ШТАММ БАКТЕРИЙ SALMONELLA ENTERICA VGNKI-11 (ВКШМ-Б-848М) В КАЧЕСТВЕ КОНТРОЛЬНОГО ШТАММА ДЛЯ ФЕНОТИПИЧЕСКИХ И МОЛЕКУЛЯРНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ В ДИАГНОСТИКЕ САЛЬМОНЕЛЛЁЗА Российский патент 2021 года по МПК C12N1/20 C12Q1/04 C12R1/01 

Изобретение относится к микробиологии (бактериологии), а именно к разделу определения чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам и молекулярной детекции механизмов резистентности, и может быть использовано в качестве контрольного штамма для контроля качества при диагностике сальмонеллеза на этапах фенотипических исследований (определение чувствительности к антибиотикам: выявление устойчивости к цефалоспоринам, фторхинолонам, тетрациклинам, аминогликозидам, сульфаниламидам, триметоприму) и молекулярных исследований направленных на создание штамма сальмонелл, характеризующегося наличием резистентности, ассоциированной с генами устойчивости к антимикробным препаратам, (gyrA (D87Y), tetA, tetR, aadA1, dfrAH, sul-1), совмещенных с наличием интегронов 1-го и 2-го классов.

В последнее десятилетие среди возбудителей сальмонеллеза отмечается тенденция к увеличению доли выявления множественно лекарственно-устойчивых штаммов. В нашей стране впервые осуществлена идентификация интегронов 1-го класса из пищевой продукции. Интегроны представляют собой рекомбинационную систему, обладающую способностью к интеграции и экспрессии генов в форме кассет. Являясь системой горизонтального переноса генов, интегроны играют ключевую роль в распространении устойчивости к лекарственным препаратам внутри и между различными видами бактерий, а также в эволюции бактериальных геномов [1].

Геномный анализ плазмидных последовательностей показал, что S. Infantis VGNKI-11 имеет интегроны 1-го и 2-го классов, ассоциированные с устойчивостью к сульфаниламидам (ген sul-1). Организация интегронов, выявленных в штамме Salmonella enterica 11 показана на рисунке 1.

В плазмидном контиге штамма S11 стабильно идентифицировали ген aadA1. Устойчивость к аминогликозидам развивается в результате ферментативной инактивации антибиотика путем присоединения молекулы уксусной кислоты (аас6-I, ацетилтрансфераза) или молекулы нуклеотида аденина (aadA, аденилтрансфераза). Модифицированные молекулы аминогликозидов теряют способность связываться с рибосомами и подавлять биосинтез белка [2]. Так же в плазмидном контиге штамма S11 стабильно вывяли ген резистентности к сульфаниламидам sul1. Мишенью для действия сульфаниламидов и триметоприма является ферменты биосинтеза фолатов в бактериальной клетке: сульфаниламиды ингибируют дегидроптероатсинтетазу, триметоприм - дигидрофолатредуктазу. В результате такого воздействия нарушается синтез дигидро- и тетрагидрофолиевых кислот и как следствие синтез пуринов и пиримидинов. Гены dfrA14 и sul1 кодируют атипичные дегидроптероатсинтетазу и дигидрофолатредуктазу, практически не чувствительные к антибактериальным средствам [3]. Как правило, эти гены входят в состав интегронов и ассоциированы с транспозонами [4].

В состав интегрона 2 класса входят: Int2, attI, attC, dfrA14 и lsp (lipoprotein signal peptidase). В выявленных интегронах 2 класса интеграза Int2 не содержит nonsense-мутации, типичной для бактерий, выделенных из клинических образцов.

Так же известен штамм бактерий SALMONELLA ENTERICA SUBSP. ENTERICA SEROVAR TYPHI в качестве контрольного для фенотипических и молекулярных исследований при диагностике брюшного тифа, однако он характеризуется устойчивостью высокого уровня только к фторхинолонам, обусловленной двумя мутациями в хромосомном гена gyrA вида. Предлагаемый в качестве изобретения штамм имеет стабильные параметры множественной резистентности, что позволяет его более широкое использование. Ген устойчивости к сульфаниамидам, ассоциированный с интегронами 1 и 2-го классов.

Наиболее близким по сущности к заявляемому изобретению является штамм бактерий Е. Coli, с интегроном подобного состава, выделенной из клинического образца в 2008 году Marquez et al., которые показали, что интеграза без стоп-кодона также является функциональной, т.е. кодирует белок, которые обеспечивает рекомбинантную активность.

