АДЕНОАССОЦИИРОВАННЫЕ ВИРУСНЫЕ ВЕКТОРЫ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ МУКОПОЛИСАХАРИДОЗОВ ТИПА IV A Российский патент 2023 года по МПК C12N9/16 C12N15/864 

ОПИСАНИЕ

Область техники, к которой относится настоящее изобретение

Настоящее изобретение относится к полинуклеотидным последовательностям и векторам, полезным для экспрессии представляющих интерес белков, и их применению в генной терапии. Настоящее изобретение также относится к векторам и последовательностям нуклеиновых кислот, полезным для лечения мукополисахаридозов (MPS), в частности для лечения мукополисахаридозов типа IVA или синдрома Моркио А.

Предшествующий уровень техники настоящего изобретения

Лизосома представляет собой органеллу, находящуюся в цитоплазме клеток животных, которая содержит более 50 гидролаз, которые расщепляют биомолекулы в ходе рециклинга отработавших клеточных компонентов или после поглощения вирусов и бактерий. Эта органелла содержит несколько типов гидролитических ферментов, включая протеазы, нуклеазы, гликозидазы, липазы, фосфолипазы, фосфатазы и сульфатазы. Все ферменты представляют собой кислые гидролазы.

Лизосомные болезни накопления (LSD) вызваны генетическими дефектами, которые затрагивают один или более лизосомальных ферментов. Эти генетические заболевания возникают обычно в результате недостаточной активности конкретного фермента, присутствующего в лизосоме. В меньшей степени эти заболевания могут быть обусловлены нехваткой белков, вовлеченных в биогенез лизосом.

LSD являются редкими для индивидуумов заболеваниями, хотя в виде группы таких нарушений они относительно обычны в общей популяции. Суммарная распространенность LSD составляет приблизительно 1 на 5000 живых новорожденных. Однако некоторые группы в пределах общей популяции особенно страдают от высокой встречаемости LSD. Например, коэффициент распространенности болезней Гоше и Тея-Сакса у потомков, происходящих от евреев центральной и восточной Европы (ашкенази), составляет 1 на 600 и 1 на 3900 новорожденных, соответственно.

Мукополисахаридозы (MPS) представляют собой группу из семи заболеваний LSD, характеризующихся отсутствием или дефицитом определенного лизосомального фермента, участвующего в метаболизме глюкозаминогликанов (GAG). Все MPS имеют аутосомно-рецессивный характер наследования, за исключением MPSII (болезнь Гюнтера), которая имеет характер наследования, связанный с X хромосомой.

Из семи MPS, мукополисахаридоз типа IV (MPSIV или синдром Морки) имеет два подтипа А и В. Синдром Моркио А и В являются аутосомно-рецессивными наследственными заболеваниями, которые одинаково влияют на мужчин и женщин. Синдром Моркио А или MPSIVA представляет собой редкое заболевание, и существующие данные о распространенности скудны и изменчивы. Сообщаемые оценки варьируются от 1 на 76320 в Северной Ирландии до 1 на 641178 в Западной Австралии. MPSIVA вызывается дефицитом одного из ферментов, участвующих в расщеплении GAG кератансульфата (KS) и хондроитин-6-сульфата (C6S). Был идентифицирован ген, кодирующий этот фермент, и сообщалось о различных мутациях.

MPSIVA вызван недостатком активности фермента N-ацетил-галактозамин-6-сульфатаза (GALNS, ЕС 3.1.6.4). GALNS представляет собой лизосомальный фермент, который гидролизует сульфатную сложноэфирную группу N-ацетилгалактозамин-6-сульфата на невосстанавливающем конце хондроитин-6-сульфата (C6S) и указанную группу галактоза-6-сульфата на невосстанавливающем конце кератансульфата (KS). Вследствие устойчивого накопления нерасщепленных C6S и KS происходит прогрессирующее клеточное повреждение, приводящее к мультисистемному заболеванию. В настоящее время в гене GALNS человека идентифицировано приблизительно 180 различных мутаций, приводящих к дефициту активности фермента GALNS.

Большинство KS и C6S продуцируются хондроцитами, и поэтому нерасщепленные субстраты накапливаются в основном в клетках и внеклеточном матриксе хряща. Это оказывает прямое влияние на развитие хрящей и костей, что приводит к системной дисплазии скелета. У пациентов с синдромом Моркио А клетки хрящевой ткани вакуолизируются, что приводит к аномальному хондрогенезу и/или эндохондральной оссификации. Большинство пациентов с MPSIVA рождаются практически здоровыми, а симптомы развиваются постепенно. Начальные симптомы распознаются в возрасте от 1 до 3 лет, а средний возраст постановки диагноза составляет приблизительно 4,7 года. Основные особенности скелета включают заметную карликовость туловища, гипоплазию зубовидного отростка, клиновидную грудную клетку, кифоз, сколиоз, наружное отклонение голени, дисплазию тазобедренных суставов, напряжение нижних ребер, гиперэластичность суставов и неправильную походку с тенденцией к падению. Другие потенциальные осложнения включают легочную недостаточность, порок клапанов сердца, потерю слуха, гепатомегалию, тонкое помутнение роговицы, грубые черты лица и широко расставленные зубы с аномально тонкой эмалью и частым кариесом. Пациенты с MPSIVA сохраняют интеллект. Скорость развития заболевания и фенотипические признаки различаются у разных пациентов. Фенотип MPSIVA определяется как тяжелый, если конечный рост составляет менее 120 см, как промежуточный, если конечный рост выше 120 см и ниже 140 см, и как мягкий, если конечный рост превышает 140 см для всех возрастов. Ожидаемая продолжительность жизни варьируется от второго десятилетия жизни до 70 лет. Эта вариабельность может быть связана с несколькими факторами, такими как характер мутации, этническая принадлежность или различия в медицинской помощи, которую получает пациент.

До недавнего времени не существовало одобренных способов лечения, специфичных для синдрома MPSIVA. Доступные способы лечения были симптоматическими и основывались на применении широкого спектра неспецифических лекарственных средств для профилактики и лечения осложнений заболевания. Однако за последние несколько лет для пациентов с MPSIVA стали доступны две основные терапевтические стратегии: заместительная ферментная терапия (ERT) и трансплантация гемопоэтических стволовых клеток (HSCT). Разработка обеих терапевтических стратегий основана на возможности перекрестной коррекции, основанной на том факте, что нормальные клетки секретируют значительные количества растворимых лизосомальных ферментов, меченных манноза-6-фосфатом (М6Р), таких как GALNS, которые впоследствии могут извлекаться из внеклеточного компартмента другими клетками через рецепторы М6Р на плазматической мембране и направляться на лизосомы. Кроме того, существует порог остаточной ферментативной активности, обычно очень низкий, выше которого клетка способна справляться с притоком субстрата, и заболевание не влияет на субъекты, что позволяет предположить, что восстановление нормальной активности не является обязательным условием для изменения клинического течения.

ERT была протестирована для MPSIVA на двух различных мышиных моделях заболевания (Tomatsu et al., 2008, 2010а, 2015). В этом исследовании дозу 250 Ед/г рекомбинантного мышиного GALNS (rGALNS) вводили еженедельно внутривенно или интраперитонеально мышам с MPSIVA в возрасте 0,5 и 12 недель. Через неделю после последней дозы мыши с MPSIVA показали заметное снижение накопления GAG во внутренних органах, выстилающих клетках синуса в костном мозге, сердечных клапанах, связках и соединительных тканях, а также заметное снижение уровня KS в крови, что свидетельствует о соматической коррекции посредством инфузии rGALNS.

В 2014 году рекомбинантный человеческий GALNS, коммерциализированный как Elosulfase alfa, VIMIZIM^® (BioMarin Pharmaceutical Inc), был одобрен Управлением по контролю за качеством пищевых продуктов и медикаментов (FDA) и Европейским агентством по лекарственным средствам (ЕМА) для лечения MPSIVA. Лечение проводилось еженедельно в дозе 2 мг/кг внутривенной инфузией, со средней продолжительностью инфузии 3,5-4,5 часа. Возраст включенных пациентов составлял от 5 до 57 лет. На момент включения в исследование все включенные пациенты могли пройти от 30 до 325 м в тесте на 6-минутную ходьбу (6MWT) (Sanford and Lo, 2014). Первичный критерий оценки был установлен как изменение пройденного расстояния по сравнению с исходным согласно 6MWT на 24 неделе после начала лечения. Второстепенные критерии оценки включали изменения по сравнению с исходным уровнем скорости подъема по лестнице за три минуты (3MSCT) и уровня KS в моче на 24 неделе. Пациентов разделяли на две группы лечения: пациенты, которые получали VIMIZIM^® в еженедельной дозе 2 мг/кг, и пациенты, которые получали 2 мг/кг один раз в две недели. У пациентов, получавших VIMIZIM^® в дозе 2 мг/кг еженедельно, пройденное расстояние согласно 6MWT было увеличено до 22,5 м по сравнению с группой плацебо через 24 недели после начала лечения. Однако не было никакой разницы в скорости подъема по лестнице у пациентов, получавших VIMIZIM^®. Более того, не наблюдалось дальнейшего улучшения способности ходить по сравнению с первыми 24 неделями лечения. С другой стороны, не было различий согласно 6MWT и 3MSCT у пациентов, получавших VIMIZIM^® в дозе 2 мг/кг один раз в две недели, по сравнению с группой плацебо. Снижение уровня KS в моче по сравнению с исходным уровнем, показатель фармакодинамического эффекта, было больше во всех группах лечения VIMIZIM^® (2014). Пациенты, которые изначально были включены в плацебо-контролируемое исследование, впоследствии имели право начать лечение VIMIZIN^® в открытом расширенном исследовании (MOR-005).

Из-за возможной гиперчувствительности к VIMIZIM^® во время приема продукта была доступна медицинская поддержка. В ходе исследования наиболее серьезными описанными побочными эффектами были анафилактические реакции и реакции гиперчувствительности, которые могли появиться в любое время в ходе инфузии VIMIZIM^® или в течение до 3 часов после приема продукта. Пациенты с острым респираторным заболеванием могут подвергаться повышенному риску и требовать дополнительного наблюдения. Такие анафилактические реакции, которые могут поставить под угрозу жизнь пациента, включают кашель, сыпь, стеснение в горле, крапивницу, гиперемию, изменения цвета кожи, низкое кровяное давление, одышку, боль в груди и желудочно-кишечные симптомы, такие как тошнота, боль в животе, рвотные позывы и рвота (http://vimizim.com). К другим недостаткам ERT относятся: 1) сложность проведения 3,5-4,5-часовой внутривенной инфузии педиатрическим пациентам, 2) тот факт, что у 100% пациентов, получавших VIMIZIM^® в дозе 2 мг/кг один раз в неделю, выработались антитела против лекарственного средства через 4 недели, 3) у всех протестированных пациентов выработались нейтрализующие антитела, способные ингибировать связывание лекарственного средства с манноза-6-фосфатным рецептором по меньшей мере один раз в ходе исследования, и 4) высокая стоимость терапии, которая включает также расходы на уход на дому (2014).

Для трансплантации гемопоэтических стволовых клеток (HSCT) с использованием стволовых клеток костного мозга (трансплантация костного мозга, ВМТ) была доказана эффективность в лечении как соматической, так и неврологической патологии у пациентов с другими MPS. Основным недостатком коррекции фенотипа с помощью HSCT является минимальное влияние лечения нарост пациентов с MPSIVA (Chinen et al., 2014; Wang et al., 2016; Yabe et al., 2016).

Из-за ограничений существующих в настоящее время терапевтических возможностей для MPSIVA необходимы альтернативные подходы.

Генная терапия in vivo предлагает возможность проводимого один раз лечения MPSIVA и других наследственных заболеваний с перспективой пожизненного положительного эффекта.

Доклинические исследования генной терапии синдрома Моркио А в основном основывались на введении векторов на основе γ-ретровирусов, лентивирусов и аденоассоциированных вирусов.

In vitro трансдукция человеческих лимфобластоидных В-клеток MPSIVA, человеческих кератиноцитов, мышиных миобластов и кроличьих синовиоцитов с помощью векторов на основе γ-ретровируса, кодирующих ген GALNS человека, привела к увеличению ферментативной активности GALNS, что привело к снижению внутриклеточного накопления GAG (Toietta et al., 2001).

Введение векторов на основе лентивируса, кодирующих кДНК GALNS человека, в фибробласты кожи в случае синдрома Моркио А показало уровни активности фермента в 7,5 раз выше, чем у нетрансдуцированных фибробластов в случае MPSIVA, хотя и ниже, чем для фибробластов здорового человека. Использование векторов на основе лентивируса также привело к нормализации активности β-гексозаминидазы и β-галактозидазы, которые, как было раскрыто, являются вторичными биомаркерами синдрома Моркио A (Almeciga et al., 2013; Salazar et al., 2016).

В частности, перенос генов, опосредованный аденоассоциированным вирусным вектором (AAV), быстро становится приоритетным подходом для многих применений генной терапии in vivo благодаря высокой эффективности трансдукции и отсутствию патогенности этих векторов. AAV векторы могут трансдуцировать постмитотические клетки, и несколько доклинических и клинических исследований продемонстрировали потенциал опосредованного AAV векторами переноса генов для эффективного управления устойчивой экспрессией терапевтических трансгенов при различных заболеваниях.

Использование AAV векторов позволило оценить влияние совместной экспрессии GALNS и сульфатаза-модифицирующего фактора 1 (SUMF1) на активность фермента. Эта совместная экспрессия привела к 4-х кратному увеличению активности фермента в культурах клеток ( et al., 2010). In vivo введение векторов AAV-GALNS на мышиной модели синдрома Моркио А показало, что активность фермента в плазме восстанавливалась до 8,5% от уровней активности фермента дикого типа через 12 недель после однократного внутривенного введения, тогда как совместное введении с вектором AAV-SUMF1 привело к увеличению активности GALNS до 19% от уровней активности фермента дикого типа. Активность фермента GALNS также повышалась до 30% и 33% от уровней активности фермента дикого типа в сердце и костях, соответственно ( Javier, Adriana, Shunji Tomatsu, 2012).

Для улучшения доставки фермента GALNS в кости был разработан модифицированный AAV вектор, несущий короткий пептид на основе кислых аминокислот внутри вирусного капсида, чтобы придать вирусу сродство к гидроксиапатиту кости. Этот модифицированный AAV вектор, кодирующий GALNS, значительно увеличивал количество копий генома вектора и экспрессию трансгена в кости на мышиной модели MPSIVA и приводил к уровням активности GALNS, составляющим 42% от уровней активности фермента дикого типа ( Javier, Adriana, Shunji Tomatsu, 2012; Tomatsu et al., 2010b).

Ни один из вышеупомянутых подходов не позволил полностью восстановить активность N-ацетил-галактозамин-6-сульфатазы, не обеспечил полного устранения интрацитоплазматических включений или не скорректировал все клинические признаки MPSIVA. Таким образом, существует потребность в новых подходах для лечения MPSIVA, которые имеют лучшие профили эффективности и безопасности.

Краткое раскрытие настоящего изобретения

Настоящее изобретение относится к новым полинуклеотидным последовательностям и векторам для лечения мукополисахаридозов, в частности мукополисахаридозов типа IVA или синдрома Моркио А.

Согласно первому аспекту настоящее изобретение относится к новой выделенной полинуклеотидной последовательность, на от 75% до 90% идентичной нуклеотидной последовательности, как представлено в SEQ ID NO: 1, где указанная последовательность кодирует функциональную N-ацетил-галактозамин-6-сульфатазу человека.

Согласно другому аспекту настоящее изобретение относится к экспрессионному вектору, содержащему полинуклеотидную последовательность согласно настоящему изобретению.

Согласно другому аспекту настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей терапевтически эффективное количество полинуклеотидных последовательностей или вектора согласно настоящему изобретению.

Согласно еще одному аспекту настоящее изобретение относится к полинуклеотидной последовательности или вектору, или фармацевтической композиции, описанным в настоящем документе, для применения в качестве лекарственного средства, в частности для лечения мукополисахаридозов типа IVA или синдрома Моркио А.

Настоящее изобретение также относится к способу получения аденоассоциированного вирусного вектора согласно настоящему изобретению.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1. Создание pAAV-CAG-hGALNS и AAV9-CAG-hGALNS. (А) Схематическое представление плазмиды pAAV-CAG-hGALNS и ее компонентов. (В) Схематическое представление генома аденоассоциированного вектора, содержащего кодирующую последовательность hGALNS.

Фиг. 2. Создание pAAV-CAG-ohGALNS-v1 и AAV9-CAG-ohGALNS-v1. (А) Схематическое представление плазмиды pAAV-CAG-ohGALNS-v1 и ее компонентов. (В) Схематическое представление генома аденоассоциированного вектора, содержащего кодирующую последовательность ohGALNS-v1.

Фиг. 3. Создание pAAV-CAG-ohGALNS-v2 и AAV9-CAG-ohGALNS-v2. (А) Схематическое представление плазмиды pAAV-CAG-ohGALNS-v2 и ее компонентов. (В) Схематическое представление генома аденоассоциированного вектора, содержащего кодирующую последовательность ohGALNS-v2.

Фиг. 4. Создание pAAV-CAG-ohGALNS-v3 и AAV9-CAG-ohGALNS-v3. (А) Схематическое представление плазмиды pAAV-CAG-ohGALNS-v3 и ее компонентов. (В) Схематическое представление генома аденоассоциированного вектора, содержащего кодирующую последовательность ohGALNS-v3.

Фиг. 5. Создание pAAV-CAG-omGalns, AAV9-CAG-omGalns и AAV8-CAG-omGalns. (А) Схематическое представление плазмиды pAAV-CAG-omGalns и ее компонентов. (В) Схематическое представление генома аденоассоциированного вектора, содержащего кодирующую последовательность omGalns.

Фиг. 6. Создание pAAV-hAAT-omGalns и AAV8-hAAT-omGalns. (А) Схематическое представление плазмиды pAAV-hAAT-omGalns и ее компонентов. (В) Схематическое представление генома аденоассоциированного вектора, содержащего кодирующую последовательность omGalns.

Фиг. 7. Внутривенная доставка AAV9 векторов, кодирующих различные варианты Gains человека (AAV9-CAG-hGalns, AAV9-CAG-ohGalns-v1, AAV9-CAG-ohGalns-v2 и AAV9-CAG-ohGalns-v3) самцам мышей. Активность GALNS в (А) печени и (В) сыворотке мышей дикого типа (здоровых) (WT), необработанных Galns-/- мышей и Galns-/- мышей, которым было системно введено посредством внутривенной (IV) инъекции 5×10⁰ вг (вирусных геномов) каждого вектора в возрасте двух месяцев. Активность GALNS WT была установлена как 100%. Значения представляют собой средние значения ± SEM для 4-5 мышей на группу.

Фиг. 8. Внутривенная доставка AAV9 вектора, кодирующего оптимизированную мышиную Gains (AAV9-CAG-omGalns) самцам мышей. Активность GALNS в (А) печени, (В) бедренной кости, (С) жировой ткани мышей дикого типа (здоровых) (WT), необработанных Galns-/- мышей и Galns-/- мышей, которым было системно введено посредством внутривенной (IV) инъекции 1×10¹² вг AAV9-CAGomGalns в возрасте одного месяца. (D) Активность GALNS в сыворотке в различные моменты времени после инъекции для той же самой группы животных. Активность GALNS WT была установлена как 100%. Значения представляют собой средние значения ± SEM для 4-5 мышей на группу. *Р < 0,05, ****Р < 0,0001, по сравнению с Galns-/- необработанными мышами.

Фиг. 9. Внутривенная доставка AAV8 вектора, кодирующего оптимизированную мышиную Gains (AAV8-CAG-omGalns) самцам мышей. Активность GALNS в (А) печени, (В) бедренной кости, (С) жировой ткани мышей дикого типа (здоровых) (WT), необработанных Galns-/- мышей и Galns-/- мышей, которым было системно введено посредством внутривенной (IV) инъекции 1×10¹² вг AAV8-CAGomGalns в возрасте одного месяца. (D) Активность GALNS в сыворотке в различные моменты времени после инъекции для той же самой группы животных. Активность GALNS WT была установлена как 100%. Значения представляют собой средние значения ± SEM для 4-5 мышей на группу. *Р < 0,05, ****Р < 0,0001, по сравнению с Galns-/- необработанными мышами.

Фиг. 10. Внутривенная доставка AAV8 вектора, кодирующего оптимизированную мышиную Gains (AAV8-hAAT-omGalns) самцам мышей. Активность GALNS в (А) печени, (В) бедренной кости, (С) жировой ткани мышей дикого типа (здоровых) (WT), необработанных Galns-/- мышей и Galns-/- мышей, которым было системно введено посредством внутривенной (IV) инъекции 1×10¹¹ вг AAV8-hAAT-omGalns в возрасте одного месяца. (D) Активность GALNS в сыворотке в различные моменты времени после инъекции для той же самой группы животных. Активность GALNS WT была установлена как 100%. Значения представляют собой средние значения ± SEM для 4-5 мышей на группу. *Р < 0,05, ****Р < 0,0001, по сравнению с Galns-/- необработанными мышами.

Фиг. 11. Внутривенная доставка AAV9 и AAV8 векторов, кодирующих оптимизированную мышиную Gains (AAV9-CAG-omGalns, AAV8-CAG-omGalns и AAV8-hAATomGalns) самцам мышей. Количественное определение кератансульфата (KS) в (А) печени и (В) сыворотке посредством анализа LC-MS/MS. ****Р < 0,0001, по сравнению с Galns-/- необработанными самцами мышей.

Фиг. 12. Внутривенная доставка AAV9 и AAV8 векторов, кодирующих оптимизированную мышиную Gains (AAV9-CAG-omGalns, AAV8-CAG-omGalns и AAV8-hAATomGalns) самцам мышей. Гистопатология эпифизарной пластинки роста большеберцовой кости в секторах, окрашенных толуидиновым синим. Исходное увеличение 100×.

Фиг. 13. Внутривенная доставка AAV9 и AAV8 векторов, кодирующих оптимизированную мышиную Gains (AAV9-CAG-omGalns, AAV8-CAG-omGalns и AAV8-hAATomGalns) самцам Galns-/- мышей. (А) Количественное определение интенсивности окрашивания, достигнутой в эпителии роговицы после окрашивания по Моури для гликозаминогликанов. (В) Гистопатология слезной железы в секторах, окрашенных толуидиновым синим, мышей дикого типа (здоровых) (WT), необработанных Galns-/-мышей и Galns-/- мышей с системным введением посредством внутривенной (IV) инъекции. Исходное увеличение 40×. ***Р < 0,001, ****Р < 0,0001 по сравнению с Galns-/-необработанными самцами мышей.

Фиг. 14. Внутривенная доставка AAV9 векторов, кодирующих оптимизированную мышиную GALNS (AAV9-CAG-omGalns) самцам мышей. Анализ посредством трансмиссионной электронной микроскопии ультраструктуры зубчатой извилины и миндалевидной железы, полученных у 6-ти месячных здоровых WT и Galns-/- самцов, которым было системно введено 1×10¹² вг векторов, кодирующих оптимизированную мышиную Gains (AAV9-CAG-omGALNS). Удлиненные лизосомы в периваскулярных макрофагах (зубчатая извилина), окружающих нервную ткань глиальных клетках и эндотелиальных клетках (миндалевидная железа) показаны стрелкой.

Депонирование микроорганизмов

Плазмиды pAAV-CAG-hGALNS (SEQ ID NO: 2), pAAV-CAG-ohGALNS-v1 (SEQ ID NO: 4), pAAV-CAG-ohGALNS-v2 (SEQ ID NO: 6) и pAAV-CAG-ohGALNS-v3 (SEQ ID NO: 8) были задепонированы 19 апреля 2018 под номерами доступа DSM 32791, DSM 32792, DSM 32793 и DSM 32794, соответственно, в DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Inhoffenstraβe 7B, D-38124 Braunschweig, Federal Republic of Germany).

Определения

Термины «нуклеотидная последовательность» или «выделенная нуклеотидная последовательность», или «полинуклеотидная последовательность», или «полинуклеотид», или «выделенная полинуклеотидная последовательность» используются взаимозаменяемо в настоящем документе и относятся к молекуле нуклеиновой кислоты, либо ДНК, либо РНК, содержащей дезоксирибонуклеотиды или рибонуклеотиды, соответственно. Нуклеиновая кислота может быть двухцепочечной, одноцепочечной или содержать части как двухцепочечной, так и одноцепочечной последовательности.

Термины «% идентичности последовательностей», «% идентичности» или «% гомологии последовательностей» относятся к процентному содержанию нуклеотидов или аминокислот кандидатной последовательности, которые идентичны нуклеотидам или аминокислотами в эталонной последовательности после выравнивания последовательностей с достижением максимального % идентичности последовательностей. Согласно предпочтительному варианту осуществления идентичность последовательностей вычисляют на основе полной длины двух данных SEQ ID NO или их части. Процент (%) идентичности последовательностей может быть определен с помощью любых способов или алгоритмов, установленных в данной области техники, таких как алгоритмы ALIGN, BLAST и BLAST 2.0. См. Altschul S, et al., Nuc Acids Res. 1977;25:3389-3402 и Altschul S, et al., J Mol Biol. 1990;215:403-410.

В настоящем документе «% идентичности последовательностей», «% идентичности» или «% гомологии последовательностей» вычисляют путем деления количества нуклеотидов или аминокислот, которые после выравнивания идентичны для эталонной последовательности и кандидатной последовательности, на общее количество нуклеотидов или аминокислот в эталонной последовательности и умножения результата на 100.

При необходимости, при определении степени аминокислотного сходства квалифицированный специалист может также принять во внимание так называемые «консервативные» аминокислотные замены, как будет понятно специалисту в данной области техники. Консервативные аминокислотные замены основаны на взаимозаменяемости остатков, имеющих подобные боковые цепи. Например, группа аминокислот с алифатическими боковыми цепями включает глицин, аланин, валин, лейцин и изолейцин, группа аминокислот с алифатическими гидроксильными боковыми цепями включает серии и треонин, группа аминокислот с амид-содержащими боковыми цепями включает аспарагин и глутамин, группа аминокислот с ароматическими боковыми цепями включает фенилаланин, тирозин и триптофан, группа аминокислот с основными боковыми цепями включает лизин, аргинин и гистидин и группа аминокислот с серосодержащими боковыми цепями включает цистеин и метионин. Варианты замен в аминокислотной последовательности, раскрытой в настоящем документе, представляют собой варианты, в которых по меньшей мере один остаток в раскрытых последовательностях был удален, и на его место вставлен другой остаток. Предпочтительно аминокислотная замена является консервативной. Предпочтительные консервативные замены для каждой из встречающихся в природе аминокислот являются следующими: Ala на Ser, Arg на Lys, Asn на Gln или His, Asp на Glu, Cys на Ser или Ala, Gln на Asn, Glu на Asp, Gly на Pro, His на Asn или Gln, He на Leu или Val, Leu на Ile или Val, Lys на Arg, Gln на Glu, Met на Leu или Ile, Phe на Met, Leu или Tyr, Ser на Thr, Thr на Ser, Trp на Tyr, Tyr на Trp или Phe и Val на Ile или Leu.

Термин «кодировать» или «кодирование» относится к генетическому коду, который определяет как транслируется нуклеотидная последовательность в полипептид или белок. Порядок нуклеотидов в последовательности определяет порядок аминокислот в полипептиде или белке.

Термин «белок» относится к макромолекуле, состоящей из одной или нескольких линейных цепей аминокислот или полипептидов. Белки могут претерпевать посттрансляционные модификации, такие как превращение цистеинового остатка в 3-оксоаланин, гликозилирование или связывание металла. Гликозилирование белка представляет собой добавление различных углеводов, которые ковалентно связываются с аминокислотной цепью.

В контексте настоящего изобретения термин «транскрипционная регуляторная область» относится к фрагменту нуклеиновой кислоты, способному регулировать экспрессию одного или нескольких генов. Регуляторные области полинуклеотидов согласно настоящему изобретению могут включать промотор, плюс элементы ответа, последовательности активатора и энхансера для связывания факторов транскрипции, чтобы способствовать связыванию РНК-полимеразы и вызывать экспрессию, и последовательности оператора или сайленсера, с которыми связываются репрессорные белки, чтобы блокировать присоединение РНК-полимеразы и предотвращать экспрессию.

Термин «промотор» следует понимать как фрагмент нуклеиновой кислоты, который функционирует, контролируя транскрипцию одного или нескольких полинуклеотидов, например, кодирующие последовательности, которые расположены в направлении 5' от полинуклеотидной последовательности (последовательностей): и который структурно идентифицируется по присутствию сайта связывания для ДНК-зависимой РНК-полимеразы, сайтов инициации транскрипции и без ограничения сайтов связывания для факторов транскрипции, репрессоров и любых других нуклеотидных последовательностей, которые, как известно в данной области техники, действуют прямо или косвенно, регулируя степень транскрипции из промотора.

Промотор считается активным или управляющим экспрессией нуклеотидной последовательности, функционально связанной с ним, когда он может инициировать транскрипцию указанной нуклеотидной последовательности в экспрессионной системе с использованием генной конструкции, содержащей указанный промотор, функционально связанный с представляющей интерес нуклеотидной последовательностью, с использованием подходящего анализа, такого как ОТ-кПЦР или Нозерн-блоттинг (обнаружение транскрипта). Активность указанного промотора также можно оценить на уровне белка с помощью подходящего анализа для кодируемого белка, такого как Вестерн-блоттинг или ELISA. Промотор считается способным инициировать транскрипцию, если транскрипт может быть обнаружен, или если обнаружено повышение уровня транскрипта или белка по меньшей мере на 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50. %, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 500%, 1000%, 1500% или 2000% по сравнению с транскрипцией с использованием конструкции, которая отличается только тем, что не содержит указанный промотор.

Термин «конститутивный» промотор относится к промотору, который активен при большинстве физиологических условиях и условиях развития. «Индуцибельный» промотор представляет собой промотор, который предпочтительно регулируется в зависимости от физиологических условий или условий развития. Индуцибельный промотор может быть активным после доставки лекарственного средства или воздействия света. Следовательно, «конститутивный» промотор не регулируется в смысле «индуцибельного» промотора. «Тканеспецифичный» промотор предпочтительно активен в определенных типах клеток/тканей. Универсальный промотор может быть определен как промотор, который активен во многих или в любых различных тканях. Обычно «многие» в этом контексте означает более 5 или по меньшей мере 6, 10, 15, 20 или 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 разных тканей.

Термин промотор «CAG» относится к промотору, содержащему промотор β-актина цыпленка и энхансерный элемент цитомегаловируса (Alexopoulou A. et al. ВМС Cell Biology 2008; 9(2): 1-11). Более точно, указанный промотор CAG содержит (i) ранний энхансерный элемент цитомегаловируса (CMV), (ii) промотор бета-актина цыпленка, (iii) первый интрон гена бета-актина цыпленка и (iv) интрон 2/экзон 3 гена бета-глобина кролика.

Термин промотор «hAAT» относится к гибридному промотору, содержащему α1-антитрипсин человека и три копии энхансерного элемента области контроля печени (HCR) из аполипопротеина Е.

Термин «функционально связанный» относится к функциональному отношению и локализации промоторной последовательности по отношению к представляющему интерес гену (например, промотор или энхансер является функционально связанным с кодирующей последовательностью, если он воздействует на транскрипцию последовательности). Обычно функционально связанный промотор примыкает к представляющей интерес последовательности. Однако энхансер может быть не примыкающим к представляющей интерес последовательности для контроля ее экспрессии.

В контексте настоящего изобретения термин «пост-транскрипционная регуляторная область» относится к любому полинуклеотиду, который способствует экспрессии, стабилизации или локализации последовательностей, содержащихся в кассете, или конечного генного продукта.

В контексте настоящего изобретения термин «вектор» относится к конструкции, способной доставлять и необязательно экспрессировать один или несколько представляющих интерес полинуклеотидов в клетке-хозяине. Примеры векторов включают без ограничения вирусные векторы, экспрессионные векторы на основе голой ДНК или РНК, плазмидные, космидные или фаговые векторы, экспрессионные ДНК- или РНК-векторы, ассоциированные с катионными конденсирующими агентами, экспрессионные ДНК- или РНК-векторы, инкапсулированный в липосомы, и некоторые эукариотические клетки, такие как клетки-продуценты. Векторы могут быть стабильными и самореплицирующимися. Нет никаких ограничений относительно типа вектора, который можно использовать. Вектором может быть клонирующий вектор, подходящий для размножения и получения полинуклеотидов, генные конструкции или экспрессионные векторы, включенные в несколько гетерологичных организмов.

