Ссылка на другие родственные заявки
Настоящая заявка связана с предварительной заявкой на выдачу патента США с серийным №61/910200, поданной 29 ноября 2013 года, содержание которой включено в настоящий документ во всей ее полноте посредством ссылки, и в отношении нее испрашивается приоритет по указанной предварительной заявке.
Область техники
Аспекты настоящего раскрытия относятся к устройству, системам, машиночитаемым носителям, изделиям и способам для отбора антитела, обладающего одним или несколькими свойствами, особенно желательными для терапевтического средства, и для получения антитела или терапевтического средства, содержащего антитело.
Уровень техники
Моноклональные антитела («моноклональное Ат» или «мАт») продолжают оставаться важным классом терапевтических средств для лечения целого ряда заболеваний, включая злокачественные опухоли, аутоиммунные нарушения и инфекции. Для легкости применения, удобства для пациентов и менее частого введения предпочтительно, чтобы был разработан водный раствор фармацевтического препарата, который бы обладал стабильностью на протяжении срока хранения (как правило, 2 года), и чтобы терапевтическое мАт само по себе имело нормальный клиренс и период полужизни в плазме крови (как правило, 3 недели).
Что касается терапии на основе мАт, предназначенной для лечения определенных хронических заболеваний, например, ревматоидного артрита, можно использовать доставку посредством подкожного введения с использованием устройства, такого как предварительно наполненный шприц/шприц-ручка, для применения пациентом в домашних условиях/самостоятельного введения и соблюдения режима терапии (см., например, Eisenstein, М. Something new under the skin. Nat Biotech 29, 107-109 (2011)). Для применения в домашних условиях в устройстве коммерчески доступны несколько продуктов на основе мАт, например, Humira®, производимые Abbott, и Simponi®, производимые Centocor, и т.д., и некоторые продукты в настоящее время оцениваются в клинических испытаниях. Для доставки нескольких сотен миллиграмм действующего вещества в небольшом объеме (~1 мл) с использованием устройства требуется жидкий препарат, содержащий высокие концентрации мАт (см., например, Eisenstein, М. Something new under the skin. Nat Biotech 29, 107-109 (2011); Shire, S.J., Shahrokh, Z. & Liu, J. Challenges in the development of high protein concentration formulations. Journal of Pharmaceutical Sciences 93, 1390-1402 (2004)). Такие системы доставки требуют, чтобы раствор имел низкую вязкость, потому что растворы с более высокой вязкостью трудно готовить и вводить, и их введение может быть болезненным, что связано с необходимостью использовать иглу большего калибра и большее прилагаемое усилие (см., например, Shire, S.J., Shahrokh, Z. & Liu, J. Challenges in the development of high protein concentration formulations. Journal of Pharmaceutical Sciences 93, 1390-1402 (2004)). Кроме того, для достижения достаточной продолжительности срока хранения необходимо, чтобы антитело оставалось стабильным (минимальная химическая или физическая деградация) в растворе без потери эффективности с сохранением безопасности. В дополнение к этому, во избежание необходимости введения одной дозы посредством многократных инъекций или более частого введения низких доз при необходимости использования подкожных инъекций, было бы целесообразно разработать мАт-кандидат, характеризующееся достаточной биодоступностью и нормальным клиренсом, связанным с продолжительным периодом полувыведения из плазмы крови (см., например, Wang, W., Wang, W., Wang, E.Q. & Balthasar, J.P. Monoclonal Antibody Pharmacokinetics and Pharmacodynamics. Clin Pharmacol Ther 84, 548-558 (2008); Zheng, Y. et al. Minipig as a potential translatable model for monoclonal antibody pharmacokinetics after intravenous and subcutaneous administration. mAbs 4, 243-255; см. также Chennamsetty, N., Voynov, V., Kayser, V., Helk, B. & Trout, B.L. Design of therapeutic proteins with enhanced stability. Proceedings of the National Academy of Sciences 106, 11937-11942 (2009)). Таким образом, существует потребность в способе или устройстве, которые бы способствовали прогнозированию желательных свойств Ат.
Сущность изобретения
В настоящем документе представлены аспекты и варианты осуществления, которые относятся к новому устройству и способам, что способствуют отбору и производству антител. Были исследованы вязкость растворов мАт при определенных концентрациях, скорость клиренса in vivo, как, например, у яванского макака (Cyno), окисление триптофана (Trp) и изомеризация аспарагиновой кислоты (Asp) в качестве типичных свойств мАт, важных для оптимизации производства, разработки, способности проходить через иглу при введении, срока хранения и фармакокинетического поведения и, таким образом, для обеспечения доставки лекарственного средства, эффективности и удобства для использования пациентом. В настоящем документе показано, что с использованием структурных параметров, установленных согласно настоящему изобретению, и посредством моделирования методом молекулярной динамики (МД), можно сравнительно точно прогнозировать желательные свойства мАт и относящиеся к категории риска мАт-кандидаты для окончательного отбора.
В настоящем документе описано, что для различия мАт, имеющих разные профили вязкости-концентрации, мАт, характеризующихся значениями нормального и быстрого клиренса, и мАт, обладающих желательной и нежелательной стабильностью, как, например, в отношении степени окисления Trp и изомеризации Asp, достаточно информации о свойствах, определяемых по аминокислотной последовательности Ат («свойства, определяемые на основе анализа последовательности», «свойства, определяемые на основе последовательности», «структурные параметры» или «структурные параметры, определяемые на основе последовательности»), таких как заряд, зарядовая асимметрия и гидрофобность, наряду со средствами многомерного анализа. Тогда как межмолекулярные и внутримолекулярные взаимодействия, определяющие вязкость, клиренс и стабильность, предполагают наличие трехмерной структуры и связанной с ней динамики, неожиданным результатом настоящей работы является то, что структурные параметры, определяемые на основе последовательности, описанные в настоящем документе, в достаточной мере позволяют определить или прогнозировать свойства Ат, такие как вязкость, скорость клиренса и стабильность. В дополнение к этому, неожиданным результатом настоящей работы является то, что структурные параметры, определяемые на основе последовательности, в достаточной мере позволяют предсказать или отличить свойства одного Ат от многих других Ат, особенно Ат, находящихся в составе одного и того же класса.
Что касается сайт-специфических свойств, таких как степень окисления Trp или изомеризация Asp, важную роль, по-видимому, играют локальная динамика и конформационные свойства; таким образом, может понадобиться МД-анализ структурных свойств. Включение вычислительных средств in-silico, используемых для структурного моделирования с помощью МД, может обеспечить скрининг большего числа кандидатов с минимальными затратами времени и ресурсов по сравнению с эмпирическими и другими экспериментальными подходами и, таким образом, увеличить эффективность отбора антител-кандидатов. В настоящем изобретении показано, что посредством тщательного анализа молекулярных движений с использованием моделирования методом МД и посредством определения соответствующих структурных свойств можно различить реакционноспособные и нереакционноспособные участки, влияющие на срок хранения Ат-содержащего терапевтического средства. В зависимости от механизма реакции, может потребоваться оценка различных наборов параметров. Например, в случае окисления Trp определения усредненной по времени площади поверхности остатка Trp (боковая цепь), доступной растворителю (SASA), было достаточно для различия реакционноспособных и нереакционноспособных участков; однако понадобились дополнительные структурные параметры наряду с многофакторным анализом для различия сайтов изомеризации Asp. В настоящем изобретении показано, что можно осуществить структурный анализ in-silico на основе последовательности мАт для отбора ведущих кандидатов со свойствами, желательными для разработки. Эта возможность может обеспечить повышение вероятности технического успеха для эффективного продвижения новых терапевтических средств на основе мАт в клиническую практику и в конечном итоге для оказания помощи пациентам.
Согласно дополнительным аспектам настоящее изобретение также относится к отобранным, полученным антителам и/или антителам, которые, как было установлено, удовлетворяют заданному критерию, с помощью способов, описанных в настоящем документе.
Краткое описание чертежей
На фиг. 1А и В представлены таблицы с параметрами для регрессионного анализа методом главных компонент для предсказания вязкости, исходя из результатов, полученных для 10 мАт при высокой ионной силе раствора (ИС) (фиг. 1А) и 10 частично перекрывающихся мАт при низкой ИС (фиг. 1В).
На фиг. 2 представлена таблица со значениями клиренса у яванского макака и рассчитанными структурными параметрами, определенными на основе последовательности, для пробного набора из 13 мАт. Штриховка в столбцах таблицы с названием сум. HI, заряд Fv при рН 5,5 и клиренс соответствуют диапазонам, приведенным в столбцах таблицы фиг. 3 с названием сум. HI, заряд и клиренс, соответственно. Штриховка с наклоном косых линий вправо, соответствующая данным, введенным в таблицу на фиг. 2, обозначает, что значения этих данных находятся в диапазоне значений, приведенном в верхней строке на фиг. 3. Штриховка с наклоном косых линий влево, соответствующая данным, введенным в таблицу на фиг. 2, обозначает, значение этих данных находится в диапазоне значений, приведенном в верхней строке на фиг. 3.
На фиг. 3 представлена таблица с заданными параметрами на основе пробного набора из 13 мАт, которые показаны на фиг. 2, для различия быстрого клиренса и нормального клиренса у яванского макака.
На фиг. 4 представлена таблица с заданными параметрами для экспериментального и прогнозируемого клиренса, исследованного на наборе из 45 мАт, на основе показателей, перечисленных на фиг. 3, причем столбец со значениями CI таблицы, приведенной на фиг. 4, соответствует столбцу со значениями клиренса таблицы, приведенной на фиг. 2, и штриховка на фиг. 4 означает то же, что и на фиг. 2, и распространяется на столбцы приведенной на фиг. 4 таблицы с экспериментальным и прогнозируемым параметрами.
На фиг. 5 представлена таблица с данными по предсказанию «горячей точки» для окисления Trp с использованием SASA боковой цепи Trp для остатков Trp с различными номерами (номер остатка), расположенных вдоль тяжелой цепи (НС) или легкой цепи (LC), в пробном наборе из 13 мАт. (в отношении других названий заголовков таблицы см. подробное описание ниже). Штриховка с наклоном косых линий вправо, соответствующая данным, введенным в таблицу, обозначает, что значение указанных введенных данных находится в пределах желаемого диапазона. Штриховка с наклоном косых линий влево, соответствующая данным, введенным в таблицу, обозначает, что значение указанных введенных данных находится в пределах желаемого диапазона.
На фиг. 6 представлена таблица с молекулярными свойствами некоторых мАт пробного набора, определенными на основе моделирования методом МД различных положений «n» остатков Asp вдоль НС и LC (приведены в столбце таблице с заголовком Asp) и положения остатка при n+1 (приведены в столбце таблицы с заголовком остаток (N+1) в последовательности). Указанные свойства включают SASA Asp (SASA_Asp), среднеквадратические флуктуации α-углерода остатка аспарагина (RMSF), SASA остатка при n+1 (SASA(N+1,N)) и измеренное, и прогнозируемое значение, округленное до одной значащей цифры (двоичной). (В отношении других названий заголовков таблицы см. подробное описание ниже). Штриховка с наклоном косых линий вправо, соответствующая данным, введенным в таблицу, обозначает, что значение указанных введенных данных находится в пределах желаемого диапазона. Штриховка с наклоном косых линий влево, соответствующая данным, введенным в таблицу, обозначает, что значение указанных введенных данных находится в пределах желаемого диапазона.
На фиг. 7 показаны профили вязкости-концентрации нескольких мАт в буферном растворе высокой ионной силы (200 мМ Аргинин НСl) при рН 5,5. Каждый набор уникально сформированных точек данных представляет собой экспериментальные данные, соответствующие конкретному мАт. Линии графика профиля были построены с использованием уравнения в форме у=а+bесх, где на оси y представлены значения вязкости (в сантипуаз, сП) и на оси x представлена концентрация белка (в мг/мл).
На фиг. 8А-8С показан анализ параметров, определенных на основе последовательности, для нескольких мАт, рассчитанных, как описано ниже в разделе Примеры: на фиг. 8А представлен заряд Fv при рН 5,5; фиг. 8В представлен параметр зарядовой асимметрии Fv (FvCAP) при рН 5,5; на фиг. 8С представлены значения гидрофобности (или показатель гидрофобности, HI). Заряд был рассчитан с использованием последовательности полноразмерного вариабельного фрагмента (Fv), что касается фиг. 8А, и с использованием последовательности вариабельного домена тяжелой цепи (VH) и вариабельного домена легкой цепи (VL) для расчета FvCAP, что касается фиг. 8В. HI был рассчитан с использованием аминокислотного состава участков, определяющих комплементарность, (CDR), что касается фиг. 8С.
На фиг. 9А-9С показаны графики корреляции log вязкости с рассчитанными структурными параметрами, определенными на основе последовательности: на фиг. 9А указанный параметр представляет собой гидрофобность; на фиг. 9В - заряд Fv при рН 5,5; и на фиг. 9С - FvCAP при рН 5,5. Значения вязкости были получены в буферных растворах низкой ионной силы при концентрации буфера 20 мМ при рН 5,5.
На фиг. 10А-10С показаны графики корреляции log вязкости с рассчитанными структурными параметрами, определенными на основе последовательности: на фиг. 10А указанный параметр представляет собой гидрофобность; на фиг. 10В - заряд Fv при рН 5,5; и на фиг. 10С - FvCAP при рН 5,5. Значения вязкости были получены в буферных растворах высокой ионной силы при концентрации буфера, содержащего аргинин НСl, 200 мМ при рН 5,5.
На фиг. 11А-Е показаны графики с данными регрессионного анализа методом главных компонент, на которых показана зависимость прогнозируемых значений вязкости от экспериментально наблюдаемых значений вязкости для разных мАт в различных условиях: на фиг. 11A, 11В и 11Е показаны результаты PCR-анализа наборов из 10 разных мАт. На фиг. 11С и 11D показаны результаты PCR-анализа наборов из 14 разных мАт. Результаты, показанные на фиг. 11А, 11В, 11С и 11D, были получены в условиях высокой ионной силы раствора. Результаты, показанные на фиг. 11Е, были получены в условиях буфера низкой ионной силы раствора. На фиг. 11А и 11Е показаны графики при концентрации мАт 150 мг/мл. На фиг. 11В, 11С и 11D показан графики при концентрации мАт 180 мг/мл. Прогнозируемые значения вязкости являются выходными значениями, полученными из анализа PCR, и описываются уравнением, описанным ниже в разделе Примеры, для 150 мг/мл и для 180 мг/мл мАт. Каждая точка данных соответствует одному мАт, а кривые линии, где приведены, соответствуют 90% доверительным интервалам.
На фиг. 12A-12D показаны прогнозируемые профили вязкости-концентрации четырех мАт (A-D) по сравнению с соответствующими экспериментальными данными. Точки данных представляют экспериментально определенные значения вязкости в буферных растворах высокой ионной силы (20 мМ буферном растворе при рН 5,5 с 200 мМ аргинина НСl). Указанные линии представляют оптимальную аппроксимацию прогнозируемых значений. Прогнозируемые значения были получены с использованием уравнения, которое описано в разделе Примеры для концентраций мАт 150 мг/мл и 180 мг/мл. Указанные линии были получены с использованием уравнения в форме у=а+bесх, где у представляет собой вязкость, и x представляет собой концентрацию белка. Эта форма уравнения была использована для аппроксимации экспериментальных данных до 200 мг/мл для нескольких мАт (данные не показаны) и значений вязкости до 200 сП. Аппроксимирующая кривая была построена с использованием прогнозируемых значений при 150 мг/мл, 180 мг/мл и значения вязкости 1,2 для концентрации белка 25 мг/мл.
На фиг. 13А и 13В показана взаимосвязь между клиренсом антител у яванского макака и рассчитанными параметрами антител: на фиг. 13А показана взаимосвязь между клиренсом антител у яванского макака и рассчитанной изоэлектрической точкой антитела (в логарифмической форме, pI); и на фиг. 13В показана взаимосвязь между клиренсом антител у яванского макака и показателем гидрофобности, рассчитанным с использованием последовательностей CDR H1 мАт.
На фиг. 14А-Е показано сравнение среднего значения и стандартного отклонения для различных свойств, определенных в результате моделирования методом МД, для лабильных (штриховка с наклоном косых линий влево, в левой части каждой фигуры) по сравнению со стабильными остатками Asp (штриховка с наклоном косых линий вправо, в правой части каждой фигуры). Каждый график включает среднее значение и стандартное отклонение. На каждом графике показаны рассчитанные р-значения. По всем параметрам RMSF, Asp SASA и SASA (N+1, N) была продемонстрирована достоверная разница (80% доверительный интервал (CI)) между лабильными и стабильными остатками. Не было выявлено достоверных различий между средними значениями внутриаминокислотной взаимной информации (MI) и свойствами энтропии Шеннона для стабильных остатков и лабильных остатков.
На фиг. 15А-15С показаны результаты сравнений профилей заряд-рН, определенных на основе анализа аминокислотной последовательности и пространственной структуры антигенсвязывающего фрагмента (Fab) трех разных мАт, в зависимости от значения pI Fab: 6,5 (А), как показано на фиг. 15А; (В) 7,5, как показано на фиг. 15В; и (С) 9,2, как показано на фиг. 15С. Профили заряд-рН, определенные на основе анализа последовательности, были рассчитаны, как описано ниже в разделе иллюстративные способы. Профили заряд-рН, определенные на основе анализа последовательности, были рассчитаны с использованием эмпирического метода PROPKA и структур Fab. Отдельные константы ассоциации (в логарифмической форме, pKa) боковой цепи каждой заряженной аминокислоты были получены и использованы в уравнении Хендерсона-Хассельбаха для получения заряда боковой цепи при заданном рН. Заряды были затем суммированы для получения общего зарядов при заданном рН.
На фиг. 15D показано распределение pKa заряженных боковых цепей in Fab, использованных на графике А. На оси у показаны стандартные, не основанные на свойствах структуры значения pKa боковых цепей аминокислот D, Е, Н, Y, K и R (которые также отмечены по оси x с помощью соответствующей вертикальной линии). Каждая точка данных по горизонтальной оси для боковой цепи конкретной аминокислоты соответствует определяемому на основе анализа пространственной структуры значению pK, полученному с использованием PROPKA, для этой аминокислоты. Тогда как на фиг. 15D показано распределение значений pKa, полученных для каждого боковой цепи аминокислоты, общий профиль заряд-рН на основе расчета определяемого на основе анализа пространственной структуры заряда был сопоставим с расчетами на основе последовательности, как показано на фиг. 15А-15С, в силу чего сходство по профилям заряд-рН между последовательностью и структурой не зависело от pI Fab.
На фиг. 16 показано сравнение определяемых на основе последовательности значений показателя гидрофобности (HI) со значениями, рассчитанными, исходя из структуры. Определяемый на основе последовательности HI был рассчитан, как описано ниже в разделе иллюстративные способы, и он основан на соотношении гидрофобных и гидрофильных аминокислот, где значение SASA для каждой аминокислоты взвешено на значение ее гидрофобности по шкале Эйзенберга. Определяемый на основе анализа пространственной структуры показатель гидрофобности рассчитывают аналогичным образом, за исключением того, что в данный расчет включают SASA, определенную, исходя из структурных свойств, для каждой аминокислоты. Указанный показатель определяется как:
HI (структура) = ∑ (SiEi/SjEj),
где i представляет собой гидрофобные аминокислоты, т.е., A, F, I, L, V, W, Y, и j представляет собой гидрофильные аминокислоты, т.е., D, Е, G, Н, K, М, N, Q, R, S, Т. (в отношении ключа для расшифровки однобуквенных сокращений для идентификации аминокислот см. таблицу 1 ниже в тексте).
S представляет собой значение SASA и Е представляет собой значение по шкале Эйзенберга для каждой аминокислоты. Указанный расчет осуществляется для всех аминокислот, присутствующих в конкретной последовательности/структуре. Приемлемую корреляцию получают между определяемым на основе анализа пространственной структуры и на основе последовательности HI (коэффициент корреляции Пирсона = 0,9).
На фиг. 17 показано сравнение определяемых на основе последовательности значений HI, рассчитанных только на основе CDR, со значениями, рассчитанными на основе их соответствующих Fv-доменов, для нескольких мАт исследуемого подкласса/класса IgG1. Значения HI, рассчитанные с использованием CDR, хорошо коррелировали со значениями, полученными с использованием Fv (коэффициент корреляции Пирсона = 0,9).
На фиг. 18 показано иллюстративное устройство, которое можно сконфигурировать в соответствии с принципами настоящего изобретения.
На фиг. 19А и 19В представлена блок-схема иллюстративных процессов в соответствии с принципами настоящего изобретения.
Подробное описание изобретения
Представлены устройство, способы, изделия и соответствующие машиночитаемые носители для определения того, обладает ли антитело одним или несколькими физико-химическими свойствами, которые удовлетворяют одному или нескольким соответствующим заданным критериям. Что касается любого одного или нескольких физико-химических свойств, результаты определения может быть использованы в качестве эмпирической оценки значений физико-химического свойства. Указанная оценка может служить для предсказания значения в отсутствие, до или вместо эмпирического определения. Значения, полученные эмпирическим путем, и результаты предсказаний, и параметры раствора, при которых могут быть осуществлены определения и предсказания, могут быть приблизительными.
Один или несколько критериев могут быть заданы для терапевтического средства, содержащего антитело. Один или несколько критериев могут быть заданы для антитела для любого применения in vitro или in vivo. Один или несколько критериев могут быть заданы для композиции, фармацевтического состава или фармацевтической композиции, содержащей антитело. Определение может представлять собой определение соответствия или пригодности антитела для включения в состав терапевтического средства или для включения в фармацевтический состав или фармацевтическую композицию.
Термин «терапевтическое средство» относится к средству, которое в эффективном количестве оказывает желательный терапевтический эффект на животного, предпочтительно млекопитающего, более предпочтительно примата, наиболее предпочтительно человека. Терапевтическое средство может быть введено в состав фармацевтической композиции, которая может включать более одного вида терапевтических средств.
Терапевтическое средство, содержащее антитело, может быть предназначено для внутривенной инъекции, подкожной инъекции, внутрибрюшинной инъекции или любых других форм введения. Терапевтическое средство может быть использовано в высокой концентрации в небольшом объеме для подкожной инъекции с использованием устройства для дозирования. Для применения терапевтического средства может потребоваться низкая вязкость. Терапевтическое средство может быть разработано для нечастого введения, и может потребоваться продолжительный период полужизни в плазме крови.
Термин «заданный критерий» применимо к терапевтическому средству может обозначать физическое, химическое или физико-химическое целевое свойство, которым должно обладать терапевтическое средство.
Представлены устройство и способы, и соответствующие машиночитаемые носители для отбора антитела для применения в составе терапевтического средства. Машиночитаемые запоминающие устройства могут включать долговременные волны. Машиночитаемые запоминающие устройства могут включать долговременные сигналы. Антитело может быть отобрано из двух или более антител-кандидатов.
Представлены устройство и способы, и соответствующие машиночитаемые носители для получения или получения антитела. Полученное антитело может быть предназначено для применения в составе терапевтического средства. Полученное антитело может быть получено в результате модификации предсуществующего антитела. Предсуществующее антитело может быть модифицировано для получения целевого антитела, которое удовлетворяет одному или нескольким заданным критериям. Параметры могут быть заданы для терапевтического средства.
Устройство может осуществлять одну или несколько стадий способа. Устройство может включать устройство логической обработки информации. Устройство может включать устройство для приема данных. Устройство может включать устройство для передачи данных. Устройство может включать машиночитаемое запоминающее устройство. Два или более устройств могут быть связаны электронными средствами друг с другом.
Устройства могут представлять собой один или несколько устройств долговременной памяти. Устройство долговременной памяти может иметь машиночитаемый программный код, воплощенный в настоящем изобретении. Выполнение машиночитаемого программного кода одним или несколькими процессорами может обеспечивать осуществление компьютерной системой стадий способа.
Указанные стадии могут быть выполнены, чтобы определить пригодность или пригодность антитела для включения в состав терапевтического средства. Указанные стадии могут быть выполнены отбора антитела из нескольких антител-кандидатов. Указанные стадии могут быть выполнены для получения антитела. Указанные стадии могут быть выполнены для модификации предсуществующего антитела. Указанные стадии могут быть выполнены для модификации предсуществующего антитела для получения целевого антитела.
Некоторые или все указанные стадии могут быть выполнены вместе друг с другом на основе одного из физико-химических свойств или комбинации двух, или более физико-химических свойств, для комбинации одной или нескольких из следующих стадий: определения пригодности антитела для включения в состав терапевтического средства; отбора антитела из нескольких антител-кандидатов; получение антитела; модификации предсуществующего антитела для создания целевого антитела; и получения целевого антитела.
Ниже приведено описание физико-химических свойств антитела; информации о структуре антитела; структурных параметров антител; заданных параметров; целевых функций; факторов масштабирования целевой функции; показателей физико-химических свойств; антител; получения антител; устройств логической обработки информации, устройств для передачи данных и устройств для приема данных; и комбинации признаков и принципов настоящего изобретения.
Физико-химические свойства антител
Иллюстративные физико-химические свойства включают вязкость, клиренс, стабильность, лабильность остатка аспарагиновой кислоты и лабильность остатка триптофана.
Физико-химическое свойство может представлять собой вязкость. Физико-химическое свойство может представлять собой скорость фармакокинетического выведения. Физико-химическое свойство может представлять собой лабильность. Лабильность может определять стабильность антитела. Лабильность может определять срок хранения антитела.
