СПОСОБ ДЛИТЕЛЬНОГО ХРАНЕНИЯ МИКОБАКТЕРИЙ ЛЕПРЫ Российский патент 2020 года по МПК C12Q1/04 C12R1/32 

Изобретение относится к медицине, а именно к микробиологии, и может быть, в частности, использовано для длительного хранения микобактерий лепры (Mycobacterium leprae).

Лепра - это хроническое инфекционное заболевание, вызываемое Mycobacterium leprae, кислотоустойчивой облигатной внутриклеточной бактерией. Заболевание остается серьезной проблемой здравоохранения в нескольких развивающихся странах, и каждый год в мире регистрируются до 200000 новых случаев заболевания. М. leprae поражает главным образом кожу, слизистую оболочку носа и периферические нервы. Несмотря на многочисленные попытки вырастить Mycobacterium leprae in vitro до сих пор этого сделать не удалось. Отсутствие методов культивирования М. leprae чрезвычайно затрудняет изучение биологических свойств этих бактерий, а также решение многих проблем практической лепрологии, таких как: разработка диагностикумов, получение профилактической вакцины, скрининг новых лекарственных препаратов, определение лекарственной чувствительности и другие.

При попытках изучения традиционными методами биохимических свойств М. leprae, выделенных из инфицированных тканей человека, исследователи сталкивались с проблемой не только недостаточного количества изучаемого материала, но и способов длительного сохранения этого материала для возможностей дальнейшего изучения.

Лабораторные животные (мыши, крысы, броненосцы), в организме которых размножаются М. leprae, выделенные из пораженных тканей больных лепрой людей, до настоящего времени являются единственным источником бактериальной массы, используемой в лепрологии для научных и практических целей. Возможность длительного сохранения этой бактериальной массы позволяет в какой-то степени стандартизировать определенный штамм для дальнейшего пассажа на животных, что важно, например, при изучении чувствительности к противолепрозным препаратам.

Из практики медицины известен способ хранения М. leprae при комнатной температуре в 40% растворе глицерина. При данном способе хранения навеску ткани (лепрома от больного лепрой; лапа мыши, зараженной интраплантарно), содержащую М. leprae, помещали в 40% раствор глицерина. Способ позволяет хранить М. leprae в течение 10-12 лет. (Ющенко А.А. Новые данные о биологии Mycobacterium leprae // Актуальные вопросы лепрологии. Астрахань. 1984. - с. 3-7). Недостатком способа является использование в качестве консерванта глицерина, в результате чего изменяются биологические свойства М. leprae, что проявляется сокращением сроков их размножения при последующих пассажах на мышах.

Известен способ хранения М. leprae при температуре -80°С (Prabhakaran K., Harris Е.В., Kirshheimer W.K. Survival of Mycobacterium leprae in tissues kept frozen at - 80°C. // Microbios Letters. 1976. - Vol. 1. - P. 193-195; Curtiss R., Blower S., Cooper et al. Leprosy research in the post-genome era // Leprosy Review. 2001. - Vol. 72, №1. - P 8-22;). Недостатком способа является необходимость использования дорогостоящего холодильного оборудования - низкотемпературных морозильных камер. Кроме того, жизнеспособность микобактерий лепры, замороженных при -80°С и затем подвергнутых оттаиванию, значительно снижалась, судя по результатам роста в подушечке лапы мыши и их метаболической активности. Отмеченные недостатки не дают возможность получить конкретный технический результат - упрощение способа.

Наиболее близким способом к предлагаемому является способ хранения M.leprae, заключающийся в том, что материал, содержащий М. leprae (ткань лепромы от больного лепрой, или лапа мыши, зараженной интраплантарно), подвергают охлаждению при температуре -18°С. (Патент №2360959 Способ хранения микобактерий лепры / М.Ю. Юшин, Н.Г. Урляпова, В.В. Анохина, О.В. Калянина - // Изобретения. - 2009. - №19.). Недостатком способа является необходимость использования холодильного оборудования.

В патентной и научной литературе другие данные о способах хранения М. leprae отсутствуют.

Предлагаемое изобретение решает основную задачу - упрощение способа хранения М. leprae.

