БИОМАРКЕРЫ ДЛЯ КОМБИНИРОВАННОЙ ТЕРАПИИ, ВКЛЮЧАЮЩЕЙ ЛЕНВАТИНИБ И ЭВЕРОЛИМУС Российский патент 2021 года по МПК G01N33/574 G01N33/68 A61K31/47 A61K31/436 A61P35/00 

[Область техники, к которой относится изобретение]

[0001]

Настоящее изобретение в целом относится к биомаркерам и почечно-клеточному раку.

[Уровень техники]

[0002]

Ряд ингибиторов киназ был разработан в качестве противоопухолевых средств. Например, группа соединений, обладающих ингибирующим действием в отношении рецепторных тирозинкиназ, таких как рецептор фактора роста эндотелия сосудов (VEGFR), как известно, ингибирует ангиогенез и рассматривается как новый класс противоопухолевых средств. Ленватиниба мезилат (также известный как E7080) является пероральным ингибитором тирозинкиназ, направленным на VEGFR1-3, рецептор фактора роста фибробластов (FGFR) 1-4, перестроенный во время трансфекции рецептор (RET), KIT и рецептор тромбоцитарного фактора роста (PDGFR). Ленватиниба мезилат был одобрен под названием LENVIMA^TM Управлением по контролю за продуктами и лекарствами США для лечения пациентов с диагнозом местного рецидивного или метастатического, прогрессирующего, невосприимчивого к радиоактивному йоду дифференцированного рака щитовидной железы. Продолжаются исследования Фазы II и III для других типов опухолей, включая почечно-клеточный рак, гепатоцеллюлярную карциному, рак эндометрия и немелкоклеточный рак легкого.

[0003]

К сожалению, большинство методов противоопухолевого лечения связано с нежелательными побочными эффектами, такими как сильная тошнота, рвота или сильная утомляемость. Такие побочные эффекты необходимо контролировать, особенно если применяется несколько противоопухолевых средств при комбинированной терапии. Кроме того, несмотря на успешное применение противоопухолевых терапий, это лечение не приводит к значимым клиническим ответам у всех пациентов, вызывая нежелательные побочные эффекты, задержки и расходы, связанные с неэффективным лечением. Таким образом, биомаркеры, которые можно использовать для прогнозирования ответа субъекта на противоопухолевое средство до его введения, особенно когда оно используется в комбинированной терапии, являются крайне необходимыми.

[0004]

В WO 2012/157672 раскрыто, что в подгруппе пациентов с меланомой, имеющих либо B-raf дикого типа и PTEN, или мутировавшие B-raf и PTEN, по высоким уровням Ang2, IL6, CXCR4, COL4A3, MEIS1, FGF9, FGFR1, FGFR2, FGFR3, FGFR4 или VEGFR1 и низким уровням SHC1, NRP2, ARHGAP22, SCG2 или PML можно прогнозировать чувствительность к соединениям ленватиниба.

[0005]

В WO 2012/166899 раскрыто, что у субъектов, страдающих раком щитовидной железы или почки, по низким уровням Ang2, VEGFA, IFNG или растворимого KDR или высоким уровням IL-6, IL-13, PDGFAB, CSF3, CCL3, CCL4, FLT4 или FGF2 можно прогнозировать чувствительность к соединениям ленватиниба. Однако, в WO 2012/166899 не раскрыто и не высказано предположение о том, что Ang2 можно использовать для прогнозирования предпочтительного применения комбинированной терапии, включающей соединения ленватиниба и другое противоопухолевое средство, такое как эверолимус, по сравнению с монотерапией таким другим противоопухолевым средством в случае пациентов, страдающих раком почки.

[0006]

В WO 2014/185540 раскрыто, что у субъектов, страдающих раком эндометрия, по низким уровням Ang2 можно прогнозировать чувствительность к соединениям ленватиниба. Однако, в WO 2014/185540 не раскрыто, что по Ang2 можно прогнозировать чувствительность к комбинированной терапии, включающей соединения ленватиниба и эверолимус, у пациентов с почечно-клеточным раком, и тем более о том, что такая комбинированная терапия предпочтительна по сравнению с монотерапией эверолимусом.

[0007]

В US 2012/0077837 раскрыт способ лечения опухолей, включающий введение пациенту соединения ленватиниба (например, ленватиниба мезилата) и эверолимуса. Однако, в US 2012/0077837 не раскрыто и не высказано предположение о том, что по Ang2 можно прогнозировать чувствительность к комбинированной терапии, включающей соединение ленватиниба (например, ленватиниба мезилата) и эверолимус, у пациентов с почечно-клеточным раком, и тем более о том, что такая комбинированная терапия предпочтительна по сравнению с монотерапией эверолимусом.

[0008]

Llovet et al. Clin. Cancer Res., 18(8):2290-2300 (2012) сообщают, что в случае пациентов с распространенной гепатоцеллюлярной карциномой, несмотря на то, что биомаркеры ангиогенеза Ang2 и VEGF являлись прогностическими факторами выживания, по этим биомаркерам не возможно было прогнозировать чувствительность к ингибитору ангиогенеза - сорафенибу.

[0009]

Таким образом, не ожидается, что биомаркер ангиогенеза, такой как Ang2, может использоваться в качестве биомаркера чувствительности к ингибиторам ангиогенеза при всех формах рака.

[Краткое описание изобретения]

[0010]

Настоящее изобретение основано, по меньшей мере частично, на выявлении биомаркеров, которые могут использоваться для идентифицирования или отбора субъекта-человека, который страдает от, у которого есть подозрение на или существует опасность развития почечно-клеточного рака, и который нуждается в комбинированной терапии, состоящей из ленватиниба или его фармацевтически приемлемой соли (например, ленватиниба мезилата) и эверолимуса. Установлено, что уровень экспрессии ангиопоэтина-2 (ʺAng2ʺ) в биологической пробе, взятой у субъекта-человека до лечения (ʺисходный уровеньʺ), является полезным прогностическим фактором того, нуждается ли субъект-человек, который страдает от, у которого есть подозрение на или существует опасность развития почечно-клеточного рака, в комбинированной терапии, состоящей из ленватиниба или его фармацевтически приемлемой соли (например, ленватиниба мезилата) и эверолимуса. Таким образом, биомаркеры и композиции, описанные в данном документе, полезны, например, для идентифицирования, стратификации и/или отбора пациента или подгруппы пациентов, страдающих от почечно-клеточного рака, для которых может быть полезна комбинированная терапия, включающей в себя ленватиниб или его фармацевтически приемлемую соль (например, ленватиниба мезилат) и эверолимус. Кроме того, способы, описанные в данном документе, пригодны, например, при выборе подходящих методов лечения (например, комбинированной терапии, включающей ленватиниб или его фармацевтически приемлемую соль (например, ленватиниба мезилат) и эверолимус, или альтернативной терапии почечно-клеточного рака) для субъекта, который страдает от, у которого есть подозрение на или существует опасность развития почечно-клеточного рака.