Изобретение направлено на разработку контрольного штамма Salmonella enterica VGNKI-11, необходимого для обеспечения достоверной диагностики сальмонеллеза, ассоциированного с AMP.

Задача настоящего изобретения - референтный штамм, стабильно сохраняющий фенотипические свойства, содержащие гены, нуклеотидная последовательность которых специфична для вида, подвида, биовара, и создание на их основе комплекта контрольных препаратов ДНК для генно-диагностических исследований.

Штамм депонирован во «Всероссийской коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве» под номером ВКШМ-Б-848М.

Штамм бактерий Salmonella enterica VGNKI-11 в качестве контрольного штамма для молекулярных исследований при идентификации гена устойчивости к сульфаниламидам, ассоциированного с интегронами 1 и 2-го классов. Изобретение обеспечивает выполнение диагностики штаммов содержащих интегроны 1 и 2-го классов и гена устойчивости к сульфаниамидам.

Таксономия и описание штамма: семейство Enterobacteriaceae род Salmonella вид Salmonella enterica серовар Infantis.

Штамм сальмонелл Salmonella enterica S11 природный, выделен из биологического материала.

Характеристика штамма Salmonella enterica ВКШМ-Б-848М.

Культурально-морфологические свойства штамма - грамотрицательные подвижные палочки без спор и капсул.

Патогенные свойства: штамм патогенный для человека, 4 группа патогенности согласно СП 1.2.036-95 и СП 1.3.2322-08.

Культуральные свойства:

Через 18-24 час культивирования при температуре (37±1)°С штамм формирует:

- на среде Эндо бледно-розовые, прозрачные, круглые, плоские, с ровными краями колонии, диаметром 2-3 мм;

- на висмут-сульфит-агаре - круглые, плоские с ровными краями, черные с металлическим блеском и почернением среды под колонией, диаметром 1,5-2 мм;

- на XLD-агаре - круглые, плоские, с ровными краями, бесцветные (в цвет агара) с черным центром колонии, диаметром 2-3 мм;

- на хромогенном агаре образуют сиреневые, характерные для сальмонелл колонии, диаметром 2-3 мм;

- на жидких питательных средах и полужидком МПА (0,3%) наблюдается диффузное помутнение среды.

Особенности штамма: gyrA (D87Y), tetA, tetR, aadA1, dfrA14, sul-1

Для поиска генов антибиотикорезистентности в бактериальном геноме использовали сервис ResFinder и базы данных Antibiotic Resistance Gene-ANNOTation, The Comprehensive Antibiotic Resistance Database и NCBI Bacterial Antimicrobial Resistance Reference Gene Database. Подтверждено наличие генетических факторов резистентности gyrA (D87Y), tetA, tetR, aadA1, dfrA14, sul-1.

Данные, полученные при помощи NGS на Miseq, и данные функциональных микробиологических тестов хорошо согласуются между собой (таблица 2).

Молекулярный механизм устойчивости - гены устойчивости к антимикробным препаратам gyrA (D87Y), tetA, tetR, aadA1, dfrA14, sul-1, а так же интегроны 1 и 2 классов.

Стабильность наличия мутаций в геноме контрольного штамма Salmonella enterica ВКШМ-Б-848М подтверждалась повторным секвенированием ДНК штамма и анализом нуклеотидной последовательности после хранения штамма в течение 6 месяцев в лиофилизированном виде в ампулах под вакуумом при температуре 2-8 С°. Изобретение реализуется следующим образом.

Пример 1

Контроль качества определения механизма устойчивости к антимикробным препаратам, ассоциированных с генами устойчивости (gyrA (D87Y), tetA, tetR, aadA1, dfrA14, sul-1), а так же интегронами 1 и 2 класса которая связана с устойчивостью к сульфаниламидам по данным полногеномного секвенирования.

Выделение геномной ДНК из жидкой суточной бактериальной культуры Salmonella enterica проводили методом сорбции на силикагеле с использованием набора АмплиПрайм ДНК-сорб-В (ФБУН ЦНИИЭ) в соответствии с инструкцией производителя. Концентрацию ДНК измеряли на флуориметре QuantiFluor® ONE dsDNA System (Promega Corporation, США).

Подготовку библиотек проводили с использованием набора для NGS Nextera XT DNA Sample Preparation Kit, набора индексов Nextera XT Index Kit, магнитных шарики для очистки ампликонов (Agencourt AMPure ХР, Beckman Coulter, США), набор реагентов для секвенирования MiSeq® Reagent Kit v2/v3 согласно стандартному протоколу производителя. Секвенирование геномов исследуемых штаммов и контрольного штамма проводили на приборе MiSeq с использованием наборов реагентов MiSeq® Reagent Kit v2/v3 (CILIA).

