ВЕКТОРЫ НА ОСНОВЕ АДЕНОАССОЦИИРОВАННЫХ ВИРУСОВ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ МУКОПОЛИСАХАРИДОЗОВ Российский патент 2021 года по МПК A61K48/00 C12N15/864 C12N9/16 

Область техники, к которой относится настоящее изобретение

Настоящее изобретение относится к векторам, пригодным для экспрессии представляющих интерес белков, и их применению в генной терапии. Настоящее изобретение также относится к векторам и последовательностям нуклеиновых кислот, пригодных для лечения мукополисахаридозов (MPS), и, в частности, для лечения мукополисахаридозов II типа или синдрома Хантера.

Предшествующий уровень техники настоящего изобретения

Лизосома представляет собой органеллу, присутствующую в цитоплазме животных клеток, которая содержит более 50 гидролаз, которые разрушают биомолекулы во время рециклинга отработанных клеточных компонентов или после поглощения вирусов и бактерий. Эта органелла содержит несколько типов гидролитических ферментов, в том числе протеаз, нуклеаз, гликозидаз, липаз, фосфолипаз, фосфатаз и сульфатаз. Все ферменты представляют собой кислые гидролазы.

Лизосомные болезни накопления (LSD) вызваны генетическими дефектами, которые затрагивают один или несколько лизосомальных ферментов. Эти наследственные заболевания, как правило, возникают в результате недостатка активности определенного фермента, присутствующего в лизосоме. В меньшей степени эти заболевания могут возникать в результате недостаточности белков, участвующих в биогенезе лизосом.

LSD по отдельности встречаются редко, однако как группа эти нарушения являются сравнительно распространенными в общей популяции. Сочетанная распространенность LSD составляет примерно 1 на 5000 живорожденных. См. Meikle Р., et al., JAMA 1999; 281:249-254. Однако некоторые группы в общей популяции особенно страдают от высокой частоты LSD. Например, болезни Гоше и Тэя-Сакса у потомков лиц еврейского происхождения из Центральной и Восточной Европы (ашкенази) составляет 1 на 600 и 1 на 3900 рождений соответственно.

Мукополисахаридоз II типа (MPSII), также известный как синдром Хантера и впервые описанный д-ром Чарльзом Хантером, представляет собой хроническую, прогрессирующую и полиорганную LSD, вызванную недостатком или отсутствием активности фермента идуронат-2-сульфатазы (IDS), кодируемого геном IDS, и участвующего в последовательном разрушении в лизосомах гликозаминогликанов (GAG) гепарансульфата (HS) и дерматансульфата (DS), приводя к их патологическому накоплению. См. Hunter, Proc R Soc Med. 1917; 10 (Sect Study Dis Child): 104-16. Вследствие Х-сцепленного рецессивного типа наследования почти все пациенты с синдромом Хантера являются мужчинами, хотя в литературе были описаны несколько женщин с синдромом Хантера. См. Mossman et al., Arch Dis Child. 1983; 58:911-915, Gullen-Navarro et al., Orphanet J Rare Dis. 2013; 25(8):92, Valstar et al., J. Inherit. Metab. Dis. 2008; 31(2):240-52.

MPSII характеризуется клинически как начинающаяся в детском возрасте прогрессирующая нейропатия центральной нервной системы (CNS). Дети с синдромом Хантера, как правило, при рождении являются нормальными, однако в возрасте до 2 лет у них появляются симптомы. См. Schwartz et al., Acta Paediatr Suppl. 2007; 96:63-70. Клиническое течение болезни, как правило, начинается с медленно прогрессирующего когнитивного нарушения с последующими когнитивными расстройствами и прогрессирующим ухудшением интеллекта. Потеря способности передвигаться наступает позже. Помимо неврологических симптомов, пациенты с MPSII страдают от изменений, которые не носят неврологический характер, в том числе рецидивирующих инфекций уха, горла, носа и дыхательных путей, частой диареи и запора, сердечной недостаточности, грубых черт лица, невысокого роста, прогрессирующей скованности и разрушения суставов, дефектов скелета, которые нарушают подвижность, а также гепато- и спленомегалии. См. Neufeld and Muenzer, "The Mucopolysaccharidoses" в Scriver С, et al., Eds., "The metabolic and molecular basis of inherited disease", McGraw-Hill Publishing Co., New York, NY, US, 2001, pp. 3421-3452. Спектр клинических проявлений заболевания значительно варьирует в зависимости от остаточных уровней активности IDS, которую имеет пациент, которая в свою очередь определяется по лежащей в основе мутации гена IDS, при этом >300 мутаций гена IDS описано к настоящему времени (http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/gene.php?gene=IDS). В целом были описаны две клинические формы MPSII. Наиболее тяжелая форма с началом болезни в возрасте от 18 месяцев до 4 лет встречается в три раза чаще, чем слабая форма, и характеризуется грубыми чертами лица, деформациями скелета, гепатоспленомегалией и неврологическим поражением, которое приводит к умственной отсталости. См. Wraith et al., Eur J Pediatr. 2008; 167(3):267-277. Пациенты обычно умирают в течение второго десятилетия жизни в результате обструктивного заболевания дыхательных путей и сердечной недостаточности. См. Wraith et al., Eur J Pediatr. 2008; 167(3):267-277, Neufeld and Muenzer, выше. Более медленно прогрессирующая форма заболевания, с более поздним началом, более продолжительной выживаемостью и минимальной неврологической дисфункцией, известная как аттенуированный фенотип, также была описана в подгруппе пациентов с MPSII. См. Wraith et al., Eur J Pediatr. 2008; 167(3):267-277, Neufeld and Muenzer, выше.

До недавнего времени определенные виды терапии синдрома MPSII отсутствовали и единственным доступным лечением было симптоматическое с применением широкого диапазона неспецифических лекарственных препаратов для предупреждения и контроля осложнений заболевания. В последние несколько лет стали доступными два основных варианта терапии: ферментозаместительная терапия (ERT) и трансплантация гемопоэтических стволовых клеток (HSCT). Схема обеих терапевтических стратегий основана на возможности перекрестной коррекции, исходя из того факта, что нормальные клетки секретируют значительные количества меченых манноза-6-фосфатом (М6Р) растворимых лизосомальных ферментов, таких как IDS, которые затем могут захватываться из внеклеточногого компартмента другими клетками с участием М6Р-рецепторов на плазматической мембране и направляться в лизосомы. См. Enns et al., Neurosurg Focus. 2008; 24(3-4):E12. Кроме того, существует пороговая величина остаточной ферментативной активности, как правило, очень низкая, выше которой клетка способна справляться с поступлением субстратов, а субъекты не поражены заболеванием, что указывает на то, что восстановление нормальной активности не является необходимым элементом изменения клинического течения болезни. См. Neufeld, Annu Rev Biochem. 1991; 60:257-80.

С момента разрешения Управлением по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных препаратов (FDA) в 2006 г. и Европейским агентством по лекарственным средствам (ЕМА) в 2007 г. рекомбинантная человеческая идуронат-2-сульфатаза (Идурсульфаза, ELAPRASE^®, Shire Pharmaceuticals) была показана для лечения пациентов с MPSII. Препарат вводится еженедельно в дозе 0,5 мг/кг при помощи внутривенной инфузии со средним временем инфузии, составляющем 1-3 часа. См. Giugliani et al., Genet Mol Biol. 2010; 33(4):589-604. Препарат ELAPRASE^® был разрешен после рандомизированного двойного слепого плацебо-контролируемого исследования 96 пациентов с синдромом Хантера без когнитивного ухудшения в начальный момент времени и при умеренно прогрессирующем заболевании. См. Muenzer et al., Genet Med. 2006; 8(8):465-73, Muenzer et al., Genet Med. 2011; 13(2):95-101. Через один год после лечения пациенты, получавшие препарат ELAPRASE^®, демонстрировали рост расстояния, проходимого за шесть минут (тест шестиминутной ходьбы) по сравнению с пациентами, получавшими плацебо. См. Muenzer et al., Genet Med. 2011; 13(2):95-101. Также было показано, что ERT совместно с препаратом ELAPRASE^® повышала диапазон подвижности суставов (ROM) и снижала объемы печени и селезенки. См. Muenzer et al., Genet Med. 2011; 13(2):95-101. Кроме того, имеются доказательства улучшенной легочной функции в случае, когда нейтрализующие антитела к идурсульфазе не присутствуют; об образовании антител к IDS сообщалось у 50% пациентов, получавших продолжительное лечение. См. Muenzer et al., Genet Med. 2011; 13(2):95-101.

В исследовании фазы 1/1 I у 31 пациента с MPSII сравнивали эффективность препарата ELAPRASE^® и второго препарата на основе бета-изоформы идурсульфазы с предложенным коммерческим названием Хантераза^® (NCT01301898, http://clinicaltrials.gov). Оба белка вводили внутривенно в дозе 0,5 мг/кг/неделя в случае препарата ELAPRASE^® и 0,5 и 1,0 мг/кг/неделя в случае хантеразы^® в течение 24 недель. Результаты в случае лечения хантеразой^® отличались сниженной секрецией GAG в моче и улучшенными показателями теста 6-минутной ходьбы, однако ни одна из доз не смогла опосредовать терапевтическую эффективность легочной функции, сердечной функции или подвижности суставов. См. Sohn et al., Orphanet J Rare Dis. 2013;8:42. Инфузии хантеразы^®, как правило, были безопасными и хорошо переносимыми, хотя сообщалось о немногих побочных эффектах, таких как крапивница и кожная сыпь. См. Sohn et al., Orphanet J Rare Dis. 2013; 8:42. Базовое исследование PIN недавно было завершено (http://clinicaltrials.gov, NCT01645189), однако результаты пока недоступны.

Вследствие гиперчувствительности к препарату ELAPRASE^® во время введения препарата должно быть доступным медицинское обеспечение. Во время этого исследования самыми тяжелыми описанными нежелательными явлениями были анафилактические реакции, которые могли возникнуть в любой момент во время инфузии препарата ELAPRASE^® или до 24 часов включительно после введения препарата. См. Muenzer et al., Genet Med. 2006; 8(8):465-73, Muenzer et al., Genet Med. 2011; 13(2):95-101. Такие анафилактические реакции, которые могут угрожать жизни пациента, включают респираторный дистресс, гипоксию, гипотензию, крапивницу и/или ангиоэдему горла или языка (http://elaprase.com/) и могут требовать вмешательств, таких как реанимационная или экстренная трахеотомия, и лечение ингаляционными бета-адренергическими агонистами, эпинефрином или внутривенными кортикостероидами. См. Burton et al., Mol Genet Metab. 2011; 103(2): 113-20. Другие недостатки ERT включают: 1) сложность осуществления 1-3-часовых внутривенных инфузий у пациентов детского возраста, многие из которых страдают психическим заболеванием (http://elaprase.com/), 2) тот факт, что 50% пациентов, получавших препарат ELAPRASE® в клинических исследованиях, имели положительные результаты на антитела к идурсульфазе с неизвестной до настоящего времени клинической значимостью, однако которые могли ограничивать эффективность препарата при длительном применении согласно тестам легочных функций. См. Muenzer et al., Mol Genet Metab. 2007; 90(3):329-37, Muenzer et al., Genet Med. 2006; 8(8):465-73, Muenzer et al., Genet Med. 2011; 13(2):95-101, и 3) высокая стоимость терапии, которая включает также затраты на домашний уход. См. Wyatt et al., Health Technol Asses. 2012; 6(39):1-543.

Вне зависимости от опасений по поводу безопасности или стоимости введения препарата ELAPRASE^®, неспособность внутривенно вводимой рекомбинантной IDS достигать ЦНС, по меньшей мере при рекомендуемой в настоящее время дозе 0,5 мг/кг в неделю, вероятно, ограничивает возможность применения ERT для лечения тяжелой нейродегенерации, наблюдаемой у пациентов с синдромом Хантера. Лишь частичное восстановление мозговой активности на фоне IDS достигали при еженедельном внутривенном введении 1,2 или 10 мг препарата ELAPRASE^®/кг 2- или 7-месячным мышам с MPSII соответственно. См. Polito et al,, Hum Mol Genet. 2010; 19(24):4871-85. Кроме того, даже при этих высоких дозах активность IDS в кровотоке возвращалась к предшествующим лечению уровням через 72 часа после введения белка. См. Polito et al., Hum Mol Genet. 2010; 19(24):4871-85. Indeed, intravenous ERT failed to correct GAG accumulation in the brains of a murine model of MPSII. См. Garcia et al., Mol Genet Metab. 2007; 91(2):183-90. Таким образом, показание препарата ELAPRASE^® ограничено лечением не относящихся к неврологическим симптомам заболевания.

Альтернативой внутривенной доставке ERT является введение экзогенного фермента непосредственно в ЦНС. Введение 20 мкг рекомбинантной человеческой IDS в латеральный желудочек 5-месячным мышам с MPSII каждые 3 недели повышало активность IDS в головном мозге, мозжечке и органах тела, таких как печень, сердце, почки и семенники. См. Higuchi et al., Mol Genet Metab. 2012; 107(1-2):122-8. Восстановление активности IDS приводило к восстановлению кратковременной памяти и двигательной активности и к снижению вакуолизации клеток и расширению лизосом в мозжечке, печени и семенниках. Однако терапевтическая эффективность была частичной, содержание GAG не было полностью нормализовано и некоторые поведенческие изменения остались устойчивыми к лечению. См. Higuchi et al., Mol Genet Metab. 2012; 107(1-2): 122-8. Недавнее исследование по безопасности и подбору доз при введении идурсульфазы в спинномозговую жидкость (CSF) при помощи устройства для интратекального введения лекарственных средств для прямого лечения патологии ЦНС у пациентов с синдромом Хантера показало снижение на примерно 80-90% от уровней GAG в CSF через 6 месяцев после лечения. См. Muenzer et al., Genet. Med. 2015; doi:10.1038/gim.2015.36 and www.clincialtrials.gov (NCT00920647). Однако имплантация перманентного устройства для интратекальной доставки, которую требует терапия, связано со значительными рисками и недостатками, а сама терапия имеет очень высокую стоимость на пациенто-год.

Другой способ достижения ЦНС при системном введении представляет собой молекулярного «троянского коня». Примером такого подхода является слитый белок на основе антитела к инсулиновому рецептору и идуронат-2-сульфатазы (HIRMAb-IDS), который может проникать через гематоэнцефалический барьер (ВВВ) при помощи опосредованного рецепторами транспорта. Внутривенное введение 3, 10 и 30 мг/кг HIRMAb-IDS молодым самцам макак резус еженедельно в течение 26 недель приводило к захвату мозгом HIRMAb-IDS в количестве 1% от всей вводимой дозы. См. Boado et al., Biotechnol Bioeng. 2014; 111(11):2317-25. Исследование также показало безопасность слитого белка, поскольку никакой связанной с инфузией реакции или иммунного ответа не наблюдалось.

Трансплантация гемопоэтических стволовых клеток (HSCT) с применением стволовых клеток костномозгового происхождения (трансплантация костного мозга, ВМТ) оказалась эффективной при лечении соматической и неврологической патологии у пациентов с другими MPS. См. Peters et al., Blood. 1996; 87(11):4894-902, Peters and Steward, Bone Marrow Transplant. 2003; 31(4):229-39, и Yamada et al., Bone Marrow Transplant. 1998; 21(6):629-34. Принцип, лежащий в основе коррекции при помощи HSCT, заключается в том, что моноциты донора способны проникать через капиллярную стенку, даже при гематоэнцефалическом барьере, после чего они дифференцируются в тканевые макрофаги, микроглию в случае ЦНС, и секретируют недостающий фермент для доставки в различные клетки. См. Krivit et al., Cell Transplant. 1995; 4(4):385-92. ВМТ, осуществляемая у мышей с MPSII, снижала накопление GAG в ряде тканей тела, в том числе печени, селезенке и легких, но не в ЦНС. См. Akiyama et al., Mol Genet Metab. 2014; 111(2):139-46. При комбинировании ВМТ с ERT (0,5 мг идурсульфазы/кг/еженедельно) дополнительный эффект на уровни GAG в сердце, почках и легких наблюдали через 7 месяцев после лечения мышей с MPSII, однако накопление GAG в ЦНС сохранялось при аномальных уровнях. См. Akiyama et al., Mol Genet Metab. 2014; 111(2): 139-46. Однако доказательство клинической эффективности не было очень сильным у пациентов с MPSII. Последующее наблюдение 10 пациентов с синдромом Хантера, которые получали ВМТ с 1982 по 1991 гг., показало очень варьирующие степени успехи. См. Vellodi et al., J Inherit Metab Dis. 1999; 22(5):638-48. Четверо из этих пациентов умерло до наступления 100 дней после ВМТ, и еще 3 - до наступления 7 лет после процедуры. Из 3 пациентов, которые выжили в течение более 7 лет после ВМТ, один не отмечал клинического эффекта; у второго было минимальное повышение активности IDS в плазме, а третьему не удалось нормализовать содержание GAG, несмотря на наличие небольшого повышения активности IDS в плазме. См. Vellodi et al., J Inherit Metab Dis. 1999; 22(5):638-48. Магнитно-резонансная томография (MRI) головного мозга показало незначительное уменьшение числа кистозных поражений через 2,5 года после ВМТ у пациента с фенотипом легкого MPSII. См. Seto et al., Ann Neurol. 2001; 50(1):79-92. Однако в этом же исследовании были получены данные по другому пациенту с легким фенотипом, у которого не проявилось никакого улучшения после MRI. См. Seto et al., Ann Neurol. 2001; 50(1):79-92. Клинические результаты очень различаются среди пациентов с синдромом Хантера, предположительно в результате различных факторов; генотип, возраст при HSCT, клинический статус пациента при HSCT, такой как степень неврологического поражения, статус доноров, химеризм доноров, источник стволовых клеток и ферментативная активность предположительно влияли на долговременный результат. См. Giugliani et al., Genet Mol Biol. 2010; 33(4):589-604, Valayannopoulos et al., Rheumatology. 2011; 5:v49-59.

В случае успешного проведения HSCT может способствовать некоторой степени клинического эффекта на соматическом уровне, снижению поведенческих проблем и лучшему характеру сна, однако может ли лечение опосредовать какое-либо значительное улучшение когнитивного нарушения, остается неясным. См. Giugliani et al., Genet Mol Biol. 2010; 33(4):589-604, Valayannopoulos et al., Rheumatology. 2011; 5:v49-59. Как правило, этот подход не рекомендуется пациентам с синдромом Хантера из-за высокой частоты заболеваемости и смертности и варьирующих нейрокогнитивных эффектов. См. Giugliani et al., Genet Mol Biol. 2010; 33(4):589-604.

Правдоподобным объяснением отсутствия эффективности HSCT является ограниченный синтез IDS в привитых клетках, приводящий к недостаточной перекрестной коррекции с участием IDS в ЦНС. Лентивирусные векторы, кодирующие человеческий ген IDS, использовали для трансдукции клеток костного мозга перед их трансплантацией в мышей с MPSII. Подвергшиеся обработке мыши с MPSII характеризовались улучшенными показателями теста Т-образного лабиринта через 14 недель после трансплантации. См. Podetz-Pedersen et al., Mol Ther. 2013; 21:s1-s285.

Принимая во внимание ограничения текущих видов лечения MPSII, требуются альтернативные подходы. Генная терапия in vivo дает возможность однократного лечения MPSII и других наследственных заболеваний с перспективой пожизненных благоприятных эффектов. Несколько подходов с использованием генной терапии, основанных на применении различных вирусных векторов в комбинации с различными путями введения, были исследованы в животных моделях заболевания MPSII.

В частности, опосредованный векторами на основе аденоассоциированных вирусов (AAV) перенос генов, быстро распространяется в качестве тактики выбора для многих видов генной терапии in vivo, благодаря высокой эффективности трансдукции и отсутствию патогенности этих векторов. Векторы на основе AAV могут трансдуцировать постмитотические клетки и несколько доклинических и клинических исследований показали перспективу опосредованного векторами на основе AAV переноса генов с целью эффективного контроля длительной экспрессии лечебных трансгенов для различных заболеваний. См. Bainbridge et al., N Engl J Med. 2008; 358(21):2231-9, Hauswirth et al., Hum Gene Ther. 2008; 19(10):979-90, Maguire et al., N Engl J Med. 2008; 358(21):2240-8, Niemeyer et al., Blood 2009; 113(4):797-806, Rivera et al., Blood 2005; 105(4):1424-30, Nathawani et al., N Engl J Med. 2011; 365(25):2357-65 and Buchlis et al., Blood 2012; 119(13):3038-41.

Системное введение векторов на основе AAV5-CMV с геном человеческой IDS в височную вену детенышам мышей с MPSII (р2) приводило к повышению активности IDS в сердце, почках, печени, легких, мышцах и селезенке, и умеренному повышению активности IDS в головном мозге, которое приводило к снижению GAG в соматических тканях и моче через 18 месяцев включительно после однократного введения вектора. См. Polito et al., Am J Hum Genet. 2009; 85(2):296-301. Кроме того, такое лечение препятствовало развитию патологии ЦНС в результате предупреждения нейродегенерации и коррекции астроглиоза и воспаления. Оценка мышей в тесте открытого поля через 18 месяцев после инъекции AAV показывала улучшение по мере лечения фенотипа крупной моторики мышей с MPSII. См. Polito et al., Am J Hum Genet. 2009; 85(2):296-301.

AAV серотипа 8, кодирующие человеческий ген IDS под контролем специфичного для печени промотора TBG также использовали для лечения MPSII. Через 7 месяцев включительно после внутривенного введения векторов 2-х-месячным мышам с MPSII наблюдалось повышение активности IDS в сыворотке, печени, селезенке, легких, сердце, почках и мышцах, приводящее к полной коррекции хранения GAG в этих соматических тканях. См. Cardone et al., Hum Mol Genet. 2006; 15(7): 1225-36. Однако требовались очень высокие дозы (4×10¹² вирусных геномов/мышь) для достижения незначительного повышения активности IDS и частичного клиренса накопившихся GAG в головном мозге при внутривенном введении векторов. См. Cardone et al., Hum Mol Genet. 2006; 15(7): 1225-36. Аналогично, внутривенное введение векторов на основе AAV8, в которых человеческий ген IDS находится под контролем универсального промотора фактора элонгации 1-а (EF) взрослым мышам с MPSII показало повышение активности IDS в печени, сердце, селезенке и почках через 24 недели включительно после введения при полной коррекции накопления GAG в этих органах. См. Jung et al., Mol Cells. 2010; 30(1):13-8. Активность IDS в головном мозге была повышенной лишь в группе выведенных из эксперимента животных в течение короткого периода времени (через 6 недель после инъекции); однако этого было недостаточно для нормализации содержания GAG в ЦНС. См. Jung et al., Mol Cells. 2010; 30(1):13-8.

Ни один из вышеупомянутых подходов полностью не восстанавливал активность идуронат-2-сульфатазы, не приводил к полному устранению внутрицитоплазматических включений в ЦНС и соматических тканях или не корректировал все клинические признаки MPSII. Таким образом, существует потребность в новых подходах к лечению MPSII, которые характеризуются лучшими профилями эффективности и безопасности.

Краткое раскрытие настоящего изобретения

Настоящее изобретение предусматривает новые нуклеотидные последовательности для лечения мукополисахаридозов, в частности, мукополисахаридозов II типа (MPSII), или синдрома Хантера.

В соответствии с первым аспектом настоящее изобретение относится к выделенной нуклеотидной последовательности, кодирующей белок идуронат-2-сульфатазу (IDS), представленный в SEQ ID NO: 1, и на 75-90% идентичной SEQ ID NO: 2. В частности, выделенные нуклеотидные последовательности согласно этому первому аспекту настоящего изобретения выбраны из SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 8.

В соответствии со вторым аспектом настоящее изобретение относится к плазмиде, содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую белок идуронат-2-сульфатазу (IDS), представленный в SEQ ID NO: 1, и, в частности, нуклеотидную последовательность, на по меньшей мере 75% идентичную SEQ ID NO: 2, предпочтительно на 75-90% идентичную SEQ ID NO: 2.

В соответствии с третьим аспектом настоящее изобретение предусматривает новые рекомбинантные векторы для лечения мукополисахаридозов II типа. Указанные рекомбинантные векторы, в частности, векторы на основе аденоассоциированных вирусов (AAV), содержащие нуклеотидную последовательность, кодирующую белок идуронат-2-сульфатазу (IDS), представленный в SEQ ID NO: 1, и, в частности, нуклеотидную последовательность, на по меньшей мере 75% идентичную SEQ ID NO: 2, предпочтительно на 75-90% идентичную SEQ ID NO: 2. В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления векторы на основе аденоассоциированных вирусов представляют собой серотип 9 (AAV9). Векторы на основе AAV9 по настоящему изобретению могут дополнительно содержать промотор, связанный с кодирующей последовательностью, с целью контроля экспрессии IDS. Подходящий промотор представляет собой промотор СAG, SEQ ID NO: 14.

Дополнительный аспект настоящего изобретения относится к фармацевтической композиции, содержащей терапевтически эффективное количество нуклеотидной последовательности или плазмиды или рекомбинантного вируса, описанных в данном документе.

Еще один дополнительный аспект настоящего изобретения относится к нуклеотидным последовательностям по настоящему изобретению или плазмиде, описанной в данном документе, или рекомбинантному вектору, описанному в данном документе для применения в качестве лекарственного препарата, в частности, для лечения мукополисахаридозов II типа.

Настоящее изобретение также предусматривает способ получения плазмид в соответствии с настоящим изобретением, а также способ получения рекомбинантных векторов в соответствии с настоящим изобретением.

В соответствии с дополнительным аспектом настоящее изобретение относится к выделенным клеткам, содержащим нуклеотидную последовательность, кодирующую IDS, и, в частности, нуклеотидную последовательность, на по меньшей мере 75% идентичную SEQ ID NO: 2, предпочтительно на 75-90% идентичную SEQ ID NO: 2.

Краткое описание чертежей

Фигура 1. Получение pAAV-CAG-hIDS и AAV-CAG-hIDS. (А) Схематическое представление плазмиды на основе pAAV-CAG-hIDS и ее компонентов. (В) Схематическое представление генома вектора на основе аденоассоциированного вируса, содержащего кодирующую последовательность hIDS.

Фигура 2. Получение варианта 1 pAAV-CAG-ohIDS и варианта 1 AAV-CAG-ohIDS. (А) Схематическое представление плазмиды варианта 1 на основе pAAV-CAG-ohIDS и ее компонентов. (В) Схематическое представление генома вектора на основе аденоассоциированного вируса, содержащего кодирующую последовательность варианта 1 ohIDS.

Фигура 3. Получение варианта 2 pAAV-CAG-ohIDS и варианта 2 AAV-CAG-ohIDS. (А) Схематическое представление плазмиды варианта 2 на основе pAAV-CAG-ohIDS и ее компонентов. (В) Схематическое представление генома вектора на основе аденоассоциированного вируса, содержащего кодирующую последовательность варианта 2 ohIDS.

Фигура 4. Получение pAAV-CAG-omIDS и AAV-CAG-omIDS. (А) Схематическое представление плазмиды на основе pAAV-CAG-omIDS и ее компонентов. (В) Схематическое представление генома вектора на основе аденоассоциированного вируса, содержащего кодирующую последовательность omIDS.

Фигура 5. Гидродинамическая доставка pAAV-CAG-hIDS, варианта 1 pAAV-CAG-ohIDS и варианта 2 pAAV-CAG-ohIDS здоровым мышам. Гистограммы обозначают активность идуронат-2-сульфатазы (IDS) в печени (А) и сыворотке (В), измеренную через 48 часов после введения 30 мкг кодирующих человеческую IDS плазмид на основе pAAV-CAG-hIDS, варианта 1 pAAV-CAG-ohIDS и варианта 2 pAAV-CAG-ohIDS. Активность IDS мышей WT с введенным солевым раствором принимали за 100%. Значения представляют собой средние значения ± SEM из 5 мышей на группу. ^*Р<0,05.