Физико-химическое свойство может представлять собой стабильность. Физико-химическое свойство может представлять собой срок хранения. Физико-химическое свойство может представлять собой лабильность остатка аспарагиновой кислоты (Asp). Физико-химическое свойство может представлять собой лабильность остатка триптофана (Trp). Лабильность Asp может определять изомеризацию Asp. Лабильность остатка Trp определяет способность Trp к окислению. Лабильность может влиять на стабильность и срок хранения антитела.
Физико-химическое свойство может зависеть от Параметр раствора. Параметр раствора может представлять собой параметр водного раствора. Параметр раствора может представлять собой температуру. Параметр раствора может представлять собой рН. Параметр раствора может представлять собой ионную силу. Параметр раствора может представлять собой концентрацию антитела. Ионная сила водного раствора антитела может полностью или частично быть задана концентрацией буферного раствора, содержащего антитело. Примером буферного раствора может послужить гистидин-ацетатный буферный раствор. Параметр раствора может включать концентрацию растворенных веществ. Концентрация растворенных веществ может включать концентрацию антитела.
Информация о структуре антитела
Информация о структуре антитела может быть использована для расчета структурных параметров. Способы могут включать расчет структурных параметров, исходя из информации о структуре антител.
Информация о структуре может соответствовать трехмерной структуре. Информация о структуре может соответствовать первичной структуре. Первичная структура может относится к линейной аминокислотной последовательности. Первичная структура может включать первичную структуру вариабельного домена антитела. Первичная структура может представлять собой исключительно первичную структуру вариабельного домена. Первичная структура может включать аминокислотную последовательность вариабельного домена легкой цепи (VL). Первичная структура может включать аминокислотную последовательность вариабельного домена тяжелой цепи (VH). Первичная структура может включать аминокислотные последовательности одного или нескольких CDR. Первичная структура может включать первичную структуру константной области антитела. Первичная структура константной области может включать аминокислотную последовательность константной области легкой цепи (CL). Первичная структура константной области может включать аминокислотную последовательность константной области тяжелой цепи (СН). Первичная структура константной области может включать аминокислотную последовательность одного или нескольких СН1, СН2 и СНЗ константных областей тяжелой цепи.
Структурный параметр может быть рассчитан, исходя из информации о первичной структуре, и может не включать информацию о структурах, отличающихся от первичной структуры. Линейная последовательность может быть установлена на основе последовательности ДНК, полученной путем секвенирования ДНК. Метод секвенирования ДНК хорошо известен в данной области.
Информация о структуре антитела может быть представлена на электронном носителе. Представленная на электронном носителе информация может храниться в машиночитаемом запоминающем устройстве. Устройство логической обработки информации может извлекать информацию о структуре антитела из машиночитаемого запоминающего устройства. Устройство для приема данных моет принимать информацию о структуре антитела. Устройство логической обработки информации может рассчитывать физико-химические параметры, исходя из информации о структуре антител. Устройство для передачи данных может передавать информацию о структуре антитела. Устройство для передачи данных может передавать сигнал, соответствующий результатам расчетов.
Термин «представленная на электронном носителе» относится к форме информации, подходящей для хранения и извлечения из базы электронных данных, и/или для обработки электронным вычислительным устройством.
Структурные параметры антитела
Структурный параметр может представлять собой общий заряд антитела. Структурный параметр может представлять собой зарядовую асимметрию антитела. Структурный параметр может представлять собой гидрофобность антитела. Структурный параметр может быть рассчитан, исходя из информации о структуре антител.
Информация о структуре антитела может включать информацию о первичной структуре антитела, например, аминокислотную последовательность антитела. Аминокислотная последовательность может представлять собой аминокислотную последовательность структурного элемента антитела. Каждый из структурных элементов может представлять собой аминокислотную последовательность. Структурные элементы могут прилегать друг к другу в аминокислотной последовательности антитела. Структурные элементы могут находиться рядом друг с другом в последовательности антитела. Структурные элементы могут быть связаны друг с другом в составе антитела. Структурный элемент может представлять собой вариабельный домен тяжелой цепи (VH) и/или вариабельный домен легкой цепи (VL). Структурный элемент может представлять собой один или несколько участков, определяющих комплементарность, (CDR). Структурный элемент может представлять собой одну или несколько константных областей (например, CH1, CL, СН2 и СН3). Структурный элемент может представлять собой тяжелую цепь и легкую цепь (половина молекулы антитела). Структурный элемент может представлять собой полное антитело. Линейная аминокислотная последовательность может представлять собой аминокислотную последовательность вариабельного домена тяжелой цепи (VH) и/или вариабельного домена легкой цепи (VL). Линейная аминокислотная последовательность может представлять собой аминокислотную последовательность одного или нескольких CDR. Линейная аминокислотная последовательность может представлять собой аминокислотную последовательность одной или нескольких константных областей антитела. Информация о структуре антитела также может включать информацию о вторичной структуре антитела и включать информацию о структурах более высокого порядка, как, например, информацию, что касается молекулярный взаимодействий в трехмерной структуре, которые могут вносить вклад в вязкость, клиренс и стабильность.
Структурные параметры могут включать общий заряд. Общий заряд может представлять собой сумму зарядов всех аминокислот в пределах структурного элемента антитела. Общий заряд может представлять собой сумму зарядов всех аминокислот в пределах структурного элемента антитела при определенном рН. РН может представлять собой рН от рН 4 до рН 9. РН может представлять собой рН 5,5. Структурный элемент может представлять собой VH- и VL-домены. Общий заряд может представлять собой сумму зарядов всех аминокислот в пределах VH- и VL-доменов. Общий заряд может представлять собой сумму зарядов всех аминокислот в пределах одного или нескольких CDR. Общий заряд может представлять собой сумму зарядов всех аминокислот в пределах одной или нескольких константных областей.
Структурные параметры могут включать зарядовую асимметрию. Зарядовая асимметрия может представлять собой произведение общего заряда одного структурного элемента антитела и общего заряда по меньшей мере еще одного структурного элемента антитела. Зарядовая асимметрия может представлять собой произведение общего заряда VH и общего заряда VL антитела. Кроме того, зарядовая асимметрия может представлять собой произведение, например, общего заряда Fv и Fc, или Fv- и СН3-домена, или Fab и Fc, и т.д.
Структурные параметры могут включать гидрофобность. Гидрофобность может включать итоговое значение функций суммирования по значениям гидрофобности одного или нескольких CDR. Каждая функция суммирования может представлять собой соотношение: (1) суммы значений гидрофобности гидрофобных остатков CDR; и (2) суммы значений гидрофобности гидрофильных остатков CDR. Значение гидрофобности для каждого аминокислотного остатка CDR может представлять собой значение гидрофобности по шкале Эйзенберга. В качестве альтернативы, гидрофобность может включать значение гидрофобности Fv.
Структурные параметры могут быть рассчитаны путем использования моделирования методом молекулярной динамики (МД). Моделирование методом МД может соответствовать набору моделируемых параметров раствора. Указанный набор может включать параметры для виртуального раствора. Моделируемые параметры раствора могут включать температуру. Моделирование методом МД может проводиться при постоянной температуре. Моделируемые параметры раствора могут включать виртуальные молекулы воды. При моделировании методом МД может быть использована явно заданная гидратацией. Моделируемые параметры раствора могут включать виртуальное растворенное вещество для поддержания нейтральности раствора.
С помощью моделирования методом МД можно рассчитать среднеквадратичную флуктуацию альфа-углерода (α-углерод) аминокислотного остатка (в положении «N») (RMSF). Аминокислотный остаток может представлять собой остаток в аминокислотной последовательности VH и/или VL. Аминокислотный остаток может представлять собой остаток в аминокислотной последовательности CDR. Аминокислотный остаток может представлять собой остаток в каркасной области (FR). Аминокислотный остаток может представлять собой остаток аспарагиновой кислоты. Аминокислотный остаток может представлять собой остаток триптофана. Аминокислотный остаток может представлять собой любой потенциально лабильный остаток.
Структурные параметры могут включать усредненную по времени SASA аминокислотного остатка. С помощью моделирования методом МД можно рассчитать усредненную по времени SASA остатка. Аминокислотный остаток может представлять собой остаток аспарагиновой кислоты. Аминокислотный остаток может представлять собой остаток триптофана. Аминокислотный остаток может представлять собой аминокислотный остаток, расположенный непосредственно рядом с потенциально лабильным остатком.
Структурные параметры могут включать усредненную по времени SASA атома азота основной цепи, расположенного непосредственно рядом с аминокислотным остатком, который занимает положение N. С помощью моделирования методом МД можно рассчитать усредненную по времени SASA атома азота основной цепи, расположенного непосредственно рядом с остатком в положении N, по аминокислотной последовательности. Аминокислотный остаток в положении N может представлять собой остаток Asp. «Расположенный непосредственно рядом» можно определить, как расположенный рядом по аминокислотной последовательности по направлению либо к аминному концу (N-конец), или либо карбоксильному концу (С-конец) аминокислотной последовательности. Аминокислотный остаток, расположенный непосредственно рядом с указанным остатком при остатке в положении N, может располагаться рядом по аминокислотной последовательности в направлении к С-концу аминокислотной последовательности (т.е., положение «N+1»). Например, если остаток представляет собой остаток аспарагиновой кислоты, занимающий положение «N», то положение «N+1» может представлять собой положение остатка, расположенного непосредственно рядом с остатком аспарагиновой кислоты, по аминокислотной последовательности в направлении к С-концу аминокислотной последовательности. Остаток при «N+1» может представлять собой глицин. Остаток при «N+1» может представлять собой треонин. Остаток при «N+1» может представлять собой аспарагиновую кислоту. Остаток при «N+1» может представлять собой аланин. Остаток при «N+1» может представлять собой любой остаток.
С помощью моделирования методом МД можно рассчитать разные значения структурных параметров для разных параметров раствора.
Заданные критерии
Каждое из физико-химических свойств может иметь соответствующий заданный критерий. Заданный критерий может представлять собой предел, пороговое значение или отсекаемое значение. Как описано ниже, в зависимости от физико-химических свойств и соответствующих целевых функций, если показатель, соответствующий физико-химическому свойству, находится ниже предела, выше предела, не превышает предела или не ниже предела, заданный критерий может считаться удовлетворительным. Согласно определенным конкретным вариантам осуществления показатель, соответствующий физико-химическому свойству, находится ниже предела. В зависимости от физико-химических свойств и целевых функций показатель можно дополнительно преобразовать, например, в бинарное значение, которое является индикатором того, удовлетворяет ли физико-химическое свойство антитела заданному критерию.
Заданный критерий может представлять собой предел вязкости. Заданный критерий может представлять собой предел фармакокинетического параметра - скорости клиренса. Заданный критерий может представлять собой предел лабильности. Заданный критерий может представлять собой предел лабильности остатка аспарагиновой кислоты. Заданный критерий может представлять собой предел лабильности триптофана. Заданный критерий может представлять собой предел стабильности. Заданный критерий может представлять собой предел срока хранения. Параметр может быть задан для терапевтического средства. Параметр может быть задан для средства нетерапевтической природы. Параметр может быть задан для композиции, включающей антитело. Указанная композиция может представлять собой композицию для применения in vivo или in vitro.
Параметр может быть задан для конкретного класса (или подкласса) антитела. Класс может представлять собой IgG. Класс (подкласс) может представлять собой IgG1 или IgG4.
Заданный критерий может представлять собой параметр, связанный с производством антитела. Заданный критерий может представлять собой параметр, связанный с транспортировкой антител с жидкостью. Заданный критерий может представлять собой параметр, связанный с хранением антитела. Заданный критерий может представлять собой параметр, связанный со сроком хранения антитела. Заданный критерий может представлять собой параметр, связанный с введением антитела. Заданный критерий может представлять собой параметр, связанный с периодом полужизни антитела в плазме крови. Заданный критерий может представлять собой параметр, связанный с скоростью клиренса антитела. Заданный критерий может представлять собой параметр, связанный с дозированием антитела. Параметр может быть задан для терапевтического средства, включая антитело. Введение или дозирование терапевтического средства может осуществляться самостоятельно пациентом. Введение может представлять собой внутривенное, внутрибрюшинное или подкожное введение.
Целевые функции
В определенных аспектах настоящее изобретение относится к способам определения того, обладает ли антитело физико-химическим свойством, которое удовлетворяет заданному критерию. Способы могут включать количественное определение или расчет показателя, исходя из целевой функции, который соответствует физико-химическому свойству. Целевая функция может включать значение рассчитанного структурного параметра, что описано по всему объему настоящей заявки.
Целевая функция может включать суммирование мультипликативных произведений факторов масштабирования целевой функции и значений соответствующих структурных параметров. Суммирование может быть включено в аргумент экспоненциального множителя в целевой функции. С помощью целевой функции можно предсказать величину физико-химического свойства, которую можно сравнить с заданным параметром. Например, целевая функция вязкости может включать суммирование мультипликативных произведений значений структурных параметров, определяемых на основе последовательности, в соответствии с настоящим изобретением и соответствующих факторов масштабирования целевой функции, где структурные свойства мАт, вносящие вклад в вязкость, могут представлять собой общий заряд, зарядовую асимметрию и гидрофобность части вариабельного домена антитела. С помощью расчета целевой функции можно получить показатель вязкости. Указанный показатель может быть преобразован в значения вязкости, и сравнение значения вязкости и предела вязкости, определяемых заданным параметром, может быть использовано, чтобы определить, имеет ли раствор антитела вязкость, которая удовлетворяет заданному критерию.
Структурные параметры и соответствующие факторы масштабирования конкретной целевой функции могут зависеть от класса (или подкласса) антитела. Например, целевая функция вязкости, описанная в предыдущем абзаце, может быть использована для предсказания вязкости антитела IgG1, тогда как для антитела IgG4 суммирование может дополнительно включать произведение общего заряда константной области или зарядовой асимметрии константной области и соответствующего фактора масштабирования целевой функции в зависимости от физико-химических свойств представляющего интерес антитела.
С помощью целевой функции можно получить значение, что не соответствует значению, которое можно непосредственно связать или соотнести с физико-химическим свойством; однако, несмотря на это, указанное значение может свидетельствовать о том, обладает ли антитело физико-химическим свойством, что удовлетворяет заданному критерию. Значение может быть преобразовано в двоичный код, который свидетельствует о том, обладает ли антитело физико-химическим свойством, что удовлетворяет заданному критерию, или нет. Например, показатель между нулем и единицей, рассчитанный, исходя из целевой функции лабильности остатка аспарагиновой кислоты, может быть округлен до одной значащей цифры для получения второго показателя, причем установлено, что антитело удовлетворяет заданному критерию лабильности остатка аспарагиновой кислоты, если второй показатель равен нулю, и не удовлетворяет заданному критерию лабильности остатка аспарагиновой кислоты, если второй показатель равен единице.
С помощью устройства логической обработки информации можно получить показатель путем обработки расчета целевой функции.
Целевая функция может иметь форму любой подходящей полиномиальной функции или функции плотности вероятности, использованной, модифицированной и/или полученной с помощью математических аналитических способов, реализованных в настоящем изобретении.
Целевые функции, соответствующие разным физико-химическим свойствам, могут иметь разные функциональные формы.
Факторы масштабирования целевой функции
Способы могут включать отбор факторов масштабирования. Отбор факторов масштабирования может включать отбор факторов масштабирования из набора факторов масштабирования. «Факторы масштабирования» также могут называться «коэффициентами».
Набор факторов масштабирования может включать факторы масштабирования для каждого одного или нескольких классов антител. Класс антител может включать IgG, IgA, IgE, IgM и IgD. Класс антител также может включать подкласс; неограничивающие примеры подкласса включают IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4. Класс антител может представлять собой IgG. Класс антител может представлять собой IgG1. Класс антител может представлять собой IgG4.
Набор факторов масштабирования может включать для каждого класса (или подкласса) Набор факторов масштабирования для каждого одного или нескольких параметров раствора. Параметры раствора могут представлять собой моделируемые параметры раствора, которые могут быть использованы для моделирования методом МД. Параметры раствора могут представлять собой действительные, эмпирические параметры раствора.
Набор факторов масштабирования может включать для каждого класса (или подкласса) и для каждого Параметр раствора Фактор масштабирования, соответствующий каждому из структурных параметров.
Набор факторов масштабирования может храниться в машиночитаемом запоминающем устройстве. Устройство логической обработки информации может производить отбор факторов масштабирования. Отбор факторов масштабирования может включать извлечение факторов масштабирования из машиночитаемого запоминающего устройства. Устройство логической обработки информации может извлекать Факторы масштабирования из машиночитаемого запоминающего устройства.
Отбор факторов масштабирования может включать получение факторов масштабирования. Факторы масштабирования могут быть получены путем аппроксимации целевой функции по эмпирическим значениям физико-химических свойств набора исследуемых антител. Факторы масштабирования могут представлять собой коэффициенты или константы, получаемые путем регрессии рассчитанных значений структурных параметров, включающих целевую функцию, в сравнении с измеренными значениями физико-химических свойств пробного набора антител (также называемых в настоящем документе «исследуемые антитела») при каждом из разных параметров раствора. Факторы масштабирования могут быть получены с помощью других способов аппроксимации структурных параметров, включающих целевую функцию, по измеренным значениям физико-химических свойств. Устройство логической обработки информации может аппроксимировать структурные параметры целевой функции по измеренным значениям физико-химических свойств. После получения тот же самый набор факторов масштабирования можно применить для предсказания вязкости или изомеризации Asp, или другой физико-химической характеристики антитела того же класса или подкласса в одних и тех же условиях.
Измеренные значения могут представлять собой эмпирические значения. Измеренные значения могут быть представлены в открытом доступе. Измеренные значения могут быть представлены на электронном носителе. Измеренные значения могут храниться в машиночитаемом запоминающем устройстве.
Показатели физико-химических свойств
Показатель одного или нескольких физико-химических свойств может быть вычислен, исходя из соответствующих целевых функций. Показатель может соответствовать физико-химическому свойству. Показатель может быть сравнен с заданным параметром.
Показатель может быть рассчитан с помощью электронного устройства. Термин «рассчитанный с помощью электронного устройства» или «количественно определенный с помощью электронного устройства» может относиться к вычислению с помощью электронно-вычислительного устройства, как, например, устройства логической обработки информации.
Устройство логической обработки информации может проводить вычисление. Устройство логической обработки информации может осуществлять сравнение. Устройство для передачи данных может выдавать сообщение, что показатель удовлетворяет заданному критерию.
Устройство логической обработки информации может производить отбор антитело из двух или более антител-кандидатов на основе показателей, соответствующих антителам-кандидатам. В процессе отбора может быть отобрано антитело-кандидат, показатель которого соответствует или лучше соответствует пределу физико-химического свойства или заданного критерия.
Показатель может явиться основой для определения того, необходимо ли производство или получение антитела.
Показатель может явиться основой для определения того, необходимо ли модифицировать или как модифицировать предсуществующее антитело. Показатель может явиться основой для модификации предсуществующего антитела для получения целевого антитела, обладающего одним или несколькими физико-химическими свойствами, которые улучшены по сравнению со свойствами предсуществующего антитела, и/или которые удовлетворяют одному или нескольким заданным критериям.
Антитела
Одно или несколько антител, исследуемых антител, антител-кандидатов, предсуществующих антител и целевых могут включать моноклональное антитело (мАт), поликлональное антитело, антитело с переключенным изотипом или любой другой тип антитела.
Одно или несколько антител, исследуемых антител, антител-кандидатов, предсуществующих антител и целевых могут включать одноцепочечный вариабельный фрагмент, однодоменное антитело или любой другой тип фрагмента или антитела.
Одно или несколько антител, исследуемых антител, антител-кандидатов, предсуществующих антител и целевых могут включать антитело человека, антитело, отличное от антитела человека, гибридное антитело, гуманизированное антитело, сконструированное антитело, искусственное антитело или любой другой тип антитела.
Одно или несколько антител, исследуемых антител, антител-кандидатов, предсуществующих антител и целевых могут принадлежать к определенному классу антител. Это может быть класс IgG, IgM или любой другой подходящий класс. Это может быть класс с переключенным изотипом. Класс может включать один или несколько подклассов. Подклассом может быть IgG1. Подклассом может быть IgG4. Подклассом может быть любой другой подкласс.
Термин «антитело» в настоящем документе используется в самом широком смысле и охватывает различные структуры антитела, включая, в том числе, моноклональные антитела, поликлональные антитела, мультиспецифические антитела {например, биспецифические антитела) и фрагменты антител. Термин «фрагмент антитела» относится к молекуле, отличной от интактного антитела, которая содержит часть интактного антитела, что связывается с антигеном, с которым связывается интактное антитело.
Термин «вариабельная область» или «вариабельный домен» относится к домену тяжелой или легкой цепи антитела, который вовлечен в связывание антитела с антигеном. Вариабельные домены тяжелой и легкой цепей (VH и VL, соответственно) антитела обычно структурно похожи, причем каждый домен содержит четыре консервативные каркасные участка (FR) и три гипервариабельные области (HVR или CDR). (См., например, Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., страница 91 (2007).) Для обеспечения антигенсвязывающей специфичности может быть достаточно наличия VH- или VL-доменов.
Используемый в настоящем документе термин «гипервариабельный участок» или «HVR» относится к каждой из областей вариабельноого домена антитела, которые имеют гипервариабельные последовательности («участки, определяющие комплементарность» или "CDR"), и/или формируют петли с определенной структурой («гипервариабельные петли»), и/или содержат остатки, контактирующие с антигеном («антигенные контакты»). Обычно, антитела состоит из шести HVR: три в VH (H1, Н2, Н3) и три в VL (L1, L2, L3).
«Каркасный участок» или «FR» относится к остаткам вариабельного домена, отличным от остатков HVR. FR вариабельного домен обычно состоит из четырех FR доменов: FR1, FR2, FR3 и FR4. Соответственно, последовательности HVR и FR обычно содержатся в следующей последовательности в VH (или VL): FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.
Термин «антитело человека» относится к антителу, которое обладает аминокислотной последовательностью, что соответствует аминокислотной последовательности антитела, образующегося в организме человека или клетках человека, или полученного из источника, отличного от человека, включающего использование репертуаров антител человека или других последовательностей, кодирующих антитела человека. Из этого определения антитела человека специально исключается гуманизированное антитело, содержащее антигенсвязывающие остатки, отличные от остатков антитела человека.
Термин «гуманизированное» антитело относится к гибридному антителу, содержащему аминокислотные остатки из HVR, отличных от HVR антитела человека, и аминокислотные остатки из FR антитела человека. Согласно определенным вариантам осуществления гуманизированное антитело будет включать, по существу, все по меньшей мере из одного и, как правило, двух вариабельных доменов, в которых все или, по существу, все из HVR (например, CDR) соответствуют HVR антитела, отличного от антитела человека, и все или, по существу, все из FR соответствуют FR антитела человека. Гуманизированное антитело дополнительно может содержать по меньшей мере часть константной области антитела, полученной из антитела человека. Термин «гуманизированная форма» антитела, например, антитела, отличного от антитела человека, относится к антителу, которое было подвержено гуманизации.
Используемый в настоящем документе термин «моноклональное антитело» относится к антителу, полученному из популяции, по существу, гомогенных антител, т.е. отдельные антитела, входящие в состав такой популяции, являются идентичными и/или связываются с одинаковыми эпитопами, за исключением возможных вариантов антител, например, содержащих происходящие естественным образом мутации или образующихся на протяжении производства препаратов моноклональных антител, причем такие варианты содержатся в незначительных количествах. В отличие от препаратов поликлональных антител, которые, как правило, содержат разные антитела, специфичные по отношению к разным детерминантам (эпитопам), каждое моноклональное антитело из препарата моноклональных антител обладает специфичностью по отношению к одной детерминанте на антигене. Таким образом, определение «моноклональный» обозначает свойство антител, которые получают, по существу, из гомогенной популяции антител, и указанное определение не включает получения указанного антитела с помощью какого-либо способа.
Термин «класс» антитела относится к типу константного домена или константной области, содержащегося в тяжелой цепи. Известно пять основных классов антител млекопитающих: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, и некоторые из этих классов можно дополнительно подразделить на подклассы (изотипы), например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2. Используемы в настоящем документе термин «классы» антител в широком смысле включают классы и подклассы антител.
Получение антител
Согласно определенным аспектам настоящее изобретение дополнительно относится к способам получения антитела, причем определяется, обладает ли полученное антитело одним или несколькими физико-химическими свойствами, которые удовлетворяют одному или нескольким заданным критериям. Настоящее изобретение может относится к способам получения целевого антитела, которое получают в результате модификации предсуществующего антитела, не удовлетворяющего заданным критериям, таким образом, что модифицированное антитело, т.е. полученное целевое антитело, обладает одним или несколькими физико-химическими свойствами, которые удовлетворяют одному или нескольким заданным критериям. Получение может относится к производству антител в небольших или больших объемах.
Полученное антитело далее может быть включено в состав фармацевтической композиции. Фармацевтические составы, содержащие антитело, готовят путем смешивания такого антитела, характеризующегося необходимой степенью очистки, с одним или несколькими дополнительными фармацевтически приемлемыми носителями (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)), в форме лиофилизированных составов или водных растворов. «Фармацевтически приемлемый носитель» относится к ингредиенту в фармацевтическом составе, отличному от активного ингредиента, который не токсичен для субъекта. Фармацевтически приемлемый носитель включает, в том числе, буфер, вспомогательное вещество, стабилизирующее или консервирующее вещество.