[0011]

В одном аспекте настоящего раскрытия предложен способ идентифицирования субъекта-человека, который страдает от, у которого есть подозрение на или существует опасность развития почечно-клеточного рака, нуждающегося в комбинированной терапии, включающей ленватиниб или его фармацевтически приемлемую соль и эверолимус. Способ включает количественный анализ биологической пробы, взятой у субъекта до начала комбинированной терапии, и определение того, что концентрация белка Ang2 в биологической пробе выше контрольного уровня. Субъекта, имеющего высокую концентрацию белка Ang2 в биологической пробе, идентифицируют как нуждающегося в комбинированной терапии, включающей ленватиниб или его фармацевтически приемлемую соль и эверолимус.

[0012]

Во втором аспекте настоящего раскрытия предложен способ отбора субъекта-человека, который страдает от, у которого есть подозрение на или существует опасность развития почечно-клеточного рака, для получения комбинированной терапии, включающей ленватиниб или его фармацевтически приемлемую соль и эверолимус. Способ включает количественный анализ биологической пробы, взятой у субъекта-человека, для установления исходного уровня содержания белка Ang2. Если установлено, что исходный уровень содержания белка Ang2 в биологической пробе выше контрольного, субъект проходит отбор для получения комбинированной терапии. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает получение комбинированной терапии субъектом-человеком.

[0013]

В третьем аспекте раскрытия предложен способ лечения почечно-клеточного рака. Способ включает предоставление биологической пробы, взятой у субъекта, страдающего почечно-клеточным раком, до начала лечения; измерение в биологической пробе уровня экспрессии белка Ang2, который выше контрольного; и получение указанным субъектом терапевтически эффективного количества ленватиниба или его фармацевтически приемлемой соли и эверолимуса.

[0014]

В четвертом аспекте раскрытия предложен способ лечения почечно-клеточного рака. Способ включает введение субъекту, страдающему почечно-клеточным раком, терапевтически эффективного количества ленватиниба или его фармацевтически приемлемой соли и эверолимуса, где у субъекта выявлен уровень экспрессии белка Ang2 выше контрольного. В некоторых вариантах осуществления у субъекта выявлена высокая концентрация белка Ang2 в биологической пробе, взятой у субъекта-человека.

[0015]

В пятом аспекте данное раскрытие касается способа лечения субъекта-человека, который страдает от, у которого есть подозрение на или существует опасность развития почечно-клеточного рака. Этот способ включает в себя получение субъектом-человеком комбинированной терапии, включающей эверолимус и ленватиниб или его фармацевтически приемлемую соль, где перед этим в биологической пробе, взятой у субъекта-человека, был выявлен исходный уровень содержания белка Ang2 выше контрольного.

[0016]

Следующие варианты осуществления предусмотрены для всех указанных выше аспектов.

[0017]

В одном варианте осуществления ленватиниб или его фармацевтически приемлемая соль представляет собой ленватиниба мезилат.

[0018]

В одном варианте осуществления почечно-клеточный рак представляет собой распространенный почечно-клеточный рак или метастатический почечно-клеточный рак.

[0019]

В некоторых вариантах осуществления биологическая проба выбрана из группы, состоящей из пробы крови, пробы сыворотки, пробы плазмы, архивной пробы опухоли почечно-клеточного рака и пробы биопсии почечно-клеточного рака.

[0020]

В некоторых вариантах осуществления контроль представляет собой предварительно установленное пороговое значение. В одном варианте осуществления предварительно установленное пороговое значение представляет собой концентрацию белка Ang2, которую определяют на основании анализа характеристических кривых обнаружения (ROC-характеристика) или анализа процентиля, прогнозируя ответ опухоли с более высокой положительной прогностической ценностью по сравнению с отсутствием порога, и где концентрация белка Ang2, равная или ниже предварительно установленного порогового значения, является низкой концентрацией Ang2, а значение выше, чем предварительно установленное пороговое значение, является высокой концентрацией Ang2. Ответ опухоли представляет собой частоту объективных ответов (ORR), частоту клинической эффективности (CBR) или % максимального уменьшения размеров опухоли. В другом варианте осуществления предварительно установленное пороговое значение представляет собой концентрацию белка Ang2, которая определена на основе имитационных моделей или анализа процентиля, предсказывающих выживаемость, и где концентрация белка Ang2, равная или ниже предварительно установленного порогового значения, является низкой концентрацией Ang2, а значение выше, чем предварительно установленное пороговое значение, является высокой концентрацией Ang2. В этом контексте выживаемость представляет собой выживаемость без прогрессирования заболевания (PFS) или общую выживаемость (OS). В конкретном варианте осуществления предварительно установленное пороговое значение представляет собой концентрацию белка Ang2, которая находится в пределах от 3565 до 5650 (например, 3760 пг/мл), и где концентрация белка Ang2, равная или ниже предварительно установленного порогового значения, является низкой концентрацией Ang2, а значение выше, чем предварительно установленное пороговое значение, является высокой концентрацией Ang2.

[0021]

В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает в себя передачу результатов тестирования поставщику медицинских услуг субъекта. В определенных вариантах осуществления способ дополнительно включает в себя корректирование медицинской карты субъекта с указанием того, что субъект нуждается или не нуждается в комбинированной терапии, включающей ленватиниб или его фармацевтически приемлемую соль и эверолимус. В конкретных вариантах осуществления запись создают на машиночитаемом носителе. В определенных вариантах осуществления способ дополнительно включает в себя назначение комбинированной терапии, включающей ленватиниб или его фармацевтически приемлемую соль и эверолимус, субъекту, если согласно прогнозу на основании исходного профиля экспрессии Ang2 субъект нуждается в комбинированной терапии, включающей ленватиниб или его фармацевтически приемлемую соль. В определенных вариантах осуществления способ дополнительно включает в себя назначение терапии, не включающей ленватиниб или его фармацевтически приемлемую соль и эверолимус, субъекту, если согласно прогнозу на основании исходного профиля экспрессии Ang2 субъект не нуждается в комбинированной терапии, включающей ленватиниб или его фармацевтически приемлемую соль и эверолимус. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает в себя получение субъектом комбинированной терапии, включающей ленватиниб или его фармацевтически приемлемую соль и эверолимус, если согласно прогнозу на основании исходного профиля экспрессии Ang2 субъект нуждается в терапии, включающей ленватиниб или его фармацевтически приемлемую соль и эверолимус. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает в себя получение субъектом терапии, не включающей ленватиниб или его фармацевтически приемлемую соль и эверолимус, если согласно прогнозу на основании исходного профиля экспрессии Ang2 субъект не нуждается в комбинированной терапии, включающей ленватиниб или его фармацевтически приемлемую соль и эверолимус.