Фигура 6. Гидродинамическая доставка pAAV-CAG-hIDS, варианта 1 pAAV-CAG-ohIDS и варианта 2 pAAV-CAG-ohIDS мышам с MPSII. (А, В) Гистограммы обозначают активность идуронат-2-сульфатазы (IDS) в печени (А) и сыворотке (В), измеренную через 1 неделю после введения кодирующих человеческую IDS плазмид на основе pAAV-CAG-hIDS, варианта 1 pAAV-CAG-ohIDS и варианта 2 pAAV-CAG-ohIDS. Мышей дикого типа и мышей с MPSII с введенным солевым раствором использовали в качестве контроля. Активность IDS мышей WT принимали за 100%. (С) Количественное определение содержания гликозаминогликана (GAG) в печени, селезенке, сердце, мочевом пузыре и семенниках через 1 неделю после введения различных кодирующих человеческую IDS плазмид. Значения представляют собой средние значения ± SEM из 5 мышей на группу. ^*Р<0,05, ^***Р<0,001, ^****Р<0,0001.

Фигура 7. Внутрисосудистая доставка AAV9-CAG-hIDS, варианта 1 AAV9-CAG-ohIDS и варианта 2 AAV9-CAG-ohIDS мышам с MPSII. Мышам с MPSII вводили внутривенно 1×10¹⁰ vg векторов на основе AAV9, кодирующих человеческую IDS дикого типа (AAV9-CAG-hIDS) или два различных варианта оптимизированных человеческих IDS (вариант 1 AAV9-CAG-ohIDS и вариант 2 AAV9-CAG-ohIDS). Мышей дикого типа и не подвергшихся обработке мышей с MPSII использовали в качестве контроля. (А, В) Гистограммы обозначают активность идуронат-2-сульфатазы (IDS) в печени (А) и сыворотке (В). Активность IDS мышей WT принимали за 100%. (С) Количественное определение содержания гликозаминогликана (GAG) в печени у животных, которым вводили два различных кодирующих человеческую IDS вектора. Значения представляют собой средние значения ± SEM из 5 мышей на группу. ^*Р<0,05, ^**Р<0,01 и ^***Р<0,001.

Фигура 8. Доставка в CSF AAV9-CAG-hIDS, варианта 1 AAV9-CAG-ohIDS и варианта 2 AAV9-CAG-ohIDS мышам с MPSII. Мышам в возрасте 2 месяцев с MPSII вводили в большую цистерну 1×10¹⁰ vg векторов на основе AAV9, кодирующих человеческую IDS дикого типа (AAV9-CAG-hIDS) или два различных варианта оптимизированных человеческих IDS (вариант 1 AAV9-CAG-ohIDS и вариант 2 AAV9-CAG-ohIDS). Мышей дикого типа (WT), не подвергшихся обработке мышей с MPSII (MPSII) и мышей с MPSII, которым вводили некодирующие (Null) векторы на основе AAV9 (MPSII-Null) использовали в качестве контроля. (А) Активность идуронат-2-сульфатазы, анализируемая через 1,5 месяца после доставки в различные области головного мозга (отделы I-V, в которых отдел I представляет наиболее ростральную область головного мозга, а отдел V представляет наиболее каудальную область). Активность IDS мышей WT принимали за 100%. (В) Количественное определение содержания гликозаминогликанов (GAG) в тех же самых областях головного мозга, как и в (А). Результаты представлены в виде среднего значения ± SEM из 5 мышей на группу. ^*Р<0,05, ^**Р<0,01, ^***Р<0,001 и ^****Р<0,0001.

Фигура 9. Доставка в CSF AAV9-CAG-hIDS, варианта 1 AAV9-CAG-ohIDS и варианта 2 AAV9-CAG-ohIDS мышам с MPSII. Мышам в возрасте 2 месяцев с MPSII вводили в большую цистерну 1×10¹⁰ vg векторов на основе AAV9, кодирующих человеческую IDS дикого типа (AAV-CAG-hIDS) или два различных варианта оптимизированных человеческих IDS (вариант 1 AAV-CAG-ohIDS и вариант 2 AAV-CAG-ohIDS). Мышей дикого типа (WT), не подвергшихся обработке мышей с MPSII (MPSII) и мышей с MPSII, получающих некодирующие (Null) векторы на основе AAV9 (MPSII-Null) использовали в качестве контроля. (А, В) Активность идуронат-2-сульфатазы, выражаемая в виде % активности WT, в печени (А) и сыворотке (В), измеряемая через 1,5 месяца после лечения. (С) Количественное определение содержания гликозаминогликанов (GAG) в органах тела. Результаты представлены в виде среднего значения ± SEM из 5 мышей на группу. ^*Р<0,05, ^**Р<0,01, ^***Р<0,001 и ^****Р<0,0001.

Фигура 10. Доставка в CSF векторов на основе AAV9, кодирующих оптимизированную мышиную идуронат-2-сульфатазу (AAV9-CAG-omIDS). (А) Активность идуронат-2-сульфатазы в различных частях головного мозга (отделы I-V) мышей дикого типа (здоровых), не подвергшихся обработке мышей с MPSII и мышей с MPSII, которым вводили в CSF при помощи интрацистернальной (IC) инъекции 5×10¹⁰ vg контрольного некодирующего вектора (AAV9-Null) или AAV9-CAG-omIDS. Активность IDS WT принимали за 100%. Анализ выполняли через 4 месяца после доставки векторов. (В) Количественное определение гликозаминогликанов (GAG) в тех же самых областях головного мозга, как и в (А). Результаты представлены в виде средних значений ± SEM из 4-5 мышей на группу. ^***Р<0,001, ^****Р<0,0001 по отношению к MPSII-Null.

Фигура 11. Доставка в CSF векторов на основе AAV9, кодирующих оптимизированную мышиную идуронат-2-сульфатазу (AAV9-CAG-omIDS). (А) Количественное определение интенсивности сигнала, получаемого в различных областях головного мозга после окрашивания на наличие лизосомального маркера LAMP2, у мышей дикого типа (здоровых) и мышей с MPSII, которым вводили в большую цистерну 5×10¹⁰ vg контрольного некодирующего вектора (AAV9-Null) или 5×10¹⁰ vg AAV9-CAG-omIDS. Анализ выполняли через 4 месяца после доставки векторов. (В) Активность других лизосомальных ферментов в экстрактах головного мозга. IDUA, идуронидаза, альфа-L-, SGSH, N-сульфоглюкозаминсульфогидролаза, NAGLU, N-ацетилглюкозаминидаза, альфа, HGSNAT, гепаран-альфа-глюкозаминид-N-ацетилтрансфераза, GALNS-галактозамин-(N-ацетил)-6-сульфатаза, GUSB, глюкуронидаза, бета, НЕХВ, гексозаминидаза В. Значения представляют собой средние значения ± SEM из 4-5 мышей на группу. ^**Р<0,01, ^***Р<0,001, ^****Р<0,0001 по отношению к MPSII-Null.

Фигура 12. Доставка в CSF векторов на основе AAV9, кодирующих оптимизированную мышиную идуронат-2-сульфатазу (AAV9-CAG-omIDS). Количественное определение интенсивности сигнала, получаемого в различных областях после окрашивания отделов головного мозга на наличие лизосомального маркера LAMP2. Анализ выполняли у мышей дикого типа (WT) и однопометных животных с MPSII через 8 месяцев после того, как последним вводили в CSF 5×10¹⁰ vg контрольного некодирующего вектора (AAV9-Null) или r 5×10¹⁰ vg AAV9-CAG-omIDS. Результаты представлены в виде среднего значения ± SEM из 2-6 мышей на группу. ^*Р<0,05 и ^**Р<0,01 по отношению к MPSII-Null.

Фигура 13. Доставка в CSF векторов на основе AAV9, кодирующих оптимизированную мышиную идуронат-2-сульфатазу (AAV9-CAG-omIDS). (А, В) Гистограммы представляют интенсивность сигнала, измеряемого после иммуноокрашивания на наличие астроцитарного маркера GFAP (А) и на наличие микроглиального маркера BSI-B4 (В) в отделах лобной, теменной и затылочной коры, верхнего двухолмия и таламуса мышей дикого типа (здоровых), и мышей с MPSII, которым вводили за 4 месяца до этого в большую цистерну 5×10¹⁰ vg контрольного некодирующего вектора (AAV9-Null) или 5×10¹⁰ vg AAV9-CAG-omIDS. Результаты представлены в виде средних значений ± SEM из 5 мышей на группу. ^**Р<0,01, ^***Р<0,001, ^****Р<0,0001 по отношению к MPSII-Null.

Фигура 14. Доставка в CSF векторов на основе AAV9, кодирующих оптимизированную мышиную идуронат-2-сульфатазу (AAV9-CAG-omIDS). (А, В) Гистограммы представляют интенсивность сигнала, измеряемого после иммуноокрашивания на наличие астроцитарного маркера GFAP (А) и на наличие микроглиального маркера BSI-B4 (В) в отделах головного мозга мышей дикого типа (WT) и однопометных животных с MPSII, которым вводили в CSF 5×10¹⁰ vg контрольного некодирующего вектора (AAV9-Null) или 5×10¹⁰ vg AAV9-CAG-omIDS. Анализ выполняли через 8 месяца после доставки векторов. Результаты представлены в виде среднего значения ± SEM из 2-6 мышей на группу. ^*Р<0,05, ^**Р<0,01, ^***Р<0,001 и ^****Р<0,0001 по отношению к MPSII-Null.

Фигура 15. Доставка в CSF векторов на основе AAV9, кодирующих оптимизированную мышиную идуронат-2-сульфатазу (AAV9-CAG-omIDS). (А, В) Активность идуронат-2-сульфатазы, выражаемая в виде % активности WT, в печени (А) и сыворотке (В) мышей дикого типа (здоровых), не подвергшихся обработке мышей с MPSII и мышей с MPSII, которым вводили в CSF 5×10¹⁰ vg контрольного некодирующего вектора (AAV9-Null) или 5×10¹⁰ vg вектора на основе AAV9-CAG-omIDS в возрасте 2 месяцев и анализировали 4 месяца спустя. Активность IDS WT принимали за 100%. (С) Количественное определение гликозаминогликанов (GAG) в органах тела. Результаты представлены в виде средних значений ± SEM из 4-5 мышей на группу. ^**Р<0,01, ^***Р<0,001, ^****Р<0,0001 по отношению к MPSII-Null.

Фигура 16. Доставка в CSF векторов на основе AAV9, кодирующих оптимизированную мышиную идуронат-2-сульфатазу (AAV9-CAG-omIDS). (А, В) Активность идуронат-2-сульфатазы, выражаемая в виде % активности WT, в легких (А) и сердце (В) здоровых мышей дикого типа (WT), не подвергшихся обработке мышей с MPSII (MPSII) и мышей с MPSII, которым вводили в CSF 5×10¹⁰ vg контрольного некодирующего вектора (AAV9-Null) или 5×10¹⁰ vg вектора на основе AAV9-CAG-omIDS в возрасте 2 месяцев и анализировали 4 месяца спустя. (С) Количественное определение числа копий векторных геномов/диплоидный геном (vg/dg) в печени, легких и сердце у мышей MPSII, которым вводили в CSF AAV9-CAG-omIDS. Полученные ткани не подвергшихся обработке мышей с MPSII использовали в качестве контроля. Результаты представлены в виде среднего значения ± SEM из 4-5 мышей на группу, как в А) и В). ^*Р<0,05, ^**Р<0,01 и ^***Р<0,001 по отношению к MPSII-Null.

Фигура 17. Доставка в CSF векторов на основе AAV9, кодирующих оптимизированную мышиную идуронат-2-сульфатазу (AAV9-CAG-omIDS). (А) Влажный вес печени по отношению к весу всего тела мышей дикого типа (здоровых), не подвергшихся обработке мышей с MPSII и мышей с MPSII, которым вводили в CSF 5×10¹⁰ vg контрольного (AAV9-Null) или 5×10¹⁰ vg вектора на основе AAV9-CAG-omIDS в возрасте 4 месяцев и анализировали 4 месяца спустя. (В) Активность других лизосомальных ферментов в экстрактах печени, полученных из тех же самых когорт животных, как и в (А). (С) Активность β-гексозаминидазы (β-НЕХО), выражаемая в виде % активности WT, в сыворотке тех же самых когорт животных, как и в (A). IDUA, идуронидаза, альфа-L-, SGSH, N-сульфоглюкозаминсульфогидролаза, NAGLU, N-ацетилглюкозаминидаза, альфа, HGSNAT, гепаран-альфа-глюкозаминид-N-ацетилтрансфераза, GALNA-галактозамин-(N-ацетил)-6-сульфатаза, GUSB, глюкуронидаза, бета, НЕХВ, гексозаминидаза В. Активности ферментов WT принимали за 100%. Значения представляют собой средние значения ± SEM из 4-5 мышей на группу. ^*Р<0,05, ^**Р<0,01, ^***Р<0,001, ^**** Р<0,0001 по отношению к MPSII-Null.

Фигура 18. Доставка в CSF векторов на основе AAV9, кодирующих оптимизированную мышиную идуронат-2-сульфатазу (AAV9-CAG-omIDS). Оценка двигательной и исследовательской активности в тесте открытого поля у наивных мышей дикого типа (здоровых), не подвергшихся обработке мышей с MPSII и мышей с MPSII, которым вводили в CSF 5×10¹⁰ vg контрольного (AAV9-Null) или 5×10¹⁰ vg вектора на основе AAV9-CAG-omIDS в возрасте 4 месяцев и анализировали 4 месяца спустя. (А) Время в центре, (В) время на периферии, (С) число вхождений в центр, (D) задержка при движении к центру, (Е) суммарное число передвижений, (F) число пересеченных линий. Значения представляют собой средние значения ± SEM из 17-22 мышей на группу. ^*Р<0,05, ^** Р<0,01 по отношению к MPSII-Null.

Фигура 19. Доставка в CSF векторов на основе AAV9, кодирующих оптимизированную мышиную идуронат-2-сульфатазу (AAV9-CAG-omIDS). Анализ выживаемости в соответствии с кривыми Каплана-Мейера у здоровых мышей дикого типа (WT), не подвергшихся обработке мышей с MPSII (MPSII) и мышей с MPSII, которым вводили в CSF 5×10¹⁰ vg контрольного некодирующего вектора (AAV9-Null) или 5×10¹⁰ vg вектора на основе AAV9-CAG-omIDS. N=24 в случае WT, N=22 в случае не подвергшихся обработке мышей с MPSII, N=27 в случае мышей с MPSII, которым вводили Null, и N=91 в случае мышей, получавших терапевтический вектор.

Фигура 20. Доставка в CSF векторов на основе AAV9, кодирующих оптимизированную мышиную идуронат-2-сульфатазу (AAV9-CAG-omIDS), при различных дозах (1,58×10⁹, 5×10⁹, 1,58×10¹⁰ и 5×10¹⁰ vg/мышь). (А) Активность идуронат-2-сульфатазы в различных частях головного мозга (отделы I-V) мышей дикого типа (здоровых), не подвергшихся обработке мышей с MPSII и мышей с MPSII, которым вводили в CSF при помощи интрацистернальной (IC) инъекции различные дозы AAV9-CAG-omIDS в возрасте 2 месяцев и анализировали 1,5 месяца спустя. Активность IDS WT принимали за 100%. (В) Количественное определение гликозаминогликанов (GAG) в тех же самых областях головного мозга, как и в (А). Результаты представлены в виде средних значений ± SEM из 5 мышей на группу. ^*Р<0,05, ^**Р<0,01, ^***Р<0,001, ^****Р<0,0001 по отношению к не подвергшимся обработке мышам с MPSII.

Фигура 21. Доставка в CSF векторов на основе AAV9, кодирующих оптимизированную мышиную идуронат-2-сульфатазу (AAV9-CAG-omIDS), при различных дозах (1,58×10⁹, 5×10⁹, 1,58×10¹⁰ и 5×10¹⁰ vg/мышь). (А, В) Активность идуронат-2-сульфатазы, выражаемая в виде % активности WT, в печени (А) и сыворотке (В) мышей дикого типа (здоровых), не подвергшихся обработке мышей с MPSII и мышей с MPSII, которым вводили в CSF различные дозы вектора на основе AAV9-CAG-omIDS в возрасте 2 месяцев и анализировали 1,5 месяца спустя. Активность IDS WT принимали за 100%. (С) Количественное определение гликозаминогликанов (GAG) в органах тела. Результаты представлены в виде средних значений ± SEM из 5 мышей на группу. ^*Р<0,05, ^**Р<0,01, ^***Р<0,001, ^****Р<0.0001 по отношению к не подвергшимся обработке мышам с MPSII.

Депонирование микроорганизмов

Плазмиды на основе pAAV-CAG-hIDS (SEQ ID NO: 3), вариант 1 pAAV-CAG-ohIDS (SEQ ID NO: 6) и вариант 2 pAAV-CAG-ohIDS (SEQ ID NO: 9) депонировали 18 декабря 2014 г. под номером доступа DSM 29866, DSM 29867 и DSM 29868 в DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Inhostrasse 7 B, D-38124 Braunschweig, Федеративная Республика Германия.

Определения

Термин «нуклеотидная последовательность» или «выделенная нуклеотидная последовательность» относится к молекуле нуклеиновой кислоты, ДНК или РНК, содержащей дезоксирибонуклеотиды или рибонуклеотиды соответственно. Нуклеиновая кислота может быть двунитевой, однонитевой или содержать участки двунитиевой и однонитевой последовательности.

Термин «% идентичности последовательности» или «% идентичности» относится к проценту нуклеотидов кандидатной последовательности, которые являются идентичными нуклеотидам в эталонной последовательности, после выравнивания последовательностей с целью достижения максимального % идентичности последовательности. % идентичности последовательности можно определить при помощи любых способов или алгоритмов, утвержденных в данной области, таких как алгоритмы ALIGN, BLAST и BLAST 2.0. См. Altschul S, et al., Nuc Acids Res. 1977; 25:3389-3402 и Altschul S, et al., J Mol Biol. 1990; 215:403-410.

В данном документе % идентичности последовательности или «% идентичности» рассчитывается путем деления числа нуклеотидов, которые являются идентичными после выравнивания эталонной последовательности и кандидатной последовательности, на общее число нуклеотидов в эталонной последовательности, и умножения результата на 100.

Термины «кодировать» или «кодирование» относятся к генетическому коду, который определяет то, как нуклеотидная последовательность транслируется в полипептид или белок. Порядок нуклеотидов в последовательности определяет порядок аминокислот в полипептиде или белке.

Термин «белок» относится к макромолекуле, состоящей из одной или нескольких линейных цепей аминокислот или полипептидов. Белки могут подвергаться посттрансляционным модификациями, например, превращению цистеинового остатка в 3-оксоаланин, гликозилированию или связыванию с металлами. Гликозилирование белка представляет собой добавление различных углеводов, которые ковалентно связываются с аминокислотной цепью.

Термин «эффективное количество» относится к количеству вещества, достаточного для достижения предполагаемой цели. Например, эффективное количество вектора на основе AAV9 для повышения активности идуронат-2-сульфатазы (IDS) представляет собой количество, достаточное для снижения накопления гликозаминогликанов. «Терапевтически эффективное количество» вектора экспрессии для лечения заболевания или нарушения представляет собой количество вектора экспрессии, достаточное для ослабления или устранения признаков и симптомов заболевания или нарушения. Эффективное количество конкретного вещества будет варьировать в зависимости от факторов, таких как природа вещества, путь введения, размер и вид животного, получающего вещество, а также цель введения вещества. Эффективное количество в каждом конкретном случае может быть определено эмпирически опытным специалистом в соответствии с принятыми в данной области способами.

Термин «индивидуум» относится к млекопитающему, предпочтительно человеку или млекопитающему помимо человека, более предпочтительно мыши, крысе, другим грызунам, кролику, собаке, кошке, свинье, корове, лошади или примату, еще более предпочтительно человеку.

Термин «функционально связанный» относится к функциональной связи и положению промоторной последовательности по отношению к представляющему интерес гену (например, промотор или энхансер функционально связан с кодирующей последовательностью, если он влияет на транскрипцию последовательности). Как правило, функционально связанный промотор является смежным по отношению к представляющему интерес гену. Однако энхансер не должен быть смежным по отношению к представляющей интерес последовательности для контроля ее экспрессии.

Термин «тропизм» относится к способу, при котором различные вирусы эволюционировали для предпочтительного целенаправленного воздействия на определенные виды хозяев или определенные типы клеток в этих видах.

Термин «генная терапия» относится к переносу представляющего интерес генетического материала (например, ДНК или РНК) в клетку для лечения или предупреждения наследственного или приобретенного заболевания или состояния. Представляющий интерес генетический материал кодирует продукт (например, белок, полипептид, пептид или функциональную РНК), образование которого in vivo является желательным. Например, представляющий интерес генетический материал может кодировать фермент, гормон, рецептор или полипептид терапевтического значения.

Термин «рекомбинантный вирусный вектор» или «вирусный вектор» относится к средству, полученному из встречающегося в природе вируса при помощи методик генной инженерии, способному переносить представляющий интерес генетический материал (например, ДНК или РНК) в клетку, что приводит к образованию продукта, кодируемого этим указанным генетическим материалом (например, белком, полипептидом, пептидом или функциональной РНК), в клетке-мишени.

Термин «рекомбинантная плазмида» или «плазмида» относится к небольшой кольцевой двунитевой самореплицирующейся молекуле ДНК, полученной при помощи методик генной инженерии, способной переносить представляющий интерес генетический материал в клетку, что приводит к образованию продукта, кодируемого этим указанным генетическим материалом (например, белком, полипептидом, пептидом или функциональной РНК), в клетке-мишени. Кроме того, термин «рекомбинантная плазмида» или «плазмида» также относится к небольшой кольцевой двунитевой самореплицирующейся молекуле ДНК, полученной при помощи методик генной инженерии, используемых во время получения вирусных векторов в качестве носителей генома рекомбинантного вектора.

Подробное раскрытие настоящего изобретения

Настоящее изобретение предусматривает новые нуклеотидные последовательности для лечения мукополисахаридозов, в частности, мукополисахаридозов II типа (MPSII), или синдрома Хантера.

Нуклеотидные последовательности в соответствии с настоящим изобретением кодируют белок идуронат-2-сульфатазу (обозначаемую как IDS), представленный в SEQ ID NO: 1, фермента, участвующего в постадийном разложении гликозаминогликанов гепарансульфатаа и дерматансульфата. Термины «встречающаяся в природе IDS» или «IDS дикого типа» относятся в контексте настоящего изобретения к нуклеотидной последовательности, полученной или образованной из клеток-хозяев при помощи способов, известных специалисту в данной области, или альтернативно синтезированной при использовании в качестве исходного материала кодирующей последовательности (CDS) для IDS других видов. Предпочтительно «встречающаяся в природе IDS» или «IDS дикого типа» является химически синтезированной из мышиной CDS (обозначаемой как mIDS) или из человеческой CDS (обозначаемой как hIDS). Более предпочтительно нуклеотидная последовательность hIDS является химически синтезированной из человеческой CDS и соответствует SEQ ID NO: 2.

В соответствии с настоящим изобретением данные указывают на то, что модифицированные нуклеотидные последовательности, также обозначаемые как оптимизированные нуклеотидные последовательности, опосредуют образование большего количества представляющего интерес белка, вероятно, в результате эффективной транскрипции mRNA или транскриптона более стабильной mRNA, или более эффективного использования кодонов. Эти последовательности обозначаются в данном документе как «оптимизированные последовательности», omIDS и ohIDS при получении из мышиной и человеческой CDS соответственно. Предпочтительно оптимизированные последовательности в соответствии с настоящим изобретением представляют собой кодон-оптимизированные последовательности.

Таким образом, первый аспект настоящего изобретения относится к выделенной нуклеотидной последовательности, кодирующей белок идуронат-2-сульфатазу (IDS), представленный в SEQ ID NO: 1, и на 75-90% идентичной SEQ ID NO: 2. В частности, выделанная нуклеотидная последовательность в соответствии с настоящим изобретением на 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 82%, 85%, 87% или 90% идентична SEQ ID NO: 2. В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления выделенные нуклеотидные последовательности по настоящему изобретению выбраны из варианта 1 ohIDS, представленного в SEQ ID NO: 5, и варианта 2 ohIDS, представленного в SEQ ID NO: 8.

В соответствии с настоящим изобретением выделенные нуклеотидные последовательности, описанные выше в данном документе, можно вставить в сайт множественного клонирования (MCS) базовой плазмиды. В частности, базовая плазмида представляет собой плазмиду, которая содержит ITR аденоассоциированного вируса (AAV), обозначаемого в данном документе как pAAV.

Второй аспект настоящего изобретения предусматривает плазмиду, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую белок идуронат-2-сульфатазу (IDS), представленный в SEQ ID NO: 1, и по меньшей мере на 75% идентичную SEQ ID NO: 2. Предпочтительно плазмида в соответствии с настоящим изобретением на 75-90% идентична SEQ ID NO: 2. В частности, плазмида в соответствии с настоящим изобретением содержит выделенную нуклеотидную последовательность, на 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 82%, 85%, 87% или 90% идентичную SEQ ID NO: 2. В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления плазмида по настоящему изобретению содержит нуклеотидную последовательность из hIDS, представленную в SEQ ID NO: 2, варианта 1 ohIDS, представленного в SEQ ID NO: 5, и варианта 2 ohIDS, представленного в SEQ ID NO: 8.

Помимо выделенных последовательностей, упомянутых выше, плазмиды в соответствии с настоящим изобретением также включают стандартные контрольные элементы, которые могут быть функционально связаны с нуклеотидной последовательностью таким образом, что обеспечивается ее транскрипция, трансляция и/или экспрессия в клетке, трансфицированной плазмидами. В частности, плазмиды в соответствии с настоящим изобретением, содержат промотор в качестве контрольного элемента, функционального связанного с представляющей интерес нуклеотидной последовательностью. Большое число промоторов, которые являются нативными или химерными, конститутивными или индуцибельными, универсальными и/или тканеспецифичными, известны в данной области. Предпочтительно промотор, используемый в контексте настоящего изобретения, представляет собой промотор CAG, который относится к комбинации, содержащей ранний энхансерный элемент цитомегаловируса и промотор β-актина цыпленка. Он дополнительно включает участки интронов β-актина цыпленка и β-глобина кролика, которые придают придают стабильность mRNA, полученной из представляющей интерес нуклеотидной последовательности. См. Alexopoulou A., et al., ВМС Cell Biology 2008; 9(2): 1-11. Промотор CAG, включенный в плазмиды на основе pAAV по настоящему изобретению, имеет последовательность SEQ ID NO: 14. Этот конкретный промотор CAG обеспечивает длительную экспрессию отсутствующего фермента во всех областях головного мозга и в печени. Как следствие, лизосомальное накопление гликозаминогликана (GAG) корректируется, предупреждая таким образом неврологические и соматические изменения, характерные для MPSII.

В соответствии с особо предпочтительным вариантом осуществления плазмида в соответствии с настоящим изобретением представляет собой плазмиду на основе pAAV-CAG-hIDS, представленного в SEQ ID NO: 3, с номером доступа DSM 29866.

В соответствии с другим особо предпочтительным вариантом осуществления плазмида в соответствии с настоящим изобретением представляет собой плазмиду варианта 1 pAAV-CAG-ohIDS, представленную в SEQ ID NO: 6, с номером доступа DSM 29867.

В соответствии с другим особо предпочтительным вариантом осуществления плазмида в соответствии с настоящим изобретением представляет собой плазмиду варианта 2 pAAV-CAG-ohIDS, представленную в SEQ ID NO: 9, с номером доступа DSM 29868.

Третий аспект настоящего изобретения относится к новым рекомбинантным векторам для лечения мукополисахаридозов II типа. Необходимо понимать, что вектор по настоящему изобретению представляет собой капсидный белок, а также векторный геном, содержащийся в нем, используемый для переноса представляющего интерес генетического материала в клетку. Кроме указанного представляющего интерес генетического материала, геном вектора может также содержать различные функциональные элементы, которые включают контрольные элементы, такие как промоторы или операторы, связывающие области транскрипционных факторов или энхансеры, а также контрольные элементы для инициации или терминации трансляции.