Предлагаемый способ подготовки микобактерий лепры к длительному хранению путем приготовления суспензии из инфицированного материала- лепромы больного лепрой, подушечек лапы мыши, зараженной Mycobacterium leprae интраплантарно, центрифугирования суспензии при 1000 об/мин с отбором надосадочной жидкости, содержащей микобактерии лепры, высушивание ее в стерильных условиях при температуре от 22 до 25°С в течение 1 суток с последующим хранением при той же температуре

Предлагаемый способ по сравнению с прототипом дает возможность хранить инфицированный материал, содержащий М. leprae, без использования холодильного оборудования при комнатной температуре, что позволяет получить положительный эффект в виде упрощения способа.

Предлагаемый способ прошел успешную апробацию в ФГБУ «НИИЛ» Минздрава России в 2017-2019 гг.

Ниже приводятся результаты апробации способа.

Пример 1.

Мыши линии СВА массой 18-25 г были заражены интраплантарно М. leprae, пассируемыми на мышах (IV пассаж), первично выделенными от больной К-ой (диагноз: лепра, погранично-лепроматозная форма), в дозе 1×10⁴ микробных тел на мышь. Материал хранили в высушенном состоянии при температуре от 22°С до 25°С в течение 4-х, 6-ти, 30-ти и 90 суток. У мышей (12 животных), зараженных М. leprae, хранившимися в высушенном состоянии в течение 4-х суток наблюдалась следующая динамика размножения микобактерий в месте инокуляции: через 8 месяцев после заражения число М. leprae в лапах увеличилось до 5,6±1,8×10⁷ (n=6), а к 12-ти месяцам составило 3,2±1,8×10⁶ (n=6). У мышей (10 животных), зараженных М. leprae, хранившимися в высушенном состоянии в течение 6 суток, через 8 месяцев после заражения число М. leprae в лапах составило 1,7±7,6×10⁶ (n=5), а к 10 месяцам увеличилось до 4,59±3,54×10⁸ (n=5). У мышей (12 животных), зараженных М. leprae, хранившимися в высушенном состоянии в течение 30 суток, через 8 месяцев после заражения число М. leprae в лапах составило 7,62±3,66×10⁷ (n=4), а к 10-ти месяцам увеличилось до 1,87±1,09×10⁸ (n=8). У мышей (7 животных), зараженных М. leprae, хранившимися в высушенном состоянии в течение 90 суток, через 6 месяцев после заражения число М. leprae в лапах составило 1,51±1,0×10⁶ (n=6), а к 11-ти месяцам увеличилось до 3,71×10⁶ (одно животное).

В контрольной группе мышей (17 животных), зараженных М. leprae, не подвергавшимися какому-либо воздействию, наблюдалась следующая динамика размножения микобактерий в месте инокуляции: через 8 месяцев после заражения число М. leprae в лапах составило 7,48±,46×10⁸ (n=9), а через 12 месяцев - 1,45±1,43×10⁸ (n=8).

Таким образом, у всех экспериментальных животных (в 100% случаев) получено интенсивное размножение М. leprae в месте инокуляции после их длительного хранения в высушенном состоянии при температуре от 22°С до 25°С.

Пример 2.

Мыши линии СВА массой 18-25 г были заражены интраплантарно М. leprae, пассируемыми на мышах (VII пассаж), первично выделенными от больного К-ва (диагноз: лепра, лепроматозный тип), в дозе 1×10⁴ микробных тел на мышь. Материал хранили в высушенном состоянии при температуре от 22°С до 25°С в течение 14-ти суток и 13-ти месяцев. У мышей (14 животных), зараженных М. leprae, хранившимися в высушенном состоянии в течение 14-ти суток, наблюдалась следующая динамика размножения микобактерий в месте инокуляции: через 5 месяцев после заражения число М. leprae составило 2,6×10⁵ (одно животное), через 10 месяцев - 6,97±4,31×10⁸ (n=5), а к 18 месяцам - 2,43±1,36×10⁸ (n=8). У мышей (30 животных), зараженных М. leprae, хранившимися в высушенном состоянии в течение 13 месяцев наблюдалась следующая динамика размножения микобактерий в месте инокуляции: через 3,5 месяца после заражения число М. leprae составило 4,8×10⁶ (одно животное), через 9 месяцев - 2,98±2,2×10⁷ (n=6), через 12 месяцев - 1,49±0,53×10⁵ (n=7), через 16 месяцев - 1,5±0,9×10⁶ (n=10), а к 20-ти месяцам - 2,18±1,73×10⁶ (n=6).