Согласно конкретному варианту осуществления указанный вектор представляет собой экспрессионный вектор. В контексте настоящего изобретения термин «экспрессионный вектор» относится к вектору, сконструированному для генной экспрессии в клетках, т.е. вектор используют для введения специфического гена в целевую клетку с получением белка, кодируемого геном.

Вектор согласно настоящему изобретению может содержать регуляторные последовательности, которые действуют как энхансерные и/или промоторные участки и приводят к эффективной транскрипции гена, который несет экспрессионный вектор. Подходящие векторы включают прокариотические экспрессионные векторы (например, pUC18, pUC19, Bluescript и их производные), mpl8, mpl9, pBR322, рМВ9, CoIE1, pCR1, RP4, фаги и «челночные» векторы (например, pSA3 и рАТ28), и эукариотические экспрессионные векторы на основе вирусных векторов (например, аденовирусы, аденоассоциированные вирусы, а также ретровирусы и лентивирусы), а также невирусные векторы, такие как pSilencer 4.1-CMV (Ambion^®, Life Technologies Corp., Carslbad, CA, US), pcDNA3, pcDNA3.1/hyg pHCMV/Zeo, pCR3.1, pEF1/His, pIND/GS, pRc/HCMV2, pSV40/Zeo2, pTRACER-HCMV, pUB6/V5-His, pVAX1, pZeoSV2, pCI, pSVL и pKSV-10, pBPV-1, pML2d и pTDT1.

Термин «рекомбинантная плазмида» или «плазмида» относится к небольшой кольцевой двухцепочечной самореплицирующейся молекуле ДНК, полученной с помощью методов генной инженерии, способной переносить представляющий интерес генетический материал в клетку, что приводит к продукции продукта, кодируемого этим генетическим материалом (например, белкового полипептида, пептида или функциональной РНК), в клетке-мишени. Кроме того, термин «рекомбинантная плазмида» или «плазмида» также относится к небольшой кольцевой двухцепочечной самореплицирующейся молекуле ДНК, полученной с помощью методов генной инженерии, используемой при получении вирусных векторов в качестве носителя рекомбинантного векторного генома.

Термин «рекомбинантный вирусный вектор» или «вирусный вектор» относится к агенту, полученному из природного вируса с помощью методов генной инженерии, способному переносить представляющий интерес генетический материал (например, ДНК или РНК) в клетку, что приводит к продукции продукта, кодируемого этим генетическим материалом (например, белкового полипептида, пептида или функциональной РНК), в клетке-мишени.

Термины «аденоассоциированный вирус», «AAV вирус», «AAV вирион», «AAV вирусная частица» и «AAV частица», используемые в настоящем изобретении как синонимы, относятся к вирусной частице, состоящей из по меньшей мере одного капсидного белка AAV (предпочтительно состоящей из всех капсидных белков определенного серотипа AAV) и инкапсулированного полинуклеотида, соответствующего геному AAV. AAV дикого типа относится к вирусу, который принадлежит к роду Dependovirus, семейству Parvoviridae. Геном AAV дикого типа имеет длину около 4,7 т.н. и состоит из одноцепочечной дезоксирибонуклеиновой кислоты (оцДНК), которая может быть смысловой или антисмысловой. Геном дикого типа включает инвертированные концевые повторы (ITR) на обоих концах цепи ДНК и три открытые рамки считывания (ORF). ORF Rep кодирует четыре белка Rep, необходимые для жизненного цикла AAV. ORF Сар содержит нуклеотидные последовательности, кодирующие капсидные белки VP1, VP2 и VP3, которые взаимодействуют с образованием капсида икосаэдрической симметрии. Наконец, ORF ААР, которая перекрывается с ORF Сар, кодирует белок ААР, который, как оказалось, способствует сборке капсида. Если частица содержит гетерологичный полинуклеотид (т.е. полинуклеотид, отличный от генома AAV дикого типа, такой как трансген, который должен быть доставлен в клетку млекопитающего), фланкированный ITR AAV, то он обычно известен как «AAV векторная частица» или «AAV вирусный вектор» или «AAV вектор». Настоящее изобретение также охватывает использование двухцепочечного AAV, также называемого dsAAV или scAAV.

В контексте настоящего изобретения термин «ITR аденоассоциированного вируса» или «ITR AAV» относится к инвертированным концевым повторам, присутствующим на обоих концах цепи ДНК генома AAV. Последовательности ITR необходимы для эффективного размножения генома AAV. Другим свойством этих последовательностей является их способность образовывать шпильку. Этот признак способствует их самопраймингу, что обеспечивает независимый от праймазы синтез второй цепи ДНК. Было также показано, что ITR необходимы как для интеграции ДНК AAV дикого типа в геном клетки-хозяина (например, в 19-ю хромосому человека для серотипа 2 AAV), так и для высвобождения из него, а также для эффективной инкапсидации ДНК AAV в полностью собранную, устойчивую к дезоксирибонуклеазе частицу AAV. Последовательности ITR имеют длину около 145 п.н. Предпочтительно, чтобы в геноме AAV вирусного вектора использовались полные последовательности ITR, хотя допустима некоторая незначительная модификация этих последовательностей. Последовательность ITR дикого типа может быть изменена путем вставки, делеции или усечения, до тех пор, пока ITR опосредует желаемые функции, например, репликацию, никование, упаковку вирусов, интеграцию и/или высвобождение провируса. Методики модификации этих ITR последовательностей хорошо известны в данной области техники. ITR может происходить из любого AAV дикого типа, включая без ограничения серотипы 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 или любой другой AAV, известный или обнаруженный позже. AAV содержит два ITR, которые могут быть одинаковыми или разными. Кроме того, два ITR AAV могут принадлежать к тому же серотипу AAV, что и капсид AAV, или могут быть отличными. Согласно предпочтительному варианту осуществления 5' и 3' ITR AAV происходят из AAV1, AAV2, AAV4, AAV5, AAV7, AAV8 и/или AAV9. Предпочтительно ITR происходят из AAV2, AAV8 и/или AAV9, причем AAV2 является наиболее предпочтительным. В одном варианте осуществления ITR AAV2 выбирают для создания псевдотипированного AAV (т.е. AAV, имеющего капсид и ITR, полученные из разных серотипов).

В контексте настоящего изобретения выражение «рекомбинантный вирусный геном» относится к геному AAV, в котором по меньшей мере один посторонний полинуклеотид вставлен в геном природного AAV. Геном AAV согласно настоящему изобретению обычно содержит цис-действующие 5' и 3' последовательности инвертированного концевого повтора (ITR) и экспрессионную кассету.

Термин «генная терапия» относится к переносу представляющего интерес генетического материала (например, ДНК или РНК) в клетку для лечения или профилактики генетического или приобретенного заболевания или состояния. Представляющий интерес генетический материал кодирует продукт (например, белок, полипептид, пептид или функциональную РНК), продукция которого in vivo желательна. Например, представляющий интерес генетический материал может кодировать фермент, гормон, рецептор или полипептид, имеющий терапевтическую ценность.

В контексте настоящего изобретения термин «трансдуцировать» или «трансдукция» относится к процессу, посредством которого чужеродная нуклеотидная последовательность вводится в клетку посредством вирусного вектора.

В контексте настоящего изобретения термин «трансфекция» относится к процессу преднамеренного введения очищенных нуклеиновых кислот не основанными на вирусах методами в эукариотические клетки.

В контексте настоящего изобретения термин «лечить» или «лечение» относится к введению соединения или композиции согласно настоящему изобретению для контроля развития заболевания. Под контролем развития заболевания понимается достижение положительных или желаемых клинических результатов, которые включают без ограничения уменьшение симптомов, сокращение продолжительности заболевания, стабилизацию патологических состояний (особенно во избежание дополнительного ухудшения), замедление прогрессирования заболевания, улучшение патологического состояния и ремиссию (как частичную, так и полную). Контроль развития заболевания также включает увеличение выживаемости по сравнению с выживаемостью, ожидаемой если лечение не применяется.

Термин «эффективное количество» относится к количеству вещества, достаточному для достижения предназначенной цели. Например, эффективное количество AAV вектора для повышения активности N-ацетил-галактозамин-6-сульфатазы (GALNS) представляет собой количество, достаточное для снижения накопления гликозаминогликанов. «Терапевтически эффективное количество» экспрессионного вектора для лечения заболевания или нарушения представляет собой количество экспрессионного вектора, достаточное для снижения или устранения признаков или симптомов заболевания или нарушения. Эффективное количество данного вещества должно варьироваться в связи с такими факторами, как природа вещества, путь введения, размер и вид животного, получающего вещество, и цель назначения вещества. Эффективное количество в каждом индивидуальном случае может быть определено эмпирически специалистом в данной области техники в соответствии со способами, принятыми в данной области техники.

Термин «индивидуум» относится к млекопитающему, предпочтительно к человеку или млекопитающему, не являющемуся человеком, более предпочтительно к мыши, крысе, другим грызунам, кролику, собаке, кошке, свинье, корове, лошади или примату, еще более предпочтительно к человеку.

Подробное раскрытие настоящего изобретения

Настоящее изобретение обеспечивает новые полинуклеотидные последовательности и векторы для лечения мукополисахаридозов, в частности мукополисахаридозов типа IVA или синдрома Моркио А.

Таким образом, согласно первому аспекту настоящее изобретение относится к выделенной полинуклеотидной последовательности (далее указывается в настоящем документе как «полинуклеотид согласно настоящему изобретению»), на от 75% до 90% идентичной нуклеотидной последовательности, как представлено в SEQ ID NO: 1, где указанная последовательность кодирует функциональную N-ацетил-галактозамин-6-сульфатазу человека.

Как указано выше, MPSIVA вызван недостатком активности фермента N-ацетил-галактозамин-6-сульфатазы (GALNS). GALNS представляет собой лизосомальный фермент, который гидролизует сульфатную сложноэфирную группу N-ацетилгалактозамин-6-сульфата на невосстанавливающем конце хондроитин-6-сульфата (C6S) и указанную группу галактоза-6-сульфата на невосстанавливающем конце кератансульфата (KS). Вследствие устойчивого накопления нерасщепленных C6S и KS происходит прогрессирующее клеточное повреждение, приводящее к мультисистемному заболеванию.

Авторы настоящего изобретения показали, что in vivo введение векторов, содержащих различные варианты кассеты, экспрессирующей N-ацетил-галактозамин-6-сульфатазу (GALNS) человека, где последовательность, кодирующая указанную GALNS, на от 75% до 90% идентична нуклеотидной последовательности дикого типа, кодирующей GALNS, приводит к существенному повышению активности GALNS по сравнению с уровнями, измеренными у животных с MPSIVA. Действительно, уровни активности GALNS человека, достигаемые с помощью экспрессионных векторов, содержащих последовательности, на от 75% до 90% идентичные последовательности дикого типа, были выше, чем уровни, опосредованные вектором, содержащим последовательность дикого типа.

Настоящее изобретение также охватывает полинуклеотидные последовательности, на от 75% до 90% идентичные нуклеотидной последовательности, кодирующей GALNS дикого типа, как представлено в SEQ ID NO: 1, где указанные последовательности кодируют функциональные варианты и фрагменты GALNS человека, известные в данной области техники. Таким образом, настоящее изобретение следует толковать как включающее ДНК, кодирующую функционально эквивалентные варианты GALNS.

В контексте настоящего изобретения термин «функционально эквивалентный вариант» относится к любому ферменту, по существу гомологичному ферменту, кодируемому полипептидной последовательностью GALNS, который сохраняет биологическую активность GALNS. Последовательность таких функционально эквивалентных вариантов может быть получена из последовательности GALNS посредством вставки, замены или делеции одной или нескольких аминокислот, и по существу сохраняет биологическую активность GALNS. Способы определения того, сохраняет ли вариант биологическую активность нативной GALNS, широко известны специалистам и включают любой из анализов, используемых в экспериментальной части настоящей заявки. В частности, функционально эквивалентные варианты GALNS, охватываемые настоящим изобретением, имеют по меньшей мере одну из функций GALNS, такую как, например, нормализация или снижение уровней гликозаминогликана (GAG), в частности уровней C6S и KS. В разделе «Примеры» настоящей заявки подробно описан способ, подходящий для определения способности функционального фермента GALNS снижать или нормализовать уровни указанных GAG.

Как показано в примерах, приведенных в настоящей заявке, полинуклеотидные последовательности согласно настоящему изобретению кодируют функциональные ферменты GALNS. Указанные ферменты проявляют повышенную активность по сравнению с ферментом WT. Результаты показывают восстановление активности GALNS после введения вектора, что приводит к существенному увеличению активности N-ацетил-галактозамин-6-сульфатазы по сравнению с уровнями, измеренными у животных с MPSIVA. Как показано в примерах, приведенных в настоящей заявке, уровни активности GALNS находятся в диапазоне от 1500% до 2600% от уровней фермента WT в печени.

Согласно предпочтительному варианту осуществления полипептид рассматривается как функционально эквивалентный вариант фермента GALNS, если он проявляет способность к функциям, упомянутым выше, в частности, если он способен разрушать гликозаминогликаны кератансульфат (KS) и хондроитин-6-сульфат (C6S) со способностью, составляющей по меньшей мере 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 100% от способности полипептида GALNS дикого типа, предпочтительно со способностью, составляющей по меньшей мере 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 100% от способности полипептида GALNS дикого типа.

Функционально эквивалентные варианты GALNS могут быть получены путем замены нуклеотидов в кодирующем ее полинуклеотиде с учетом предпочтения кодонов в клетке-хозяине, которая будет использоваться для продукции GALNS.

Функционально эквивалентные варианты GALNS могут быть созданы путем консервативных аминокислотных замен и тестирования полученного варианта в одном из функциональных анализов, описанных выше, или других функциональных анализах, известных в данной области техники. Консервативные аминокислотные замены основаны на взаимозаменяемости остатков, имеющих подобные боковые цепи. Например, группа аминокислот с алифатическими боковыми цепями включает глицин, аланин, валин, лейцин и изолейцин, группа аминокислот с алифатическими гидроксильными боковыми цепями включает серии и треонин, группа аминокислот с амид-содержащими боковыми цепями включает аспарагин и глутамин, группа аминокислот с ароматическими боковыми цепями включает фенилаланин, тирозин и триптофан, группа аминокислот с основными боковыми цепями включает лизин, аргинин и гистидин и группа аминокислот с серосодержащими боковыми цепями включает цистеин и метионин. Предпочтительными группами консервативных аминокислотных замен являются валин-лейцин-изолейцин, фенилаланин-тирозин, лизин-аргинин, аланин-валин и аспарагин-глутами.

Согласно конкретному варианту осуществления настоящего изобретения нуклеотидная последовательность, кодирующая белок GALNS или его функционально эквивалентный вариант, содержащаяся в полинуклеотиде согласно настоящему изобретению, на от 75% до 90% идентична нуклеотидной последовательности, как представлено в SEQ ID NO: 1. Согласно более конкретному варианту осуществления указанная нуклеотидная последовательность на от 80% до 85% идентична нуклеотидной последовательности, как представлено в SEQ ID NO: 1. Согласно более предпочтительному варианту осуществления указанная последовательность выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 7.

Согласно другому варианту осуществления настоящего изобретения белок GALNS, кодируемый полинуклеотидом согласно настоящему изобретению, выбран из группы, состоящей из GALNS человека (hGALNS) и мышиной GALNS (mGALNS), предпочтительно GALNS человека (hGALNS).

Полинуклеотид согласно настоящему изобретению может дополнительно содержать последовательности контроля экспрессии, включая без ограничения подходящие регуляторные последовательности транскрипции (т.е. инициация, терминацию, промотор и энхансер), эффективные сигналы процессинга РНК (например, сплайсинг и сигналы полиаденилирования (поли-А)), последовательности, которые стабилизируют цитоплазматическую мРНК, последовательности, которые усиливают эффективность трансляции (т.е. консенсусные последовательность Козака), последовательности, которые повышают стабильность белка, и, если желательно, последовательности, которые усиливают секрецию кодируемого продукта. Большое количество последовательностей контроля экспрессии известно в данной области техники и может быть использовано согласно настоящему изобретению.

Таким образом, согласно настоящему изобретению, согласно конкретному варианту осуществления полинуклеотид согласно настоящему изобретению имеет транскрипционную регуляторную область, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, кодирующей GALNS. Согласно конкретному варианту осуществления настоящего изобретения указанная транскрипционная регуляторная область содержит промотор. Согласно другому конкретному варианту осуществления настоящего изобретения транскрипционная регуляторная область полинуклеотида согласно настоящему изобретению дополнительно содержит энхансер, функционально связанный с промотором.

Полинуклеотид согласно настоящему изобретению может быть включен в вектор. Согласно конкретному варианту осуществления указанный вектор представляет собой экспрессионный вектор. Таким образом, согласно другому аспекту настоящее изобретение относится к экспрессионному вектору, указываемому в настоящем документе как «вектор согласно настоящему изобретению», содержащему полинуклеотид согласно настоящему изобретению. Согласно конкретному варианту осуществления указанный вектор представляет собой плазмиду. Согласно другому конкретному варианту осуществления указанный вектор представляет собой AAV вектор, причем указанный AAV вектор содержит рекомбинантный вирусный геном, содержащий полинуклеотид согласно настоящему изобретению.

Все варианты осуществления, раскрытые в контексте полинуклеотида согласно настоящему изобретению, также применимы для вектора согласно настоящему изобретению.

Согласно другому варианту осуществления полинуклеотидная последовательность согласно настоящему изобретению фланкирована инвертированными концевыми повторами аденоассоциированного вируса (ITR AAV). Согласно более конкретному варианту осуществления указанные ITR AAV представляют собой ITR AAV2.

Согласно другому варианту осуществления полинуклеотид согласно настоящему изобретению дополнительно содержит пост-транскрипционную регуляторную область. В контексте настоящего изобретения термин «пост-транскрипционная регуляторная область» относится к любому полинуклеотиду, который способствует экспрессии, стабилизации или локализации последовательностей, содержащихся в кассете, или конечного генного продукта. Пост-транскрипционной регуляторной областью может быть без ограничения пост-транскрипционная регуляторная область вируса гепатита сурков (WPRE). В контексте настоящего изобретения термин «пост-регуляторный элемент вируса гепатита В сурков» или «WPRE» относится к последовательности ДНК, которая, при транскрибировании, создает третичную структуру, способную усиливать экспрессию гена.

Согласно другому варианту осуществления полинуклеотидная последовательность согласно настоящему изобретению дополнительно содержит сигнал полиаденилирования.

В контексте настоящего изобретения термин «сигнал полиаденилирования» относится к последовательности нуклеиновой кислоты, которая опосредует присоединение полиаденинового хвоста к 3'-концу мРНК. Подходящие сигналы полиаденилирования включают без ограничения ранний сигнал полиаденилирования SV40, поздний сигнал полиаденилирования SV40, сигнал полиаденилирования тимидинкиназы HSV, сигнал полиаденилирования гена протамина, сигнал полиаденилирования аденовируса 5 Elb, сигнал полиаденилирования бычьего гормона роста, сигнал полиаденилирования человеческого варианта гормона роста, сигнал поли-А бета-глобина кролика и тому подобное. Согласно конкретному варианту осуществления сигнал полиаденилирования представляет собой сигнал поли-А бета-глобина кролика или его функциональные варианты или фрагменты.

Как указано выше, согласно конкретному варианту осуществления настоящего изобретения полинуклеотид согласно настоящему изобретению включен в вектор. Согласно конкретному варианту осуществления указанный вектор представляет собой экспрессионный вектор. Согласно конкретному варианту осуществления указанный экспрессионный вектор содержит промотороную последовательность, функционально связанную с указанной полинуклеотидной последовательностью. Указанный промотор может представлять собой конститутивный промотор или тканеспецифичный промотор. Согласно конкретному варианту осуществления указанный промотор выбран из промотора CAG, промотора hAAT или промотора CMV. Согласно предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения указанный промотор представляет собой промотор CAG. Согласно другому конкретному варианту осуществления указанный промотор представляет собой промотор hAAT.

Полинуклеотид согласно настоящему изобретению содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую GALNS или ее функционально эквивалентный вариант. Согласно варианту осуществления указанная нуклеотидная последовательность представляет собой нуклеотидную последовательность, кодирующую GALNS человека, которая соответствует последовательности из базы данных NCBI с номером доступа NM_000512.4, более конкретно представляет собой последовательность SEQ ID NO: 1. Согласно предпочтительному варианту осуществления нуклеотидная последовательность представляет собой вариант нуклеотидной последовательности, кодирующей GALNS человека. Более конкретно, указанная последовательность на от 75 до 90% идентична нуклеотидной последовательности, как представлено в SEQ ID NO: 1. Более конкретно, указанная последовательность на от 80 до 85% идентична нуклеотидной последовательности, как представлено в SEQ ID NO: 1. Предпочтительно, указанная последовательность представляет собой последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 7.

Согласно более конкретному варианту осуществления экспрессионный вектор согласно настоящему изобретению выбран из группы, состоящей из плазмиды pAAV-CAG-ohGALNS-v1 с номером доступа DSM 32792, как представлено в SEQ ID NO: 4, плазмиды pAAV-CAG-ohGALNS-v2 с номером доступа DSM 32793, как представлено в SEQ ID NO: 6, плазмиды pAAV-CAG-ohGALNS-v3 с номером доступа DSM 32794, как представлено в SEQ ID NO: 8.

Согласно другому конкретному варианту осуществления настоящее изобретение относится к экспрессионному вектору. Более конкретно, аденоассоциированному вирусному вектору или AAV вектору, причем AAV вектор содержит рекомбинантный вирусный геном, где указанный рекомбинантный вирусный геном содержит полинуклеотид, содержащий транскрипционную регуляторную область, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, кодирующей GALNS или ее функционально эквивалентный вариант.

AAV согласно настоящему изобретению включают любой серотип из известных серотипов AAV. В общем, разные серотипы AAV имеют геномные последовательности со значительной гомологией, обеспечивающей идентичный ряд генетических функций, продукцию вирионов, которые по существу эквивалентны в физическом и функциональном смысле и реплицируются и собираются посредством практически идентичных механизмов. В частности, AAV согласно настоящему изобретению может принадлежать к серотипу 1 AAV (AAV1), AAV2, AAV3 (включая типы 3А и 3В), AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV птиц, AAV крупного рогатого скота, AAV собаки, AAV лошади, AAV овцы и любые другие AAV. Примеры последовательностей генома различных серотипов AAV можно найти в литературе или в общедоступных базах данных, таких как GenBank. См. номера доступа в GenBank AF028704.1 (AAV6), NC006260 (AAV7), NC006261 (AAV8) и АХ753250.1 (AAV9). Согласно предпочтительному варианту осуществления AAV вектор согласно настоящему изобретению имеет серотип, выбранный из группы, состоящей из серотипов AAV2, AAV5, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10 и AAVrh10. Согласно предпочтительному варианту осуществления указанный AAV вектор согласно настоящему изобретению имеет серотип 9, AAV9, или серотип 8, AAV8.

Согласно конкретному варианту осуществления указанный AAV вектор содержит последовательность человеческой или мышиной GALNS. Согласно варианту осуществления указанный вектор содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую GALNS человека, которая соответствует последовательности из базы данных NCBI с номером доступа NM_000512.4, более конкретно представляет собой последовательность SEQ ID NO: 1. Согласно предпочтительному варианту осуществления указанный вектор содержит нуклеотидную последовательность, которая представляет собой вариант нуклеотидной последовательности, кодирующей GALNS человека. Более конкретно, указанная последовательность на от 75 до 90% идентична нуклеотидной последовательности, как представлено в SEQ ID NO: 1. Более конкретно, указанная последовательность на от 80 до 85% идентична нуклеотидной последовательности, как представлено в SEQ ID NO: 1. Предпочтительно, указанная последовательность представляет собой последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 7.

Согласно другому конкретному варианту осуществления настоящего изобретения AAV вектор представляет собой AAV9-CAG-hGALNS, SEQ ID NO: 12, которая содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1, связанную с промотором CAG. Согласно другому варианту осуществления AAV вектор представляет собой AAV9-CAG-ohGALNS-v1, SEQ ID NO: 13, содержащую нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 3, связанную с промотором CAG. Согласно другому варианту осуществления AAV вектор представляет собой AAV9-CAG-ohGALNS-v2, SEQ ID NO: 14, содержащую нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 5, связанную с промотором CAG. Согласно другому варианту осуществления AAV вектор представляет собой AAV9-CAG-ohGALNS-v3, SEQ ID NO: 15, содержащую нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 7, связанную с промотором CAG.

Согласно предпочтительному варианту осуществления AAV согласно настоящему изобретению содержит рекомбинантный вирусный геном, содержащий полинуклеотидную последовательность, содержащую в 5' - 3' направлении: (i) 5' ITR AAV2, (ii) предранний энхансер CMV, (iii) промотор бета-актина цыпленка, (iv) первый интрон гена бета-актина цыпленка, (v) интрон 2/экзон 3 из гена бета-глобина кролика, (vi) кДНК GALNS или ее функционально эквивалентный вариант, (vii) сигнал поли-А, такой как сигнал поли-А бета-глобина кролика, и (viii) 3' ITR AAV2. Специалистам в данной области понятно, что векторный геном может содержать другие последовательности (например, промежуточные последовательности между последовательностями, конкретно описанными выше). Компоненты (i) - (v) имеют значение, обычно понятное специалисту в данной области техники.

Согласно предпочтительному варианту осуществления рекомбинантный вирусный геном содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 12. В частности, 5' ITR AAV2 содержит нуклеотиды 1-131, промотор CAG содержит нуклеотиды 185-1707, кДНК GALNS человека содержит нуклеотиды 1918-3494, сигнал поли-А бета-глобина кролика содержит нуклеотиды 3520-4048, и 3' ITR AAV2 содержит нуклеотиды 4107-4215 последовательности SEQ ID NO: 12.

Согласно другому предпочтительному варианту осуществления рекомбинантный вирусный геном содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 13. В частности, 5' ITR AAV2 содержит нуклеотиды 1-131, промотор CAG содержит нуклеотиды 185-1707, кДНК GALNS человека содержит нуклеотиды 1918-3494, сигнал поли-А бета-глобина кролика содержит нуклеотиды 3520-4048, и 3' ITR AAV2 содержит нуклеотиды 4107-4215 последовательности SEQ ID NO: 13.

Согласно другому предпочтительному варианту осуществления рекомбинантный вирусный геном содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 14. В частности, 5' ITR AAV2 содержит нуклеотиды 1-120, энхансер CMV содержит нуклеотиды 194-557, промотор бета-актина содержит нуклеотиды 558-839, первый интрон гена бета-актина цыпленка содержит нуклеотиды 840-1804, интрон 2/экзон 3 гена бета-глобина кролика содержит нуклеотиды 1805-1906, кДНК GALNS человека содержит нуклеотиды 1934-3592, сигнал поли-А бета-глобина кролика содержит нуклеотиды 3619-4147, и 3' ITR AAV2 содержит нуклеотиды 4206-4313 последовательности SEQ ID NO: 14.

Согласно другому предпочтительному варианту осуществления рекомбинантный вирусный геном содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 15. В частности, 5' ITR AAV2 содержит нуклеотиды 1-120, энхансер CMV содержит нуклеотиды 194-557, промотор бета-актина содержит нуклеотиды 558-839, первый интрон гена бета-актина цыпленка содержит нуклеотиды 840-1804, интрон 2/экзон 3 гена бета-глобина кролика содержит нуклеотиды 1805-1906, кДНК GALNS человека содержит нуклеотиды 1934-3592, сигнал поли-А бета-глобина кролика содержит нуклеотиды 3619-4147, и 3' ITR AAV2 содержит нуклеотиды 4206-4313 последовательности SEQ ID NO: 15.

Модифицированные последовательности AAV также можно использовать в контексте настоящего изобретения. Такие модифицированные последовательности, например, включают последовательности, обладающие по меньшей мере приблизительно 70%, по меньшей мере приблизительно 75%, по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95% или более идентичностью нуклеотидной и/или аминокислотной последовательности (например, последовательность, обладающая приблизительно 75-99% идентичностью нуклеотидной или аминокислотной последовательности) с ITR AAV или VP любого из известных серотипов, которые поддерживают функцию указанных компонентов. Анализы для определения функции ITR AAV или VP известны в данной области техники. Указанные модифицированные последовательности можно использовать вместо последовательностей ITR AAV или VP дикого типа.

AAV вектор согласно настоящему изобретению содержит капсид любого серотипа. В общем, разные серотипы AAV имеют геномные последовательности со значительной гомологией на уровне аминокислот и нуклеиновых кислот, обеспечивающей идентичный ряд генетических функций, продукцию вирионов, которые по существу эквивалентны в физическом и функциональном смысле и реплицируются и собираются посредством практически идентичных механизмов. В частности, AAV согласно настоящему изобретению может принадлежать к серотипу 1 AAV (AAV1), AAV2, AAV3 (включая типы 3 А и ЗВ), AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV птиц, AAV крупного рогатого скота, AAV собаки, AAV лошади, AAV овцы и любые другие AAV. Примеры последовательностей генома различных серотипов AAV можно найти в литературе или в общедоступных базах данных, таких как GenBank. См. номера доступа в GenBank AF028704.1 (AAV6), NC006260 (AAV7), NC006261 (AAV8) и AX753250.1 (AAV9). Согласно предпочтительному варианту осуществления аденоассоциированный вирусный вектор согласно настоящему изобретению имеет серотип, выбранный из группы, состоящей из серотипов AAV2, AAV5, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10 и AAVrh10. Согласно более предпочтительному варианту осуществления указанный AAV представляет собой AAV серотипа 9, AAV9, или AAV серотипа 8, AAV8.

В геноме AAV вектора согласно настоящему изобретению отсутствуют открытые рамки считывания rep и cap. Такие AAV векторы могут быть реплицированы и упакованы только в инфекционные вирусные частицы в клетках-хозяевах, которые были трансфицированы вектором, кодирующим и экспрессирующим продукты генов rep и cap (т.е. AAV белки Rep и Сар), и где клетки-хозяева были транс фицированы вектором, который кодирует и экспрессирует белки из аденовируса.

Фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению

Полинуклеотид или экспрессионный вектор согласно настоящему изобретению можно вводить в организм человека или животного обычными способами, которые требуют его составления в виде фармацевтической композиции. Таким образом, согласно второму аспекту настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции (указываемой далее в настоящем документе как «фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению»), содержащей терапевтически эффективное количество полинуклеотида согласно настоящему изобретению или вектора согласно настоящему изобретению. Фармацевтическая композиция может дополнительно включать фармацевтически приемлемый носитель.

Все варианты осуществления, раскрытые в контексте полинуклеотида согласно настоящему изобретению или вектора согласно настоящему изобретению, также применимы для фармацевтических композиций согласно настоящему изобретению.

Термин «терапевтически эффективное количество» относится к количеству полинуклеотида, вектора или AAV вектора согласно настоящему изобретению, рассчитанному для получения желаемого эффекта, и, как правило, будет определяться, среди других причин, собственными признаками полинуклеотида, вектора или AAV вектора согласно настоящему изобретению и терапевтическим эффектом, который должен быть получен. Таким образом, указанное количество, которое будет эффективным при лечении заболевания, может быть определено стандартными клиническими способами, описанными в настоящем документе или другими известными в данной области техники способами. Точная доза, используемая в составе, будет зависеть от пути введения.

Начальные дозы можно оценить на основе данных in vivo (например, животных моделей) с использованием способов, хорошо известных в данной области техники. Специалист в данной области техники может легко оптимизировать введение людям на основе данных на животных.

Согласно конкретному варианту осуществления доза состава может быть измерена или рассчитана как вирусные частицы или как геномные копии («GC»)/вирусные геномы («вг»).