Векторы в соответствии с настоящим изобретением получают из аденоассоциированных вирусов (AAV) и используют для переноса представляющей интерес нуклеотидной последовательности в клетку-мишень. Было доказано, что они характеризуются высокой эффективностью трансдукции постмитотических клеток в широком диапазоне тканей. В контексте настоящего изобретения векторы используют для доставки кодирующей последовательности человеческой идуронат-2-сульфатазы (hIDS of SEQ ID NO: 2) или оптимизированного варианта кодирующей последовательности человеческой идуронат-2-сульфатазы, (варианта 1 ohIDS из SEQ ID NO: 5 или варианта 2 ohIDS из SEQ ID NO: 8). Вектор на основе аденоассоциированного вируса представляет собой вектор, полученный из аденоассоциированного вируса семейства парвовирусов. Геном аденоассоциированного вируса построен из однонитевой дезоксинуклеиновой кислоты (ssDNA). Эти вирусы инфицируют млекопитающих, но являются непатогенными (т.е. не вызывают заболевание). Они могут инфицировать делящиеся или неделящиеся клетки, и их тропизм изменяется в зависимости от серотипа. Серотип представляет собой классификацию групп вирусов в зависимости от их капсидных антигенов. Серотип аденоассоциированного вируса, определяемый по его капсидному белку, обозначает тропизм вируса и способствует его вхождению в определенный тип клеток. В контексте настоящего изобретения AAV имеет серотип 1, 2, 5, 7, 8, 9 или 10. Предпочтительно AAV представляет собой серотип 9 (AAV9), поскольку он характеризуется наилучшей способностью доставлять генетический материл в головной мозг, а также в периферические органы при однократном введении в CSF. Векторы на основе AAV9 по настоящему изобретению состоят из вирусного капсида серотипа 9 человеческого аденоассоциированного вируса и модифицированного генома, содержащего инвертированные концевые повторы (ITR) человеческого аденоассоциированного вируса серотипа 2, промотор CAG, кодирующую последовательность гена человеческой идуронат-2-сульфатазы (hIDS) или ее оптимизированный вариант (также обозначаемый как нуклеотидная последовательность в соответствии с настоящим изобретением), и поли-А из гена бета-глобина кролика.

Таким образом, в соответствии со вторым аспектом настоящее изобретение относится к рекомбинантному AAV, содержащему нуклеотидную последовательность, кодирующую белок идуронат-2-сульфатазу (IDS), представленный в SEQ ID NO: 1, и по меньшей мере на 75% идентичную SEQ ID NO: 2. Предпочтительно рекомбинантный AAV в соответствии с настоящим изобретением на 75-90%) идентичен SEQ ID NO: 2. В частности, рекомбинантный AAV в соответствии с настоящим изобретением содержит нуклеотидную нуклеотидную последовательность в соответствии с настоящим изобретением, на 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 82%, 85%, 87% или 90% идентичную SEQ ID NO: 2. В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления выделенные нуклеотидные последовательности в рекомбинантном AAV по настоящему изобретению выбраны из hIDS, представленного в SEQ ID NO: 2, варианта 1 ohIDS, представленного в SEQ ID NO: 5, и варианта 2 ohIDS, представленного в SEQ ID NO: 8.

В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления настоящее изобретение относится к рекомбинантному AAV9, содержащему нуклеотидную последовательность, кодирующую белок идуронат-2-сульфатазу IDS, представленный в SEQ ID NO: 1, и по меньшей мере на 75% идентичную SEQ ID NO: 2. Предпочтительно рекомбинантный AAV9 по настоящему изобретению содержит нуклеотидную последовательность, на 75-90% идентичную SEQ ID NO: 2. В частности, рекомбинантный AAV9 по настоящему изобретению содержит нуклеотидную нуклеотидную последовательность в соответствии с настоящим изобретением, на 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 82%, 85%, 87% или 90% идентичную SEQ ID NO: 2. В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления рекомбинантный AAV по настоящему изобретению содержит нуклеотидные последовательности из hIDS, представленного в SEQ ID NO: 2, варианта 1 ohIDS, представленного в SEQ ID NO: 5, и варианта 2 ohIDS, представленного в SEQ ID NO: 8.

Кроме того, неожиданным образом было обнаружено, что ассоциация в одной и то же структуре капсида AAV9 с нуклеотидной последовательностью, кодирующей идуронат-2-сульфатазу (IDS), совместно с выбранным промотором, особенно промотором CAG, способствует длительной экспрессии отсутствующего фермента во всех областях головного мозга, в частности, если структуру доставляют в спинномозговую жидкость (CSF) при помощи интрацистернальной инъекции. Как следствие, лизосомальное накопление гликозаминогликана (GAG) корректируется, предупреждая таким образом неврологические изменения, характерные для заболевания MPSII. Данный эффект наблюдали даже в обонятельной луковице, которая удалена от места введения векторов (большой цистерны). Дополнительно векторы на основе AAV9 в соответствии с настоящим изобретением, доставляемые в CSF, могли достигать системного кровотока с трансдукцией печени. Образование и секреция фермента клетками печени приводила к повышению активности идуронат-2-сульфатазы (IDS) в сыворотке, в конечном итоге приводя к снижению патологии лизосом во многих соматических тканях. Это представляет собой очевидное преимущество векторов в соответствии с настоящим изобретением над существующими подходами, которые лишь частично корректировали клинические признаки заболевания и, как правило, вызывают эффект в головном мозге или в системном кровотоке, но не в обеих.

Соответственно, настоящее изобретение относится к векторам на основе AAV9, содержащим промотор CAG, связанный с нуклеотидной последовательностью, кодирующей идуронат-2-сульфатазу (IDS), представленной в SEQ ID NO: 1.

В частности, векторы на основе AAV9 по настоящему изобретению содержат промотор CAG, связанный с нуклеотидной последовательностью, кодирующей белок идуронат-2-сульфатазу (IDS), представленный в SEQ ID NO: 1, и по меньшей мере на 75% идентичную SEQ ID NO: 2. Предпочтительно векторы на основе AAV9 по настоящему изобретению содержат промотор CAG, связанный с нуклеотидной последовательностью, кодирующей белок идуронат-2-сульфатазу (IDS), представленный в SEQ ID NO: 1, и на 75-90% идентичную SEQ ID NO: 2. В частности, нуклеотидная последовательность, содержащаяся в векторе на основе AAV9 в соответствии с настоящим изобретением на 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 82%, 85%, 87% или 90% идентична SEQ ID NO: 2.

В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления рекомбинантный вектор по настоящему изобретению представляет собой AAV9-CAG-hIDS (SEQ ID NO: 4), содержащий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 2, функционально связанную с промотором CAG из SEQ ID NO: 14.

В соответствии с другим предпочтительным вариантом осуществления рекомбинантный вектор по настоящему изобретению представляет собой вариант 1 AAV9-CAG-ohIDS (SEQ ID NO: 7), содержащий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 5, функционально связанную с промотором С AG из SEQ ID NO: 14.

В соответствии с другим предпочтительным вариантом осуществления рекомбинантный вектор по настоящему изобретению представляет собой вариант 2 AAV9-CAG-ohIDS (SEQ ID NO: 10), содержащий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 8, функционально связанную с промотором CAG из SEQ ID NO: 14.

Рекомбинантные векторы по настоящему изобретению, как определено выше в данном документе, можно получить из соответствующих плазмид, также описанных выше в данном документе, в результате трансфекции клеток HEK293 при помощи способов, известных в данной области.

Таким образом, настоящее изобретение дополнительно предусматривает способ получения векторов на основе аденоассоциированых вирусов AAV в соответствии с настоящим изобретением, и, в частности, AAV9. Способ предусматривает стадии:

i) получения первой плазмиды, содержащей последовательность, кодирующую представляющий интерес белок, расположенный между первым концевым повтором AAV и вторым концевым повтором AAV, промотор CAG, функционально связанный с последовательностью, кодирующей представляющий интерес белок; второго вектора, содержащего rep-ген AAV и cap-ген AAV, и третьего вектора, содержащего ген хелперного функционального элемента аденовируса;

ii) котрансфекции компетентных клеток векторами из стадии i);

iii) культивирования трансфицированных клеток из стадии ii) в течение периода времени, достаточного для образования вирусных частиц; и

iv) очистки векторов экспрессии от культуры из стадии iii).

В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления первый AAV и вторые концевые повторы первого вектора представляют собой ITR из AAV серотипа 2. В соответствии с другим предпочтительным вариантом осуществления гер-гены AAV второго вектора происходят из AAV серотипа 2. В соответствии с другим предпочтительным вариантом осуществления компетентные клетки представляют собой клетки HEK293. В соответствии с другим предпочтительным вариантом осуществления cap-гены AAV второго вектора происходят из AAV серотипа 9.

Настоящее изобретение также предусматривает способ получения плазмиды в соответствии с изобретением, предусматривающий стадии:

i) эксцизии последовательности, кодирующей представляющий интерес белок из исходной плазмиды, в результате переваривания при помощи Mlul/EcoRI,

ii) клонирования последовательности, кодирующей представляющий интерес белок между двумя сайтами рестрикции базовой плазмиды на основе AAV pAAV-CAG, тем самым получения соответствующей плазмиды, включающей последовательность, кодирующую представляющий интерес белок.

Настоящее изобретение предусматривает в соответствии с дополнительным аспектом фармацевтические композиции, содержащие терапевтически эффективное количество выделенных нуклеотидных последовательностей, описанных в данном документе, плазмид, описанных в данном документе, или векторов на основе AAV, в частности, векторов на основе AAV9, описанных в данном документе.

Фармацевтические композиции по настоящему изобретению содержит выделенные нуклеотидные последовательности, описанные в данном документе, плазмиды, описанные в данном документе, или векторы на основе AAV, описанные в данном документе, в фармацевтически приемлемом носителе. Композиция также может содержать по меньшей мере одно вспомогательное вещество. Вспомогательные вещества можно выбрать из носителей, наполнителей, растворителей, разбавителей или адъювантов. Допустимые носители, разбавители или адъюванты являются нетоксичными, предпочтительно инертными в используемых дозе и концентрациях, и включают буферы, такие как фосфатные, цитратные, или буферы на основе других органических кислот; антиоксиданты; низкомолекулярные полипептиды, белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры; аминокислоты; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, в том числе глюкозу, маннозу или декстрины; хелатирующие средства; саахроспирты, такие как маннит и сорбит, солеобразующие противоионы, такие как натрий; и/или неионные поверхностно-активные вещества, такие как блок-сополимер полиэтилена и полиоксипропилена (Pluronic F68®) и полиэтиленгликоль (PEG).

В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления фармацевтические композиции по настоящему изобретению являются подходящими для парентерального введения. Примерами парентерального введения являются внутривенные, интрацистернальные и внутримышечные инъекции. Предпочтительно фармацевтическая композиция в соответствии с настоящим изобретением является подходящей для внутривенного или интрацистернального введения. Композиции, подходящие для такого парентерального введения, включают стерильные водные растворы или дисперсии, стерильные порошки для экстемпорального приготовления стерильных растворов или дисперсий. Предпочтительно фармацевтические композиции в соответствии с настоящим изобретением защищают от загрязняющего действия бактерий и грибов.

Доза для человека и животных может варьировать в зависимости от факторов, которые имеют свое основание у соответствующих видов или других факторов, таких как возраст, пол, вес или степень заболевания и т.д.

Еще один дополнительный аспект настоящего изобретения относится к терапевтическому применению выделенных нуклеотидных последовательностей, описанных в данном документе, плазмид, описанных в данном документе, или векторов на основе AAV, в частности, векторов на основе AAV9, описанных в данном документе. Как упомянуто выше, выделенные нуклеотидные последовательности, плазмиды, описанные в данном документе, или векторы на основе AAV, в частности, векторы на основе AAV9 в соответствии с настоящим изобретением, опосредуют экспрессию отсутствующего фермента IDS, таким образом корректируя лизосомальное накопление GAG. Это способствует коррекции всех клинических признаков мукополисахаридозов II типа (MPSII). В этом отношении настоящее изобретение также относится к выделенным нуклеотидным последовательностям, описанным в данном документе, плазмидам, описанным в данном документе, или векторам на основе AAV, в частности, векторам на основе AAV9, описанным в данном документе, для применения в качестве лекарственного препарата.

В частности, настоящее изобретение относится к выделенным нуклеотидным последовательностям, описанным в данном документе, плазмидам, описанным в данном документе, или векторам на основе AAV, в частности, векторам на основе AAV9, описанным в данном документе, для повышения активности идуронат-2-сульфатазы (IDS) в организме.

В соответствии с дополнительным предпочтительным аспектом настоящее изобретение относится к выделенным нуклеотидным последовательностям, описанным в данном документе, плазмидам, описанным в данном документе, или векторам на основе AAV, в частности, векторам на основе AAV9, описанным в данном документе, для лечения мукополисахаридозов II типа (MPSII).

В соответствии с еще одним дополнительным вариантом осуществления настоящее изобретение относится к выделенным нуклеотидным последовательностям, описанным в данном документе, плазмидам, описанным в данном документе, или векторам на основе AAV, в частности, векторам на основе AAV9, описанным в данном документе, для получения лекарственного препарата, пригодного для лечения мукополисахаридозов II типа (MPSII).

Другой вариант осуществления настоящего изобретения направлен на способ лечения мукополисахаридозов II типа (MPSII), предусматривает стадию введения по меньшей мере одной нуклеотидной последовательности, описанной в данном документе, одной плазмиды, описанной в данном документе, или одного вектора на основе AAV, в частности, вектора на основе AAV9, описанного в данном документе, субъекту, нуждающемуся в этом.

Настоящее изобретение дополнительно предусматривает выделенную клетку, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую идуронат-2-сульфатазу из SEQ ID NO: 1. В частности, клетка в соответствии с настоящим изобретением содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок идуронат-2-сульфатазу (IDS), представленный в SEQ ID NO: 1, и на по меньшей мере 75% идентичную SEQ ID NO: 2, предпочтительно на 75-90% идентичную SEQ ID NO: 2. В частности, нуклеотидная последовательность, содержащаяся в выделенной клетке в соответствии с настоящим изобретением на 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 82%, 85%, 87% или 90% идентична SEQ ID NO: 2.

В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления клетки по настоящему изобретению содержат нуклеотидную последовательность из SEQ ID NO: 2, кодирующую идуронат-2-сульфатазу (IDS) SEQ ID NO: 1.

В соответствии с другим предпочтительным вариантом осуществления клетки по настоящему изобретению содержат нуклеотидную последовательность из SEQ ID NO: 5, кодирующую идуронат-2-сульфатазу (IDS) SEQ ID NO: 1.

В соответствии с другим предпочтительным вариантом осуществления клетки по настоящему изобретению содержат нуклеотидную последовательность из SEQ ID NO: 8, кодирующую идуронат-2-сульфатазу (IDS) SEQ ID NO: 1.

Следующие примеры носят только иллюстративный характер и ни в коем случае не могут считаться ограничивающими.

ОБЩИЕ ПРОЦЕДУРЫ

1. Рекомбинантные векторы на основе AAV

Векторы на основе AAV, описанные в данном документе, получали при помощи тройной трансфекции. Материалами, необходимыми для получения векторов, были клетки HEK293 (экспрессирующие гены аденовируса Е1), хелперная плазмида, обеспечивающая функционирование аденовирусов, плазмида, представляющая гер-гены AAV серотипа 2 и cap-гены серотипа 9 (AAV9) и, наконец, базовая плазмида с ITR AAV2 и представляющая интерес конструкция.

Для получения векторов на основе AAV, экспрессирующих идуронат-2-сульфатазу, оптимизированные или неоптимизированные кодирующие последовательности человеческой или мышиной идуронат-2-сульфатазы клонировали в базовую плазмиду на основе AAV под контролем универсального гибридного промотора CAG. Массовое получение плазмид выполняли при помощи набора EndoFree Plasmid Megaprep (Qiagen).

Векторы получали при помощи трансфекции клеток HEK293 без участия хелперных вирусов при помощи трех плазмид с модификациями. См. Matsushita Т, et al., Gene Ther. 1998; 5:938-945 и Wright J, et al., Mol. Ther. 2005; 12:171-178. Клетки культивировали до достижения 70% конфлюентности в роллерных флаконах (RB) (Corning, Корнинг, Нью-Йорк, США) в DMEM с добавлением 10% FBS и затем контрансфицировали 1) плазмидой, несущей кассету экспрессии, фланкированной вирусными ITR AAV серотипа 2 (описанными выше); 2) плазмидой, несущей rep2-гены и сар9-гены AAV; и 3) плазмидой, несущей хелперные функциональные элементы аденовирусов. Векторы очищали при помощи двух последовательных градиентов плотности хлористого цезия с использованием оптимизированного протокола, как описано ранее. См. Ayuso Е., et al., Gene Ther. 2010; 17:503-510. Векторы диализировали против PBS + 0,001% Pluronic® F68, фильтровали, титровали при помощи qPCR и хранили при -80°С до применения.

Векторы по настоящему изобретению разрабатывали в соответствии с методиками молекулярной биологии, известными в данной области.

2. Животные

Модельную мышь с недостаточностью идуронат-2-сульфатазы (MPSII) приобретали в Taconic (Germantown, NY 12526 USA, Stock TF1838). Пораженные MPSII и здоровые контрольные мыши были результатом инбридинга между гемизиготными самцами-основателями и гетерозиготными самками-основательницами. Генотипы определяли по геномным ДНК из образцов подрезанных хвостов при помощи ПЦР-анализа, в котором амплифицировали последовательность, охватывающую целевую мутацию. Последовательности соответствующих смысловых и антисмысловых праймеров были следующими: прямой праймер: 5'-ТТТ TGT GTA СТС САА ССС CG -3' (SEQ ID NO: 15), обратный праймер: 5'-TGT СТС CAT AAC AGC ССА GG -3' (SEQ ID NO: 16), мутация обрабтного праймера: 5'-GCC СТС АСА TTG ССА AAG GA -3' (SEQ ID NO: 17). Мышей содержали ad libitum на стандартной диете (Harlan, Tekland) и поддерживали цикл свет-темнота, равный 12 ч (включение света в 9.00 утра).

3. Гидродинамическая доставка IDS-кодирующих плазмид мышам

Для гидродинамической доставки плазмид на основе pAAV-CAG-hIDS, варианта 1 pAAV-CAG-ohIDS и варианта 2 pAAV-CAG-ohIDS 3-месячные животные с MPSII и животные дикого типа получали в хвостовую вену инъекцию в течение <5 секунд в суммарной дозе 30 мкг плазмид в объеме, равном 10% от веса тела животного. Эта методика приводила к экспрессии кодируемых плазмидами трансгенов главным образом в печени. См. Liu et al., Gene Ther. 1990; 6(7): 1258-66. В качестве контроля когорта мышей получала равный объем солевого раствора. Мышей разделяли на две когорты и выводили из эксперимента через 48 часов или 1 неделю после гидродинамической инъекции плазмид. Органы брали для анализа, как описано в следующем разделе.

4. Введение векторов мышам

В случае доставки в CSF векторов на основе AAV9-CAG-omIDS мышам суммарную дозу 5×10¹⁰ vg вводили в большую цистерну 2-месячным животным с MPSII. Аналогичной когорте животных вводили 5×10¹⁰ vg контрольного некодирующего (AAV9-Null) вектора. В возрасте 6 и 10 месяцев, т.е. через 4 и 8 месяцев после введения векторов, мышей анестезировали и ткани брали на анализ.

В случае внутривенной доставки векторов на основе AAV9, содержащих hIDS дикого типа или любой из оптимизированных вариантов кодирующей IDS последовательности мышам суммарную дозу 1×10¹⁰ vg вектора вводили в хвостовую вену 3,5-месячных животных с MPSII. Животные WT и не подвергшиеся обработке животные с MPSII выступали в качестве контроля. Через три недели после введения мышей анестезировали и ткани собирали на анализ.

5. Сбор образцов

При выведении из эксперимента животных глубоко анестезировали и затем транскаудально перфузировали 12 мл PBS для полного очищения крови от тканей. Весь головной мозг и несколько тканей тела (в том числе ткань печени, селезенки, поджелудочной железы, почек, легких, сердца, скелетных мышц, семенников, мочевого пузыря, кишечника и жировую ткань) собирали и замораживали в жидком азоте и хранили при -80°С или погружали в формалин для последующих гистологических анализов.

6. Активность идуронат-2-сульфатазы и количественное определение гликозаминогликанов

Образцы головного мозга, печени легких и сердца подвергали действию ультразвука в воде Mili-Q. Сыворотку анализировали необработанной, активность идуронат-2-сульфатазы определяли при помощи флуорогенного субстрата на основе 4-метилумбеллиферона (Moscerdam Substrates, Угстгест, Нидерланды), как описано ранее. См. Voznyi et al., J Inner Metab Diss 2001; 24:675-680. Уровни активности в головном мозге, печени, легких и сердце нормализовали по отношению к суммарному количеству белка, определенного количественно при помощи метода Бредфорда (Bio-Rad, Геркулес, Калифорния, США). Сывороточную активность нормализовали по отношению к объему.

В случае количественного определения гликозаминогликанов (GAG) образцы тканей взвешивали и затем переваривали при помощи протеиназы K, а экстракты очищали при помощи центрифугирования и фильтрации. Уровни GAG определяли в экстрактах тканей при помощи набора для определения сульфатированных гликозаминогликанов BIyscan (Biocolor, Каррикфергус, графство Антрим, Великобритания) с использованием хондроитин-4-сульфата в качестве стандарта. Уровни GAG нормализовали по отношению к влажному весу тканей.

7. Активность других лизосомальных ферментов

Образцы головного мозга и печени подвергали действию ультразвука в 500 мкл воды Mili-Q и активность ферментов определяли в супернатантах с использованием флуорогенных субстратов на основе 4-метилумбеллиферона. Сыворотку анализировали необработанной. Активность IDUA анализировали в 15 мкг белка, инкубированного в течение 1 ч при 37°С с 4-метилумбеллиферил-α-L-идуронидом (Glycosynth). См. Barter et al., Blood 2002; 99(5)1857-9. Активность SGSH измеряли, как описано ранее. См. Karpova et al., J Inherit Metab Dis. 1996; 19(3):278-285, Haurigot et al., выше. Вкратце, 30 мкг белка сначала инкубировали с 4-MU-αGlcNS в течение 17 часов при 47°С. Вторую инкубацию проводили в присутствии 10 ЕД./мл а-глюкозидазы (Sigma-Aldrich) в 0,2% BSA в течение 24 часов при 37°С. В случае активности NAGLU 30 мкг экстракта тканевых белков инкубировали с 4-метилумбеллиферил-α-N-ацетил-D-глюкозаминидом (Moscerdam Substrates) в течение 3 ч при 37°С, как описано ранее. См. Marsh et al., Clin Genet. 1985; 27(3):258-62, Ribera et al., выше. Активность HGSNAT определяли на основе 30 мкг белкового экстракта, инкубированного с ацетилкоэнзимом А и 4-метилумбелиферрил-3-D-глюкозамином (MU-3GlcNH₂, Moscerdam Substrates) в течение 17 ч при 37°С. См. Voznyi et al., J Inh Metab Dis 1993; 16:465-72. Активность GALNS анализировали с использованием 2-стадийного протокола с применением 10 мкг белкового экстракта и 4-метилумбеллиферил β-D-галактопиранозид-6-сульфат-натриевой соли (MU-3Gal-6S) во время первой инкубации в течение 17 ч при 37°С. Вторую стадию осуществляли при помощи добавления Pi-буфера (буфер 0,9 М Na₂HPO₄/0,9 М NaH₂PO₄, рН 4,3, + 0,02% (w/v) Na-азид) и β-галактозидазы (β-Gal-Ao, Sigma) и инкубации смеси в течение 2 ч при 37°С. См. van Diggelen et al., Clin Chim Acta 1990; 187:131-40. Активность фермента GUSB определяли на основе 10 мкг белкового экстракта, инкубированного с 4-метилумбеллиферил-β-D-глюкуронида (Sigma) при 37°С в течение 1 ч. Активность НЕХВ анализировали при помощи инкубации 0,1 мкг белкового экстракта с 4-метилумбеллиферил N-ацетил-β-D-глюкозаминидом (Sigma) в течение 1 ч при 37°С. После остановки реакций в результате повышения рН выделяемую флуоресценцию измеряли при помощи флуориметра FLx800 (BioTek Instruments). Все уровни активности в головном мозге и печени нормализовали по отношению к суммарному количеству белка, определенного количественно при помощи метода Бредфорда (Bio-Rad, Геркулес, Калифорния, США).

8. Гистологический анализ

Ткани фиксировали в течение 12-24 ч в формалине, заключали в парафин и выполняли срезы. С целью иммуногистохимического выявления LAMP2 в головном мозге парафиновые срезы подвергали высокотемпературной демаскировке антигена в цитратном буфере, рН 6, и затем инкубировали в течение ночи при 4°С с крысиным антителом к LAMP2 (Ab13524; Abeam, Кембридж, Великобритания), разведенным при 1:500, а затем инкубировали с биотинилированным кроличьим антителом к крысиному антителу (Dako, Глоструп, Дания) при 1:300. В случае иммуноокрашивания на наличие GFAP в образцах головного мозга парафиновые срезы инкубировали при 4°С с кроличьим антителом к GFAP (Ab6673; Abeam, Кембридж, Великобритания), разведенным при 1:1000, а затем инкубировали с биотинилированным козьим антителом к кроличьему антителу (31820; Vector Laboratories, Бурлингейм, Калифорния, США) при 1:300. Сигналы от LAMP2 и GFAP амплифицировали при помощи инкубации срезов с набором для окрашивания ABC-Peroxidase (Thermo Scientific, Уолтем, Массачусетс, США) при разведении 1:100 и визуализировали при помощи 3,3-диаминобензидина (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США) в качестве хромогена.

Для окрашивания микроглиальных клеток в образцах головного мозга парафиновые среды инкубировали в течение ночи при 4°С с лектином BSI-B4 (L5391; Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США), разведенным при 1:100. Сигнал от BSI-B4 визуализировали при помощи 3,3-диаминобензидина (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США) в качестве хромогена. Изображения в светлом поле получали при помощи оптического микроскопа (Eclipse 90i; Nikon, Токио, Япония).

Компьютерную программу NIS Elements Advanced Research 2.20 использовали для количественного определения сигналов от LAMP2, GFAP и BSI-B4 в 3-4 изображениях каждого отдела головного мозга (исходное увеличение, х20) на животное, при помощи одинаковых параметров порога пропускания сигнала для всех животных. Затем рассчитывали процент положительной площади, т.е. площади в пикселях с положительным сигналом на суммарной площади ткани в изображении.

9. Количественное определение числа копий векторных геномов в тканях

После переваривания тканей в течение ночи при помощи протеиназы K (0,2 мг/мл), полную ДНК выделяли при помощи набора MasterPureDNA Purification (Epicenter). Количественную ПЦР с праймерами и зондом, специфичным по отношению к последовательности НВВ2 (содержащейся в сегменте поли-А) использовали для количественного определения числа копий векторных геномов в 20 нг полной РНК. Прямой праймер: 5'-СТТ GAG CAT CTG ACT TCT GGC TAA T-3'; обратный праймер: 5'-GAT TTG CCC TCC CAT ATG TCC-3'; зонд: 5'-CCG AGT GAG AG А С AC AAA AAA TTC CAA CAC-3'. Кривую эталонного стандарта, построенную на основе серийных разведений линеаризованной плазмиды, содержащей последовательность поли-А, использовали для интерполяции конечных значений vg/образец.

10. Тест открытого поля

Поведение 6-месячных крыс анализировали при помощи теста открытого поля, выполняемого с 9.00 до 13.00. Животных помещали в нижний левый угол ярко-освещенной камеры (41×41×30 см), пересеченной 2 пучками лучей света (SedaCom32; Panlab), которые выявляли горизонтальные и вертикальные движения мышей. Поверхность разделяли на три разбитые на квадраты концентрические области: центральную (14×14 см), периферическую (27×27 см) и пограничную (41×41 см). Исследовательскую и двигательную активности фиксировали в течение первых 3 минут теста при помощи системы видеотелевизионного сопровождения целей (SmartJunior, Panlab).

11. Статистический анализ

Все результаты выражали в виде среднего значения ± SEM. Статистические сравнения проводили при помощи однофакторного ANOVA. Множественные сравнения между контрольными группами и группами обработки выполняли при помощи апостериорного критерия Даннета, а между всеми группами при помощи апостериорного критерия Тьюки. Статистическую значимость учитывали при Р<0,05. Кривые Каплана-Мейера использовали для оценки выживаемости, а логарифмический ранговый критерий использовали для сравнений.