[0022]

В одном варианте осуществления концентрацию Ang2 измеряют иммунологическим способом. В некоторых вариантах осуществления иммунологический способ выбран из группы, состоящей из иммуноферментного анализа, радиоиммунологического анализа, хемилюминесцентного иммунологического анализа, электрохемилюминесцентного иммунологического анализа, латексного турбидиметрического иммунологического анализа, латексного фотометрического иммунологического анализа, иммунохроматографического анализа и вестерн-блоттинга. В другом варианте осуществления концентрацию Ang2 измеряют с помощью иммуноферментного анализа.

[0023]

В шестом аспекте настоящего раскрытия предложен ленватиниб или его фармацевтически приемлемая соль для сопутствующего использования с эверолимусом в лечении почечно-клеточного рака у субъекта-человека, где субъекта-человека идентифицируют с помощью способов, описанных выше, как субъекта, который нуждается в комбинированной терапии, включающей ленватиниб или его фармацевтически приемлемую соль и эверолимус. В некоторых вариантах осуществления фармацевтически приемлемая соль ленватиниба представляет собой ленватиниба мезилат. В одном варианте осуществления почечно-клеточной рак представляет собой распространенный или метастатический почечно-клеточный рак.

[0024]

В седьмом аспекте настоящего раскрытия предложено средство обнаружения белка Ang2 для применения в прогнозировании того, нуждается ли субъект-человек, который страдает от, у которого есть подозрение на или существует опасность развития почечно-клеточного рака, в комбинированной терапии, включающей ленватиниб или его фармацевтически приемлемую соль и эверолимус. В одном варианте осуществления средство обнаружения белка Ang2 представляет собой антитело к Ang2.

[0025]

Восьмой аспект настоящего раскрытия касается набора, в который входит средство обнаружения белка Ang2 для применения в прогнозировании того, нуждается ли субъект-человек, который страдает от, у которого есть подозрение на или существует опасность развития почечно-клеточного рака, в комбинированной терапии, состоящей из ленватиниба или его фармацевтически приемлемой соли и эверолимуса. В определенных вариантах осуществления средство обнаружения белка Ang2 представляет собой антитело к Ang2. В определенных вариантах осуществления антитело к Ang2 представляет собой моноклональное антитело. В других вариантах осуществления антитело к Ang2 представляет собой поликлональное антитело. В определенных вариантах осуществления антитело конъюгируют с поддающимся обнаружению средством. В одном варианте осуществления поддающееся обнаружению средство представляет собой пероксидазу хрена, биотин, флуоресцентный фрагмент, радиоактивный фрагмент, гистидиновую метку или пептидную метку. В одном варианте осуществления поддающееся обнаружению меченое антитело наносят на микропланшет. В определенных вариантах осуществления микропланшет представляет собой 96-луночный микропланшет. В определенных вариантах осуществления набор необязательно включает один или несколько стандартов концентрации, один или несколько буферов (например, промывочные буферы), один или несколько разбавителей (например, аналитические и/или калибровочные разбавители) и один или несколько реагентов, которые облегчают обнаружение того, связывается ли специфически средство обнаружения белка Ang2 с Ang2 в биологической пробе, взятой у субъекта (например, цветные реагенты, стоп-реагенты).

[0026]

Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют то же значение, которое обычно понимается специалистом с обычной квалификацией в данной области техники, к которой принадлежит данное изобретение. Хотя способы и материалы, подобные или эквивалентные описанным в данном документе, могут быть использованы в практике или тестировании настоящего изобретения, иллюстративные способы и материалы описаны ниже. Все публикации, заявки на патенты, патенты и другие ссылки, упомянутые в данном документе, включены с помощью ссылки во всей своей полноте. В случае конфликта настоящая заявка, включая определения, будет превалировать. Материалы, способы и примеры являются только иллюстративными и не предназначены для ограничения.

[0027]

Другие отличительные признаки и преимущества настоящего изобретения будут очевидны из следующего подробного описания и из формулы изобретения.

[Краткое описание графических материалов]

[0028]

[Фиг. 1]

Фиг. 1 представляет собой кривые общей выживаемости (OS) Каплана-Мейера в группах, где использовались комбинация и эверолимус. В каждой группе строили две кривые, на основании исходного уровня Ang2 (> 3760 пг/мл или ≦ 3760 пг/мл). Тонкая черная линия: группа с высоким Ang2 в исследовании с использованием эверолимуса, жирная черная линия: группа с высоким Ang2 в исследовании с использованием комбинации, тонкая серая линия: группа с низким Ang2 в исследовании с использованием эверолимуса, жирная серая линия: группа с низким Ang2 в исследовании с использованием комбинации.

[Фиг. 2]

Фиг. 2 представляет собой кривые выживаемости Каплана-Мейера без прогрессирования заболевания (PFS) в группах, где использовались комбинация и эверолимус. В каждой группе строили две кривые, на основании исходного уровня Ang2 (> 3760 пг/мл или ≦ 3760 пг/мл). Тонкая черная линия: группа с высоким Ang2 в исследовании с использованием эверолимуса, жирная черная линия: группа с высоким Ang2 в исследовании с использованием комбинации, тонкая серая линия: группа с низким Ang2 в исследовании с использованием эверолимуса, жирная серая линия: группа с низким Ang2 в исследовании с использованием комбинации.

[Описание вариантов осуществления]

[0029]

Это раскрытие обеспечивает способы и композиции для идентифицирования субъекта (такого как больной человек), страдающего почечно-клеточным раком, нуждающегося в комбинированной терапии, включающей ленватиниб или его фармацевтически приемлемую соль (например, ленватиниба мезилат) и эверолимус. В настоящем раскрытии предложен Ang2 в качестве прогностического биомаркера для идентифицирования тех субъектов, которые страдают от, у которых есть подозрение на или существует опасность развития почечно-клеточного рака (например, распространенного или метастатического почечно-клеточного рака), для которых рекомендовано получение комбинированной терапии, включающей ленватиниб или его фармацевтически приемлемую соль (например, ленватиниба мезилат) и эверолимус. Биомаркеры, композиции и способы, описанные в данном документе, пригодны при выборе подходящих терапевтических методов (например, комбинированной терапии, состоящей из ленватиниба или его фармацевтически приемлемой соли (например, ленватиниба мезилата) и эверолимуса, или альтернативной терапии почечно-клеточного рака) для субъектов, которые страдают от, у которых есть подозрение на или существует опасность развития почечно-клеточного рака. Кроме того, данная заявка предлагает способы отбора пациентов, которые страдают от, у которых есть подозрение на или существует опасность развития почечно-клеточного рака, для которых могут быть полезны комбинированная терапия, включающая ленватиниб или его фармацевтически приемлемую соль (например, ленватиниба мезилат) и эверолимус, а также способы лечения.