В состав по настоящему изобретению могут быть включены несколько активных ингредиентов с целью лечения определенного состояния, при этом предпочтительно, чтобы эффект какого-либо из этих активных ингредиентов при их взаимодействии, не оказывал нежелательного действия на другие активные ингредиенты в этом составе. Такие активные ингредиенты содержатся в соответствующих комбинациях и количестве, делающих их эффективными для получения ожидаемого результата.
Составы, которые используются для введения in vivo, обычно являются стерильными. Стерильность обеспечивается без труда, например, путем фильтрации через стерилизующие мембранные фильтры.
Моноклональные антитела, которые могут быть использованы в соответствии с настоящем изобретением, могут быть получены разнообразными способами, включая, в том числе, способ получения гибридом, способы на основе рекомбинантной ДНК, способы фагового дисплея и способы, включающие использование трансгенных животных, антитела которых содержат все или часть локусов иммуноглобулина человека.
Антитела могут быть получены любыми способами, известными в данной области техники. Антитело может быть получено способом культивирования клетки-хозяина, содержащей нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело, в условиях, подходящих для экспрессии антитела. Антитело может быть получено с помощью рекомбинантной ДНК в клетке-хозяине. Клетками-хозяевами могут выступать прокариотические клетки (включая, в том числе, клетки Е. coli) или эукариотические клетки (включая, в том числе, клетки насекомых, как, например, клетки SF9, или клетки млекопитающих, как, например, клетки овариальные клетки китайского хомячка). Антитело может быть получено путем временной или стабильной трансфекции клеточной линии. Антитело может быть получено в организме трансгенного животного. Антитело может быть получено другим способом синтеза, известным в данной области техники. Антитело может быть получено путем очистки с использованием стандартных способов, как, например, способы хроматографии.
Термин «предсуществующее антитело» может относиться к антителу, в котором аминокислотная последовательность модифицирована таким образом, что приводит к улучшению одного или нескольких физико-химических свойств, которые определяются в соответствии с настоящим изобретением, и/или удовлетворению одного или нескольких заданных критериев. Предсуществующее антитело может обладать приемлемой антигенсвязывающей специфичностью, аффинностью и другими эффекторными функциями. Предсуществующее антитело может обладать нежелательными или неприемлемыми физико-химическими свойствами, которые определяются согласно настоящему изобретению.
Термины «целевое антитело», «модифицированное антитело» или «антитело, полученное в результате мутагенеза» могут быть использованы взаимозаменяемо. Эти термины могут иметь отношение к антителу с одним или несколько изменениями, внесенными в аминокислотную последовательность предсуществующего антитела таким образом, что модифицированное или полученное в результате мутагенеза антитело обладает одним или несколькими физико-химическими свойствами, которые удовлетворяют одному или нескольким заданным критериям, и вместе с этим, по существу, сохраняет аффинность связывания с антигеном, специфичность и другие желательные функции, такие как антителозависимая клеточноопосредованная цитотоксичность (АКЦТ), и другие эффекторные функции предсуществующего антитела. Одно или несколько свойств целевого антитела, модифицированного или полученного в результате мутагенеза антитела могут быть лучшими, чем свойства предсуществующего антитела, например, что касается улучшения аффинности связывания с антигеном, специфичности и/или других желательных функций.
Модификация предсуществующего антитела может включать модификацию аминокислотной последовательности предсуществующего антитела. Аминокислотная последовательность предсуществующего антитела может быть модифицирована таким образом, чтобы соответствовать целевой аминокислотной последовательности, которая соответствует заданному критерию.
Модификация аминокислотной последовательности предсуществующего антитела может включать изменение свойств одной или несколько аминокислот в аминокислотной последовательности предсуществующего антитела. Изменение свойств одного или несколько аминокислотных остатков может включать химическую модификацию одного или нескольких остатков. Химическая модификация одного или нескольких остатков может включать изменение хиральных свойств одного или нескольких остатков. Химическая модификация одного или нескольких остатков может включать изменение одного или нескольких атомов одного или нескольких остатков.
Модификация аминокислотной последовательности предсуществующего антитела может включать замену или замещение одного или нескольких аминокислотных остатков в аминокислотной последовательности предсуществующего антитела другим аминокислотным остатком. Модификация аминокислотной последовательности предсуществующего антитела может включать удаление одного или нескольких аминокислотных остатков из аминокислотной последовательности предсуществующего антитела. Модификация аминокислотной последовательности предсуществующего антитела может включать добавление или вставку одного или нескольких аминокислотных остатков в аминокислотную последовательность предсуществующего антитела.
Аминокислотное замещение может быть консервативным или неконсервативным замещением. В данной области техники хорошо известно, что представляют собой консервативное или неконсервативное аминокислотное замещение. Консервативные замещения показаны в таблице №1 внизу с заголовком «предпочтительные замещения». Более существенные изменения приведены в таблице №1 под заголовком «иллюстративные замещения» и дополнительно описаны ниже со ссылкой на классы аминокислот по свойствам боковых цепей. С целью получения модифицированного антитела, т.е. целевого антитела, в предсуществующее антитело может быть введено аминокислотное замещение. Можно провести скрининг модифицированных антител в отношении наличия желательного свойства, например, желательного физико-химического свойства, помимо сохранения ими желательных свойств, характерных для предсуществующего антитела.
Аминокислоты могут быть сгруппированы в соответствии с общими свойствами боковой цепи: (1) гидрофобные: норлейцин, Met, Ala, Val, Leu, Ile; (2) нейтральные, гидрофильные: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; (3) кислые: Asp, Glu; (4) основные: His, Lys, Arg; (5) остатки, которые влияют на пространственную ориентацию цепей: Gly, Pro; и (6) ароматические соединения: Trp, Tyr, Phe. Неконсервативные замещения предполагают замену представителя одного из этих классов представителем другого класса.
Исследователь сможет увеличить или уменьшить общий заряд или гидрофобность в соответствии с настоящим изобретением путем замещения одного или нескольких аминокислотных остатков в последовательности антитела, таким образом, может быть получено антитело с физико-химическим свойством, которое удовлетворяет заданному критерию. Например, замещение основного аминокислотного остатка на кислый или нейтральный аминокислотный остаток может привести к уменьшению расчетного значения общего заряда, а замещение гидрофильного аминокислотного остатка на гидрофобный аминокислотный остаток может привести к увеличению расчетного значения гидрофобности, при этом соответствующий показатель может быть использован как основа для определения того, удовлетворяет ли антитело определенному заданному параметру. Целевое антитело, модифицированное или полученное в результате мутагенеза антитело могут подвергаться дополнительному анализу in-silico или экспериментальному анализу в реальных условиях, чтобы подтвердить, что целевое антитело, модифицированное или полученное в результате мутагенеза антитело действительно обладают по меньшей мере одним физико-химическим свойством, которое удовлетворяет заданному критерию.
Целевое антитело, модифицированное или полученное в результате мутагенеза антитело могут подвергаться дополнительному анализу, чтобы удостовериться, что модифицированное антитело по меньшей мере, по существу, сохраняет желаемую активность предсуществующего антитела, как, например, антигенсвязывающую специфичность или аффинность, с использованием способов, известных в данной области техники. Например, антигенсвязывающая специфичность, аффинность и кинетика связывания могут быть измерены с помощью ИФА, флуоресцентного иммуноанализа, радиоиммунологического анализа или анализа с использованием BIACORE® (Biacore АВ, Уппсала, Швеция).
Термин «по существу, сохраняет» активность может относится к сохранению по меньшей мере 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, или 99% активности.
Устройства логической обработки информации, устройства для передачи данных, устройства для приема данных
Одно или несколько устройств логической обработки информации, устройств для передачи данных и устройств для приема данных могут быть реализованы в виде вычислительной машины или входить в состав вычислительной машины.
Вычислительная машина может представлять собой клиент, сервер, одновременно и клиент, и сервер, программируемый логический контроллер («ПЛК») или любое другое подходящее устройство обработки. Вычислительная машина может включать центральный процессор («ЦП»), память и схему ввода/вывода («ввод/вывод») и/или любое другое подходящее устройство.
ЦП могут представлять собой один или несколько микропроцессоров, микрокомпьютеров и микроконтроллеров. Микропроцессоры, микрокомпьютеры и микроконтроллеры могут включать компоненты цифровых схем, такие как затворы и триггеры. ЦП могут быть сконструированы с использованием одного или нескольких дискретных компонентов цифровых схем, таких как триггеры и затворы.
Микропроцессоры, микрокомпьютеры и микроконтроллеры могут соответствовать одной или нескольким архитектурам, как, например, компьютеры с сокращенным набором команд («RISC») или компьютер с полным набором команд («CISC»), или компьютер с архитектурой сверхдлинного командного слова («VLIW»), или с любой другой соответствующей архитектурой. Архитектуры могут определять конфигурацию одного или нескольких каналов передачи данных, схем управления, тактирующих схем, схем памяти и любых других подходящих конфигураций каналов или схем.
Каналы передачи данных могут быть конвейерными или отличаться от таковых. Каналы передачи данных могут включать арифметико-логическое устройство («ALU»). Схемы управления могут интерпретировать команды. Схемы управления могут контролировать каналы передачи данных. Тактирующие схемы могут управлять синхронизацией одного или нескольких контроллеров и каналов передачи данных. Схемы управления могут содержать в себе один или несколько конечных автоматов, одно или несколько постоянных запоминающих устройств и один или несколько внутренних блоков обработки данных в любой подходящей комбинации.
Из схем памяти могут выводиться расчетные значения числовых переменных, такие как факторы масштабирования. Из схем памяти могут посылаться команды, как, например, команды, необходимые для расчета целевой функции. Память может включать один или несколько регистров. Память может включать один или несколько уровней кэша. Память может включать компоненты адресации. Компоненты адресации могут управлять системой виртуальной памяти. Компоненты адресации могут управлять доступом к внешней памяти и или запоминающим устройствам.
Микропроцессор может быть интегрирован на одном кремниевом кристалле вместе с регистрами и несколькими или всеми интегральными схемами кэш-памяти, реализация одного или нескольких уровней кэша может выполняться вне данного микропроцессора.
Память может включать одну или несколько из запоминающего устройства с произвольным доступом («RAM»), постоянного запоминающего устройства «ROM»), флэш-памяти, электрически стираемой перепрограммируемой памяти («EEPROM»), электрически перепрограммируемой памяти («EPROM»), магнитного диска, магнитной ленты, барабанов, оптических дисков и любой другой подходящей памяти.
Память может быть разделена на компоненты «на борту» (например, регистровая память и память, называемая кэшем), которые могут быть включены в состав кристалла микропроцессора, и компоненты «внешней памяти», которые могут находиться вне микропроцессора. Внешняя память может входить в состав физической адресной памяти (например, память, которую можно назвать оперативной памятью/ оперативным запоминающим устройством) или виртуальной адресной памяти. Для энергонезависимого хранения может использоваться память на магнитных дисках, также такую память можно использовать для частичной реализации на ней системы виртуальной памяти.
Схема ввода/вывода может находиться внутри или вне кристалла микропроцессора. Возможность подключения устройств ввода-вывода может включать прямое подключение к компонентам аппаратного обеспечения (например, принтеры, элементы управления процессами и другие подходящие компоненты аппаратного обеспечения). Подключение устройств ввода-вывода может включать один или несколько сетевых компонентов (таких как проводные модемы, беспроводное подключение WIFI, соединение в ближней зоне и другие подходящие сетевые компоненты) для связи с сетью. Сеть может включать узлы в проводной связи. Сеть может включать узлы в беспроводной связи. Сети могут включать глобальную вычислительную сеть («WAN»), локальную вычислительную сеть («LAN»), сеть WIFI или любой другой подходящий тип сети.
Что касается некоторого типа подключения устройств ввода-вывода, информация может передаваться с использованием передатчика. Что касается некоторого типа подключения устройств ввода-вывода, информация может приниматься с использованием приемника. В некоторых случаях передатчик с приемником можно объединить в приемопередатчик. Как правило, данные - это цифровая информация в виде пакетов. Однако информация может быть передана с посылкой одного бита, которым, например, включается машина или указывается состояние процесса или вычисления; информация может быть получена с приемом одного бита, например, бита, который указывает на состояние датчика, процесса или вычисления, или же в этот один бит может входить информация об аналоговом напряжении или силе тока.
Устройство передачи данных может включать компоненты аппаратного обеспечения. Устройство передачи данных может включать компоненты программного обеспечения. Аппаратное обеспечение может быть включено для физического взаимодействия с элементами проводной и беспроводной связи, через которые распространяется радиочастотная энергия. Аппаратное обеспечение устройства передачи данных может включать радиопередатчик. В состав устройства передачи данных могут входить только компоненты аппаратного обеспечения. Части аппаратного обеспечения могут находиться за пределами микропроцессоров, микрокомпьютеров и микроконтроллеров. Например, для вывода одного бита может быть использован усилитель сдвига уровня для контроля машины. Некоторые протоколы работы устройств передачи данных могут обновляться через обновления программного обеспечения.
Устройство приема данных может включать компоненты аппаратного обеспечения. Устройство приема данных может включать компоненты программного обеспечения. Аппаратное обеспечение может быть включено для физического взаимодействия с элементами проводной и беспроводной связи, через которые распространяется радиочастотная энергия. Устройство приема данных аппаратное обеспечение может включать радиоприемное устройство. В состав устройства приема данных могут входить только компоненты аппаратного обеспечения. Части аппаратного обеспечения могут находиться за пределами микропроцессоров, микрокомпьютеров и микроконтроллеров. Например, для вывода одного бита может быть использован усилитель сдвига уровня для приема данных от датчика. Некоторые протоколы работы устройств приема данных могут обновляться через обновления программного обеспечения.
Вычислительная машина может быть сконфигурирована с возможностью включения средств для отбора целевой функции, соответствующей одному или нескольким физико-химическим свойствам антитела.
Вычислительная машина может быть сконфигурирована с возможностью включения средств для определения в машиночитаемом запоминающем устройстве (машинная память) значений факторов масштабирования целевой функции в условиях раствора антител. Вычислительная машина может быть сконфигурирована с возможностью включения средств для извлечения установленных значений факторов масштабирования.
Вычислительная машина может быть сконфигурирована с возможностью включения средств для обработки структурных параметров антител. Обработка может представлять собой логическую обработку. Обработка может представлять собой обработку численных данных. Обработка может включать оценку параметров. С помощью обработки можно получить значения параметров. Обработка может быть основана на структурных особенностях антител. Обработка может быть основана параметры раствора.
Вычислительная машина может быть сконфигурирована с возможностью включения средств для оценки целевой функции. Оценка может быть основана на значениях параметров и значениях факторов масштабирования. С помощью оценки целевой функции можно предсказать значения одного или нескольких физико-химических свойств антитела в условиях раствора.
Вычислительная машина может быть сконфигурирована с возможностью включения средств для сравнения результатов предсказания с заданным параметром, соответствующим одному или нескольким физико-химическим свойствам.
Вычислительная машина может быть сконфигурирована с возможностью включения средств для отбора антитела на основе сравнения. Отбор антитела возможен, если результаты предсказания соответствуют заданному критерию. Отбор антитела возможен для получения антител.
Комбинации признаков и принципов настоящего изобретения
Далее описаны способы применения вышеописанных признаков и принципов настоящего изобретения в отношении иллюстративных физико-химических свойств. Иллюстративные физико-химические свойства включают вязкость, клиренс, лабильность остатка аспарагиновой кислоты и лабильность остатка триптофана.
Понятно, что способы могут подразумевать применение вышеописанных признаков и принципов к одному физико-химическому свойству или к комбинации двух или более физико-химических свойств в любой комбинации друг с другом.
Способы могут быть реализованы путем любой комбинации признаков устройства, средств или того и другого.
Вязкость
Физико-химическое свойство может представлять собой вязкость антитела. Заданный критерий может представлять собой предел вязкости. Заданный критерий может считаться удовлетворенным, если вязкость антитела равна пределу вязкости. Заданный критерий может считаться удовлетворенным, если вязкость антитела меньше предела вязкости. Предел вязкости может составлять 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10 или 5 сП. Далее рассматриваются основанные на вязкости способы определения пригодности антитела для включения в состав терапевтического средства, отбора антитела из нескольких антител-кандидатов, получения антитела, модификации предсуществующего антитела и получения целевого антитела. Понятно, что одна или несколько стадий одного из способов может быть осуществлена в комбинации с одной или несколькими стадиями других способов.
Вязкость: способы определения соответствия или пригодности антитела для включения в состав терапевтического средства
Способы могут включать определение, на основе показателя вязкости, пригодности антитела для включения в состав терапевтического средства. Исходя из информации о структуре антител способы могут включать (а) расчет, что может включать: (1) общий заряд; и (2) зарядовую асимметрию; (б) отбор для антитела: первого фактора масштабирования (или фактора масштабирования общего заряда), который соответствует общему заряду, и второго фактора масштабирования (или фактора масштабирования зарядовой асимметрии), который соответствует зарядовой асимметрии; (в) расчет показателя, исходя из целевой функции, содержащей факторы масштабирования, причем указанный показатель соответствует вязкости; (г) сравнение показателя с заданным параметром; и (д) определение того, обладает ли антитело вязкостью, которая удовлетворяет заданному критерию.
Расчет, исходя из информации о структуре, может включать расчет, исходя из информации о первичной структуре. Первичная структура может включать аминокислотную последовательность вариабельного домена легкой цепи (VL) и аминокислотную последовательность вариабельного домена тяжелой цепи (VH). Способы могут включать расчет общего заряда, исходя из информации о структуре вариабельного домена. Общий заряд может складываться из суммы общего заряда аминокислотной последовательности VL и общего заряда аминокислотной последовательности VH. Способы могут включать расчет зарядовой асимметрии, исходя из информации о структуре вариабельного домена. Зарядовая асимметрия может включать арифметическое произведение общего заряда аминокислотной последовательности VL и общего заряда аминокислотной последовательности VH. Указанный способ может дополнительно подразумевать расчет (3) гидрофобности, исходя из информации об одном или нескольких участках, определяющих комплементарность.
Указанный способ может дополнительно подразумевать стадию секвенирования аминокислотной последовательности антитела. Указанный способ может дополнительно подразумевать стадию получения антитела.
Способы могут включать расчет показателя гидрофобности, исходя из информации о структуре одного участка вариабельного домена, определяющего комплементарность. Один участок, определяющий комплементарность, может представлять собой любой CDR1, CDR2 и CDR3 антитела. Способы могут включать расчет показателя гидрофобности, исходя из информации о структуре одного или нескольких участков, определяющих комплементарность, (CDR). Один или несколько участков, определяющих комплементарность, могут включать два, три, четыре, пять или шесть участков, определяющих комплементарность. Один или несколько участков, определяющих комплементарность, могут включать шесть участков, определяющих комплементарность. Показатель гидрофобности может быть рассчитан как сумма значений гидрофобности одного или нескольких участков, определяющих комплементарность. Гидрофобность может включать итоговое значение функций суммирования по значениям гидрофобности одного или нескольких CDR. Каждая из функций суммирования может представлять собой соотношение суммы значений, полученных для гидрофобных остатков CDR, и суммы значений, полученных для гидрофильных остатков CDR. Способы могут включать расчет показателя гидрофобности, исходя из информации о структуре Fv-домена. Способы могут включать расчет показателя гидрофобности, исходя из информации о структуре Fv-домена, если пробный набор антител включает антитела разных классов или подклассов. Значение, полученное для гидрофобного остатка или гидрофильного остатка, может представлять собой значение гидрофобности по шкале Эйзенберга для конкретного аминокислотного остатка.
Вязкость можно экспериментально измерить с использованием реометр, включая, в том числе, реометр типа конус-пластина и реометр с падающим шариком.
Способы могут включать определение значения показателя с помощью электронно-вычислительной машины. Значение показателя можно определить, исходя из целевой функции. Целевая функция может включать факторы масштабирования. Показатель может соответствовать вязкости.
Способы могут включать сравнение показателя с заданным параметром предела вязкости для определения того, обладает ли антитело вязкостью, которая удовлетворяет заданному критерию предела вязкости.
В целевой функции, log10 от показателя может зависеть от суммы:
(общий заряд X первый фактор масштабирования) плюс
(зарядовая асимметрия X второй фактор масштабирования) плюс
(гидрофобность X третий фактор масштабирования).
Целевая функция может иметь общую форму показатель = 10констант.10сум..
Способы могут включать отбор факторов масштабирования. Факторы масштабирования могут включать первый фактор масштабирования (или фактор масштабирования общего заряда). Первый фактор масштабирования может соответствовать общему заряду. Фактор масштабирования может включать второй фактор масштабирования (или фактор масштабирования зарядовой асимметрии). Второй фактор масштабирования может соответствовать зарядовой асимметрии. Фактор масштабирования может включать третий фактор масштабирования (или фактор масштабирования гидрофобности). Третий фактор масштабирования может соответствовать гидрофобности. Факторы масштабирования могут быть отобраны из набора факторов масштабирования, который может включать множество первых факторов масштабирования, множество вторых факторов масштабирования и множество третьих факторов масштабирования. Способы могут дополнительно включать получение факторов масштабирования, исходя из данных по меньшей мере одного измерения вязкости раствора по меньшей мере одного исследуемого антитела, причем указанное антитело и исследуемое антитело относятся к одному и тому же классу антител. Факторы масштабирования могут представлять собой полученные факторы масштабирования.
Параметры раствора могут включать ионную силу. Что касается растворов низкой ионной силы, то третий фактор масштабирования может быть равен нулю. Примером раствора низкой ионной силы может являться буферный раствор с концентрацией 20-30 миллимоль.
Что касается растворов низкой ионной силы, то способы могут не включать расчет показателя гидрофобности, исходя из информации о структуре антитела, и ни сумма, ни факторы масштабирования не могут включать третий фактор масштабирования. Что касается растворов низкой ионной силы, то способы могут не включать отбор третьего фактора масштабирования. В целевой функции, что касается растворов низкой ионной силы, log10 от показателя может зависеть от суммы:
(общий заряд X первый фактор масштабирования) плюс
(зарядовая асимметрия X второй фактор масштабирования).
Что касается растворов высокой ионной силы, то близкое соответствие показателя физико-химическому свойству может быть достигнуто путем включения одного, двух, трех, четырех, пяти или шести CDR в расчет показателя гидрофобности. Примером раствора высокой ионной силы может быть буферный раствор с концентрацией 200 миллимоль.
Например, для моноклонального IgG1 в составе приблизительно 200 миллимолярного раствора буфера при около 25°С и около рН 5,5, первый, второй и третий факторы масштабирования могут быть соотнесены с концентрацией антитела следующим образом:
для концентрации антитела около 150 миллиграмм на миллилитр первый фактор масштабирования может составлять около -0,036, второй фактор масштабирования может составлять около -0,012 и третий фактор масштабирования может составлять около 0,34; и для концентрации антитела около 180 миллиграмм на миллилитр первый фактор масштабирования может составлять около -0,05, второй фактор масштабирования может составлять около -0,017 и третий фактор масштабирования может составлять около 0,42.
Термин «около», что касается заданного значения или диапазона, может относиться к достаточному приближению к указанному значению или диапазону для получения результата, по существу, подобного результату, полученному при указанном значении или в пределах указанного диапазона. «По существу, подобный» результат может находиться в пределах 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% или 10% результата, полученного при указанном значении или в пределах указанного диапазона.
Для этого примера раствора высокой ионной силы, с помощью количественного определения показателя для каждой из иллюстративных концентраций антител можно получить показатель, во многом соответствующий измеренной вязкости, которая измеряется в сантипуазах. Для некоторых классов и подклассов антител указанный способ может включать расчет зарядовой асимметрии константной области, исходя из информации о структуре константной области антитела. Для этих классов и подклассов набор факторов масштабирования может включать множество факторов масштабирования зарядовой асимметрии константной области, и способы могут включать подбор для антитела факторов масштабирования зарядовой асимметрии константной области (или четвертого фактора масштабирования), который может соответствовать зарядовой асимметрии константной области. Для этих классов и подклассов целевая функция может включать фактор масштабирования зарядовой асимметрии константной области. Класс антител (или подкласс) может представлять собой IgG4.
Для этих классов и подклассов log10 от показателя может зависеть от суммы:
(общий заряд X первый фактор масштабирования) плюс
(зарядовая асимметрия вариабельного домена X второй фактор масштабирования) плюс
(гидрофобность X третий фактор масштабирования) и
в зависимости от класса (или подкласса), зарядовая асимметрия константной области X фактор масштабирования зарядовой асимметрии константной области).
Для этих классов и подклассов, что касается растворов низкой ионной силы, третий фактор масштабирования может быть равен нулю. Что касается растворов низкой ионной силы, способы могут не включать расчет показателя гидрофобности, исходя из информации о структуре антитела, и ни сумма, ни факторы масштабирования не могут включать третий фактор масштабирования. Что касается растворов низкой ионной силы, способы могут не включать отбор третьего фактора масштабирования. В целевой функции, что касается растворов низкой ионной силы, log10 от показателя может зависеть от суммы:
(общий заряд X первый фактор масштабирования) плюс
(зарядовая асимметрия вариабельного домена X второй фактор масштабирования) плюс
(зарядовая асимметрия константной области X фактор масштабирования зарядовой асимметрии константной области).
Классы и подклассы, для которых с помощью указанных способов можно рассчитать и использовать зарядовую асимметрию константной области, и с помощью указанных способов можно отобрать и использовать соответствующий фактор масштабирования зарядовой асимметрии константной области, могут включать IgG4.
Вязкость: способы отбора антител-кандидатов для включения в состав терапевтического средства
Способы могут включать отбор антитела на основе показателя вязкости из двух или более антител-кандидатов и могут не включать никаких, могут включать некоторые или все стадии способа для определения пригодности антитела на основе показателя вязкости.