Примеры

Пример 1. Конструирование pAAV-CAG-UDS

CDS для человеческой идуронат-2-сульфатазы использовали в качестве исходного материала (эталонная последовательность в NCBI: NM_000202.6) и химически синтезировали для данной цели (GenScript Inc). CDS получали клонированной в плазмиде pUC57 (AmpR), фланкированной сайтами рестрикции Swal.

CDS-фрагмент на основе Swal-Swal и человеческой идуронат-2-сульфатазы вырезали из плазмиды pUC57 и затем клонировали между сайтами рестрикции Mlul и EcoPI базовой плазмиды на основе AAV pAAV-CAG после получения 5' и 3' выступающих концов, притупленных фрагментом Кленова (Fermentas). Полученную плазмиду назвали pAAV-CAG-hIDS (номер доступа DSM 29866). См. фиг. 1А и SEQ ID NO: 3.

Плазмиду на основе pAAV-CAG получали ранее, и она содержала ITR из генома AAV2, промотор CAG и сигнальную последовательность поли-А из β-глобина кролика, а также сайт множественного клонирования представляющих интерес CDS. Промотор CAG представляет собой гибридный промотор, состоящий из раннего/промежуточного энхансера CMV и промотора β-актина цыпленка. Этот промотор способен управлять выраженной экспрессией универсально. См. Sawicki J et al., Exper Cell Res. 1998; 244:367-369, Huang J et al., J Gene Med. 2003; 5:900-908, Liu Y ei al., Exp Mol Med. 2007; 39(2):170-175.

Пример 2. Конструирование варианта 1 pAAV-CAG-ohIDS

Разрабатывали и получали кассеты экспрессии, включающие оптимизированный вариант последовательности cDNA человеческой идуронат-2-сульфатазы (ohIDS). Оптимизацию последовательности выполняли с целью повышения до максимума эффективности образования белка идуронат-2-сульфатазы у человека путем устранения криптических сайтов сплайсинга и дестабилизирующих РНК элементов последовательности с целью повышения стабильности РНК, добавления стабилизирующих РНК элементов последовательности, оптимизации кодонов и адаптации содержания G/C, избежания стабильных вторичных структур РНК среди других изменений. CDS для человеческой идуронат-2-сульфатазы (эталонная последовательность в NCBI: NM_000202.6) использовали в качестве исходного материала для оптимизации последовательности (DNA 2.0 Inc). Оптимизированные CDS получали клонированными в плазмиде pJ204:191476 (AmpR), фланкированной по сайтам рестрикции Mlul и EcoRI на 5' и 3' соответственно.

CDS-фрагмент, оптимизированный Mlul/EcoRI, на основе человеческой идуронат-2-сульфатазы вырезали из плазмиды pJ204:191476 и затем клонировали между сайтами рестрикции Mlul и EcoRI базовой плазмиды на основе AAV pAAV-CAG. Полученную плазмиду назвали вариант 1 pAAV-CAG-ohIDS (номер доступа DSM 29867). См. фиг. 2А и SEQ ID NO: 6.

Пример 3. Конструирование варианта 2 pAAV-CAG-ohIDS

CDS для человеческой идуронат-2-сульфатазы (эталонная последовательность в NCBI: NM_000202.6) подвергали оптимизации последовательности (GeneScript Inc). Оптимизированные CDS получали клонированными в плазмиде pUC57 (AmpR), фланкированной по сайтам рестрикции Mlul и EcoRI на 5' и 3' соответственно.

Плазмиду на основе pUC57-ohIDS переваривали при помощи Mlul и EcoRI с целью вырезания оптимизированной CDS идуронат-2-сульфатазы. Затем этот фрагмент клонировали между одинаковыми сайтами базовой плазмиды pAAV-CAG с целью получения плазмиды варианта 2 pAAV-CAG-ohIDS (номер доступа DSM 29868). См. фиг. 3А и SEQ ID NO: 9.

Пример 4. Конструирование pAAV-CAG-omIDS

CDS для мышиной идуронат-2-сульфатазы (эталонная последовательность в NCBI: NM_010498.3) подвергали оптимизации последовательности (GeneArt; Life Technologies). Оптимизированные CDS получали клонированными в плазмиде pMA-RQ (AmpR), фланкированной по сайтам рестрикции Mlul и EcoRI на 5' и 3' соответственно.

CDS-фрагмент, оптимизированный Mlul/EcoRI, на основе мышиной идуронат-2-сульфатазы (SEQ ID NO: 11) вырезали из плазмиды pMA-RQ и затем клонировали между сайтами рестрикции Mlul и EcoRI базовой плазмиды на основе AAV pAAV-CAG. Полученную плазмиду назвали pAAV-CAG-omIDS. См. фиг. 4А и SEQ ID NO: 12.

Пример 5. Получение AAV9-CAG-hIDS

Векторы на основе AAV9-CAG-hlDS (SEQ ID NO: 4) получали при помощи трансфекции клеток HEK293 без участия хелперных вирусов при помощи трех плазмид с модификациями. См. Matsushita et al., Gene Ther. 1998; 5(7):938-45, Wright et al., Mol Ther. 2005; 12(1)171-8. Клетки культивировали до достижения 70% конфлюентности в роллерных флаконах (RB) (Corning, Корнинг, Нью-Йорк, США) в DMEM с добавлением 10% FBS и затем контрансфицировали 1) плазмидой, несущей кассету экспрессии, фланкированную ITR AAV2 (pAAV-CAG-hIDS); 2) плазмидой, несущей rep-гены AAV2 и cap-гены AAV9 (pREP2CAP9); и 3) плазмидой, несущей хелперные функциональные элементы аденовируса. Векторы очищали при помощи двух последовательных градиентов плотности хлористого цезия с использованием оптимизированного протокола, как описано ранее. См. Ayuso et al., Gene Ther. 2010; 17(4):503-10. Векторы диализировали против PBS + 0,001% Pluronic® F68, фильтровали, титровали при помощи qPCR и хранили при -80°С до применения. См. фиг. 1В.

Пример 6. Получение варианта 1 AAV9-CAG-ohIDS

Векторы на основе варианта 1 AAV9-CAG-ohIDS (SEQ ID NO: 7) получали при помощи трансфекции клеток HEK293 без участия хелперных вирусов при помощи трех плазмид с модификациями. См. Matsushita et al., и Wright et al., выше. Клетки культивировали до достижения 70% конфлюентности в роллерных флаконах (RB) (Corning, Корнинг, Нью-Йорк, США) в DMEM с добавлением 10% FBS и затем контрансфицировали 1) плазмидой, несущей кассету экспрессии, фланкированную ITR AAV2 (вариант 1 pAAV-CAG-ohIDS); 2) плазмидой, несущей rep-гены AAV2 и сар-гены AAV9 (pREP2CAP9); и 3) плазмидой, несущей хелперные функциональные элементы аденовируса. Векторы очищали при помощи двух последовательных градиентов плотности хлористого цезия с использованием оптимизированного протокола, как описано ранее. См. Ayuso et al., выше. Векторы диализировали против PBS + 0,001% Pluronic® F68, фильтровали, титровали при помощи qPCR и хранили при -80°С до применения. См. фиг. 2В.

Пример 7. Получение варианта 2 AAV9-CAG-ohIDS

Векторы на основе варианта 2 AAV9-CAG-ohIDS (SEQ ID NO: 10) получали при помощи трансфекции клеток HEK293 без участия хелперных вирусов при помощи трех плазмид с модификациями. См. Matsushita et al., и Wright et al., выше. Клетки культивировали до достижения 70% конфлюентности в роллерных флаконах (RB) (Corning, Корнинг, Нью-Йорк, США) в DMEM с добавлением 10% FBS и затем контрансфицировали 1) плазмидой, несущей кассету экспрессии, фланкированную ITR AAV2 (вариант 2 pAAV-CAG-ohIDS); 2) плазмидой, несущей rep-гены AAV2 и сар-гены AAV9 (pREP2CAP9); и 3) плазмидой, несущей хелперные функциональные элементы аденовируса. Векторы очищали при помощи двух последовательных градиентов плотности хлористого цезия с использованием оптимизированного протокола, как описано ранее. См. Ayuso et al., выше. Векторы диализировали против PBS + 0,001% Pluronic® F68, фильтровали, титровали при помощи qPCR и хранили при -80°С до применения. См. фиг. 3В.

Пример 8. Получение AAV9-CAG-omIDS

Векторы на основе AAV9-CAG-omIDS (SEQ ID NO: 13) получали при помощи трансфекции клеток HEK293 без участия хелперных вирусов при помощи трех плазмид с модификациями. См. Matsushita et al., и Wright et al., выше. Клетки культивировали до достижения 70% конфлюентности в роллерных флаконах (RB) (Corning, Корнинг, Нью-Йорк, США) в DMEM с добавлением 10% FBS и затем контрансфицировали 1) плазмидой, несущей кассету экспрессии, фланкированную ITR AAV2 (вариант 2 pAAV-CAG-omIDS); 2) плазмидой, несущей rep-гены AAV2 и cap-гены AAV9 (pREP2CAP9); и 3) плазмидой, несущей хелперные функциональные элементы аденовируса. Векторы очищали при помощи двух последовательных градиентов плотности хлористого цезия с использованием оптимизированного протокола, как описано ранее. См. Ayuso et al., выше. Векторы диализировали против PBS + 0,001% Pluronic® F68, фильтровали, титровали при помощи qPCR и хранили при -80°С до применения. См. фиг. 4В.

Пример 9. Гидродинамическая инъекция pAAV-CAG-hIDS, варианта 1 pAAV-CAG-ohIDS и варианта 2 pAAV-CAG-ohIDS здоровым мышам.

Суммарную дозу 30 мкг плазмид pAAV-CAG-hIDS, варианта 1 pAAV-CAG-ohIDS и варианта 2 pAAV-CAG-ohIDS, содержащую различные варианты кассеты экспрессии на основе идуронат-2-сульфатазы, вводили 2-месячным мышам WT при помощи гидродинамической инъекции в хвостовую вену. Эта методика целенаправленно воздействует на экспрессию доставленной плазмиды в печень. См. Liu et ai, Gene Ther. 1990; 6(7): 1258-66.

Через сорок восемь часов после доставки плазмид значительное повышение по отношению к исходным уровням активности идуронат-2-сульфатазы отмечали в печени и сыворотке всех животных, которым вводили кодирующие идуронат-2-сульфатазу плазмиды. В печени и сыворотке уровни активности, достигнутые при применении кассет экспрессии, содержащих оптимизированные варианты гена идуронат-2-сульфатазы, были выше полученных в случае гена дикого типа. Кроме того, животные, которые получали плазмиду варианта 2 pAAV-CAG-ohIDS, характеризовались уровнями активности идуронат-2-сульфатазы в сыворотке, которые были статистически выше, чем описанные в случае других 2 плазмид. См. фиг. 5А и 5В.

Пример 10. Гидродинамическая инъекция pAAV-CAG-hIDS, варианта 1 pAAV-CAG-ohIDS и варианта 2 pAAV-CAG-ohIDS мышам с MPSII.

Суммарную дозу 30 мкг плазмид pAAV-CAG-hIDS, варианта 1 pAAV-CAG-ohIDS и варианта 3 pAAV-CAG-ohIDS, содержащую различные варианты кассеты экспрессии на основе идуронат-2-сульфатазы, вводили 2-месячным мышам, пораженным MPSII, при помощи гидродинамической инъекции в хвостовую вену.

Ткани собирали на анализ через 1 неделю после доставки плазмид. Все три содержащие идуронат-2-сульфатазу плазмиды, опосредовали значительное повышение активности идуронат-2-сульфатазы по отношению к животным с MPSII, которые получали инъекцию солевого раствора; активности варьировали от 1200% до 2200% от уровней WT в печени и от 2000% до 5700% от уровней WT в сыворотке. Уровни активности, достигнутые при применении кассет экспрессии, содержащих кодон-оптимизированные варианты гена идуронат-2-сульфатазы, были статистически выше опосредованных плазмидой, содержащей ген дикого типа. См. фиг. 6А и 6В.

Находясь в соответствии с высокими уровнями активности идуронат-2-сульфатазы, описанными в печени и сыворотке, содержание GAG полностью нормализовалось во всех анализируемых тканях со всеми плазмидными конструкциями. См. фиг. 6С.

Пример 11. Внутривенная доставка AAV9-CAG-MDS, варианта 1 AAV9-CAG-ohIDS и варианта 2 AAV9-CAG-ohIDS мышам с MPSII

Мыши с MPSII (в возрасте 3,5 месяцев) получали внутривенную инъекцию в хвостовую вену 1×10¹⁰ vg векторов на основе AAV9, содержащих последовательности человеческой идуронат-2-сульфатазы дикого типа или оптимизированные последовательности человеческой идуронат-2-сульфатазы. Отдельные когорты сопоставимых по возрасту мышей WT и не подвергшихся обработке мышей с MPSII выступали в качестве контроля. Через три недели после лечения животных выводили из эксперимента и собирали и анализировали образцы крови и печени.

Внутривенное введение векторов на основе AAV9 в дозе 1×10¹⁰ vg/мышь целенаправленно воздействует на экспрессию трансгенов главным образом в печени. См. Wu et al., Mol. Ther. 2006; 14(3):316-27, Inagaki et al., Mol. Ther. 2006; 14(1):45-33. При измерении активности идуронат-2-сульфатазы в экстрактах печени через 3 недели после доставки векторов отчетливое повышение активности ферментов описывали у самцов с MPSII, которые получали любой из кодирующих человеческую IDS векторов. См. фиг. 7А. Однако повышение было значимо более высоким в случае животных с MPSII, которые получали векторы на основе AAV9, содержащие оптимизированные последовательности человеческой идуронат-2-сульфатазы (вариант 1 AAV9-CAG-ohIDS и вариант 2 AAV9-CAG-ohIDS). Уровни активности идуронат-2-сульфатазы, достигаемые у животных, которые получали векторы с последовательностью дикого типа, были примерно в два раза выше наблюдаемых у здоровых животных WT. См. фиг. 7А. В случае векторов, которые содержат оптимизированные последовательности человеческой IDS, уровни активности идуронат-2-сульфатазы были в несколько раз выше наблюдаемых у здоровых животных или у животных с MPSII, подвергшихся обработке векторов, содержащих последовательность IDS дикого типа. См. фиг. 7А.

Идуронат-2-сульфатаза представляет собой секретируемый лизосомальный фермент и поэтому его синтез в печени представляет собой источник циркулирующего фермента. См. Haurigot et al., выше. Аналогично наблюдениям, полученным в случае экстрактов печени, уровни активности идуронат-2-сульфатазы в крови животных с MPSII, подвергшихся обработке векторов на основе AAV9, содержащих оптимизированные последовательности человеческой IDS, были в несколько раз выше, чем наблюдаемые у здоровых животных, или у животных с MPSII, подвергшихся обработке векторов, содержащих последовательность человеческой IDS дикого типа. См. фиг. 7В.

Находясь в соответствии с высокими уровнями активности идуронат-2-сульфатазы, описанной в печени и сыворотке, содержание GAG полностью нормализовалось в печени мышей с MPSII, подвергшихся обработке вариантом 1 AAV9-CAG-ohIDS и вариантом 2 AAV9-CAG-ohIDS. Однако уровни GAG лишь частично снижали в печени животных, подвергшихся обработке равной дозы векторов на основе AAV9, несущих кодирующую последовательность IDS дикого типа. См. фиг. 1С.

Пример 12. Интрацистернальная доставка AAV9-CAG-hIDS, варианта 1 AAV9-CAG-ohIDS и варианта 2 AAV9-CAG-ohIDS мышам с MPSII

Двухмесячные мыши с MPSII получали интрацистернальную инъекцию 5×10¹⁰ vg векторов на основе AAV9, содержащих последовательность человеческой идуронат-2-сульфатазы дикого типа или оптимизированную последовательность человеческой идуронат-2-сульфатазы в общем объеме 5 мкл. Отдельные когорты сопоставимых по возрасту мышей WT, не подвергшихся обработке мышей с MPSII и мышей с MPSII, получающих 5×10¹⁰ vg некодирующего вектора (AAV9-CAG-Null) выступали в качестве контроля. В возрасте 3,5 месяцев, т.е. через 1,5 месяца после лечения, животных выводили из эксперимента и собирали и анализировали образцы.

При измерении активности идуронат-2-сульфатазы в экстрактах головного мозга отчетливое повышение активности ферментов описывали у самцов с MPSII, которые получали любой из кодирующих человеческую IDS векторов. См. фиг. 8А. Однако повышение было в несколько раз выше в случае животных с MPSII, которые получали векторы на основе AAV9, содержащие оптимизированные последовательности человеческой идуронат-2-сульфатазы (вариант 1 AAV9-CAG-ohIDS и вариант 2 AAV9-CAG-ohIDS), чем у животных с MPSII, подвергшихся обработке векторами, содержащими последовательность IDS дикого типа. См. фиг. 8А. Уровни активности идуронат-2-сульфатазы у животных, которые получали векторы с оптимизированными последовательностями человеческой идуронат-2-сульфатазы, были почти такими же высокими, как таковые в случае WT или даже выше; в наиболее ростральной области головного мозга (отдел I) активность IDS, полученная в результате обработки векторами, содержащими оптимизированные последовательности человеческой идуронат-2-сульфатазы почти вдвое превышала уровни в случае WT. См. фиг. 8А.

Находясь в соответствии с повышением активности IDS в головном мозге, накопление субстрата, который характеризует заболевание, корректировалось в головном мозге подвергшихся обработке мышей с MPSII, о чем свидетельствовало значимое снижение содержания GAG. См. фиг. 8В. Полную нормализацию уровней GAG наблюдали в случае всех конструкций во всех анализируемых областях, за исключением отдела V, в котором эффект синтеза IDS, полученной из векторов, содержащих кодирующие IDS последовательности дикого типа, не был очевидным. См. фиг. 8В.

Векторы на основе AAV9, вводимые в CSF, распространяются к периферии и трансдуцируют печень. См. Haurigot et al., Clin Invest. 2013; 123(8):3254-3271, Ribera et al., Hum Mol Genet. 2014; 24(7):2078-2095. Соответственно, повышение активности идуронат-2-сульфатазы описывали в печени и сыворотке мышей с MPSII, подвергшихся обработке любым из кодирующих человеческую IDS векторов. См. фиг. 9А и 9В. Снова повышение было значительно выше в случае животных с MPSII, которые получали векторы на основе AAV9, содержащие оптимизированные последовательности человеческой идуронат-2-сульфатазы (вариант 1 AAV9-CAG-ohIDS и вариант 2 AAV9-CAG-ohIDS), чем у животных с MPSII, подвергшихся обработке векторами, содержащими последовательность IDS дикого типа. См. фиг. 9А и 9В. При оценке эффективности терапии при помощи количественного определения содержания GAG в различных органах тела полную нормализацию уровней GAG наблюдали во всех тканях мышей с MPSII, подвергшихся обработке любым из кодирующих оптимизированную человеческую IDS векторов. См. фиг. 9С. Однако мыши с MPSII, которые получали последовательность человеческой IDS дикого типа, характеризовались полной нормализацией содержания GAG в печени, сердце, легких и селезенке, но лишь частичной коррекцией в семенниках, почках, мочевом пузыре и жировой ткани. См. фиг. 9С.

Пример 13. Интрацистернальная доставка AAV9-CAG-omIDS

Суммарную дозу 5×10¹⁰ векторных геномов вектора на основе AAV9-CAG-omIDS вводили в большую цистерну 2-месячных животных с MPSII в суммарном объеме 5 мкл. Вначале мыши анализировали в возрасте 6 месяцев, т.е. через 4 после введения векторов. Доставка в CSF векторов на основе AAV9-CAG-omIDS приводила к восстановлению активности идуронат-2-сульфатазы во всех областях головного мозга, достигая уровней, которые составляли в среднем 40% от наблюдаемых у здоровых животных в различных областях. См. фиг. 10А. Через четыре месяца после доставки векторов накопление субстрата, характерное для заболевания, полностью нормализовалось в головном мозге подвергнутых обработке мышей с MPSII, о чем свидетельствовала нормализация содержания GAG во всех анализируемых областях головного мозга. См. фиг. 10В. Аналогично, размер лизосомального компартмента полностью нормализовался, о чем свидетельствовало количественное определение интенсивности сигнала в случае иммунного выявления лизосомального маркера LAMP2. Сигнал от LAMP2 пропорционален размеру лизосомального компартмента, который, в свою очередь, зависит от количества накопленного нерасщепленного гепаран- и дерматансульфата. См. фиг. 11А. Кроме того, эффект лечения на расширение лизосом оставался стабильным через 8 месяцев после доставки AAV9-CAG-omIDS, указывая на длительную эффективность терапии. См. фиг. 12.

Нарушение нормального гомеостаза лизосом в результате накопления нерасщепленного субстрата может изменять активность других лизосомальных ферментов, отличных от того, который непосредственно нарушается в результате мутации. См. Ribera et al., Hum Mol Genet. 2014; doi: 10.1093/hmg/ddu727. В мозге не подвергшихся обработке мышей с MPSII или мышей с MPSII, подвергшихся обработке контрольным вектором «Null», активности IDUA (идуронидазы, альфа-L-), SGSH (N-сульфоглюкозаминсульфогидролазы), NAGLU (N-ацетилглюкозаминидазы, альфа), HGSNAT (гепаран-альфа-глюкозаминид-N-ацетилтрансферазы), GALNS (галактозамин-(N-ацетил)-6-сульфатазы), GUSB (глюкуронидазы, бета), НЕХВ (гексозаминидазы В) были изменены, однако обработка AAV9-CAG-omIDS возвращала эти активности к уровням, наблюдаемым у здоровых животных WT, указывая на то, что вектор был способен восстанавливать гомеостаз лизосом. См. фиг. 11В.

Находясь в соответствии с коррекцией лизосомальной патологии, все признаки воспаления исчезали из головного мозга подвергшихся обработке мышей с MPSII. Через четыре месяца после лечения интенсивности сигналов в случае окрашивания, используемые для выявления астроцитоза (GFAP) и микроглиоза (BSI-B4), были подобными у подвергшихся обработке мышей с MPSII и у здоровых животных в различных областях головного мозга, в отличие от сигнала, описанного у мышей с MPSII, которым вводили контрольный вектор на основе AAV9 «Null», что показывало отчетливое повышение активации этих маркеров нейровоспаления. См. фиг. 13А и 13В. Кроме того, в возрасте 10 месяцев, т.е. через 8 месяцев после переноса генов, благоприятное влияние обработки AAV9-CAG-omIDS на нейровоспаление, оцениваемое при помощи окрашивания GFAP и BSI-B4, сохранялось, указывая на длительное устранение нейровоспаления. См. фиг. 14А и 14В.

Векторы на основе AAV9, вводимые в CSF, распространяются к периферии и трансдуцируют печень. См. Haurigot et al., Clin Invest. 2013; 123(8):3254-3271, Ribera et al., Hum Mol Genet. 2014; doi: 10.1093/hmg/ddu727. Соответственно, повышение активности идуронат-2-сульфатазы описывали через 4 месяца после переноса генов в печени и сыворотке мышей с MPSII, подвергшихся обработке AAV9-CAG-omIDS, достигая уровней примерно 1700% и 700% от уровней, наблюдаемых у здоровых животных, соответственно. См. фиг. 15А и 15В. При оценке соматической эффективности терапии при помощи количественного определения содержания GAG в различных органах, полную нормализацию наблюдали в большинстве тканей, в том числе печени, сердце, легких, семенниках, селезенке и жировой ткани, за исключением почек и мочевого пузыря, в которых наблюдали >50% снижение GAG. См. фиг. 15С.

Через четыре месяца после лечения активность также повышалась в легких и была особенно высокой в сердце. См. фиг. 16А и 16В. Эти два органа, легкие и сердце, характеризовались очень низкими значениями числа копий векторных геномов/диплоидный геном, указывая на отсутствие эффективной трансдукции этих органов после доставки в CSF AAV9-CAG-omIDS в дозе 5×10¹⁰ vg. См. фиг. 16С. Этот результат свидетельствовал о перекрестной коррекции недостаточности IDS при помощи захвата IDS из кровотока.

Находясь в соответствии с данными о содержании GAG, вес печени нормализовался у 6-месячных мышей с MPSII, подвергшихся обработке AAV9-CAG-omIDS в возрасте 2 месяцев. См. фиг. 17А. Дополнительную демонстрацию возможности обработки AAV9-CAG-omIDS в CSF для противодействия лизосомальной патологии у мышей с MPSII, представляли при помощи измерения активности других лизосомальных ферментов в экстрактах печени. IDUA, SGSH, NAGLU, HGSNAT, GALNS, GUSB, НЕХВ были значительно изменены по отношению к уровням WT у не подвергшихся обработке мышей с MPSII или мышей с MPSII, подвергшихся обработке контрольным вектором «Null». Обработка AAV9-CAG-omIDS полностью нормализовала активности всех этих ферментов. См. фиг. 17В. Кроме того, активность НЕХВ также повышается как следствие лизосомальной патологии, и она полностью нормализовалась после обработки AAV9-CAG-omIDS. См. фиг. 17С, представляющую доказательство коррекции функционирования лизосом во всем организме.

Влияние введения в CSF AAV9-CAG-omIDS на поведение определяли в возрасте 6 месяцев при помощи теста открытого поля, который оценивает общую двигательную и исследовательскую активность мышей в неизвестной среде. Не подвергшиеся обработке и подвергшиеся обработке AAV9-null мыши с MPSII проявляли сниженную исследовательскую активность по сравнению с мышами с точки зрения времени, проведенного в центре и на периферии, числа вхождений в центр и на периферию и общего числа быстрых передвижений. Интрацистернальное введение AAV9-CAG-omIDS полностью корректировало поведенческие нарушения у мышей с MPSII. См. фиг. 18A-F.

В конечном итого, терапевтическую эффективность обработки в CSF AAV9-CAG-omIDS оценивали при сравнении выживания не подвергшихся обработке и подвергшихся обработке мышей с MPSII. Генная терапия на основе AAV9-CAG-omIDS значительно увеличивала продолжительно жизни мышей с MPSII. См. фиг. 19. Если в возрасте 17 месяцев все не подвергшиеся обработке или подвергшиеся обработке AAV9-CAG-Null мыши с MPSII погибали, 76% мышей с MPSII, получавших AAV9-CAG-omIDS, были живы. Кроме того, 65% не подвергшихся обработке животных по-прежнему были живы в возрасте 22 месяцев. % животных дикого типа, живых в этом возрасте, составил 79%. См. фиг. 19.

Пример 14. Интрацистернальная доставка различных доз AAV9-CAG-omIDS: исследование «доза-эффект»

Четыре различных дозы (1,58×10⁹, 5×10⁹, 1,58×10¹⁰ и 5×10¹⁰ vg/мышь) векторов на основе AAV9-CAG-omIDS вводили 2-месячным животным с MPSII при помощи интрацистернальной инъекции в суммарном объеме 5 мкл.

Через полтора месяца после введения векторов животных выводили из эксперимента и ткани собирали на анализ, активность идуронат-2-сульфатазы измеряли в различных областях головного мозга (отделы I-V). Активность повышалась в зависимости от дозы и находилась в диапазоне от 0,8 до 53% от активности WT в различных областях. См. фиг. 20А. Аналогичную зависимость «доза-эффект» наблюдали при анализе влияния лечения на накопление GAG. Однако полную коррекцию накопления GAG описывали только при двух максимальных дозах 1,58×10¹⁰ и 5×10¹⁰ vg/мышь. См. фиг. 20В.

В печени и сыворотке активность также повышалась в зависимости от дозы, находясь в диапазоне от 20% до 4300% в печени и от 0,4% до 1100% в сыворотке. Активность IDS не выявляли в сыворотке в случае 2 минимальных доз (1,58×10⁹, 5×10⁹ vg/мышь). См. фиг. 21А и 21В. Находясь в соответствии с данными об активности, измерение содержания GAG в периферических тканях характеризовалось снижением зависимости «доза-эффект» в случае содержания GAG в печени, сердце, легких, семенниках, селезенке, почках, мочевом пузыре и жировой ткани. Полное или почти полную нормализацию уровней GAG достигали почти во всех тканях в случае 2 максимальных доз (1,58×10¹⁰ и 5×10¹⁰ vg/мышь), за исключением легких и мочевого пузыря, в которых описывали >70% снижения, и почек, в которых наблюдали примерно 50% снижение. См. фиг. 21С.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Laboratorios del Dr. ESTEVE S. A.