Для определения количества геномных копий (GC) на миллилитр вирусных композиций согласно настоящему изобретению можно использовать любой способ, известный в данной области техники. Один из способов осуществления количественного определения GC AAV заключается в следующем: очищенные образцы AAV вектора сначала обрабатывают ДНКазой для удаления неинкапсидированной геномной ДНК AAV или загрязняющей плазмидной ДНК, присутствующей в результате процесса получения. Затем устойчивые к ДНКазе частицы подвергают термообработке для высвобождения генома из капсида. Высвободившиеся геномы затем количественно оценивают с помощью ПЦР в реальном времени с использованием наборов праймеров/зондов, нацеленных на конкретный участок вирусного генома.

Термины «фармацевтически приемлемый носитель», «фармацевтически приемлемый разбавитель», «фармацевтически приемлемое вспомогательное средство» или «фармацевтически приемлемая среда», используемые в настоящем документе взаимозаменяемо, относятся к нетоксичному твердому, полутвердому или жидкому наполнителю, разбавителю, инкапсулирующему материалу или вспомогательному средству для получения любого обычного типа. Фармацевтически приемлемый носитель практически нетоксичен для реципиентов в используемых дозах и концентрациях и совместим с другими ингредиентами состава. Количество и природа фармацевтически приемлемых носителей зависят от желаемой формы введения. Фармацевтически приемлемые носители известны и могут быть получены способами, хорошо известными в данной области техники.

Фармацевтическая композиция может быть составлена в соответствии с обычными процедурами в виде фармацевтической композиции, адаптированной для внутривенного, подкожного, внутримышечного, в спинномозговую жидкость (CSF), например, интрацистернального или интрацеребровентрикулярного, введения людям. Согласно предпочтительному варианту осуществления фармацевтическая композиция предназначена для внутривенного введения или введения в спинномозговую жидкость (CSF). Более предпочтительно фармацевтическая композиция предназначена для внутривенного введения.

AAV вектор может быть составлен для парентерального введения путем инъекции (например, путем болюсной инъекции или непрерывной инфузии). Составы для инъекций могут быть представлены в виде стандартной лекарственной формы (например, в ампулах или в контейнерах с одной или несколькими дозами) с добавлением консерванта. Вирусные композиции могут принимать такие формы, как суспензии, растворы или эмульсии в масляных или водных средах, и могут содержать вспомогательные средства для получения составов, такие как суспендирующие, стабилизирующие или диспергирующие средства. Жидкие препараты составов AAV могут быть получены обычными способами с фармацевтически приемлемыми добавками, такими как суспендирующие средства (например, сорбитный сироп, производные целлюлозы или гидрогенизированные пищевые жиры), эмульгирующие средства (например, лецитин или гуммиарабик), неводные среды (например, миндальное масло, масляные сложные эфиры, этиловый спирт или фракционированные растительные масла) и консерванты (например, метил- или пропил-п-гидроксибензоаты или сорбиновая кислота). Препараты также могут содержать буферные соли. Альтернативно, композиции могут быть в форме порошка для смешивания с подходящей средой (например, стерильной апирогенной водой) перед использованием. При необходимости композиция также может включать местный анестетик, такой как лидокаин, для облегчения боли в месте инъекции. Если композицию собираются вводить путем инфильтрации, она может быть снабжена бутылкой для инфильтрации, содержащей воду или физиологический раствор фармацевтического качества. Когда композицию вводят путем инъекции, она может быть снабжена ампулой с водой для инъекций или стерильным физиологическим раствором, так что ингредиенты могут быть смешаны перед введением. Предпочтительно, фармацевтически приемлемый носитель представляет собой физиологический раствор и детергент, такой как блок-сополимер полиэтилена и полиоксипропилена, Pluronic F68^®.

Композиции согласно настоящему изобретению могут быть составлены для доставки животным для ветеринарных целей (например, домашнему скоту (крупный рогатый скот, свиньи, другие)) и другим субъектам млекопитающим, отличным от человека, а также людям. Фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению может быть составлена с физиологически приемлемым носителем для использования при переносе генов и генной терапии.

Также охватывается использование адъювантов в комбинации с полинуклеотидом, вектором или AAV вектором согласно настоящему изобретению или в смеси с ними. Рассматриваемые адъюванты включают без ограничения адъюванты на основе минеральных солей или адъюванты в виде гелей на основе минеральных солей, адъюванты в виде частиц, адъюванты в виде микрочастиц, мукозные адъюванты.

Адъюванты можно вводить субъекту в виде смеси с полинуклеотидом, вектором или AAV вектором согласно настоящему изобретению или использовать в комбинации.

Фармацевтическую композицию согласно настоящему изобретению можно вводить местно или системно. Согласно варианту осуществления фармацевтическую композицию вводят рядом с тканью или органом, клетки которого необходимо трансдуцировать. Согласно конкретному варианту осуществления фармацевтическую композицию согласно настоящему изобретению вводят системно.

В контексте настоящего изобретения термины «системно вводимые» и «системное введение» означают, что полинуклеотид, векторы, AAV векторы или композиции согласно настоящему изобретению можно вводить субъекту нелокализованным образом. Системное введение может достигать нескольких органов или тканей во всем организме субъекта или может достигать конкретных органов или тканей субъекта. Например, внутривенное введение может привести к трансдукции более чем одной ткани или органа у субъекта. Фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению можно вводить в виде однократной дозы или, согласно частным вариантам осуществления настоящего изобретения, можно использовать несколько доз (например, два, три, четыре или более введений) для достижения терапевтического эффекта. Согласно предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения фармацевтическую композицию согласно настоящему изобретению вводят в виде однократной дозы, т.е. ее вводят один раз в течение жизни.

Таким образом, согласно другому аспекту настоящее изобретение относится к полинуклеотиду или вектору согласно настоящему изобретению или фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению для использования в медицине.

Согласно другому аспекту настоящее изобретение относится к полинуклеотиду или вектору согласно настоящему изобретению, или фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению для использования при лечении мукополисахаридоза типа IVA или синдрома Моркио А.

Как показано в примерах, приведенных в настоящем документе, AAV векторы, содержащие различные варианты кассеты, экспрессирующей N-ацетил-галактозамин-6-сульфатазу человека, вводили внутривенно 2-х месячным мышам, пораженным MPSIVA, посредством инъекции в хвостовую вену. Анализ активности GALNS показал, что трансдукция со всеми векторами, содержащими N-ацетил-галактозамин-6-сульфатазу, приводит к значительному увеличению активности N-ацетил-галактозамин-6-сульфатазы по сравнению с уровнями, измеренными у животных с MPSIVA.

Таким образом, согласно другому аспекту настоящее изобретение относится к полинуклеотиду или вектору согласно настоящему изобретению, или фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению для повышения активности N-ацетил-галактозамин-6-сульфатазы.

Согласно другому аспекту настоящее изобретение относится к способу лечения и/или профилактики мукополисахаридоза типа IVA у субъекта, нуждающегося в этом, который предусматривает введение указанному субъекту полинуклеотида согласно настоящему изобретению или вектора согласно изобретению, или фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению.

В контексте настоящего изобретения термины «предотвращать», «предотвращение» и «профилактика» относятся к подавлению возникновения или снижению частоты возникновения заболевания у субъекта. Профилактика может быть полной (например, полное отсутствие патологических клеток у субъекта) или частичной. Профилактика также означает снижение предрасположенности к клиническому состоянию. В контексте настоящего изобретения термины «лечить» или «лечение» относятся к введению полинуклеотида, или вектора, или AAV вектора, или фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению для контроля развития заболевания после появления его клинических признаков. Под контролем развития заболевания понимается достижение положительных или желаемых клинических результатов, которые включают без ограничения уменьшение симптомов, сокращение продолжительности заболевания, стабилизацию патологических состояний (особенно во избежание дополнительного ухудшения), замедление прогрессирования заболевания, улучшение патологического состояния и ремиссию (как частичную, так и полную). Контроль развития заболевания также включает увеличение выживаемости по сравнению с выживаемостью, ожидаемой если лечение не применяется.

В контексте настоящего изобретения термин «субъект» относится к индивидууму или животному, такому как человек, не относящийся к человеку примат (например, шимпанзе и другие виды обезьян и высших обезьян), сельскохозяйственное животное (например, птицы, рыба, крупный рогатый скот, овцы, свиньи, козы и лошади), домашнее млекопитающее (например, собаки и кошки) или лабораторное животное (например, грызуны, такие как мыши, крысы и морские свинки). Термин включает субъектов любого возраста и пола. Согласно предпочтительному варианту осуществления субъектом является млекопитающее, предпочтительно человек.

Способы получения AAV согласно настоящему изобретению

Настоящее изобретение также относится к способам получения AAV векторов согласно настоящему изобретению. Указанные AAV векторы могут быть получены путем введения полинуклеотидов согласно настоящему изобретению в клетки, которые конститутивно экспрессируют белки Rep и Сар, или когда последовательности, кодирующие Rep и Сар, обеспечены в плазмидах или векторах.

Таким образом, согласно другому аспекту настоящее изобретение относится к способу получения AAV вектора, предусматривающему стадии:

(i) обеспечения клетки, содержащей полинуклеотид согласно настоящему изобретению, AAV белки Cap, AAV белки Rep и необязательно вирусные белки, от которых зависит репликация AAV,

(ii) поддержания клетки в условиях, подходящих для сборки AAV, и

(iii) очистки аденоассоциированного вирусного вектора, продуцированного клеткой.

Любая клетка, способная продуцировать AAV, может использоваться согласно настоящему изобретению.

Полинуклеотид согласно настоящему изобретению, используемый в этом способе, был описан ранее. Любой из вариантов осуществления, раскрытых в контексте полинуклеотидов согласно настоящему изобретению, применим в контексте способов получения AAV согласно настоящему изобретению.

В контексте настоящего изобретения термин «белок Сар» относится к полипептиду, имеющему по меньшей мере одну функциональную активность нативного AAV белка Сар (например, VP1, VP2 и VP3). Примеры функциональной активности белков Сар включают способность индуцировать образование капсида, способствовать накоплению одноцепочечной ДНК, способствовать упаковке ДНК AAV в капсидах (т.е. инкапсидацию), связываться с клеточными рецепторами и способствовать проникновению вириона в клетки-хозяева. В принципе, в контексте настоящего изобретения можно использовать любой белок Сар.

Согласно предпочтительному варианту осуществления белки Сар происходят из AAV8 или AAV9.

В контексте настоящего изобретения термин «капсид» относится к структуре, в которую упакован вирусный геном. Капсид состоит из нескольких олигомерных структурных субъединиц, состоящих из белков. Например, AAV имеет икосаэдрический капсид, образованный взаимодействием трех капсидных белков VP1, VP2 и VP3.

В контексте настоящего изобретения термин «белок Rep» относится к полипептиду, обладающему по меньшей мере одной функциональной активностью нативного AAV белка Rep.«Функциональная активность» белка Rep представляет собой любую активность, связанную с физиологической функцией белка, включая облегчение репликации ДНК посредством распознавания, связывания и никования AAV ориджина репликации ДНК, а также активности ДНК-геликазы. Дополнительные функции включают модуляцию транскрипции из AAV (или других гетерологичных) промоторов и сайт-специфическую интеграцию ДНК AAV в хромосому хозяина. Согласно конкретному варианту осуществления AAV гены Rep происходят из серотипа AAV2.

В контексте настоящего изобретения выражение «вирусные белки, от которых зависит репликация AAV» относится к полипептидам, которые выполняют функции, от которых зависит репликация AAV (то есть «вспомогательные функции»). Вспомогательные функции включают без ограничения те функции, которые требуются для активации транскрипции гена AAV, стадия-специфического сплайсинга мРНК AAV, репликации ДНК AAV, синтеза белков Сар и сборки капсида AAV. Дополнительные связанные с вирусом функции могут быть получены из любого из известных вспомогательных вирусов, таких как аденовирус, вирус герпеса (кроме вируса простого герпеса типа 1) и вирус осповакцины. Вспомогательные функции включают без ограничения аденовирус Е1, Е2а, VA и Е4 или вирус герпеса UL5, UL8, UL52 и UL29 и герпесвирусную полимеразу.

Полинуклеотид согласно настоящему изобретению или гены AAV rep, AAV cap и гены, обеспечивающие вспомогательные функции, могут быть введены в клетку путем включения указанных генов в вектор, такой как, например, плазмида, и введения указанного вектора в клетку. Гены могут быть включены в одну и ту же плазмиду или в разные плазмиды. Согласно предпочтительному варианту осуществления полинуклеотид согласно настоящему изобретению включен в одну плазмида, гены AAV rep и cap включены в другую плазмиду, а гены, обеспечивающие вспомогательные функции, включены в еще одну другую плазмиду.

Плазмиды, содержащие полинуклеотид согласно настоящему изобретению и/или гены AAV rep и cap, или гены, обеспечивающие вспомогательные функции, могут быть введены в клетку с использованием любого подходящего способа, хорошо известного в данной области техники. Примеры способов трансфекции включают без ограничения соосаждение с фосфатом кальция, DEAE-декстраном, полибреном, электропорацию, микроинъекцию, опосредованное липосомами слияние, липофекцию, ретровирусное инфецирование и биолистическую трансфекцию. Согласно конкретному варианту осуществления трансфекцию проводят посредством соосаждения с фосфатом кальция. Когда в клетке отсутствует экспрессия любого из генов AAV rep и cap, а также генов, обеспечивающих аденовирусные вспомогательные функции, указанные гены могут быть введены в клетку одновременно с полинуклеотидом согласно настоящему изобретению. Альтернативно, указанные гены можно ввести в клетку до или после введения полинуклеотида согласно настоящему изобретению.

Согласно конкретному варианту осуществления клетки трансфицируют одновременно тремя плазмидами: i) плазмидой, содержащей полинуклеотид согласно настоящему изобретению, ii) плазмидой, содержащей гены AAV rep и cap, и iii) плазмидой, содержащей гены, обеспечивающие вспомогательные функции.

Стадия (ii) способа согласно настоящему изобретению предусматривает поддержание клетки в условиях, подходящих для сборки AAV.

Способы культивирования клеток и примерные условия, которые способствуют высвобождению векторных частиц AAV, такие как лизинг клеток, могут быть выполнены, как описано в примерах, приведенных в настоящем документе. Клетки-продуценты выращивают в течение подходящего периода времени, чтобы способствовать сборке AAV и высвобождению вирусных векторов в среду. Как правило, время культивирования измеряют с момента образования вируса. Например, в случае AAV продукция вируса обычно начинается после обеспечения вспомогательной вирусной функции в соответствующей клетке-продуценте, как описано в настоящем документе.

Стадия (iii) способа согласно настоящему изобретению предусматривает очистку AAV вектора, продуцированного клеткой.

Любой способ очистки AAV от указанных клеток или указанной культуральной среды может быть использован для получения AAV согласно настоящему изобретению. Согласно конкретному варианту осуществления AAV согласно настоящему изобретению очищают в соответствии с оптимизированным способом, основанным на стадии осаждения с применением полиэтиленгликоля и двух последовательных градиентах хлорида цезия (CsCl).

В данной области техники известны различные природные и сконструированные AAV, кодирующие их нуклеиновые кислоты, AAV белки Сар и Rep, а также способы выделения или создания, размножения и очистки таких AAV и, в частности, их капсидов, подходящие для использования при получении AAV

Настоящее изобретение, кроме того, относится к выделенной клетке, содержащей полинуклеотидную последовательность согласно настоящему изобретению, кодирующую белок GALNS или его функционально эквивалентный вариант.

Все варианты осуществления, раскрытые в контексте полинуклеотидов, векторов или AAV векторов согласно настоящему изобретению и фармацевтических композиций согласно настоящему изобретению, применимы к терапевтическим способам согласно настоящему изобретению.

Общие методики

1. Рекомбинантные AAV векторы

AAV векторы, описанные в настоящем документе, получали тройной трансфекцией. В качестве материалов, необходимых для создания векторов, использовали клетки HEK293 (экспрессирующие гены аденовируса Е1), вспомогательную плазмиду, обеспечивающую функции аденовируса, плазмиду, обеспечивающую AAV гены гер из серотипа 2 и гены cap из серотипов 8 или 9 (AAV8 или AAV9) и, наконец, основную плазмиду с ITR AAV2 и представляющей интерес конструкцией.

Для создания AAV векторов, экспрессирующих N-ацетил-галактозамин-6-сульфатазу, оптимизированные или неоптимизированные кодирующие последовательности человеческой или мышиной N-ацетил-галактозамин-6-сульфатазы клонировали в основную AAV плазмиду под контролем универсального гибридного промотора CAG или печень-специфического промотора hAAT. Крупномасштабное получение плазмид производили с использованием EndoFree Plasmid Megaprep Kit (Qiagen).

Векторы создавали путем трансфекции без использования вспомогательного вируса клеток HEK293 с использованием трех плазмид с модификациями (Matsushita et al., 1998; Wright et al., 2005). Клетки культивировали до 70% слияния в роллерных флаконах (RB) (Corning, Corning, NY, US) в DMEM с добавлением 10% FBS, а затем совместно трансфицировали с 1) плазмидой, несущей экспрессионную кассету, фланкированную вирусными ITR серотипа 2 AAV (описаны выше), 2) плазмидой, несущей гены AAV rep2 и сар8 или сар9, и 3) плазмидой, несущей вспомогательные аденовирусные функции. Векторы очищали посредством двух последовательных градиентов хлорида цезия с использованием оптимизированного протокола, как описано ранее (Ayuso et al., 2010). Векторы диализовали с применением PBS + 0,001% Pluronic^® F68, фильтровали, количественно определяли с помощью кПЦР и хранили при -80°С до использования.

Векторы согласно настоящему изобретению конструировали согласно методикам молекулярной биологии, известным в данной области техники.

2. In vitro исследования трансфекции

HEK293 клетки трансфецировали с 4 мкг pAAV-CAG-omGALNS, pAAV-hAAT-omGALNS, pAAV-CAG-hGALNS, pAAV-CAG-ohGALNS-v1, pAAV-CAG-ohGALNS-v2 или pAAV-CAG-ohGALNS-v3 с применением Lipofectamine^® 2000 (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, CA, USA) согласно инструкциям производителя. Через 48 часов клетки и культуральные среды собирали и обрабатывали с целью экстракции белка.

Белковые экстракты получали путем обработки клеток ультразвуком в 250 мкл воды Mili-Q, и содержание белка определяли количественно с помощью анализа белка методом Бредфорд (Bio-Rad, Hercules, CA, US). Активность N-ацетил-галактозамин-6-сульфатазы определяли в 1 мкг экстрактов клеточного белка и 5 мкл культуральной среды и нормализовали по общему количеству белка и объему, соответственно, с флуорогенным субстратом, полученным из 4-метилумбеллиферона (Toronto Rerearch Chemicals Inc, Ontario, Canada), как описано ранее (van Diggelen et al., 1990).

3. Животные

Получали эмбриональные стволовые клетки C57BL/6N-A/a, несущие репортерный ген (LacZ), нацеленный на вставку в ген Gains, доступный посредством Международного консорциума по фенотипированию мышей (IMPC, www.mousephenotype.org). Клоны микроинъектировали в бластоцисты C57BL/6JO1aHsd, доступные посредством Отделения трансгенных животных Центра биотехнологии и генной терапии животных (CBATEG) при Universitat Autonoma de Barcelona (UAB), и полученные мужские химеры скрещивали с женскими C57B1/6NTac с получения потомства с нокаутом Gains (мыши с MPSIVA или Galns-/- мыши). Генотип определяли на геномной ДНК из образцов, полученных посредством обрезания хвоста, с помощью ПЦР-анализа, при котором амплифицируют последовательность, охватывающую целевую мутацию. Последовательностями соответствующих смысловых и антисмысловых праймеров были: смысловой праймер: 5' CCA GGG ААТ GTC CCA ССТ ATT Т 3' (SEQ ID NO: 20), антисмысловой праймер: 5' GTC AGG TTG АСА CGA AGC TG 3' (SEQ ID NO: 21) и антисмысловой праймер KO: 5' GGA ACT TCG GTT CCG GCG 3' (SEQ ID NO: 22). Смысловые и антисмысловые праймеры позволяют генотипировать мышей WT. Смысловой и антисмысловой праймеры KO позволяют генотипировать Galns-/- мышей.

Мышей кормили без ограничения стандартной диетой (Harlan, Tekland) и поддерживали 12-часовой цикл свет-темнота (свет включали в 9:00 утра).

Из-за отсутствия активности GALNS у этих животных уже в возрасте одного месяца проявлялись несколько патологических признаков, характерных для заболевания MPSIVA, включая накопление гликозаминогликанов (GAG) и удлинение лизосомального компартмента в различных областях эпифизарной пластинки бедренной кости и большеберцовой кости. Более того, многие из этих патологических признаков усугублялись с возрастом, что свидетельствует об ухудшении патологии у пожилых животных.

Подобным образом, по мере взросления животных наблюдалось накопление GAG в периферических органах, таких как печень, сердце и селезенка. Однако значительных различий в продолжительности жизни между однопометниками Galns-/- и WT не наблюдалось.

4. Введение вектора мышам

Для внутривенной доставки векторов AAV8-hAAT-omGALNS общую дозу 1 ×10¹¹ вг инъецировали мышам в общем объеме 200 мкл через хвостовую вену животных Galns-/- в возрасте 3-4 недель. Подобной группе животных инъецировали 1×10¹¹ вг контрольного некодирующего вектора (AAV8-hAAT-null).

Для внутривенной доставки векторов AAV8-CAG-omGALNS мышам общую дозу 1×10¹² вг инъецировали мышам в общем объеме 200 мкл через хвостовую вену животных Galns-/- в возрасте 3-4 недель. Подобной группе животных инъецировали 1×10¹² вг контрольного некодирующего вектора (AAV8-CAG-null).

Для внутривенной доставки векторов AAV9-CAG-omGALNS мышам общую дозу 1×10¹² вг инъецировали мышам в общем объеме 200 мкл через хвостовую вену животных Galns-/- в возрасте 3-4 недель. Подобной группе животных инъецировали 1×10¹² вг контрольного некодирующего вектора (AAV9-CAG-null).

В возрасте 7 месяцев, через 6 месяцев после введения вектора, мышей умерщвляли и собирали ткани.

Для внутривенной векторной доставки 5×10¹⁰ векторных геномов AAV9 векторов, несущих различные варианты последовательности, кодирующей N-ацетил-галактозамин-6-сульфатазу человека, вводили мышам в общем объеме 200 мкл посредством инъекции в хвостовую вену животных Galns-/- в возрасте двух месяцев. Животных WT и необработанные животных Galns-/- использовали в качестве контроля.

В возрасте 2,5 месяцев, через 15 дней после введения вектора, мышей умерщвляли и собирали ткани.

5. Сбор образцов

При умерщвлении животных глубоко анестезировали и затем транскардиально перфузировали с 50 мл PBS для полного удаления крови из тканей. Мозг целиком и несколько соматических тканей (включая печень, селезенку, почки, легкие, сердце, жировую ткань, глаза, слезные железы и кости) собирали и либо замораживали в жидком азоте и хранили при -80°С, либо погружали в формалин для последующих гистологических анализов.

6. Активность N-ацетил-галактозамин-6-сульфатазы и количественное определение гликозаминогликанов

Образцы печени и жировой ткани обрабатывали ультразвуком в воде Mili-Q, а образцы бедренной кости гомогенизировали в буфере для гомогенизации, состоящем из 25 ммоль/л Трис-HCl, рН 7,2, и 1 ммоль/л фенилметилсульфонилфторида. Активность N-ацетил-галактозамин-6-сульфатазы определяли с флуорогенным субстратом, полученным из 4-метилумбеллиферона (Toronto Rerearch Chemicals Inc, Ontario, Canada), как описано ранее (van Diggelen et al., 1990). Уровни GALNS в печени, жировой ткани и бедренной кости нормализовывали по отношению к общему количеству белка, количественно определенному с помощью анализа белка методом Бредфорда (Bio-Rad, Hercules, CA, US).

Для количественного определения GAG образцы тканей взвешивали, а затем расщепляли протеиназой K, и экстракты очищали центрифугированием и фильтрацией. Уровни GAG определяли методом жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии (LC-MS/MS) в экстрактах тканей и сыворотке. Уровни GAG нормализовывали к массе влажной ткани или к общему объему расщепленных образцов.

7. Гистологический анализ

Ткани фиксировали в течение 12-24 часов в формалине, включали в парафин и разрезали.

Для обнаружения накопления GAG в эпителии роговицы парафиновые срезы подвергали коллоидному окрашиванию по Моури, которое выявляет GAG в синем цвете. Для обнаружения накопления GAG в слезной железе и эпифизарной пластинке роста большеберцовой кости срезы смолы подвергали окрашиванию толуидиновым синим, которое выявляет накопление GAG в белом цвете.

Программное обеспечение NIS Elements Advanced Research 2.20 использовали для количественной оценки % площади GAG+ на 15-20 изображениях каждого глаза (исходное увеличение, ×40) на животное, используя одинаковые настройки порога сигнала для всех животных. Затем вычисляли процент положительной области, то есть площадь в пикселях с положительным сигналом по всей площади ткани в интересующей области изображения.

8. Анализ посредством трансмиссионной электронной микроскопии

Мышей умерщвляли передозировкой изофлурана (Isoflo, Labs. Esteve, Barcelona, ES) и перфузировали через нижнюю полую вену с 1 мл 2,5% глутарового альдегида и 2% параформальдегида. Небольшую часть (приблизительно 1 мм3) зубчатой извилины и миндалевидной железы вырезали и инкубировали в течение 2 часов при 4°С в том же фиксаторе. После промывки в холодном какодилатном буфере образцы пост-фиксировали в 1% тетроксиде осмия, окрашивали в водном уранилацетате, а затем дегидратировали с помощью серии градиентного этанола и включали в эпоксидную смолу. Ультратонкие срезы (600-800 ) блоков смолы окрашивали цитратом свинца и исследовали в трансмиссионном электронном микроскопе (Н-7000; Hitachi, Tokyo, JP).

9. Статистический анализ

Все результаты выражены как среднее ± SEM. Статистические сравнения были выполнены с использованием однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA). Множественные сравнения между контрольной и экспериментальной группами проводили с использованием критерия Дьюнетта, а между всеми группами - с помощью критерия Тьюки. Статистическую значимость признавали, если Р < 0,05.

Примеры

Пример 1. Конструирование pAAV-CAG-hGALNS

CDS для N-ацетил-галактозамин-6-сульфатазы человека (NCBI эталонная последовательность: NM_000512.4) применяли в качестве исходного материала и химически синтезировали для этой цели (GeneArt; Life Technologies). CDS SEQ ID NO: 1 получали клонированной внутри плазмиды pMK-RQ (KanR), фланкированной сайтами рестрикции MluI и EcoRI на 5' и 3', соответственно.

MluI/EcoRI фрагмент CDS N-ацетил-галактозамин-6-сульфатазы человека вырезали из плазмиды pMK-RQ и затем клонировали между сайтами рестрикции MluI и EcoRI AAV основной плазмиды pAAV-CAG. Полученная плазмида была названа pAAV-CAG-hGALNS (номер доступа DSM 32791). См. Фиг. 1А и SEQ ID NO: 2.

AAV основную плазмиду pAAV-CAG, используемую согласно настоящему изобретению, создавали заранее, и она содержала ITR из генома AAV2, промотор CAG и сигнал поли-А из β-глобина кролика, а также сайт множественного клонирования для клонирования представляющих интерес CDS. Промотор CAG представляет собой гибридный промотор, состоящий из раннего/промежуточного энхансера CMV и промотора β-актина цыпленка. Этот промотор способен управлять экспрессией белка повсеместно.

Пример 2. Конструирование pAAV-CAG-ohGALNS-v1

Экспрессионные кассеты, включающие оптимизированный вариант последовательности кДНК N-ацетил-галактозамин-6-сульфатазы (ohGALNS) конструировали и получали. Оптимизацию последовательности проводили с получением максимальной эффективности продукции белка N-ацетил-галактозамин-6-сульфатазы у человека путем исключения скрытых участков сплайсинга и элементов последовательности, дестабилизирующих РНК, для повышения стабильности РНК, добавления элементов последовательности, стабилизирующих РНК, оптимизации кодона и адаптации содержания G/C, исключения стабильных вторичных структур РНК, среди других изменений. CDS для N-ацетил-галактозамин-6-сульфатазы человека (NCBI эталонная последовательность: NM_000512.4) использовали в качестве начальной точки оптимизации последовательности.

Оптимизированную CDS SEQ ID NO: 3 (GeneArt; Life Technologies) получали клонированной в плазмиду pMK-RQ (KanR), фланкированную сайтами рестрикции MluI и EcoRI на 5' и 3', соответственно.

MluI/EcoRI оптимизированный фрагмент CDS N-ацетил-галактозамин-6-сульфатазы человека вырезали из плазмиды pMK-RQ и затем клонировали между сайтами рестрикции MluI и EcoRI AAV основной плазмиды pAAV-CAG. Полученная плазмида была названа pAAV-CAG-ohGALNS-v1 (номер доступа DSM 32792). См. Фиг. 2А и SEQ ID NO: 4.

Пример 3. Конструирование pAAV-CAG-ohGALNS-v2

CDS для N-ацетил-галактозамин-6-сульфатазы человека (NCBI эталонная последовательность: NM_000512.4) подвергали оптимизации последовательности (GenSript, Inc). Оптимизированную CDS SEQ ID NO: 5 получали клонированной в плазмиде pUC57 (AmpR), фланкированной сайтами рестрикции MluI и EcoRI на 5' и 3', соответственно.

MluI/EcoRI оптимизированный фрагмент CDS N-ацетил-галактозамин-6-сульфатазы человека вырезали из плазмиды pUC57 и затем клонировали между сайтами рестрикции MluI и EcoRI AAV основной плазмиды pAAV-CAG. Полученная плазмида была названа pAAV-CAG-ohGALNS-v2 (номер доступа DSM 32793). См. Фиг. 3А и SEQ ID NO: 6.

Пример 4. Конструирование pAAV-CAG-ohGALNS-v3

CDS для N-ацетил-галактозамин-6-сульфатазы человека (NCBI эталонная последовательность: NM_000512.4) подвергали оптимизации последовательности (DNA 2.0 Inc). Оптимизированную CDS SEQ ID NO: 7 получали клонированной в плазмиде pj201 (KanR), фланкированной сайтами рестрикции MluI и EcoRI на 5' и 3', соответственно.

MluI/EcoRI оптимизированный фрагмент CDS N-ацетил-галактозамин-6-сульфатазы человека вырезали из плазмиды pj201 и затем клонировали между сайтами рестрикции MluI и EcoRI AAV основной плазмиды pAAV-CAG. Полученная плазмида была названа pAAV-CAG-ohGALNS-v3 (номер доступа DSM 32794). См. Фиг. 4А и SEQ ID NO: 8.

Пример 5. Конструирование pAAV-CAG-omGALNS

CDS мышиной N-ацетил-галактозамин-6-сульфатазы (NCBI эталонная последовательность: NM_016722.4) подвергали оптимизации последовательности (GeneArt; Life Technologies). Оптимизированную CDS SEQ ID NO: 9 получали клонированной в плазмиде pMA-RQ-Bb (AmpR), фланкированной сайтами рестрикции MluI и EcoRI на 5' и 3', соответственно.

MluI/EcoRI оптимизированный фрагмент CDS мышиной N-ацетил-галактозамин-6-сульфатазы вырезали из плазмиды pMA-RQ-Bb и затем клонировали между сайтами рестрикции MluI и EcoRI AAV основной плазмиды р AAV-CAG. Полученная плазмида была названа pAAV-CAG-omGALNS. См. Фиг. 5А и SEQ ID NO: 10.

Пример 6. Конструирование pAAV-hAAT-omGALNS

CDS мышиной N-ацетил-галактозамин-6-сульфатазы (NCBI эталонная последовательность: NM_016722.4) подвергали оптимизации последовательности (GeneArt; Life Technologies) SEQ ID NO: 9.

Промотор hAAT (SEQ ID NO: 19) получали клонированным в плазмиде pGG2-hAAT (AmpR), фланкированной сайтами рестрикции BglII и MluI на 5' и 3', соответственно.