Способы могут включать получение первой части информации о структуре первого антитела-кандидата. Первая часть информации о структуре может включать первую аминокислотную последовательность первого антитела-кандидата. Способы могут включать получение второй части информации о структуре второго антитела-кандидата. Вторая часть информации о структуре может включать вторую аминокислотную последовательность второго антитела-кандидата.
Способы могут включать численный расчет первого набора структурных параметров, исходя из первой части информации о структуре: (1) первого показателя общего заряда; (2) первого показателя зарядовой асимметрии; и, (3) первого значения показателя гидрофобности. Способы могут включать численный расчет второго набора структурных параметров, исходя из второй части информации о структуре: (1) второго показателя общего заряда; (2) второго показателя зарядовой асимметрии; и (3) второго показателя гидрофобности.
Способы могут включать определение первого значения показателя с помощью электронно-вычислительной машины, исходя из первой целевой функции. Первая целевая функция может включать первый набор факторов масштабирования, соответствующий первому набору физико-химических параметров. Первое значение показателя может соответствовать первому антителу-кандидату. Первое значение показателя может соответствовать первому показателю вязкости первого антитела-кандидата. Способы могут включать определение значения второго показателя с помощью электронно-вычислительной машины, исходя из второй целевой функции. Вторая целевая функция может включать второй набор факторов масштабирования, соответствующий второму набору структурных параметров. Второе значение показателя может соответствовать второму антителу-кандидату. Второе значение показателя может соответствовать второму показателю вязкости второго антитела-кандидата. Первый и второй набор факторов масштабирования и целевых функций могут быть одинаковыми. Первый и второй набор факторов масштабирования и целевых функций могут быть разными.
Каждый набор факторов масштабирования может включать фактор масштабирования общего заряда, соответствующий общему заряду, фактор масштабирования зарядовой асимметрии, соответствующий зарядовой асимметрии и фактор масштабирования гидрофобности, соответствующий гидрофобности. Для некоторых классов и подклассов антител-кандидатов факторы масштабирования зарядовой асимметрии первого набора и/или второго набора факторов масштабирования могут представлять собой факторы масштабирования зарядовой асимметрии вариабельного домена.
Для определенных классов и подклассов антител-кандидатов способы могут включать расчет первого показателя зарядовой асимметрии константной области для первого набора структурных параметров и/или второго показателя зарядовой асимметрии константной области для второго набора структурных параметров, исходя из информации о структуре константной области первого антитела-кандидата и/или второго антитела-кандидата, соответственно. Примером таких классов и подклассов может являться IgG4.
Первая целевая функция и вторая целевая функция могут включать факторы масштабирования для первого антитела-кандидата и второго антитела-кандидата, соответственно. Для антител-кандидатов, находящихся в растворах низкой ионной силы, факторы масштабирования гидрофобности могут быть равны нулю. Для антител-кандидатов, находящихся в растворах низкой ионной силы, способы не могут включать расчет показателей гидрофобности. Для антител-кандидатов, находящихся в растворах низкой ионной силы, целевые функции не могут включать факторы масштабирования гидрофобности.
Если класс или подкласс первого антитела-кандидата представляет собой класс или подкласс второго антитела-кандидата, то первый набор факторов масштабирования может быть идентичным второму набору факторов масштабирования. Если параметры раствора первого антитела-кандидата представляют собой параметры раствора второго антитела-кандидата, то первый набор факторов масштабирования может быть идентичным второму набору факторов масштабирования.
Первый показатель может удовлетворять заданному критерию предела вязкости. Второй показатель может удовлетворять заданному критерию предела вязкости.
Способы могут включать отбор первого антитела-кандидата или второго антитела-кандидата, которые будут использованы в составе терапевтического средства, на основе относительного значения первого показателя и второго показателя. Способы могут включать отбор первого антитела-кандидата, если первый показатель ниже второго показателя. Способы могут включать отбор второго антитела-кандидата, если второй показатель ниже первого показателя. Способы могут дополнительно включать стадию сравнения первого и/или второго показателя с заданным параметром. Отобранное антитело может обладать вязкостью, которая удовлетворяет заданному критерию.
Вязкость: способы приготовления терапевтического средства
Способы приготовления могут включать установление предела вязкости раствора антител с использованием емкости для производства и дозирования терапевтического средства. Способы приготовления терапевтического средства могут не включать никаких, могут включать некоторые или все стадии способа для определения пригодности антитела на основе показателя вязкости.
Способы приготовления могут включать выбор элемента для подачи жидкости в емкость для производства и дозирования терапевтического средства. Элемент для проведения жидкости может включать магистраль, клапан, пористую пробку или любой другой элемент для проведения жидкости. Любой другой элемент для проведения жидкости может включать трубку, хроматографический сорбент или фильтр. Элемент для проведения жидкости может обладать гидродинамическим сопротивлением. Гидродинамическое сопротивление может зависеть от вязкости раствора антител, учитывая ряд параметров процесса приготовления и/или дозирования в условия водного раствора.
Способы приготовления могут включать определение значения показателя, соответствующего вязкости антитела, исходя из информации о структуре антител. Определение значения показателя может быть осуществлено в соответствии со способами определения пригодности антитела с точки зрения соответствия показателю вязкости.
Способы могут включать пропускание раствора антитела через элемент для проведения жидкости только в том случае, если указанный показатель не превышает предела. Способы могут включать получение антитела только в том случае, если указанный показатель не превышает предела.
Способы могут включать конструирование целевого антитела таким образом, чтобы вязкость терапевтического средства не превышала предела вязкости.
Способы могут включать определение аминокислотной последовательности для целевого антитела. Аминокислотная последовательность может соответствовать показателю вязкости, который ниже предела вязкости.
Определение аминокислотной последовательности может включать определение с помощью электронно-вычислительной машины пробных значений вязкости на основе пробной аминокислотной последовательности антитела, полученного из предсуществующего антитела. Количественное определение может не включать никаких, может включать некоторые или все указанные стадии для определения пригодности антитела с точки зрения соответствия показателю вязкости.
Настоящее изобретение также относится к способам приготовления композиции, содержащей антитело. Способы могут включать установление предела вязкости раствора антител на основе гидродинамического сопротивления элемента для подачи жидкости, находящегося в производственной емкости, причем гидродинамическое сопротивление зависит от вязкости жидкости, которая протекает через указанный элемент; передачу по сети информации о структуре антитела; получения по сети показателя вязкости раствора антитела, рассчитанного, исходя из информации о его структуре; и передачу раствора антитела через указанный элемент для получения композиции только в том случае, если указанный показатель не превышает предела вязкости.
Указанный способ может включать установление предела вязкости раствора антител на основе гидродинамического сопротивления элемента для подачи жидкости, находящегося в производственной емкости, причем гидродинамическое сопротивление зависит от вязкости жидкости, которая протекает через указанный элемент; расчет показателя вязкости раствора антитела, исходя из информации о его структуре; и передачу раствора антитела через указанный элемент для получения композиции только в том случае, если указанный показатель не превышает предела вязкости.
Вязкость: способы получения антител
Способы получения антитела, раствор которого обладает вязкостью, что удовлетворяет заданному критерию, могут подразумевать стадии (а) установления предела вязкости для раствора антител; (б) расчета показателя, который соответствует вязкости раствора антитела, исходя из информации о структуре антитела, в соответствии со способами, описанными по всему объему настоящей заявки; и определения того, обладает ли раствор антитела вязкостью, которая удовлетворяет заданному критерию; и (в)получения антител в том случае, если показатель не превышает предел вязкости.
Способы получения антитела, раствор которого обладает вязкостью, что удовлетворяет заданному критерию, могут подразумевать стадии установления предела вязкости для раствора антитела, причем предел вязкости удовлетворяет заданному критерию; передачи по сети информации о структуре антитела; получения по сети показателя, что соответствует вязкости раствора антител, причем показатель рассчитывают, исходя из информации о его структуре; определения того, обладает ли раствор антитела вязкостью, которая удовлетворяет заданному критерию; и получения антитела только в том случае, если указанный показатель не превышает предела вязкости.
Для каждого варианта осуществления, описанного в настоящем документе, показатель рассчитывают по способу, включающему стадии: расчета общего заряда и зарядовой асимметрии, исходя из информации о структуре антитела; подбора для антитела: первого фактора масштабирования, который соответствует общему заряду, и второго фактора масштабирования, который соответствует зарядовой асимметрии; и расчета показателя, исходя из целевой функции, содержащей факторы масштабирования, причем показатель соответствует вязкости. Расчет, исходя из информации о структуре, может включать расчет, исходя из информации о первичной структуре. Первичная структура может включать аминокислотную последовательность вариабельного домена легкой цепи (VL) и аминокислотную последовательность вариабельного домена тяжелой цепи (VH). Общий заряд может складываться из суммы общего заряда аминокислотной последовательности VL и общего заряда аминокислотной последовательности VH. Зарядовая асимметрия может включать арифметическое произведение общего заряда аминокислотной последовательности VL и общего заряда аминокислотной последовательности VH. Указанный способ может дополнительно подразумевать получение факторов масштабирования, исходя из данных по меньшей мере одного измерения вязкости раствора по меньшей мере одного исследуемого антитела, причем указанное антитело и исследуемое антитело относятся к одному и тому же классу антител. Отбор факторов масштабирования может включать отбор первого фактора масштабирования и второго фактора масштабирования из набора факторов масштабирования для каждого одного или нескольких параметров водного раствора. Целевая функция, log10 от показателя могут включать сумму (общий заряд X первый фактор масштабирования) плюс (зарядовая асимметрия X второй фактор масштабирования).
Для каждого варианта осуществления, описанного в настоящем документе, способы могут дополнительно включать расчет показателя гидрофобности, исходя из информации о структуре, исходя из информации об одном или нескольких участках, определяющих комплементарность (CDR); и отбор третьего фактора масштабирования, который соответствует показателю гидрофобности, причем целевая функция дополнительно содержит третий фактор масштабирования. Гидрофобность может включать итоговое значение функций суммирования по значениям гидрофобности одного или нескольких CDR. Каждая из функций суммирования может представлять собой соотношение суммы значений, полученных для гидрофобных остатков CDR, и суммы значений, полученных для гидрофильных остатков CDR. Указанные значения могут представлять собой значения гидрофобности по шкале Эйзенберга. Один или несколько CDR могут включать один, два, три, четыре, пять или все шесть CDR. Отбор факторов масштабирования может дополнительно включать отбор первого фактора масштабирования, второго фактора масштабирования и третьего фактора масштабирования из набора факторов масштабирования для каждого одного или нескольких параметров водного раствора. Целевая функция, log10 от показателя могут включать сумму (общий заряд X первый фактор масштабирования) плюс (зарядовая асимметрия X второй фактор масштабирования), плюс (гидрофобность X третий фактор масштабирования).
Для каждого варианта осуществления, описанного в настоящем документе, способы могут дополнительно включать стадию мутагенеза одного или нескольких аминокислотных остатков в аминокислотной последовательности вариабельной области легкой цепи и/или тяжелой цепи антитела для создания целевого антитела, если показатель превышает предел вязкости. Стадия мутагенеза аминокислотных остатков в аминокислотной последовательности вариабельной области легкой цепи и/или тяжелой цепи может приводить к уменьшению гидрофобности, увеличению общего заряда и/или увеличению или уменьшению зарядовой асимметрии таким образом, что указанный показатель, характерный для целевого антитела, не превышает предел вязкости. Указанный способ может дополнительно подразумевать стадию получения целевого антитела.
Согласно дополнительным аспектам настоящее изобретение относится к отобранным, полученным антителам и/или антителам, которые, как было установлено, удовлетворяют заданному критерию, с помощью способов и устройства, описанных в настоящем документе
Клиренс
Физико-химическое свойство может представлять собой скорость фармакокинетического выведения антител. Заданный критерий может представлять собой предельное значение фармакокинетического выведения антитела. Заданный критерий может считаться удовлетворенным, если скорость клиренса антитела равна пределу скорости клиренса. Заданный критерий может считаться удовлетворенным, если скорость клиренса антитела меньше предела скорости клиренса. Предел скорости клиренса может составлять 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6 или 5 мл/кг/сутки. Предел скорости клиренса у яванского макака может составлять 10 мл/кг/сутки.
Далее будут рассмотрены основанные на определении скорости клиренса способы определения пригодности антитела для включения в состав терапевтического средства, отбора антитела из нескольких антител-кандидатов, получения антитела, модификации предсуществующего антитела и получения целевого антитела. Понятно, что одна или несколько стадий одного способа могут быть осуществлены в комбинации с одной или несколькими стадиями других способов.
Клиренс: способы определения соответствия или пригодности антитела для включения в состав терапевтического средства
Способы могут включать определение пригодности антитела для включения в состав терапевтического средства на основе клиренса. Способы могут включать расчет общего заряда, исходя из информации о структуре антител. Диапазон значений общего заряда может зависеть от параметров водного раствора. Общий заряд может попадать в пределы диапазона общих зарядов. Диапазон значений общего заряда может составлять от -4 до 12. Диапазон значений общего заряда может составлять от -2 до 6,2. Диапазон значений общего заряда может составлять от 0 до 6,2. Диапазон значений общего заряда может изменяться в зависимости от параметров раствора и размер выборки пробного набора антител.
Способы могут включать (а) расчет показателя гидрофобности, если значение общего заряда потенциально попадает в пределы диапазона значений общего заряда, исходя из информации о структуре одного или нескольких CDR, и (i) определение того, что антитело характеризуется скоростью клиренса, которая удовлетворяет заданному критерию, если показатель гидрофобности не превышает предела гидрофобности, или (ii) определение того, что антитело характеризуется скоростью клиренса, которая не удовлетворяет заданному критерию, если показатель гидрофобности превышает Предельное значение гидрофобности; и (б) определение того, что антитело характеризуется скоростью клиренса, которая не удовлетворяет заданному критерию, если значение общего заряда не попадает в диапазон значений общего заряда. Информация о структуре может представлять собой информацию о первичной структуре. Первичная структура может включать аминокислотную последовательность вариабельного домена легкой цепи (VL) и аминокислотную последовательность вариабельного домена тяжелой цепи (VH). Общий заряд может представлять собой общий заряд VH и VL при рН 5,5. Диапазон значений общего заряда может составлять от около -2,0 до около 6,2. Предельное значение гидрофобности может составлять около 4.
Способы могут включать расчет показателя гидрофобности, исходя из информации о структуре одного участка вариабельного домена, определяющего комплементарность. Способы могут включать расчет показателя гидрофобности, исходя из информации о структуре одного или нескольких участков, определяющих комплементарность, как описано в настоящем документе. Множество участков, определяющих комплементарность, может включать два, три, четыре пять или шесть участков, определяющих комплементарность. Показатель гидрофобности может быть рассчитан как сумма значений гидрофобности одного или нескольких участков, определяющих комплементарность. Один или несколько CDR могут относиться к легкой цепи (LC) CDR1, LC CDR3 и CDR3 тяжелой цепи (НС). Указанный способ может дополнительно включать стадию выделения антител.
В разделе иллюстративные результаты и графические материалы раскрыто соответствие показателя скорости клиренса.
Клиренс: способы отбора антител-кандидатов для включения в состав терапевтического средства
Способы могут включать отбор антитела из двух или более антител-кандидатов на основе скорости клиренса и могут включать одну или несколько стадий способа для пригодности антитела по скорости клиренса.
Например, антитело может быть отобрано из двух антител-кандидатов для включения в состав терапевтического средства. Способы отбора могут включать получение первой части информации о структуре первого антитела-кандидата. Первая часть информации о структуре может включать первую аминокислотную последовательность первого антитела-кандидата. Способы отбора могут включать получение второй части информации о структуре второго антитела-кандидата. Вторая часть информации о структуре может включать вторую аминокислотную последовательность второго антитела-кандидата. Способы могут включать расчет первого значения показателя общего заряда, исходя из первой части информации о структуре, и первого значения показателя гидрофобности, исходя из информации о структуре одного или нескольких CDR первого антитела-кандидата. Способы могут включать расчет второго значения показателя общего заряда, исходя из второй части информации о структуре, и второго значения показателя гидрофобности, исходя из информации о структуре одного или нескольких CDR второго антитела-кандидата.
Первый диапазон значений общего заряда и второй диапазон значений общего заряда могут зависеть от параметров водного раствора. Первый диапазон значений общего заряда и второй диапазон значений общего заряда могут зависеть от класса или подкласса первого антитела-кандидата и класса или подкласса второго антитела-кандидата, соответственно. Первый и второй диапазон значений общего заряда могут быть одинаковыми. Первый и второй диапазон значений общего заряда могут быть разными.
Способы могут включать отбор первого антитела-кандидата или второго антитела-кандидата, которые будут использованы в составе терапевтического средства, на основе относительного значения первого показателя и второго показателя. Способы могут включать отбор антитела-кандидата, которое обладает более низкой гидрофобностью, чем другое антитело-кандидат или антитела-кандидаты. Способы могут включать отбор антитела-кандидата, которое обладает скоростью клиренса, что удовлетворяет заданному критерию.
Клиренс: способы приготовления терапевтического средства
Способы приготовления могут включать установление предела скорости клиренса для антитела на основе поддерживающей дозы. Способы приготовления терапевтического средства могут включать одну или несколько стадий способа для определения пригодности антитела по скорости клиренса.
Способы приготовления могут включать определение поддерживающей дозы для терапевтического средства. Поддерживающая доза может зависеть от скорости фармакокинетического выведения антител. Скорость клиренса может представлять собой скорость клиренса антитела при целом ряде физиологических условий. Использование антитела в терапевтических целях предполагает наличие физиологических условий.
Способы могут включать получение или производство антител только в том случае, если антитело характеризуется скоростью клиренса, которая не превышает предела. Указанный способ может включать передачу по сети информации о структуре антитела; получение по сети значения общего заряда антитела, причем общий заряд рассчитывается, исходя из информации о структуре; получение по сети значения гидрофобности, рассчитанного, исходя из информации о структуре, исходя из информации об одном или нескольких участках антитела, определяющих комплементарность (CDR), если значение общего заряда попадает в диапазон значений общего заряда, и (i) определение того, что антитело характеризуется скоростью клиренса, которая удовлетворяет заданному критерию, если значение гидрофобности не превышает предела значений гидрофобности, или (ii) определение того, что антитело характеризуется скоростью клиренса, которая не удовлетворяет заданному критерию, если значение гидрофобности превышает предел значений гидрофобности; определение того, что антитело характеризуется скоростью клиренса, которая не удовлетворяет заданному критерию, если значение общего заряда не попадает в диапазон значений общего заряда; получение антител только в том случае, если установлено, что антитело характеризуется скоростью клиренса, которая удовлетворяет заданному критерию.
Настоящее изобретение также относится к способам получения антитела, которое обладает скоростью клиренса, что удовлетворяет заданному критерию, включающий стадии: расчета общего заряда антитела, исходя из информации о структуре антитела; расчет показателя гидрофобности, исходя из информации о структуре, исходя из информации об одном или нескольких участках антитела, определяющих комплементарность (CDR), если значение общего заряда попадает в диапазон значений общего заряда, и (i) определение того, что антитело характеризуется скоростью клиренса, которая удовлетворяет заданному критерию, если значение гидрофобности не превышает предельное значение гидрофобности, или (ii) определение того, что антитело характеризуется скоростью клиренса, которая не удовлетворяет заданному критерию, если значение гидрофобности превышает предел значений гидрофобности; определение того, что антитело характеризуется скоростью клиренса, которая не удовлетворяет заданному критерию, если значение общего заряда не попадает в диапазон значений общего заряда; получение антител только в том случае, если установлено, что антитело характеризуется скоростью клиренса, которая удовлетворяет заданному критерию.
Для каждого варианта осуществления, описанного в настоящем документе, расчет, исходя из информации о структуре, может включать расчет, исходя из информации о первичной структуре. Первичная структура может включать аминокислотную последовательность вариабельного домена легкой цепи (VL) и аминокислотную последовательность вариабельного домена тяжелой цепи (VH). Общий заряд может складываться из суммы общего заряда аминокислотной последовательности VL и общего заряда аминокислотной последовательности VH. Общий заряд может включать сумму общего заряда VH и общего заряда VL при рН около 5,5. Гидрофобность может включать итоговое значение функций суммирования по значениям гидрофобности одного или нескольких CDR. Функция суммирования может представлять собой соотношение суммы значений, полученных для гидрофобных остатков CDR, и суммы значений, полученных для гидрофильных остатков CDR. Указанные значения могут представлять собой значения гидрофобности по шкале Эйзенберга. Один или несколько CDR могут включать один, два, три, четыре, пять или все шесть CDR. Один или несколько CDR могут относиться к легкой цепи (LC) CDR1, LC CDR3 и CDR3 тяжелой цепи (НС). Скорость клиренса может составлять не более, чем около 10 мл/кг/сутки по результатам измерений у модельного животного яванского макака. Диапазон значений общего заряда может составлять от около -2,0 до около 6,2. Предельное значение гидрофобности может составлять около 4.
Способы могут включать мутагенез одного или нескольких аминокислотных остатков предсуществующего антитела для получения целевого антитела, осуществляемый таким образом, чтобы скорость клиренса целевого антитела не превышала предел скорости клиренса. Способы могут дополнительно включать стадии увеличения или уменьшения общего заряда таким образом, чтобы значение общего заряда целевого антитела попало в пределы диапазона значений общего заряда, и/или увеличения или уменьшения гидрофобности таким образом, чтобы значение гидрофобности целевого антитела не превышало предельное значение гидрофобности.
Способы могут включать определение для целевого антитела аминокислотной последовательности. Способы могут дополнительно включать стадию получения целевого антитела.
Согласно дополнительным аспектам настоящее изобретение относится к отобранным, полученным антителам и/или антителам, которые, как было установлено, удовлетворяют заданному критерию скорости клиренса с помощью способов и устройства, описанных в настоящем документе.
Лабильность остатка аспарагиновой кислоты
Физико-химическое свойство может представлять собой лабильность остатка аспарагиновой кислоты (Asp) антитела. Лабильность Asp может определяться изомеризацией остатка Asp.Остаток Asp может находиться в CDR антитела. Заданный критерий может представлять собой предел лабильности остатка Asp. Заданный критерий может считаться удовлетворенным, если лабильность Asp антитела равна пределу лабильности остатка Asp. Заданный критерий может считаться удовлетворенным, если лабильность Asp антитела меньше предела лабильности остатка Asp.Предел лабильности остатка Asp может составлять 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1% или меньше. Предел лабильности остатка Asp может составлять 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1% или меньше на протяжении двух недель при 40°С. Предел лабильности остатка Asp может составлять 5% или меньше на протяжении двух недель при 40°С.
Далее будут рассмотрены основанные на определении лабильности остатка Asp способы определения пригодности антитела для включения в состав терапевтического средства, отбора антитела из нескольких антител-кандидатов, получения антитела, модификации предсуществующего антитела и получения целевого антитела. Понятно, что одна или несколько стадий одного способа могут быть осуществлены в комбинации с одной или несколькими стадиями других способов.
Лабильность Asp: способы определения пригодности антитела для включения в состав терапевтического средства
Способы могут включать основанное на лабильности остатка Asp определение пригодности антитела для включения в состав терапевтического средства. Исходя из информации о структуре антител способы могут включать (а) расчет: (1) флуктуации α-углерода Asp, (2) усредненной по времени SASA остатка Asp и (3) усредненной по времени SASA атома азота основной цепи, связанного с остатком, расположенным непосредственно рядом с остатком Asp. Атом азота основной цепи может быть связан с остатком, расположенным в последовательности непосредственно рядом с остатком Asp; (б) отбор для антитела (i) фактора масштабирования флуктуации, (ii) фактора масштабирования площади поверхности остатка аспарагиновой кислоты и (iii) фактора масштабирования площади поверхности атома азота основной цепи; (в) расчет показателя, исходя из целевой функции, содержащей факторы масштабирования, причем указанный показатель соответствует лабильности остатка аспарагиновой кислоты; и (г) определение того, характеризуется ли антитело лабильностью аспарагиновой кислоты, которая удовлетворяет заданному критерию. Для расчета может быть использовано моделирование методом МД. Для моделирования методом МД может быть использован набор моделируемых параметров раствора и может быть использована явно заданная гидратация.
Остаток Asp может находиться в CDR. Аминокислотный остаток, расположенный непосредственно рядом с остатком аспарагиновой кислоты, находится в положении N+1 по отношению к остатку аспарагиновой кислоты в положении N.
Способы могут включать отбор факторов масштабирования. Факторы масштабирования могут представлять собой полученные факторы масштабирования. Факторы масштабирования могут включать факторы масштабирования флуктуации, соответствующие флуктуации α-углерода Asp. Факторы масштабирования могут включать фактор масштабирования SASA остатка Asp, соответствующий SASA остатка Asp. Факторы масштабирования могут включать фактор масштабирования SASA атома азота основной цепи, соответствующий SASA атома азота основной цепи. Факторы масштабирования могут быть отобраны из набора факторов масштабирования, который может включать множество факторов масштабирования флуктуации, множество факторов масштабирования SASA остатка Asp и множество факторов масштабирования SASA атома азота основной цепи.
Способы могут включать определение значения показателя с помощью электронно-вычислительной машины. Значение показателя можно определить, исходя из целевой функции. Целевая функция может включать факторы масштабирования. Показатель может соответствовать лабильности остатка Asp.
Способы могут включать сравнение показателя с заданным параметром предела лабильности остатка Asp для определения того, характеризуется ли антитело лабильностью Asp, которая удовлетворяет заданному критерию предела лабильности остатка Asp.