[0030]

Определения

Термин ʺсубъектʺ означает млекопитающее, включая, но без ограничения, человека, шимпанзе, орангутана, гориллу, бабуина, мартышку, мышь, крысу, свинью, лошадь, собаку и корову.

[0031]

Термин ʺсубъект-человек... нуждающийся в комбинированной терапииʺ означает субъекта-человека, для которого комбинированная терапия рекомендована в качестве предпочтительного лечения. Неограничительными примерами случаев, где комбинированная терапия рекомендована в качестве предпочтительного лечения являются: по прогнозу комбинированная терапия, включающая два определенных лекарственных средства, будет более эффективной, чем другая(ие) комбинированная(ые) терапия(ии), включающая(ие) два лекарственных средства, по меньшей мере одно из которых отличается от указанных двух определенных лекарственных средств; по прогнозу комбинированная терапия, включающая два определенных лекарственных средства, будет более эффективной, чем монотерапия одним из указанных двух лекарственных средств или каждым из них.

[0032]

Термин ʺкомбинированная терапияʺ означает терапию, при которой пациенту одновременно вводят два или более лекарственных средства. Два или более лекарственных средства можно вводить одновременно, практически одновременно или последовательно. В некоторых случаях два или более лекарственных средства можно составлять вместе (например, в одной таблетке или капсуле). В других случаях два или более лекарственных средства не составлены в один препарат (например, их вводят в отдельных таблетках или капсулах).

[0033]

Термин ʺленватинибʺ относится к 4-(3-хлор-4- (циклопропиламинокарбонил)аминофенокси)-7-метокси-6-хинолинкарбоксамиду. Это соединение раскрыто в Примере 368 (см. колонку 270) патента США № 7253286. Патент США № 7253286 включен ссылкой во всей своей полноте в данный документ. Термин ʺсоединение ленватинибаʺ относится к ʺленватинибу или его фармацевтически приемлемой солиʺ. Примером фармацевтически приемлемой соли ленватиниба является ленватиниба мезилат. Ленватиниба мезилат также упоминается как E7080. Ленватиниба мезилат был одобрен под названием LENVIMA^TM Управлением по контролю за продуктами и лекарствами США для лечения пациентов с диагнозом местного рецидивного или метастатического, прогрессирующего, невосприимчивого к радиоактивному йоду дифференцированного рака щитовидной железы.

[0034]

Термин ʺфармацевтически приемлемая сольʺ определенно не ограничен в отношении типа соли. Примеры таких солей включают, но без ограничения, соль присоединения неорганической кислоты, такую как соль соляной кислоты, соль серной кислоты, соль угольной кислоты, бикарбонатную соль, соль бромистоводородной кислоты и соль йодистоводородной кислоты; соль присоединения органической карбоксильной кислоты, такую как соль уксусной кислоты, соль малеиновой кислоты, соль молочной кислоты, соль винной кислоты и соль трифторуксусной кислоты; соль присоединения органической сульфокислоты, такую как соль метансульфоновой кислоты, соль гидроксиметансульфоновой кислоты, соль гидроксиэтансульфоновой кислоты, соль бензолсульфоновой кислоты, соль толуолсульфоновой кислоты и тауриновую соль; соль присоединения амина, такую как соль триметиламина, соль триэтиламина, соль пиридина, соль прокаина, соль пиколина, соль дициклогексиламина, соль N,N'-дибензилэтилендиамина, соль N-метилглюкамина, соль диэтаноламина, соль триэтаноламина, соль трис(гидроксиметиламино)метана и соль фенэтилбензиламина; и соль присоединения аминокислоты, такую как соль аргинина, соль лизина, соль серина, соль глицина, соль аспарагиновой кислоты и соль глутаминовой кислоты. В одном варианте осуществления фармацевтически приемлемая соль представляет собой соль метансульфоновой кислоты (ʺмезилатʺ). Форма соли метансульфоновой кислоты (т.е. мезилата) 4-(3-хлор-4-(циклопропиламинокарбонил)аминофенокси)-7-метокси-6- хинолинкарбоксамида раскрыта в патенте США № 7612208, который ссылкой включен в данный документ во всей своей полноте.

[0035]

Термин ʺэверолимусʺ относится к (1R,9S,12S,15R,16E,18R,19R,21R,23S,24E,26E,28E,30S,32S,35R)-1,18-дигидрокси-12-{(1R)-2-[(1S,3R,4R)-4-(2-гидроксиэтокси)-3-метоксициклогексил]-1-метилэтил}-19,30-диметокси-15,17,21,23,29,35-гексаметил-11,36-диокса-4-аза-трицикло[30.3.1.0^4,9]гексатриаконта-16,24,26,28-тетраен-2,3,10,14,20-пентаону. Это соединение раскрыто в патенте США № 5665772. Патент США № 5665772 включен ссылкой во всей своей полноте в данный документ. Эверолимус был одобрен под названием AFINITOR (зарегистрированная торговая марка) Управлением по контролю за продуктами и лекарствами США для лечения различных заболеваний, включая распространенный почечно-клеточный рак после безуспешного лечения сунитинибом или сорафенибом.

[0036]

Термин "белок" означает любую цепь аминокислот, соединенных пептидной связью, независимо от длины или пост-трансляционной модификации. Как правило, белок, описанный в данном документе, является ʺвыделеннымʺ, если его массовая доля составляет по меньшей мере 60% от общего белка в препарате, например, 60% от общего белка в пробе. В некоторых вариантах осуществления массовая доля белка, описанного в данном документе, составляет по меньшей мере 75%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 99% от общего белка в препарате.

[0037]

Термин ʺVEGF-прицельная терапияʺ означает любую терапию, включающую введение противоопухолевого средства, которое действует на рецептор(ы) фактора роста эндотелия сосудов (VEGF). Неограничивающими примерами противоопухолевых средств, применяемых в VEGF-прицельной терапии, являются: сунитиниб, сорафениб, пазопаниб, бевацизумаб, акситиниб, ваталаниб и тивозаниб.