Промотор CAG (SEQ ID NO: 18) вырезали из плазмиды pAAV-CAG-omGALNS и затем замещали на промотор hAAT. Полученная плазмида была названа pAAV-hAAT-omGALNS. См. Фиг. 6А и SEQ ID NO: 11.

Промотор hAAT представляет собой гибридный промотор, состоящий из промотора α1-антитрипсина человека и трех копий энхансерного элемента области контроля печени (HCR) из аполипопротеина Е. Этот промотор способен управлять эффективной печень-специфической экспрессией.

Пример 7. Получение AAV9-CAG-hGALNS

Векторы AAV9-CAG-hGALNS (SEQ ID NO: 12) создавали посредством трансфекции без использования вспомогательного вируса клеток HEK293 с использованием трех плазмид с модификациями (Matsushita et al., 1998; Wright et al., 2005).

Клетки культивировали до 70% слияния в роллерных флаконах (RB) (Corning, Corning, NY, US) в DMEM с добавлением 10% FBS, а затем совместно трансфицировали с: 1) плазмидой, несущей экспрессионную кассету, фланкированную ITR AAV2 (pAAV-CAG-hGALNS; SEQ ID NO: 2), 2) плазмидой, несущей AAV2 ген rep и AAV9 ген cap (pREP2CAP9), и 3) плазмидой, несущей вспомогательные аденовирусные функции. Векторы очищали посредством двух последовательных градиентов хлорида цезия с использованием оптимизированного протокола, как описано ранее (Ayuso et al., 2010). Векторы диализовали с применением PBS + 0,001% Pluronic^® F68, фильтровали, количественно определяли с помощью кПЦР и хранили при -80°С до использования. См. Фиг. 1B.

Пример 8. Получение AAV9-CAG-ohGALNS-v1

Векторы AAV9-CAG-ohGALNS-v1 (SEQ ID NO: 13) создавали посредством трансфекции без использования вспомогательного вируса клеток HEK293 с использованием трех плазмид с модификациями. (Matsushita et al., 1998; Wright et al., 2005). Клетки культивировали до 70% слияния в роллерных флаконах (RB) (Corning, Corning, NY, US) в DMEM с добавлением 10% FBS, а затем совместно трансфицировали с: 1) плазмидой, несущей экспрессионную кассету, фланкированную ITR AAV2 (pAAV-CAG-ohGALNS-v1; SEQ ID NO: 4), 2) плазмидой, несущей AAV2 ген rep и AAV9 ген cap (pREP2CAP9), и 3) плазмидой, несущей вспомогательные аденовирусные функции. Векторы очищали посредством двух последовательных градиентов хлорида цезия с использованием оптимизированного протокола, как описано ранее (Ayuso et al., 2010). Векторы диализовали с применением PBS + 0,001% Pluronic^® F68, фильтровали, количественно определяли с помощью кПЦР и хранили при -80°С до использования. См. Фиг. 2 В.

Пример 9. Получение AAV9-CAG-ohGALNS-v2

Векторы AAV9-CAG-ohGALNS-v2 (SEQ ID NO: 14) создавали посредством трансфекции без использования вспомогательного вируса клеток HEK293 с использованием трех плазмид с модификациями. (Matsushita et al., 1998; Wright et al., 2005). Клетки культивировали до 70% слияния в роллерных флаконах (RB) (Corning, Corning, NY, US) в DMEM с добавлением 10% FBS, а затем совместно трансфицировали с: 1) плазмидой, несущей экспрессионную кассету, фланкированную ITR AAV2 (pAAV-CAG-ohGALNS-v2; SEQ ID NO: 6), 2) плазмидой, несущей AAV2 ген rep и AAV9 ген cap (pREP2CAP9), и 3) плазмидой, несущей вспомогательные аденовирусные функции. Векторы очищали посредством двух последовательных градиентов хлорида цезия с использованием оптимизированного протокола, как описано ранее (Ayuso et al., 2010). Векторы диализовали с применением PBS + 0,001% Pluronic^® F68, фильтровали, количественно определяли с помощью кПЦР и хранили при -80°С до использования. См. Фиг. 3В.

Пример 10. Получение AAV9-CAG-ohGALNS-v3

Векторы AAV9-CAG-ohGALNS-v3 (SEQ ID NO: 15) создавали посредством трансфекции без использования вспомогательного вируса клеток HEK293 с использованием трех плазмид с модификациями. (Matsushita et al., 1998; Wright et al., 2005). Клетки культивировали до 70% слияния в роллерных флаконах (RB) (Corning, Corning, NY, US) в DMEM с добавлением 10% FBS, а затем совместно трансфицировали с: 1) плазмидой, несущей экспрессионную кассету, фланкированную ITR AAV2 (pAAV-CAG-ohGALNS-v3; SEQ ID NO: 7), 2) плазмидой, несущей AAV2 ген rep и AAV9 ген cap (pREP2CAP9), и 3) плазмидой, несущей вспомогательные аденовирусные функции. Векторы очищали посредством двух последовательных градиентов хлорида цезия с использованием оптимизированного протокола, как описано ранее (Ayuso et al., 2010). Векторы диализовали с применением PBS + 0,001% Pluronic^® F68, фильтровали, количественно определяли с помощью кПЦР и хранили при -80°С до использования. См. Фиг. 4 В.

Пример 11. Получение AAV9-CAG-omGALNS

Векторы AAV9-CAG-omGALNS (SEQ ID NO: 16) создавали посредством трансфекции без использования вспомогательного вируса клеток HEK293 с использованием трех плазмид с модификациями. См. (Matsushita et al., 1998; Wright et al., 2005). Клетки культивировали до 70% слияния в роллерных флаконах (RB) (Corning, Corning, NY, US) в DMEM с добавлением 10% FBS, а затем совместно трансфицировали с: 1) плазмидой, несущей экспрессионную кассету, фланкированную ITR AAV2 (pAAV-CAG-omGALNS; SEQ ID NO: 10), 2) плазмидой, несущей AAV2 ген rep и AAV9 ген cap (pREP2CAP9), и 3) плазмидой, несущей вспомогательные аденовирусные функции. Векторы очищали посредством двух последовательных градиентов хлорида цезия с использованием оптимизированного протокола, как описано ранее (Ayuso et al., 2010). Векторы диализовали с применением PBS + 0,001% Pluronic^® F68, фильтровали, количественно определяли с помощью кПЦР и хранили при -80°С до использования. См. Фиг. 5 В и SEQ ID NO: 16.

Пример 12. Получение AAV8-CAG-omGALNS

Векторы AAV8-CAG-omGALNS (SEQ ID NO: 16) создавали посредством трансфекции без использования вспомогательного вируса клеток HEK293 с использованием трех плазмид с модификациями. См. (Matsushita et al., 1998; Wright et al., 2005). Клетки культивировали до 70% слияния в роллерных флаконах (RB) (Corning, Corning, NY, US) в DMEM с добавлением 10% FBS, а затем совместно трансфицировали с: 1) плазмидой, несущей экспрессионную кассету, фланкированную ITR AAV2 (pAAV-CAG-omGALNS; SEQ ID NO: 10), 2) плазмидой, несущей AAV2 ген rep и AAV8 ген cap (pREP2CAP8), и 3) плазмидой, несущей вспомогательные аденовирусные функции. Векторы очищали посредством двух последовательных градиентов хлорида цезия с использованием оптимизированного протокола, как описано ранее (Ayuso et al., 2010). Векторы диализовали с применением PBS + 0,001% Pluronic^® F68, фильтровали, количественно определяли с помощью кПЦР и хранили при -80°С до использования. См. Фиг. 5 В и SEQ ID NO: 16.

Пример 13. Получение AAV8-hAAT-omGALNS

Векторы AAV8-hAAT-omGALNS (SEQ ID NO: 17) создавали посредством трансфекции без использования вспомогательного вируса клеток HEK293 с использованием трех плазмид с модификациями. См. (Matsushita et al., 1998; Wright et al., 2005). Клетки культивировали до 70% слияния в роллерных флаконах (RB) (Corning, Corning, NY, US) в DMEM с добавлением 10% FBS, а затем совместно трансфицировали с: 1) плазмидой, несущей экспрессионную кассету, фланкированную ITR AAV2 (pAAV-hAAT-omGALNS; SEQ ID NO: 11), 2) плазмидой, несущей AAV2 ген rep и AAV8 ген cap (pREP2CAP8), и 3) плазмидой, несущей вспомогательные аденовирусные функции. Векторы очищали посредством двух последовательных градиентов хлорида цезия с использованием оптимизированного протокола, как описано ранее (Ayuso et al., 2010). Векторы диализовали с применением PBS + 0,001% Pluronic^® F68, фильтровали, количественно определяли с помощью кПЦР и хранили при -80°С до использования. См. Фиг. 6 В и SEQ ID NO: 17.

Пример 14. Внутривенная инъекция AAV9-CAG-hGALNS, AAV9-CAG-ohGALNS-v1, AAV9-CAG-ohGALNS-v2 или AAV9-CAG-ohGALNS-v3 мышам с MPSIVA

Общую дозу 5×10¹⁰ векторных геномов AAV9-CAG-hGALNS, AAV9-CAG-ohGALNS-v1, AAV9-CAG-ohGALNS-v2 или AAV9-CAG-ohGALNS-v3, содержащих различные варианты кассеты, экспрессирующей N-ацетил-галактозамин-6-сульфатазу человека, вводили внутривенно мышам, пораженным MPSIVA, в возрасте двух месяцев, посредством инъекции в хвостовую вену.

Анализ активности GALNS проводили через 2 недели после доставки вектора. Трансдукция всеми четырьмя векторами, содержащими N-ацетил-галактозамин-6-сульфатазу, привела к существенному повышению активности N-ацетил-галактозамин-6-сульфатазы по сравнению с уровнями, измеренными у животных с MPSIVA. Уровни активности N-ацетил-галактозамин-6-сульфатазы были в интервале от 1500% до 2600% от уровней WT в печени и от 55% до 99% от уровней WT в сыворотке. См. Фиг. 7А и 7В. В печени уровни активности, достигнутые с помощью экспрессионной кассеты, содержащей как вариант 2, так и вариант 3 N-ацетил-галактозамин-6-сульфатаза человека, были выше, чем уровни активности, опосредованные вектором, содержащим последовательность дикого типа. См. Фиг. 7А. В сыворотке как вариант 2, и вариант 3 N-ацетил-галактозамин-6-сульфатазы человека приводил к более высокому повышению ферментативной активности, чем дикий тип и вариант 1. См. Фиг. 7 В.

Пример 15. Внутривенная доставка AAV9-CAG-omGALNS, AAV8-CAG-omGALNS или AAV8-hAAT-omGALNS мышам с MPSIVA

Общую дозу 1×10¹² векторных геномов AAV9-CAG-omGALNS, 1×10¹² векторных геномов AAV8-CAG-omGALNS или 1×10¹¹ векторных геномов AAV8-hAAT-omGALNS векторы инъецировали через хвостовую вену животным с MPSIVA в возрасте 3-4 недель, в общем объеме 200 мкл. Через четыре и шесть месяцев после введения вектора животных умерщвляли и собирали образцы для дальнейшего анализа.

Через шесть месяцев после обработки с AAV ферментативная активность GALNS в печени, бедренной кости, жировой ткани и сыворотке обработанных животных с MPSIVA нормализовалась, достигнув значений, аналогичных или даже более высоких, чем у здоровых животных. См. Фиг. 8, 9 и 10. Восстановление активности GALNS привело к полной нормализации характерного для данного заболевания накопления субстрата в печени и сыворотке, на что указывают подобные концентрации кератансульфата у контрольных мышей дикого типа и обработанных Galns-/- мышей. См. Фиг. 11.

При внутривенных введениях различных векторов в кровоток происходит трансдукция в основном печени среди других тканей и органов (Ruzo et al., 2012). Соответственно, активность GALNS в печени самцов мышей с MPSIVA, получивших различные векторы, была приблизительно в 25 раз выше, чем наблюдаемая у здоровых животных. См. Фиг. 8А, 9А и 10А.

При сверхэкспрессии в печени растворимые лизосомальные белки эффективно секретируются в кровоток, превращая этот орган в источник циркулирующего фермента (Ruzo et al., 2012). В сыворотке обработанных мышей с MPSIVA активность GALNS достигала пика приблизительно через 3 месяца после инъекции, а затем стабилизировалась в течение длительного времени со значениями в 20-50 раз выше, чем у однопометников дикого типа. См. Фиг. 8D, 9D и 10D. При оценке соматической эффективности терапии путем количественной оценки содержания GAG в сыворотке и печени наблюдали полную нормализацию уровней KS в крови и печени. См. Фиг. 11.

Через четыре месяца после доставки AAV в эпифизарной пластинке роста большеберцовой кости обработанных мышей с MPSIVA наблюдалось отчетливое снижение внутриклеточного накопления GAG, на что указывало наличие множества внутриклеточных депо GAG. См. Фиг. 12.

У животных, получавших AAV, также наблюдалась полная нормализация накопления GAG в слезной железе, на что указывало отсутствие внутриклеточных депо GAG. См. Фиг. 13 В. Аналогичным образом, количественная оценка интенсивности сигнала GAG-положительной области в срезах эпителия роговицы, окрашенных коллоидным окрашиванием по Моури, выявила снижение % накопления GAG на поверхности эпителия роговицы у Galns-/- мышей, получавших AAV9-CAG-omGALNS или AAV8-hAAT-omGALNS, по сравнению со значениями, зарегистрированными у GALNS-дефицитных мышей. См. Фиг. 13А.

Ультраструктурный анализ с помощью трансмиссионной электронной микроскопии зубчатой извилины и миндалевидной железы 7-ми месячных самцов мышей выявил наличие крупных вакуолей, содержащих электролюминесцентное вещество, в цитоплазме клеток необработанных GALNS-дефицитных мышей. Эти клетки были идентифицированы как периваскулярные макрофаги в зубчатой извилине или периневрональные глиальные клетки и эндотелиальные клетки в миндалевидной железе. Эти везикулы, которые представляли собой лизосомы, заполненные запасным материалом, полностью отсутствовали в образцах, полученных у здоровых животных дикого типа или Galns-/-животных, получавших AAV9-CAG-omGALNS, что подтверждает восстановление нормального размера лизосомального компартмента после переноса гена. См. Фиг. 14.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> ЭСТЕВ ФАРМАСЬЮТИКАЛС, С.А.

УНИВЕРСИТАТ АУТОНОМА ДЕ БАРСЕЛОНА

<120> АДЕНОАССОЦИИРОВАННЫЕ ВИРУСНЫЕ ВЕКТОРЫ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ

МУКОПОЛИСАХАРИДОЗОВ ТИПА IV A

<130> EP2212.10

<150> EP18382373.1

<151> 2018-05-30

<160> 22

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1577

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

tgccaccatg gcggcggttg tcgcggcgac gaggtggtgg cagctgttgc tggtgctcag 60

cgccgcgggg atgggggcct cgggcgcccc gcagcccccc aacatcctgc tcctgctcat 120

ggacgacatg ggatggggtg acctcggggt gtatggagag ccctccagag agaccccgaa 180

tttggaccgg atggctgcag aagggctgct tttcccaaac ttctattctg ccaaccctct 240

gtgctcgcca tcgagggcgg cactgctcac aggacggcta cccatccgca atggcttcta 300

caccaccaac gcccatgcca gaaacgccta cacaccgcag gagattgtgg gcggcatccc 360

agactcggag cagctcctgc cggagcttct gaagaaggcc ggctacgtca gcaagattgt 420

cggcaagtgg catctgggtc acaggcccca gttccacccc ctgaagcacg gatttgatga 480

gtggtttgga tcccccaact gccactttgg accttatgac aacaaggcca ggcccaacat 540

ccctgtgtac agggactggg agatggttgg cagatattat gaagaatttc ctattaatct 600

gaagacgggg gaagccaacc tcacccagat ctacctgcag gaagccctgg acttcattaa 660

gagacaggca cggcaccacc cctttttcct ctactgggct gtcgacgcca cgcacgcacc 720

cgtctatgcc tccaaaccct tcttgggcac cagtcagcga gggcggtatg gagacgccgt 780

ccgggagatt gatgacagca ttgggaagat actggagctc ctccaagacc tgcacgtcgc 840

ggacaacacc ttcgtcttct tcacgtcgga caacggcgct gccctcattt ccgcccccga 900

acaaggtggc agcaacggcc cctttctgtg tgggaagcag accacgtttg aaggagggat 960

gagggagcct gccctcgcat ggtggccagg gcacgtcact gcaggccagg tgagccacca 1020

gctgggcagc atcatggacc tcttcaccac cagcctggcc cttgcgggcc tgacgccgcc 1080

cagcgacagg gccattgatg gcctcaacct cctccccacc ctcctgcagg gccggctgat 1140

ggacaggcct atcttctatt accgtggcga cacgctgatg gcggccaccc tcgggcagca 1200

caaggctcac ttctggacct ggaccaactc ctgggagaac ttcagacagg gcattgattt 1260

ctgccctggg cagaacgttt caggggtcac aactcacaat ctggaagacc acacgaagct 1320

gcccctgatc ttccacctgg gacgggaccc aggggagagg ttccccctca gctttgccag 1380

cgccgagtac caggaggccc tcagcaggat cacctcggtc gtccagcagc accaggaggc 1440

cttggtcccc gcgcagcccc agctcaacgt gtgcaactgg gcggtcatga actgggcacc 1500

tccgggctgt gaaaagttag ggaagtgtct gacacctcca gaatccattc ccaagaagtg 1560

cctctggtcc cactagg 1577

<210> 2

<211> 7804

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> pAAV-CAG-hGALNS

<400> 2

gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc gggcgacctt 60

tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca actccatcac 120

taggggttcc ttgtagttaa tgattaaccc gccatgctac ttatctactc gacattgatt 180

attgactagt tattaatagt aatcaattac ggggtcatta gttcatagcc catatatgga 240

gttccgcgtt acataactta cggtaaatgg cccgcctggc tgaccgccca acgacccccg 300

cccattgacg tcaataatga cgtatgttcc catagtaacg ccaataggga ctttccattg 360

acgtcaatgg gtggagtatt tacggtaaac tgcccacttg gcagtacatc aagtgtatca 420

tatgccaagt acgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa tggcccgcct ggcattatgc 480

ccagtacatg accttatggg actttcctac ttggcagtac atctacgtat tagtcatcgc 540

tattaccatg gtcgaggtga gccccacgtt ctgcttcact ctccccatct cccccccctc 600

cccaccccca attttgtatt tatttatttt ttaattattt tgtgcagcga tgggggcggg 660

gggggggggg gggcgcgcgc caggcggggc ggggcggggc gaggggcggg gcggggcgag 720

gcggagaggt gcggcggcag ccaatcagag cggcgcgctc cgaaagtttc cttttatggc 780

gaggcggcgg cggcggcggc cctataaaaa gcgaagcgcg cggcgggcgg gagtcgctgc 840

gttgccttcg ccccgtgccc cgctccgccg ccgcctcgcg ccgcccgccc cggctctgac 900

tgaccgcgtt actcccacag gtgagcgggc gggacggccc ttctcctccg ggctgtaatt 960

agcgcttggt ttaatgacgg cttgtttctt ttctgtggct gcgtgaaagc cttgaggggc 1020

tccgggaggg ccctttgtgc ggggggagcg gctcgggggg tgcgtgcgtg tgtgtgtgcg 1080

tggggagcgc cgcgtgcggc tccgcgctgc ccggcggctg tgagcgctgc gggcgcggcg 1140

cggggctttg tgcgctccgc agtgtgcgcg aggggagcgc ggccgggggc ggtgccccgc 1200

ggtgcggggg gggctgcgag gggaacaaag gctgcgtgcg gggtgtgtgc gtgggggggt 1260

gagcaggggg tgtgggcgcg tcggtcgggc tgcaaccccc cctgcacccc cctccccgag 1320

ttgctgagca cggcccggct tcgggtgcgg ggctccgtac ggggcgtggc gcggggctcg 1380

ccgtgccggg cggggggtgg cggcaggtgg gggtgccggg cggggcgggg ccgcctcggg 1440

ccggggaggg ctcgggggag gggcgcggcg gcccccggag cgccggcggc tgtcgaggcg 1500

cggcgagccg cagccattgc cttttatggt aatcgtgcga gagggcgcag ggacttcctt 1560

tgtcccaaat ctgtgcggag ccgaaatctg ggaggcgccg ccgcaccccc tctagcgggc 1620

gcggggcgaa gcggtgcggc gccggcagga aggaaatggg cggggagggc cttcgtgcgt 1680

cgccgcgccg ccgtcccctt ctccctctcc agcctcgggg ctgtccgcgg ggggacggct 1740

gccttcgggg gggacggggc agggcggggt tcggcttctg gcgtgtgacc ggcggctcta 1800

gagcctctgc taaccatgtt catgccttct tctttttcct acagctcctg ggcaacgtgc 1860

tggttattgt gctgtctcat cattttggca aagaattgat taattcgagc gaacgcgtgc 1920

caccatggcg gcggttgtcg cggcgacgag gtggtggcag ctgttgctgg tgctcagcgc 1980

cgcggggatg ggggcctcgg gcgccccgca gccccccaac atcctgctcc tgctcatgga 2040

cgacatggga tggggtgacc tcggggtgta tggagagccc tccagagaga ccccgaattt 2100

ggaccggatg gctgcagaag ggctgctttt cccaaacttc tattctgcca accctctgtg 2160

ctcgccatcg agggcggcac tgctcacagg acggctaccc atccgcaatg gcttctacac 2220

caccaacgcc catgccagaa acgcctacac accgcaggag attgtgggcg gcatcccaga 2280

ctcggagcag ctcctgccgg agcttctgaa gaaggccggc tacgtcagca agattgtcgg 2340

caagtggcat ctgggtcaca ggccccagtt ccaccccctg aagcacggat ttgatgagtg 2400

gtttggatcc cccaactgcc actttggacc ttatgacaac aaggccaggc ccaacatccc 2460

tgtgtacagg gactgggaga tggttggcag atattatgaa gaatttccta ttaatctgaa 2520

gacgggggaa gccaacctca cccagatcta cctgcaggaa gccctggact tcattaagag 2580

acaggcacgg caccacccct ttttcctcta ctgggctgtc gacgccacgc acgcacccgt 2640

ctatgcctcc aaacccttct tgggcaccag tcagcgaggg cggtatggag acgccgtccg 2700

ggagattgat gacagcattg ggaagatact ggagctcctc caagacctgc acgtcgcgga 2760

caacaccttc gtcttcttca cgtcggacaa cggcgctgcc ctcatttccg cccccgaaca 2820

aggtggcagc aacggcccct ttctgtgtgg gaagcagacc acgtttgaag gagggatgag 2880

ggagcctgcc ctcgcatggt ggccagggca cgtcactgca ggccaggtga gccaccagct 2940

gggcagcatc atggacctct tcaccaccag cctggccctt gcgggcctga cgccgcccag 3000

cgacagggcc attgatggcc tcaacctcct ccccaccctc ctgcagggcc ggctgatgga 3060

caggcctatc ttctattacc gtggcgacac gctgatggcg gccaccctcg ggcagcacaa 3120

ggctcacttc tggacctgga ccaactcctg ggagaacttc agacagggca ttgatttctg 3180

ccctgggcag aacgtttcag gggtcacaac tcacaatctg gaagaccaca cgaagctgcc 3240

cctgatcttc cacctgggac gggacccagg ggagaggttc cccctcagct ttgccagcgc 3300

cgagtaccag gaggccctca gcaggatcac ctcggtcgtc cagcagcacc aggaggcctt 3360

ggtccccgcg cagccccagc tcaacgtgtg caactgggcg gtcatgaact gggcacctcc 3420

gggctgtgaa aagttaggga agtgtctgac acctccagaa tccattccca agaagtgcct 3480

ctggtcccac taggaattcg agctcggtac ccgggaatca attcactcct caggtgcagg 3540

ctgcctatca gaaggtggtg gctggtgtgg ccaatgccct ggctcacaaa taccactgag 3600

atctttttcc ctctgccaaa aattatgggg acatcatgaa gccccttgag catctgactt 3660

ctggctaata aaggaaattt attttcattg caatagtgtg ttggaatttt ttgtgtctct 3720

cactcggaag gacatatggg agggcaaatc atttaaaaca tcagaatgag tatttggttt 3780

agagtttggc aacatatgcc catatgctgg ctgccatgaa caaaggttgg ctataaagag 3840

gtcatcagta tatgaaacag ccccctgctg tccattcctt attccataga aaagccttga 3900

cttgaggtta gatttttttt atattttgtt ttgtgttatt tttttcttta acatccctaa 3960

aattttcctt acatgtttta ctagccagat ttttcctcct ctcctgacta ctcccagtca 4020

tagctgtccc tcttctctta tggagatccc tcgacctgca gcccaagctg tagataagta 4080

gcatggcggg ttaatcatta actacaagga acccctagtg atggagttgg ccactccctc 4140

tctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggctttg cccgggcggc ctcagtgagc 4200

gagcgagcgc gcagctgcat taatgaatcg gccaacgcgc ggggagaggc ggtttgcgta 4260

ttgggcgctc ttccgcttcc tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt cggctgcggc 4320

gagcggtatc agctcactca aaggcggtaa tacggttatc cacagaatca ggggataacg 4380

caggaaagaa catgtgagca aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt 4440

tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa 4500

gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct 4560

ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc 4620

cttcgggaag cgtggcgctt tctcatagct cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg 4680

tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct 4740

tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag 4800

cagccactgg taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga 4860

agtggtggcc taactacggc tacactagaa gaacagtatt tggtatctgc gctctgctga 4920

agccagttac cttcggaaaa agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg 4980

gtagcggtgg tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag 5040

aagatccttt gatcttttct acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag 5100

ggattttggt catgagatta tcaaaaagga tcttcaccta gatcctttta aattaaaaat 5160

gaagttttaa atcaatctaa agtatatatg agtaaacttg gtctgacagt taccaatgct 5220

taatcagtga ggcacctatc tcagcgatct gtctatttcg ttcatccata gttgcctgac 5280

tccccgtcgt gtagataact acgatacggg agggcttacc atctggcccc agtgctgcaa 5340

tgataccgcg agacccacgc tcaccggctc cagatttatc agcaataaac cagccagccg 5400

gaagggccga gcgcagaagt ggtcctgcaa ctttatccgc ctccatccag tctattaatt 5460

gttgccggga agctagagta agtagttcgc cagttaatag tttgcgcaac gttgttgcca 5520

ttgctacagg catcgtggtg tcacgctcgt cgtttggtat ggcttcattc agctccggtt 5580

cccaacgatc aaggcgagtt acatgatccc ccatgttgtg caaaaaagcg gttagctcct 5640

tcggtcctcc gatcgttgtc agaagtaagt tggccgcagt gttatcactc atggttatgg 5700

cagcactgca taattctctt actgtcatgc catccgtaag atgcttttct gtgactggtg 5760

agtactcaac caagtcattc tgagaatagt gtatgcggcg accgagttgc tcttgcccgg 5820

cgtcaatacg ggataatacc gcgccacata gcagaacttt aaaagtgctc atcattggaa 5880

aacgttcttc ggggcgaaaa ctctcaagga tcttaccgct gttgagatcc agttcgatgt 5940

aacccactcg tgcacccaac tgatcttcag catcttttac tttcaccagc gtttctgggt 6000

gagcaaaaac aggaaggcaa aatgccgcaa aaaagggaat aagggcgaca cggaaatgtt 6060

gaatactcat actcttcctt tttcaatatt attgaagcat ttatcagggt tattgtctca 6120

tgagcggata catatttgaa tgtatttaga aaaataaaca aataggggtt ccgcgcacat 6180

ttccccgaaa agtgccacct gacgtctaag aaaccattat tatcatgaca ttaacctata 6240

aaaataggcg tatcacgagg ccctttcgtc tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc 6300

tctgacacat gcagctcccg gagacggtca cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca 6360

gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg 6420

cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat 6480

gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgat tccaacatcc aataaatcat acaggcaagg 6540

caaagaatta gcaaaattaa gcaataaagc ctcagagcat aaagctaaat cggttgtacc 6600

aaaaacatta tgaccctgta atacttttgc gggagaagcc tttatttcaa cgcaaggata 6660

aaaattttta gaaccctcat atattttaaa tgcaatgcct gagtaatgtg taggtaaaga 6720

ttcaaacggg tgagaaaggc cggagacagt caaatcacca tcaatatgat attcaaccgt 6780

tctagctgat aaattcatgc cggagagggt agctattttt gagaggtctc tacaaaggct 6840

atcaggtcat tgcctgagag tctggagcaa acaagagaat cgatgaacgg taatcgtaaa 6900

actagcatgt caatcatatg taccccggtt gataatcaga aaagccccaa aaacaggaag 6960

attgtataag caaatattta aattgtaagc gttaatattt tgttaaaatt cgcgttaaat 7020

ttttgttaaa tcagctcatt ttttaaccaa taggccgaaa tcggcaaaat cccttataaa 7080

tcaaaagaat agaccgagat agggttgagt gttgttccag tttggaacaa gagtccacta 7140

ttaaagaacg tggactccaa cgtcaaaggg cgaaaaaccg tctatcaggg cgatggccca 7200

ctacgtgaac catcacccta atcaagtttt ttggggtcga ggtgccgtaa agcactaaat 7260

cggaacccta aagggagccc ccgatttaga gcttgacggg gaaagccggc gaacgtggcg 7320

agaaaggaag ggaagaaagc gaaaggagcg ggcgctaggg cgctggcaag tgtagcggtc 7380

acgctgcgcg taaccaccac acccgccgcg cttaatgcgc cgctacaggg cgcgtactat 7440

ggttgctttg acgagcacgt ataacgtgct ttcctcgtta gaatcagagc gggagctaaa 7500

caggaggccg attaaaggga ttttagacag gaacggtacg ccagaatcct gagaagtgtt 7560

tttataatca gtgaggccac cgagtaaaag agtctgtcca tcacgcaaat taaccgttgt 7620

cgcaatactt ctttgattag taataacatc acttgcctga gtagaagaac tcaaactatc 7680

ggccttgctg gtaatatcca gaacaatatt accgccagcc attgcaacgg aatcgccatt 7740

cgccattcag gctgcgcaac tgttgggaag ggcgatcggt gcgggcctct tcgctattac 7800

gcca 7804

<210> 3

<211> 1577

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CDS ohGALNS-version1

<400> 3

tgccaccatg gctgctgtgg tggctgccac aagatggtgg cagctgctgc tggtgctgag 60

cgccgctgga atgggagctt ctggcgctcc ccagcccccc aatattctcc tgctgctgat 120

ggacgacatg ggctggggcg atctgggagt gtacggcgag cctagcagag agacacccaa 180

cctggacaga atggccgccg agggcctgct gttccccaac ttctacagcg ccaaccccct 240

gtgcagccca tctagagccg ctctgctgac cggcagactg cccatcagaa acggcttcta 300

caccaccaac gcccacgccc ggaacgccta cacaccccag gaaatcgtgg gcggcatccc 360

cgatagcgaa cagctgctgc ctgagctgct gaagaaagcc ggctacgtgt ccaagatcgt 420

gggcaagtgg cacctgggcc acagacccca gttccaccct ctgaagcacg gcttcgacga 480

gtggttcggc agccccaatt gccacttcgg cccctacgac aacaaggcca gacccaacat 540

ccccgtgtac cgggactggg agatggtggg acggtactac gaagagttcc ccatcaacct 600

gaaaaccggc gaggccaacc tgacccagat ctacctgcag gaagccctgg acttcatcaa 660

gcggcaggcc cggcaccacc ctttctttct gtactgggcc gtggacgcca cccacgcccc 720

tgtgtatgcc agcaagcctt tcctgggcac cagccagaga ggcagatacg gcgacgccgt 780

gcgcgagatc gatgacagca tcggcaagat cctggaactg ctgcaggacc tgcacgtggc 840

cgacaacacc ttcgtgttct tcaccagcga caacggcgct gccctgatct ctgctcctga 900

gcagggcggc agcaacggcc catttctgtg tggcaagcag accaccttcg agggcggcat 960

gagagaacct gccctggctt ggtggcctgg ccatgtgaca gctggacagg tgtcccacca 1020

gctgggcagc atcatggacc tgttcaccac cagcctggcc ctggccggac tgacacctcc 1080

aagcgacaga gccatcgacg gcctgaacct gctgcctacc ctgctgcagg gacggctgat 1140

ggaccggccc atcttctact acagaggcga caccctgatg gccgccacac tgggacagca 1200

caaggcccac ttttggacct ggaccaacag ctgggagaac ttccggcagg gcatcgactt 1260

ttgccctggc cagaatgtgt ccggcgtgac cacccacaac ctggaagatc acaccaagct 1320

gcccctgatt ttccacctgg gcagagatcc cggcgagcgg ttccctctgt cttttgccag 1380

cgccgagtac caggaagctc tgagcagaat cacctccgtg gtgcagcagc accaggaagc 1440

actggtgcct gctcagcccc agctgaacgt gtgcaattgg gccgtgatga actgggcccc 1500

tcccggctgt gaaaagctgg gaaagtgcct gaccccccct gagagcatcc ccaagaaatg 1560

cctgtggtcc cactgag 1577

<210> 4

<211> 7804

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> pAAV-CAG-ohGALNSversion1

<400> 4

gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc gggcgacctt 60

tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca actccatcac 120

taggggttcc ttgtagttaa tgattaaccc gccatgctac ttatctactc gacattgatt 180

attgactagt tattaatagt aatcaattac ggggtcatta gttcatagcc catatatgga 240

gttccgcgtt acataactta cggtaaatgg cccgcctggc tgaccgccca acgacccccg 300

cccattgacg tcaataatga cgtatgttcc catagtaacg ccaataggga ctttccattg 360

acgtcaatgg gtggagtatt tacggtaaac tgcccacttg gcagtacatc aagtgtatca 420

tatgccaagt acgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa tggcccgcct ggcattatgc 480