Universitat Autтnoma de Barcelona

<120> ADENOASSOCIATED VIRUS VECTORS FOR THE TREATMENT OF

MUCOPOLYSACCHARIDOSES

<130> PCT2212.6

<150> EP15382297

<151> 2015-06-05

<160> 17

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 550

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

Met Pro Pro Pro Arg Thr Gly Arg Gly Leu Leu Trp Leu Gly Leu Val

1 5 10 15

Leu Ser Ser Val Cys Val Ala Leu Gly Ser Glu Thr Gln Ala Asn Ser

20 25 30

Thr Thr Asp Ala Leu Asn Val Leu Leu Ile Ile Val Asp Asp Leu Arg

35 40 45

Pro Ser Leu Gly Cys Tyr Gly Asp Lys Leu Val Arg Ser Pro Asn Ile

50 55 60

Asp Gln Leu Ala Ser His Ser Leu Leu Phe Gln Asn Ala Phe Ala Gln

65 70 75 80

Gln Ala Val Cys Ala Pro Ser Arg Val Ser Phe Leu Thr Gly Arg Arg

85 90 95

Pro Asp Thr Thr Arg Leu Tyr Asp Phe Asn Ser Tyr Trp Arg Val His

100 105 110

Ala Gly Asn Phe Ser Thr Ile Pro Gln Tyr Phe Lys Glu Asn Gly Tyr

115 120 125

Val Thr Met Ser Val Gly Lys Val Phe His Pro Gly Ile Ser Ser Asn

130 135 140

His Thr Asp Asp Ser Pro Tyr Ser Trp Ser Phe Pro Pro Tyr His Pro

145 150 155 160

Ser Ser Glu Lys Tyr Glu Asn Thr Lys Thr Cys Arg Gly Pro Asp Gly

165 170 175

Glu Leu His Ala Asn Leu Leu Cys Pro Val Asp Val Leu Asp Val Pro

180 185 190

Glu Gly Thr Leu Pro Asp Lys Gln Ser Thr Glu Gln Ala Ile Gln Leu

195 200 205

Leu Glu Lys Met Lys Thr Ser Ala Ser Pro Phe Phe Leu Ala Val Gly

210 215 220

Tyr His Lys Pro His Ile Pro Phe Arg Tyr Pro Lys Glu Phe Gln Lys

225 230 235 240

Leu Tyr Pro Leu Glu Asn Ile Thr Leu Ala Pro Asp Pro Glu Val Pro

245 250 255

Asp Gly Leu Pro Pro Val Ala Tyr Asn Pro Trp Met Asp Ile Arg Gln

260 265 270

Arg Glu Asp Val Gln Ala Leu Asn Ile Ser Val Pro Tyr Gly Pro Ile

275 280 285

Pro Val Asp Phe Gln Arg Lys Ile Arg Gln Ser Tyr Phe Ala Ser Val

290 295 300

Ser Tyr Leu Asp Thr Gln Val Gly Arg Leu Leu Ser Ala Leu Asp Asp

305 310 315 320

Leu Gln Leu Ala Asn Ser Thr Ile Ile Ala Phe Thr Ser Asp His Gly

325 330 335

Trp Ala Leu Gly Glu His Gly Glu Trp Ala Lys Tyr Ser Asn Phe Asp

340 345 350

Val Ala Thr His Val Pro Leu Ile Phe Tyr Val Pro Gly Arg Thr Ala

355 360 365

Ser Leu Pro Glu Ala Gly Glu Lys Leu Phe Pro Tyr Leu Asp Pro Phe

370 375 380

Asp Ser Ala Ser Gln Leu Met Glu Pro Gly Arg Gln Ser Met Asp Leu

385 390 395 400

Val Glu Leu Val Ser Leu Phe Pro Thr Leu Ala Gly Leu Ala Gly Leu

405 410 415

Gln Val Pro Pro Arg Cys Pro Val Pro Ser Phe His Val Glu Leu Cys

420 425 430

Arg Glu Gly Lys Asn Leu Leu Lys His Phe Arg Phe Arg Asp Leu Glu

435 440 445

Glu Asp Pro Tyr Leu Pro Gly Asn Pro Arg Glu Leu Ile Ala Tyr Ser

450 455 460

Gln Tyr Pro Arg Pro Ser Asp Ile Pro Gln Trp Asn Ser Asp Lys Pro

465 470 475 480

Ser Leu Lys Asp Ile Lys Ile Met Gly Tyr Ser Ile Arg Thr Ile Asp

485 490 495

Tyr Arg Tyr Thr Val Trp Val Gly Phe Asn Pro Asp Glu Phe Leu Ala

500 505 510

Asn Phe Ser Asp Ile His Ala Gly Glu Leu Tyr Phe Val Asp Ser Asp

515 520 525

Pro Leu Gln Asp His Asn Met Tyr Asn Asp Ser Gln Gly Gly Asp Leu

530 535 540

Phe Gln Leu Leu Met Pro

545 550

<210> 2

<211> 1653

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 2

atgccgccac cccggaccgg ccgaggcctt ctctggctgg gtctggttct gagctccgtc 60

tgcgtcgccc tcggatccga aacgcaggcc aactcgacca cagatgctct gaacgttctt 120

ctcatcatcg tggatgacct gcgcccctcc ctgggctgtt atggggataa gctggtgagg 180

tccccaaata ttgaccaact ggcatcccac agcctcctct tccagaatgc ctttgcgcag 240

caagcagtgt gcgccccgag ccgcgtttct ttcctcactg gcaggagacc tgacaccacc 300

cgcctgtacg acttcaactc ctactggagg gtgcacgctg gaaacttctc caccatcccc 360

cagtacttca aggagaatgg ctatgtgacc atgtcggtgg gaaaagtctt tcaccctggg 420

atatcttcta accataccga tgattctccg tatagctggt cttttccacc ttatcatcct 480

tcctctgaga agtatgaaaa cactaagaca tgtcgagggc cagatggaga actccatgcc 540

aacctgcttt gccctgtgga tgtgctggat gttcccgagg gcaccttgcc tgacaaacag 600

agcactgagc aagccataca gttgttggaa aagatgaaaa cgtcagccag tcctttcttc 660

ctggccgttg ggtatcataa gccacacatc cccttcagat accccaagga atttcagaag 720

ttgtatccct tggagaacat caccctggcc cccgatcccg aggtccctga tggcctaccc 780

cctgtggcct acaacccctg gatggacatc aggcaacggg aagacgtcca agccttaaac 840

atcagtgtgc cgtatggtcc aattcctgtg gactttcagc ggaaaatccg ccagagctac 900

tttgcctctg tgtcatattt ggatacacag gtcggccgcc tcttgagtgc tttggacgat 960

cttcagctgg ccaacagcac catcattgca tttacctcgg atcatgggtg ggctctaggt 1020

gaacatggag aatgggccaa atacagcaat tttgatgttg ctacccatgt tcccctgata 1080

ttctatgttc ctggaaggac ggcttcactt ccggaggcag gcgagaagct tttcccttac 1140

ctcgaccctt ttgattccgc ctcacagttg atggagccag gcaggcaatc catggacctt 1200

gtggaacttg tgtctctttt tcccacgctg gctggacttg caggactgca ggttccacct 1260

cgctgccccg ttccttcatt tcacgttgag ctgtgcagag aaggcaagaa ccttctgaag 1320

cattttcgat tccgtgactt ggaagaggat ccgtacctcc ctggtaatcc ccgtgaactg 1380

attgcctata gccagtatcc ccggccttca gacatccctc agtggaattc tgacaagccg 1440

agtttaaaag atataaagat catgggctat tccatacgca ccatagacta taggtatact 1500

gtgtgggttg gcttcaatcc tgatgaattt ctagctaact tttctgacat ccatgcaggg 1560

gaactgtatt ttgtggattc tgacccattg caggatcaca atatgtataa tgattcccaa 1620

ggtggagatc ttttccagtt gttgatgcct tga 1653

<210> 3

<211> 7900

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> pAAV-CAG-hIDS

<400> 3

aaatacgcgt atgccgccac cccggaccgg ccgaggcctt ctctggctgg gtctggttct 60

gagctccgtc tgcgtcgccc tcggatccga aacgcaggcc aactcgacca cagatgctct 120

gaacgttctt ctcatcatcg tggatgacct gcgcccctcc ctgggctgtt atggggataa 180

gctggtgagg tccccaaata ttgaccaact ggcatcccac agcctcctct tccagaatgc 240

ctttgcgcag caagcagtgt gcgccccgag ccgcgtttct ttcctcactg gcaggagacc 300

tgacaccacc cgcctgtacg acttcaactc ctactggagg gtgcacgctg gaaacttctc 360

caccatcccc cagtacttca aggagaatgg ctatgtgacc atgtcggtgg gaaaagtctt 420

tcaccctggg atatcttcta accataccga tgattctccg tatagctggt cttttccacc 480

ttatcatcct tcctctgaga agtatgaaaa cactaagaca tgtcgagggc cagatggaga 540

actccatgcc aacctgcttt gccctgtgga tgtgctggat gttcccgagg gcaccttgcc 600

tgacaaacag agcactgagc aagccataca gttgttggaa aagatgaaaa cgtcagccag 660

tcctttcttc ctggccgttg ggtatcataa gccacacatc cccttcagat accccaagga 720

atttcagaag ttgtatccct tggagaacat caccctggcc cccgatcccg aggtccctga 780

tggcctaccc cctgtggcct acaacccctg gatggacatc aggcaacggg aagacgtcca 840

agccttaaac atcagtgtgc cgtatggtcc aattcctgtg gactttcagc ggaaaatccg 900

ccagagctac tttgcctctg tgtcatattt ggatacacag gtcggccgcc tcttgagtgc 960

tttggacgat cttcagctgg ccaacagcac catcattgca tttacctcgg atcatgggtg 1020

ggctctaggt gaacatggag aatgggccaa atacagcaat tttgatgttg ctacccatgt 1080

tcccctgata ttctatgttc ctggaaggac ggcttcactt ccggaggcag gcgagaagct 1140

tttcccttac ctcgaccctt ttgattccgc ctcacagttg atggagccag gcaggcaatc 1200

catggacctt gtggaacttg tgtctctttt tcccacgctg gctggacttg caggactgca 1260

ggttccacct cgctgccccg ttccttcatt tcacgttgag ctgtgcagag aaggcaagaa 1320

ccttctgaag cattttcgat tccgtgactt ggaagaggat ccgtacctcc ctggtaatcc 1380

ccgtgaactg attgcctata gccagtatcc ccggccttca gacatccctc agtggaattc 1440

tgacaagccg agtttaaaag atataaagat catgggctat tccatacgca ccatagacta 1500

taggtatact gtgtgggttg gcttcaatcc tgatgaattt ctagctaact tttctgacat 1560

ccatgcaggg gaactgtatt ttgtggattc tgacccattg caggatcaca atatgtataa 1620

tgattcccaa ggtggagatc ttttccagtt gttgatgcct tgagaattca tttaattcga 1680

gctcggtacc cgggaatcaa ttcactcctc aggtgcaggc tgcctatcag aaggtggtgg 1740

ctggtgtggc caatgccctg gctcacaaat accactgaga tctttttccc tctgccaaaa 1800

attatgggga catcatgaag ccccttgagc atctgacttc tggctaataa aggaaattta 1860

ttttcattgc aatagtgtgt tggaattttt tgtgtctctc actcggaagg acatatggga 1920

gggcaaatca tttaaaacat cagaatgagt atttggttta gagtttggca acatatgccc 1980

atatgctggc tgccatgaac aaaggttggc tataaagagg tcatcagtat atgaaacagc 2040

cccctgctgt ccattcctta ttccatagaa aagccttgac ttgaggttag atttttttta 2100

tattttgttt tgtgttattt ttttctttaa catccctaaa attttcctta catgttttac 2160

tagccagatt tttcctcctc tcctgactac tcccagtcat agctgtccct cttctcttat 2220

ggagatccct cgacctgcag cccaagctgt agataagtag catggcgggt taatcattaa 2280

ctacaaggaa cccctagtga tggagttggc cactccctct ctgcgcgctc gctcgctcac 2340

tgaggccgcc cgggctttgc ccgggcggcc tcagtgagcg agcgagcgcg cagctgcatt 2400

aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat tgggcgctct tccgcttcct 2460

cgctcactga ctcgctgcgc tcggtcgttc ggctgcggcg agcggtatca gctcactcaa 2520

aggcggtaat acggttatcc acagaatcag gggataacgc aggaaagaac atgtgagcaa 2580

aaggccagca aaaggccagg aaccgtaaaa aggccgcgtt gctggcgttt ttccataggc 2640

tccgcccccc tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga 2700

caggactata aagataccag gcgtttcccc ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc 2760

cgaccctgcc gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt 2820

ctcatagctc acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggct 2880

gtgtgcacga accccccgtt cagcccgacc gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg 2940

agtccaaccc ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc agccactggt aacaggatta 3000

gcagagcgag gtatgtaggc ggtgctacag agttcttgaa gtggtggcct aactacggct 3060

acactagaag aacagtattt ggtatctgcg ctctgctgaa gccagttacc ttcggaaaaa 3120

gagttggtag ctcttgatcc ggcaaacaaa ccaccgctgg tagcggtggt ttttttgttt 3180

gcaagcagca gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga agatcctttg atcttttcta 3240

cggggtctga cgctcagtgg aacgaaaact cacgttaagg gattttggtc atgagattat 3300

caaaaaggat cttcacctag atccttttaa attaaaaatg aagttttaaa tcaatctaaa 3360

gtatatatga gtaaacttgg tctgacagtt accaatgctt aatcagtgag gcacctatct 3420

cagcgatctg tctatttcgt tcatccatag ttgcctgact ccccgtcgtg tagataacta 3480

cgatacggga gggcttacca tctggcccca gtgctgcaat gataccgcga gacccacgct 3540

caccggctcc agatttatca gcaataaacc agccagccgg aagggccgag cgcagaagtg 3600

gtcctgcaac tttatccgcc tccatccagt ctattaattg ttgccgggaa gctagagtaa 3660

gtagttcgcc agttaatagt ttgcgcaacg ttgttgccat tgctacaggc atcgtggtgt 3720

cacgctcgtc gtttggtatg gcttcattca gctccggttc ccaacgatca aggcgagtta 3780

catgatcccc catgttgtgc aaaaaagcgg ttagctcctt cggtcctccg atcgttgtca 3840

gaagtaagtt ggccgcagtg ttatcactca tggttatggc agcactgcat aattctctta 3900

ctgtcatgcc atccgtaaga tgcttttctg tgactggtga gtactcaacc aagtcattct 3960

gagaatagtg tatgcggcga ccgagttgct cttgcccggc gtcaatacgg gataataccg 4020

cgccacatag cagaacttta aaagtgctca tcattggaaa acgttcttcg gggcgaaaac 4080

tctcaaggat cttaccgctg ttgagatcca gttcgatgta acccactcgt gcacccaact 4140

gatcttcagc atcttttact ttcaccagcg tttctgggtg agcaaaaaca ggaaggcaaa 4200

atgccgcaaa aaagggaata agggcgacac ggaaatgttg aatactcata ctcttccttt 4260

ttcaatatta ttgaagcatt tatcagggtt attgtctcat gagcggatac atatttgaat 4320

gtatttagaa aaataaacaa ataggggttc cgcgcacatt tccccgaaaa gtgccacctg 4380

acgtctaaga aaccattatt atcatgacat taacctataa aaataggcgt atcacgaggc 4440

cctttcgtct cgcgcgtttc ggtgatgacg gtgaaaacct ctgacacatg cagctcccgg 4500

agacggtcac agcttgtctg taagcggatg ccgggagcag acaagcccgt cagggcgcgt 4560

cagcgggtgt tggcgggtgt cggggctggc ttaactatgc ggcatcagag cagattgtac 4620

tgagagtgca ccatatgcgg tgtgaaatac cgcacagatg cgtaaggaga aaataccgca 4680

tcaggcgatt ccaacatcca ataaatcata caggcaaggc aaagaattag caaaattaag 4740

caataaagcc tcagagcata aagctaaatc ggttgtacca aaaacattat gaccctgtaa 4800

tacttttgcg ggagaagcct ttatttcaac gcaaggataa aaatttttag aaccctcata 4860

tattttaaat gcaatgcctg agtaatgtgt aggtaaagat tcaaacgggt gagaaaggcc 4920

ggagacagtc aaatcaccat caatatgata ttcaaccgtt ctagctgata aattcatgcc 4980

ggagagggta gctatttttg agaggtctct acaaaggcta tcaggtcatt gcctgagagt 5040

ctggagcaaa caagagaatc gatgaacggt aatcgtaaaa ctagcatgtc aatcatatgt 5100

accccggttg ataatcagaa aagccccaaa aacaggaaga ttgtataagc aaatatttaa 5160

attgtaagcg ttaatatttt gttaaaattc gcgttaaatt tttgttaaat cagctcattt 5220

tttaaccaat aggccgaaat cggcaaaatc ccttataaat caaaagaata gaccgagata 5280

gggttgagtg ttgttccagt ttggaacaag agtccactat taaagaacgt ggactccaac 5340

gtcaaagggc gaaaaaccgt ctatcagggc gatggcccac tacgtgaacc atcaccctaa 5400

tcaagttttt tggggtcgag gtgccgtaaa gcactaaatc ggaaccctaa agggagcccc 5460

cgatttagag cttgacgggg aaagccggcg aacgtggcga gaaaggaagg gaagaaagcg 5520

aaaggagcgg gcgctagggc gctggcaagt gtagcggtca cgctgcgcgt aaccaccaca 5580

cccgccgcgc ttaatgcgcc gctacagggc gcgtactatg gttgctttga cgagcacgta 5640

taacgtgctt tcctcgttag aatcagagcg ggagctaaac aggaggccga ttaaagggat 5700

tttagacagg aacggtacgc cagaatcctg agaagtgttt ttataatcag tgaggccacc 5760

gagtaaaaga gtctgtccat cacgcaaatt aaccgttgtc gcaatacttc tttgattagt 5820

aataacatca cttgcctgag tagaagaact caaactatcg gccttgctgg taatatccag 5880

aacaatatta ccgccagcca ttgcaacgga atcgccattc gccattcagg ctgcgcaact 5940

gttgggaagg gcgatcggtg cgggcctctt cgctattacg ccagctgcgc gctcgctcgc 6000

tcactgaggc cgcccgggca aagcccgggc gtcgggcgac ctttggtcgc ccggcctcag 6060

tgagcgagcg agcgcgcaga gagggagtgg ccaactccat cactaggggt tccttgtagt 6120

taatgattaa cccgccatgc tacttatcta ctcgacattg attattgact agttattaat 6180

agtaatcaat tacggggtca ttagttcata gcccatatat ggagttccgc gttacataac 6240

ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa 6300

tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt 6360

atttacggta aactgcccac ttggcagtac atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc 6420

ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg cctggcatta tgcccagtac atgaccttat 6480