[0038]

Термин ʺотвечает на терапию/чувствительный к терапииʺ означает, что субъект, который получил терапию, показывает положительный ответ на предоставленную терапию. Неограничивающими примерами такого положительного ответа являются: уменьшение размера опухоли, уменьшение метастазирования опухоли или увеличенный период выживаемости после лечения.

[0039]

Термин ʺисходный уровеньʺ белка в пробе, взятой у субъекта, означает концентрацию белка в пробе перед получением субъектом комбинированной терапии, включающей эверолимус и ленватиниб или его фармацевтически приемлемую соль.

[0040]

Ангиопоэтин-2

Ангиопоэтины представляют собой белковые факторы роста, которые способствуют ангиогенезу (формированию кровеносных сосудов из уже существующих кровеносных сосудов) и созреванию кровеносных сосудов опухоли. Исследования на нокаутных мышах показали, что ангиопоэтин 2 (Ang2) необходим для формирования зрелых кровеносных сосудов. Экспрессия Ang2 в эндотелиальных клетках является достаточной для привлечения миелоидных клеток и индукции воспаления даже в отсутствие предшествующих провоспалительных стимулов.

[0041]

ID гена, соответствующий указатель URL, ID белка и инвентарный номер в UniProtKB ангиопоэтина-2 (Ang2) приведены ниже:

Официальное обозначение гена: Ang2

ID гена: 285

URL: www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/285

Другие соответствующие ему обозначения: Ang-2, ANG-2, ANG2, Ang2 (90), Ang290, ANGPT2

Инвентарный номер в UniProtKB: O15123

[0042]

Исходный уровень Ang2 (например, экспрессии белка или иРНК) выше контрольного указывает на/предсказывает то, что субъект нуждается в комбинированной терапии, включающей ленватиниб (например, ленватиниба мезилат) и эверолимус. Например, по высоким концентрациям (по сравнению с контрольной) исходного белка Ang2 в биологической пробе, взятой субъекта до лечения терапией, прогнозируют то, что субъект нуждается в комбинированной терапии, включающей соединение ленватиниба (например, ленватиниба мезилат) и эверолимус.

[0043]

В определенных вариантах осуществления принимается, что субъект отвечает на комбинированную терапию, включающую соединение ленватиниба (например, ленватиниба мезилат) и эверолимус, если у субъекта наблюдается частичный ответ после лечения данной терапией. ʺЧастичный ответʺ означает по меньшей мере 30% уменьшение суммы наибольшего диаметра (LD) целевых поражений, принимая в качестве эталона исходный суммированный LD. В некоторых вариантах осуществления принимается, что субъект отвечает на комбинированную терапию, включающую соединение ленватиниба и эверолимус, если у субъекта наблюдается уменьшение размеров опухоли после лечения данной терапией. ʺ% максимального уменьшения размеров опухолиʺ (MTS) означает процент изменения суммы диаметров целевых поражений, принимая в качестве эталона исходную сумму диаметров. В других вариантах осуществления принимается, что субъект отвечает на комбинированную терапию, включающую соединение ленватиниба и эверолимус, если у субъекта наблюдается общая выживаемость. ʺОбщая выживаемостьʺ (OS) относится ко времени от рандомизации до смерти по любой причине. ʺРандомизацияʺ означает случайный отбор пациента в тестируемую группу или контрольную группу при определении плана лечения для пациента. В некоторых вариантах осуществления принимается, что субъект отвечает на комбинированную терапию, включающую соединение ленватиниба и эверолимус, если у субъекта наблюдается как общая выживаемость, так и уменьшение размеров опухоли. В других вариантах осуществления принимается, что субъект отвечает на комбинированную терапию, включающую соединение ленватиниба и эверолимус, если у субъекта наблюдается выживаемость без прогрессирования заболевания. ʺВыживаемость без прогрессирования заболеванияʺ (PFS) относится ко времени от даты рандомизации до даты первого документированного свидетельства прогрессирования заболевания или смерти, в зависимости от того, что произойдет раньше. В некоторых вариантах осуществления принимается, что субъект отвечает на комбинированную терапию, включающую соединение ленватиниба и эверолимус, если у субъекта наблюдается как выживаемость без прогрессирования заболевания, так и уменьшение размеров опухоли.

[0044]

В данном раскрытии предложены способы идентифицирования субъекта, страдающего почечно-клеточным раком, который будет иметь больше шансов на выживание (например, общее выживание (OS)) после комбинированной терапии, включающей соединение ленватиниба (например, ленватиниба мезилат) и эверолимус, по сравнению с монотерапией, включающей один эверолимус. В данном способе биологическую пробу субъекта, полученную до лечения комбинированной терапией, включающей соединение ленватиниба и эверолимус, количественно оценивают и измеряют уровень белка Ang2. Высокая исходная концентрация белка Ang2 по сравнению с контролем указывает на то, что субъект будет иметь больше шансов на выживание (например, OS) после комбинированной терапии, включающей соединение ленватиниба и эверолимус, по сравнению с монотерапией, включающей один эверолимус.

[0045]

В некоторых вариантах осуществления соединение ленватиниба (например, ленватиниба мезилат) можно вводить субъекту по настоящему изобретению перорально один раз в день в дозировке 12, 18 или 24 мг (каждая в пересчете на свободное основание ленватиниба).

[0046]

В некоторых вариантах осуществления эверолимус можно вводить субъекту по настоящему изобретению перорально один раз в день в дозировке 5 или 10 мг.

[0047]

Концентрацию Ang2 можно измерить с помощью любого способа, известного в данной области техники, такого как иммунологический анализ. Неограничивающие примеры таких способов включают иммуноферментный анализ, радиоиммунологический анализ, хемилюминесцентный иммунологический анализ, электрохемилюминесцентный иммунологический анализ, латексный турбидиметрический иммунологический анализ, латексный фотометрический иммунологический анализ, иммунохроматографический анализ и вестерн-блоттинг. В определенных вариантах осуществления концентрацию Ang2 измеряют с помощью иммуноферментного анализа.

[0048]

Контроли

Как описано выше, способы настоящего изобретения могут включать измерение исходного уровня Ang2 в биологической пробе, взятой у субъекта, который страдает от, у которого есть подозрение на или существует опасность развития почечно-клеточного рака, где по уровню экспрессии Ang2 по сравнению с контрольным можно определить, что субъект вероятно нуждается в (или для которого может быть полезна) комбинированная терапия, включающая соединение ленватиниба (например, ленватиниба мезилат) и эверолимус. В определенных вариантах осуществления, когда концентрация исходного Ang2 в биологической пробе, взятой у субъекта, который страдает от, у которого есть подозрение на или существует опасность развития почечно-клеточного рака, выше контрольной, субъекта идентифицируют как нуждающегося в комбинированной терапии, включающей соединение ленватиниба и эверолимус. В данном контексте термин ʺконтрольʺ включает в себя пробу (например, из той же ткани), взятую у субъекта, о котором известно, что он не нуждается в комбинированной терапии, включающей соединение ленватиниба (например, ленватиниба мезилат) и эверолимус. Под определение такого субъекта, который не нуждается в комбинированной терапии, включающей соединение ленватиниба (например, ленватиниба мезилат) и эверолимус, может подходить субъект, прогноз для которого указывает на то, что он будет отвечать на комбинированную терапию, но такой ответ на комбинированную терапию не будет существенно лучше, чем прогнозируемый ответ на монотерапию эверолимусом. Термин ʺконтрольʺ также включает в себя пробу (например, из той же ткани), взятую в прошлом у субъекта, о котором известно, что он не нуждается в комбинированной терапии, включающей соединение ленватиниба и эверолимус, и используемую в качестве эталона для будущих сравнений с тестируемыми пробами, взятыми у субъектов, для которых должна быть спрогнозирована потребность в комбинированной терапии.

[0049]

В некоторых вариантах осуществления вместо термина ʺконтрольʺ может быть использован термин ʺположительный контрольʺ. ʺПоложительную контрольнуюʺ концентрацию для Ang2 в определенном типе клеток или тканей можно в альтернативном случае предварительно устанавливать путем анализа одного или нескольких субъектов, которые были идентифицированы как нуждающиеся в комбинированной терапии, включающей соединение ленватиниба (например, ленватиниба мезилат) и эверолимус. Это предварительно установленное эталонное значение (которое может быть средним или медианой уровня экспрессии, взятого у множества субъектов, которые были идентифицированы как нуждающиеся в комбинированной терапии) можно затем использовать в качестве ʺположительного контрольногоʺ уровня экспрессии при сравнении с тестируемой пробой. При таком сравнении прогнозируют, что субъект нуждается в комбинированной терапии, включающей соединение ленватиниба (например, ленватиниба мезилат) и эверолимус, если концентрация анализируемого Ang2 является такой же или сопоставимой (по меньшей мере 85%, но менее чем 100%) с предварительно установленным положительным контрольным эталоном.

[0050]

В определенных вариантах осуществления ʺконтрольʺ представляет собой предварительно установленное пороговое значение.

[0051]

Пороговые значения

В некоторых вариантах осуществления описанные в данном документе способы включают определение того, находится ли концентрация Ang2 выше или ниже заранее определенного порогового значения.

[0052]

В соответствии со способами и композициями, описанными в данном документе, эталонную концентрацию исходного Ang2 принимают за пороговое значение, по значению выше или ниже которого прогнозируют потребность в комбинированной терапии, включающей соединение ленватиниба (например, ленватиниба мезилат) и эверолимус. Некоторые пороговые значения не являются абсолютными в том смысле, что клинические корреляции еще могут оставаться значимыми в диапазоне значений по обе стороны от порога; однако, можно выбрать оптимальное пороговое значение (например, изменяя H-баллы) концентрации Ang2 для конкретного типа пробы. Пороговые значения, определенные для применения в способах, описанных в данном документе, можно сравнить, например, с опубликованными диапазонами концентраций, но можно индивидуализировать для используемой методологии и популяции пациентов. Понятно, что можно усовершенствовать оптимальные пороговые значения в зависимости от сложности используемых статистических методов и от числа и источника проб, используемых для определения значений эталонного уровня для различных типов проб. Таким образом, установленные пороговые значения можно отрегулировать вверх или вниз на основании периодических переоценок или изменений в методологии или распределении популяции.

[0053]

Эталонную концентрацию Ang2 можно определить многими способами. Эталонный уровень можно определить путем сравнения концентрации представляющего интерес Ang2 в, например, популяциях субъектов (например, пациентов), которые нуждаются в комбинированной терапии, включающей соединение ленватиниба (например, ленватиниба мезилат) и эверолимус, или не нуждаются в комбинированной терапии, включающей соединение ленватиниба и эверолимус. Это можно выполнить, например, путем анализа гистограммы, в которой вся когорта пациентов представлена графически, где первая ось представляет собой концентрацию Ang2, а вторая ось представляет собой число субъектов в когорте, чья проба содержит одну или несколько концентраций. Определение эталонной концентрации Ang2 можно выполнить на основе количества или концентрации, которая наилучшим образом характеризует эти отдельные группы. Эталонный уровень может быть одним числом, в равной степени применимым к каждому субъекту, или эталонный уровень может меняться в зависимости от конкретных субпопуляций субъектов. Например, более пожилые субъекты могут иметь другой эталонный уровень, чем более молодые субъекты, для одной и той же формы рака. Кроме того, субъект с заболеванием на более поздней стадии (например, с распространенной или метастатической формой почечно-клеточного рака) может иметь другое эталонное значение, чем субъект с более легкой формой заболевания.

[0054]

Предварительно установленное пороговое значение может быть концентрацией белка, которую определили на основе анализа характеристических кривых обнаружения (ROC). ROC-кривые используют для определения порогового значения при клиническом тестировании. Рассмотрим ситуацию, когда есть две группы пациентов и с помощью утвержденной стандартной методики установлено, что одна группа нуждается в комбинированной терапии, включающей соединение ленватиниба и эверолимус, а о другой известно, что она не нуждается в комбинированной терапии, включающей соединение ленватиниба и эверолимус. Измерение с использованием биологической пробы от всех членов обеих групп используют для тестирования на потребность в комбинированной терапии, включающей соединение ленватиниба и эверолимус. Тестирование выявит некоторых, но не всех субъектов, нуждающихся в комбинированной терапии, включающей соединение ленватиниба и эверолимус. Отношение нуждающихся в комбинированной терапии субъектов, обнаруженных при тестировании, к общему числу нуждающихся в комбинированной терапии субъектов (установленному с помощью утвержденной стандартной методики), представляет собой долю истинно положительных (также известную как чувствительность). Тестирование выявит некоторых, но не всех субъектов, не нуждающихся в комбинированной терапии, включающей соединение ленватиниба и эверолимус. Отношение не нуждающихся в комбинированной терапии субъектов, обнаруженных при тестировании, к общему числу не нуждающихся в комбинированной терапии субъектов (установленному с помощью утвержденной стандартной методики), представляет собой долю истинно отрицательных (также известную как специфичность). Есть надежда, что анализ ROC-кривых описанного выше теста обнаружит пороговое значение, которое сведет к минимуму количество ложно положительных и ложно отрицательных результатов. ROC представляет собой графическое изображение, иллюстрирующее эффективность системы стратифицирования двоичной классификацией по мере изменения ее порога чувствительности. Его строят, откладывая долю истинно положительных из положительных против доли ложно положительных из отрицательных при различных пороговых условиях.