ccagtacatg accttatggg actttcctac ttggcagtac atctacgtat tagtcatcgc 540

tattaccatg gtcgaggtga gccccacgtt ctgcttcact ctccccatct cccccccctc 600

cccaccccca attttgtatt tatttatttt ttaattattt tgtgcagcga tgggggcggg 660

gggggggggg gggcgcgcgc caggcggggc ggggcggggc gaggggcggg gcggggcgag 720

gcggagaggt gcggcggcag ccaatcagag cggcgcgctc cgaaagtttc cttttatggc 780

gaggcggcgg cggcggcggc cctataaaaa gcgaagcgcg cggcgggcgg gagtcgctgc 840

gttgccttcg ccccgtgccc cgctccgccg ccgcctcgcg ccgcccgccc cggctctgac 900

tgaccgcgtt actcccacag gtgagcgggc gggacggccc ttctcctccg ggctgtaatt 960

agcgcttggt ttaatgacgg cttgtttctt ttctgtggct gcgtgaaagc cttgaggggc 1020

tccgggaggg ccctttgtgc ggggggagcg gctcgggggg tgcgtgcgtg tgtgtgtgcg 1080

tggggagcgc cgcgtgcggc tccgcgctgc ccggcggctg tgagcgctgc gggcgcggcg 1140

cggggctttg tgcgctccgc agtgtgcgcg aggggagcgc ggccgggggc ggtgccccgc 1200

ggtgcggggg gggctgcgag gggaacaaag gctgcgtgcg gggtgtgtgc gtgggggggt 1260

gagcaggggg tgtgggcgcg tcggtcgggc tgcaaccccc cctgcacccc cctccccgag 1320

ttgctgagca cggcccggct tcgggtgcgg ggctccgtac ggggcgtggc gcggggctcg 1380

ccgtgccggg cggggggtgg cggcaggtgg gggtgccggg cggggcgggg ccgcctcggg 1440

ccggggaggg ctcgggggag gggcgcggcg gcccccggag cgccggcggc tgtcgaggcg 1500

cggcgagccg cagccattgc cttttatggt aatcgtgcga gagggcgcag ggacttcctt 1560

tgtcccaaat ctgtgcggag ccgaaatctg ggaggcgccg ccgcaccccc tctagcgggc 1620

gcggggcgaa gcggtgcggc gccggcagga aggaaatggg cggggagggc cttcgtgcgt 1680

cgccgcgccg ccgtcccctt ctccctctcc agcctcgggg ctgtccgcgg ggggacggct 1740

gccttcgggg gggacggggc agggcggggt tcggcttctg gcgtgtgacc ggcggctcta 1800

gagcctctgc taaccatgtt catgccttct tctttttcct acagctcctg ggcaacgtgc 1860

tggttattgt gctgtctcat cattttggca aagaattgat taattcgagc gaacgcgtgc 1920

caccatggct gctgtggtgg ctgccacaag atggtggcag ctgctgctgg tgctgagcgc 1980

cgctggaatg ggagcttctg gcgctcccca gccccccaat attctcctgc tgctgatgga 2040

cgacatgggc tggggcgatc tgggagtgta cggcgagcct agcagagaga cacccaacct 2100

ggacagaatg gccgccgagg gcctgctgtt ccccaacttc tacagcgcca accccctgtg 2160

cagcccatct agagccgctc tgctgaccgg cagactgccc atcagaaacg gcttctacac 2220

caccaacgcc cacgcccgga acgcctacac accccaggaa atcgtgggcg gcatccccga 2280

tagcgaacag ctgctgcctg agctgctgaa gaaagccggc tacgtgtcca agatcgtggg 2340

caagtggcac ctgggccaca gaccccagtt ccaccctctg aagcacggct tcgacgagtg 2400

gttcggcagc cccaattgcc acttcggccc ctacgacaac aaggccagac ccaacatccc 2460

cgtgtaccgg gactgggaga tggtgggacg gtactacgaa gagttcccca tcaacctgaa 2520

aaccggcgag gccaacctga cccagatcta cctgcaggaa gccctggact tcatcaagcg 2580

gcaggcccgg caccaccctt tctttctgta ctgggccgtg gacgccaccc acgcccctgt 2640

gtatgccagc aagcctttcc tgggcaccag ccagagaggc agatacggcg acgccgtgcg 2700

cgagatcgat gacagcatcg gcaagatcct ggaactgctg caggacctgc acgtggccga 2760

caacaccttc gtgttcttca ccagcgacaa cggcgctgcc ctgatctctg ctcctgagca 2820

gggcggcagc aacggcccat ttctgtgtgg caagcagacc accttcgagg gcggcatgag 2880

agaacctgcc ctggcttggt ggcctggcca tgtgacagct ggacaggtgt cccaccagct 2940

gggcagcatc atggacctgt tcaccaccag cctggccctg gccggactga cacctccaag 3000

cgacagagcc atcgacggcc tgaacctgct gcctaccctg ctgcagggac ggctgatgga 3060

ccggcccatc ttctactaca gaggcgacac cctgatggcc gccacactgg gacagcacaa 3120

ggcccacttt tggacctgga ccaacagctg ggagaacttc cggcagggca tcgacttttg 3180

ccctggccag aatgtgtccg gcgtgaccac ccacaacctg gaagatcaca ccaagctgcc 3240

cctgattttc cacctgggca gagatcccgg cgagcggttc cctctgtctt ttgccagcgc 3300

cgagtaccag gaagctctga gcagaatcac ctccgtggtg cagcagcacc aggaagcact 3360

ggtgcctgct cagccccagc tgaacgtgtg caattgggcc gtgatgaact gggcccctcc 3420

cggctgtgaa aagctgggaa agtgcctgac cccccctgag agcatcccca agaaatgcct 3480

gtggtcccac tgagaattcg agctcggtac ccgggaatca attcactcct caggtgcagg 3540

ctgcctatca gaaggtggtg gctggtgtgg ccaatgccct ggctcacaaa taccactgag 3600

atctttttcc ctctgccaaa aattatgggg acatcatgaa gccccttgag catctgactt 3660

ctggctaata aaggaaattt attttcattg caatagtgtg ttggaatttt ttgtgtctct 3720

cactcggaag gacatatggg agggcaaatc atttaaaaca tcagaatgag tatttggttt 3780

agagtttggc aacatatgcc catatgctgg ctgccatgaa caaaggttgg ctataaagag 3840

gtcatcagta tatgaaacag ccccctgctg tccattcctt attccataga aaagccttga 3900

cttgaggtta gatttttttt atattttgtt ttgtgttatt tttttcttta acatccctaa 3960

aattttcctt acatgtttta ctagccagat ttttcctcct ctcctgacta ctcccagtca 4020

tagctgtccc tcttctctta tggagatccc tcgacctgca gcccaagctg tagataagta 4080

gcatggcggg ttaatcatta actacaagga acccctagtg atggagttgg ccactccctc 4140

tctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggctttg cccgggcggc ctcagtgagc 4200

gagcgagcgc gcagctgcat taatgaatcg gccaacgcgc ggggagaggc ggtttgcgta 4260

ttgggcgctc ttccgcttcc tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt cggctgcggc 4320

gagcggtatc agctcactca aaggcggtaa tacggttatc cacagaatca ggggataacg 4380

caggaaagaa catgtgagca aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt 4440

tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa 4500

gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct 4560

ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc 4620

cttcgggaag cgtggcgctt tctcatagct cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg 4680

tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct 4740

tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag 4800

cagccactgg taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga 4860

agtggtggcc taactacggc tacactagaa gaacagtatt tggtatctgc gctctgctga 4920

agccagttac cttcggaaaa agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg 4980

gtagcggtgg tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag 5040

aagatccttt gatcttttct acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag 5100

ggattttggt catgagatta tcaaaaagga tcttcaccta gatcctttta aattaaaaat 5160

gaagttttaa atcaatctaa agtatatatg agtaaacttg gtctgacagt taccaatgct 5220

taatcagtga ggcacctatc tcagcgatct gtctatttcg ttcatccata gttgcctgac 5280

tccccgtcgt gtagataact acgatacggg agggcttacc atctggcccc agtgctgcaa 5340

tgataccgcg agacccacgc tcaccggctc cagatttatc agcaataaac cagccagccg 5400

gaagggccga gcgcagaagt ggtcctgcaa ctttatccgc ctccatccag tctattaatt 5460

gttgccggga agctagagta agtagttcgc cagttaatag tttgcgcaac gttgttgcca 5520

ttgctacagg catcgtggtg tcacgctcgt cgtttggtat ggcttcattc agctccggtt 5580

cccaacgatc aaggcgagtt acatgatccc ccatgttgtg caaaaaagcg gttagctcct 5640

tcggtcctcc gatcgttgtc agaagtaagt tggccgcagt gttatcactc atggttatgg 5700

cagcactgca taattctctt actgtcatgc catccgtaag atgcttttct gtgactggtg 5760

agtactcaac caagtcattc tgagaatagt gtatgcggcg accgagttgc tcttgcccgg 5820

cgtcaatacg ggataatacc gcgccacata gcagaacttt aaaagtgctc atcattggaa 5880

aacgttcttc ggggcgaaaa ctctcaagga tcttaccgct gttgagatcc agttcgatgt 5940

aacccactcg tgcacccaac tgatcttcag catcttttac tttcaccagc gtttctgggt 6000

gagcaaaaac aggaaggcaa aatgccgcaa aaaagggaat aagggcgaca cggaaatgtt 6060

gaatactcat actcttcctt tttcaatatt attgaagcat ttatcagggt tattgtctca 6120

tgagcggata catatttgaa tgtatttaga aaaataaaca aataggggtt ccgcgcacat 6180

ttccccgaaa agtgccacct gacgtctaag aaaccattat tatcatgaca ttaacctata 6240

aaaataggcg tatcacgagg ccctttcgtc tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc 6300

tctgacacat gcagctcccg gagacggtca cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca 6360

gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg 6420

cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat 6480

gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgat tccaacatcc aataaatcat acaggcaagg 6540

caaagaatta gcaaaattaa gcaataaagc ctcagagcat aaagctaaat cggttgtacc 6600

aaaaacatta tgaccctgta atacttttgc gggagaagcc tttatttcaa cgcaaggata 6660

aaaattttta gaaccctcat atattttaaa tgcaatgcct gagtaatgtg taggtaaaga 6720

ttcaaacggg tgagaaaggc cggagacagt caaatcacca tcaatatgat attcaaccgt 6780

tctagctgat aaattcatgc cggagagggt agctattttt gagaggtctc tacaaaggct 6840

atcaggtcat tgcctgagag tctggagcaa acaagagaat cgatgaacgg taatcgtaaa 6900

actagcatgt caatcatatg taccccggtt gataatcaga aaagccccaa aaacaggaag 6960

attgtataag caaatattta aattgtaagc gttaatattt tgttaaaatt cgcgttaaat 7020

ttttgttaaa tcagctcatt ttttaaccaa taggccgaaa tcggcaaaat cccttataaa 7080

tcaaaagaat agaccgagat agggttgagt gttgttccag tttggaacaa gagtccacta 7140

ttaaagaacg tggactccaa cgtcaaaggg cgaaaaaccg tctatcaggg cgatggccca 7200

ctacgtgaac catcacccta atcaagtttt ttggggtcga ggtgccgtaa agcactaaat 7260

cggaacccta aagggagccc ccgatttaga gcttgacggg gaaagccggc gaacgtggcg 7320

agaaaggaag ggaagaaagc gaaaggagcg ggcgctaggg cgctggcaag tgtagcggtc 7380

acgctgcgcg taaccaccac acccgccgcg cttaatgcgc cgctacaggg cgcgtactat 7440

ggttgctttg acgagcacgt ataacgtgct ttcctcgtta gaatcagagc gggagctaaa 7500

caggaggccg attaaaggga ttttagacag gaacggtacg ccagaatcct gagaagtgtt 7560

tttataatca gtgaggccac cgagtaaaag agtctgtcca tcacgcaaat taaccgttgt 7620

cgcaatactt ctttgattag taataacatc acttgcctga gtagaagaac tcaaactatc 7680

ggccttgctg gtaatatcca gaacaatatt accgccagcc attgcaacgg aatcgccatt 7740

cgccattcag gctgcgcaac tgttgggaag ggcgatcggt gcgggcctct tcgctattac 7800

gcca 7804

<210> 5

<211> 1577

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CDS ohGALNS-version2

<400> 5

tgccaccatg gccgccgtgg tcgccgcaac tcgatggtgg cagctgctgc tggtcctgtc 60

cgccgctggc atgggagcct ctggagcccc tcagccccct aacatcctgc tgctgctgat 120

ggacgatatg ggatggggcg acctgggcgt gtacggagag ccaagccggg agacacccaa 180

tctggatagg atggcagcag agggcctgct gttcccaaac ttttattccg ccaatcctct 240

gtgcagccca tcccgcgccg ccctgctgac cggccggctg cccatcagaa acggcttcta 300

caccacaaac gcccacgccc ggaatgccta tacacctcag gagatcgtgg gcggcatccc 360

cgactctgag cagctgctgc ctgagctgct gaagaaggcc ggctacgtga gcaagatcgt 420

gggcaagtgg cacctgggac acaggccaca gttccaccct ctgaagcacg gcttcgatga 480

gtggtttggc agccccaatt gtcactttgg cccttacgac aacaaggcca gacccaatat 540

ccccgtgtac agagattggg agatggtggg caggtactat gaggagttcc ctatcaacct 600

gaagaccggc gaggccaatc tgacacagat ctacctgcag gaggccctgg actttatcaa 660

gaggcaggcc cgccaccacc ccttctttct gtactgggca gtggatgcaa cccacgcacc 720

agtgtatgcc tctaagccct tcctgggcac aagccagagg ggcagatatg gcgacgccgt 780

gagagagatc gacgattcta tcggcaagat cctggagctg ctgcaggacc tgcacgtggc 840

cgataacacc ttcgtgttct tcacatccga taatggagcc gccctgatct ccgccccaga 900

gcagggagga tctaacggac ccttcctgtg cggcaagcag accacatttg agggaggaat 960

gagggagcct gccctggcat ggtggccagg ccacgtgacc gccggccagg tgagccacca 1020

gctgggctcc atcatggacc tgttcaccac aagcctggcc ctggcaggcc tgaccccacc 1080

atccgacaga gccatcgatg gcctgaatct gctgcctaca ctgctgcagg gcaggctgat 1140

ggaccgccca atcttctact ataggggcga taccctgatg gcagccacac tgggacagca 1200

caaggcacac ttttggacct ggacaaactc ctgggagaat ttccgccagg gcatcgattt 1260

ttgtccaggc cagaacgtgt ctggcgtgac cacacacaat ctggaggacc acaccaagct 1320

gcccctgatc tttcacctgg gccgggatcc tggcgagaga ttcccactgt cttttgccag 1380

cgccgagtac caggaggccc tgtcccggat cacatctgtg gtgcagcagc accaggaggc 1440

cctggtgcca gcacagcccc agctgaacgt gtgcaattgg gccgtgatga actgggcccc 1500

tccaggctgt gagaaactgg gcaaatgtct gactccccct gaatctatcc ctaagaagtg 1560

tctgtggtcc cattagg 1577

<210> 6

<211> 7804

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> pAAV-CAG-ohGALNS-version2

<400> 6

gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc gggcgacctt 60

tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca actccatcac 120

taggggttcc ttgtagttaa tgattaaccc gccatgctac ttatctactc gacattgatt 180

attgactagt tattaatagt aatcaattac ggggtcatta gttcatagcc catatatgga 240

gttccgcgtt acataactta cggtaaatgg cccgcctggc tgaccgccca acgacccccg 300

cccattgacg tcaataatga cgtatgttcc catagtaacg ccaataggga ctttccattg 360

acgtcaatgg gtggagtatt tacggtaaac tgcccacttg gcagtacatc aagtgtatca 420

tatgccaagt acgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa tggcccgcct ggcattatgc 480

ccagtacatg accttatggg actttcctac ttggcagtac atctacgtat tagtcatcgc 540

tattaccatg gtcgaggtga gccccacgtt ctgcttcact ctccccatct cccccccctc 600

cccaccccca attttgtatt tatttatttt ttaattattt tgtgcagcga tgggggcggg 660

gggggggggg gggcgcgcgc caggcggggc ggggcggggc gaggggcggg gcggggcgag 720

gcggagaggt gcggcggcag ccaatcagag cggcgcgctc cgaaagtttc cttttatggc 780

gaggcggcgg cggcggcggc cctataaaaa gcgaagcgcg cggcgggcgg gagtcgctgc 840

gttgccttcg ccccgtgccc cgctccgccg ccgcctcgcg ccgcccgccc cggctctgac 900

tgaccgcgtt actcccacag gtgagcgggc gggacggccc ttctcctccg ggctgtaatt 960

agcgcttggt ttaatgacgg cttgtttctt ttctgtggct gcgtgaaagc cttgaggggc 1020

tccgggaggg ccctttgtgc ggggggagcg gctcgggggg tgcgtgcgtg tgtgtgtgcg 1080

tggggagcgc cgcgtgcggc tccgcgctgc ccggcggctg tgagcgctgc gggcgcggcg 1140

cggggctttg tgcgctccgc agtgtgcgcg aggggagcgc ggccgggggc ggtgccccgc 1200

ggtgcggggg gggctgcgag gggaacaaag gctgcgtgcg gggtgtgtgc gtgggggggt 1260

gagcaggggg tgtgggcgcg tcggtcgggc tgcaaccccc cctgcacccc cctccccgag 1320

ttgctgagca cggcccggct tcgggtgcgg ggctccgtac ggggcgtggc gcggggctcg 1380

ccgtgccggg cggggggtgg cggcaggtgg gggtgccggg cggggcgggg ccgcctcggg 1440

ccggggaggg ctcgggggag gggcgcggcg gcccccggag cgccggcggc tgtcgaggcg 1500

cggcgagccg cagccattgc cttttatggt aatcgtgcga gagggcgcag ggacttcctt 1560

tgtcccaaat ctgtgcggag ccgaaatctg ggaggcgccg ccgcaccccc tctagcgggc 1620

gcggggcgaa gcggtgcggc gccggcagga aggaaatggg cggggagggc cttcgtgcgt 1680

cgccgcgccg ccgtcccctt ctccctctcc agcctcgggg ctgtccgcgg ggggacggct 1740

gccttcgggg gggacggggc agggcggggt tcggcttctg gcgtgtgacc ggcggctcta 1800

gagcctctgc taaccatgtt catgccttct tctttttcct acagctcctg ggcaacgtgc 1860

tggttattgt gctgtctcat cattttggca aagaattgat taattcgagc gaacgcgtgc 1920

caccatggcc gccgtggtcg ccgcaactcg atggtggcag ctgctgctgg tcctgtccgc 1980

cgctggcatg ggagcctctg gagcccctca gccccctaac atcctgctgc tgctgatgga 2040

cgatatggga tggggcgacc tgggcgtgta cggagagcca agccgggaga cacccaatct 2100

ggataggatg gcagcagagg gcctgctgtt cccaaacttt tattccgcca atcctctgtg 2160

cagcccatcc cgcgccgccc tgctgaccgg ccggctgccc atcagaaacg gcttctacac 2220

cacaaacgcc cacgcccgga atgcctatac acctcaggag atcgtgggcg gcatccccga 2280

ctctgagcag ctgctgcctg agctgctgaa gaaggccggc tacgtgagca agatcgtggg 2340

caagtggcac ctgggacaca ggccacagtt ccaccctctg aagcacggct tcgatgagtg 2400

gtttggcagc cccaattgtc actttggccc ttacgacaac aaggccagac ccaatatccc 2460

cgtgtacaga gattgggaga tggtgggcag gtactatgag gagttcccta tcaacctgaa 2520

gaccggcgag gccaatctga cacagatcta cctgcaggag gccctggact ttatcaagag 2580

gcaggcccgc caccacccct tctttctgta ctgggcagtg gatgcaaccc acgcaccagt 2640

gtatgcctct aagcccttcc tgggcacaag ccagaggggc agatatggcg acgccgtgag 2700

agagatcgac gattctatcg gcaagatcct ggagctgctg caggacctgc acgtggccga 2760

taacaccttc gtgttcttca catccgataa tggagccgcc ctgatctccg ccccagagca 2820

gggaggatct aacggaccct tcctgtgcgg caagcagacc acatttgagg gaggaatgag 2880

ggagcctgcc ctggcatggt ggccaggcca cgtgaccgcc ggccaggtga gccaccagct 2940

gggctccatc atggacctgt tcaccacaag cctggccctg gcaggcctga ccccaccatc 3000

cgacagagcc atcgatggcc tgaatctgct gcctacactg ctgcagggca ggctgatgga 3060

ccgcccaatc ttctactata ggggcgatac cctgatggca gccacactgg gacagcacaa 3120

ggcacacttt tggacctgga caaactcctg ggagaatttc cgccagggca tcgatttttg 3180

tccaggccag aacgtgtctg gcgtgaccac acacaatctg gaggaccaca ccaagctgcc 3240

cctgatcttt cacctgggcc gggatcctgg cgagagattc ccactgtctt ttgccagcgc 3300

cgagtaccag gaggccctgt cccggatcac atctgtggtg cagcagcacc aggaggccct 3360

ggtgccagca cagccccagc tgaacgtgtg caattgggcc gtgatgaact gggcccctcc 3420

aggctgtgag aaactgggca aatgtctgac tccccctgaa tctatcccta agaagtgtct 3480

gtggtcccat taggaattcg agctcggtac ccgggaatca attcactcct caggtgcagg 3540

ctgcctatca gaaggtggtg gctggtgtgg ccaatgccct ggctcacaaa taccactgag 3600

atctttttcc ctctgccaaa aattatgggg acatcatgaa gccccttgag catctgactt 3660

ctggctaata aaggaaattt attttcattg caatagtgtg ttggaatttt ttgtgtctct 3720

cactcggaag gacatatggg agggcaaatc atttaaaaca tcagaatgag tatttggttt 3780

agagtttggc aacatatgcc catatgctgg ctgccatgaa caaaggttgg ctataaagag 3840

gtcatcagta tatgaaacag ccccctgctg tccattcctt attccataga aaagccttga 3900

cttgaggtta gatttttttt atattttgtt ttgtgttatt tttttcttta acatccctaa 3960

aattttcctt acatgtttta ctagccagat ttttcctcct ctcctgacta ctcccagtca 4020

tagctgtccc tcttctctta tggagatccc tcgacctgca gcccaagctg tagataagta 4080

gcatggcggg ttaatcatta actacaagga acccctagtg atggagttgg ccactccctc 4140

tctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggctttg cccgggcggc ctcagtgagc 4200

gagcgagcgc gcagctgcat taatgaatcg gccaacgcgc ggggagaggc ggtttgcgta 4260

ttgggcgctc ttccgcttcc tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt cggctgcggc 4320

gagcggtatc agctcactca aaggcggtaa tacggttatc cacagaatca ggggataacg 4380

caggaaagaa catgtgagca aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt 4440

tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa 4500

gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct 4560

ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc 4620

cttcgggaag cgtggcgctt tctcatagct cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg 4680

tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct 4740

tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag 4800

cagccactgg taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga 4860

agtggtggcc taactacggc tacactagaa gaacagtatt tggtatctgc gctctgctga 4920

agccagttac cttcggaaaa agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg 4980

gtagcggtgg tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag 5040

aagatccttt gatcttttct acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag 5100

ggattttggt catgagatta tcaaaaagga tcttcaccta gatcctttta aattaaaaat 5160

gaagttttaa atcaatctaa agtatatatg agtaaacttg gtctgacagt taccaatgct 5220

taatcagtga ggcacctatc tcagcgatct gtctatttcg ttcatccata gttgcctgac 5280

tccccgtcgt gtagataact acgatacggg agggcttacc atctggcccc agtgctgcaa 5340

tgataccgcg agacccacgc tcaccggctc cagatttatc agcaataaac cagccagccg 5400

gaagggccga gcgcagaagt ggtcctgcaa ctttatccgc ctccatccag tctattaatt 5460

gttgccggga agctagagta agtagttcgc cagttaatag tttgcgcaac gttgttgcca 5520

ttgctacagg catcgtggtg tcacgctcgt cgtttggtat ggcttcattc agctccggtt 5580

cccaacgatc aaggcgagtt acatgatccc ccatgttgtg caaaaaagcg gttagctcct 5640

tcggtcctcc gatcgttgtc agaagtaagt tggccgcagt gttatcactc atggttatgg 5700

cagcactgca taattctctt actgtcatgc catccgtaag atgcttttct gtgactggtg 5760

agtactcaac caagtcattc tgagaatagt gtatgcggcg accgagttgc tcttgcccgg 5820

cgtcaatacg ggataatacc gcgccacata gcagaacttt aaaagtgctc atcattggaa 5880

aacgttcttc ggggcgaaaa ctctcaagga tcttaccgct gttgagatcc agttcgatgt 5940

aacccactcg tgcacccaac tgatcttcag catcttttac tttcaccagc gtttctgggt 6000

gagcaaaaac aggaaggcaa aatgccgcaa aaaagggaat aagggcgaca cggaaatgtt 6060

gaatactcat actcttcctt tttcaatatt attgaagcat ttatcagggt tattgtctca 6120

tgagcggata catatttgaa tgtatttaga aaaataaaca aataggggtt ccgcgcacat 6180

ttccccgaaa agtgccacct gacgtctaag aaaccattat tatcatgaca ttaacctata 6240

aaaataggcg tatcacgagg ccctttcgtc tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc 6300

tctgacacat gcagctcccg gagacggtca cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca 6360

gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg 6420

cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat 6480

gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgat tccaacatcc aataaatcat acaggcaagg 6540

caaagaatta gcaaaattaa gcaataaagc ctcagagcat aaagctaaat cggttgtacc 6600

aaaaacatta tgaccctgta atacttttgc gggagaagcc tttatttcaa cgcaaggata 6660

aaaattttta gaaccctcat atattttaaa tgcaatgcct gagtaatgtg taggtaaaga 6720

ttcaaacggg tgagaaaggc cggagacagt caaatcacca tcaatatgat attcaaccgt 6780

tctagctgat aaattcatgc cggagagggt agctattttt gagaggtctc tacaaaggct 6840

atcaggtcat tgcctgagag tctggagcaa acaagagaat cgatgaacgg taatcgtaaa 6900

actagcatgt caatcatatg taccccggtt gataatcaga aaagccccaa aaacaggaag 6960

attgtataag caaatattta aattgtaagc gttaatattt tgttaaaatt cgcgttaaat 7020

ttttgttaaa tcagctcatt ttttaaccaa taggccgaaa tcggcaaaat cccttataaa 7080

tcaaaagaat agaccgagat agggttgagt gttgttccag tttggaacaa gagtccacta 7140

ttaaagaacg tggactccaa cgtcaaaggg cgaaaaaccg tctatcaggg cgatggccca 7200

ctacgtgaac catcacccta atcaagtttt ttggggtcga ggtgccgtaa agcactaaat 7260

cggaacccta aagggagccc ccgatttaga gcttgacggg gaaagccggc gaacgtggcg 7320

agaaaggaag ggaagaaagc gaaaggagcg ggcgctaggg cgctggcaag tgtagcggtc 7380

acgctgcgcg taaccaccac acccgccgcg cttaatgcgc cgctacaggg cgcgtactat 7440

ggttgctttg acgagcacgt ataacgtgct ttcctcgtta gaatcagagc gggagctaaa 7500

caggaggccg attaaaggga ttttagacag gaacggtacg ccagaatcct gagaagtgtt 7560

tttataatca gtgaggccac cgagtaaaag agtctgtcca tcacgcaaat taaccgttgt 7620

cgcaatactt ctttgattag taataacatc acttgcctga gtagaagaac tcaaactatc 7680

ggccttgctg gtaatatcca gaacaatatt accgccagcc attgcaacgg aatcgccatt 7740

cgccattcag gctgcgcaac tgttgggaag ggcgatcggt gcgggcctct tcgctattac 7800

gcca 7804

<210> 7

<211> 1577

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CDS ohGALNS-version3

<400> 7

tgccaccatg gcagcggtgg tggccgcgac cagatggtgg cagcttctcc tggtcctgtc 60

ggccgcggga atgggtgcct cgggcgcgcc gcagccccct aacattctgc tgctgctgat 120

ggacgatatg ggatggggcg acctgggggt gtacggagag ccttcacggg aaacccccaa 180

cctggaccgc atggcggctg aaggcctgct gttcccgaac ttttactccg cgaatccgct 240

gtgctcccct tcgcgcgccg ccctcctgac cggacggttg cctatccgca acggcttcta 300

cactactaac gcacacgcca ggaacgccta caccccgcaa gaaattgtgg gaggaatccc 360

ggattccgaa cagctgctgc cggaactgct gaagaaggcc ggctacgtgt cgaagatcgt 420

gggaaagtgg catcttggtc atcggcctca gttccacccg ctcaagcacg ggttcgatga 480

atggttcgga tcccccaact gccactttgg cccctacgac aacaaggctc ggcctaacat 540

tcccgtctac cgggactggg aaatggtcgg aagatactac gaggagttcc ccatcaacct 600

caagactggc gaagccaacc tgactcagat ctacctccaa gaggccctgg acttcatcaa 660

gcgccaggcc cggcaccacc cgttcttcct ctattgggcg gtggacgcca cccatgcccc 720

cgtgtacgca tcaaagccgt tccttggaac tagccagaga ggcagatacg gggatgccgt 780

gcgcgaaatt gatgactcca tcggaaagat cctggagctg ctccaggacc tccatgtcgc 840

cgacaatacc ttcgtgttct ttacttccga taacggcgcc gccttgatca gcgccccgga 900

gcagggaggc tccaacggcc cttttctctg tgggaaacag accaccttcg agggagggat 960

gcgggaaccg gctctggctt ggtggcccgg acacgtgacc gccggccaag tgtcgcacca 1020

gcttggctcc atcatggact tgttcaccac ctcactggcc ctcgcggggc tcaccccacc 1080

aagcgaccga gcgattgacg gtctgaactt gctccccact ctgctgcaag gaaggctgat 1140

ggaccggccc atcttctact atcggggcga taccttgatg gccgccaccc tgggacagca 1200

caaggcccac ttttggactt ggacaaactc ctgggagaac ttccgccaag ggatcgactt 1260

ctgccccggt caaaacgtgt ccggcgtgac cacccacaac ctggaggacc ataccaagct 1320

gccactgatt ttccaccttg gtcgggaccc aggagagaga ttcccactga gcttcgcctc 1380

cgccgaatat caggaagcac tgtcccggat cacgagcgtg gtgcagcagc atcaggaggc 1440

cctggtgccg gcgcagccgc agctcaatgt ctgcaactgg gctgtgatga actgggcacc 1500

ccctggctgc gaaaaactcg ggaagtgtct gactccacct gagagcatcc cgaagaagtg 1560

cctgtggagc cactagg 1577

<210> 8

<211> 7804

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> pAAV-CAG-ohGALNS-version3

<400> 8

gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc gggcgacctt 60

tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca actccatcac 120

taggggttcc ttgtagttaa tgattaaccc gccatgctac ttatctactc gacattgatt 180

attgactagt tattaatagt aatcaattac ggggtcatta gttcatagcc catatatgga 240

gttccgcgtt acataactta cggtaaatgg cccgcctggc tgaccgccca acgacccccg 300

cccattgacg tcaataatga cgtatgttcc catagtaacg ccaataggga ctttccattg 360

acgtcaatgg gtggagtatt tacggtaaac tgcccacttg gcagtacatc aagtgtatca 420

tatgccaagt acgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa tggcccgcct ggcattatgc 480