gggactttcc tacttggcag tacatctacg tattagtcat cgctattacc atggtcgagg 6540

tgagccccac gttctgcttc actctcccca tctccccccc ctccccaccc ccaattttgt 6600

atttatttat tttttaatta ttttgtgcag cgatgggggc gggggggggg ggggggcgcg 6660

cgccaggcgg ggcggggcgg ggcgaggggc ggggcggggc gaggcggaga ggtgcggcgg 6720

cagccaatca gagcggcgcg ctccgaaagt ttccttttat ggcgaggcgg cggcggcggc 6780

ggccctataa aaagcgaagc gcgcggcggg cgggagtcgc tgcgttgcct tcgccccgtg 6840

ccccgctccg ccgccgcctc gcgccgcccg ccccggctct gactgaccgc gttactccca 6900

caggtgagcg ggcgggacgg cccttctcct ccgggctgta attagcgctt ggtttaatga 6960

cggcttgttt cttttctgtg gctgcgtgaa agccttgagg ggctccggga gggccctttg 7020

tgcgggggga gcggctcggg gggtgcgtgc gtgtgtgtgt gcgtggggag cgccgcgtgc 7080

ggctccgcgc tgcccggcgg ctgtgagcgc tgcgggcgcg gcgcggggct ttgtgcgctc 7140

cgcagtgtgc gcgaggggag cgcggccggg ggcggtgccc cgcggtgcgg ggggggctgc 7200

gaggggaaca aaggctgcgt gcggggtgtg tgcgtggggg ggtgagcagg gggtgtgggc 7260

gcgtcggtcg ggctgcaacc ccccctgcac ccccctcccc gagttgctga gcacggcccg 7320

gcttcgggtg cggggctccg tacggggcgt ggcgcggggc tcgccgtgcc gggcgggggg 7380

tggcggcagg tgggggtgcc gggcggggcg gggccgcctc gggccgggga gggctcgggg 7440

gaggggcgcg gcggcccccg gagcgccggc ggctgtcgag gcgcggcgag ccgcagccat 7500

tgccttttat ggtaatcgtg cgagagggcg cagggacttc ctttgtccca aatctgtgcg 7560

gagccgaaat ctgggaggcg ccgccgcacc ccctctagcg ggcgcggggc gaagcggtgc 7620

ggcgccggca ggaaggaaat gggcggggag ggccttcgtg cgtcgccgcg ccgccgtccc 7680

cttctccctc tccagcctcg gggctgtccg cggggggacg gctgccttcg ggggggacgg 7740

ggcagggcgg ggttcggctt ctggcgtgtg accggcggct ctagagcctc tgctaaccat 7800

gttcatgcct tcttcttttt cctacagctc ctgggcaacg tgctggttat tgtgctgtct 7860

catcattttg gcaaagaatt gattaattcg agcgaacgcg 7900

<210> 4

<211> 4319

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> AAV9-CAG-hIDS

<400> 4

attacgccag ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg 60

ggcgaccttt ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa 120

ctccatcact aggggttcct tgtagttaat gattaacccg ccatgctact tatctactcg 180

acattgatta ttgactagtt attaatagta atcaattacg gggtcattag ttcatagccc 240

atatatggag ttccgcgtta cataacttac ggtaaatggc ccgcctggct gaccgcccaa 300

cgacccccgc ccattgacgt caataatgac gtatgttccc atagtaacgc caatagggac 360

tttccattga cgtcaatggg tggagtattt acggtaaact gcccacttgg cagtacatca 420

agtgtatcat atgccaagta cgccccctat tgacgtcaat gacggtaaat ggcccgcctg 480

gcattatgcc cagtacatga ccttatggga ctttcctact tggcagtaca tctacgtatt 540

agtcatcgct attaccatgg tcgaggtgag ccccacgttc tgcttcactc tccccatctc 600

ccccccctcc ccacccccaa ttttgtattt atttattttt taattatttt gtgcagcgat 660

gggggcgggg gggggggggg ggcgcgcgcc aggcggggcg gggcggggcg aggggcgggg 720

cggggcgagg cggagaggtg cggcggcagc caatcagagc ggcgcgctcc gaaagtttcc 780

ttttatggcg aggcggcggc ggcggcggcc ctataaaaag cgaagcgcgc ggcgggcggg 840

agtcgctgcg ttgccttcgc cccgtgcccc gctccgccgc cgcctcgcgc cgcccgcccc 900

ggctctgact gaccgcgtta ctcccacagg tgagcgggcg ggacggccct tctcctccgg 960

gctgtaatta gcgcttggtt taatgacggc ttgtttcttt tctgtggctg cgtgaaagcc 1020

ttgaggggct ccgggagggc cctttgtgcg gggggagcgg ctcggggggt gcgtgcgtgt 1080

gtgtgtgcgt ggggagcgcc gcgtgcggct ccgcgctgcc cggcggctgt gagcgctgcg 1140

ggcgcggcgc ggggctttgt gcgctccgca gtgtgcgcga ggggagcgcg gccgggggcg 1200

gtgccccgcg gtgcgggggg ggctgcgagg ggaacaaagg ctgcgtgcgg ggtgtgtgcg 1260

tgggggggtg agcagggggt gtgggcgcgt cggtcgggct gcaacccccc ctgcaccccc 1320

ctccccgagt tgctgagcac ggcccggctt cgggtgcggg gctccgtacg gggcgtggcg 1380

cggggctcgc cgtgccgggc ggggggtggc ggcaggtggg ggtgccgggc ggggcggggc 1440

cgcctcgggc cggggagggc tcgggggagg ggcgcggcgg cccccggagc gccggcggct 1500

gtcgaggcgc ggcgagccgc agccattgcc ttttatggta atcgtgcgag agggcgcagg 1560

gacttccttt gtcccaaatc tgtgcggagc cgaaatctgg gaggcgccgc cgcaccccct 1620

ctagcgggcg cggggcgaag cggtgcggcg ccggcaggaa ggaaatgggc ggggagggcc 1680

ttcgtgcgtc gccgcgccgc cgtccccttc tccctctcca gcctcggggc tgtccgcggg 1740

gggacggctg ccttcggggg ggacggggca gggcggggtt cggcttctgg cgtgtgaccg 1800

gcggctctag agcctctgct aaccatgttc atgccttctt ctttttccta cagctcctgg 1860

gcaacgtgct ggttattgtg ctgtctcatc attttggcaa agaattgatt aattcgagcg 1920

aacgcgaaat acgcgtatgc cgccaccccg gaccggccga ggccttctct ggctgggtct 1980

ggttctgagc tccgtctgcg tcgccctcgg atccgaaacg caggccaact cgaccacaga 2040

tgctctgaac gttcttctca tcatcgtgga tgacctgcgc ccctccctgg gctgttatgg 2100

ggataagctg gtgaggtccc caaatattga ccaactggca tcccacagcc tcctcttcca 2160

gaatgccttt gcgcagcaag cagtgtgcgc cccgagccgc gtttctttcc tcactggcag 2220

gagacctgac accacccgcc tgtacgactt caactcctac tggagggtgc acgctggaaa 2280

cttctccacc atcccccagt acttcaagga gaatggctat gtgaccatgt cggtgggaaa 2340

agtctttcac cctgggatat cttctaacca taccgatgat tctccgtata gctggtcttt 2400

tccaccttat catccttcct ctgagaagta tgaaaacact aagacatgtc gagggccaga 2460

tggagaactc catgccaacc tgctttgccc tgtggatgtg ctggatgttc ccgagggcac 2520

cttgcctgac aaacagagca ctgagcaagc catacagttg ttggaaaaga tgaaaacgtc 2580

agccagtcct ttcttcctgg ccgttgggta tcataagcca cacatcccct tcagataccc 2640

caaggaattt cagaagttgt atcccttgga gaacatcacc ctggcccccg atcccgaggt 2700

ccctgatggc ctaccccctg tggcctacaa cccctggatg gacatcaggc aacgggaaga 2760

cgtccaagcc ttaaacatca gtgtgccgta tggtccaatt cctgtggact ttcagcggaa 2820

aatccgccag agctactttg cctctgtgtc atatttggat acacaggtcg gccgcctctt 2880

gagtgctttg gacgatcttc agctggccaa cagcaccatc attgcattta cctcggatca 2940

tgggtgggct ctaggtgaac atggagaatg ggccaaatac agcaattttg atgttgctac 3000

ccatgttccc ctgatattct atgttcctgg aaggacggct tcacttccgg aggcaggcga 3060

gaagcttttc ccttacctcg acccttttga ttccgcctca cagttgatgg agccaggcag 3120

gcaatccatg gaccttgtgg aacttgtgtc tctttttccc acgctggctg gacttgcagg 3180

actgcaggtt ccacctcgct gccccgttcc ttcatttcac gttgagctgt gcagagaagg 3240

caagaacctt ctgaagcatt ttcgattccg tgacttggaa gaggatccgt acctccctgg 3300

taatccccgt gaactgattg cctatagcca gtatccccgg ccttcagaca tccctcagtg 3360

gaattctgac aagccgagtt taaaagatat aaagatcatg ggctattcca tacgcaccat 3420

agactatagg tatactgtgt gggttggctt caatcctgat gaatttctag ctaacttttc 3480

tgacatccat gcaggggaac tgtattttgt ggattctgac ccattgcagg atcacaatat 3540

gtataatgat tcccaaggtg gagatctttt ccagttgttg atgccttgag aattcattta 3600

attcgagctc ggtacccggg aatcaattca ctcctcaggt gcaggctgcc tatcagaagg 3660

tggtggctgg tgtggccaat gccctggctc acaaatacca ctgagatctt tttccctctg 3720

ccaaaaatta tggggacatc atgaagcccc ttgagcatct gacttctggc taataaagga 3780

aatttatttt cattgcaata gtgtgttgga attttttgtg tctctcactc ggaaggacat 3840

atgggagggc aaatcattta aaacatcaga atgagtattt ggtttagagt ttggcaacat 3900

atgcccatat gctggctgcc atgaacaaag gttggctata aagaggtcat cagtatatga 3960

aacagccccc tgctgtccat tccttattcc atagaaaagc cttgacttga ggttagattt 4020

tttttatatt ttgttttgtg ttattttttt ctttaacatc cctaaaattt tccttacatg 4080

ttttactagc cagatttttc ctcctctcct gactactccc agtcatagct gtccctcttc 4140

tcttatggag atccctcgac ctgcagccca agctgtagat aagtagcatg gcgggttaat 4200

cattaactac aaggaacccc tagtgatgga gttggccact ccctctctgc gcgctcgctc 4260

gctcactgag gccgcccggg ctttgcccgg gcggcctcag tgagcgagcg agcgcgcag 4319

<210> 5

<211> 1653

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ohIDS-version1

<400> 5

atgcccccac ctagaaccgg aagaggattg ctctggctcg gacttgtgct gtccagcgtg 60

tgtgtggccc tgggctcgga aacccaggcc aacagcacca ccgacgccct gaatgtgctg 120

ctgattatcg tggacgatct ccggccttcg ctgggctgct acggggataa gctggtccgc 180

tccccgaata tcgaccaact ggcttcacat agcctgcttt tccaaaacgc attcgcccaa 240

caagccgtgt gcgccccgag ccgcgtgtct ttcctcaccg gccggcgccc tgatactacc 300

cggctctacg acttcaacag ctactggaga gtgcacgcag gaaacttctc caccattcct 360

cagtacttta aggagaacgg ttacgtcacc atgagcgtgg ggaaggtgtt ccaccctgga 420

atttcctcca accacaccga cgactcgcca tactcctggt cctttccccc ttaccaccca 480

tcatccgaga agtacgagaa caccaagacg tgcaggggcc cagacgggga actgcacgcg 540

aacctcctct gcccggtcga tgtgctggat gtgcccgaag gcaccctccc tgacaaacag 600

agcaccgaac aggccatcca gctcctcgag aagatgaaaa cttcagcctc cccgttcttt 660

ctggccgtgg gataccacaa gccgcatatc cccttccggt acccaaagga gttccagaag 720

ctgtacccgc tggagaacat taccctggct cctgatcccg aagtgccgga cggcctgccg 780

cccgtggcat acaacccttg gatggacatc cgccagaggg aggatgtgca agccctgaac 840

atctccgtgc catacggtcc gatcccggtc gacttccagc ggaagattag gcagtcatat 900

ttcgcgtccg tgtcctactt ggacactcag gtcggacgcc tcctctccgc tctcgacgat 960

ctgcagctgg ccaactcgac cattatcgcg ttcacctcgg accatggttg ggctctgggc 1020

gaacacggag aatgggccaa gtacagcaat ttcgatgtcg cgactcacgt gcccctgatc 1080

ttctacgtgc ccggacgcac agccagcttg cctgaagcgg gggaaaagct gttcccttac 1140

ctggatccct tcgactccgc ctctcaactt atggagccag gcagacagtc gatggacctg 1200

gtggaactcg tgtcactgtt ccctaccctc gccggtctgg ccggacttca ggtcccgcct 1260

cggtgcccgg tgccgtcctt ccacgtggag ctgtgtcgcg agggaaagaa cctcctgaaa 1320

cacttccggt tccgcgacct ggaggaagat ccctacttgc cgggcaaccc gagagaactt 1380

atcgcatact cccagtaccc tcgcccctcc gacatcccgc agtggaactc cgacaagccg 1440

agcctgaagg acattaagat catggggtac tccatccgga ctattgacta tcggtacact 1500

gtgtgggtcg ggttcaaccc agatgagttt ctggccaact tctccgatat ccatgccgga 1560

gagctgtact tcgtggactc ggacccgctg caggaccaca acatgtacaa cgactcacag 1620

ggcggcgacc tgttccagtt gctgatgccc tga 1653

<210> 6

<211> 7888

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> pAAV-CAG-ohIDS-version1

<400> 6

cgcgtgccac catgccccca cctagaaccg gaagaggatt gctctggctc ggacttgtgc 60

tgtccagcgt gtgtgtggcc ctgggctcgg aaacccaggc caacagcacc accgacgccc 120

tgaatgtgct gctgattatc gtggacgatc tccggccttc gctgggctgc tacggggata 180

agctggtccg ctccccgaat atcgaccaac tggcttcaca tagcctgctt ttccaaaacg 240

cattcgccca acaagccgtg tgcgccccga gccgcgtgtc tttcctcacc ggccggcgcc 300

ctgatactac ccggctctac gacttcaaca gctactggag agtgcacgca ggaaacttct 360

ccaccattcc tcagtacttt aaggagaacg gttacgtcac catgagcgtg gggaaggtgt 420

tccaccctgg aatttcctcc aaccacaccg acgactcgcc atactcctgg tcctttcccc 480

cttaccaccc atcatccgag aagtacgaga acaccaagac gtgcaggggc ccagacgggg 540

aactgcacgc gaacctcctc tgcccggtcg atgtgctgga tgtgcccgaa ggcaccctcc 600

ctgacaaaca gagcaccgaa caggccatcc agctcctcga gaagatgaaa acttcagcct 660

ccccgttctt tctggccgtg ggataccaca agccgcatat ccccttccgg tacccaaagg 720

agttccagaa gctgtacccg ctggagaaca ttaccctggc tcctgatccc gaagtgccgg 780

acggcctgcc gcccgtggca tacaaccctt ggatggacat ccgccagagg gaggatgtgc 840

aagccctgaa catctccgtg ccatacggtc cgatcccggt cgacttccag cggaagatta 900

ggcagtcata tttcgcgtcc gtgtcctact tggacactca ggtcggacgc ctcctctccg 960

ctctcgacga tctgcagctg gccaactcga ccattatcgc gttcacctcg gaccatggtt 1020

gggctctggg cgaacacgga gaatgggcca agtacagcaa tttcgatgtc gcgactcacg 1080

tgcccctgat cttctacgtg cccggacgca cagccagctt gcctgaagcg ggggaaaagc 1140

tgttccctta cctggatccc ttcgactccg cctctcaact tatggagcca ggcagacagt 1200

cgatggacct ggtggaactc gtgtcactgt tccctaccct cgccggtctg gccggacttc 1260

aggtcccgcc tcggtgcccg gtgccgtcct tccacgtgga gctgtgtcgc gagggaaaga 1320

acctcctgaa acacttccgg ttccgcgacc tggaggaaga tccctacttg ccgggcaacc 1380

cgagagaact tatcgcatac tcccagtacc ctcgcccctc cgacatcccg cagtggaact 1440

ccgacaagcc gagcctgaag gacattaaga tcatggggta ctccatccgg actattgact 1500

atcggtacac tgtgtgggtc gggttcaacc cagatgagtt tctggccaac ttctccgata 1560

tccatgccgg agagctgtac ttcgtggact cggacccgct gcaggaccac aacatgtaca 1620

acgactcaca gggcggcgac ctgttccagt tgctgatgcc ctgagaattc gagctcggta 1680

cccgggaatc aattcactcc tcaggtgcag gctgcctatc agaaggtggt ggctggtgtg 1740

gccaatgccc tggctcacaa ataccactga gatctttttc cctctgccaa aaattatggg 1800

gacatcatga agccccttga gcatctgact tctggctaat aaaggaaatt tattttcatt 1860

gcaatagtgt gttggaattt tttgtgtctc tcactcggaa ggacatatgg gagggcaaat 1920

catttaaaac atcagaatga gtatttggtt tagagtttgg caacatatgc ccatatgctg 1980

gctgccatga acaaaggttg gctataaaga ggtcatcagt atatgaaaca gccccctgct 2040

gtccattcct tattccatag aaaagccttg acttgaggtt agattttttt tatattttgt 2100

tttgtgttat ttttttcttt aacatcccta aaattttcct tacatgtttt actagccaga 2160

tttttcctcc tctcctgact actcccagtc atagctgtcc ctcttctctt atggagatcc 2220

ctcgacctgc agcccaagct gtagataagt agcatggcgg gttaatcatt aactacaagg 2280

aacccctagt gatggagttg gccactccct ctctgcgcgc tcgctcgctc actgaggccg 2340

cccgggcttt gcccgggcgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagctgca ttaatgaatc 2400

ggccaacgcg cggggagagg cggtttgcgt attgggcgct cttccgcttc ctcgctcact 2460

gactcgctgc gctcggtcgt tcggctgcgg cgagcggtat cagctcactc aaaggcggta 2520

atacggttat ccacagaatc aggggataac gcaggaaaga acatgtgagc aaaaggccag 2580

caaaaggcca ggaaccgtaa aaaggccgcg ttgctggcgt ttttccatag gctccgcccc 2640

cctgacgagc atcacaaaaa tcgacgctca agtcagaggt ggcgaaaccc gacaggacta 2700

taaagatacc aggcgtttcc ccctggaagc tccctcgtgc gctctcctgt tccgaccctg 2760

ccgcttaccg gatacctgtc cgcctttctc ccttcgggaa gcgtggcgct ttctcatagc 2820

tcacgctgta ggtatctcag ttcggtgtag gtcgttcgct ccaagctggg ctgtgtgcac 2880

gaaccccccg ttcagcccga ccgctgcgcc ttatccggta actatcgtct tgagtccaac 2940

ccggtaagac acgacttatc gccactggca gcagccactg gtaacaggat tagcagagcg 3000

aggtatgtag gcggtgctac agagttcttg aagtggtggc ctaactacgg ctacactaga 3060

agaacagtat ttggtatctg cgctctgctg aagccagtta ccttcggaaa aagagttggt 3120

agctcttgat ccggcaaaca aaccaccgct ggtagcggtg gtttttttgt ttgcaagcag 3180

cagattacgc gcagaaaaaa aggatctcaa gaagatcctt tgatcttttc tacggggtct 3240

gacgctcagt ggaacgaaaa ctcacgttaa gggattttgg tcatgagatt atcaaaaagg 3300

atcttcacct agatcctttt aaattaaaaa tgaagtttta aatcaatcta aagtatatat 3360

gagtaaactt ggtctgacag ttaccaatgc ttaatcagtg aggcacctat ctcagcgatc 3420

tgtctatttc gttcatccat agttgcctga ctccccgtcg tgtagataac tacgatacgg 3480

gagggcttac catctggccc cagtgctgca atgataccgc gagacccacg ctcaccggct 3540

ccagatttat cagcaataaa ccagccagcc ggaagggccg agcgcagaag tggtcctgca 3600

actttatccg cctccatcca gtctattaat tgttgccggg aagctagagt aagtagttcg 3660

ccagttaata gtttgcgcaa cgttgttgcc attgctacag gcatcgtggt gtcacgctcg 3720

tcgtttggta tggcttcatt cagctccggt tcccaacgat caaggcgagt tacatgatcc 3780

cccatgttgt gcaaaaaagc ggttagctcc ttcggtcctc cgatcgttgt cagaagtaag 3840

ttggccgcag tgttatcact catggttatg gcagcactgc ataattctct tactgtcatg 3900

ccatccgtaa gatgcttttc tgtgactggt gagtactcaa ccaagtcatt ctgagaatag 3960

tgtatgcggc gaccgagttg ctcttgcccg gcgtcaatac gggataatac cgcgccacat 4020

agcagaactt taaaagtgct catcattgga aaacgttctt cggggcgaaa actctcaagg 4080

atcttaccgc tgttgagatc cagttcgatg taacccactc gtgcacccaa ctgatcttca 4140

gcatctttta ctttcaccag cgtttctggg tgagcaaaaa caggaaggca aaatgccgca 4200

aaaaagggaa taagggcgac acggaaatgt tgaatactca tactcttcct ttttcaatat 4260

tattgaagca tttatcaggg ttattgtctc atgagcggat acatatttga atgtatttag 4320

aaaaataaac aaataggggt tccgcgcaca tttccccgaa aagtgccacc tgacgtctaa 4380

gaaaccatta ttatcatgac attaacctat aaaaataggc gtatcacgag gccctttcgt 4440

ctcgcgcgtt tcggtgatga cggtgaaaac ctctgacaca tgcagctccc ggagacggtc 4500

acagcttgtc tgtaagcgga tgccgggagc agacaagccc gtcagggcgc gtcagcgggt 4560

gttggcgggt gtcggggctg gcttaactat gcggcatcag agcagattgt actgagagtg 4620

caccatatgc ggtgtgaaat accgcacaga tgcgtaagga gaaaataccg catcaggcga 4680

ttccaacatc caataaatca tacaggcaag gcaaagaatt agcaaaatta agcaataaag 4740

cctcagagca taaagctaaa tcggttgtac caaaaacatt atgaccctgt aatacttttg 4800

cgggagaagc ctttatttca acgcaaggat aaaaattttt agaaccctca tatattttaa 4860

atgcaatgcc tgagtaatgt gtaggtaaag attcaaacgg gtgagaaagg ccggagacag 4920

tcaaatcacc atcaatatga tattcaaccg ttctagctga taaattcatg ccggagaggg 4980

tagctatttt tgagaggtct ctacaaaggc tatcaggtca ttgcctgaga gtctggagca 5040

aacaagagaa tcgatgaacg gtaatcgtaa aactagcatg tcaatcatat gtaccccggt 5100

tgataatcag aaaagcccca aaaacaggaa gattgtataa gcaaatattt aaattgtaag 5160

cgttaatatt ttgttaaaat tcgcgttaaa tttttgttaa atcagctcat tttttaacca 5220

ataggccgaa atcggcaaaa tcccttataa atcaaaagaa tagaccgaga tagggttgag 5280

tgttgttcca gtttggaaca agagtccact attaaagaac gtggactcca acgtcaaagg 5340

gcgaaaaacc gtctatcagg gcgatggccc actacgtgaa ccatcaccct aatcaagttt 5400

tttggggtcg aggtgccgta aagcactaaa tcggaaccct aaagggagcc cccgatttag 5460

agcttgacgg ggaaagccgg cgaacgtggc gagaaaggaa gggaagaaag cgaaaggagc 5520

gggcgctagg gcgctggcaa gtgtagcggt cacgctgcgc gtaaccacca cacccgccgc 5580

gcttaatgcg ccgctacagg gcgcgtacta tggttgcttt gacgagcacg tataacgtgc 5640

tttcctcgtt agaatcagag cgggagctaa acaggaggcc gattaaaggg attttagaca 5700

ggaacggtac gccagaatcc tgagaagtgt ttttataatc agtgaggcca ccgagtaaaa 5760

gagtctgtcc atcacgcaaa ttaaccgttg tcgcaatact tctttgatta gtaataacat 5820

cacttgcctg agtagaagaa ctcaaactat cggccttgct ggtaatatcc agaacaatat 5880

taccgccagc cattgcaacg gaatcgccat tcgccattca ggctgcgcaa ctgttgggaa 5940

gggcgatcgg tgcgggcctc ttcgctatta cgccagctgc gcgctcgctc gctcactgag 6000

gccgcccggg caaagcccgg gcgtcgggcg acctttggtc gcccggcctc agtgagcgag 6060

cgagcgcgca gagagggagt ggccaactcc atcactaggg gttccttgta gttaatgatt 6120

aacccgccat gctacttatc tactcgacat tgattattga ctagttatta atagtaatca 6180

attacggggt cattagttca tagcccatat atggagttcc gcgttacata acttacggta 6240

aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat aatgacgtat 6300

gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc aatgggtgga gtatttacgg 6360

taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc caagtacgcc ccctattgac 6420

gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt atgggacttt 6480

cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta ccatggtcga ggtgagcccc 6540