В целевой функции показатель может зависеть от числа Эйлера (основание е), возведенного в степень суммы:
(показатель флуктуации α-углерода Asp X фактор масштабирования флуктуации) плюс
(усредненная по времени SASA остатка Asp X фактор масштабирования SASA остатка Asp), плюс
(усредненная по времени доступная растворителю SASA атома азота основной цепи X фактор масштабирования SASA атома азота основной цепи). Целевая функция может иметь общую форму показатель = еконстант.есум..
Целевая функция может иметь общую форму показатель = 1/(еконстант.есум.). Целевая функция может иметь общую форму показатель = 1/(1+еконстант. eсум.).
Например, для моноклонального IgG1 при моделируемой температуре около 300 K с явно заданной гидратацией и другими моделируемыми параметрами раствора, которые описаны в разделе иллюстративные способы, фактор масштабирования флуктуации может составлять около 3,3; фактор масштабирования SASA остатка Asp может составлять около -22,2; и фактор масштабирования SASA атома азота основной цепи может составлять около 16,0.
Способы могут включать показатель, который является первым показателем, и первый показатель, округленный до одной значащей цифры для получения второго показателя. Второй показатель может быть равным либо 1, либо нулю. Второй показатель, который равен нулю, может свидетельствовать о том, что первый показатель удовлетворяет заданному критерию предела лабильности.
Лабильность Asp: способы отбора антител-кандидатов для включения в состав терапевтического средства
Способы могут включать отбор антитела на основе лабильности остатка Asp из двух или более антител-кандидатов и могут включать одну или несколько стадий способов для определения пригодности лабильности остатка Asp.
Способы отбора могут включать получение первой части информации о структуре первого антитела-кандидата. Первая часть информации о структуре может включать первую аминокислотную последовательность вариабельного домена первого антитела-кандидата. Способы отбора могут включать получение второй части информации о структуре второго антитела-кандидата. Вторая часть информации о структуре может включать вторую аминокислотную последовательность вариабельного домена второго антитела-кандидата.
Способы могут включать расчет первого набора физико-химических параметров, исходя из первой части информации о структуре, включая: (1) первый показатель флуктуации α-углерода первого остатка Asp первого антитела-кандидата, (2) первую усредненную по времени SASA первого остатка Asp и (3) первую усредненную по времени SASA первого атома азота основной цепи, связанного с остатком, расположенным непосредственно рядом с первым остатком Asp. Первый остаток Asp может находиться в CDR первого антитела-кандидата. Первый атом азота основной цепи может быть связан с остатком, расположенным непосредственно рядом в последовательности с первым остатком Asp.
Способы могут численный включать расчет второго набора физико-химических параметров, исходя из второй части информации о структуре, включая: (1) второй показатель флуктуации второго α-углерода остатка Asp второго антитела-кандидата, (2) вторую усредненную по времени SASA второго остатка Asp и (3) вторую усредненную по времени SASA второго атома азота основной цепи, связанного с остатком, расположенным непосредственно рядом со вторым остатком Asp. Второй остаток Asp может находиться в CDR второго антитела-кандидата. Второй атом азота основной цепи может быть связан с остатком, расположенным непосредственно рядом в последовательности со вторым остатком Asp.
Способы могут включать определение первого значения показателя с помощью электронно-вычислительной машины, исходя из первой целевой функции. Первая целевая функция может включать первый набор факторов масштабирования, соответствующий первому набору физико-химических параметров. Первое значение показателя может соответствовать первому антителу-кандидату. Первое значение показателя может соответствовать первому значению показателя лабильности остатка Asp первого антитела-кандидата. Первое значение показателя лабильности остатка Asp может соответствовать первому показателю изомеризации аспарагиновой кислоты.
Способы могут включать определение значения второго показателя с помощью электронно-вычислительной машины, исходя из второй целевой функции. Вторая целевая функция может включать второй набор факторов масштабирования, соответствующий второму набору физико-химических параметров. Второе значение показателя может соответствовать второму антителу-кандидату. Второе значение показателя может соответствовать второму значению показателя лабильности остатка Asp второго антитела-кандидата. Второе значение показателя лабильности остатка Asp может соответствовать второму показателю изомеризации аспарагиновой кислоты.
Каждый набор факторов масштабирования может включать фактор масштабирования флуктуации α-углерода, соответствующий флуктуации α-углерода, фактор масштабирования SASA остатка Asp, соответствующий SASA остатка Asp, и фактор масштабирования SASA азота основной цепи, соответствующий SASA азота основной цепи.
Первая целевая функция и вторая целевая функция могут включать факторы масштабирования для первого антитела-кандидата и второго антитела-кандидата, соответственно. При одних и тех же моделируемых параметрах раствора, что и для антитела, в отношении которого применяются способы определения пригодности лабильности остатка Asp, целевые функции для антител-кандидатов могут быть идентичными целевой функции, использованной в способах определения пригодности лабильности остатка Asp для антител-кандидатов того же класса или подкласса.
Если первое антитело-кандидат относится к тому же классу или подклассу, что и второе антитело-кандидат, то первый набор факторов масштабирования может быть идентичным второму набору факторов масштабирования. Если параметры раствора первого антитела-кандидата одинаковы с параметрами раствора второго антитела-кандидата, то первый набор факторов масштабирования может быть идентичным второму набору факторов масштабирования. Если значения гидратации для первого антитела-кандидата и второго антитела-кандидата одинаковы, то первый набор факторов масштабирования может быть идентичным второму набору факторов масштабирования.
Первый показатель может удовлетворять заданному критерию предела лабильности остатка Asp.Второй показатель может удовлетворять заданному критерию предела лабильности остатка Asp.
Способы могут включать отбор первого антитела-кандидата или второго антитела-кандидата, которые будут использованы в составе терапевтического средства, на основе относительного значения первого показателя и второго показателя. Способы могут включать отбор первого антитела-кандидата, если первый показатель ниже второго показателя. Способы могут включать отбор второго антитела-кандидата, если второй показатель ниже первого показателя. Способы могут дополнительно включать стадию измерения лабильности остатка Asp отобранного антитела. Способы могут дополнительно включать стадию получения отобранного антитела.
Лабильность Asp: способы приготовления терапевтического средства
Способы приготовления могут включать установление предела лабильности остатка Asp для антитела на основе, например, срока хранения для антитела. Способы получения антитела могут включать одну или несколько стадий способа для определения пригодности лабильности остатка Asp. Антитело может представлять собой терапевтическое средство или может быть включено в состав терапевтического средства.
Способы приготовления могут включать определение срока хранения. Срок хранения может зависеть от лабильности остатка Asp антитела, что может быть включено в состав терапевтического средства. Лабильность остатка аспарагиновой кислоты может определять изомеризацию аспарагиновой кислоты. Заданный критерий может представлять собой предел лабильности. Предел лабильности может быть основан на сроке хранения. Предел лабильности может составлять около 2,5% изомеризованных остатков аспарагиновой кислоты/неделю.
Способы могут включать получение антитела только в том случае, если указанный показатель не превышает предела, причем аминокислотная последовательность участка антитела, определяющего комплементарность (CDR), содержит остаток аспарагиновой кислоты. Указанный способ может включать установление предела лабильности остатка аспарагиновой кислоты для антитела, причем предел лабильности остатка аспарагиновой кислоты должен удовлетворять заданному критерию; передачу по сети информации о структуре антитела; получение по сети показателя, который соответствует лабильности остатка аспарагиновой кислоты антитела, причем указанный показатель рассчитывают, исходя из информации о структуре антитела; определение того, характеризуется ли антитело лабильностью аспарагиновой кислоты, которая удовлетворяет заданному критерию; и получение антител только в том случае, если указанный показатель не превышает предела вязкости.
Способы могут включать установление предела лабильности остатка аспарагиновой кислоты для антитела, причем предел лабильности остатка аспарагиновой кислоты должен удовлетворять заданному критерию; расчет показателя, который соответствует лабильности остатка аспарагиновой кислоты антитела, исходя из информации о структуре антитела; определение того, характеризуется ли антитело лабильностью аспарагиновой кислоты, которая удовлетворяет заданному критерию; и получение антитела, только в том случае, если указанный показатель не превышает предела лабильности остатка аспарагиновой кислоты.
Способы приготовления могут включать определение значения показателя, соответствующего лабильности остатка Asp антитела, с помощью электронно-вычислительной машины, исходя из информации о структуре антител. Определение значения показателя может быть осуществлено в соответствии со способами определения пригодности лабильности остатка Asp антитела.
Показатель может быть рассчитан по способу, который включает стадии: расчета (i) показателей среднеквадратичной флуктуации альфа-углерода, связанного с остатком аспарагиновой кислоты, исходя из аминокислотной последовательности CDR, (ii) усредненной по времени поверхности остатка аспарагиновой кислоты, доступной растворителю, и (iii) усредненной по времени доступной растворителю поверхности атома азота основной цепи, связанного с аминокислотным остатком, расположенным непосредственно рядом с остатком аспарагиновой кислоты; подбора для антитела (i) фактора масштабирования флуктуации, (ii) фактора масштабирования площади поверхности остатка аспарагиновой кислоты и (iii) фактора масштабирования площади поверхности атома азота основной цепи; и расчета показателя, исходя из целевой функции, содержащей факторы масштабирования, причем указанный показатель соответствует лабильности остатка аспарагиновой кислоты. Аминокислотный остаток, расположенный непосредственно рядом с остатком аспарагиновой кислоты, может находиться в положении N+1 по отношению к остатку аспарагиновой кислоты в положении N. Факторы масштабирования могут быть получены из данных по меньшей мере одного измерения лабильности остатка аспарагиновой кислоты по меньшей мере одного исследуемого антитела. Измерение лабильности остатка аспарагиновой кислоты по меньшей мере одного исследуемого антитела может включать инкубацию по меньшей мере одного исследуемого антитела при определенной температуре с последующим применением масс-спектрометрии и методов на основе ВЭЖХ. Отбор факторов масштабирования может включать отбор из набора факторов масштабирования для каждого одного или нескольких параметров водного раствора: (i) фактора масштабирования флуктуации, (ii) фактора масштабирования площади поверхности остатка аспарагиновой кислоты; и (iii) фактора масштабирования площади поверхности атома азота основной цепи. Целевая функция, показатель содержат число Эйлера, возведенное в степень суммы (флуктуация X фактор масштабирования флуктуации) плюс (усредненная по времени площадь поверхности остатка аспарагиновой кислоты, доступная растворителю X фактор масштабирования площади поверхности остатка аспарагиновой кислоты) плюс (усредненная по времени площадь поверхности атома азота основной цепи, доступная растворителю X фактор масштабирования площади поверхности атома азота основной цепи). Параметры водного раствора могут включать температуру, рН, тип буфера и ионную силу. Параметры водного раствора могут включать наличие 20 мМ гистидин-ацетатного буфера. Параметры водного раствора могут включать температуру около 313 K. Показатель представляет собой первый показатель, и первый показатель может быть округлен до одной значащей цифры для получения второго показателя, причем второй показатель равен нулю, что соответствует первому показателю, который не превышает предела вязкости, и второй показатель равен 1, что соответствует первому показателю, который превышает предел вязкости. Аминокислотный остаток, расположенный непосредственно рядом с остатком аспарагиновой кислоты, может быть отобран из группы, состоящей из глицина, треонина, аспарагиновой кислоты и аланина. Способы могут включать конструирование целевого антитела таким образом, чтобы лабильность Asp терапевтического средства не превышала предела лабильности остатка Asp.
Для каждого варианта осуществления, описанного в настоящем документе, способы могут включать стадию мутагенеза одного или нескольких аминокислотных остатков предсуществующего антитела для создания целевого антитела таким образом, чтобы показатель целевого антитела удовлетворял заданному критерию. Способы могут дополнительно включать стадию измерения лабильности остатка Asp целевого антитела. Способы могут дополнительно включать стадию получения целевого антитела.
Способы могут включать определение аминокислотной последовательности для целевого антитела. Аминокислотная последовательность может соответствовать показателю лабильности остатка Asp, который ниже предела лабильности остатка Asp.
Согласно дополнительным аспектам настоящее изобретение относится к отобранным, полученным антителам и/или антителам, которые, как было установлено, удовлетворяют заданному критерию лабильности остатка аспарагиновой кислоты с помощью способов и устройства, описанных в настоящем документе.
Лабильность остатка триптофана
Физико-химическое свойство может представлять собой лабильность остатка триптофана (Trp) антитела. Лабильность остатка Trp может определяться окислением остатка Trp. Остаток Trp может находиться в CDR антитела. Заданный критерий может представлять предел лабильности остатка Trp. Заданный критерий может считаться удовлетворенным, если лабильность остатка Trp антитела равна пределу лабильности остатка Trp. Заданный критерий может считаться удовлетворенным, если лабильность остатка Trp антитела меньше предела лабильности остатка Trp. Предел лабильности остатка Trp может определиться окислением его остатков на 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15 или 10%. Предел лабильности остатка Trp можно установить для антитела с использованием ряда определенных параметров.
Далее будут рассмотрены основанные на определении лабильности остатка Trp способы определения пригодности антитела для включения в состав терапевтического средства, отбора антитела из нескольких антител-кандидатов, получения антитела, модификации предсуществующего антитела и получения целевого антитела. Понятно, что одна или несколько стадий одного способа могут быть осуществлены в комбинации с одной или несколькими стадиями других способов.
Лабильность остатка Trp: способы определения пригодности антитела для включения в состав терапевтического средства
Способы могут включать определение пригодности антитела для включения в состав терапевтического средства на основе лабильности остатка Trp. Способы могут включать расчет усредненной по времени SASA остатка Trp, находящегося в CDR, исходя из информации о структуре антител. Для расчета может быть использовано моделирование методом МД. Для моделирования методом МД может быть использован набор моделируемых параметров раствора и может быть использована явно заданная гидратация.
Способы могут включать стадии (а) расчета усредненной по времени SASA остатка триптофана, исходя из аминокислотной последовательности участка антитела, определяющего комплементарность (CDR); (б) сравнения усредненной по времени SASA с отсекаемым значением; и (в) определение того, что антитело характеризуется лабильностью остатка триптофана, которая удовлетворяет заданному критерию, если усредненная по времени SASA меньше предельного значение. Отсекаемое значение для SASA боковой цепи триптофана может составлять 80 Å2. Аминокислотная последовательность вариабельного домена тяжелой цепи (VH) и аминокислотная последовательность вариабельного домена легкой цепи (VL) могут содержать только один остаток триптофана.
В качестве альтернативы способы могут включать определение значения показателя с помощью электронно-вычислительной машины. Значение показателя можно определить, исходя из целевой функции. Показатель может соответствовать лабильности остатка Trp.
Способы могут включать сравнение показателя с заданным параметром предела лабильности остатка Trp для определения того, характеризуется ли антитело лабильностью остатка Trp, которая удовлетворяет заданному критерию предела лабильности остатка Trp.
В целевой функции показатель может зависеть от усредненной по времени SASA остатка Trp.
Способы могут дополнительно включать стадию получения антитела, что характеризуется лабильностью остатка Trp, которая удовлетворяет заданному критерию.
Лабильность остатка Trp: способы отбора антител-кандидатов для включения в состав терапевтического средства
Способы могут включать отбор антитела из двух или более антител-кандидатов на основе лабильности остатка Trp, и могут не включать никаких, могут включать некоторые или все стадии способа для определения пригодности антитела по лабильности остатка Trp.
Способы отбора могут включать получение первой части информации о структуре первого антитела-кандидата. Первая часть информации о структуре может включать первую аминокислотную последовательность вариабельного домена первого антитела-кандидата. Способы отбора могут включать получение второй части информации о структуре второго антитела-кандидата. Вторая часть информации о структуре может включать вторую аминокислотную последовательность вариабельного домена второго антитела-кандидата.
Способы могут включать расчет первой усредненной по времени SASA первого остатка Trp, исходя из первой части информации о структуре. Первый остаток Trp может находиться в CDR первого антитела-кандидата.
Способы могут включать расчет второй усредненной по времени SASA второго остатка Trp, исходя из второй части информации о структуре. Второй остаток Trp может находиться в CDR второго антитела-кандидата.
Способы могут включать отбор первого или второго антитела, если первое или второе антитело характеризуются усредненной по времени SASA остатка Trp, которая меньше отсекаемого значения.
Способы могут включать определение первого значения показателя с помощью электронно-вычислительной машины, исходя из первой целевой функции. Первое значение показателя может соответствовать первому антителу-кандидату. Первое значение показателя может соответствовать первому значению показателя лабильности остатка Trp первого антитела-кандидата. Первое значение показателя лабильности Trp может соответствовать первой степени окисления Trp.
Способы могут включать определение значения второго показателя с помощью электронно-вычислительной машины, исходя из второй целевой функции. Второе значение показателя может соответствовать второму антителу-кандидату. Второе значение показателя может соответствовать второму значению показателя лабильности остатка Trp второго антитела-кандидата. Второе значение показателя лабильности Trp может соответствовать второй степени окисления триптофана.
Первый показатель может удовлетворять заданному критерию предела лабильности остатка Trp. Второй показатель может удовлетворять заданному критерию предела лабильности остатка Trp.
Способы могут включать отбор первого антитела-кандидата или второго антитела-кандидата, которые будут использованы в составе терапевтического средства, на основе относительного значения первого показателя и второго показателя. Способы могут включать отбор первого антитела-кандидата, если первый показатель ниже второго показателя. Способы могут включать отбор второго антитела-кандидата, если второй показатель ниже первого показателя.
Лабильность остатка Trp: способы приготовления терапевтического средства
Способы приготовления могут включать установление для антитела предела лабильности остатка Trp. Способы приготовления терапевтического средства могут включать одну или несколько стадий способа для определения пригодности антитела по лабильности остатка Trp. Предел лабильности остатка Trp для антитела может быть основан на сроке хранения. Лабильность остатка триптофана может определяться окислением триптофана. Антитело может представлять собой терапевтическое средство.
Способы приготовления могут включать определение срока хранения. Срок хранения может зависеть от лабильности остатка Trp антитела, что может быть включено в состав терапевтического средства.
Настоящее изобретение также относится к способам получения антитела, которое характеризуется лабильностью остатков триптофана, что удовлетворяет заданному критерию, причем способ включает стадию передачи по сети информации о структуре антитела; получения по сети значения усредненной по времени площади поверхности остатка триптофана участка антитела, определяющего комплементарность (CDR), доступной растворителю, усредненной по времени площади поверхности, доступной растворителю, рассчитанной, исходя из информации о структуре, исходя из аминокислотной последовательности CDR; сравнения усредненной по времени площади поверхности, доступной растворителю, с отсекаемым значением; и определения того, характеризуется ли антитело лабильностью остатков триптофана, которая удовлетворяет заданному критерию, если усредненная по времени площадь поверхности, доступная растворителю, меньше отсекаемого значения; и получения антитела только в том случае, если установлено, что антитело характеризуется лабильностью, которая удовлетворяет заданному критерию.
Способы могут включать стадию расчета усредненной по времени SASA остатка триптофана; сравнения усредненной по времени SASA с отсекаемым значением; и определения того, что антитело характеризуется лабильностью остатка триптофана, которая удовлетворяет заданному критерию, если усредненная по времени SASA меньше предельного значение. Способы могут дополнительно включать получение антитела, которое удовлетворяет заданному критерию.
Для каждого варианта осуществления, описанного в настоящем документе, степень гидратации может послужить основой для расчета усредненной по времени площади поверхности, доступной растворителю. Степень гидратации может представлять собой параметр, используемый в компьютерном моделировании методом молекулярной динамики. Моделирование методом молекулярной динамики может быть осуществлено с использованием программного обеспечения для моделирования AMBER. Отсекаемое значение для площади поверхности боковой цепи триптофана, доступной растворителю, может составлять около 80 Å2. Поверхность боковой цепи триптофана, доступную растворителю, можно определить с использованием программного обеспечения AREAIMOL. Аминокислотные последовательности всех шести CDR антитела могут содержать только один остаток триптофана. Указанный способ может дополнительно подразумевать стадию измерения лабильности остатка Trp если установлено, что антитело характеризуется лабильностью Trp, которая удовлетворяет заданному критерию.
Способы приготовления могут включать определение значения показателя, соответствующего лабильности остатка Trp антитела, с помощью электронно-вычислительной машины, исходя из информации о структуре антител. Определение значения показателя может быть осуществлено в соответствии со способами определения пригодности антитела на основе лабильности остатков Trp.
Способы могут включать получение антитела только в том случае, если указанный показатель не превышает предела.
Способы могут включать замещение остатка Trp другим остатком, отличным от Trp, в предсуществующем антителе для создания целевого антитела. Способы могут дополнительно включать стадию получения целевого антитела.
Согласно дополнительным аспектам настоящее изобретение относится к отобранным, полученным антителам и/или антителам, которые, как было установлено, удовлетворяют заданному критерию лабильности остатка триптофана с помощью способов и устройства, описанных в настоящем документе
Примеры
Иллюстративные способы
Понятно, что исследуемые антитела могут быть включены в пробный набор антител, рассматриваемый ниже.
Понятно, что факторы масштабирования могут называться «коэффициентами», что рассматривается ниже.
Понятно, что ни один из признаков, описанных в связи с иллюстративными способами или иллюстративными результатами, как подразумевается, не ограничивается иллюстративным способом или иллюстративным результатом, в связи с которым описан данный признак.
мАт
Использованные мАт представляли собой иллюстративные моноклональные антитела IgG1, полученные путем экспрессии в клетках яичников китайского хомячка, и очищенные с использованием хроматографических методов, включая аффинную очистку с помощью хроматографии с белком А и ионообменную хроматографию.
Структурные параметры, определяемые на основе последовательности
Заряд
Общий заряд для заданной последовательности при заданном рН рассчитывали путем сложения зарядов всех заряженных аминокислот с использованием известных pKa боковых цепей (см., например, Berg, J.M., Tymoczko, J.L. & Stryer, L. Biochemistry. (W.H. Freeman, Basingstoke)) и уравнение Хендерсона-Хассельбаха. PKa Cys не учитывалась, допуская, что все Cys вовлечены в образование дисульфидных связей.
Параметр зарядовой асимметрии Fv (FvCAP)
FvCAP был разработан для определения зарядовой асимметрии между VH- и VL-доменами. FvCAP был просто рассчитан путем произведения общего заряда на VH-домене и VL-домене. Отрицательное произведение, таким образом, будет представлять наличие зарядовой асимметрии между двумя доменами, тогда как положительное произведение будет представлять наличие на двух доменах зарядов одинакового знака.
Показатель гидрофобности (HI)
HI был разработан для обозначения соотношения гидрофобных аминокислот к гидрофильным аминокислотам. Значение относительной силы гидрофобности каждой аминокислоты было взвешено с использованием шкалы гидрофобности Эйзенберга в этих рассчетах (см., например, Eisenberg, D., Weiss, R.M., Terwilliger, Т.С. & Wilcox, W. Hydrophobic moments and protein structure. Faraday Symposia of the Chemical Society 17, 109-120 (1982)). Все аминокислоты с положительным значением по данной шкале были отнесены к гидрофобным, тогда как, аминокислоты с отрицательными значениями по данной шкале были отнесены к гидрофильным.
HI был определен как: HI=(niEi/njEj), где i представляет собой гидрофобные аминокислоты, т.е., A, F, I, L, V, W, Y, a j представляет собой гидрофильные аминокислоты, т.е., D, Е, G, Н, К, М, N, Q, R, S, Т; n представляет собой номер каждой аминокислоты, а Е представляет собой значение по шкале Эйзенберга для каждой аминокислоты. Данный расчет может быть произведен для трехмерной структуры белка, причем при таком расчете параметр n заменяют на S, причем S определяется как SASA каждой аминокислоты (фиг. 16).
Физико-химические свойства
Вязкость
Измерения вязкости осуществляли с использованием ротационного реометра Anton Paar Physica MCR 501 типа конус-пластина с коаксиальными цилиндрами (Anton Paar, Грац, Австрия). Получали растворы антител с заданными концентрациями, затем 70 мкл каждого образца раствора белков распределяли по пластине для образцов и опускали конус. Была обеспечена защита образцов от испарения и контроль температуры на уровне 25+/- 5оС. Вязкость образцов определяли по измерению крутящего момента каждую секунду в течение 60 секунд с использованием постоянной скорости сдвига 1000 с-1. Результаты измерений вязкости представляли в виде среднего значения по итогам устойчивых измерений вязкости с использованием трех повторностей. Анализ образцов и представление данных осуществляли с использованием программного обеспечения Anton Paar RheoPlus.
Клиренс
Значения клиренса у яванского макака, использованные в этом исследовании, были получены из ранее опубликованных данных (см., например, 
, I. et al. А strategy for risk mitigation of antibodies with fast clearance. mAbs 4, 753-760).
Моделирование методом МД
Исходные структуры для МД
Данные по структуре Fab были получены либо исходя из трехмерной кристаллической структуры (при наличии таковой), либо из гомологичной модели, созданной с использованием локальной адаптации с помощью Modeller (см., например, Sali, А. & Blundell, T.L. Comparative Protein Modeling by Satisfaction of Spatial Restraints. J Mol Biol 234, 779-815 (1993)). Fab-домен был использован в качестве исходной структуры для МД перед добавлением ионов (в случае необходимости) и молекул явно заданного растворителя.