ccagtacatg accttatggg actttcctac ttggcagtac atctacgtat tagtcatcgc 540

tattaccatg gtcgaggtga gccccacgtt ctgcttcact ctccccatct cccccccctc 600

cccaccccca attttgtatt tatttatttt ttaattattt tgtgcagcga tgggggcggg 660

gggggggggg gggcgcgcgc caggcggggc ggggcggggc gaggggcggg gcggggcgag 720

gcggagaggt gcggcggcag ccaatcagag cggcgcgctc cgaaagtttc cttttatggc 780

gaggcggcgg cggcggcggc cctataaaaa gcgaagcgcg cggcgggcgg gagtcgctgc 840

gttgccttcg ccccgtgccc cgctccgccg ccgcctcgcg ccgcccgccc cggctctgac 900

tgaccgcgtt actcccacag gtgagcgggc gggacggccc ttctcctccg ggctgtaatt 960

agcgcttggt ttaatgacgg cttgtttctt ttctgtggct gcgtgaaagc cttgaggggc 1020

tccgggaggg ccctttgtgc ggggggagcg gctcgggggg tgcgtgcgtg tgtgtgtgcg 1080

tggggagcgc cgcgtgcggc tccgcgctgc ccggcggctg tgagcgctgc gggcgcggcg 1140

cggggctttg tgcgctccgc agtgtgcgcg aggggagcgc ggccgggggc ggtgccccgc 1200

ggtgcggggg gggctgcgag gggaacaaag gctgcgtgcg gggtgtgtgc gtgggggggt 1260

gagcaggggg tgtgggcgcg tcggtcgggc tgcaaccccc cctgcacccc cctccccgag 1320

ttgctgagca cggcccggct tcgggtgcgg ggctccgtac ggggcgtggc gcggggctcg 1380

ccgtgccggg cggggggtgg cggcaggtgg gggtgccggg cggggcgggg ccgcctcggg 1440

ccggggaggg ctcgggggag gggcgcggcg gcccccggag cgccggcggc tgtcgaggcg 1500

cggcgagccg cagccattgc cttttatggt aatcgtgcga gagggcgcag ggacttcctt 1560

tgtcccaaat ctgtgcggag ccgaaatctg ggaggcgccg ccgcaccccc tctagcgggc 1620

gcggggcgaa gcggtgcggc gccggcagga aggaaatggg cggggagggc cttcgtgcgt 1680

cgccgcgccg ccgtcccctt ctccctctcc agcctcgggg ctgtccgcgg ggggacggct 1740

gccttcgggg gggacggggc agggcggggt tcggcttctg gcgtgtgacc ggcggctcta 1800

gagcctctgc taaccatgtt catgccttct tctttttcct acagctcctg ggcaacgtgc 1860

tggttattgt gctgtctcat cattttggca aagaattgat taattcgagc gaacgcgtgc 1920

caccatggca gcggtggtgg ccgcgaccag atggtggcag cttctcctgg tcctgtcggc 1980

cgcgggaatg ggtgcctcgg gcgcgccgca gccccctaac attctgctgc tgctgatgga 2040

cgatatggga tggggcgacc tgggggtgta cggagagcct tcacgggaaa cccccaacct 2100

ggaccgcatg gcggctgaag gcctgctgtt cccgaacttt tactccgcga atccgctgtg 2160

ctccccttcg cgcgccgccc tcctgaccgg acggttgcct atccgcaacg gcttctacac 2220

tactaacgca cacgccagga acgcctacac cccgcaagaa attgtgggag gaatcccgga 2280

ttccgaacag ctgctgccgg aactgctgaa gaaggccggc tacgtgtcga agatcgtggg 2340

aaagtggcat cttggtcatc ggcctcagtt ccacccgctc aagcacgggt tcgatgaatg 2400

gttcggatcc cccaactgcc actttggccc ctacgacaac aaggctcggc ctaacattcc 2460

cgtctaccgg gactgggaaa tggtcggaag atactacgag gagttcccca tcaacctcaa 2520

gactggcgaa gccaacctga ctcagatcta cctccaagag gccctggact tcatcaagcg 2580

ccaggcccgg caccacccgt tcttcctcta ttgggcggtg gacgccaccc atgcccccgt 2640

gtacgcatca aagccgttcc ttggaactag ccagagaggc agatacgggg atgccgtgcg 2700

cgaaattgat gactccatcg gaaagatcct ggagctgctc caggacctcc atgtcgccga 2760

caataccttc gtgttcttta cttccgataa cggcgccgcc ttgatcagcg ccccggagca 2820

gggaggctcc aacggccctt ttctctgtgg gaaacagacc accttcgagg gagggatgcg 2880

ggaaccggct ctggcttggt ggcccggaca cgtgaccgcc ggccaagtgt cgcaccagct 2940

tggctccatc atggacttgt tcaccacctc actggccctc gcggggctca ccccaccaag 3000

cgaccgagcg attgacggtc tgaacttgct ccccactctg ctgcaaggaa ggctgatgga 3060

ccggcccatc ttctactatc ggggcgatac cttgatggcc gccaccctgg gacagcacaa 3120

ggcccacttt tggacttgga caaactcctg ggagaacttc cgccaaggga tcgacttctg 3180

ccccggtcaa aacgtgtccg gcgtgaccac ccacaacctg gaggaccata ccaagctgcc 3240

actgattttc caccttggtc gggacccagg agagagattc ccactgagct tcgcctccgc 3300

cgaatatcag gaagcactgt cccggatcac gagcgtggtg cagcagcatc aggaggccct 3360

ggtgccggcg cagccgcagc tcaatgtctg caactgggct gtgatgaact gggcaccccc 3420

tggctgcgaa aaactcggga agtgtctgac tccacctgag agcatcccga agaagtgcct 3480

gtggagccac taggaattcg agctcggtac ccgggaatca attcactcct caggtgcagg 3540

ctgcctatca gaaggtggtg gctggtgtgg ccaatgccct ggctcacaaa taccactgag 3600

atctttttcc ctctgccaaa aattatgggg acatcatgaa gccccttgag catctgactt 3660

ctggctaata aaggaaattt attttcattg caatagtgtg ttggaatttt ttgtgtctct 3720

cactcggaag gacatatggg agggcaaatc atttaaaaca tcagaatgag tatttggttt 3780

agagtttggc aacatatgcc catatgctgg ctgccatgaa caaaggttgg ctataaagag 3840

gtcatcagta tatgaaacag ccccctgctg tccattcctt attccataga aaagccttga 3900

cttgaggtta gatttttttt atattttgtt ttgtgttatt tttttcttta acatccctaa 3960

aattttcctt acatgtttta ctagccagat ttttcctcct ctcctgacta ctcccagtca 4020

tagctgtccc tcttctctta tggagatccc tcgacctgca gcccaagctg tagataagta 4080

gcatggcggg ttaatcatta actacaagga acccctagtg atggagttgg ccactccctc 4140

tctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggctttg cccgggcggc ctcagtgagc 4200

gagcgagcgc gcagctgcat taatgaatcg gccaacgcgc ggggagaggc ggtttgcgta 4260

ttgggcgctc ttccgcttcc tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt cggctgcggc 4320

gagcggtatc agctcactca aaggcggtaa tacggttatc cacagaatca ggggataacg 4380

caggaaagaa catgtgagca aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt 4440

tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa 4500

gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct 4560

ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc 4620

cttcgggaag cgtggcgctt tctcatagct cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg 4680

tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct 4740

tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag 4800

cagccactgg taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga 4860

agtggtggcc taactacggc tacactagaa gaacagtatt tggtatctgc gctctgctga 4920

agccagttac cttcggaaaa agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg 4980

gtagcggtgg tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag 5040

aagatccttt gatcttttct acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag 5100

ggattttggt catgagatta tcaaaaagga tcttcaccta gatcctttta aattaaaaat 5160

gaagttttaa atcaatctaa agtatatatg agtaaacttg gtctgacagt taccaatgct 5220

taatcagtga ggcacctatc tcagcgatct gtctatttcg ttcatccata gttgcctgac 5280

tccccgtcgt gtagataact acgatacggg agggcttacc atctggcccc agtgctgcaa 5340

tgataccgcg agacccacgc tcaccggctc cagatttatc agcaataaac cagccagccg 5400

gaagggccga gcgcagaagt ggtcctgcaa ctttatccgc ctccatccag tctattaatt 5460

gttgccggga agctagagta agtagttcgc cagttaatag tttgcgcaac gttgttgcca 5520

ttgctacagg catcgtggtg tcacgctcgt cgtttggtat ggcttcattc agctccggtt 5580

cccaacgatc aaggcgagtt acatgatccc ccatgttgtg caaaaaagcg gttagctcct 5640

tcggtcctcc gatcgttgtc agaagtaagt tggccgcagt gttatcactc atggttatgg 5700

cagcactgca taattctctt actgtcatgc catccgtaag atgcttttct gtgactggtg 5760

agtactcaac caagtcattc tgagaatagt gtatgcggcg accgagttgc tcttgcccgg 5820

cgtcaatacg ggataatacc gcgccacata gcagaacttt aaaagtgctc atcattggaa 5880

aacgttcttc ggggcgaaaa ctctcaagga tcttaccgct gttgagatcc agttcgatgt 5940

aacccactcg tgcacccaac tgatcttcag catcttttac tttcaccagc gtttctgggt 6000

gagcaaaaac aggaaggcaa aatgccgcaa aaaagggaat aagggcgaca cggaaatgtt 6060

gaatactcat actcttcctt tttcaatatt attgaagcat ttatcagggt tattgtctca 6120

tgagcggata catatttgaa tgtatttaga aaaataaaca aataggggtt ccgcgcacat 6180

ttccccgaaa agtgccacct gacgtctaag aaaccattat tatcatgaca ttaacctata 6240

aaaataggcg tatcacgagg ccctttcgtc tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc 6300

tctgacacat gcagctcccg gagacggtca cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca 6360

gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg 6420

cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat 6480

gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgat tccaacatcc aataaatcat acaggcaagg 6540

caaagaatta gcaaaattaa gcaataaagc ctcagagcat aaagctaaat cggttgtacc 6600

aaaaacatta tgaccctgta atacttttgc gggagaagcc tttatttcaa cgcaaggata 6660

aaaattttta gaaccctcat atattttaaa tgcaatgcct gagtaatgtg taggtaaaga 6720

ttcaaacggg tgagaaaggc cggagacagt caaatcacca tcaatatgat attcaaccgt 6780

tctagctgat aaattcatgc cggagagggt agctattttt gagaggtctc tacaaaggct 6840

atcaggtcat tgcctgagag tctggagcaa acaagagaat cgatgaacgg taatcgtaaa 6900

actagcatgt caatcatatg taccccggtt gataatcaga aaagccccaa aaacaggaag 6960

attgtataag caaatattta aattgtaagc gttaatattt tgttaaaatt cgcgttaaat 7020

ttttgttaaa tcagctcatt ttttaaccaa taggccgaaa tcggcaaaat cccttataaa 7080

tcaaaagaat agaccgagat agggttgagt gttgttccag tttggaacaa gagtccacta 7140

ttaaagaacg tggactccaa cgtcaaaggg cgaaaaaccg tctatcaggg cgatggccca 7200

ctacgtgaac catcacccta atcaagtttt ttggggtcga ggtgccgtaa agcactaaat 7260

cggaacccta aagggagccc ccgatttaga gcttgacggg gaaagccggc gaacgtggcg 7320

agaaaggaag ggaagaaagc gaaaggagcg ggcgctaggg cgctggcaag tgtagcggtc 7380

acgctgcgcg taaccaccac acccgccgcg cttaatgcgc cgctacaggg cgcgtactat 7440

ggttgctttg acgagcacgt ataacgtgct ttcctcgtta gaatcagagc gggagctaaa 7500

caggaggccg attaaaggga ttttagacag gaacggtacg ccagaatcct gagaagtgtt 7560

tttataatca gtgaggccac cgagtaaaag agtctgtcca tcacgcaaat taaccgttgt 7620

cgcaatactt ctttgattag taataacatc acttgcctga gtagaagaac tcaaactatc 7680

ggccttgctg gtaatatcca gaacaatatt accgccagcc attgcaacgg aatcgccatt 7740

cgccattcag gctgcgcaac tgttgggaag ggcgatcggt gcgggcctct tcgctattac 7800

gcca 7804

<210> 9

<211> 1563

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CDS omGALNS

<400> 9

atggctgctt gtacagccgc tcagcagctg ctgctggtgc tgtctgctct gggactgctg 60

gctgctggcg ctcctcagcc tcctaacatc gtgctgctgc tgatggacga catgggctgg 120

ggcgatctgg gagtgaacgg cgagcctagc agagagacac ccaacctgga cagaatggcc 180

gccgagggca tgctgttccc cagcttctac agcgccaacc ccctgtgcag cccttctaga 240

gccgctctgc tgaccggcag actgcccatc agaaacggct tctacaccac caacgcccac 300

gccagaaacg cctacacacc ccaggaaatc atgggcggca tccccaacag cgagcatctg 360

ctgcctgagc tgctgaagaa ggccggctac accaacaaga tcgtgggcaa gtggcacctg 420

ggccacagac cccagttcca ccctctgaag cacggcttcg acgagtggtt cggcagcccc 480

aactgtcact tcggccccta cgacaacaag gccaagccca acatccccgt gtacagagac 540

tgggagatgg tgggaagatt ctacgaagag ttccccatca acagaaagac cggcgaggcc 600

aacctgaccc agctgtacac acaggaagcc ctggacttca tccagaccca gcacgccaga 660

cagagcccct tcttcctgta ctgggccatc gacgccacac acgcccctgt gtacgccagc 720

agacagttcc tgggcaccag cctgagaggc agatatggcg acgccgtgcg cgagatcgac 780

gactctgtgg gcaagatcct gtccctgctg cagaacctgg gcatcagcaa gaacaccttc 840

gtgttcttca ccagcgacaa cggcgctgcc ctgatcagcg ctcctaatga gggcggcagc 900

aacggcccat tcctgtgcgg caagcagacc acattcgagg gcggaatgag agagcccgct 960

atcgcttggt ggcctggcca tatcgctgct ggccaggtgt cacaccagct gggcagcatc 1020

atggacctgt tcaccacctc cctgagcctg gccggactga agcctcctag cgacagagtg 1080

atcgacggcc tggacctgct gcccaccatg ctgaagggcc agatgatgga cagacccatc 1140

ttctactaca gaggcaacac cctgatggcc gtgaccctgg gccagtacaa ggcccacctg 1200

tggacctgga ccaacagctg ggaagagttt acccagggca ccgatttctg ccctggccag 1260

aatgtgtccg gcgtgaccac ccacacccag gaagaacaca ccgagctgcc cctgatcttc 1320

cacctgggaa gggaccccgg cgagagattc cctctgagct tccacagcga cgagtaccag 1380

gacgccctga gcagaaccac ccaggtggtg caggaacacc agaaaagcct ggtgcccggc 1440

cagccccagc tgaacgtgtg taaccaggcc gtgatgaact gggcccctcc cggatgtgaa 1500

aagctgggaa agtgcctgac cccccctgag agcgtgcccg agaagtgttt ctgggcccac 1560

tga 1563

<210> 10

<211> 7798

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> pAAV-CAG-omGALNS

<400> 10

gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc gggcgacctt 60

tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca actccatcac 120

taggggttcc ttgtagttaa tgattaaccc gccatgctac ttatctactc gacattgatt 180

attgactagt tattaatagt aatcaattac ggggtcatta gttcatagcc catatatgga 240

gttccgcgtt acataactta cggtaaatgg cccgcctggc tgaccgccca acgacccccg 300

cccattgacg tcaataatga cgtatgttcc catagtaacg ccaataggga ctttccattg 360

acgtcaatgg gtggagtatt tacggtaaac tgcccacttg gcagtacatc aagtgtatca 420

tatgccaagt acgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa tggcccgcct ggcattatgc 480

ccagtacatg accttatggg actttcctac ttggcagtac atctacgtat tagtcatcgc 540

tattaccatg gtcgaggtga gccccacgtt ctgcttcact ctccccatct cccccccctc 600

cccaccccca attttgtatt tatttatttt ttaattattt tgtgcagcga tgggggcggg 660

gggggggggg gggcgcgcgc caggcggggc ggggcggggc gaggggcggg gcggggcgag 720

gcggagaggt gcggcggcag ccaatcagag cggcgcgctc cgaaagtttc cttttatggc 780

gaggcggcgg cggcggcggc cctataaaaa gcgaagcgcg cggcgggcgg gagtcgctgc 840

gttgccttcg ccccgtgccc cgctccgccg ccgcctcgcg ccgcccgccc cggctctgac 900

tgaccgcgtt actcccacag gtgagcgggc gggacggccc ttctcctccg ggctgtaatt 960

agcgcttggt ttaatgacgg cttgtttctt ttctgtggct gcgtgaaagc cttgaggggc 1020

tccgggaggg ccctttgtgc ggggggagcg gctcgggggg tgcgtgcgtg tgtgtgtgcg 1080

tggggagcgc cgcgtgcggc tccgcgctgc ccggcggctg tgagcgctgc gggcgcggcg 1140

cggggctttg tgcgctccgc agtgtgcgcg aggggagcgc ggccgggggc ggtgccccgc 1200

ggtgcggggg gggctgcgag gggaacaaag gctgcgtgcg gggtgtgtgc gtgggggggt 1260

gagcaggggg tgtgggcgcg tcggtcgggc tgcaaccccc cctgcacccc cctccccgag 1320

ttgctgagca cggcccggct tcgggtgcgg ggctccgtac ggggcgtggc gcggggctcg 1380

ccgtgccggg cggggggtgg cggcaggtgg gggtgccggg cggggcgggg ccgcctcggg 1440

ccggggaggg ctcgggggag gggcgcggcg gcccccggag cgccggcggc tgtcgaggcg 1500

cggcgagccg cagccattgc cttttatggt aatcgtgcga gagggcgcag ggacttcctt 1560

tgtcccaaat ctgtgcggag ccgaaatctg ggaggcgccg ccgcaccccc tctagcgggc 1620

gcggggcgaa gcggtgcggc gccggcagga aggaaatggg cggggagggc cttcgtgcgt 1680

cgccgcgccg ccgtcccctt ctccctctcc agcctcgggg ctgtccgcgg ggggacggct 1740

gccttcgggg gggacggggc agggcggggt tcggcttctg gcgtgtgacc ggcggctcta 1800

gagcctctgc taaccatgtt catgccttct tctttttcct acagctcctg ggcaacgtgc 1860

tggttattgt gctgtctcat cattttggca aagaattgat taattcgagc gaacgcgtgc 1920

caccatggct gcttgtacag ccgctcagca gctgctgctg gtgctgtctg ctctgggact 1980

gctggctgct ggcgctcctc agcctcctaa catcgtgctg ctgctgatgg acgacatggg 2040

ctggggcgat ctgggagtga acggcgagcc tagcagagag acacccaacc tggacagaat 2100

ggccgccgag ggcatgctgt tccccagctt ctacagcgcc aaccccctgt gcagcccttc 2160

tagagccgct ctgctgaccg gcagactgcc catcagaaac ggcttctaca ccaccaacgc 2220

ccacgccaga aacgcctaca caccccagga aatcatgggc ggcatcccca acagcgagca 2280

tctgctgcct gagctgctga agaaggccgg ctacaccaac aagatcgtgg gcaagtggca 2340

cctgggccac agaccccagt tccaccctct gaagcacggc ttcgacgagt ggttcggcag 2400

ccccaactgt cacttcggcc cctacgacaa caaggccaag cccaacatcc ccgtgtacag 2460

agactgggag atggtgggaa gattctacga agagttcccc atcaacagaa agaccggcga 2520

ggccaacctg acccagctgt acacacagga agccctggac ttcatccaga cccagcacgc 2580

cagacagagc cccttcttcc tgtactgggc catcgacgcc acacacgccc ctgtgtacgc 2640

cagcagacag ttcctgggca ccagcctgag aggcagatat ggcgacgccg tgcgcgagat 2700

cgacgactct gtgggcaaga tcctgtccct gctgcagaac ctgggcatca gcaagaacac 2760

cttcgtgttc ttcaccagcg acaacggcgc tgccctgatc agcgctccta atgagggcgg 2820

cagcaacggc ccattcctgt gcggcaagca gaccacattc gagggcggaa tgagagagcc 2880

cgctatcgct tggtggcctg gccatatcgc tgctggccag gtgtcacacc agctgggcag 2940

catcatggac ctgttcacca cctccctgag cctggccgga ctgaagcctc ctagcgacag 3000

agtgatcgac ggcctggacc tgctgcccac catgctgaag ggccagatga tggacagacc 3060

catcttctac tacagaggca acaccctgat ggccgtgacc ctgggccagt acaaggccca 3120

cctgtggacc tggaccaaca gctgggaaga gtttacccag ggcaccgatt tctgccctgg 3180

ccagaatgtg tccggcgtga ccacccacac ccaggaagaa cacaccgagc tgcccctgat 3240

cttccacctg ggaagggacc ccggcgagag attccctctg agcttccaca gcgacgagta 3300

ccaggacgcc ctgagcagaa ccacccaggt ggtgcaggaa caccagaaaa gcctggtgcc 3360

cggccagccc cagctgaacg tgtgtaacca ggccgtgatg aactgggccc ctcccggatg 3420

tgaaaagctg ggaaagtgcc tgaccccccc tgagagcgtg cccgagaagt gtttctgggc 3480

ccactgagaa ttcgagctcg gtacccggga atcaattcac tcctcaggtg caggctgcct 3540

atcagaaggt ggtggctggt gtggccaatg ccctggctca caaataccac tgagatcttt 3600

ttccctctgc caaaaattat ggggacatca tgaagcccct tgagcatctg acttctggct 3660

aataaaggaa atttattttc attgcaatag tgtgttggaa ttttttgtgt ctctcactcg 3720

gaaggacata tgggagggca aatcatttaa aacatcagaa tgagtatttg gtttagagtt 3780

tggcaacata tgcccatatg ctggctgcca tgaacaaagg ttggctataa agaggtcatc 3840

agtatatgaa acagccccct gctgtccatt ccttattcca tagaaaagcc ttgacttgag 3900

gttagatttt ttttatattt tgttttgtgt tatttttttc tttaacatcc ctaaaatttt 3960

ccttacatgt tttactagcc agatttttcc tcctctcctg actactccca gtcatagctg 4020

tccctcttct cttatggaga tccctcgacc tgcagcccaa gctgtagata agtagcatgg 4080

cgggttaatc attaactaca aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg 4140

cgctcgctcg ctcactgagg ccgcccgggc tttgcccggg cggcctcagt gagcgagcga 4200

gcgcgcagct gcattaatga atcggccaac gcgcggggag aggcggtttg cgtattgggc 4260

gctcttccgc ttcctcgctc actgactcgc tgcgctcggt cgttcggctg cggcgagcgg 4320

tatcagctca ctcaaaggcg gtaatacggt tatccacaga atcaggggat aacgcaggaa 4380

agaacatgtg agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg 4440

cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga 4500

ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat accaggcgtt tccccctgga agctccctcg 4560

tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg 4620

gaagcgtggc gctttctcat agctcacgct gtaggtatct cagttcggtg taggtcgttc 4680

gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc gccttatccg 4740

gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt atcgccactg gcagcagcca 4800

ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc ttgaagtggt 4860

ggcctaacta cggctacact agaagaacag tatttggtat ctgcgctctg ctgaagccag 4920

ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc gctggtagcg 4980

gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct caagaagatc 5040

ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt taagggattt 5100

tggtcatgag attatcaaaa aggatcttca cctagatcct tttaaattaa aaatgaagtt 5160

ttaaatcaat ctaaagtata tatgagtaaa cttggtctga cagttaccaa tgcttaatca 5220

gtgaggcacc tatctcagcg atctgtctat ttcgttcatc catagttgcc tgactccccg 5280

tcgtgtagat aactacgata cgggagggct taccatctgg ccccagtgct gcaatgatac 5340

cgcgagaccc acgctcaccg gctccagatt tatcagcaat aaaccagcca gccggaaggg 5400

ccgagcgcag aagtggtcct gcaactttat ccgcctccat ccagtctatt aattgttgcc 5460

gggaagctag agtaagtagt tcgccagtta atagtttgcg caacgttgtt gccattgcta 5520

caggcatcgt ggtgtcacgc tcgtcgtttg gtatggcttc attcagctcc ggttcccaac 5580

gatcaaggcg agttacatga tcccccatgt tgtgcaaaaa agcggttagc tccttcggtc 5640

ctccgatcgt tgtcagaagt aagttggccg cagtgttatc actcatggtt atggcagcac 5700

tgcataattc tcttactgtc atgccatccg taagatgctt ttctgtgact ggtgagtact 5760

caaccaagtc attctgagaa tagtgtatgc ggcgaccgag ttgctcttgc ccggcgtcaa 5820

tacgggataa taccgcgcca catagcagaa ctttaaaagt gctcatcatt ggaaaacgtt 5880

cttcggggcg aaaactctca aggatcttac cgctgttgag atccagttcg atgtaaccca 5940

ctcgtgcacc caactgatct tcagcatctt ttactttcac cagcgtttct gggtgagcaa 6000

aaacaggaag gcaaaatgcc gcaaaaaagg gaataagggc gacacggaaa tgttgaatac 6060

tcatactctt cctttttcaa tattattgaa gcatttatca gggttattgt ctcatgagcg 6120

gatacatatt tgaatgtatt tagaaaaata aacaaatagg ggttccgcgc acatttcccc 6180

gaaaagtgcc acctgacgtc taagaaacca ttattatcat gacattaacc tataaaaata 6240

ggcgtatcac gaggcccttt cgtctcgcgc gtttcggtga tgacggtgaa aacctctgac 6300

acatgcagct cccggagacg gtcacagctt gtctgtaagc ggatgccggg agcagacaag 6360

cccgtcaggg cgcgtcagcg ggtgttggcg ggtgtcgggg ctggcttaac tatgcggcat 6420

cagagcagat tgtactgaga gtgcaccata tgcggtgtga aataccgcac agatgcgtaa 6480

ggagaaaata ccgcatcagg cgattccaac atccaataaa tcatacaggc aaggcaaaga 6540

attagcaaaa ttaagcaata aagcctcaga gcataaagct aaatcggttg taccaaaaac 6600

attatgaccc tgtaatactt ttgcgggaga agcctttatt tcaacgcaag gataaaaatt 6660

tttagaaccc tcatatattt taaatgcaat gcctgagtaa tgtgtaggta aagattcaaa 6720

cgggtgagaa aggccggaga cagtcaaatc accatcaata tgatattcaa ccgttctagc 6780

tgataaattc atgccggaga gggtagctat ttttgagagg tctctacaaa ggctatcagg 6840

tcattgcctg agagtctgga gcaaacaaga gaatcgatga acggtaatcg taaaactagc 6900

atgtcaatca tatgtacccc ggttgataat cagaaaagcc ccaaaaacag gaagattgta 6960

taagcaaata tttaaattgt aagcgttaat attttgttaa aattcgcgtt aaatttttgt 7020

taaatcagct cattttttaa ccaataggcc gaaatcggca aaatccctta taaatcaaaa 7080

gaatagaccg agatagggtt gagtgttgtt ccagtttgga acaagagtcc actattaaag 7140

aacgtggact ccaacgtcaa agggcgaaaa accgtctatc agggcgatgg cccactacgt 7200

gaaccatcac cctaatcaag ttttttgggg tcgaggtgcc gtaaagcact aaatcggaac 7260

cctaaaggga gcccccgatt tagagcttga cggggaaagc cggcgaacgt ggcgagaaag 7320

gaagggaaga aagcgaaagg agcgggcgct agggcgctgg caagtgtagc ggtcacgctg 7380

cgcgtaacca ccacacccgc cgcgcttaat gcgccgctac agggcgcgta ctatggttgc 7440

tttgacgagc acgtataacg tgctttcctc gttagaatca gagcgggagc taaacaggag 7500

gccgattaaa gggattttag acaggaacgg tacgccagaa tcctgagaag tgtttttata 7560

atcagtgagg ccaccgagta aaagagtctg tccatcacgc aaattaaccg ttgtcgcaat 7620

acttctttga ttagtaataa catcacttgc ctgagtagaa gaactcaaac tatcggcctt 7680

gctggtaata tccagaacaa tattaccgcc agccattgca acggaatcgc cattcgccat 7740

tcaggctgcg caactgttgg gaagggcgat cggtgcgggc ctcttcgcta ttacgcca 7798

<210> 11

<211> 7438

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> pAAV-hAAT-omGALNS

<400> 11

gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc gggcgacctt 60

tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca actccatcac 120

taggggttcc ttgtagttaa tgattaaccc gccatgctac ttatctactc gacattgatt 180

attgactagg atctgatatc atcgatgaat tcgagctcgg tacccggccg cagatttagg 240

tgacactata gaatatgcat cactagtaag cttgcgaatt ccagtctaca gagaggtctc 300

tgacctctgc cccagctcca aggtcagcag gcagggaggg ctgtgtgttt gctgtttgct 360

gcttgcaatg tttgcccatt ttagggacat gagtaggctg aagtttgttc agtgtggact 420

tcagaggcag cacacaaaca gcaagcttgc gaattccagt ctacagagag gtctctgacc 480

tctgccccag ctccaaggtc agcaggcagg gagggctgtg tgtttgctgt ttgctgcttg 540

caatgtttgc ccattttagg gacatgagta ggctgaagtt tgttcagtgt ggacttcaga 600

ggcagcacac aaacagcaag cttgcgaatt ccagtctaca gagaggtctc tgacctctgc 660

cccagctcca aggtcagcag gcagggaggg ctgtgtgttt gctgtttgct gcttgcaatg 720

tttgcccatt ttagggacat gagtaggctg aagtttgttc agtgtggact tcagaggcag 780

cacacaaaca gcaagctttg ctctagactg gaattcgtcg acgagctccc tatagtgagt 840

cgtattagag gccgactgac ccggtacccg gggatcttgc taccagtgga acagccacta 900

aggattctgc agtgagagca gagggccagc taagtggtac tctcccagag actgtctgac 960

tcacgccacc ccctccacct tggacacagg acgctgtggt ttctgagcca ggtacaatga 1020

ctcctttcgg taagtgcagt ggaagctgta cactgcccag gcaaagcgtc cgggcagcgt 1080

aggcgggcga ctcagatccc agccagtgga cttagcccct gtttgctcct ccgataactg 1140

gggtgacctt ggttaatatt caccagcagc ctcccccgtt gcccctctgg atccactgct 1200

taaatacgga cgaggacagg gccctgtctc ctcagcttca ggcaccacca ctgacctggg 1260

acagtgaatg tccccctgat ctgcggccgt gactctctta aggtagcctt gcagaagttg 1320

gtcgtgaggc actgggcagg taagtatcaa ggttacaaga caggtttaag gagaccaata 1380

gaaactgggc ttgtcgagac agagaagact cttgcgtttc tgataggcac ctattggtct 1440

tactgacatc cactttgcct ttctctccac aggtgtccac tcccagttca attacagctc 1500

ttaaggctag agtacttaat acgactcact ataggctagc ctcgacctcg agacgcgtgc 1560

caccatggct gcttgtacag ccgctcagca gctgctgctg gtgctgtctg ctctgggact 1620

gctggctgct ggcgctcctc agcctcctaa catcgtgctg ctgctgatgg acgacatggg 1680

ctggggcgat ctgggagtga acggcgagcc tagcagagag acacccaacc tggacagaat 1740

ggccgccgag ggcatgctgt tccccagctt ctacagcgcc aaccccctgt gcagcccttc 1800

tagagccgct ctgctgaccg gcagactgcc catcagaaac ggcttctaca ccaccaacgc 1860

ccacgccaga aacgcctaca caccccagga aatcatgggc ggcatcccca acagcgagca 1920

tctgctgcct gagctgctga agaaggccgg ctacaccaac aagatcgtgg gcaagtggca 1980

cctgggccac agaccccagt tccaccctct gaagcacggc ttcgacgagt ggttcggcag 2040

ccccaactgt cacttcggcc cctacgacaa caaggccaag cccaacatcc ccgtgtacag 2100

agactgggag atggtgggaa gattctacga agagttcccc atcaacagaa agaccggcga 2160

ggccaacctg acccagctgt acacacagga agccctggac ttcatccaga cccagcacgc 2220

cagacagagc cccttcttcc tgtactgggc catcgacgcc acacacgccc ctgtgtacgc 2280

cagcagacag ttcctgggca ccagcctgag aggcagatat ggcgacgccg tgcgcgagat 2340

cgacgactct gtgggcaaga tcctgtccct gctgcagaac ctgggcatca gcaagaacac 2400

cttcgtgttc ttcaccagcg acaacggcgc tgccctgatc agcgctccta atgagggcgg 2460

cagcaacggc ccattcctgt gcggcaagca gaccacattc gagggcggaa tgagagagcc 2520

cgctatcgct tggtggcctg gccatatcgc tgctggccag gtgtcacacc agctgggcag 2580

catcatggac ctgttcacca cctccctgag cctggccgga ctgaagcctc ctagcgacag 2640

agtgatcgac ggcctggacc tgctgcccac catgctgaag ggccagatga tggacagacc 2700

catcttctac tacagaggca acaccctgat ggccgtgacc ctgggccagt acaaggccca 2760

cctgtggacc tggaccaaca gctgggaaga gtttacccag ggcaccgatt tctgccctgg 2820

ccagaatgtg tccggcgtga ccacccacac ccaggaagaa cacaccgagc tgcccctgat 2880

cttccacctg ggaagggacc ccggcgagag attccctctg agcttccaca gcgacgagta 2940

ccaggacgcc ctgagcagaa ccacccaggt ggtgcaggaa caccagaaaa gcctggtgcc 3000

cggccagccc cagctgaacg tgtgtaacca ggccgtgatg aactgggccc ctcccggatg 3060

tgaaaagctg ggaaagtgcc tgaccccccc tgagagcgtg cccgagaagt gtttctgggc 3120

ccactgagaa ttcgagctcg gtacccggga atcaattcac tcctcaggtg caggctgcct 3180

atcagaaggt ggtggctggt gtggccaatg ccctggctca caaataccac tgagatcttt 3240

ttccctctgc caaaaattat ggggacatca tgaagcccct tgagcatctg acttctggct 3300

aataaaggaa atttattttc attgcaatag tgtgttggaa ttttttgtgt ctctcactcg 3360

gaaggacata tgggagggca aatcatttaa aacatcagaa tgagtatttg gtttagagtt 3420

tggcaacata tgcccatatg ctggctgcca tgaacaaagg ttggctataa agaggtcatc 3480

agtatatgaa acagccccct gctgtccatt ccttattcca tagaaaagcc ttgacttgag 3540

gttagatttt ttttatattt tgttttgtgt tatttttttc tttaacatcc ctaaaatttt 3600

ccttacatgt tttactagcc agatttttcc tcctctcctg actactccca gtcatagctg 3660

tccctcttct cttatggaga tccctcgacc tgcagcccaa gctgtagata agtagcatgg 3720

cgggttaatc attaactaca aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg 3780

cgctcgctcg ctcactgagg ccgcccgggc tttgcccggg cggcctcagt gagcgagcga 3840

gcgcgcagct gcattaatga atcggccaac gcgcggggag aggcggtttg cgtattgggc 3900

gctcttccgc ttcctcgctc actgactcgc tgcgctcggt cgttcggctg cggcgagcgg 3960

tatcagctca ctcaaaggcg gtaatacggt tatccacaga atcaggggat aacgcaggaa 4020

agaacatgtg agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg 4080

cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga 4140

ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat accaggcgtt tccccctgga agctccctcg 4200

tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg 4260

gaagcgtggc gctttctcat agctcacgct gtaggtatct cagttcggtg taggtcgttc 4320

gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc gccttatccg 4380

gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt atcgccactg gcagcagcca 4440

ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc ttgaagtggt 4500

ggcctaacta cggctacact agaagaacag tatttggtat ctgcgctctg ctgaagccag 4560

ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc gctggtagcg 4620

gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct caagaagatc 4680

ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt taagggattt 4740

tggtcatgag attatcaaaa aggatcttca cctagatcct tttaaattaa aaatgaagtt 4800

ttaaatcaat ctaaagtata tatgagtaaa cttggtctga cagttaccaa tgcttaatca 4860

gtgaggcacc tatctcagcg atctgtctat ttcgttcatc catagttgcc tgactccccg 4920

tcgtgtagat aactacgata cgggagggct taccatctgg ccccagtgct gcaatgatac 4980

cgcgagaccc acgctcaccg gctccagatt tatcagcaat aaaccagcca gccggaaggg 5040

ccgagcgcag aagtggtcct gcaactttat ccgcctccat ccagtctatt aattgttgcc 5100

gggaagctag agtaagtagt tcgccagtta atagtttgcg caacgttgtt gccattgcta 5160

caggcatcgt ggtgtcacgc tcgtcgtttg gtatggcttc attcagctcc ggttcccaac 5220

gatcaaggcg agttacatga tcccccatgt tgtgcaaaaa agcggttagc tccttcggtc 5280

ctccgatcgt tgtcagaagt aagttggccg cagtgttatc actcatggtt atggcagcac 5340

tgcataattc tcttactgtc atgccatccg taagatgctt ttctgtgact ggtgagtact 5400

caaccaagtc attctgagaa tagtgtatgc ggcgaccgag ttgctcttgc ccggcgtcaa 5460

tacgggataa taccgcgcca catagcagaa ctttaaaagt gctcatcatt ggaaaacgtt 5520

cttcggggcg aaaactctca aggatcttac cgctgttgag atccagttcg atgtaaccca 5580

ctcgtgcacc caactgatct tcagcatctt ttactttcac cagcgtttct gggtgagcaa 5640

aaacaggaag gcaaaatgcc gcaaaaaagg gaataagggc gacacggaaa tgttgaatac 5700

tcatactctt cctttttcaa tattattgaa gcatttatca gggttattgt ctcatgagcg 5760

gatacatatt tgaatgtatt tagaaaaata aacaaatagg ggttccgcgc acatttcccc 5820

gaaaagtgcc acctgacgtc taagaaacca ttattatcat gacattaacc tataaaaata 5880

ggcgtatcac gaggcccttt cgtctcgcgc gtttcggtga tgacggtgaa aacctctgac 5940

acatgcagct cccggagacg gtcacagctt gtctgtaagc ggatgccggg agcagacaag 6000

cccgtcaggg cgcgtcagcg ggtgttggcg ggtgtcgggg ctggcttaac tatgcggcat 6060

cagagcagat tgtactgaga gtgcaccata tgcggtgtga aataccgcac agatgcgtaa 6120

ggagaaaata ccgcatcagg cgattccaac atccaataaa tcatacaggc aaggcaaaga 6180

attagcaaaa ttaagcaata aagcctcaga gcataaagct aaatcggttg taccaaaaac 6240

attatgaccc tgtaatactt ttgcgggaga agcctttatt tcaacgcaag gataaaaatt 6300

tttagaaccc tcatatattt taaatgcaat gcctgagtaa tgtgtaggta aagattcaaa 6360

cgggtgagaa aggccggaga cagtcaaatc accatcaata tgatattcaa ccgttctagc 6420

tgataaattc atgccggaga gggtagctat ttttgagagg tctctacaaa ggctatcagg 6480

tcattgcctg agagtctgga gcaaacaaga gaatcgatga acggtaatcg taaaactagc 6540

atgtcaatca tatgtacccc ggttgataat cagaaaagcc ccaaaaacag gaagattgta 6600

taagcaaata tttaaattgt aagcgttaat attttgttaa aattcgcgtt aaatttttgt 6660

taaatcagct cattttttaa ccaataggcc gaaatcggca aaatccctta taaatcaaaa 6720

gaatagaccg agatagggtt gagtgttgtt ccagtttgga acaagagtcc actattaaag 6780

aacgtggact ccaacgtcaa agggcgaaaa accgtctatc agggcgatgg cccactacgt 6840

gaaccatcac cctaatcaag ttttttgggg tcgaggtgcc gtaaagcact aaatcggaac 6900

cctaaaggga gcccccgatt tagagcttga cggggaaagc cggcgaacgt ggcgagaaag 6960

gaagggaaga aagcgaaagg agcgggcgct agggcgctgg caagtgtagc ggtcacgctg 7020

cgcgtaacca ccacacccgc cgcgcttaat gcgccgctac agggcgcgta ctatggttgc 7080

tttgacgagc acgtataacg tgctttcctc gttagaatca gagcgggagc taaacaggag 7140

gccgattaaa gggattttag acaggaacgg tacgccagaa tcctgagaag tgtttttata 7200

atcagtgagg ccaccgagta aaagagtctg tccatcacgc aaattaaccg ttgtcgcaat 7260

acttctttga ttagtaataa catcacttgc ctgagtagaa gaactcaaac tatcggcctt 7320

gctggtaata tccagaacaa tattaccgcc agccattgca acggaatcgc cattcgccat 7380

tcaggctgcg caactgttgg gaagggcgat cggtgcgggc ctcttcgcta ttacgcca 7438

<210> 12

<211> 4215

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> AAV9-CAG-hGALNS

<400> 12

gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc gggcgacctt 60

tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca actccatcac 120

taggggttcc ttgtagttaa tgattaaccc gccatgctac ttatctactc gacattgatt 180

attgactagt tattaatagt aatcaattac ggggtcatta gttcatagcc catatatgga 240

gttccgcgtt acataactta cggtaaatgg cccgcctggc tgaccgccca acgacccccg 300

cccattgacg tcaataatga cgtatgttcc catagtaacg ccaataggga ctttccattg 360

acgtcaatgg gtggagtatt tacggtaaac tgcccacttg gcagtacatc aagtgtatca 420

tatgccaagt acgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa tggcccgcct ggcattatgc 480

ccagtacatg accttatggg actttcctac ttggcagtac atctacgtat tagtcatcgc 540

tattaccatg gtcgaggtga gccccacgtt ctgcttcact ctccccatct cccccccctc 600

cccaccccca attttgtatt tatttatttt ttaattattt tgtgcagcga tgggggcggg 660

gggggggggg gggcgcgcgc caggcggggc ggggcggggc gaggggcggg gcggggcgag 720

gcggagaggt gcggcggcag ccaatcagag cggcgcgctc cgaaagtttc cttttatggc 780

gaggcggcgg cggcggcggc cctataaaaa gcgaagcgcg cggcgggcgg gagtcgctgc 840

gttgccttcg ccccgtgccc cgctccgccg ccgcctcgcg ccgcccgccc cggctctgac 900

tgaccgcgtt actcccacag gtgagcgggc gggacggccc ttctcctccg ggctgtaatt 960

agcgcttggt ttaatgacgg cttgtttctt ttctgtggct gcgtgaaagc cttgaggggc 1020

tccgggaggg ccctttgtgc ggggggagcg gctcgggggg tgcgtgcgtg tgtgtgtgcg 1080

tggggagcgc cgcgtgcggc tccgcgctgc ccggcggctg tgagcgctgc gggcgcggcg 1140

cggggctttg tgcgctccgc agtgtgcgcg aggggagcgc ggccgggggc ggtgccccgc 1200

ggtgcggggg gggctgcgag gggaacaaag gctgcgtgcg gggtgtgtgc gtgggggggt 1260

gagcaggggg tgtgggcgcg tcggtcgggc tgcaaccccc cctgcacccc cctccccgag 1320

ttgctgagca cggcccggct tcgggtgcgg ggctccgtac ggggcgtggc gcggggctcg 1380

ccgtgccggg cggggggtgg cggcaggtgg gggtgccggg cggggcgggg ccgcctcggg 1440

ccggggaggg ctcgggggag gggcgcggcg gcccccggag cgccggcggc tgtcgaggcg 1500

cggcgagccg cagccattgc cttttatggt aatcgtgcga gagggcgcag ggacttcctt 1560

tgtcccaaat ctgtgcggag ccgaaatctg ggaggcgccg ccgcaccccc tctagcgggc 1620

gcggggcgaa gcggtgcggc gccggcagga aggaaatggg cggggagggc cttcgtgcgt 1680

cgccgcgccg ccgtcccctt ctccctctcc agcctcgggg ctgtccgcgg ggggacggct 1740

gccttcgggg gggacggggc agggcggggt tcggcttctg gcgtgtgacc ggcggctcta 1800

gagcctctgc taaccatgtt catgccttct tctttttcct acagctcctg ggcaacgtgc 1860

tggttattgt gctgtctcat cattttggca aagaattgat taattcgagc gaacgcgtgc 1920

caccatggcg gcggttgtcg cggcgacgag gtggtggcag ctgttgctgg tgctcagcgc 1980

cgcggggatg ggggcctcgg gcgccccgca gccccccaac atcctgctcc tgctcatgga 2040

cgacatggga tggggtgacc tcggggtgta tggagagccc tccagagaga ccccgaattt 2100

ggaccggatg gctgcagaag ggctgctttt cccaaacttc tattctgcca accctctgtg 2160

ctcgccatcg agggcggcac tgctcacagg acggctaccc atccgcaatg gcttctacac 2220

caccaacgcc catgccagaa acgcctacac accgcaggag attgtgggcg gcatcccaga 2280

ctcggagcag ctcctgccgg agcttctgaa gaaggccggc tacgtcagca agattgtcgg 2340

caagtggcat ctgggtcaca ggccccagtt ccaccccctg aagcacggat ttgatgagtg 2400

gtttggatcc cccaactgcc actttggacc ttatgacaac aaggccaggc ccaacatccc 2460

tgtgtacagg gactgggaga tggttggcag atattatgaa gaatttccta ttaatctgaa 2520

gacgggggaa gccaacctca cccagatcta cctgcaggaa gccctggact tcattaagag 2580

acaggcacgg caccacccct ttttcctcta ctgggctgtc gacgccacgc acgcacccgt 2640

ctatgcctcc aaacccttct tgggcaccag tcagcgaggg cggtatggag acgccgtccg 2700

ggagattgat gacagcattg ggaagatact ggagctcctc caagacctgc acgtcgcgga 2760

caacaccttc gtcttcttca cgtcggacaa cggcgctgcc ctcatttccg cccccgaaca 2820

aggtggcagc aacggcccct ttctgtgtgg gaagcagacc acgtttgaag gagggatgag 2880

ggagcctgcc ctcgcatggt ggccagggca cgtcactgca ggccaggtga gccaccagct 2940

gggcagcatc atggacctct tcaccaccag cctggccctt gcgggcctga cgccgcccag 3000

cgacagggcc attgatggcc tcaacctcct ccccaccctc ctgcagggcc ggctgatgga 3060

caggcctatc ttctattacc gtggcgacac gctgatggcg gccaccctcg ggcagcacaa 3120

ggctcacttc tggacctgga ccaactcctg ggagaacttc agacagggca ttgatttctg 3180

ccctgggcag aacgtttcag gggtcacaac tcacaatctg gaagaccaca cgaagctgcc 3240

cctgatcttc cacctgggac gggacccagg ggagaggttc cccctcagct ttgccagcgc 3300

cgagtaccag gaggccctca gcaggatcac ctcggtcgtc cagcagcacc aggaggcctt 3360

ggtccccgcg cagccccagc tcaacgtgtg caactgggcg gtcatgaact gggcacctcc 3420

gggctgtgaa aagttaggga agtgtctgac acctccagaa tccattccca agaagtgcct 3480

ctggtcccac taggaattcg agctcggtac ccgggaatca attcactcct caggtgcagg 3540

ctgcctatca gaaggtggtg gctggtgtgg ccaatgccct ggctcacaaa taccactgag 3600

atctttttcc ctctgccaaa aattatgggg acatcatgaa gccccttgag catctgactt 3660

ctggctaata aaggaaattt attttcattg caatagtgtg ttggaatttt ttgtgtctct 3720

cactcggaag gacatatggg agggcaaatc atttaaaaca tcagaatgag tatttggttt 3780

agagtttggc aacatatgcc catatgctgg ctgccatgaa caaaggttgg ctataaagag 3840

gtcatcagta tatgaaacag ccccctgctg tccattcctt attccataga aaagccttga 3900

cttgaggtta gatttttttt atattttgtt ttgtgttatt tttttcttta acatccctaa 3960

aattttcctt acatgtttta ctagccagat ttttcctcct ctcctgacta ctcccagtca 4020

tagctgtccc tcttctctta tggagatccc tcgacctgca gcccaagctg tagataagta 4080

gcatggcggg ttaatcatta actacaagga acccctagtg atggagttgg ccactccctc 4140

tctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggctttg cccgggcggc ctcagtgagc 4200

gagcgagcgc gcagc 4215

<210> 13

<211> 4215

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> AAV9-CAG-ohGALNS-version1

<400> 13

gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc gggcgacctt 60

tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca actccatcac 120

taggggttcc ttgtagttaa tgattaaccc gccatgctac ttatctactc gacattgatt 180

attgactagt tattaatagt aatcaattac ggggtcatta gttcatagcc catatatgga 240

gttccgcgtt acataactta cggtaaatgg cccgcctggc tgaccgccca acgacccccg 300

cccattgacg tcaataatga cgtatgttcc catagtaacg ccaataggga ctttccattg 360

acgtcaatgg gtggagtatt tacggtaaac tgcccacttg gcagtacatc aagtgtatca 420

tatgccaagt acgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa tggcccgcct ggcattatgc 480

ccagtacatg accttatggg actttcctac ttggcagtac atctacgtat tagtcatcgc 540

tattaccatg gtcgaggtga gccccacgtt ctgcttcact ctccccatct cccccccctc 600

cccaccccca attttgtatt tatttatttt ttaattattt tgtgcagcga tgggggcggg 660

gggggggggg gggcgcgcgc caggcggggc ggggcggggc gaggggcggg gcggggcgag 720

gcggagaggt gcggcggcag ccaatcagag cggcgcgctc cgaaagtttc cttttatggc 780

gaggcggcgg cggcggcggc cctataaaaa gcgaagcgcg cggcgggcgg gagtcgctgc 840

gttgccttcg ccccgtgccc cgctccgccg ccgcctcgcg ccgcccgccc cggctctgac 900

tgaccgcgtt actcccacag gtgagcgggc gggacggccc ttctcctccg ggctgtaatt 960

agcgcttggt ttaatgacgg cttgtttctt ttctgtggct gcgtgaaagc cttgaggggc 1020

tccgggaggg ccctttgtgc ggggggagcg gctcgggggg tgcgtgcgtg tgtgtgtgcg 1080

tggggagcgc cgcgtgcggc tccgcgctgc ccggcggctg tgagcgctgc gggcgcggcg 1140

cggggctttg tgcgctccgc agtgtgcgcg aggggagcgc ggccgggggc ggtgccccgc 1200

ggtgcggggg gggctgcgag gggaacaaag gctgcgtgcg gggtgtgtgc gtgggggggt 1260

gagcaggggg tgtgggcgcg tcggtcgggc tgcaaccccc cctgcacccc cctccccgag 1320

ttgctgagca cggcccggct tcgggtgcgg ggctccgtac ggggcgtggc gcggggctcg 1380

ccgtgccggg cggggggtgg cggcaggtgg gggtgccggg cggggcgggg ccgcctcggg 1440

ccggggaggg ctcgggggag gggcgcggcg gcccccggag cgccggcggc tgtcgaggcg 1500

cggcgagccg cagccattgc cttttatggt aatcgtgcga gagggcgcag ggacttcctt 1560

tgtcccaaat ctgtgcggag ccgaaatctg ggaggcgccg ccgcaccccc tctagcgggc 1620

gcggggcgaa gcggtgcggc gccggcagga aggaaatggg cggggagggc cttcgtgcgt 1680

cgccgcgccg ccgtcccctt ctccctctcc agcctcgggg ctgtccgcgg ggggacggct 1740

gccttcgggg gggacggggc agggcggggt tcggcttctg gcgtgtgacc ggcggctcta 1800

gagcctctgc taaccatgtt catgccttct tctttttcct acagctcctg ggcaacgtgc 1860

tggttattgt gctgtctcat cattttggca aagaattgat taattcgagc gaacgcgtgc 1920

caccatggct gctgtggtgg ctgccacaag atggtggcag ctgctgctgg tgctgagcgc 1980

cgctggaatg ggagcttctg gcgctcccca gccccccaat attctcctgc tgctgatgga 2040

cgacatgggc tggggcgatc tgggagtgta cggcgagcct agcagagaga cacccaacct 2100

ggacagaatg gccgccgagg gcctgctgtt ccccaacttc tacagcgcca accccctgtg 2160

cagcccatct agagccgctc tgctgaccgg cagactgccc atcagaaacg gcttctacac 2220

caccaacgcc cacgcccgga acgcctacac accccaggaa atcgtgggcg gcatccccga 2280

tagcgaacag ctgctgcctg agctgctgaa gaaagccggc tacgtgtcca agatcgtggg 2340

caagtggcac ctgggccaca gaccccagtt ccaccctctg aagcacggct tcgacgagtg 2400

gttcggcagc cccaattgcc acttcggccc ctacgacaac aaggccagac ccaacatccc 2460

cgtgtaccgg gactgggaga tggtgggacg gtactacgaa gagttcccca tcaacctgaa 2520

aaccggcgag gccaacctga cccagatcta cctgcaggaa gccctggact tcatcaagcg 2580

gcaggcccgg caccaccctt tctttctgta ctgggccgtg gacgccaccc acgcccctgt 2640

gtatgccagc aagcctttcc tgggcaccag ccagagaggc agatacggcg acgccgtgcg 2700

cgagatcgat gacagcatcg gcaagatcct ggaactgctg caggacctgc acgtggccga 2760

caacaccttc gtgttcttca ccagcgacaa cggcgctgcc ctgatctctg ctcctgagca 2820

gggcggcagc aacggcccat ttctgtgtgg caagcagacc accttcgagg gcggcatgag 2880

agaacctgcc ctggcttggt ggcctggcca tgtgacagct ggacaggtgt cccaccagct 2940

gggcagcatc atggacctgt tcaccaccag cctggccctg gccggactga cacctccaag 3000

cgacagagcc atcgacggcc tgaacctgct gcctaccctg ctgcagggac ggctgatgga 3060

ccggcccatc ttctactaca gaggcgacac cctgatggcc gccacactgg gacagcacaa 3120

ggcccacttt tggacctgga ccaacagctg ggagaacttc cggcagggca tcgacttttg 3180

ccctggccag aatgtgtccg gcgtgaccac ccacaacctg gaagatcaca ccaagctgcc 3240

cctgattttc cacctgggca gagatcccgg cgagcggttc cctctgtctt ttgccagcgc 3300

cgagtaccag gaagctctga gcagaatcac ctccgtggtg cagcagcacc aggaagcact 3360

ggtgcctgct cagccccagc tgaacgtgtg caattgggcc gtgatgaact gggcccctcc 3420

cggctgtgaa aagctgggaa agtgcctgac cccccctgag agcatcccca agaaatgcct 3480

gtggtcccac tgagaattcg agctcggtac ccgggaatca attcactcct caggtgcagg 3540

ctgcctatca gaaggtggtg gctggtgtgg ccaatgccct ggctcacaaa taccactgag 3600

atctttttcc ctctgccaaa aattatgggg acatcatgaa gccccttgag catctgactt 3660

ctggctaata aaggaaattt attttcattg caatagtgtg ttggaatttt ttgtgtctct 3720

cactcggaag gacatatggg agggcaaatc atttaaaaca tcagaatgag tatttggttt 3780

agagtttggc aacatatgcc catatgctgg ctgccatgaa caaaggttgg ctataaagag 3840

gtcatcagta tatgaaacag ccccctgctg tccattcctt attccataga aaagccttga 3900

cttgaggtta gatttttttt atattttgtt ttgtgttatt tttttcttta acatccctaa 3960

aattttcctt acatgtttta ctagccagat ttttcctcct ctcctgacta ctcccagtca 4020

tagctgtccc tcttctctta tggagatccc tcgacctgca gcccaagctg tagataagta 4080

gcatggcggg ttaatcatta actacaagga acccctagtg atggagttgg ccactccctc 4140

tctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggctttg cccgggcggc ctcagtgagc 4200

gagcgagcgc gcagc 4215

<210> 14

<211> 4215

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> AAV9-CAG-ohGALNS-version2

<400> 14

gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc gggcgacctt 60

tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca actccatcac 120

taggggttcc ttgtagttaa tgattaaccc gccatgctac ttatctactc gacattgatt 180

attgactagt tattaatagt aatcaattac ggggtcatta gttcatagcc catatatgga 240

gttccgcgtt acataactta cggtaaatgg cccgcctggc tgaccgccca acgacccccg 300

cccattgacg tcaataatga cgtatgttcc catagtaacg ccaataggga ctttccattg 360

acgtcaatgg gtggagtatt tacggtaaac tgcccacttg gcagtacatc aagtgtatca 420

tatgccaagt acgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa tggcccgcct ggcattatgc 480

ccagtacatg accttatggg actttcctac ttggcagtac atctacgtat tagtcatcgc 540

tattaccatg gtcgaggtga gccccacgtt ctgcttcact ctccccatct cccccccctc 600

cccaccccca attttgtatt tatttatttt ttaattattt tgtgcagcga tgggggcggg 660

gggggggggg gggcgcgcgc caggcggggc ggggcggggc gaggggcggg gcggggcgag 720

gcggagaggt gcggcggcag ccaatcagag cggcgcgctc cgaaagtttc cttttatggc 780

gaggcggcgg cggcggcggc cctataaaaa gcgaagcgcg cggcgggcgg gagtcgctgc 840

gttgccttcg ccccgtgccc cgctccgccg ccgcctcgcg ccgcccgccc cggctctgac 900

tgaccgcgtt actcccacag gtgagcgggc gggacggccc ttctcctccg ggctgtaatt 960

agcgcttggt ttaatgacgg cttgtttctt ttctgtggct gcgtgaaagc cttgaggggc 1020

tccgggaggg ccctttgtgc ggggggagcg gctcgggggg tgcgtgcgtg tgtgtgtgcg 1080

tggggagcgc cgcgtgcggc tccgcgctgc ccggcggctg tgagcgctgc gggcgcggcg 1140

cggggctttg tgcgctccgc agtgtgcgcg aggggagcgc ggccgggggc ggtgccccgc 1200

ggtgcggggg gggctgcgag gggaacaaag gctgcgtgcg gggtgtgtgc gtgggggggt 1260

gagcaggggg tgtgggcgcg tcggtcgggc tgcaaccccc cctgcacccc cctccccgag 1320

ttgctgagca cggcccggct tcgggtgcgg ggctccgtac ggggcgtggc gcggggctcg 1380

ccgtgccggg cggggggtgg cggcaggtgg gggtgccggg cggggcgggg ccgcctcggg 1440

ccggggaggg ctcgggggag gggcgcggcg gcccccggag cgccggcggc tgtcgaggcg 1500

cggcgagccg cagccattgc cttttatggt aatcgtgcga gagggcgcag ggacttcctt 1560

tgtcccaaat ctgtgcggag ccgaaatctg ggaggcgccg ccgcaccccc tctagcgggc 1620

gcggggcgaa gcggtgcggc gccggcagga aggaaatggg cggggagggc cttcgtgcgt 1680

cgccgcgccg ccgtcccctt ctccctctcc agcctcgggg ctgtccgcgg ggggacggct 1740

gccttcgggg gggacggggc agggcggggt tcggcttctg gcgtgtgacc ggcggctcta 1800

gagcctctgc taaccatgtt catgccttct tctttttcct acagctcctg ggcaacgtgc 1860

tggttattgt gctgtctcat cattttggca aagaattgat taattcgagc gaacgcgtgc 1920

caccatggcc gccgtggtcg ccgcaactcg atggtggcag ctgctgctgg tcctgtccgc 1980

cgctggcatg ggagcctctg gagcccctca gccccctaac atcctgctgc tgctgatgga 2040

cgatatggga tggggcgacc tgggcgtgta cggagagcca agccgggaga cacccaatct 2100

ggataggatg gcagcagagg gcctgctgtt cccaaacttt tattccgcca atcctctgtg 2160

cagcccatcc cgcgccgccc tgctgaccgg ccggctgccc atcagaaacg gcttctacac 2220

cacaaacgcc cacgcccgga atgcctatac acctcaggag atcgtgggcg gcatccccga 2280

ctctgagcag ctgctgcctg agctgctgaa gaaggccggc tacgtgagca agatcgtggg 2340

caagtggcac ctgggacaca ggccacagtt ccaccctctg aagcacggct tcgatgagtg 2400

gtttggcagc cccaattgtc actttggccc ttacgacaac aaggccagac ccaatatccc 2460

cgtgtacaga gattgggaga tggtgggcag gtactatgag gagttcccta tcaacctgaa 2520

gaccggcgag gccaatctga cacagatcta cctgcaggag gccctggact ttatcaagag 2580

gcaggcccgc caccacccct tctttctgta ctgggcagtg gatgcaaccc acgcaccagt 2640

gtatgcctct aagcccttcc tgggcacaag ccagaggggc agatatggcg acgccgtgag 2700

agagatcgac gattctatcg gcaagatcct ggagctgctg caggacctgc acgtggccga 2760

taacaccttc gtgttcttca catccgataa tggagccgcc ctgatctccg ccccagagca 2820

gggaggatct aacggaccct tcctgtgcgg caagcagacc acatttgagg gaggaatgag 2880

ggagcctgcc ctggcatggt ggccaggcca cgtgaccgcc ggccaggtga gccaccagct 2940

gggctccatc atggacctgt tcaccacaag cctggccctg gcaggcctga ccccaccatc 3000

cgacagagcc atcgatggcc tgaatctgct gcctacactg ctgcagggca ggctgatgga 3060

ccgcccaatc ttctactata ggggcgatac cctgatggca gccacactgg gacagcacaa 3120

ggcacacttt tggacctgga caaactcctg ggagaatttc cgccagggca tcgatttttg 3180

tccaggccag aacgtgtctg gcgtgaccac acacaatctg gaggaccaca ccaagctgcc 3240

cctgatcttt cacctgggcc gggatcctgg cgagagattc ccactgtctt ttgccagcgc 3300

cgagtaccag gaggccctgt cccggatcac atctgtggtg cagcagcacc aggaggccct 3360

ggtgccagca cagccccagc tgaacgtgtg caattgggcc gtgatgaact gggcccctcc 3420

aggctgtgag aaactgggca aatgtctgac tccccctgaa tctatcccta agaagtgtct 3480

gtggtcccat taggaattcg agctcggtac ccgggaatca attcactcct caggtgcagg 3540

ctgcctatca gaaggtggtg gctggtgtgg ccaatgccct ggctcacaaa taccactgag 3600

atctttttcc ctctgccaaa aattatgggg acatcatgaa gccccttgag catctgactt 3660

ctggctaata aaggaaattt attttcattg caatagtgtg ttggaatttt ttgtgtctct 3720

cactcggaag gacatatggg agggcaaatc atttaaaaca tcagaatgag tatttggttt 3780

agagtttggc aacatatgcc catatgctgg ctgccatgaa caaaggttgg ctataaagag 3840

gtcatcagta tatgaaacag ccccctgctg tccattcctt attccataga aaagccttga 3900

cttgaggtta gatttttttt atattttgtt ttgtgttatt tttttcttta acatccctaa 3960

aattttcctt acatgtttta ctagccagat ttttcctcct ctcctgacta ctcccagtca 4020

tagctgtccc tcttctctta tggagatccc tcgacctgca gcccaagctg tagataagta 4080

gcatggcggg ttaatcatta actacaagga acccctagtg atggagttgg ccactccctc 4140

tctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggctttg cccgggcggc ctcagtgagc 4200