[0055]

В одном варианте осуществления концентрацию Ang2 определяют на основании ROC-анализа, прогнозируя ответ опухоли с положительной прогностической ценностью, где концентрация Ang2, равная или ниже предварительно установленного порогового значения, является низкой концентрацией Ang2, а значение выше, чем предварительно установленное пороговое значение, является высокой концентрацией Ang2. Положительная прогностическая ценность представляет собой долю положительных результатов теста, которые являются истинно положительными; она отражает вероятность того, что положительные результаты теста отражают основное состояние, на наличие которого проводится тестирование. Способы построения ROC-кривых и определения положительной прогностической ценности хорошо известны в данной области техники. В определенных вариантах осуществления ответ опухоли представляет собой частоту объективных ответов (ORR), частоту клинической эффективности (CBR) или % максимального уменьшения размеров опухоли.

[0056]

В другом варианте осуществления предварительно установленное пороговое значение может представлять собой концентрацию Ang2, которая определена на основе имитационных моделей прогнозирования выживаемости, где концентрация Ang2, равная или ниже предварительно установленного порогового значения, является низкой концентрацией Ang2, и значение выше, чем предварительно установленное пороговое значение, является высокой концентрацией Ang2. В некоторых вариантах осуществления выживаемость представляет собой выживаемость без прогрессирования заболевания (PFS). В других вариантах осуществления выживаемость представляет собой общую выживаемость (OS).

[0057]

В определенных вариантах осуществления предварительно установленное пороговое значение для белка Ang2 находится в диапазоне концентраций от 3565 до 5650 пг/мл. В конкретном варианте осуществления предварительно установленное пороговое значение для белка Ang2 составляет примерно 3760 пг/мл. Во всех этих вариантах осуществления концентрация белка Ang2, равная или ниже предварительно установленного порогового значения, является низкой концентрацией Ang2 и значение выше, чем предварительно установленное пороговое значение, является высокой концентрацией Ang2. В данном контексте ʺпримерноʺ означает ±10%.

[0058]

Биологические пробы

Подходящие биологические пробы для способов, описанных в данном документе, включают любую биологическую жидкость, клетки, ткани или их фракции, которые содержат белок Ang2. Биологическая проба может быть, например, образцом, взятым у субъекта (например, млекопитающего, такого как человек) или может происходить от такого субъекта. Например, проба может быть срезом ткани, полученным путем биопсии, архивной опухолевой тканью или клетками, которые помещены в или адаптированы к культуре ткани. Биологическая проба может также быть биологической жидкостью, такой как кровь, плазма, сыворотка, или такой пробой, которая абсорбирована на субстрат (например, стекло, полимер, бумага). Биологическая проба может также включать пробу ткани почечно-клеточной раковой опухоли. В конкретных вариантах осуществления биологическая проба представляет собой опухолевую клетку (клетки) или опухолевую ткань, взятую из области субъекта, предположительно содержащей опухоль или предраковое поражение. Например, биологическая проба может представлять собой пробу почечно-клеточной раковой опухоли. Биологическую пробу можно дополнительно разделять на фракции, если необходимо, до фракции, содержащей определенные типы клеток. Например, пробу крови можно разделять на сыворотку или на фракции, содержащие определенные типы клеток крови, такие как красные кровяные тельца или белые кровяные тельца (лейкоциты). При желании проба может быть комбинацией проб, взятых у субъекта, такой как комбинация проб ткани и жидкости.

[0059]

Биологические пробы можно взять у субъекта, который страдает от, у которого есть подозрение на или существует опасность развития почечно-клеточного рака. В определенных вариантах осуществления у субъекта выявлен распространенный или метастатический почечно-клеточный рак. В некоторых вариантах осуществления субъект имеет рецидивирующий почечно-клеточный рак. В других вариантах осуществления у субъекта выявлен неоперабельный распространенный или метастатический почечно-клеточный рак. В других вариантах осуществления у субъекта выявлен почечно-клеточный III стадии. В определенных вариантах осуществления у субъекта выявлен почечно-клеточный рак IV стадии.

[0060]

Можно использовать любые подходящие способы получения биологических проб, хотя типичные способы включают в себя, например, флеботомию, процедуру тонкоигольной аспирационной биопсии. Пробы можно таже брать, например, с помощью микрургии (например, лазерной захватывающей микрургии (LCM) или лазерной микрургии (LMD)).

[0061]

Способы взятия и/или хранения проб, при которых сохраняются активность или целостность молекул (например, нуклеиновых кислот или белков) в пробе, хорошо известны специалистам в данной области техники. Например, биологическую пробу можно дополнительно приводить в контакт с одним или несколькими дополнительными средствами, такими как буферы и/или ингибиторы, включая один или несколько из ингибиторов нуклеаз, протеаз и фосфатаз, которые предохраняют от или сводят к минимуму изменения в молекулах (например, нуклеиновых кислотах или белках) в пробе. Такие ингибиторы включают, например, хелаторы, такие как этилендиаминтетрауксусную кислоту (EDTA), этиленгликоль-бис(P-аминоэтиловый эфир) N,N,N1,N1-тетрауксусной кислоты (EGTA), ингибиторы протеаз, такие как фенилметилсульфонилфторид (PMSF), апротинин, лейпептин, антипаин и тому подобные, и ингибиторы фосфатаз, такие как фосфат, фторид натрия, ванадат и тому подобные. Подходящие буферы и условия для выделения молекул хорошо известны специалистам в данной области техники и могут меняться в зависимости от, например, типа молекулы в пробе, которую необходимо охарактеризовать (см., например, Ausubel et al. Current Protocols in Molecular Biology (Supplement 47), John Wiley & Sons, New York (1999); Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press (1988); Harlow and Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1999); Tietz Textbook of Clinical Chemistry, 3rd ed. Burtis and Ashwood, eds. W.B. Saunders, Philadelphia, (1999)). Пробу можно также обработать для удаления или сведения к минимуму наличия мешающих веществ. Например, биологическую пробу можно фракционировать или очищать с удалением одного или нескольких материалов, которые не представляют интерес. Способы фракционирования или очистки биологической пробы включают, но без ограничения, хроматографические способы, такие как жидкостная хроматография, ионообменная хроматография, эксклюзионная хроматография или аффинная хроматография. Для применения в способах, описанных в данном документе, проба может находиться в различных физических состояниях. Например, проба может быть жидкой или твердой, может быть растворена или суспендирована в жидкости, может быть в эмульсии или геле, или может быть абсорбирована на материале.