МД с использованием GROMACS для анализа изомеризации аспартата
Моделирование Fab методом МД проводили с использованием пакета программ для моделирования Gromacs 4,0 (см., например, Hess, В., Kutzner, С, van der Spoel, D. & Lindahl, E. GROMACS 4: Algorithms for highly efficient, load-balanced, and scalable molecular simulation. Journal of Chemical Theory and Computation 4, 435-447 (2008)). Силовое поле OPLSAA (см., например, Jorgensen, W.L., Maxwell, D.S. & TiradoRives, J. Development and testing of the OPLS all-atom force field on conformational energetics and properties of organic liquids. J Am Chem Soc 118, 11225-11236 (1996); Xu, Z.T., Luo, H.H. & Tieleman, D.P. Modifying the OPLS-AA force field to improve hydration free energies for several amino acid side chains using new atomic charges and an off-plane charge model for aromatic residues. J Comput Chem 28, 689-697 (2007)) было использовано для расчета атомных движений. Зарядовое состояние титруемых остатков оценивали с использованием эмпирического способа PROPKA (см., например, Li, Н., Robertson, A.D. & Jensen, J.H. Very fast empirical prediction and rationalization of protein pKa values. Proteins 61, 704-721 (2005); Bas, D.C., Rogers, D.M. & Jensen, J.H. Very fast prediction and rationalization of pKa values for protein-ligand complexes. Proteins 73, 765-783 (2008)). Для всех остатков было задано каноническое состояние протонирования.
Fab- и Fv-фрагменты были полностью гидратированы с использованием молекул воды TIP3P (см., например, Jorgensen, W.L., Chandrasekhar, J., Madura, J.D., Impey, R.W. & Klein, M.L. Comparison of Simple Potential Functions for Simulating Liquid Water. J Chem Phys 79, 926-935 (1983)). Приблизительно 10000 молекул воды были использованы для гидратации Fv и 25500 молекул воды были использованы для гидратации Fab. Атомы хлора или натрия были добавлены для нейтрализации общего заряда системы в случае необходимости. В каждом моделировании были использованы октаэдральные периодические граничные условия. Электростатические взаимодействия были рассчитаны с использованием РМЕ (см., например, Darden, Т., York, D. & Pedersen, L. Particle Mesh Ewald - an N.Log(N) Method for Ewald Sums in Large Systems. J Chem Phys 98, 10089-10092 (1993)) с отсечением электростатических взаимодействий в реальном пространстве при 1,0 нм. Потенциал Леннарда-Джонса, с помощью которого описывается ван-дер-ваальсово взаимодействие, отсекался при 1,0 нм. Алгоритм Settle (см., например, Miyamoto, S. & Kollman, P.A. Settle - an Analytical Version of the Shake and Rattle Algorithm for Rigid Water Models. J Comput Chem 13, 952-962 (1992)) использовали для ограничения длин связей и углов молекул воды, Lines использовали для ограничения всех других длин связей (см., например, Hess, В., Bekker, Н., Berendsen, H.J.С. & Fraaije, J.G.E.M. LINCS: линейный решатель задач удовлетворения ограничений молекулярного моделирования. J Comput Chem 18, 1463-1472 (1997)) и алгоритм vsite в Gromacs 4,0 были использованы для устранения движений алкильных и амидных водородных атомов, что позволило использовать временной шаг 4 фемтосекунды (фс).
В ходе моделирования расчетов температура системы поддерживалась постоянной путем ее сообщения с термостатом с температурой 300 К с использованием алгоритма V-rescale (см., например, Bussi, G., Donadio, D. & Parrinello, M. Canonical sampling through velocity rescaling. J Chem Phys 126, (2007)). На протяжении равновесного состояния продолжительностью 200 пикосекунд (пс), обеспечивающего конвергенцию плотности системы, поддерживалось постоянное давление на уровне 1,0 атмосферы путем присоединения системы к баростату (см., например, Berendsen, H.J.С, Postma, J.P.M., Vangunsteren, W.F., Dinola, A. & Haak, J.R. Molecular-Dynamics with Coupling to an External Bath. J Chem Phys 81, 3684-3690 (1984)). По достижению равновесного состояния моделирование проводили при постоянном объеме. Траектории, полученные в результате этого моделирования, анализировали с помощью различных инструментов, доступных в пакете программ GROMACS. Все SASA рассчитывают с использованием опции g_sas программы GROMACS (см., например, Eisenhaber, F., Lijnzaad, P., Argos, P., Sander, C. & Scharf, M. The double cube lattice method: efficient approaches to numerical integration of surface area and volume and to dot surface contouring of molecular assemblies. J. Comp. Chem. 16, 273-284 (1995)); расчет взаимной информации был проводился локально по аналогии с Lange и 
(см., например, Kortkhonjia, Е. et al. Solution dynamics of monoclonal antibodies: Experimental and computational approach. mAb In Press (2013); Lange, O.F. & Grubmuller, H. Full correlation analysis of conformational protein dynamics. Proteins-Structure Function and Genetics 70, 1294-1312 (2008)); энтропию Шеннона для распределений ϕ-ψ рассчитывают как 
где p(i,j) представляет собой вероятность обнаружения {ϕ,ψ} в интервале {ϕi,ψj}, интервалы определяются как ячейка сетки с шагом 3° и распределения ϕ-ψ получают из g_rama; опции g_rsmf, g_hbond и dssp программы GROMACS были использованы для расчета среднеквадратичных флуктуаций, водородных связей и состояния вторичной структуры, соответственно. Подробности, касающиеся аналитической методологии для энтропии Шеннона и взаимной информации, были опубликованы ранее (см., например, Kortkhonjia, Е. et al. Solution dynamics of monoclonal antibodies: Experimental and computational approach. mAb In Press (2013)).
МД с использованием AMBER для анализа окисления триптофана
Моделирование Fab-фрагментов методом МД проводили с использованием пакета программ для моделирования Amber 11 (см., например, D.A. Case, T.A.D., Т.Е. Cheatham, III, C.L. Simmerling, J. Wang, R.E. Duke, R. Luo, R.C. Walker, W. Zhang, K.M. Merz, B. Roberts, B. Wang, S. Hayik, A. Roitberg, G. Seabra, I.K., K.F. Wong, F. Paesani, J. Vanicek, X. Wu, S.R. Brozell, T. Steinbrecher, H. Gohlke, Q. Cai, X. Ye, J. Wang, M.-J. Hsieh, G. Cui, D.R. Roe, D.H. & Mathews, M.G.S., C. Sagui, V. Babin, T. Luchko, S. Gusarov, A. Kovalenko, and P.A. Kollman University of California, San Francisco; 2011)). Использовали силовое поле FF99SB с фиксированным зарядом. Для всех остатков было задано каноническое состояние протонирования на основе их термодинамической pKa.
Fab-фрагменты были полностью гидратированы с использованием молекул воды TIP3P. Приблизительно 35000 молекул воды были использованы для гидратации Fab. Атомы хлора или натрия были добавлены для нейтрализации общего заряда системы. В каждом моделировании были использованы октаэдральные периодические граничные условия. Электростатические взаимодействия были рассчитаны с использованием РМЕ с отсекаемым значением расстояния для электростатических взаимодействий 0,8 нм. Алгоритм SHAKE использовали для устранения движений водорода в алкильных и амидных группах, что позволило использовать временной шаг 3 фс.
В ходе моделирования расчетов температура системы поддерживалась постоянной путем ее сообщения с термостатом с температурой 300 K, с использованием динамики Ланжевена с частотой 3/пс. В ходе минимизации энергии, уравновешивания и последующих расчетов генераций МД траекторий давление в системе поддерживалось постоянным путем ее сообщения с баростатом с давлением 1 атм.
Траектории, полученные в результате моделирования методом МД, анализировали с помощью общедоступных инструментов. Все SASA рассчитывают с использованием Areaimol, программы, которая входит в состав программы ССП4 (см., например, Bailey, S. The Сср4 Suite - Programs for Protein Crystallography. Acta Crystallogr D 50, 760-763 (1994)). SASA определяли для каждого боковой цепи триптофана, но включая атомы пептидного каркаса.
Окисление Trp, индуцированное 2,2'-азобис(2-амидинопропан)дигидрохлоридом (ААРН)
Индукцию окисления с помощью ААРН, осуществляли путем смешивания раствора мАт с ААРН в конечных концентрациях 1 мг/мл и 1 мМ соответственно (см., например, Ji, J.A., Zhang, В., Cheng, W. & Wang, Y.J. Methionine, tryptophan, and histidine oxidation in a model protein, PTH: Mechanisms and stabilization. Journal of Pharmaceutical Sciences 98, 4485-4500 (2009)). Растворы инкубировали при 40°C в течение 16 часов. Реакцию останавливали путем добавления 20 мМ Met, после чего производили замену буфера на 20 мМ буфер при рН 5,5 с использованием обессоливающих колонок PD-10. Растворы затем анализировали с использованием триптического гидролиза, после чего проводили LC-MS/MS для анализа сайт-специфического окисления Trp. Хроматограммы по выделенному иону соответствующих пептидов интегрировали ручным способом с использованием Xcalibur Qual Browser. Впоследствии рассчитывали относительный процент окисления путем деления площади пиков, образованных ионами окисленных пептидов, на сумму площадей пиков, образованных ионами окисленных и соответствующих неокисленных пептидов.
Экспериментальное определение скоростей распада Asp
Растворы мАт заменяли буфером с использованием центрифужных ультрафильтров Centricon с окончательным составом раствора: 5 мг/мл белка в 20 мМ буферном растворе при рН 5,5, 240 мМ сахарозы. Образцы помещали на 40°С и отбирали на t=0, 14 сутки и 28 сутки.
Триптическое пептидное картирование с помощью LC-MS/MS
Подвергнутые термической обработке образцы анализировали с использованием расщепления с образованием триптических пептидов, после чего осуществляли LC-MS/MS. Образцы белков подвергали расщеплению согласно опубликованным протоколам с незначительными модификациями (см., например, Yu, Х.С. et al. Accurate determination of succinimide degradation products using high fidelity trypsin digestion peptide map analysis. Analytical chemistry 83, 5912-5919 (2011)).
Пептидное картирование осуществляли на системе Agilent 1200 для ВЭЖХ, оборудованной колонкой Jupiter С18 (Phenomenex, 2,0×250 мм, размер частиц 5 мкм) и присоединенной к масс-спектрометру Thermo Fisher LTQ Orbitrap. Растворитель A состоял из 0,1% TFA в воде, и растворитель В состоял из 0,09% TFA в 90% ацетонитриле. Использовали двухступенчатый градиент; 0 - 10% В за 20 минут с последующими от 10 до 40% В в течение 137 минут. Скорость потока составляла 0,25 мл/мин, температура колонки составляла 55°С и количество белка в пробе составляло 22 мкг. Уровень распада на каждом сайте определяли с помощью хроматографии по выделенному иону (EIC) с использованием программного обеспечения Xcalibur (см., например, Yu, Х.С. et al. Accurate determination of succinimide degradation products using high fidelity trypsin digestion peptide map analysis. Analytical chemistry 83, 5912-5919 (2011)).
Регрессионный анализ
Регрессию на главные компоненты и логистический регрессивный анализ осуществляли с использованием XLSTAT® (Addinsoft, Нью Йорк, Нью Йорк).
Иллюстративные результаты
Вязкость
Вязкость может иметь важное значение для приготовления и доставки высококонцентрированных растворов мАт (см., например, Shire, S.J., Shahrokh, Z. & Liu, J. Challenges in the development of high protein concentration formulations. Journal of Pharmaceutical Sciences 93, 1390-1402 (2004)). Было отмечено, что мАт, различающиеся главным образом только по последовательности участков, определяющих комплементарность, (CDR), могут характеризоваться целым рядом профилей вязкости-концентрации при сходных условиях напряжения сдвига (фиг. 7). Для сходных изотипов IgG вариабельный домен Fv (и находящиеся в его пределах CDR) может играть важную роль в определении межмолекулярных взаимодействий, что приводят к различиям в вязкости (см., например, Kanai, S., Liu, J., Patapoff, Т. & Shire, S.J. Reversible self-association of a concentrated monoclonal antibody solution mediated by Fab-Fab interaction that impacts solution viscosity. Journal of Pharmaceutical Sciences (2008); Liu, J., Nguyen, M.D.H., Andya, J.D. & Shire, S.J. Reversible self-association increases the viscosity of a concentrated monoclonal antibody in aqueous solution. Journal of Pharmaceutical Sciences 94, 1928-1940 (2005)). Одной из целей настоящего изобретения было определить, какие параметры можно получить из CDR и Fv, чтобы установить элементы, вносящие вклад в гидрофобные и электростатические взаимодействия (см., например, Du, W. & Klibanov, A.M. Hydrophobic salts markedly diminish viscosity of concentrated protein solutions. Biotechnology and Bioengineering 108, 632-636; Yadav, S., Liu, J., Shire, S.J. & Kalonia, D.S. Specific interactions in high concentration antibody solutions resulting in high viscosity. Journal of Pharmaceutical Sciences 99, 1152-1168). Внимание было сосредоточено только на последовательности, поскольку это является самым простым способом получения и анализа данных. Однако следует отметить, что любые из параметров, которые указаны ниже, что рассчитывают по последовательности, можно также рассчитать на основе анализа пространственной структуры (фиг. 15 и 16).
Были рассчитаны следующие параметры: а) общий заряд Fv при заданном рН (например, рН 5,5), б) параметр зарядовой асимметрии Fv (FvCAP) и с) показатель гидрофобности (HI) CDR или Fv. Общий заряд потенциально может вносить вклад во взаимодействия типа отталкивания, тогда как FvCAP и HI могут вносить вклад во взаимодействия типа притяжения. Параметр FvCAP представляет собой зарядовую асимметрию между VH- и VL-доменом. Была выдвинута гипотеза о том, что наличие противоположного общего заряда между VH- и VL-доменами (отрицательный FvCAP) обеспечит возможность для взаимодействия Fv-домена с другим Fv-доменом посредством взаимодействия, подобного дипольному, или с другим заряженным участком, присутствующим на мАт (см., например, Yadav, S., Liu, J., Shire, S.J. & Kalonia, D.S. Specific interactions in high concentration antibody solutions resulting in high viscosity. Journal of Pharmaceutical Sciences 99, 1152-1168; Yadav, S. et al. Establishing a Link Between Amino Acid Sequences and Self-Associating and Viscoelastic Behavior of Two Closely Related Monoclonal Antibodies. Pharmaceutical Research 28, 1750-1764). Ожидалось, что большее отрицательное значение FvCAP приведет к более сильным взаимодействиям типа притяжения по сравнению с меньшим отрицательным или положительным значением. Следует отметить, что фактическая структурная конформация может приводить к такому распределению зарядовой асимметрии, которое нельзя установить по последовательности, как было определено выше, тем не менее, в расчетах подход на основе информации о последовательности в качестве первого приближения обеспечивает возможность более простого определения недостатка зарядовой симметрии по меньшей мере в одном измерении. При сравнении этих параметров в отношении целого ряда мАт (фиг. 8А-8С) был отмечен широкий диапазон параметров, даже если главное различие в последовательности заключалось в CDR-области (все мАт изотипа IgG1). Значения HI, рассчитанные для CDR, были такими же, как и значения, рассчитанные для Fv (фиг. 17), таким образом, первые были использованы для дальнейшего анализа.
Далее были изучены корреляции между этими параметрами и экспериментальными значениями вязкости при двух разных параметрах раствора с использованием пробного набора из 10 мАт. В качестве растворов с двумя разными параметрами раствора были использованы 20 мМ буферный раствор низкой ионной силы (гистидин-ацетатный) при рН 5,5 (фиг. 9А-9С) и 20 мМ буферный раствор высокой ионной силы (+ 200 мМ аргинин HCl) при рН 5,5 (фиг. 10А-10С). В случае буфера низкой ионной силы, наблюдалась значительная корреляция между зарядом Fv и вязкостью (коэффициент корреляции Пирсона = -0,8) и между FvCAP и вязкостью (коэффициент корреляции Пирсона = -0,9). Однако между HI и вязкостью наблюдалась только слабая корреляция. Таким образом, оказалось, что электростатические взаимодействия играют основную роль в регуляции вязкости, причем гидрофобность в меньшей степени влияет на общую вязкость раствора этих мАт. Более сильная корреляция между FvCAP и вязкостью свидетельствует о том, что зарядовая асимметрия между VH- и VL-доменом также потенциально сыграла некоторую роль в регуляции вязкости. Для буфера с высокой ионной силой (фиг. 10А-10С) имелась корреляция между зарядом Fv и вязкостью (коэффициент корреляции Пирсона = -0,9) и между FvCAP и вязкостью (коэффициент корреляции Пирсона = -0,8). Более слабая корреляция была отмечена между HI и вязкостью, что указывало на то, что в этих условиях все параметры способствовали регуляции вязкости.
На следующем этапе был использован анализ PCR в качестве инструмента многомерной (многопеременной) регрессии для оценки его пригодности в разработке прогностической модели для вязкости. Данные вязкости в условиях буфера высокой ионной силы были использован в качестве иллюстративного примера наряду с теоретически полученными параметрами (фиг. 1А). Данные вязкости при 150 мг/мл и 180 мг/мл при 25°С были использованы в качестве независимых переменных, тогда как заряд Fv при рН 5,5 (также может быть представлен как q), Fv САР при рН 5,5 (также может быть представлен как qCAP) и HI (также может быть представлен как φ) были использованы в качестве зависимых переменных. На фиг. 1В показаны данные вязкости и рассчитанные параметры, которые не включают HI, для условий низкой ионной силы при 150 мг/мл при 25°С для пробного набора 10 мАт (частично перекрываются с исследуемым набором из 10 мАт в условиях высокой ионной силы). На фиг. 11А и 11В показан результат анализа PCR с использованием пробного набора из 10 мАт в условиях высокой ионной силы для 150 мг/мл и 180 мг/мл, соответственно, где показан график зависимости наблюдаемых экспериментальных значений вязкости от прогнозируемых значений вязкости, которые были получены с помощью уравнения наилучшего соответствия с 90% доверительным интервалом. Уравнение наилучшего соответствия описано ниже:
В дополнительных экспериментах исследовали пробный набор из 14 мАт. Вместо расчета HI для CDR в этих экспериментах был рассчитан HI для Fv. Анализ PCR был использован в качестве инструмента многопеременной регрессии для оценки его пригодности в разработке прогностической модели для вязкости. На фиг. 11С показан результат анализа PCR, в котором наблюдаемые экспериментальные значения вязкости при 180 мг/мл для различных мАт нанесены на график зависимости от прогнозируемых значений вязкости, которые были получены с помощью уравнения наилучшего соответствия с 90% доверительным интервалом. Уравнение наилучшего соответствия описано ниже:
Следует отметить, что могут быть использованы коэффициенты, специфичные для конкретной буферной системы и соответствующей концентрации белка. В целом, сильная корреляция (коэффициент корреляции Пирсона = 0,9) и средняя абсолютная ошибка, равная 7±9, при 180 мг/мл между наблюдаемым и прогнозируемым значениями демонстрирует, что эта модель применима для получения значений вязкости с использованием рассчитанных теоретических параметров, определенных, исходя из последовательности антитела. Для дополнительного изучения и указанной модели использовали подход перекрестной проверки с исключением (LOOCV), в котором значение вязкости для каждого мАт было использовано в качестве точки данных проверки, тогда как значения вязкости для остальных мАт были использованы в качестве пробного набора. Анализ PCR осуществляли на пробном наборе, и выходные данные модели с использованием указанных параметров использовали для предсказания значения вязкости «исключаемых» мАт; эти этапы затем повторяли для каждого мАт. На фиг. 11D показан график зависимости наблюдаемых экспериментальных значений вязкости при 180 мг/мл от предсказанных с помощью LOOCV значений. Наблюдается сильная корреляция между прогнозируемым и наблюдаемым значениями вязкости (коэффициент корреляции Пирсона = 0,8) со средней абсолютной ошибкой, равной 9±10.
Аналогичным образом анализ PCR был использован в качестве инструмента многопараметрической регрессии для разработки прогностической модели для вязкости в условиях буфера низкой ионной силы. Пробный набор содержал 10 мАт в концентрации 150 мг/мл в буфере низкой ионной силы (20 мМ гистидиновый буфер). На фиг. 11Е показан результат анализа PCR с использованием пробного набора из 10 мАт в концентрации 150 мг/мл, наблюдаемых экспериментальных значений вязкости от прогнозируемых значений вязкости, которые были получены с помощью уравнения наилучшего соответствия с 90% доверительным интервалом. Уравнение наилучшего соответствия описано ниже:
Следует отметить, что были использованы коэффициенты, специфичные для этой буферной системы и соответствующих концентраций белка. В целом, сильная корреляция между наблюдаемым и прогнозируемым значениями (r2=0,8) продемонстрировали, что эта модель применима для получения значений вязкости с использованием рассчитанных теоретических параметров, определенных, исходя из последовательности антитела. Для верификации указанная модель была исследована на четырех разных антителах, не принадлежащих к пробному набору. С использованием теоретических параметров и Уравнений 1 и 2 были отдельно рассчитаны значения вязкости при 180 мг/мл и 150 мг/мл и, допуская, что вязкость составляет 1,2 сП при 25 мг/мл и 0,8 при 0 мг/мл, была составлена состоящая из четырех точек кривая вязкость-концентрация и сравнена с экспериментальными данными вязкости. На фиг. 12A-12D показано такое сравнение для четырех мАт. Теоретическая модель позволила точно прогнозировать вязкость-концентрацию при сравнении с экспериментальными данными. Таким образом, модельное уравнение, полученное с помощью регрессионного анализа методом дробных наименьших квадратов, с использованием полученных на основе последовательности теоретических параметров позволило эффективно предсказать кривые вязкость-концентрация для этой белок-буферной системы, включающей антитела изотипа IgG1.
Клиренс
Разные антитела одного и того же изотипа могут характеризоваться значительными различиями в клиренсе плазмы крови у людей, а также у яванского макака. (Клиренс плазмы крови у яванского макака (клиренс у яванского макака) - установленная доклиническая модель у для оценки фармакокинетического профиля мАт (см., например, 
, I. et al. A strategy for risk mitigation of antibodies with fast clearance. mAbs 4, 753-760)). В некоторых исследованиях было показано, что такие различия коррелируют с pi или специфическими мутациями в последовательности (см., например, Igawa, Т. et al. Reduced elimination of IgG antibodies by engineering the variable region. Protein Engineering Design and Selection 23, 385-392; Wu, H. et al. Development of Motavizumab, an Ultra-potent Antibody for the Prevention of Respiratory Syncytial Virus Infection in the Upper and Lower Respiratory Tract. Journal of Molecular Biology 368, 652-665 (2007)). Основываясь на гипотезе о том, что различия в любых проявляемых свойствах мАт предпочтительно должны быть связаны с различиями в Fv или CDR (внутри одного и того же каркасного участка), было проведено исследование, чтобы определить, можно ли с помощью анализа каких-либо свойств последовательности предсказать различия в клиренсе у яванского макака. Основная гипотеза заключалась в том, что более быстрый клиренс был обусловлен нецелевым связыванием мАт с поверхностями/или белками in vivo через усиление белок-белковых взаимодействий, которые были гидрофобными и/или с электростатическими взаимодействиями по природе. Таким образом, было предположено, что любые крайние проявления таких свойств вариабельного домена, как pI, заряд или гидрофобность, приведут к увеличению скорости клиренса антитела у яванского макака. На основе опубликованных данных значение клиренса >/= 10 мл/кг/сутки у яванского макака было обозначено как более быстрый клиренс, и значение <10 мл/кг/сутки - как нормальный клиренс (см., например, , I. et al. A strategy for risk mitigation of antibodies with fast clearance. mAbs 4, 753-760).
У яванского макака оценивали и сравнивали скорость клиренса большого набора мАт класса IgG1 (45 мАт) с использованием максимально вводимой дозы (в пределах от 10 мг/кг до 100 мг/кг) с рассчитанными pI мАт и значениями HI последовательности CDR (фиг. 13А и 13Б). Как сообщается в литературе (см., например, , I. et al. А strategy for risk mitigation of antibodies with fast clearance. mAbs 4, 753-760), не было отмечено никакой выраженной корреляции между рассчитанной pI мАт и клиренсом или между HI (рассчитанным по CDR или Fv) и клиренсом (данные не показаны). Тогда как не было отмечено никакой выраженной корреляции между pI и клиренсом или HI и клиренсом, было отмечено, что при высоких значениях pi (~ 8,7-9,5) и низких значениях pI (~ 6,4-7,1), а также при высоких значениях HI (>1,2), большее количество мАт имеет высокие значения клиренса. Корреляция между рассчитанным зарядом Fv-домена при рН 7,4 (физиологический рН) и значениями клиренса (данные не показаны) не была отмечена.
Целью следующего этапа было определить, взаимодополняют ли pI (и/или заряд) и гидрофобность друг друга в отношении определения более быстрого клиренса в сравнении с нормальным клиренсом. Также было исследовано, может ли заряд при определенном рН быть более селективным в отношении значений клиренса (клиренс антител связан с сольватацией неонатального Fc-рецептора через эндосомальное окружение, для которого характерен низкий рН, рН 5-6 (где Fc представляет собой С-концевую область антитела тяжелой цепи, в состав которой входит по меньшей мере часть константной области)) (см., например, Wang, W., Wang, E.Q. & Balthasar, J.P. Monoclonal Antibody Pharmacokinetics and Pharmacodynamics. Clin Pharmacol Ther 84, 548-558 (2008)). Таким образом, было исследовано, существует ли корреляция между зарядом Fv и клиренсом в диапазоне рН 5,0-7,4. Также было исследовано, будет ли достигнута более выраженная корреляция между гидрофобностью определенных CDR и клиренсом в отличие от гидрофобности всей последовательности CDR. С использованием множества этих переменных было установлено, что определенная комбинация этих переменных является более селективной в отношении клиренса.
