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Cys Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 175

<211> 107

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> VL

<400> 175

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Cys Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 176

<211> 107

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> VL

<400> 176

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Cys Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 177

<211> 107

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> VL

<400> 177

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Cys Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 178

<211> 107

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> VL

<400> 178

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Cys Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 179

<211> 107

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> VL

<400> 179

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Cys Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys