СПОСОБ ХРАНЕНИЯ МИКОБАКТЕРИЙ ЛЕПРЫ Российский патент 2009 года по МПК C12N1/04 C12R1/32 

Изобретение относится к медицине, а именно к лепрологии, и может быть, в частности, использовано для длительного хранения М.leprae.

Из практики медицины известен способ хранения М.leprae при комнатной температуре в 40% растворе глицерина. При данном методе хранения навеску ткани (лепрома человека, больного лепрой; лапа мыши, зараженной интраплантарно), содержащую М. leprae, помещали в 40% раствор глицерина. Способ позволяет хранить М.leprae в течение 10-12 лет (Ющенко А.А. Новые данные о биологии Mycobacterium leprae // Актуальные вопросы лепрологии. Астрахань. 1984. - с.3-7.). Недостатком способа является использование в качестве консерванта глицерина, в результате чего изменяются биологические свойства М. leprae, что проявляется сокращением сроков их размножения при последуюющих пассажах на мышех. Т.о., отмеченный недостаток не дает возможность получить конкретный технический результат - упрощение способа.

Известен способ хранения М. leprae при температуре -80°С (Curtiss R., Blower S., Cooper et al. Leprosy research in the post-genome era // Leprosy Review. 2001. - Vol.72, №1. - P 8-22). Недостатком способа является необходимость использования дорогостоящего холодильного оборудования - низкотемпературных морозильных камер. Кроме того, жизнеспособность микобактерий лепры, замороженных при -80°С и затем подвергнутых оттаиванию, значительно снижалась судя по результатам роста в подушечке лапы мыши и их метаболической активности. Отмеченные недостатки не дают возможность получить конкретный технический результат - упрощение способа.

Наиболее близким способом к предлагаемому является способ хранения М.leprae, заключающийся в том, что органы броненосцев, экспериментально зараженных М.leprae, хранили при температуре -80°С. Данный способ позволяет хранить М.leprae до 19 месяцев. (Prabhakaran К., Harris Е.В., Kirshheimer W.K. Survival of Mycobacterium leprae in tissues kept frozen at -80°C. // Microbios Letters. 1976. - Vol.1. - P.193-195. Недостатком способа является необходимость использования дорогостоящего оборудования - низкотемпературных морозильных камер. Т.о., отмеченный недостаток не позволяет получить конкретный технический результат - упрощение способа.

В патентной и научной литературе другие данные о способах хранения микобактерий лепры отсутствуют.

Предлагаемое изобретение решает основную задачу - упрощение способа. Сущность изобретения выражена совокупностью существенных признаков, достаточных для обеспечиваемого изобретением технического результата.

Решение поставленной задачи предлагаемым способом состоит в том, что хранящийся материал подвергают охлаждению при температуре -18°С.

Упрощение предлагаемого способа по сравнению с прототипом дает возможность хранить инфицированный материал, содержащий микобактерий лепры, без использования дорогостоящего холодильного оборудования, т.е. использовать бытовые морозильные камеры.

Проведенный анализ патентной и научной литературы показал, что предлагаемый способ хранения М.leprae ранее не применялся.

Отсутствие воспроизводимых способов культивирования М.leprae на искусственных питательных средах создает определенные трудности как для изучения биологии возбудителя лепры, так и для создания различных биологических препаратов на основе М.leprae. Лабораторные животные (мыши, крысы, броненосцы), в организме которых размножаются М.leprae, выделенные из пораженных тканей больных лепрой людей, до настоящего времени являются единственным источником бактериальной массы, используемой в лепрологии для научных и практических целей. В частности, изучение чувствительности к противолепрозным препаратам производится на мышах, зараженных в подушечку лапки (Shepard С.С.The experimental disease that follows the infection of human leprosy bacilli into footpads of mice // J. Exp.Med., 1960. - V.36. - P.445-454.). Пассирование на животных изменяет некоторые свойства M.leprae, поскольку во время пассирования происходит адаптация возбудителя к организму животного. Т.о., если производятся исследования с использованием M.leprae, выделенных от конкретного больного, в таком случае при длительных экспериментах работа производится на различных пассажах. Например, работы начаты с использованием I пассажа, а завершены уже с использованием III пассажа. Если возникает необходимость для исследований использовать определенный пассаж, например III, в таком случае будут использованы M.leprae от разных больных, т.е. разные штаммы M.leprae.

Предлагаемый нами способ позволяет длительно хранить M.leprae, что дает возможность использовать определенный штамм и определенный пассаж для исследования. Т.о. появляется возможность до некоторой степени стандартизировать источник получения различных биологических препаратов (в частности, антигенов для производства диагностических тест-систем).

Хранение M.leprae при температуре -18°С (в бытовом морозильнике) является существенным отличием предлагаемого способа хранения и именно это отличие позволило получить положительный эффект в виде упрощения способа. Предлагаемый способ позволяет отказаться от использования низкотемпературных морозильных камер для хранения M.leprae.

Предлагаемый способ хранения микобактерий лепры осуществляется следующим образом: ткань лепромы человека, больного лепрой, или лапа мыши, зараженной интраплантарно, помещается в стерильный пластиковый контейнер (бакпечатка одноразового применения) и хранится при температуре -18°С. Материал хранили от 3 до 12 месяцев (время наблюдения). При необходимости использования ткань размораживали и готовили суспензию для заражения животных.

Предлагаемый способ прошел успешную апробацию в ФГУ «НИИ по изучению лепры Росздрава» в 1997-2007 гг.

Ниже приводятся результаты апробации способа.

Пример 1.

Мыши линии BALB/C были заражены интраплантарно М.leprae, пассируемыми на мышах (IV пассаж), выделенными от больного К., в дозе 1×10⁴ микробных тел на мышь. Материал хранили при температуре -18°С в течение 12 месяцев. Через 7 месяцев после заражения животных в месте инокуляции количество М.leprae составило 2,9×10⁵+0,91, а через 12 месяцев после заражения достигло 3,68×10⁵+0,59.

Таким образом, получено интенсивное размножение М.leprae в месте инокуляции после длительного хранения при температуре -18°С.

Пример 2.

Мыши линии СВА были заражены интраплантарно М.leprae, пассируемыми на мышах (V пассаж), выделенными от больного К., в дозе 1×10⁴ микробных тел на мышь. Материал хранили при температуре -18°С в течение 4 месяцев. Через 8 месяцев после заражения животных в месте инокуляции количество M.leprae составило 4,1×10⁶+1,7.

Таким образом, получено интенсивное размножение M.leprae в месте инокуляции после длительного хранения при температуре -18°С.

Пример 3.

Мыши линии СВА были заражены интраплантарно M.leprae, пассируемыми на мышах (IX пассаж), выделенными от больного Н., в дозе 1×10⁴ микробных тел на мышь. Материал хранили при температуре -18°С в течение 4 месяцев. Через 8 месяцев после заражения животных в месте инокуляции количество M.leprae составило 1,1×10⁸+0,07.

Таким образом, получено интенсивное размножение M.leprae в месте инокуляции после длительного хранения при температуре -18°С.

Предлагаемый способ позволяет осуществлять забор и хранение материала, содержащего микобактерий лепры с целью его дальнейшего исследования непосредственно в периферийных противолепрозных учреждениях, которые не оснащены специальным научным оборудованием, в частности низкотемпературными морозильными камерами.

Предлагаемым способом достигается упрощение хранения M.leprae по сравнению с прототипом, которое заключается в уменьшении затрат, связанных с необходимостью использования низкотемпературных (-80°С) морозильных камер.

Таким образом, авторами предложен новый, никем ранее не предлагаемый способ хранения M.leprae. Предлагаемый способ может быть рекомендован для использования в научных и клинических лабораториях противолепрозных учреждений системы здравоохранения.

Изобретение относится к микробиологии. Описан способ хранения микобактерий лепры, заключающийся в воздействии низких температур на инфицированный материал. Хранящийся материал подвергается охлаждению при температуре -18°С, что позволяет использовать бытовые морозильные камеры. Изобретение позволяет упростить способ хранения M.leprae.

Способ хранения микобактерий лепры, состоящий в воздействии низких температур на инфицированный материал, содержащий микобактерии лепры, отличающийся тем, что хранящийся материал подвергают охлаждению при температуре -18°С.