Для упрощения анализа был составлен пробный набор из 13 мАт для охвата полного диапазона значений клиренса (фиг. 2). МАт в пробном наборе были расположены в порядке уменьшения значений клиренса. Были оценены критерии, которые позволили разделить две группы мАт, т.е. на группу мАт со значением клиренса >/- 10 мл/кг/сутки и группу мАт со значением клиренса <10 мл/кг/сутки. Как было упомянуто, общего показателя гидрофобности всех CDR было недостаточно для установления различий. Кроме того, показатель гидрофобности LC CDR2, НС CDR1 и НС CDR2 также не позволил установить такие различия, которые были показаны путем расчета среднего значения HI для мАт, характеризующихся более быстрым клиренсом, по сравнению с мАт, характеризующимися нормальным клиренсом. С другой стороны, была отмечена общая тенденция к тому, что мАт, характеризующиеся более быстрым клиренсом, имели тенденцию к более высокой гидрофобности среди оставшихся 3 CDR (LC CDR1, LC CDR3 и НС CDR3). Среднее значение HI для мАт, характеризующихся более быстрым клиренсом, в целом, было более высоким по сравнению со значением для мАт, характеризующихся нормальным клиренсом. Это стало более очевидным с использованием расчета суммы значений HI этих 3 CDR. Сумма средних значений HI (LC CDR1, LC CDR3 и НС CDR3) для мАт в группе с более быстрым клиренсом была статистически значимо выше суммы средних значений у мАт, характеризующихся нормальным клиренсом (3,9+/-1,4 в сравнении с 2,5+/-0,7, соответственно, р=0,005). В отношении заряда было отмечена тенденция к тому, что при рН 5,5, у мАт с нормальными значениями клиренса значения заряда находились в пределах 0,4-6,1, тогда как у 4 из 7 мАт, который характеризуются более быстрым клиренсом, значения заряда выходили за пределы указанного диапазона. Кроме того, оказалось, что заряд и избирательный HI CDR взаимодополняли друг друга в отношении отличия мАт с более быстрым клиренсом, т.е. для мАт со значениями заряда в пределах от 0,4 до 6,1 в группе с быстрым клиренсом сумма значений HI была относительно больше. Этот анализ данных показал, что и крайние значения гидрофобности определенных CDR, и крайние значения величины заряда (либо отрицательный, либо сильно положительный) могут быть использованы для предсказания наличия мАт с более быстрым клиренсом.
Описанный выше анализ привел к разработке критерия для отличия мАт, характеризующихся более быстрым клиренсом, от мАт с нормальным клиренсом (фиг. 3). При отделении мАт с суммарным значением HI>4,0 и/или величиной заряда Fv либо </= -2,0 либо >/= 6,2 (фиг. 2, фон с обратной косой чертой с наклоном влево) от мАт с суммарным значением гидрофобности </= 4,0 и значениями заряда Fv от -2,0 до 6,2 (фиг. 2, фон с прямой косой чертой с наклоном вправо), были отмечены четкие различия между мАт, характеризующимися более быстрым клиренсом и мАт, характеризующимися нормальным клиренсом.
Теоретические критерии были распространены на полный набор из 45 мАт для исследования их пригодности. Для облегчения визуализации такого анализа использовали схему кодирования штриховки фона, описанную выше. Всем суммарным значениям HI > 4,0 был присвоен фон с обратной косой чертой с наклоном влево и остальным значениям был присвоен фон с прямой косой чертой с наклоном вправо. Всем значениям заряда </= -2,0 или >/= 6,2 был присвоен фон с обратной косой чертой с наклоном влево и остальным значениям был присвоен фон с прямой косой чертой с наклоном вправо. Всем значениям клиренса у яванского макака >/= 10 был присвоен фон с обратной косой чертой с наклоном влево и остальным значениям был присвоен фон с прямой косой чертой с наклоном вправо. На следующем этапе данные сортировали на основе увеличения измеренных значений клиренса, чтобы определить, совпадают ли узоры штриховки (и, таким образом, позволяют ли критерии предсказать правильные результаты) (фиг. 4). Действительно, критерии были вполне применимы для полного набора из 45 мАт. На основе либо большого значения суммарного HI, либо крайних значений величины заряда Fv, был точно предсказан более быстрый клиренс у яванского макака для 15/16 (94%) мАт (включая 6/6 в исходном пробном наборе) и нормальный клиренс у яванского макака для 24/29 (83%) мАт (включая 7/7 в исходном пробном наборе).
В дополнительных экспериментах пробный набор был расширен до 14 мАт для разработки критериев, чтобы отличить мАт, характеризующиеся более быстрым клиренсом, от мАт с нормальным клиренсом. В этом пробном наборе мАт, характеризующиеся более быстрым клиренсом, были без труда отделены от мАт, характеризующихся нормальным клиренсом, если критерии были заданы таким образом, что мАт с суммарным значением HI > 4,0 и/или величиной заряда Fv либо ≤0, либо ≥6,2 будут характеризоваться более быстрым клиренсом, тогда как мАт с суммарным значением HI ≤ 4,0 и величиной заряда Fv от 0 до 6,2 будут характеризоваться нормальным клиренсом. Критерии были распространены на набор из 61 мАт для исследования его пригодности. На основе либо большого значения суммарного HI, либо крайних значений величины заряда Fv, был точно предсказан более быстрый клиренс у яванского макака для 10/13 (77%) мАт (за исключением 8/8 в исходном пробном наборе, 86%, включая пробный набор мАт) и нормальный клиренс у яванского макака для 24/34 (70%) мАт (за исключением 6/6 в исходном пробном наборе, 75%, включая пробный набор мАт) (данные не показаны).
С помощью этих анализов была установлена возможность использования фундаментальных свойств молекул, таких как заряд и гидрофобность, в оценке биологических свойств, таких как клиренс в этом случае. С помощью анализа была подтверждена гипотеза о том, что неспецифическое связывание явилось причиной более быстрого выведения из плазмы крови, поскольку вариабельный домен с чрезмерными значениями гидрофобности или зарядов мог потенциально взаимодействовать с поверхностями, отличными от целевого антигена.
Окисление Trp и изомеризация Asp
Химические модификации, такие как окисление Trp и изомеризация Asp и связанная с ними потеря активности, могут ограничивать срок хранения препаратов мАт в водных растворах. Было использовано полноатомное моделирование методом МД с явно заданной гидратацией, чтобы определить степень риска взаимной предрасположенности к окислению Trp и изомеризации Asp.
Для окисления Trp была изучена корреляция между полученной с помощью генерации МД-траекторий усредненной по времени SASA и степенью окисления остатков Trp в присутствии 2,2'-азобис(2-амидинопропан)дигидрохлорида (ААРН, химическое соединение, которое, как известно, окисляет лабильные аминокислоты боковых цепей) (см., например, Ji, J.A., Zhang, В., Cheng, W. & Wang, Y.J. Methionine, tryptophan, and histidine oxidation in a model protein, PTH: Mechanisms and stabilization. Journal of Pharmaceutical Sciences 98, 4485-4500 (2009)). Под воздействием ААРН образуются органические свободные радикалы, что приводит к окислению экспонированных боковых цепей. Таким образом, была выдвинута гипотеза о том, что параметр SASA мог бы послужить прямым критерием подверженности Trp окислению при попадании в раствор окислителей на протяжении производства или хранения антител. На фиг. 5 приведены 38 остатков Trp, содержащихся в 17 разных мАт. Все эти остатки Trp содержались в CDR за исключением последних остатков 9 Trp, которые содержались в константной области.
Был определен критерий, по которому остатки триптофана считались лабильными по отношению к окислению ААРН, если их доля в данном положении превышала 35%, при доле окисленных остатков триптофана ниже 35% последние считались нелабильными. Для разделения остатков Trp был использован код штриховки фона, причем для доли окисленных остатков Trp, превышающей 35%, был назначен фон с обратной косой чертой с наклоном влево и для доли окисленных остатков Trp меньше 35% - был присвоен фон с прямой косой чертой с наклоном вправо, и все остатки Trp были отсортированы на основе частоты встречаемости окисленных остатков (фиг. 5). Тенденция была характерной: среднее значение усредненной по времени SASA лабильных остатков Trp было статистически значимо выше (122 А2 +/- 40) по сравнению с нелабильными остатками (37 А2 +/- 41), причем р-значение составляло 0,0001. На основе этого анализа и для минимизации числа ложных негативов, было назначено отсекаемое значение для SASA боковой цепи >80 А2 (>30% SASA для боковой цепи Trp) для установления корреляции, чтобы обнаружить сайты, содержащие лабильные остатки Trp, и для различения реакционноспособных и нереакционноспособных участков. Этот критерий позволил точно идентифицировать 13/14 (93%) лабильных Trp и 20/24 (83%) нелабильных остатков Trp. Было отмечено, что молекулы, для которых с использованием упомянутого выше критерия были определены ложные позитивы, по меньшей мере два из трех мАт, т.е. мАт12 Trp НС109, мАт7 TRP НС33, характеризовались наличием двух остатков Trp на одном Fv-домене, которые почти в равной степени были экспонированы растворителю. Возник вопрос в том, является ли статистическая вероятность окисления двух экспонированных растворителю остатков Trp на одном Fv низкой в случае экспериментального определения по сравнению с одним сайтом Trp на многих Fv-доменах (и, таким образом, мАт), что бы привело к избирательному окислению только одного остатка Trp при воздействии окислителя, даже если площадь экспонирования растворителю является одинаковой. Если бы это предположение оправдалось, это могло бы быть одной из возможных причин получения ложных позитивов, определенных на основе площади, доступной растворителю. В целом, был сделан вывод, что определения усредненной по времени SASA боковой цепи остатка Trp было достаточно, чтобы различить лабильные и нелабильные остатки Trp, и, если два остатка Trp с достаточной площадью, доступной растворителю, содержались бы в одном Fv-домене, такой критерий должен использоваться с большой долей рассудительности.
Для изомеризации Asp из МД-траекторий были получены множественные переменные, связанные с потенциально лабильными остатками Asp. Были исследованы следующие свойства, согласующиеся механизмом изомеризации Asp (см., например, Wakankar, A.A. et al. Aspartate isomerization in the complementarity determining regions of two closely related monoclonal antibodies. Biochemistry 46, 1534-1544 (2007)) (нуклеофильная атака на карбонильный углерод Asp атомом азота пептидной связи между N-концевым аминокислотным остатком и N+1 аминокислотным остатком): (1) усредненная по времени SASA для всех остатков Asp (SASA_Asp), атома N n+1 остатка основной цепи остатков Asp (SASA (n+1), N) и атома Н n+1 остатка (SASA (n+1), Н); (2) внутриаминокислотная взаимная информация (MI) для остатков Asp; (3) энтропия Шеннона для распределений ϕ-ψ; и (4) среднеквадратичные флуктуации для атомов Сα (RMSF). Для МД-расчетов был выбран целый ряд Fab, которые содержали как известные лабильные, так и стабильные остатки Asp. Внимание было сосредоточено на мотивах, которые, как было ранее продемонстрировано, подвергаются изомеризации с такой скоростью, что влияет на срок хранения (DG, DS, DT, DD, DA) (см., Radkiewicz, J.L., Zipse, Н., Clarke, S. & Houk, K.N. Neighboring Side Chain Effects on Asparaginyl and Aspartyl Degradation: An Ab Initio Study of the Relationship between Peptide Conformation and Backbone NH Acidity. J. Am. Chem. Soc. 123, 3499-3506 (2001); Yi, L. et al. Isomerization of Asp-Asp motif in model peptides and a Monoclonal Antibody Fab Fragment. Journal of Pharmaceutical Sciences 102, 947-959), а остальные остатки Asp не принимались во внимание.
Был получен набор экспериментальных данных на основе того, что все мАт были получены при сходных условиях (рН 5,5), подвергались термической обработке (40°С), и был проведен анализ пептидных карт для расчета скоростей деградации остатков Asp. На фиг. 6 показаны и экспериментальные результаты, и значения параметров свойств, определенные на основе моделирование методом МД. Все потенциально лабильные остатки Asp представлены на фиг. 6, за исключением остатков Asp, не содержащихся в CDR (остатки Asp каркасного участка), которые были только приведены для одного белка, поскольку повторение этих не содержащихся в CDR остатков Asp было бы излишним.
Анализ данных проводили в две стадии. Во-первых, лабильные остатки (>/= 2,5% / неделя) отделяли от стабильных остатков (<2,5% / неделя) и сравнивали среднее значение для каждого из параметров свойств в двух группах остатков Asp (фиг. 14). Эта стадия позволила установить, для каких параметров свойств были отмечены существенные различия между двумя группами. Как показали р-значения, среди шести исследованных параметров свойств, четыре параметра, а именно SASA_Asp, RMSF, SASA (n+1, N) и (n+1, H), показали достоверные различия (80% CI) в двух группах остатков Asp. Поскольку ни один из этих четырех параметров свойств сам по себе не позволил прогнозировать скорость изомеризации остатков Asp, на следующей стадии использовали многофакторный анализ. Прямая корреляция не была установлена ни с использованием средств многомерной регрессии методом главных компонент, ни с использованием регрессионного анализа методом дробных наименьших квадратов. Таким образом, был поставлен вопрос, может ли быть установлена бинарная корреляция, т.е. можно ли отличить сайты со скоростью деградации ≥2,5% / неделя от сайтов со скоростью деградации <2,5% / неделя. С этой целью, скорости >2,5% / неделя было присвоено значение 1 и скорости <2,5% / неделя - значение 0 (фиг. 6). Затем проводили логистический регрессионный анализ с использованием SASA_Asp, RMSF, SASA (n+1, N) в качестве независимых переменных, а значения скорости, представленные в бинарном виде, использовали в качестве зависимых переменных. Параметр SASA (n+1, Н) был исключен, поскольку он не давал дополнительных преимуществ при проведении регрессионного анализа. Уравнение, полученное в результате регрессии, показано ниже:
Результаты решения этого уравнения, были округлены до одной значащей цифры для получения результатов либо в виде 0 (нереакционноспособные), либо 1 (реакционноспособные) и показаны на фиг. 6.
Логистическая регрессия позволила точно предсказать 5/6 лабильных сайтов и все 9/9 нереакционноспособных сайтов. По существу, уравнение, полученное в результате логистического моделирования, позволяет использовать три параметра (SASA_Asp, RMSF и SASA (n+1, N)) для предсказания подверженности остатков Asp деградации с большей скоростью, чем 2,5% / неделю в исследуемых экспериментальных условиях.
Модель верифицировали с использованием подхода LOOCV. Исключая одно мАт и используя оставшиеся мАт в качестве пробного набора для логистического регрессивного анализа, было предсказано наличие 5/6 лабильных сайтов и 7/9 нереакционноспособных сайтов (Фигура 6). Тогда как точность результатов предсказания незначительно уменьшилась, тем не менее, указанная модель позволила точно предсказать наличие в общей сложности 12/15 сайтов (80%) и, таким образом, может считаться удовлетворительной. Снижение точности предсказания наличия сайтов с использованием подхода LOOCV в процентном отношении указывает на вероятность того, что определенные мАт из исходного пробного набора могут непропорционально вносить вклад в достижение высокоточного результата предсказания. Следует отметить, что, тогда как этот подход к моделированию может быть применим к определенному набору экспериментальных параметров, похоже, что основополагающий подход можно расширить на любой набор экспериментальных параметров, поскольку для набора остатков Asp экспериментальные параметры известны.
На фиг. 18 показано иллюстративное устройство 1800. Устройство 1800 может представлять собой вычислительную машину. Устройство 1800 может включать модуль чипа 1802, который может содержать одну или несколько интегральных схем, и который может включать устройство логической обработки информации, имеющее соответствующую конфигурацию, основанное на рассчитанных параметрах физико-химических свойств антитела, например, для определения пригодности антитела для производства или включения в состав терапевтического средства; отбора антитела из антител-кандидатов для включения в состав терапевтического средства; поддержания процесса приготовления терапевтического средства, содержащего антитело; или для выполнения любых других подходящих логических операций, связанных с отбором антител in-silico или с другими связанными действиями.
Устройство 1800 может включать один или несколько из следующих компонентов: схему ввода/вывода 1804, которая может содержать устройство передачи данных и устройство приема данных, и может иметь сопряжение на основе оптико-оптико-волоконного кабеля, коаксиального кабеля, телефонных линий, беспроводных устройств, аппаратуры с физическим уровнем (PHY), контрольных устройств в виде клавиатуры/монитора, или любые другие подходящие средства или устройства; периферийные устройства 1806, которые могут содержать счетчики-таймеры, блоки синхронизации, работающие в режиме реального времени, генераторы со сбросом по включению питания или любые другие подходящие периферийные устройства; устройство логической обработки информации 1808, которое может осуществлять вычисление значений структурных параметров антитела, исходя из информации о структуре антитела; отбор факторов масштабирования, соответствующих структурным параметрам антитела; определение значений показателей, соответствующих физико-химическим свойствам антитела; определение значений гидродинамического сопротивления сосудов для приготовления и дозирования; и машиночитаемую память 1810.
Машиночитаемая память 1810 может быть сконфигурирована с возможностью хранения в машиночитаемых структурах данных: информации о структуре антитела; факторов масштабирования, соответствующих структурным параметрам антитела; и любой другой подходящей информации или данных.
Связь между компонентами 1802, 1804, 1806, 1808 и 1810 может быть реализована посредством системной шины или другой схемой соединений 1812 и могут быть установлены на одной или нескольких печатных платах, например, 1820. Согласно некоторым вариантам осуществления указанные компоненты можно интегрировать на одной кремниевой интегральной схеме.
Надо понимать, что компоненты программного обеспечения, включая программы и данные, могут - при желании - быть записаны на носители типа ROM (с памятью только для чтения), включая CD-ROM, EPROM и EEPROM, либо же они могут храниться в любом другом подходящем формате машиночитаемых носителей, например, помимо прочего, на различных типах дисковых носителей, на платах или различных энергозависимых устройствах накопления и хранения данных. Компоненты, которые описаны в настоящем документе в виде программного обеспечения, могут альтернативным и/или дополнительным образом (при желании) быть полностью или частично реализованы в аппаратной части.
Передача различных сигналов, несущих информацию, которые описаны в настоящем документе, может осуществляться между любым передатчиком и приемником в виде электромагнитных волн, распространяющихся по средам, которые могут проводить ЭМ-сигналы, как-то: металлические проводники, волоконнооптические линии и/или при помощи беспроводной связи (например, по воздуху и/или в пространстве) Устройство 1800 может функционировать в сетевой среде, поддерживающей соединение с одним или несколькими удаленными компьютерами через локальную вычислительную сеть (LAN), глобальную компьютерную сеть (WAN) или другие подходящие сети. При использовании в сетевой среде LAN устройство 1800 может быть подключено к LAN через сетевой интерфейс или через адаптер к схеме ввода/вывода 1804. При использовании в сетевой среде WAN устройство 1800 может включать модем или другие средства для установления связи через WAN. Надо понимать, что сетевые соединения показаны с иллюстративной целью, и могут быть использованы другие средства для установления каналов связи между компьютерами. Предусмотрено использование любых различных широко известных протоколов, таких как TCP/IP, Ethernet, FTP, HTTP и тому подобное, и системой можно управлять в клиент-серверной конфигурации, чтобы позволить пользователю управлять устройством логической обработки информации 1808, например, через Интернет.
Устройство 1800 может быть частью многочисленных общих или специальных вычислительных систем, сред или конфигураций. Примеры широко известных вычислительных систем, сред и/или конфигураций, которые потенциально могут подойти для применения в настоящем изобретении, включают, в том числе, персональные компьютеры, серверные компьютеры, наладонники или ноутбуки, мобильные телефоны и/или другие карманные персональные компьютеры (КПК), многопроцессорные системы, микропроцессорные системы, планшетные компьютеры, приборы бытовой электроники с программируемым управлением, персональные компьютеры, объединенные в одну сеть, миникомпьютеры, компьютеры систем мейнфреймов, среды распределенных вычислений, в которые входит любая из вышеуказанных систем или любое из вышеуказанных устройств, и прочее.
На фиг. 19А и 19В показаны иллюстративные процессы 1900 для обеспечения отбора антител in-silico в соответствии с принципами настоящего изобретения. Описание того, что стадии проиллюстрированных процессов осуществляются «системой», приведено с иллюстративной целью. «Система» может включать один или несколько признаков устройства, показанного на фиг. 18, и/или любого другого подходящего устройства, такого как вычислительная машина, или подхода. «Система» может быть оснащена модулем, реализующим отбор антитела in-silico, или любой другой подходящий элемент, организация или модальность.
На фиг. 19А и 19В сплошные стрелки обозначают поток управления процессами поток информации. Штриховые стрелки обозначают поток информации.
Порядок выполнения и/или описание стадий процессов приведены на фиг. 19А и 19В только с иллюстративной целью. Абсолютно нет никакой необходимости в выполнении каждого из описанных стадий в проиллюстрированном порядке. Процессы 1900 могут включать стадии, которые не показаны.
Процессы 1900 могут быть воплощены в виде алгоритма, алгоритм может включать некоторые или все указанные стадии процессов 1900.
Процессы 1900 могут начинаться на стадии 1920 (как показано на фиг. 19А). На стадии 1920 система может получить набор данных. Информация 1922 может включать некоторые или все данные, полученные на стадии 1920.
Информация 1922 может включать информацию, относящуюся к антителу (Ат) 1926, с параметрами раствора 1924. Система может осуществлять процессы 1900 для анализа Ат 1926 с параметрами раствора 1924 для удовлетворения заданного критерия (DC) 1958.
Ат 1926 может относится к подклассу/классу Ат 1948. Подкласс/класс Ат 1948 может представлять собой класс антител, такой как IgA или IgE. Подкласс/класс Ат 1948 может представлять собой подкласс антител, такой как IgA1. Подкласс/класс Ат 1948 может представлять собой подкласс антител, такие как IgG1 или IgG4. Подкласс/класс Ат 1948 может представлять собой любой класс антител, подкласс или вид.
Ат 1926 может иметь структуру. Структура Ат 1926 может быть представлена структурой Ат 1950. Структура Ат 1950 может представлять собой цифровой код, соответствующий структуре Ат 1926.
Структура Ат 1950 может включать информацию об аминокислотной последовательности антитела 1926. Последовательность 1952 может представлять собой информацию о последовательности. Последовательность 1952 может представлять собой цифровой код, соответствующий последовательности Ат 1926. Последовательность 1952 может представлять собой первичную структуру.
Последовательность 1952 может включать полную последовательность 1954 Ат 1926. Полная последовательность 1954 может содержать информацию о последовательностях всех частей, доменов, областей и/или признаках Ат 1926, включая тяжелую цепь НС, легкую цепь LC, вариабельный домен Fv, константный домен Fc, любой или все участки, определяющие комплементарность CDR1, CDR2 и т.д., и любой другой структурный признак Ат 1926.
Последовательность 1952 может включать частичную последовательность 1956 Ат 1926. Частичная последовательность 1956 может быть короче, чем полная последовательность 1954. Частичная последовательность 1956 может представлять собой неполную последовательность Ат 1926. Частичная последовательность 1956 может содержать информацию о последовательности одной или нескольких частей, доменов, областей и/или признаков Ат 1926, включая тяжелую цепь НС, легкую цепь LC, вариабельный домен Fv, константный домен Fc, любой или все участки, определяющие комплементарность CDR1, CDR2 и т.д., и/или любой другой структурный признак Ат 1926.
Информация 1922 может включать информацию, относящуюся к параметрам 1924. Параметры 1924 могут включать информацию, относящуюся к системе буфер + солевой раствор (BSS) 1930. BSS 1930 может представлять собой цифровой код, соответствующий некоторым параметрам раствора, содержащего Ат 1926. Параметры раствора могут включать один или несколько параметров из: температуры (Т) 1932; химического состава 1934 системы буфер + солевой раствор, что может включать определение химических веществ в составе системы буфер + солевой раствор, который может содержать или может и не содержать солей, отличных от солей, содержащихся в буфере; и концентрации 1936 химических веществ, которые могут содержаться в растворе. Концентрации 1936 может включать информацию, относящуюся к одному или нескольким параметрам из: концентрации буфера 1938; концентрации солей 1940; концентрации Ат 1942; рН 1944; и ионной силы 1946 (ИС).
BSS 1930 может представлять собой виртуальный раствор. Виртуальный раствор может быть связан с моделированием методом МД. BSS 1930 может представлять собой реальный раствор. Ат 1926 может представлять собой виртуальное антитело. Виртуальное антитело может быть связано с моделированием методом МД. Структура виртуального антитела может быть основана на структуре реального антитела с отличием от реального антитела по гипотетическому изменению последовательности. Ат 1926 может представлять собой реальное антитело.
Информация 1922 может включать информацию, относящуюся к физико-химическому свойству (PC) 1928. PC 1928 может включать одно или несколько физико-химических свойств, таких как вязкость, клиренс, стабильность, лабильность остатка аспарагиновой кислоты и лабильность остатка триптофана. PC 128 может включать любое другое физико-химическое свойство раствора Ат или Ат, такое как цвет или изоэлектрическая точка. PC 128 может играть некоторую роль в определении DC 1958. Например, если PC 128 представляет собой вязкость, DC 1958 может относиться к вязкости; DC 1958 может включать, например, предел вязкости.
Информация 1922 может включать выходные данные 1931 для BSS. Выходные данные 1931 для BSS могут включать данные, относящиеся к параметрам 1924. Выходные данные 1931 для BSS могут включать данные, относящиеся к BSS 1930.