acgttctgct tcactctccc catctccccc ccctccccac ccccaatttt gtatttattt 6600

attttttaat tattttgtgc agcgatgggg gcgggggggg ggggggggcg cgcgccaggc 6660

ggggcggggc ggggcgaggg gcggggcggg gcgaggcgga gaggtgcggc ggcagccaat 6720

cagagcggcg cgctccgaaa gtttcctttt atggcgaggc ggcggcggcg gcggccctat 6780

aaaaagcgaa gcgcgcggcg ggcgggagtc gctgcgttgc cttcgccccg tgccccgctc 6840

cgccgccgcc tcgcgccgcc cgccccggct ctgactgacc gcgttactcc cacaggtgag 6900

cgggcgggac ggcccttctc ctccgggctg taattagcgc ttggtttaat gacggcttgt 6960

ttcttttctg tggctgcgtg aaagccttga ggggctccgg gagggccctt tgtgcggggg 7020

gagcggctcg gggggtgcgt gcgtgtgtgt gtgcgtgggg agcgccgcgt gcggctccgc 7080

gctgcccggc ggctgtgagc gctgcgggcg cggcgcgggg ctttgtgcgc tccgcagtgt 7140

gcgcgagggg agcgcggccg ggggcggtgc cccgcggtgc ggggggggct gcgaggggaa 7200

caaaggctgc gtgcggggtg tgtgcgtggg ggggtgagca gggggtgtgg gcgcgtcggt 7260

cgggctgcaa ccccccctgc acccccctcc ccgagttgct gagcacggcc cggcttcggg 7320

tgcggggctc cgtacggggc gtggcgcggg gctcgccgtg ccgggcgggg ggtggcggca 7380

ggtgggggtg ccgggcgggg cggggccgcc tcgggccggg gagggctcgg gggaggggcg 7440

cggcggcccc cggagcgccg gcggctgtcg aggcgcggcg agccgcagcc attgcctttt 7500

atggtaatcg tgcgagaggg cgcagggact tcctttgtcc caaatctgtg cggagccgaa 7560

atctgggagg cgccgccgca ccccctctag cgggcgcggg gcgaagcggt gcggcgccgg 7620

caggaaggaa atgggcgggg agggccttcg tgcgtcgccg cgccgccgtc cccttctccc 7680

tctccagcct cggggctgtc cgcgggggga cggctgcctt cgggggggac ggggcagggc 7740

ggggttcggc ttctggcgtg tgaccggcgg ctctagagcc tctgctaacc atgttcatgc 7800

cttcttcttt ttcctacagc tcctgggcaa cgtgctggtt attgtgctgt ctcatcattt 7860

tggcaaagaa ttgattaatt cgagcgaa 7888

<210> 7

<211> 4307

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> AAV9-CAG-ohIDS-version1

<400> 7

attacgccag ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg 60

ggcgaccttt ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa 120

ctccatcact aggggttcct tgtagttaat gattaacccg ccatgctact tatctactcg 180

acattgatta ttgactagtt attaatagta atcaattacg gggtcattag ttcatagccc 240

atatatggag ttccgcgtta cataacttac ggtaaatggc ccgcctggct gaccgcccaa 300

cgacccccgc ccattgacgt caataatgac gtatgttccc atagtaacgc caatagggac 360

tttccattga cgtcaatggg tggagtattt acggtaaact gcccacttgg cagtacatca 420

agtgtatcat atgccaagta cgccccctat tgacgtcaat gacggtaaat ggcccgcctg 480

gcattatgcc cagtacatga ccttatggga ctttcctact tggcagtaca tctacgtatt 540

agtcatcgct attaccatgg tcgaggtgag ccccacgttc tgcttcactc tccccatctc 600

ccccccctcc ccacccccaa ttttgtattt atttattttt taattatttt gtgcagcgat 660

gggggcgggg gggggggggg ggcgcgcgcc aggcggggcg gggcggggcg aggggcgggg 720

cggggcgagg cggagaggtg cggcggcagc caatcagagc ggcgcgctcc gaaagtttcc 780

ttttatggcg aggcggcggc ggcggcggcc ctataaaaag cgaagcgcgc ggcgggcggg 840

agtcgctgcg ttgccttcgc cccgtgcccc gctccgccgc cgcctcgcgc cgcccgcccc 900

ggctctgact gaccgcgtta ctcccacagg tgagcgggcg ggacggccct tctcctccgg 960

gctgtaatta gcgcttggtt taatgacggc ttgtttcttt tctgtggctg cgtgaaagcc 1020

ttgaggggct ccgggagggc cctttgtgcg gggggagcgg ctcggggggt gcgtgcgtgt 1080

gtgtgtgcgt ggggagcgcc gcgtgcggct ccgcgctgcc cggcggctgt gagcgctgcg 1140

ggcgcggcgc ggggctttgt gcgctccgca gtgtgcgcga ggggagcgcg gccgggggcg 1200

gtgccccgcg gtgcgggggg ggctgcgagg ggaacaaagg ctgcgtgcgg ggtgtgtgcg 1260

tgggggggtg agcagggggt gtgggcgcgt cggtcgggct gcaacccccc ctgcaccccc 1320

ctccccgagt tgctgagcac ggcccggctt cgggtgcggg gctccgtacg gggcgtggcg 1380

cggggctcgc cgtgccgggc ggggggtggc ggcaggtggg ggtgccgggc ggggcggggc 1440

cgcctcgggc cggggagggc tcgggggagg ggcgcggcgg cccccggagc gccggcggct 1500

gtcgaggcgc ggcgagccgc agccattgcc ttttatggta atcgtgcgag agggcgcagg 1560

gacttccttt gtcccaaatc tgtgcggagc cgaaatctgg gaggcgccgc cgcaccccct 1620

ctagcgggcg cggggcgaag cggtgcggcg ccggcaggaa ggaaatgggc ggggagggcc 1680

ttcgtgcgtc gccgcgccgc cgtccccttc tccctctcca gcctcggggc tgtccgcggg 1740

gggacggctg ccttcggggg ggacggggca gggcggggtt cggcttctgg cgtgtgaccg 1800

gcggctctag agcctctgct aaccatgttc atgccttctt ctttttccta cagctcctgg 1860

gcaacgtgct ggttattgtg ctgtctcatc attttggcaa agaattgatt aattcgagcg 1920

aacgcgtgcc accatgcccc cacctagaac cggaagagga ttgctctggc tcggacttgt 1980

gctgtccagc gtgtgtgtgg ccctgggctc ggaaacccag gccaacagca ccaccgacgc 2040

cctgaatgtg ctgctgatta tcgtggacga tctccggcct tcgctgggct gctacgggga 2100

taagctggtc cgctccccga atatcgacca actggcttca catagcctgc ttttccaaaa 2160

cgcattcgcc caacaagccg tgtgcgcccc gagccgcgtg tctttcctca ccggccggcg 2220

ccctgatact acccggctct acgacttcaa cagctactgg agagtgcacg caggaaactt 2280

ctccaccatt cctcagtact ttaaggagaa cggttacgtc accatgagcg tggggaaggt 2340

gttccaccct ggaatttcct ccaaccacac cgacgactcg ccatactcct ggtcctttcc 2400

cccttaccac ccatcatccg agaagtacga gaacaccaag acgtgcaggg gcccagacgg 2460

ggaactgcac gcgaacctcc tctgcccggt cgatgtgctg gatgtgcccg aaggcaccct 2520

ccctgacaaa cagagcaccg aacaggccat ccagctcctc gagaagatga aaacttcagc 2580

ctccccgttc tttctggccg tgggatacca caagccgcat atccccttcc ggtacccaaa 2640

ggagttccag aagctgtacc cgctggagaa cattaccctg gctcctgatc ccgaagtgcc 2700

ggacggcctg ccgcccgtgg catacaaccc ttggatggac atccgccaga gggaggatgt 2760

gcaagccctg aacatctccg tgccatacgg tccgatcccg gtcgacttcc agcggaagat 2820

taggcagtca tatttcgcgt ccgtgtccta cttggacact caggtcggac gcctcctctc 2880

cgctctcgac gatctgcagc tggccaactc gaccattatc gcgttcacct cggaccatgg 2940

ttgggctctg ggcgaacacg gagaatgggc caagtacagc aatttcgatg tcgcgactca 3000

cgtgcccctg atcttctacg tgcccggacg cacagccagc ttgcctgaag cgggggaaaa 3060

gctgttccct tacctggatc ccttcgactc cgcctctcaa cttatggagc caggcagaca 3120

gtcgatggac ctggtggaac tcgtgtcact gttccctacc ctcgccggtc tggccggact 3180

tcaggtcccg cctcggtgcc cggtgccgtc cttccacgtg gagctgtgtc gcgagggaaa 3240

gaacctcctg aaacacttcc ggttccgcga cctggaggaa gatccctact tgccgggcaa 3300

cccgagagaa cttatcgcat actcccagta ccctcgcccc tccgacatcc cgcagtggaa 3360

ctccgacaag ccgagcctga aggacattaa gatcatgggg tactccatcc ggactattga 3420

ctatcggtac actgtgtggg tcgggttcaa cccagatgag tttctggcca acttctccga 3480

tatccatgcc ggagagctgt acttcgtgga ctcggacccg ctgcaggacc acaacatgta 3540

caacgactca cagggcggcg acctgttcca gttgctgatg ccctgagaat tcgagctcgg 3600

tacccgggaa tcaattcact cctcaggtgc aggctgccta tcagaaggtg gtggctggtg 3660

tggccaatgc cctggctcac aaataccact gagatctttt tccctctgcc aaaaattatg 3720

gggacatcat gaagcccctt gagcatctga cttctggcta ataaaggaaa tttattttca 3780

ttgcaatagt gtgttggaat tttttgtgtc tctcactcgg aaggacatat gggagggcaa 3840

atcatttaaa acatcagaat gagtatttgg tttagagttt ggcaacatat gcccatatgc 3900

tggctgccat gaacaaaggt tggctataaa gaggtcatca gtatatgaaa cagccccctg 3960

ctgtccattc cttattccat agaaaagcct tgacttgagg ttagattttt tttatatttt 4020

gttttgtgtt atttttttct ttaacatccc taaaattttc cttacatgtt ttactagcca 4080

gatttttcct cctctcctga ctactcccag tcatagctgt ccctcttctc ttatggagat 4140

ccctcgacct gcagcccaag ctgtagataa gtagcatggc gggttaatca ttaactacaa 4200

ggaaccccta gtgatggagt tggccactcc ctctctgcgc gctcgctcgc tcactgaggc 4260

cgcccgggct ttgcccgggc ggcctcagtg agcgagcgag cgcgcag 4307

<210> 8

<211> 1653

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ohIDS-version2

<400> 8

atgcctcctc ctagaactgg aagggggctg ctgtggctgg ggctggtcct gtcatcagtg 60

tgtgtcgctc tgggctccga gactcaggca aactccacca cagacgccct gaatgtgctg 120

ctgatcattg tcgacgatct gcgaccttcc ctggggtgct acggcgacaa gctggtgagg 180

tctccaaaca tcgatcagct ggcttcacac agcctgctgt tccagaatgc ctttgctcag 240

caggcagtgt gtgcaccatc acgggtcagc ttcctgaccg gaaggagacc tgacactacc 300

aggctgtacg attttaactc atattggaga gtgcatgccg ggaatttcag caccatccca 360

cagtacttta aggagaacgg ctatgtgaca atgtccgtgg gaaaagtctt ccaccccggc 420

attagctcca atcatacaga cgattctcca tactcctggt cttttccccc ttatcacccc 480

tctagtgaga agtacgaaaa cacaaaaact tgcaggggac cagacgggga gctgcatgca 540

aatctgctgt gtcccgtgga cgtcctggat gtgcccgaag gcacactgcc tgataagcag 600

agcactgagc aggccattca gctgctggaa aagatgaaaa caagtgcttc acccttcttt 660

ctggcagtgg gatatcacaa accacatatc cccttcagat atcccaagga gtttcagaaa 720

ctgtaccctc tggaaaacat tactctggct cccgaccctg aggtgcctga tggactgcca 780

cccgtcgcat ataacccatg gatggacatc cggcagcgcg aggatgtgca ggccctgaat 840

atcagtgtcc cttacgggcc aattcccgtg gacttccaga gaaagattcg gcagtcttac 900

tttgccagcg tctcctatct ggatactcaa gtgggacgac tgctgagcgc tctggacgat 960

ctgcagctgg ccaacagcac catcattgct ttcacatccg accacggatg ggctctggga 1020

gagcatggag aatgggcaaa gtatagcaat ttcgatgtgg ccactcacgt cccactgatc 1080

ttttacgtgc ccggccgaac cgcatccctg ccagaggctg gagaaaaact gttcccttac 1140

ctggacccat ttgattctgc tagtcagctg atggagcctg gccgacagtc tatggacctg 1200

gtggaactgg tcagtctgtt ccctacactg gctggactgg caggactgca ggtgcctcca 1260

agatgccctg tgccatcttt tcacgtcgag ctgtgtcggg aaggcaagaa cctgctgaaa 1320

catttcaggt tcagggacct ggaggaagat ccttatctgc caggaaatcc cagggagctg 1380

atcgcctaca gtcagtatcc ccgcccttca gacattcctc agtggaactc cgacaagcca 1440

tctctgaagg atatcaaaat tatgggatac agcatccgca ctattgatta ccgatatacc 1500

gtgtgggtcg ggttcaaccc cgacgagttc ctggcaaatt ttagtgatat ccacgccggc 1560

gaactgtatt ttgtggactc agatcctctg caggaccata acatgtacaa tgacagccag 1620

ggcggagatc tgttccagct gctgatgcca tga 1653

<210> 9

<211> 7888

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> pAAV-CAG-ohIDS-version2

<400> 9

cgcgtgccac catgcctcct cctagaactg gaagggggct gctgtggctg gggctggtcc 60

tgtcatcagt gtgtgtcgct ctgggctccg agactcaggc aaactccacc acagacgccc 120

tgaatgtgct gctgatcatt gtcgacgatc tgcgaccttc cctggggtgc tacggcgaca 180

agctggtgag gtctccaaac atcgatcagc tggcttcaca cagcctgctg ttccagaatg 240

cctttgctca gcaggcagtg tgtgcaccat cacgggtcag cttcctgacc ggaaggagac 300

ctgacactac caggctgtac gattttaact catattggag agtgcatgcc gggaatttca 360

gcaccatccc acagtacttt aaggagaacg gctatgtgac aatgtccgtg ggaaaagtct 420

tccaccccgg cattagctcc aatcatacag acgattctcc atactcctgg tcttttcccc 480

cttatcaccc ctctagtgag aagtacgaaa acacaaaaac ttgcagggga ccagacgggg 540

agctgcatgc aaatctgctg tgtcccgtgg acgtcctgga tgtgcccgaa ggcacactgc 600

ctgataagca gagcactgag caggccattc agctgctgga aaagatgaaa acaagtgctt 660

cacccttctt tctggcagtg ggatatcaca aaccacatat ccccttcaga tatcccaagg 720

agtttcagaa actgtaccct ctggaaaaca ttactctggc tcccgaccct gaggtgcctg 780

atggactgcc acccgtcgca tataacccat ggatggacat ccggcagcgc gaggatgtgc 840

aggccctgaa tatcagtgtc ccttacgggc caattcccgt ggacttccag agaaagattc 900

ggcagtctta ctttgccagc gtctcctatc tggatactca agtgggacga ctgctgagcg 960

ctctggacga tctgcagctg gccaacagca ccatcattgc tttcacatcc gaccacggat 1020

gggctctggg agagcatgga gaatgggcaa agtatagcaa tttcgatgtg gccactcacg 1080

tcccactgat cttttacgtg cccggccgaa ccgcatccct gccagaggct ggagaaaaac 1140

tgttccctta cctggaccca tttgattctg ctagtcagct gatggagcct ggccgacagt 1200

ctatggacct ggtggaactg gtcagtctgt tccctacact ggctggactg gcaggactgc 1260

aggtgcctcc aagatgccct gtgccatctt ttcacgtcga gctgtgtcgg gaaggcaaga 1320

acctgctgaa acatttcagg ttcagggacc tggaggaaga tccttatctg ccaggaaatc 1380

ccagggagct gatcgcctac agtcagtatc cccgcccttc agacattcct cagtggaact 1440

ccgacaagcc atctctgaag gatatcaaaa ttatgggata cagcatccgc actattgatt 1500

accgatatac cgtgtgggtc gggttcaacc ccgacgagtt cctggcaaat tttagtgata 1560

tccacgccgg cgaactgtat tttgtggact cagatcctct gcaggaccat aacatgtaca 1620

atgacagcca gggcggagat ctgttccagc tgctgatgcc atgagaattc gagctcggta 1680

cccgggaatc aattcactcc tcaggtgcag gctgcctatc agaaggtggt ggctggtgtg 1740

gccaatgccc tggctcacaa ataccactga gatctttttc cctctgccaa aaattatggg 1800

gacatcatga agccccttga gcatctgact tctggctaat aaaggaaatt tattttcatt 1860

gcaatagtgt gttggaattt tttgtgtctc tcactcggaa ggacatatgg gagggcaaat 1920

catttaaaac atcagaatga gtatttggtt tagagtttgg caacatatgc ccatatgctg 1980

gctgccatga acaaaggttg gctataaaga ggtcatcagt atatgaaaca gccccctgct 2040

gtccattcct tattccatag aaaagccttg acttgaggtt agattttttt tatattttgt 2100

tttgtgttat ttttttcttt aacatcccta aaattttcct tacatgtttt actagccaga 2160

tttttcctcc tctcctgact actcccagtc atagctgtcc ctcttctctt atggagatcc 2220

ctcgacctgc agcccaagct gtagataagt agcatggcgg gttaatcatt aactacaagg 2280

aacccctagt gatggagttg gccactccct ctctgcgcgc tcgctcgctc actgaggccg 2340

cccgggcttt gcccgggcgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagctgca ttaatgaatc 2400

ggccaacgcg cggggagagg cggtttgcgt attgggcgct cttccgcttc ctcgctcact 2460

gactcgctgc gctcggtcgt tcggctgcgg cgagcggtat cagctcactc aaaggcggta 2520

atacggttat ccacagaatc aggggataac gcaggaaaga acatgtgagc aaaaggccag 2580

caaaaggcca ggaaccgtaa aaaggccgcg ttgctggcgt ttttccatag gctccgcccc 2640

cctgacgagc atcacaaaaa tcgacgctca agtcagaggt ggcgaaaccc gacaggacta 2700

taaagatacc aggcgtttcc ccctggaagc tccctcgtgc gctctcctgt tccgaccctg 2760

ccgcttaccg gatacctgtc cgcctttctc ccttcgggaa gcgtggcgct ttctcatagc 2820

tcacgctgta ggtatctcag ttcggtgtag gtcgttcgct ccaagctggg ctgtgtgcac 2880

gaaccccccg ttcagcccga ccgctgcgcc ttatccggta actatcgtct tgagtccaac 2940

ccggtaagac acgacttatc gccactggca gcagccactg gtaacaggat tagcagagcg 3000

aggtatgtag gcggtgctac agagttcttg aagtggtggc ctaactacgg ctacactaga 3060

agaacagtat ttggtatctg cgctctgctg aagccagtta ccttcggaaa aagagttggt 3120

agctcttgat ccggcaaaca aaccaccgct ggtagcggtg gtttttttgt ttgcaagcag 3180

cagattacgc gcagaaaaaa aggatctcaa gaagatcctt tgatcttttc tacggggtct 3240

gacgctcagt ggaacgaaaa ctcacgttaa gggattttgg tcatgagatt atcaaaaagg 3300

atcttcacct agatcctttt aaattaaaaa tgaagtttta aatcaatcta aagtatatat 3360

gagtaaactt ggtctgacag ttaccaatgc ttaatcagtg aggcacctat ctcagcgatc 3420

tgtctatttc gttcatccat agttgcctga ctccccgtcg tgtagataac tacgatacgg 3480

gagggcttac catctggccc cagtgctgca atgataccgc gagacccacg ctcaccggct 3540

ccagatttat cagcaataaa ccagccagcc ggaagggccg agcgcagaag tggtcctgca 3600

actttatccg cctccatcca gtctattaat tgttgccggg aagctagagt aagtagttcg 3660

ccagttaata gtttgcgcaa cgttgttgcc attgctacag gcatcgtggt gtcacgctcg 3720

tcgtttggta tggcttcatt cagctccggt tcccaacgat caaggcgagt tacatgatcc 3780

cccatgttgt gcaaaaaagc ggttagctcc ttcggtcctc cgatcgttgt cagaagtaag 3840

ttggccgcag tgttatcact catggttatg gcagcactgc ataattctct tactgtcatg 3900

ccatccgtaa gatgcttttc tgtgactggt gagtactcaa ccaagtcatt ctgagaatag 3960

tgtatgcggc gaccgagttg ctcttgcccg gcgtcaatac gggataatac cgcgccacat 4020

agcagaactt taaaagtgct catcattgga aaacgttctt cggggcgaaa actctcaagg 4080

atcttaccgc tgttgagatc cagttcgatg taacccactc gtgcacccaa ctgatcttca 4140

gcatctttta ctttcaccag cgtttctggg tgagcaaaaa caggaaggca aaatgccgca 4200

aaaaagggaa taagggcgac acggaaatgt tgaatactca tactcttcct ttttcaatat 4260

tattgaagca tttatcaggg ttattgtctc atgagcggat acatatttga atgtatttag 4320

aaaaataaac aaataggggt tccgcgcaca tttccccgaa aagtgccacc tgacgtctaa 4380

gaaaccatta ttatcatgac attaacctat aaaaataggc gtatcacgag gccctttcgt 4440

ctcgcgcgtt tcggtgatga cggtgaaaac ctctgacaca tgcagctccc ggagacggtc 4500

acagcttgtc tgtaagcgga tgccgggagc agacaagccc gtcagggcgc gtcagcgggt 4560

gttggcgggt gtcggggctg gcttaactat gcggcatcag agcagattgt actgagagtg 4620

caccatatgc ggtgtgaaat accgcacaga tgcgtaagga gaaaataccg catcaggcga 4680

ttccaacatc caataaatca tacaggcaag gcaaagaatt agcaaaatta agcaataaag 4740

cctcagagca taaagctaaa tcggttgtac caaaaacatt atgaccctgt aatacttttg 4800

cgggagaagc ctttatttca acgcaaggat aaaaattttt agaaccctca tatattttaa 4860

atgcaatgcc tgagtaatgt gtaggtaaag attcaaacgg gtgagaaagg ccggagacag 4920

tcaaatcacc atcaatatga tattcaaccg ttctagctga taaattcatg ccggagaggg 4980

tagctatttt tgagaggtct ctacaaaggc tatcaggtca ttgcctgaga gtctggagca 5040

aacaagagaa tcgatgaacg gtaatcgtaa aactagcatg tcaatcatat gtaccccggt 5100

tgataatcag aaaagcccca aaaacaggaa gattgtataa gcaaatattt aaattgtaag 5160

cgttaatatt ttgttaaaat tcgcgttaaa tttttgttaa atcagctcat tttttaacca 5220

ataggccgaa atcggcaaaa tcccttataa atcaaaagaa tagaccgaga tagggttgag 5280

tgttgttcca gtttggaaca agagtccact attaaagaac gtggactcca acgtcaaagg 5340

gcgaaaaacc gtctatcagg gcgatggccc actacgtgaa ccatcaccct aatcaagttt 5400

tttggggtcg aggtgccgta aagcactaaa tcggaaccct aaagggagcc cccgatttag 5460

agcttgacgg ggaaagccgg cgaacgtggc gagaaaggaa gggaagaaag cgaaaggagc 5520

gggcgctagg gcgctggcaa gtgtagcggt cacgctgcgc gtaaccacca cacccgccgc 5580

gcttaatgcg ccgctacagg gcgcgtacta tggttgcttt gacgagcacg tataacgtgc 5640

tttcctcgtt agaatcagag cgggagctaa acaggaggcc gattaaaggg attttagaca 5700

ggaacggtac gccagaatcc tgagaagtgt ttttataatc agtgaggcca ccgagtaaaa 5760

gagtctgtcc atcacgcaaa ttaaccgttg tcgcaatact tctttgatta gtaataacat 5820

cacttgcctg agtagaagaa ctcaaactat cggccttgct ggtaatatcc agaacaatat 5880

taccgccagc cattgcaacg gaatcgccat tcgccattca ggctgcgcaa ctgttgggaa 5940

gggcgatcgg tgcgggcctc ttcgctatta cgccagctgc gcgctcgctc gctcactgag 6000

gccgcccggg caaagcccgg gcgtcgggcg acctttggtc gcccggcctc agtgagcgag 6060

cgagcgcgca gagagggagt ggccaactcc atcactaggg gttccttgta gttaatgatt 6120

aacccgccat gctacttatc tactcgacat tgattattga ctagttatta atagtaatca 6180

attacggggt cattagttca tagcccatat atggagttcc gcgttacata acttacggta 6240

aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat aatgacgtat 6300

gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc aatgggtgga gtatttacgg 6360

taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc caagtacgcc ccctattgac 6420

gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt atgggacttt 6480

cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta ccatggtcga ggtgagcccc 6540

acgttctgct tcactctccc catctccccc ccctccccac ccccaatttt gtatttattt 6600

attttttaat tattttgtgc agcgatgggg gcgggggggg ggggggggcg cgcgccaggc 6660

ggggcggggc ggggcgaggg gcggggcggg gcgaggcgga gaggtgcggc ggcagccaat 6720

cagagcggcg cgctccgaaa gtttcctttt atggcgaggc ggcggcggcg gcggccctat 6780

aaaaagcgaa gcgcgcggcg ggcgggagtc gctgcgttgc cttcgccccg tgccccgctc 6840

cgccgccgcc tcgcgccgcc cgccccggct ctgactgacc gcgttactcc cacaggtgag 6900

cgggcgggac ggcccttctc ctccgggctg taattagcgc ttggtttaat gacggcttgt 6960

ttcttttctg tggctgcgtg aaagccttga ggggctccgg gagggccctt tgtgcggggg 7020

gagcggctcg gggggtgcgt gcgtgtgtgt gtgcgtgggg agcgccgcgt gcggctccgc 7080

gctgcccggc ggctgtgagc gctgcgggcg cggcgcgggg ctttgtgcgc tccgcagtgt 7140

gcgcgagggg agcgcggccg ggggcggtgc cccgcggtgc ggggggggct gcgaggggaa 7200

caaaggctgc gtgcggggtg tgtgcgtggg ggggtgagca gggggtgtgg gcgcgtcggt 7260

cgggctgcaa ccccccctgc acccccctcc ccgagttgct gagcacggcc cggcttcggg 7320

tgcggggctc cgtacggggc gtggcgcggg gctcgccgtg ccgggcgggg ggtggcggca 7380

ggtgggggtg ccgggcgggg cggggccgcc tcgggccggg gagggctcgg gggaggggcg 7440

cggcggcccc cggagcgccg gcggctgtcg aggcgcggcg agccgcagcc attgcctttt 7500

atggtaatcg tgcgagaggg cgcagggact tcctttgtcc caaatctgtg cggagccgaa 7560

atctgggagg cgccgccgca ccccctctag cgggcgcggg gcgaagcggt gcggcgccgg 7620

caggaaggaa atgggcgggg agggccttcg tgcgtcgccg cgccgccgtc cccttctccc 7680

tctccagcct cggggctgtc cgcgggggga cggctgcctt cgggggggac ggggcagggc 7740

ggggttcggc ttctggcgtg tgaccggcgg ctctagagcc tctgctaacc atgttcatgc 7800

cttcttcttt ttcctacagc tcctgggcaa cgtgctggtt attgtgctgt ctcatcattt 7860

tggcaaagaa ttgattaatt cgagcgaa 7888

<210> 10

<211> 4307

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> AAV9-CAG-ohIDS-version2

<400> 10

attacgccag ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg 60

ggcgaccttt ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa 120

ctccatcact aggggttcct tgtagttaat gattaacccg ccatgctact tatctactcg 180

acattgatta ttgactagtt attaatagta atcaattacg gggtcattag ttcatagccc 240

atatatggag ttccgcgtta cataacttac ggtaaatggc ccgcctggct gaccgcccaa 300

cgacccccgc ccattgacgt caataatgac gtatgttccc atagtaacgc caatagggac 360

tttccattga cgtcaatggg tggagtattt acggtaaact gcccacttgg cagtacatca 420

agtgtatcat atgccaagta cgccccctat tgacgtcaat gacggtaaat ggcccgcctg 480

gcattatgcc cagtacatga ccttatggga ctttcctact tggcagtaca tctacgtatt 540

agtcatcgct attaccatgg tcgaggtgag ccccacgttc tgcttcactc tccccatctc 600

ccccccctcc ccacccccaa ttttgtattt atttattttt taattatttt gtgcagcgat 660

gggggcgggg gggggggggg ggcgcgcgcc aggcggggcg gggcggggcg aggggcgggg 720

cggggcgagg cggagaggtg cggcggcagc caatcagagc ggcgcgctcc gaaagtttcc 780

ttttatggcg aggcggcggc ggcggcggcc ctataaaaag cgaagcgcgc ggcgggcggg 840

agtcgctgcg ttgccttcgc cccgtgcccc gctccgccgc cgcctcgcgc cgcccgcccc 900

ggctctgact gaccgcgtta ctcccacagg tgagcgggcg ggacggccct tctcctccgg 960

gctgtaatta gcgcttggtt taatgacggc ttgtttcttt tctgtggctg cgtgaaagcc 1020

ttgaggggct ccgggagggc cctttgtgcg gggggagcgg ctcggggggt gcgtgcgtgt 1080

gtgtgtgcgt ggggagcgcc gcgtgcggct ccgcgctgcc cggcggctgt gagcgctgcg 1140

ggcgcggcgc ggggctttgt gcgctccgca gtgtgcgcga ggggagcgcg gccgggggcg 1200

gtgccccgcg gtgcgggggg ggctgcgagg ggaacaaagg ctgcgtgcgg ggtgtgtgcg 1260

tgggggggtg agcagggggt gtgggcgcgt cggtcgggct gcaacccccc ctgcaccccc 1320

ctccccgagt tgctgagcac ggcccggctt cgggtgcggg gctccgtacg gggcgtggcg 1380

cggggctcgc cgtgccgggc ggggggtggc ggcaggtggg ggtgccgggc ggggcggggc 1440

cgcctcgggc cggggagggc tcgggggagg ggcgcggcgg cccccggagc gccggcggct 1500

gtcgaggcgc ggcgagccgc agccattgcc ttttatggta atcgtgcgag agggcgcagg 1560

gacttccttt gtcccaaatc tgtgcggagc cgaaatctgg gaggcgccgc cgcaccccct 1620

ctagcgggcg cggggcgaag cggtgcggcg ccggcaggaa ggaaatgggc ggggagggcc 1680

ttcgtgcgtc gccgcgccgc cgtccccttc tccctctcca gcctcggggc tgtccgcggg 1740

gggacggctg ccttcggggg ggacggggca gggcggggtt cggcttctgg cgtgtgaccg 1800

gcggctctag agcctctgct aaccatgttc atgccttctt ctttttccta cagctcctgg 1860

gcaacgtgct ggttattgtg ctgtctcatc attttggcaa agaattgatt aattcgagcg 1920

aacgcgtgcc accatgcctc ctcctagaac tggaaggggg ctgctgtggc tggggctggt 1980

cctgtcatca gtgtgtgtcg ctctgggctc cgagactcag gcaaactcca ccacagacgc 2040

cctgaatgtg ctgctgatca ttgtcgacga tctgcgacct tccctggggt gctacggcga 2100

caagctggtg aggtctccaa acatcgatca gctggcttca cacagcctgc tgttccagaa 2160

tgcctttgct cagcaggcag tgtgtgcacc atcacgggtc agcttcctga ccggaaggag 2220

acctgacact accaggctgt acgattttaa ctcatattgg agagtgcatg ccgggaattt 2280

cagcaccatc ccacagtact ttaaggagaa cggctatgtg acaatgtccg tgggaaaagt 2340

cttccacccc ggcattagct ccaatcatac agacgattct ccatactcct ggtcttttcc 2400

cccttatcac ccctctagtg agaagtacga aaacacaaaa acttgcaggg gaccagacgg 2460

ggagctgcat gcaaatctgc tgtgtcccgt ggacgtcctg gatgtgcccg aaggcacact 2520

gcctgataag cagagcactg agcaggccat tcagctgctg gaaaagatga aaacaagtgc 2580

ttcacccttc tttctggcag tgggatatca caaaccacat atccccttca gatatcccaa 2640

ggagtttcag aaactgtacc ctctggaaaa cattactctg gctcccgacc ctgaggtgcc 2700

tgatggactg ccacccgtcg catataaccc atggatggac atccggcagc gcgaggatgt 2760

gcaggccctg aatatcagtg tcccttacgg gccaattccc gtggacttcc agagaaagat 2820

tcggcagtct tactttgcca gcgtctccta tctggatact caagtgggac gactgctgag 2880

cgctctggac gatctgcagc tggccaacag caccatcatt gctttcacat ccgaccacgg 2940

atgggctctg ggagagcatg gagaatgggc aaagtatagc aatttcgatg tggccactca 3000

cgtcccactg atcttttacg tgcccggccg aaccgcatcc ctgccagagg ctggagaaaa 3060

actgttccct tacctggacc catttgattc tgctagtcag ctgatggagc ctggccgaca 3120

gtctatggac ctggtggaac tggtcagtct gttccctaca ctggctggac tggcaggact 3180

gcaggtgcct ccaagatgcc ctgtgccatc ttttcacgtc gagctgtgtc gggaaggcaa 3240

gaacctgctg aaacatttca ggttcaggga cctggaggaa gatccttatc tgccaggaaa 3300

tcccagggag ctgatcgcct acagtcagta tccccgccct tcagacattc ctcagtggaa 3360

ctccgacaag ccatctctga aggatatcaa aattatggga tacagcatcc gcactattga 3420

ttaccgatat accgtgtggg tcgggttcaa ccccgacgag ttcctggcaa attttagtga 3480

tatccacgcc ggcgaactgt attttgtgga ctcagatcct ctgcaggacc ataacatgta 3540

caatgacagc cagggcggag atctgttcca gctgctgatg ccatgagaat tcgagctcgg 3600

tacccgggaa tcaattcact cctcaggtgc aggctgccta tcagaaggtg gtggctggtg 3660

tggccaatgc cctggctcac aaataccact gagatctttt tccctctgcc aaaaattatg 3720

gggacatcat gaagcccctt gagcatctga cttctggcta ataaaggaaa tttattttca 3780

ttgcaatagt gtgttggaat tttttgtgtc tctcactcgg aaggacatat gggagggcaa 3840

atcatttaaa acatcagaat gagtatttgg tttagagttt ggcaacatat gcccatatgc 3900

tggctgccat gaacaaaggt tggctataaa gaggtcatca gtatatgaaa cagccccctg 3960

ctgtccattc cttattccat agaaaagcct tgacttgagg ttagattttt tttatatttt 4020

gttttgtgtt atttttttct ttaacatccc taaaattttc cttacatgtt ttactagcca 4080

gatttttcct cctctcctga ctactcccag tcatagctgt ccctcttctc ttatggagat 4140

ccctcgacct gcagcccaag ctgtagataa gtagcatggc gggttaatca ttaactacaa 4200

ggaaccccta gtgatggagt tggccactcc ctctctgcgc gctcgctcgc tcactgaggc 4260

cgcccgggct ttgcccgggc ggcctcagtg agcgagcgag cgcgcag 4307

<210> 11

<211> 1665

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> omIDS

<400> 11

atgagcccac ctcccccacc cccaatctgg cggcagctga gcttcagcct gctgctgggc 60

agcttctgta tcgccctgga aagcgccaag cttgcccagg gcaacagcgc caccgacgcc 120

ctgaacatcc tgctgatcat cgtggacgac ctgaggccca gcctgggatg ctacggcgac 180

aagctggtcc gcagccccaa catcgaccag ctggcttctc acagcgtgct gttccagaac 240

gcattcgcac agcaggccgt gtgcgccccc agcagagtgt ctttcctgac cggcagaagg 300

cccgacacca ccagactgta cgacttcaac agctactggc gggtgcacag cggcaacttc 360

agcaccatcc cccagtactt caaagaaaac ggctacgtga ccatgagcgt gggcaaggtg 420

ttccaccccg gcatcagcag caaccacagc gacgactacc cctacagctg gtccttccca 480

ccctaccacc ccagcagcga gaagtacgag aacaccaaga cctgcaaggg ccaggacggc 540

aagctgcacg ccaacctgct gtgccctgtg gacgtggcag acgtgccaga gggaaccctg 600

cctgacaagc agagcaccga ggaagccatc agactgctgg aaaagatgaa gaccagcgcc 660

agccccttct tcctggccgt gggctaccac aagccccaca tccctttcag ataccccaaa 720

gagttccaga agctgtaccc cctggaaaac atcaccctgg cccccgaccc ccacgtgcca 780

gattctctgc cccccgtggc ctacaacccc tggatggata tccgcgagcg cgaggacgtg 840

caggctctga acatcagcgt gccctacggc cctatccccg aggacttcca gagaaagatc 900

agacagagct acttcgccag cgtgtcctac ctggacaccc aagtgggaca cgtgctgagc 960

gccctggacg atctgagact ggcccacaac accatcattg ccttcaccag cgaccacggc 1020

tgggctctgg gagagcacgg cgagtgggcc aagtacagca acttcgacgt ggccaccaga 1080

gtgcccctga tgctgtacgt gcccggcaga accgcccctc tgcctgccgc tggacagaag 1140

ctgttccctt accgggaccc cttcgacccc gccagcgatt ggatggacgc cggcagacac 1200

accgaggacc tggtggaact ggtgtccctg ttccccaccc tggccggact ggctggactg 1260

cctgtgcccc ccagatgccc catccctagc ttccacgtcg aactgtgcag agagggccag 1320

aacctgcaga aacatctgca gctgcacgac ctggaagagg aacccgacct gttcggcaac 1380

cccagagagc tgatcgccta cagccagtac cccagacccg ccgacttccc ccagtggaac 1440

agcgacaagc ccagcctgaa cgacatcaaa gtgatgggct acagcatcag gaccgtggac 1500

tacagataca ccgtgtgggt cggattcgac cccagcgagt tcctggccaa cttcagcgac 1560

atccacgccg gcgagctgta cttcgtggac agcgaccccc tgcaggacca caacgtgtac 1620

aacgacagcc agcacggcgg cctgctgcac agcctgaggc cttga 1665

<210> 12

<211> 7914

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> pAAV-CAG-omIDS

<400> 12

cgcgtgctag cgccaccatg agcccacctc ccccaccccc aatctggcgg cagctgagct 60

tcagcctgct gctgggcagc ttctgtatcg ccctggaaag cgccaagctt gcccagggca 120

acagcgccac cgacgccctg aacatcctgc tgatcatcgt ggacgacctg aggcccagcc 180

tgggatgcta cggcgacaag ctggtccgca gccccaacat cgaccagctg gcttctcaca 240

gcgtgctgtt ccagaacgca ttcgcacagc aggccgtgtg cgcccccagc agagtgtctt 300

tcctgaccgg cagaaggccc gacaccacca gactgtacga cttcaacagc tactggcggg 360

tgcacagcgg caacttcagc accatccccc agtacttcaa agaaaacggc tacgtgacca 420

tgagcgtggg caaggtgttc caccccggca tcagcagcaa ccacagcgac gactacccct 480

acagctggtc cttcccaccc taccacccca gcagcgagaa gtacgagaac accaagacct 540

gcaagggcca ggacggcaag ctgcacgcca acctgctgtg ccctgtggac gtggcagacg 600

tgccagaggg aaccctgcct gacaagcaga gcaccgagga agccatcaga ctgctggaaa 660

agatgaagac cagcgccagc cccttcttcc tggccgtggg ctaccacaag ccccacatcc 720

ctttcagata ccccaaagag ttccagaagc tgtaccccct ggaaaacatc accctggccc 780

ccgaccccca cgtgccagat tctctgcccc ccgtggccta caacccctgg atggatatcc 840

gcgagcgcga ggacgtgcag gctctgaaca tcagcgtgcc ctacggccct atccccgagg 900

acttccagag aaagatcaga cagagctact tcgccagcgt gtcctacctg gacacccaag 960

tgggacacgt gctgagcgcc ctggacgatc tgagactggc ccacaacacc atcattgcct 1020

tcaccagcga ccacggctgg gctctgggag agcacggcga gtgggccaag tacagcaact 1080

tcgacgtggc caccagagtg cccctgatgc tgtacgtgcc cggcagaacc gcccctctgc 1140

ctgccgctgg acagaagctg ttcccttacc gggacccctt cgaccccgcc agcgattgga 1200

tggacgccgg cagacacacc gaggacctgg tggaactggt gtccctgttc cccaccctgg 1260

ccggactggc tggactgcct gtgcccccca gatgccccat ccctagcttc cacgtcgaac 1320

tgtgcagaga gggccagaac ctgcagaaac atctgcagct gcacgacctg gaagaggaac 1380

ccgacctgtt cggcaacccc agagagctga tcgcctacag ccagtacccc agacccgccg 1440

acttccccca gtggaacagc gacaagccca gcctgaacga catcaaagtg atgggctaca 1500

gcatcaggac cgtggactac agatacaccg tgtgggtcgg attcgacccc agcgagttcc 1560

tggccaactt cagcgacatc cacgccggcg agctgtactt cgtggacagc gaccccctgc 1620

aggaccacaa cgtgtacaac gacagccagc acggcggcct gctgcacagc ctgaggcctt 1680

gagcggccgc gaattcgagc tcggtacccg ggaatcaatt cactcctcag gtgcaggctg 1740

cctatcagaa ggtggtggct ggtgtggcca atgccctggc tcacaaatac cactgagatc 1800

tttttccctc tgccaaaaat tatggggaca tcatgaagcc ccttgagcat ctgacttctg 1860

gctaataaag gaaatttatt ttcattgcaa tagtgtgttg gaattttttg tgtctctcac 1920

tcggaaggac atatgggagg gcaaatcatt taaaacatca gaatgagtat ttggtttaga 1980

gtttggcaac atatgcccat atgctggctg ccatgaacaa aggttggcta taaagaggtc 2040

atcagtatat gaaacagccc cctgctgtcc attccttatt ccatagaaaa gccttgactt 2100

gaggttagat tttttttata ttttgttttg tgttattttt ttctttaaca tccctaaaat 2160

tttccttaca tgttttacta gccagatttt tcctcctctc ctgactactc ccagtcatag 2220

ctgtccctct tctcttatgg agatccctcg acctgcagcc caagctgtag ataagtagca 2280

tggcgggtta atcattaact acaaggaacc cctagtgatg gagttggcca ctccctctct 2340

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgcccg ggctttgccc gggcggcctc agtgagcgag 2400