Поиск генетических факторов, обеспечивающих резистентность к антибиотикам, вели при помощи нескольких ресурсов: онлайн-ресурс ResFinder, находящегося на сервере Центра геномной эпидемиологии Датского технического университета; база данных Antibiotic Resistance Gene-ANNOTation, база данных The Comprehensive Antibiotic Resistance Database. Аннотация геномов была выполнена с помощью сервера RAST на открытой платформе для сравнительного анализа геномов SEED.

Контрольный штамм Salmonella enterica ВКШМ-Б-848М проявлял заявленные свойства: стабильно обнаруживались гены устойчивости к антимикробным препаратам, gyrA (D87Y), tetA, tetR, aadA1, dfrA14, sul-1, атак же интегроны 1 и 2 классов, связанных с устойчивостью к сульфаниламидам.

Пример 2

При использовании метода серийных разведений руководствовались следующими методическими рекомендациями: МУК 4.2.1890-04 «Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам»; VET01-А4 Performance Standards for Antimicrobial Disk and Dilution Susceptibility Tests for Bacteria Isolated From Animals, Approved Standard - Fourth Edition.

Использовали микрометод серийных разведений, т.е. с использованием стерильных 96-ти луночных планшетов и величине конечного объема 100 мкл.

В качестве питательной среды использовали бульон Мюллера-Хинтона с добавлением ионов кальция и магния. Планшеты инкубировали при 37°С в течение 24 часов. Учет результатов проводили визуально, сравнивая рост микроорганизма в присутствии АБП с ростом культуры в ячейке без АБП. За минимальную подавляющую концентрацию принимали концентрацию, обеспечивающую полное подавление видимого роста исследуемого штамма.

Контрольный штамм относился к категории «Устойчивый» к цефалоспоринам, фторхинолонам, тетрациклинам, аминогликозидам, сульфаниламидам, триметоприму уровень устойчивости расценивался как высокий.

Для обеспечения достоверной диагностики сальмонеллеза, ассоциированного с AMP необходимо проводить контроль качества на каждом этапе исследования материала. Предлагаемый штамм обладает стабильными свойствами, позволяющими контролировать этап определения механизма устойчивости фенотипическими и молекулярными методами.

Литературные источники

1. Kaushik М. et al. Integrons in Enterobacteriaceae: diversity, distribution and epidemiology. Int J Antimicrob Agents. 2018; 51(2):167-176. doi: 10.1016/j.ijantimicag.2017.10.004.

2. Ramirez M.S., Tolmasky M.E. Aminoglycoside modifying enzymes. Drug Resist Updat. 2010; 13(6):151-71. doi: 10.1016/j.drup.2010.08.003.

3. Lopez M. et. al. First detection of the staphylococcal trimethoprim resistance gene dfrK and the dfrK-carrying transposon Tn559 in enterococci. Microb Drug Resist. 2012; 18(1):13-18. doi: 10.1089/mdr.2011.0073.

4. Deng Y. et al. Resistance integrons: class 1, 2 and 3 integrons Ann Clin Microbiol Antimicrob (2015) 14:45 DOI 10.1186/s12941-015-0100-6.

Изобретение относится к микробиологии. Штамм бактерий Salmonella enterica VGNKI-11, обладающий множественной резистентностью к антимикробным препаратам, с выявленными генетическими детерминантами устойчивости, депонирован во «Всероссийской коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве» под номером ВКШМ-Б-848М и может быть использован для фенотипических и молекулярных исследований при идентификации интегронов 1 и 2 класса, в диагностике сальмонеллеза. Изобретение позволяет обеспечить выполнение диагностики штаммов с множественной устойчивостью к антимикробным средствам: цефалоспоринам, фторхинолонам, тетрациклинам, аминогликозидам, сульфаниламидам, триметоприму. 2 табл., 2 пр., 1 ил.

Штамм бактерий Salmonella enterica VGNKI-11, депонированный во «Всероссийской коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве» под номером ВКШМ-Б-848М, обладающий множественной резистентностью к антимикробным препаратам, с выявленными генетическими детерминантами устойчивости для фенотипических и молекулярных исследований при идентификации интегронов 1 и 2 класса, в диагностике сальмонеллеза.