В контрольной группе мышей (13 животных), зараженных М. leprae, не подвергавшимися какому-либо воздействию, наблюдалась следующая динамика размножения микобактерий в месте инокуляции: через 6 месяцев после заражения число М. leprae в лапах составило 2,94±0,97×10⁸ (n=6), а через 12 месяцев - 1,09±0,35××10⁹ (n=7).

Таким образом, у всех экспериментальных животных (в 100% случаев) получено интенсивное размножение М. leprae в месте инокуляции после их длительного хранения в высушенном состоянии при температуре от 22°С до 25°С.

Пример 3.

Мыши линии СВА массой 18-25 г были заражены интраплантарно М. leprae, пассируемыми на мышах (XIII пассаж), первично выделенными от больной М-вой (диагноз: лепра, лепроматозный тип), в дозе 1×10⁴ микробных тел на мышь. Материал хранили при в высушенном состоянии при температуре от 22°С до 25°С в течение 6-ти и 13-ти месяцев. У мышей (26 животных), зараженных М. leprae, хранившимися в высушенном состоянии в течение 6-ти месяцев, наблюдалась следующая динамика размножения микобактерий в месте инокуляции: через 4 месяца после заражения число М. leprae составило 8,0±3,4×10⁶ (n=6), через 10 месяцев - 9,3±5,5×10⁵ (n=6), через 15 месяцев - 5,04±2,61×10⁷ (n=8), а к 17-ти месяцам - 1,76±1,74×10⁷ (n=6). У мышей (26 животных), зараженных М. leprae, хранившимися в высушенном состоянии в течение 13-ти месяцев, наблюдалась следующая динамика размножения микобактерий в месте инокуляции: через 12 месяцев после заражения число М. leprae составило 1,16±1,12×10⁷ (n=8), через 16 месяцев - 4,77±4,05×10⁶ (n=8), а к 20-ти месяцам - 2,87±2,67×10⁸ (n=10).

В контрольной группе мышей (16 животных), зараженных М. leprae, не подвергавшимися какому-либо воздействию, наблюдалась следующая динамика размножения микобактерий в месте инокуляции: через 6 месяцев после заражения число М. leprae в лапах составило 3,58±2,79×10⁸ (n=4), через 9 месяцев - 2,13±0,95××10⁹ (n=5), а через 12 месяцев - 7,73±2,67×10⁸ (n=7).

Таким образом, у всех экспериментальных животных (в 100% случаев) получено интенсивное размножение М. leprae в месте инокуляции после их длительного хранения в высушенном состоянии при температуре от 22°С до 25°С.

Предлагаемый способ позволяет осуществлять забор, хранение и транспортировку материала, содержащего микобактерий лепры, без использования морозильных камер с целью его дальнейшего исследования непосредственно в научно-исследовательских учреждениях, в том числе и противолепрозных.

Предлагаемым способом достигается упрощение способа хранения М. leprae по сравнению с прототипом, которое заключается в уменьшении затрат, связанных с необходимостью использования морозильных камер.

Таким образом, авторами предложен новый, никем ранее не предлагаемый способ длительного хранения М. leprae, который может быть рекомендован для использования в научных и клинических лабораториях.

Изобретение относится к медицине и к микробиологии и может быть использовано для длительного хранения микобактерий лепры - Mycobacterium leprae. Способ предусматривает приготовление суспензии Mycobacterium lepraе из инфицированного материала - лепромы больных лепрой, лап мышей, зараженных интраплантарно. Затем осуществляют центрифугирование суспензии микобактерий лепры, подлежащих хранению, при 1000 об/мин и высушивают в стерильных условиях при температуре от 22°С до 25°С в течение 1 суток с последующим хранением в тех же условиях. Изобретение позволяет обеспечить длительное хранение микобактерий лепры и упростить его. 3 пр.

Способ подготовки микобактерий лепры к длительному хранению путем приготовления суспензии из инфицированного материала - лепромы больных лепрой, подушечек лапы мыши, зараженной Mycobacterium leprae интраплантарно, центрифугирования суспензии при 1000 об/мин с отбором надосадочной жидкости, содержащей микобактерии лепры, высушивания её в стерильных условиях при температуре от 22°С до 25°С в течение 1 суток с последующим хранением при той же температуре.