cgagcgcgca gctgcattaa tgaatcggcc aacgcgcggg gagaggcggt ttgcgtattg 2460

ggcgctcttc cgcttcctcg ctcactgact cgctgcgctc ggtcgttcgg ctgcggcgag 2520

cggtatcagc tcactcaaag gcggtaatac ggttatccac agaatcaggg gataacgcag 2580

gaaagaacat gtgagcaaaa ggccagcaaa aggccaggaa ccgtaaaaag gccgcgttgc 2640

tggcgttttt ccataggctc cgcccccctg acgagcatca caaaaatcga cgctcaagtc 2700

agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa gataccaggc gtttccccct ggaagctccc 2760

tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc ttaccggata cctgtccgcc tttctccctt 2820

cgggaagcgt ggcgctttct catagctcac gctgtaggta tctcagttcg gtgtaggtcg 2880

ttcgctccaa gctgggctgt gtgcacgaac cccccgttca gcccgaccgc tgcgccttat 2940

ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg taagacacga cttatcgcca ctggcagcag 3000

ccactggtaa caggattagc agagcgaggt atgtaggcgg tgctacagag ttcttgaagt 3060

ggtggcctaa ctacggctac actagaagaa cagtatttgg tatctgcgct ctgctgaagc 3120

cagttacctt cggaaaaaga gttggtagct cttgatccgg caaacaaacc accgctggta 3180

gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag aaaaaaagga tctcaagaag 3240

atcctttgat cttttctacg gggtctgacg ctcagtggaa cgaaaactca cgttaaggga 3300

ttttggtcat gagattatca aaaaggatct tcacctagat ccttttaaat taaaaatgaa 3360

gttttaaatc aatctaaagt atatatgagt aaacttggtc tgacagttac caatgcttaa 3420

tcagtgaggc acctatctca gcgatctgtc tatttcgttc atccatagtt gcctgactcc 3480

ccgtcgtgta gataactacg atacgggagg gcttaccatc tggccccagt gctgcaatga 3540

taccgcgaga cccacgctca ccggctccag atttatcagc aataaaccag ccagccggaa 3600

gggccgagcg cagaagtggt cctgcaactt tatccgcctc catccagtct attaattgtt 3660

gccgggaagc tagagtaagt agttcgccag ttaatagttt gcgcaacgtt gttgccattg 3720

ctacaggcat cgtggtgtca cgctcgtcgt ttggtatggc ttcattcagc tccggttccc 3780

aacgatcaag gcgagttaca tgatccccca tgttgtgcaa aaaagcggtt agctccttcg 3840

gtcctccgat cgttgtcaga agtaagttgg ccgcagtgtt atcactcatg gttatggcag 3900

cactgcataa ttctcttact gtcatgccat ccgtaagatg cttttctgtg actggtgagt 3960

actcaaccaa gtcattctga gaatagtgta tgcggcgacc gagttgctct tgcccggcgt 4020

caatacggga taataccgcg ccacatagca gaactttaaa agtgctcatc attggaaaac 4080

gttcttcggg gcgaaaactc tcaaggatct taccgctgtt gagatccagt tcgatgtaac 4140

ccactcgtgc acccaactga tcttcagcat cttttacttt caccagcgtt tctgggtgag 4200

caaaaacagg aaggcaaaat gccgcaaaaa agggaataag ggcgacacgg aaatgttgaa 4260

tactcatact cttccttttt caatattatt gaagcattta tcagggttat tgtctcatga 4320

gcggatacat atttgaatgt atttagaaaa ataaacaaat aggggttccg cgcacatttc 4380

cccgaaaagt gccacctgac gtctaagaaa ccattattat catgacatta acctataaaa 4440

ataggcgtat cacgaggccc tttcgtctcg cgcgtttcgg tgatgacggt gaaaacctct 4500

gacacatgca gctcccggag acggtcacag cttgtctgta agcggatgcc gggagcagac 4560

aagcccgtca gggcgcgtca gcgggtgttg gcgggtgtcg gggctggctt aactatgcgg 4620

catcagagca gattgtactg agagtgcacc atatgcggtg tgaaataccg cacagatgcg 4680

taaggagaaa ataccgcatc aggcgattcc aacatccaat aaatcataca ggcaaggcaa 4740

agaattagca aaattaagca ataaagcctc agagcataaa gctaaatcgg ttgtaccaaa 4800

aacattatga ccctgtaata cttttgcggg agaagccttt atttcaacgc aaggataaaa 4860

atttttagaa ccctcatata ttttaaatgc aatgcctgag taatgtgtag gtaaagattc 4920

aaacgggtga gaaaggccgg agacagtcaa atcaccatca atatgatatt caaccgttct 4980

agctgataaa ttcatgccgg agagggtagc tatttttgag aggtctctac aaaggctatc 5040

aggtcattgc ctgagagtct ggagcaaaca agagaatcga tgaacggtaa tcgtaaaact 5100

agcatgtcaa tcatatgtac cccggttgat aatcagaaaa gccccaaaaa caggaagatt 5160

gtataagcaa atatttaaat tgtaagcgtt aatattttgt taaaattcgc gttaaatttt 5220

tgttaaatca gctcattttt taaccaatag gccgaaatcg gcaaaatccc ttataaatca 5280

aaagaataga ccgagatagg gttgagtgtt gttccagttt ggaacaagag tccactatta 5340

aagaacgtgg actccaacgt caaagggcga aaaaccgtct atcagggcga tggcccacta 5400

cgtgaaccat caccctaatc aagttttttg gggtcgaggt gccgtaaagc actaaatcgg 5460

aaccctaaag ggagcccccg atttagagct tgacggggaa agccggcgaa cgtggcgaga 5520

aaggaaggga agaaagcgaa aggagcgggc gctagggcgc tggcaagtgt agcggtcacg 5580

ctgcgcgtaa ccaccacacc cgccgcgctt aatgcgccgc tacagggcgc gtactatggt 5640

tgctttgacg agcacgtata acgtgctttc ctcgttagaa tcagagcggg agctaaacag 5700

gaggccgatt aaagggattt tagacaggaa cggtacgcca gaatcctgag aagtgttttt 5760

ataatcagtg aggccaccga gtaaaagagt ctgtccatca cgcaaattaa ccgttgtcgc 5820

aatacttctt tgattagtaa taacatcact tgcctgagta gaagaactca aactatcggc 5880

cttgctggta atatccagaa caatattacc gccagccatt gcaacggaat cgccattcgc 5940

cattcaggct gcgcaactgt tgggaagggc gatcggtgcg ggcctcttcg ctattacgcc 6000

agctgcgcgc tcgctcgctc actgaggccg cccgggcaaa gcccgggcgt cgggcgacct 6060

ttggtcgccc ggcctcagtg agcgagcgag cgcgcagaga gggagtggcc aactccatca 6120

ctaggggttc cttgtagtta atgattaacc cgccatgcta cttatctact cgacattgat 6180

tattgactag ttattaatag taatcaatta cggggtcatt agttcatagc ccatatatgg 6240

agttccgcgt tacataactt acggtaaatg gcccgcctgg ctgaccgccc aacgaccccc 6300

gcccattgac gtcaataatg acgtatgttc ccatagtaac gccaataggg actttccatt 6360

gacgtcaatg ggtggagtat ttacggtaaa ctgcccactt ggcagtacat caagtgtatc 6420

atatgccaag tacgccccct attgacgtca atgacggtaa atggcccgcc tggcattatg 6480

cccagtacat gaccttatgg gactttccta cttggcagta catctacgta ttagtcatcg 6540

ctattaccat ggtcgaggtg agccccacgt tctgcttcac tctccccatc tcccccccct 6600

ccccaccccc aattttgtat ttatttattt tttaattatt ttgtgcagcg atgggggcgg 6660

gggggggggg ggggcgcgcg ccaggcgggg cggggcgggg cgaggggcgg ggcggggcga 6720

ggcggagagg tgcggcggca gccaatcaga gcggcgcgct ccgaaagttt ccttttatgg 6780

cgaggcggcg gcggcggcgg ccctataaaa agcgaagcgc gcggcgggcg ggagtcgctg 6840

cgttgccttc gccccgtgcc ccgctccgcc gccgcctcgc gccgcccgcc ccggctctga 6900

ctgaccgcgt tactcccaca ggtgagcggg cgggacggcc cttctcctcc gggctgtaat 6960

tagcgcttgg tttaatgacg gcttgtttct tttctgtggc tgcgtgaaag ccttgagggg 7020

ctccgggagg gccctttgtg cggggggagc ggctcggggg gtgcgtgcgt gtgtgtgtgc 7080

gtggggagcg ccgcgtgcgg ctccgcgctg cccggcggct gtgagcgctg cgggcgcggc 7140

gcggggcttt gtgcgctccg cagtgtgcgc gaggggagcg cggccggggg cggtgccccg 7200

cggtgcgggg ggggctgcga ggggaacaaa ggctgcgtgc ggggtgtgtg cgtggggggg 7260

tgagcagggg gtgtgggcgc gtcggtcggg ctgcaacccc ccctgcaccc ccctccccga 7320

gttgctgagc acggcccggc ttcgggtgcg gggctccgta cggggcgtgg cgcggggctc 7380

gccgtgccgg gcggggggtg gcggcaggtg ggggtgccgg gcggggcggg gccgcctcgg 7440

gccggggagg gctcggggga ggggcgcggc ggcccccgga gcgccggcgg ctgtcgaggc 7500

gcggcgagcc gcagccattg ccttttatgg taatcgtgcg agagggcgca gggacttcct 7560

ttgtcccaaa tctgtgcgga gccgaaatct gggaggcgcc gccgcacccc ctctagcggg 7620

cgcggggcga agcggtgcgg cgccggcagg aaggaaatgg gcggggaggg ccttcgtgcg 7680

tcgccgcgcc gccgtcccct tctccctctc cagcctcggg gctgtccgcg gggggacggc 7740

tgccttcggg ggggacgggg cagggcgggg ttcggcttct ggcgtgtgac cggcggctct 7800

agagcctctg ctaaccatgt tcatgccttc ttctttttcc tacagctcct gggcaacgtg 7860

ctggttattg tgctgtctca tcattttggc aaagaattga ttaattcgag cgaa 7914

<210> 13

<211> 4333

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> AAV9-CAG-omIDS

<400> 13

attacgccag ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg 60

ggcgaccttt ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa 120

ctccatcact aggggttcct tgtagttaat gattaacccg ccatgctact tatctactcg 180

acattgatta ttgactagtt attaatagta atcaattacg gggtcattag ttcatagccc 240

atatatggag ttccgcgtta cataacttac ggtaaatggc ccgcctggct gaccgcccaa 300

cgacccccgc ccattgacgt caataatgac gtatgttccc atagtaacgc caatagggac 360

tttccattga cgtcaatggg tggagtattt acggtaaact gcccacttgg cagtacatca 420

agtgtatcat atgccaagta cgccccctat tgacgtcaat gacggtaaat ggcccgcctg 480

gcattatgcc cagtacatga ccttatggga ctttcctact tggcagtaca tctacgtatt 540

agtcatcgct attaccatgg tcgaggtgag ccccacgttc tgcttcactc tccccatctc 600

ccccccctcc ccacccccaa ttttgtattt atttattttt taattatttt gtgcagcgat 660

gggggcgggg gggggggggg ggcgcgcgcc aggcggggcg gggcggggcg aggggcgggg 720

cggggcgagg cggagaggtg cggcggcagc caatcagagc ggcgcgctcc gaaagtttcc 780

ttttatggcg aggcggcggc ggcggcggcc ctataaaaag cgaagcgcgc ggcgggcggg 840

agtcgctgcg ttgccttcgc cccgtgcccc gctccgccgc cgcctcgcgc cgcccgcccc 900

ggctctgact gaccgcgtta ctcccacagg tgagcgggcg ggacggccct tctcctccgg 960

gctgtaatta gcgcttggtt taatgacggc ttgtttcttt tctgtggctg cgtgaaagcc 1020

ttgaggggct ccgggagggc cctttgtgcg gggggagcgg ctcggggggt gcgtgcgtgt 1080

gtgtgtgcgt ggggagcgcc gcgtgcggct ccgcgctgcc cggcggctgt gagcgctgcg 1140

ggcgcggcgc ggggctttgt gcgctccgca gtgtgcgcga ggggagcgcg gccgggggcg 1200

gtgccccgcg gtgcgggggg ggctgcgagg ggaacaaagg ctgcgtgcgg ggtgtgtgcg 1260

tgggggggtg agcagggggt gtgggcgcgt cggtcgggct gcaacccccc ctgcaccccc 1320

ctccccgagt tgctgagcac ggcccggctt cgggtgcggg gctccgtacg gggcgtggcg 1380

cggggctcgc cgtgccgggc ggggggtggc ggcaggtggg ggtgccgggc ggggcggggc 1440

cgcctcgggc cggggagggc tcgggggagg ggcgcggcgg cccccggagc gccggcggct 1500

gtcgaggcgc ggcgagccgc agccattgcc ttttatggta atcgtgcgag agggcgcagg 1560

gacttccttt gtcccaaatc tgtgcggagc cgaaatctgg gaggcgccgc cgcaccccct 1620

ctagcgggcg cggggcgaag cggtgcggcg ccggcaggaa ggaaatgggc ggggagggcc 1680

ttcgtgcgtc gccgcgccgc cgtccccttc tccctctcca gcctcggggc tgtccgcggg 1740

gggacggctg ccttcggggg ggacggggca gggcggggtt cggcttctgg cgtgtgaccg 1800

gcggctctag agcctctgct aaccatgttc atgccttctt ctttttccta cagctcctgg 1860

gcaacgtgct ggttattgtg ctgtctcatc attttggcaa agaattgatt aattcgagcg 1920

aacgcgtgct agcgccacca tgagcccacc tcccccaccc ccaatctggc ggcagctgag 1980

cttcagcctg ctgctgggca gcttctgtat cgccctggaa agcgccaagc ttgcccaggg 2040

caacagcgcc accgacgccc tgaacatcct gctgatcatc gtggacgacc tgaggcccag 2100

cctgggatgc tacggcgaca agctggtccg cagccccaac atcgaccagc tggcttctca 2160

cagcgtgctg ttccagaacg cattcgcaca gcaggccgtg tgcgccccca gcagagtgtc 2220

tttcctgacc ggcagaaggc ccgacaccac cagactgtac gacttcaaca gctactggcg 2280

ggtgcacagc ggcaacttca gcaccatccc ccagtacttc aaagaaaacg gctacgtgac 2340

catgagcgtg ggcaaggtgt tccaccccgg catcagcagc aaccacagcg acgactaccc 2400

ctacagctgg tccttcccac cctaccaccc cagcagcgag aagtacgaga acaccaagac 2460

ctgcaagggc caggacggca agctgcacgc caacctgctg tgccctgtgg acgtggcaga 2520

cgtgccagag ggaaccctgc ctgacaagca gagcaccgag gaagccatca gactgctgga 2580

aaagatgaag accagcgcca gccccttctt cctggccgtg ggctaccaca agccccacat 2640

ccctttcaga taccccaaag agttccagaa gctgtacccc ctggaaaaca tcaccctggc 2700

ccccgacccc cacgtgccag attctctgcc ccccgtggcc tacaacccct ggatggatat 2760

ccgcgagcgc gaggacgtgc aggctctgaa catcagcgtg ccctacggcc ctatccccga 2820

ggacttccag agaaagatca gacagagcta cttcgccagc gtgtcctacc tggacaccca 2880

agtgggacac gtgctgagcg ccctggacga tctgagactg gcccacaaca ccatcattgc 2940

cttcaccagc gaccacggct gggctctggg agagcacggc gagtgggcca agtacagcaa 3000

cttcgacgtg gccaccagag tgcccctgat gctgtacgtg cccggcagaa ccgcccctct 3060

gcctgccgct ggacagaagc tgttccctta ccgggacccc ttcgaccccg ccagcgattg 3120

gatggacgcc ggcagacaca ccgaggacct ggtggaactg gtgtccctgt tccccaccct 3180

ggccggactg gctggactgc ctgtgccccc cagatgcccc atccctagct tccacgtcga 3240

actgtgcaga gagggccaga acctgcagaa acatctgcag ctgcacgacc tggaagagga 3300

acccgacctg ttcggcaacc ccagagagct gatcgcctac agccagtacc ccagacccgc 3360

cgacttcccc cagtggaaca gcgacaagcc cagcctgaac gacatcaaag tgatgggcta 3420

cagcatcagg accgtggact acagatacac cgtgtgggtc ggattcgacc ccagcgagtt 3480

cctggccaac ttcagcgaca tccacgccgg cgagctgtac ttcgtggaca gcgaccccct 3540

gcaggaccac aacgtgtaca acgacagcca gcacggcggc ctgctgcaca gcctgaggcc 3600

ttgagcggcc gcgaattcga gctcggtacc cgggaatcaa ttcactcctc aggtgcaggc 3660

tgcctatcag aaggtggtgg ctggtgtggc caatgccctg gctcacaaat accactgaga 3720

tctttttccc tctgccaaaa attatgggga catcatgaag ccccttgagc atctgacttc 3780

tggctaataa aggaaattta ttttcattgc aatagtgtgt tggaattttt tgtgtctctc 3840

actcggaagg acatatggga gggcaaatca tttaaaacat cagaatgagt atttggttta 3900

gagtttggca acatatgccc atatgctggc tgccatgaac aaaggttggc tataaagagg 3960

tcatcagtat atgaaacagc cccctgctgt ccattcctta ttccatagaa aagccttgac 4020

ttgaggttag atttttttta tattttgttt tgtgttattt ttttctttaa catccctaaa 4080

attttcctta catgttttac tagccagatt tttcctcctc tcctgactac tcccagtcat 4140

agctgtccct cttctcttat ggagatccct cgacctgcag cccaagctgt agataagtag 4200

catggcgggt taatcattaa ctacaaggaa cccctagtga tggagttggc cactccctct 4260

ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggctttgc ccgggcggcc tcagtgagcg 4320

agcgagcgcg cag 4333

<210> 14

<211> 646

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CAG promoter

<400> 14

actagttatt aatagtaatc aattacgggg tcattagttc atagcccata tatggagttc 60

cgcgttacat aacttacggt aaatggcccg cctggctgac cgcccaacga cccccgccca 120

ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa tagggacttt ccattgacgt 180

caatgggtgg agtatttacg gtaaactgcc cacttggcag tacatcaagt gtatcatatg 240

ccaagtacgc cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc ccgcctggca ttatgcccag 300

tacatgacct tatgggactt tcctacttgg cagtacatct acgtattagt catcgctatt 360

accatggtcg aggtgagccc cacgttctgc ttcactctcc ccatctcccc cccctcccca 420

cccccaattt tgtatttatt tattttttaa ttattttgtg cagcgatggg ggcggggggg 480

gggggggggc gcgcgccagg cggggcgggg cggggcgagg ggcggggcgg ggcgaggcgg 540

agaggtgcgg cggcagccaa tcagagcggc gcgctccgaa agtttccttt tatggcgagg 600

cggcggcggc ggcggcccta taaaaagcga agcgcgcggc gggcgg 646

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Forward Primer

<400> 15

ttttgtgtac tccaaccccg 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Reverse Primer

<400> 16

tgtctgcata acagcccagg 20

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Reverse Primer Mutation

<400> 17

gccctcacat tgccaaagga 20

<---

Группа изобретений относится к биотехнологии и фармацевтике. Выделенная нуклеиновая кислота имеет нуклеотидную последовательность, кодирующую белок идуронат-2-сульфатазу, представленный в SEQ ID NO:1, где указанная нуклеотидная последовательность выбрана из SEQ ID NO:5 и SEQ ID NO:8, для применения в качестве лекарственного средства для лечения мукополисахаридоза II типа. Представлены варианты плазмид, рекомбинантный вектор на основе аденоассоциированного вируса серотипа 9 для применения в качестве лекарственного средства для лечения мукополисахаридоза II типа. Фармацевтическая композиция содержит терапевтически эффективное количество нуклеиновой кислоты, плазмиду или рекомбинантный вектор для применения в качестве лекарственного средства для лечения мукополисахаридоза II типа. Способ получения векторов включает следующие стадии. Обеспечивают первый вектор, содержащий нуклеотидную последовательность, выбранную из SEQ ID NO:5 и SEQ ID NO:8, расположенную между первым концевым повтором AAV и вторым концевым повтором AAV, промотор CAG, функционально связанный с нуклеотидной последовательностью; второй вектор, содержащий rep-ген AAV и cap-ген AAV из серотипа 9; и третий вектор, содержащий ген хелперного функционального элемента аденовируса. Осуществляют котрансфекцию компетентных клеток указанными векторами. Культивируют трансфицированные клетки и очищают векторы экспрессии от культуры. Способ получения плазмиды включает следующие стадии. Осуществляют эксцизию нуклеотидной последовательности из исходной плазмиды в результате переваривания при помощи Mlul/EcoRI. Клонируют нуклеотидную последовательность, выбранную из SEQ ID NO:5 и SEQ ID NO:8, между двумя сайтами рестрикции базовой плазмиды на основе AAV pAAV-CAG. Выделенная клетка содержит нуклеиновую кислоту для лечения мукополисахаридоза II типа. Группа изобретений обеспечивает новые последовательности, которые используют для лечения мукополисахаридоза II типа. 8 н. и 5 з.п. ф-лы, 14 пр., 47 ил.

1. Выделенная нуклеиновая кислота, имеющая нуклеотидную последовательность, кодирующую белок идуронат-2-сульфатазу (IDS), представленный в SEQ ID NO:1, где указанная нуклеотидная последовательность выбрана из SEQ ID NO:5 и SEQ ID NO:8, для применения в качестве лекарственного средства для лечения мукополисахаридоза II типа.

2. Плазмида, которая представляет собой вариант 1 pAAV-CAG-оhIDS с номером доступа DSM 29867, представленный в SEQ ID NO:6, содержащая нуклеиновую кислоту по п.1, имеющую нуклеотидную последовательность варианта 1 оhIDS, представленного в SEQ ID NO:5, функционально связанная с ранним энхансерным элементом цитомегаловируса и промотором CAG β-актина цыпленка для применения в качестве лекарственного средства для лечения мукополисахаридоза II типа.

3. Плазмида, которая представляет собой вариант 2 pAAV-CAG-оhIDS с номером доступа DSM 29868, представленный в SEQ ID NO:9, содержащая нуклеиновую кислоту по п.1, имеющую нуклеотидную последовательность варианта 2 оhIDS, представленного в SEQ ID NO:8, функционально связанная с ранним энхансерным элементом цитомегаловируса и промотором CAG β-актина цыпленка для применения в качестве лекарственного средства для лечения мукополисахаридоза II типа.

4. Рекомбинантный вектор на основе аденоассоциированного вируса серотипа 9, вектор AAV9, содержащий нуклеиновую кислоту по п.1, для применения в качестве лекарственного средства для лечения мукополисахаридоза II типа.

5. Рекомбинантный вектор по п.4, который представляет собой вариант 1 AAV9-CAG-оhIDS, содержащий нуклеотидную последовательность варианта 1 оhIDS, представленный в SEQ ID NO:5, функционально связанный с ранним энхансерным элементом цитомегаловируса и промотором CAG β-актина цыпленка CAG с SEQ ID NO:14.

6. Рекомбинантный вектор по п.4, который представляет собой вариант 2 AAV9-CAG-оhIDS, содержащий нуклеотидную последовательность варианта 2 оhIDS, представленный в SEQ ID NO:8, функционально связанный с ранним энхансерным элементом цитомегаловируса и промотором CAG β-актина цыпленка CAG с SEQ ID NO:14.

7. Фармацевтическая композиция, содержащая терапевтически эффективное количество нуклеиновой кислоты по п.1, плазмиду по любому из пп.2-3 или рекомбинантный вектор по любому из пп.4-6, для применения в качестве лекарственного средства для лечения мукополисахаридоза II типа.

8. Фармацевтическая композиция по п.7 для внутривенного или интрацистернального введения.

9. Нуклеиновая кислота по п.1, плазмида по любому из пп.2-3 или рекомбинантный вектор по любому из пп.4-6 для лечения мукополисахаридоза II типа.

10. Нуклеиновая кислота по п.1, плазмида по любому из пп.2-3 или рекомбинантный вектор по любому из пп.4-6 для повышения активности идуронат-2-сульфатазы.

11. Способ получения векторов, определенных в любом из пп.4-6, предусматривающий стадии:

i) обеспечения первого вектора, содержащего нуклеотидную последовательность по п.1, выбранную из SEQ ID NO:5 и SEQ ID NO:8, расположенную между первым концевым повтором AAV и вторым концевым повтором AAV, промотора CAG, функционально связанного с нуклеотидной последовательностью по п.1; второго вектора, содержащего rep-ген AAV и cap-ген AAV из серотипа 9; и третьего вектора, содержащего ген хелперного функционального элемента аденовируса;

ii) котрансфекции компетентных клеток векторами из стадии i);

iii) культивирования трансфицированных клеток стадии ii); и

iv) очистки векторов экспрессии от культуры из стадии iii).

12. Способ получения плазмиды по любому из пп.2-3, предусматривающий стадии:

i) эксцизии нуклеотидной последовательности по п.1 из исходной плазмиды, в результате переваривания при помощи Mlul/EcoRI,

ii) клонирования нуклеотидной последовательности по п.1, выбранную из SEQ ID NO:5 и SEQ ID NO:8, между двумя сайтами рестрикции базовой плазмиды на основе AAV pAAV-CAG, тем самым получения соответствующей плазмиды, включающей нуклеотидную последовательность по п.1.

13. Выделенная клетка, содержащая нуклеиновую кислоту по п.1, для лечения мукополисахаридоза II типа.