gagcgagcgc gcagc 4215

<210> 15

<211> 4215

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> AAV9-CAG-ohGALNS-version3

<400> 15

gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc gggcgacctt 60

tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca actccatcac 120

taggggttcc ttgtagttaa tgattaaccc gccatgctac ttatctactc gacattgatt 180

attgactagt tattaatagt aatcaattac ggggtcatta gttcatagcc catatatgga 240

gttccgcgtt acataactta cggtaaatgg cccgcctggc tgaccgccca acgacccccg 300

cccattgacg tcaataatga cgtatgttcc catagtaacg ccaataggga ctttccattg 360

acgtcaatgg gtggagtatt tacggtaaac tgcccacttg gcagtacatc aagtgtatca 420

tatgccaagt acgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa tggcccgcct ggcattatgc 480

ccagtacatg accttatggg actttcctac ttggcagtac atctacgtat tagtcatcgc 540

tattaccatg gtcgaggtga gccccacgtt ctgcttcact ctccccatct cccccccctc 600

cccaccccca attttgtatt tatttatttt ttaattattt tgtgcagcga tgggggcggg 660

gggggggggg gggcgcgcgc caggcggggc ggggcggggc gaggggcggg gcggggcgag 720

gcggagaggt gcggcggcag ccaatcagag cggcgcgctc cgaaagtttc cttttatggc 780

gaggcggcgg cggcggcggc cctataaaaa gcgaagcgcg cggcgggcgg gagtcgctgc 840

gttgccttcg ccccgtgccc cgctccgccg ccgcctcgcg ccgcccgccc cggctctgac 900

tgaccgcgtt actcccacag gtgagcgggc gggacggccc ttctcctccg ggctgtaatt 960

agcgcttggt ttaatgacgg cttgtttctt ttctgtggct gcgtgaaagc cttgaggggc 1020

tccgggaggg ccctttgtgc ggggggagcg gctcgggggg tgcgtgcgtg tgtgtgtgcg 1080

tggggagcgc cgcgtgcggc tccgcgctgc ccggcggctg tgagcgctgc gggcgcggcg 1140

cggggctttg tgcgctccgc agtgtgcgcg aggggagcgc ggccgggggc ggtgccccgc 1200

ggtgcggggg gggctgcgag gggaacaaag gctgcgtgcg gggtgtgtgc gtgggggggt 1260

gagcaggggg tgtgggcgcg tcggtcgggc tgcaaccccc cctgcacccc cctccccgag 1320

ttgctgagca cggcccggct tcgggtgcgg ggctccgtac ggggcgtggc gcggggctcg 1380

ccgtgccggg cggggggtgg cggcaggtgg gggtgccggg cggggcgggg ccgcctcggg 1440

ccggggaggg ctcgggggag gggcgcggcg gcccccggag cgccggcggc tgtcgaggcg 1500

cggcgagccg cagccattgc cttttatggt aatcgtgcga gagggcgcag ggacttcctt 1560

tgtcccaaat ctgtgcggag ccgaaatctg ggaggcgccg ccgcaccccc tctagcgggc 1620

gcggggcgaa gcggtgcggc gccggcagga aggaaatggg cggggagggc cttcgtgcgt 1680

cgccgcgccg ccgtcccctt ctccctctcc agcctcgggg ctgtccgcgg ggggacggct 1740

gccttcgggg gggacggggc agggcggggt tcggcttctg gcgtgtgacc ggcggctcta 1800

gagcctctgc taaccatgtt catgccttct tctttttcct acagctcctg ggcaacgtgc 1860

tggttattgt gctgtctcat cattttggca aagaattgat taattcgagc gaacgcgtgc 1920

caccatggca gcggtggtgg ccgcgaccag atggtggcag cttctcctgg tcctgtcggc 1980

cgcgggaatg ggtgcctcgg gcgcgccgca gccccctaac attctgctgc tgctgatgga 2040

cgatatggga tggggcgacc tgggggtgta cggagagcct tcacgggaaa cccccaacct 2100

ggaccgcatg gcggctgaag gcctgctgtt cccgaacttt tactccgcga atccgctgtg 2160

ctccccttcg cgcgccgccc tcctgaccgg acggttgcct atccgcaacg gcttctacac 2220

tactaacgca cacgccagga acgcctacac cccgcaagaa attgtgggag gaatcccgga 2280

ttccgaacag ctgctgccgg aactgctgaa gaaggccggc tacgtgtcga agatcgtggg 2340

aaagtggcat cttggtcatc ggcctcagtt ccacccgctc aagcacgggt tcgatgaatg 2400

gttcggatcc cccaactgcc actttggccc ctacgacaac aaggctcggc ctaacattcc 2460

cgtctaccgg gactgggaaa tggtcggaag atactacgag gagttcccca tcaacctcaa 2520

gactggcgaa gccaacctga ctcagatcta cctccaagag gccctggact tcatcaagcg 2580

ccaggcccgg caccacccgt tcttcctcta ttgggcggtg gacgccaccc atgcccccgt 2640

gtacgcatca aagccgttcc ttggaactag ccagagaggc agatacgggg atgccgtgcg 2700

cgaaattgat gactccatcg gaaagatcct ggagctgctc caggacctcc atgtcgccga 2760

caataccttc gtgttcttta cttccgataa cggcgccgcc ttgatcagcg ccccggagca 2820

gggaggctcc aacggccctt ttctctgtgg gaaacagacc accttcgagg gagggatgcg 2880

ggaaccggct ctggcttggt ggcccggaca cgtgaccgcc ggccaagtgt cgcaccagct 2940

tggctccatc atggacttgt tcaccacctc actggccctc gcggggctca ccccaccaag 3000

cgaccgagcg attgacggtc tgaacttgct ccccactctg ctgcaaggaa ggctgatgga 3060

ccggcccatc ttctactatc ggggcgatac cttgatggcc gccaccctgg gacagcacaa 3120

ggcccacttt tggacttgga caaactcctg ggagaacttc cgccaaggga tcgacttctg 3180

ccccggtcaa aacgtgtccg gcgtgaccac ccacaacctg gaggaccata ccaagctgcc 3240

actgattttc caccttggtc gggacccagg agagagattc ccactgagct tcgcctccgc 3300

cgaatatcag gaagcactgt cccggatcac gagcgtggtg cagcagcatc aggaggccct 3360

ggtgccggcg cagccgcagc tcaatgtctg caactgggct gtgatgaact gggcaccccc 3420

tggctgcgaa aaactcggga agtgtctgac tccacctgag agcatcccga agaagtgcct 3480

gtggagccac taggaattcg agctcggtac ccgggaatca attcactcct caggtgcagg 3540

ctgcctatca gaaggtggtg gctggtgtgg ccaatgccct ggctcacaaa taccactgag 3600

atctttttcc ctctgccaaa aattatgggg acatcatgaa gccccttgag catctgactt 3660

ctggctaata aaggaaattt attttcattg caatagtgtg ttggaatttt ttgtgtctct 3720

cactcggaag gacatatggg agggcaaatc atttaaaaca tcagaatgag tatttggttt 3780

agagtttggc aacatatgcc catatgctgg ctgccatgaa caaaggttgg ctataaagag 3840

gtcatcagta tatgaaacag ccccctgctg tccattcctt attccataga aaagccttga 3900

cttgaggtta gatttttttt atattttgtt ttgtgttatt tttttcttta acatccctaa 3960

aattttcctt acatgtttta ctagccagat ttttcctcct ctcctgacta ctcccagtca 4020

tagctgtccc tcttctctta tggagatccc tcgacctgca gcccaagctg tagataagta 4080

gcatggcggg ttaatcatta actacaagga acccctagtg atggagttgg ccactccctc 4140

tctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggctttg cccgggcggc ctcagtgagc 4200

gagcgagcgc gcagc 4215

<210> 16

<211> 4209

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> AAV9-CAG-omGALNS/ AAV8-CAG-omGALNS

<400> 16

gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc gggcgacctt 60

tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca actccatcac 120

taggggttcc ttgtagttaa tgattaaccc gccatgctac ttatctactc gacattgatt 180

attgactagt tattaatagt aatcaattac ggggtcatta gttcatagcc catatatgga 240

gttccgcgtt acataactta cggtaaatgg cccgcctggc tgaccgccca acgacccccg 300

cccattgacg tcaataatga cgtatgttcc catagtaacg ccaataggga ctttccattg 360

acgtcaatgg gtggagtatt tacggtaaac tgcccacttg gcagtacatc aagtgtatca 420

tatgccaagt acgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa tggcccgcct ggcattatgc 480

ccagtacatg accttatggg actttcctac ttggcagtac atctacgtat tagtcatcgc 540

tattaccatg gtcgaggtga gccccacgtt ctgcttcact ctccccatct cccccccctc 600

cccaccccca attttgtatt tatttatttt ttaattattt tgtgcagcga tgggggcggg 660

gggggggggg gggcgcgcgc caggcggggc ggggcggggc gaggggcggg gcggggcgag 720

gcggagaggt gcggcggcag ccaatcagag cggcgcgctc cgaaagtttc cttttatggc 780

gaggcggcgg cggcggcggc cctataaaaa gcgaagcgcg cggcgggcgg gagtcgctgc 840

gttgccttcg ccccgtgccc cgctccgccg ccgcctcgcg ccgcccgccc cggctctgac 900

tgaccgcgtt actcccacag gtgagcgggc gggacggccc ttctcctccg ggctgtaatt 960

agcgcttggt ttaatgacgg cttgtttctt ttctgtggct gcgtgaaagc cttgaggggc 1020

tccgggaggg ccctttgtgc ggggggagcg gctcgggggg tgcgtgcgtg tgtgtgtgcg 1080

tggggagcgc cgcgtgcggc tccgcgctgc ccggcggctg tgagcgctgc gggcgcggcg 1140

cggggctttg tgcgctccgc agtgtgcgcg aggggagcgc ggccgggggc ggtgccccgc 1200

ggtgcggggg gggctgcgag gggaacaaag gctgcgtgcg gggtgtgtgc gtgggggggt 1260

gagcaggggg tgtgggcgcg tcggtcgggc tgcaaccccc cctgcacccc cctccccgag 1320

ttgctgagca cggcccggct tcgggtgcgg ggctccgtac ggggcgtggc gcggggctcg 1380

ccgtgccggg cggggggtgg cggcaggtgg gggtgccggg cggggcgggg ccgcctcggg 1440

ccggggaggg ctcgggggag gggcgcggcg gcccccggag cgccggcggc tgtcgaggcg 1500

cggcgagccg cagccattgc cttttatggt aatcgtgcga gagggcgcag ggacttcctt 1560

tgtcccaaat ctgtgcggag ccgaaatctg ggaggcgccg ccgcaccccc tctagcgggc 1620

gcggggcgaa gcggtgcggc gccggcagga aggaaatggg cggggagggc cttcgtgcgt 1680

cgccgcgccg ccgtcccctt ctccctctcc agcctcgggg ctgtccgcgg ggggacggct 1740

gccttcgggg gggacggggc agggcggggt tcggcttctg gcgtgtgacc ggcggctcta 1800

gagcctctgc taaccatgtt catgccttct tctttttcct acagctcctg ggcaacgtgc 1860

tggttattgt gctgtctcat cattttggca aagaattgat taattcgagc gaacgcgtgc 1920

caccatggct gcttgtacag ccgctcagca gctgctgctg gtgctgtctg ctctgggact 1980

gctggctgct ggcgctcctc agcctcctaa catcgtgctg ctgctgatgg acgacatggg 2040

ctggggcgat ctgggagtga acggcgagcc tagcagagag acacccaacc tggacagaat 2100

ggccgccgag ggcatgctgt tccccagctt ctacagcgcc aaccccctgt gcagcccttc 2160

tagagccgct ctgctgaccg gcagactgcc catcagaaac ggcttctaca ccaccaacgc 2220

ccacgccaga aacgcctaca caccccagga aatcatgggc ggcatcccca acagcgagca 2280

tctgctgcct gagctgctga agaaggccgg ctacaccaac aagatcgtgg gcaagtggca 2340

cctgggccac agaccccagt tccaccctct gaagcacggc ttcgacgagt ggttcggcag 2400

ccccaactgt cacttcggcc cctacgacaa caaggccaag cccaacatcc ccgtgtacag 2460

agactgggag atggtgggaa gattctacga agagttcccc atcaacagaa agaccggcga 2520

ggccaacctg acccagctgt acacacagga agccctggac ttcatccaga cccagcacgc 2580

cagacagagc cccttcttcc tgtactgggc catcgacgcc acacacgccc ctgtgtacgc 2640

cagcagacag ttcctgggca ccagcctgag aggcagatat ggcgacgccg tgcgcgagat 2700

cgacgactct gtgggcaaga tcctgtccct gctgcagaac ctgggcatca gcaagaacac 2760

cttcgtgttc ttcaccagcg acaacggcgc tgccctgatc agcgctccta atgagggcgg 2820

cagcaacggc ccattcctgt gcggcaagca gaccacattc gagggcggaa tgagagagcc 2880

cgctatcgct tggtggcctg gccatatcgc tgctggccag gtgtcacacc agctgggcag 2940

catcatggac ctgttcacca cctccctgag cctggccgga ctgaagcctc ctagcgacag 3000

agtgatcgac ggcctggacc tgctgcccac catgctgaag ggccagatga tggacagacc 3060

catcttctac tacagaggca acaccctgat ggccgtgacc ctgggccagt acaaggccca 3120

cctgtggacc tggaccaaca gctgggaaga gtttacccag ggcaccgatt tctgccctgg 3180

ccagaatgtg tccggcgtga ccacccacac ccaggaagaa cacaccgagc tgcccctgat 3240

cttccacctg ggaagggacc ccggcgagag attccctctg agcttccaca gcgacgagta 3300

ccaggacgcc ctgagcagaa ccacccaggt ggtgcaggaa caccagaaaa gcctggtgcc 3360

cggccagccc cagctgaacg tgtgtaacca ggccgtgatg aactgggccc ctcccggatg 3420

tgaaaagctg ggaaagtgcc tgaccccccc tgagagcgtg cccgagaagt gtttctgggc 3480

ccactgagaa ttcgagctcg gtacccggga atcaattcac tcctcaggtg caggctgcct 3540

atcagaaggt ggtggctggt gtggccaatg ccctggctca caaataccac tgagatcttt 3600

ttccctctgc caaaaattat ggggacatca tgaagcccct tgagcatctg acttctggct 3660

aataaaggaa atttattttc attgcaatag tgtgttggaa ttttttgtgt ctctcactcg 3720

gaaggacata tgggagggca aatcatttaa aacatcagaa tgagtatttg gtttagagtt 3780

tggcaacata tgcccatatg ctggctgcca tgaacaaagg ttggctataa agaggtcatc 3840

agtatatgaa acagccccct gctgtccatt ccttattcca tagaaaagcc ttgacttgag 3900

gttagatttt ttttatattt tgttttgtgt tatttttttc tttaacatcc ctaaaatttt 3960

ccttacatgt tttactagcc agatttttcc tcctctcctg actactccca gtcatagctg 4020

tccctcttct cttatggaga tccctcgacc tgcagcccaa gctgtagata agtagcatgg 4080

cgggttaatc attaactaca aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg 4140

cgctcgctcg ctcactgagg ccgcccgggc tttgcccggg cggcctcagt gagcgagcga 4200

gcgcgcagc 4209

<210> 17

<211> 3849

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> AAV8-hAAT-omGALNS

<400> 17

gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc gggcgacctt 60

tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca actccatcac 120

taggggttcc ttgtagttaa tgattaaccc gccatgctac ttatctactc gacattgatt 180

attgactagg atctgatatc atcgatgaat tcgagctcgg tacccggccg cagatttagg 240

tgacactata gaatatgcat cactagtaag cttgcgaatt ccagtctaca gagaggtctc 300

tgacctctgc cccagctcca aggtcagcag gcagggaggg ctgtgtgttt gctgtttgct 360

gcttgcaatg tttgcccatt ttagggacat gagtaggctg aagtttgttc agtgtggact 420

tcagaggcag cacacaaaca gcaagcttgc gaattccagt ctacagagag gtctctgacc 480

tctgccccag ctccaaggtc agcaggcagg gagggctgtg tgtttgctgt ttgctgcttg 540

caatgtttgc ccattttagg gacatgagta ggctgaagtt tgttcagtgt ggacttcaga 600

ggcagcacac aaacagcaag cttgcgaatt ccagtctaca gagaggtctc tgacctctgc 660

cccagctcca aggtcagcag gcagggaggg ctgtgtgttt gctgtttgct gcttgcaatg 720

tttgcccatt ttagggacat gagtaggctg aagtttgttc agtgtggact tcagaggcag 780

cacacaaaca gcaagctttg ctctagactg gaattcgtcg acgagctccc tatagtgagt 840

cgtattagag gccgactgac ccggtacccg gggatcttgc taccagtgga acagccacta 900

aggattctgc agtgagagca gagggccagc taagtggtac tctcccagag actgtctgac 960

tcacgccacc ccctccacct tggacacagg acgctgtggt ttctgagcca ggtacaatga 1020

ctcctttcgg taagtgcagt ggaagctgta cactgcccag gcaaagcgtc cgggcagcgt 1080

aggcgggcga ctcagatccc agccagtgga cttagcccct gtttgctcct ccgataactg 1140

gggtgacctt ggttaatatt caccagcagc ctcccccgtt gcccctctgg atccactgct 1200

taaatacgga cgaggacagg gccctgtctc ctcagcttca ggcaccacca ctgacctggg 1260

acagtgaatg tccccctgat ctgcggccgt gactctctta aggtagcctt gcagaagttg 1320

gtcgtgaggc actgggcagg taagtatcaa ggttacaaga caggtttaag gagaccaata 1380

gaaactgggc ttgtcgagac agagaagact cttgcgtttc tgataggcac ctattggtct 1440

tactgacatc cactttgcct ttctctccac aggtgtccac tcccagttca attacagctc 1500

ttaaggctag agtacttaat acgactcact ataggctagc ctcgacctcg agacgcgtgc 1560

caccatggct gcttgtacag ccgctcagca gctgctgctg gtgctgtctg ctctgggact 1620

gctggctgct ggcgctcctc agcctcctaa catcgtgctg ctgctgatgg acgacatggg 1680

ctggggcgat ctgggagtga acggcgagcc tagcagagag acacccaacc tggacagaat 1740

ggccgccgag ggcatgctgt tccccagctt ctacagcgcc aaccccctgt gcagcccttc 1800

tagagccgct ctgctgaccg gcagactgcc catcagaaac ggcttctaca ccaccaacgc 1860

ccacgccaga aacgcctaca caccccagga aatcatgggc ggcatcccca acagcgagca 1920

tctgctgcct gagctgctga agaaggccgg ctacaccaac aagatcgtgg gcaagtggca 1980

cctgggccac agaccccagt tccaccctct gaagcacggc ttcgacgagt ggttcggcag 2040

ccccaactgt cacttcggcc cctacgacaa caaggccaag cccaacatcc ccgtgtacag 2100

agactgggag atggtgggaa gattctacga agagttcccc atcaacagaa agaccggcga 2160

ggccaacctg acccagctgt acacacagga agccctggac ttcatccaga cccagcacgc 2220

cagacagagc cccttcttcc tgtactgggc catcgacgcc acacacgccc ctgtgtacgc 2280

cagcagacag ttcctgggca ccagcctgag aggcagatat ggcgacgccg tgcgcgagat 2340

cgacgactct gtgggcaaga tcctgtccct gctgcagaac ctgggcatca gcaagaacac 2400

cttcgtgttc ttcaccagcg acaacggcgc tgccctgatc agcgctccta atgagggcgg 2460

cagcaacggc ccattcctgt gcggcaagca gaccacattc gagggcggaa tgagagagcc 2520

cgctatcgct tggtggcctg gccatatcgc tgctggccag gtgtcacacc agctgggcag 2580

catcatggac ctgttcacca cctccctgag cctggccgga ctgaagcctc ctagcgacag 2640

agtgatcgac ggcctggacc tgctgcccac catgctgaag ggccagatga tggacagacc 2700

catcttctac tacagaggca acaccctgat ggccgtgacc ctgggccagt acaaggccca 2760

cctgtggacc tggaccaaca gctgggaaga gtttacccag ggcaccgatt tctgccctgg 2820

ccagaatgtg tccggcgtga ccacccacac ccaggaagaa cacaccgagc tgcccctgat 2880

cttccacctg ggaagggacc ccggcgagag attccctctg agcttccaca gcgacgagta 2940

ccaggacgcc ctgagcagaa ccacccaggt ggtgcaggaa caccagaaaa gcctggtgcc 3000

cggccagccc cagctgaacg tgtgtaacca ggccgtgatg aactgggccc ctcccggatg 3060

tgaaaagctg ggaaagtgcc tgaccccccc tgagagcgtg cccgagaagt gtttctgggc 3120

ccactgagaa ttcgagctcg gtacccggga atcaattcac tcctcaggtg caggctgcct 3180

atcagaaggt ggtggctggt gtggccaatg ccctggctca caaataccac tgagatcttt 3240

ttccctctgc caaaaattat ggggacatca tgaagcccct tgagcatctg acttctggct 3300

aataaaggaa atttattttc attgcaatag tgtgttggaa ttttttgtgt ctctcactcg 3360

gaaggacata tgggagggca aatcatttaa aacatcagaa tgagtatttg gtttagagtt 3420

tggcaacata tgcccatatg ctggctgcca tgaacaaagg ttggctataa agaggtcatc 3480

agtatatgaa acagccccct gctgtccatt ccttattcca tagaaaagcc ttgacttgag 3540

gttagatttt ttttatattt tgttttgtgt tatttttttc tttaacatcc ctaaaatttt 3600

ccttacatgt tttactagcc agatttttcc tcctctcctg actactccca gtcatagctg 3660

tccctcttct cttatggaga tccctcgacc tgcagcccaa gctgtagata agtagcatgg 3720

cgggttaatc attaactaca aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg 3780

cgctcgctcg ctcactgagg ccgcccgggc tttgcccggg cggcctcagt gagcgagcga 3840

gcgcgcagc 3849

<210> 18

<211> 1674

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CAG Promoter

<400> 18

gacattgatt attgactagt tattaatagt aatcaattac ggggtcatta gttcatagcc 60

catatatgga gttccgcgtt acataactta cggtaaatgg cccgcctggc tgaccgccca 120

acgacccccg cccattgacg tcaataatga cgtatgttcc catagtaacg ccaataggga 180

ctttccattg acgtcaatgg gtggagtatt tacggtaaac tgcccacttg gcagtacatc 240

aagtgtatca tatgccaagt acgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa tggcccgcct 300

ggcattatgc ccagtacatg accttatggg actttcctac ttggcagtac atctacgtat 360

tagtcatcgc tattaccatg gtcgaggtga gccccacgtt ctgcttcact ctccccatct 420

cccccccctc cccaccccca attttgtatt tatttatttt ttaattattt tgtgcagcga 480

tgggggcggg gggggggggg gggcgcgcgc caggcggggc ggggcggggc gaggggcggg 540

gcggggcgag gcggagaggt gcggcggcag ccaatcagag cggcgcgctc cgaaagtttc 600

cttttatggc gaggcggcgg cggcggcggc cctataaaaa gcgaagcgcg cggcgggcgg 660

gagtcgctgc gttgccttcg ccccgtgccc cgctccgccg ccgcctcgcg ccgcccgccc 720

cggctctgac tgaccgcgtt actcccacag gtgagcgggc gggacggccc ttctcctccg 780

ggctgtaatt agcgcttggt ttaatgacgg cttgtttctt ttctgtggct gcgtgaaagc 840

cttgaggggc tccgggaggg ccctttgtgc ggggggagcg gctcgggggg tgcgtgcgtg 900

tgtgtgtgcg tggggagcgc cgcgtgcggc tccgcgctgc ccggcggctg tgagcgctgc 960

gggcgcggcg cggggctttg tgcgctccgc agtgtgcgcg aggggagcgc ggccgggggc 1020

ggtgccccgc ggtgcggggg gggctgcgag gggaacaaag gctgcgtgcg gggtgtgtgc 1080

gtgggggggt gagcaggggg tgtgggcgcg tcggtcgggc tgcaaccccc cctgcacccc 1140

cctccccgag ttgctgagca cggcccggct tcgggtgcgg ggctccgtac ggggcgtggc 1200

gcggggctcg ccgtgccggg cggggggtgg cggcaggtgg gggtgccggg cggggcgggg 1260

ccgcctcggg ccggggaggg ctcgggggag gggcgcggcg gcccccggag cgccggcggc 1320

tgtcgaggcg cggcgagccg cagccattgc cttttatggt aatcgtgcga gagggcgcag 1380

ggacttcctt tgtcccaaat ctgtgcggag ccgaaatctg ggaggcgccg ccgcaccccc 1440

tctagcgggc gcggggcgaa gcggtgcggc gccggcagga aggaaatggg cggggagggc 1500

cttcgtgcgt cgccgcgccg ccgtcccctt ctccctctcc agcctcgggg ctgtccgcgg 1560

ggggacggct gccttcgggg gggacggggc agggcggggt tcggcttctg gcgtgtgacc 1620

ggcggctcta gagcctctgc taaccatgtt catgccttct tctttttcct acag 1674

<210> 19

<211> 1221

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> hAAT Promoter

<400> 19

gatctgatat catcgatgaa ttcgagctcg gtacccggcc gcagatttag gtgacactat 60

agaatatgca tcactagtaa gcttgcgaat tccagtctac agagaggtct ctgacctctg 120

ccccagctcc aaggtcagca ggcagggagg gctgtgtgtt tgctgtttgc tgcttgcaat 180

gtttgcccat tttagggaca tgagtaggct gaagtttgtt cagtgtggac ttcagaggca 240

gcacacaaac agcaagcttg cgaattccag tctacagaga ggtctctgac ctctgcccca 300

gctccaaggt cagcaggcag ggagggctgt gtgtttgctg tttgctgctt gcaatgtttg 360

cccattttag ggacatgagt aggctgaagt ttgttcagtg tggacttcag aggcagcaca 420

caaacagcaa gcttgcgaat tccagtctac agagaggtct ctgacctctg ccccagctcc 480

aaggtcagca ggcagggagg gctgtgtgtt tgctgtttgc tgcttgcaat gtttgcccat 540

tttagggaca tgagtaggct gaagtttgtt cagtgtggac ttcagaggca gcacacaaac 600

agcaagcttt gctctagact ggaattcgtc gacgagctcc ctatagtgag tcgtattaga 660

ggccgactga cccggtaccc ggggatcttg ctaccagtgg aacagccact aaggattctg 720

cagtgagagc agagggccag ctaagtggta ctctcccaga gactgtctga ctcacgccac 780

cccctccacc ttggacacag gacgctgtgg tttctgagcc aggtacaatg actcctttcg 840

gtaagtgcag tggaagctgt acactgccca ggcaaagcgt ccgggcagcg taggcgggcg 900

actcagatcc cagccagtgg acttagcccc tgtttgctcc tccgataact ggggtgacct 960

tggttaatat tcaccagcag cctcccccgt tgcccctctg gatccactgc ttaaatacgg 1020

acgaggacag ggccctgtct cctcagcttc aggcaccacc actgacctgg gacagtgaat 1080

gtccccctga tctgcggccg tgactctctt aaggtagcct tgcagaagtt ggtcgtgagg 1140

cactgggcag gtaagtatca aggttacaag acaggtttaa ggagaccaat agaaactggg 1200

cttgtcgaga cagagaagac t 1221

<210> 20

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Sense primer

<400> 20

ccagggaatg tcccacctat tt 22

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense primer

<400> 21

gtcaggttga cacgaagctg 20

<210> 22

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Antisense primer KO

<400> 22

ggaacttcgg ttccggcg 18

<---

Изобретение относится к биотехнологии. Описана выделенная нуклеиновая кислота, имеющая нуклеотидную последовательность, на от 75% до 90% идентичную нуклеотидной последовательности, как представлено в SEQ ID NO: 1, где указанная нуклеиновая кислота кодирует функциональную N-ацетил-галактозамин-6-сульфатазу человека и где указанная нуклеиновая кислота выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 7, для применения в лечении мукополисахаридоза типа IVA или синдрома Моркио А. Также представлен экспрессионный вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, указанную нуклеиновую кислоту, для применения в лечении мукополисахаридоза типа IVA или синдрома Моркио А. Кроме того, описана фармацевтическая композиция, содержащая терапевтически эффективное количество нуклеиновой кислоты или вектора, для применения в лечении мукополисахаридоза типа IVA или синдрома Моркио А. Описано применение вектора по любому в производстве лекарственного средства. Описан способ получения вектора, предусматривающий стадии: (i) обеспечения клетки, содержащей нуклеиновую кислоту по п.1, AAV белки Cap, AAV белки Rep и необязательно вирусные белки, от которых зависит репликация AAV, (ii) поддержания клетки в условиях, подходящих для сборки AAV, и (iii) очистки аденоассоциированного вирусного вектора, продуцированного клеткой. Изобретение расширяет арсенал средств для лечения мукополисахаридоза типа IVA или синдрома Моркио А. 6 н. и 7 з.п. ф-лы, 14 ил., 15 пр.

1. Выделенная нуклеиновая кислота, имеющая нуклеотидную последовательность, на от 75% до 90% идентичную нуклеотидной последовательности, как представлено в SEQ ID NO: 1, где указанная нуклеиновая кислота кодирует функциональную N-ацетил-галактозамин-6-сульфатазу человека и, где указанная нуклеиновая кислота выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 7, для применения в лечении мукополисахаридоза типа IVA или синдрома Моркио А.

2. Экспрессионный вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по п. 1, для применения в лечении мукополисахаридоза типа IVA или синдрома Моркио А.

3. Экспрессионный вектор по п. 2, где указанный вектор содержит промоторную последовательность, функционально связанную с указанной нуклеиновой кислотой, причем указанный промотор выбран из промотора CAG, промотора hAAT или промотора CMV.

4. Экспрессионный вектор по п. 3, где указанный промотор представляет собой промотор CAG.

5. Экспрессионный вектор по п. 2, где указанный вектор представляет собой рекомбинантный AAV вектор.

6. Экспрессионный вектор по п. 5, где указанный рекомбинантный AAV вектор выбран из AAV2, AAV5, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10 и AAVrh10.

7. Вектор по п. 2, где указанный вектор выбран из группы, состоящей из плазмиды pAAV-CAG-ohGALNS-вариант 1 с номером доступа DSM 32792, как представлено в SEQ ID NO: 4, плазмиды pAAV-CAG-ohGALNS-вариант 2 с номером доступа DSM 32793, как представлено в SEQ ID NO: 6, и плазмиды pAAV-CAG-ohGALNS-вариант 3 с номером доступа DSM 32794, как представлено в SEQ ID NO: 8.

8. Фармацевтическая композиция, содержащая терапевтически эффективное количество нуклеиновой кислоты по п. 1 или вектора по любому из пп. 2-7, для применения в лечении мукополисахаридоза типа IVA или синдрома Моркио А.

9. Фармацевтическая композиция по п. 8, отличающаяся тем, что композицию вводят внутривенно.

10. Фармацевтическая композиция по п. 8, отличающаяся тем, что композицию вводят один раз в течение жизни.

11. Применение вектора по любому из пп. 2-7 в производстве лекарственного средства.

12. Применение вектора по любому из пп. 2-7 в производстве лекарственного средства для лечения мукополисахаридоза типа IVA или синдрома Моркио А.

13. Способ получения вектора по п. 5 или 6, предусматривающий стадии:

(i) обеспечения клетки, содержащей нуклеиновую кислоту по п. 1, AAV белки Cap, AAV белки Rep и необязательно вирусные белки, от которых зависит репликация AAV,

(ii) поддержания клетки в условиях, подходящих для сборки AAV, и

(iii) очистки аденоассоциированного вирусного вектора, продуцированного клеткой.