Информация 1922 может включать выходные данные 1927 для Ат. Выходные данные 1927 для Ат могут включать данные, относящиеся к Ат 1926.
Информация 1922 может включать выходные данные 1929 для PC. Выходные данные 1929 для PC могут включать данные, относящиеся к PC 1928.
Информация 1922 может включать выходные данные 1959 для DC. Выходные данные 1959 для DC могут включать данные, относящиеся к DC 1958.
Система может переходить от стадии 1920 к стадии 1960. На стадии 1960 система может производить отбор целевой функции. Целевая функция может включать факторы масштабирования (sf) и параметры (Р). Параметры Р могут включать один или несколько связанных с пространственной структурой свойств, таких как заряд, зарядовая асимметрия и гидрофобность. Параметры Р могут включать любое другое связанное с пространственной структурой свойство, такое как магнитный момент и дипольный момент. Система может производить умножение параметра Pi на фактор масштабирования sfi. Мультипликативное произведение sfiPi может представлять собой член уравнения целевой функции.
Система может производить отбор целевой функции на основе информации, получаемой из выходных данных 1929 для PC. Информация, получаемая из выходных данных 1929 для PC, может включать информацию, касающуюся PC 1928. Информация, касающаяся PC 1928, может быть использована в отборе целевой функции. Например, если PC 128 представляет собой вязкость, система может производить отбор целевой функции, из которой, после оценки Ат 1926 в условиях 1924, можно получить показатель, соответствующий вязкости Ат 1926 в BSS 1930. Математическая запись уравнения целевой функции может устанавливать взаимосвязь между членами sfiPi и PC 1928.
Система может переходить к стадии 1962. На стадии 1962 система может производить отбор параметров, которые должны быть включены в целевую функцию. Параметры могут включать параметры P1…Pn, где n может представлять собой общее число параметров, включенных в целевую функцию. Система может производить отбор параметров P1…Pn на основе информации, получаемой из выходных данных 1927 для Ат. Информация, получаемая из выходных данных 1927 для Ат, может включать информацию, касающуюся Ат 1926. Информация, касающаяся Ат 1926 может быть использована в отборе параметров P1…Pn. Например, если целевая функция, отобранная на стадии, 1962 устанавливает взаимосвязь между членами sfiPi и значениями вязкости, отбор параметров Р1…Рn может зависеть от подкласса/класса Ат 1948. Если подкласс/класс Ат 1948 представляет собой IgG4, система может включить в целевую функцию значения параметров, связанных с свойствами Fc; если подкласс/класс Ат 1948 представляет собой IgG1, система может исключить из целевой функции значения параметров, относящихся к свойствам Fc.
Система может производить отбор параметров P1…Pn на основе информации, получаемой из выходных данных 1931 для BSS. Информация, получаемая из выходных данных 1931 для BSS, может включать информацию, касающуюся BSS 1930. Информация, касающаяся BSS 1930, может быть использована в отборе параметров P1…Рn. Информация, получаемая из выходных данных 1931 для BSS, может включать информацию, касающуюся ионной силы (ИС) 1946. Информация, касающаяся ИС 1946 может быть использована в отборе параметров Р1…Рn. Например, если целевая функция, отобранная на стадии 1960, устанавливает взаимосвязь между членами sfiPi и значениями вязкости, отбор параметров P1…Pn может зависеть от ИС 1946. Если ИС 1946 представляет собой высокую ионной силу, система может включить в целевую функцию значения параметров, связанных с гидрофобностью; если ИС 1946 представляет собой низкую ионную силу, система может исключить из целевой функции параметры, связанные с гидрофобностью.
Система может переходить к стадии 1964. На стадии 1964 система может производить отбор sf-значений. Отбор sf-значений может включать определение sf-значений sf1…sfn нa стадии 1966. Каждое значение sf1…sfn, может послужить в качестве множителя при одном из параметров P1…Pn, соответственно. На стадии 1966 определение значений sf1…sfn может включать определение каждого значения фактора масштабирования в машинной памяти 1910 (как показано на фиг. 19Б).
Машинная память 1910 может включать один или несколько признаков памяти 1810 (как показано на фиг. 18). В машинной памяти 1910 могут храниться значения факторов масштабирования. В машинной памяти 1910 могут храниться значения факторов масштабирования, сгруппированные по температуре, согласно тому, как это представлено в памяти, конфигурация которой проведена по параметру температуры (от ТA до Тх) 1911. В машинной памяти 1910 могут храниться значения факторов масштабирования, сгруппированные по параметру ионной силы, согласно тому, как это представлено в памяти, конфигурация которой проведена по параметру ионной силы (от ISα до ISω) 1913. В машинной памяти 1910 могут храниться значения факторов масштабирования, сгруппированные по подклассу, согласно тому, как это представлено в памяти, конфигурация которой проведена по подклассам IgG (от IgG1 до IgG4) 1915. В машинной памяти 1910 могут храниться значения факторов масштабирования, сгруппированные по параметру состава буфер + солевой раствор, согласно тому, как это представлено в памяти, конфигурация которой проведена по параметру состава буфер + солевой раствор (от BSS1 до BSSm) 1916. В машинной памяти 1910 могут храниться значения факторов масштабирования, сгруппированные по параметру рН, согласно тому, как это представлено в памяти, конфигурация которой проведена по параметру рН (от pHI от рНX) 1917.
В машинной памяти 1910 могут храниться данные, как, например, данные, показанные в конфигурации машинной памяти 1919. В конфигурации 1919 возможно визуальное представление данных, находящихся в машинной памяти 1910, при помощи средства для просмотра данных, например, монитора, который управляется схемой ввода/вывода 1804 (как показано на фиг. 18). Конфигурация 1919 включает целый ряд значений факторов масштабирования, на основе конкретных структурных особенностей Ат (например, полная последовательность, Fv, Fc) для IgG1 в определенных условиях (180 мг/мл Ат при 25°С, рН 5,5 и высокая ИС; в 20 мМ буфере + 200 mM аргинина HCl, каждое значение является приближенным).
В базе данных 1905 могут храниться измеренные значения PC антитела различных подклассов в различных условиях. Система может анализировать измеренные значения PC для получения факторов масштабирования. В системе могут храниться значения факторов масштабирования в машинной памяти 1910.
На стадии 1964 система может производить отбор значений sf1…sfn на основе информации, получаемой из выходных данных 1931 для BSS. Информация, получаемая из выходных данных 1931 для BSS, может включать Т 1932, состав 1934 и концентрации 1936. Т 1932, состав 1934 и/или концентрации 1936 могут быть использована в отборе значений sf1…sfn. Например, для набора параметров Р1…Рn, отобранных на стадии 1962, для целевой функции, отобранной на стадии 1960, значения sf1…sfn могут зависеть от Т 1932; тогда как для раствора, инкубируемого при 25°С, может быть отобран один набор значений sf1…sfn, другой набор значений sf1…sfn может быть отобран для второго раствора, отличающегося от первого раствора только в том отношении, что второй раствор инкубируют при 35°С. Два набора значений sf1…sfn для двух растворов, отличающихся только по температуре, могут располагаться в двух разных ячейках в машинной памяти 1910.
Система может производить отбор значений sf1…sfn на основе информации, получаемой из выходных данных 1927 для Ат. Информация, получаемая из выходных данных 1927 для Ат может быть использована на стадии 1964.
Информация, получаемая из выходных данных 1927 для Ат, может включать информацию о структуре Ат 1950. Структура Ат 1950 может быть использована в отборе значений sf1…sfn. Например, для набора параметров P1…Pn, отобранных на стадии 1962, для целевой функции, отобранной на стадии 1960, значения sf1…sfn могут зависеть от последовательности 1952; тогда как для антитела с полной последовательностью 1954 может быть отобран один набор значений sf1…sfn, другой набор значений sf1…sfn может быть отобран для того же антитела с частичной последовательностью 1956. Два набора значений sf1…sfn для одного и того же антитела с двумя разными последовательностями 1952 могут располагаться в двух разных ячейках в машинной памяти 1910.
На стадии 1966 ячейки с факторами масштабирования в машинной памяти 1910 могут быть идентифицированы в соответствии с информацией, получаемой из выходных данных 1931 для BSS, и/или из выходных данных 1927 для Ат.
На стадии 1968 система может извлечь значения sf1…sfn. Значения sf1…sfn могут быть извлечены из ячеек машинной памяти, идентифицированных на стадии 1966.
Система может переходить к стадии 1970. На стадии 1970 система может вычислить значения P1'…Pn' для параметров Р1…Рn, соответственно. Значения P1'…Pn' могут быть вычислены на основе информации, получаемой из выходных данных 1927 для Ат. Информация, получаемая из выходных данных 1927 для Ат, может быть использована на стадии 1970. Значения P1'…Pn' могут быть вычислены на основе информации, получаемой из выходных данных 1931 для BSS. Информация, получаемая из выходных данных 1931 для BSS, может быть использована на стадии 1970.
Система может переходить к стадии 1972. На стадии 1972 система может оценить целевую функцию. Значение целевой функции может быть вычислено на основе значений sf1…sfn и значений P1'…Pn'. Значение, рассчитанное для целевой функции, может соответствовать прогнозируемому значению PC 1928 для Ат 1926 в условиях 1924.
Система может переходить к стадии 1974. Информация, получаемая из выходных данных 1959 для DC, относящаяся к DC 1958, может быть использована на стадии 1974. На стадии 1974 система может провести сравнение прогнозируемого значения PC 1928 с DC 1958, чтобы определить, удовлетворяет ли Ат 1926 в условиях 1924 DC 1958.
Если DC 1958 удовлетворен, система может переходить к стадии 1976. На стадии 1976 может осуществляться процесс производства Ат. Производство Ат может включать транспортировка антител с жидкостью Ат 1926. Производство Ат может включать хранение Ат 1926. Производство Ат может включать получение Ат 1926. Получение Ат 1926 может включать преобразование виртуального антитела 1926 в реальное антитело. Производство Ат может включать любые стадии и действия, связанные с производством антитела.
Система может переходить к стадии 1978 от стадии 1976. Система может переходить к стадии 1978, если на стадии 1974 DC 1958 не удовлетворен.
На стадии 1978 система может произвести запрос, необходимо ли произвести сброс одного или нескольких значений данных из выходных данных 1931 для BSS, выходных данных 1927 для Ат, выходных данных 1929 для PC и/или выходных данных 1959 для DC. Например, тогда как DC 1958, возможно, был удовлетворен на стадии 1974, и на этапе 1976 может проходить процесс производства Ат 1926, может возникнуть необходимость в получении на этой стадии производства Ат 1926 с концентрацией, отличной от концентрации 1942 Ат; в получении на этой стадии производства Ат 1926 в буфере с химическим составом, отличным от состава 1934; или в получении на этой стадии производства антитела, отличного от Ат 1926.
Если ответ на запрос на стадии 1978 является отрицательным, система может перейти к завершению работы 1980. Система может по умолчанию завершить работу 1980 в отсутствие ответа на стадии 1978 по истечению заданного времени или в соответствии с некоторым другим критерием.
Если ответ на запрос на стадии 1978, является утвердительным, система может перейти к стадии 1982. На стадии 1982 может осуществляться сброс одного или нескольких значений данных из выходных данных 1931 для BSS, выходных данных 1927 для Ат, выходных данных 1929 для PC и выходных данных 1958 для DC. Например, может осуществляться сброс одного или нескольких значений данных, касающихся последовательности 1950 (например: путем изменения одного аминокислотного остатка; смены последовательности с полной на частичную; замены Ат 1926 на антитело, по существу, отличающееся по последовательности от Ат 1926); или может осуществляться сброс одного или нескольких значений данных, касающихся концентрации 1936 (например: путем изменения рН или IS). Аналогичным образом, могут быть внесены изменения в данные, касающиеся подкласса/класса Ат 1948, BSS 1930, PC 1928 и DC 1958.
Система может перейти обратно от стадии 1982 к стадии 1920. Сброс данных на стадии 1982 может привести к стадии 1920.
Специалистам в данной области техники понятно, что элементы устройства, средства и код, представленные и описанные в настоящем документе, могут быть сконфигурированы иным способом, чем тот, что изложен в настоящем документе, и что один или несколько элементов могут быть использованы по выбору. Специалистам в данной области техники понятно, что указанные стадии процессов и способов, представленных и описанных в настоящем документе, могут быть осуществлены в другом порядке, чем тот, что изложен в настоящем документе, и что одна или несколько проиллюстрированных стадий могут быть использованы по выбору.
Таким образом, были представлены устройство, способы и средства, включая машиночитаемый код, для осуществления одной или нескольких стадий: определения пригодности антитела для включения в состав терапевтического средства на основе рассчитанных параметров физико-химических свойств антитела; отбора антител-кандидатов для включения в состав терапевтического средства на основе рассчитанных параметров физико-химических свойств антитела; и приготовления терапевтического средства на основе рассчитанных параметров физико-химических свойств антитела. Специалистам в данной области техники понятно, что практическое воплощение настоящего изобретения возможно в других вариантах осуществления, чем те, что описаны в настоящем документе, которые приведены с иллюстративной целью, а не с целью ограничения объема охраны настоящего изобретения. Объем охраны настоящего изобретения определяется приведенной ниже формулой изобретения.
| название | год | авторы | номер документа |
|---|---|---|---|
| СПОСОБ УЛУЧШЕНИЯ СТАБИЛЬНОСТИ АНТИТЕЛ | 2014 |
|
RU2711719C2 |
| СПОСОБЫ И КОМПОЗИЦИИ, ВКЛЮЧАЮЩИЕ ОЧИЩЕННЫЕ РЕКОМБИНАНТНЫЕ ПОЛИПЕПТИДЫ | 2014 |
|
RU2793783C1 |
| ВАРИАНТЫ И ИЗОФОРМЫ АНТИТЕЛ С ПОНИЖЕННОЙ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЬЮ | 2018 |
|
RU2813990C2 |
| АНТИТЕЛА К LY6G6D И СПОСОБЫ ПРИМЕНЕНИЯ | 2020 |
|
RU2818569C1 |
| АНТИТЕЛО, КОТОРОЕ СВЯЗЫВАЕТСЯ С VEGF И IL-1БЕТА, И СПОСОБЫ ПРИМЕНЕНИЯ | 2019 |
|
RU2816476C2 |
| ИММУНОТЕРАПИЯ С ПРИМЕНЕНИЕМ АНТИТЕЛ, СВЯЗЫВАЮЩИХ БЕЛОК 1 ПРОГРАММИРУЕМОЙ СМЕРТИ КЛЕТОК (PD-1) | 2017 |
|
RU2768404C2 |
| АНТИТЕЛА, НАЦЕЛЕННЫЕ НА О-АНТИГЕН НА ОСНОВЕ ГАЛАКТАНА ИЗ К.PNEUMONIAE | 2015 |
|
RU2759950C2 |
| АНТИТЕЛА С ДВОЙНОЙ СПЕЦИФИЧНОСТЬЮ | 2014 |
|
RU2732032C2 |
| АНТИТЕЛА К ФАКТОРУ XI И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ | 2016 |
|
RU2739946C2 |
| ПРЕПАРАТ, СОДЕРЖАЩИЙ АНТИТЕЛО | 2017 |
|
RU2748046C2 |
Группа изобретений относится к области отбору и получения антител. Способ определения пригодности раствора антитела для включения в фармацевтическую композицию включает установление верхнего предела вязкости; расчет, исходя из информации о первичной структуре структурной информации об антителе в растворе, общего заряда и зарядовой асимметрии. Причем первичная структура включает: аминокислотную последовательность вариабельного домена легкой цепи (VL) и аминокислотную последовательности вариабельного домена тяжелой цепи (VH); получение: первого фактора масштабирования, который соответствует общему заряду, второго фактора масштабирования, который соответствует зарядовой асимметрии; расчет показателя исходя из целевой функции, содержащей факторы масштабирования, общий заряд и зарядовую асимметрию, причем показатель представляет собой вязкость раствора антитела; и определение того, что раствор антитела является пригодным для включения в фармацевтическую композицию, принимая во внимание указанный показатель, не превышающий верхнего предела вязкости. Также раскрывается вариант способа определения пригодности раствора целевого антитела для включения в фармацевтическую композицию, способ отбора между первым раствором антитела и вторым раствором антитела для включения в фармацевтическую композицию. Группа изобретений обеспечивает повышение вероятности технического успеха для эффективного продвижения новых терапевтических средств на основе мАт в клиническую практику. 3 н. и 25 з.п. ф-лы, 19 ил., 1 табл.
1. Способ определения пригодности раствора антитела для включения в фармацевтическую композицию, включающий:
установление верхнего предела вязкости;
расчет, исходя из информации о первичной структуре структурной информации об антителе в растворе, общего заряда и зарядовой асимметрии, причем первичная структура включает:
аминокислотную последовательность вариабельного домена легкой цепи (VL) и аминокислотную последовательности вариабельного домена тяжелой цепи (VH);
получение:
первого фактора масштабирования, который соответствует общему заряду,
второго фактора масштабирования, который соответствует зарядовой асимметрии;
расчет показателя исходя из целевой функции, содержащей факторы масштабирования, общий заряд и зарядовую асимметрию, причем показатель представляет собой вязкость раствора антитела; и
определение того, что раствор антитела является пригодным для включения в фармацевтическую композицию, принимая во внимание указанный показатель, не превышающий верхнего предела вязкости.
2. Способ по п. 1, причем общий заряд получают путем сложения значения общего заряда аминокислотной последовательности VL и значения общего заряда аминокислотной последовательности VH.
3. Способ по п. 2, причем зарядовая асимметрия представляет собой арифметическое произведение значения общего заряда аминокислотной последовательности VL и значения общего заряда аминокислотной последовательности VH.
4. Способ по п. 1, где получение факторов масштабирования дополнительно включает:
определение факторов масштабирования исходя из данных по меньшей мере одного измерения вязкости по меньшей мере одного раствора исследуемого антитела, отличного от раствора предсуществующего антитела, причем предсуществующее антитело и исследуемое антитело относятся к одному и тому же классу антител.
5. Способ по п. 4, причем получение факторов масштабирования дополнительно включает: определение факторов масштабирования исходя из данных о множестве измерений вязкости по меньшей мере одного раствора исследуемого антитела, причем каждое измерение вязкости проводилось при разных параметрах раствора.
6. Способ по п. 1 или 5, причем в целевой функции log10 от показателя содержит сумму: (общий заряд умножается на первый фактор масштабирования) плюс (зарядовая асимметрия умножается на второй фактор масштабирования).
7. Способ по п. 1, дополнительно включающий:
расчет показателя гидрофобности исходя из информации о структуре, исходя из информации об одном или нескольких участках, определяющих комплементарность (CDR) антитела; и
отбор третьего фактора масштабирования, который соответствует показателю гидрофобности, причем целевая функция дополнительно содержит третий фактор масштабирования.
8. Способ по п. 7, причем показатель гидрофобности включает итоговое значение функций суммирования по значениям гидрофобности одного или нескольких CDR.
9. Способ по п. 8, причем каждая из функций суммирования представляет собой соотношение суммы значений, полученных для гидрофобных остатков CDR, и суммы значений, полученных для гидрофильных остатков CDR.
10. Способ по п. 8 или 9, причем указанные значения представляют собой значения гидрофобности по шкале Эйзенберга.
11. Способ по п. 7 или 8, причем один или несколько CDR включают один, два, три, четыре, пять или шесть CDR.
12. Способ по п. 7 или 8, причем один или несколько CDR включают все шесть CDR.
13. Способ по п. 7, причем в целевой функции log10 от показателя содержит сумму: (общий заряд умножается на первый фактор масштабирования), плюс (зарядовая асимметрия умножается на второй фактор масштабирования), плюс (гидрофобность умножается на третий фактор масштабирования).
14. Способ определения пригодности раствора целевого антитела для включения в фармацевтическую композицию, включающий:
установление верхнего предела вязкости;
расчет, исходя из информации о первичной структуре структурной информации об антителе в растворе, общего заряда и зарядовой асимметрии, причем первичная структура включает:
аминокислотную последовательность вариабельного домена легкой цепи (VL) и аминокислотную последовательности вариабельного домена тяжелой цепи (VH);
получение:
первого фактора масштабирования, который соответствует общему заряду, и
второго фактора масштабирования, который соответствует зарядовой асимметрии;
расчет показателя исходя из целевой функции, содержащей факторы масштабирования, общий заряд и зарядовую асимметрию, причем показатель представляет собой вязкость раствора антитела; и
принимая во внимание указанный показатель, превышающий верхний предел вязкости,
мутагенез, исходя из информации, полученной от вычислительного устройства о первичной структурной информации об антителе, одного или нескольких аминокислотных остатков по меньшей мере одной аминокислотной последовательности вариабельной области легкой цепи и тяжелой цепи антитела для создания целевого антитела, и
определение того, что раствор целевого антитела является пригодным для включения в фармацевтическую композицию.
15. Способ по п. 14, причем определение того, что раствор целевого антитела является пригодным для включения в фармацевтическую композицию, включает:
расчет другого показателя, исходя из информации о структуре целевого антитела в растворе; и
определение того, что другой показатель не превышает верхний предел вязкости.
16. Способ отбора между первым раствором антитела и вторым раствором антитела для включения в фармацевтическую композицию, включающий:
для каждого из первого раствора антитела и второго раствора антитела
расчет, исходя из информации о первичной структуре структурной информации об антителе в растворе, общего заряда и зарядовой асимметрии, причем первичная структура включает:
аминокислотную последовательность вариабельного домена легкой цепи (VL) и аминокислотную последовательности вариабельного домена тяжелой цепи (VH);
получение:
первого фактора масштабирования, который соответствует общему заряду, и второго фактора масштабирования, который соответствует зарядовой асимметрии;
расчет показателя исходя из целевой функции, содержащей факторы масштабирования, общий заряд и зарядовую асимметрию, причем показатель представляет собой вязкость; и
отбор для включения в фармацевтическую композицию одного из первого раствора антитела и второго раствора антитела на основе того, какой показатель раствора антитела представляет более низкую вязкость.
17. Способ по п. 16, причем общий заряд получают путем сложения значения общего заряда аминокислотной последовательности VL и значения общего заряда аминокислотной последовательности VH.
18. Способ по п. 16, причем зарядовая асимметрия представляет собой арифметическое произведение значения общего заряда аминокислотной последовательности VL и значения общего заряда аминокислотной последовательности VH.
19. Способ по п. 16, где получение факторов масштабирования дополнительно включает:
определение факторов масштабирования исходя из данных по меньшей мере одного измерения вязкости по меньшей мере одного раствора исследуемого антитела, отличного от раствора предсуществующего антитела, причем предсуществующее антитело и исследуемое антитело относятся к одному и тому же классу антител.
20. Способ по п. 19, причем получение факторов масштабирования дополнительно включает: определение факторов масштабирования исходя из данных о множестве измерений вязкости по меньшей мере одного раствора исследуемого антитела, причем каждое измерение вязкости проводилось при разных параметрах раствора.
21. Способ по п. 16 или 20, причем в целевой функции log 10 от показателя содержит сумму: (общий заряд умножается на первый фактор масштабирования) плюс (зарядовая асимметрия умножается на второй фактор масштабирования).
22. Способ по п. 16, дополнительно включающий:
расчет показателя гидрофобности, исходя из информации о структуре, исходя из информации об одном или нескольких участках, определяющих комплементарность (CDR) антитела; и
отбор третьего фактора масштабирования, который соответствует показателю гидрофобности, причем целевая функция дополнительно содержит третий фактор масштабирования.
23. Способ по п. 22, причем показатель гидрофобности включает итоговое значение функций суммирования по значениям гидрофобности одного или нескольких CDR.
24. Способ по п. 23, причем каждая из функций суммирования представляет собой соотношение суммы значений, полученных для гидрофобных остатков CDR, и суммы значений, полученных для гидрофильных остатков CDR.
25. Способ по п. 23 или 24, причем указанные значения представляют собой значения гидрофобности по шкале Эйзенберга.
26. Способ по п. 22 или 23, причем один или несколько CDR включают один, два, три, четыре, пять или шесть CDR.
27. Способ по п. 22 или 23, причем один или несколько CDR включают все шесть CDR.
28. Способ по п. 22, причем в целевой функции log10 от показателя содержит сумму: (общий заряд умножается на первый фактор масштабирования) плюс (зарядовая асимметрия умножается на второй фактор масштабирования), плюс (гидрофобность умножается на третий фактор масштабирования).
| ВЫДЕЛЕННОЕ АНТИ-CD30 АНТИТЕЛО (ВАРИАНТЫ), ХОЗЯЙСКАЯ КЛЕТКА, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ХИМЕРНОГО ИЛИ ГУМАНИЗИРОВАННОГО ВАРИАНТА АНТИ-CD30 АНТИТЕЛ (ВАРИАНТЫ), СПОСОБ ИНГИБИРОВАНИЯ РОСТА КЛЕТОК CD30+ И СПОСОБ ИНГИБИРОВАНИЯ РОСТА ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК, ЭКСПРЕССИРУЮЩИХ CD30 | 2006 |
|
RU2492186C2 |
| TIMOTHY M | |||
| LAUER ET AL | |||
| "Developability index: A rapid in silico tool for the screening of antibody aggregation propensity", JOURNAL OF PHARMACEUTICAL SCIENCES, NO | |||
| Печь для непрерывного получения сернистого натрия | 1921 |
|
SU1A1 |
| SANDEEP YADAV ET AL | |||
| "Establishing a Link Between Amino Acid Sequences and Self-Associating and Viscoelastic Behavior of Two | |||