[0062]

Определение уровней экспрессии/концентраций биомаркеров

Генную экспрессию можно определить, например, как экспрессию белка или РНК целевого гена. То есть присутствие или уровень экспрессии (количество) гена можно определить путем обнаружения и/или измерения уровня экспрессии иРНК или белка данного гена. В некоторых вариантах осуществления экспрессию Ang2 можно определять по активности Ang2, кодируемого геном Ang2.

[0063]

В одном варианте осуществления экспрессию Ang2 можно определить путем обнаружения и/или измерения уровня экспрессии или концентрации Ang2, кодируемого геном Ang2. Способы определения экспрессии/концентрации белка хорошо известны в данной области техники. Обычно используемый способ включает применение антител, специфических для представляющего интерес целевого белка. Например, способы определения экспрессии белка включают, но без ограничения, анализ вестерн блот или дот-блот, иммуногистохимию (например, количественную иммуногистохимию), иммуноцитохимию, твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA), анализ иммуносорбентных пятен с иммобилизованными ферментами (ELISPOT; Coligan J. E., et al., eds. (1995) Current Protocols in Immunology. Wiley, New York), радиоиммунологический анализ, хемилюминесцентный иммунологический анализ, электрохемилюминесцентный иммунологический анализ, латексный турбидиметрический иммунологический анализ, латексный фотометрический иммунологический анализ, иммунохроматографический анализ и анализ микроматрицы антител (см., например, публикации патентов США №№ 20030013208 и 2004171068, раскрытия каждого из которых ссылкой включены в данный документ во всей полноте). Дополнительное описание многих из способов, указанных выше, и дополнительные способы обнаружения экспрессии белков можно найти, например, в Sambrook et al. (выше).

[0064]

В одном примере присутствие или величину экспрессии Ang2 можно определить с помощью методики вестерн блоттинга. Например, лизат, который можно получить из биологической пробы, или биологическую пробу саму по себе, можно привести в контакт с буфером Лэммли и подвергнуть гель-электрофорезу в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE). SDS-PAGE-разделенные белки, разделенные по размеру, можно затем перенести на фильтровальную мембрану (например, из нитроцеллюлозы) и подвергнуть методам иммуноблоттинга с использованием поддающегося обнаружению меченого антитела, специфичного к Ang2. Присутствие или количество связанного поддающегося обнаружению меченого антитела указывает на присутствие или количество белка в биологической пробе.

[0065]

В другом примере иммунологический анализ можно использовать для обнаружения и/или измерения экспрессии белка Ang2. Как указано выше, для целей обнаружения иммунологический анализ можно выполнить с антителом, которое несет фрагмент для обнаружения (например, флуоресцентное средство или фермент). Белки из биологической пробы можно конъюгировать непосредственно с твердофазной матрицей (например, многолуночным аналитическим планшетом, нитроцеллюлозой, агарозой, сефарозой, закодированными частицами или магнитными гранулами), или их можно конъюгировать с первым членом специфически связывающей пары (например, биотином или стрептавидином), который прикрепляется к твердофазной матрице при связывании со вторым членом специфически связывающей пары (например, стрептавидином или биотином). Такое прикрепление к твердофазной матрице позволяет очистить белки от других мешающих или посторонних компонентов биологической пробы перед контактом с обнаруживающим антителом, а также позволяет в последующем отмыть несвязанное антитело. Здесь, как и выше, присутствие или количество связанного поддающегося обнаружению меченого антитела указывает на присутствие или количество белка в биологической пробе.

[0066]

Нет никаких специфических ограничений в отношении формы антитела и настоящее раскрытие включает в себя поликлональные антитела, а также моноклональные антитела. Антисыворотка, полученная путем иммунизации животных, таких как кролики, Ang2 или его фрагментом, а также поликлональные и моноклональные антитела всех классов, человеческие антитела и гуманизированные антитела, полученные посредством генетической рекомбинации, также включены.

[0067]

Интактный белок или его частичный пептид можно использовать в качестве антигена для иммунизации. В качестве частичных пептидов белков могут быть предоставлены, например, амино (N)-концевой фрагмент белка и карбокси (C)-концевой фрагмент.

[0068]

Ген, кодирующий Ang2 или его фрагмент (например, иммунологический фрагмент), вставляют в известный вектор экспрессии и путем трансформации клеток-хозяев вектором, описанным в данном документе, нужный белок или его фрагмент извлекают с внешней поверхности или изнутри клетки-хозяина с использованием стандартных способов. Этот белок можно использовать в качестве сенсибилизирующего антигена. Кроме того, клетки, экспрессирующие белок, клеточные лизаты или химически синтезированный белок по настоящему изобретению также можно использовать в качестве сенсибилизирующего антигена.

[0069]

Выбор млекопитающих, которых иммунизируют сенсибилизирующим антигеном, не ограничен; однако предпочтительно выбирать животных, рассматривая совместимость с родительскими клетками, используемыми при слиянии клеток. Как правило, используют животных, принадлежащих к отрядам Rodentia, Lagomorpha или приматов. Примеры животных, относящихся к отряду Rodentia, которых можно использовать, включают, например, мышей, крыс и хомячков. Примеры животных, относящихся к отряду Lagomorpha, которых можно использовать, включают, например, кроликов. Примеры животных, относящихся к отряду приматов, которых можно использовать, включают, например, обезьян. Примеры обезьян для использования включают парвотряд Сatarrhini (обезьяны Старого Света), например, Macaca fascicularis, макаки резус, гамадрилы и шимпанзе.

[0070]

Кроме того, антитело по настоящему раскрытию может быть фрагментом антитела или модифицированным антителом при условии, что оно связывается с Ang2. Например, Fab, F (ab') 2, Fv или одноцепочечный Fv (scFv), в котором Fv H-цепи и Fv L-цепи соответствующим образом связаны линкером (Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:5879-5883, (1988)), можно предоставить в качестве фрагментов антитела.

[0071]

Антитела можно конъюгировать с различными молекулами, такими как флуоресцентные вещества, радиоактивные вещества и люминесцентные вещества. Способы присоединения таких фрагментов к антителу уже разработаны и являются общепринятыми в данной области (см., например, патенты США № 5057313 и № 5156840).

[0072]

Примеры способов, которыми анализируют антиген-связывающую активность антител, включают, например, измерение оптической плотности, твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA), иммуноферментный анализ (EIA), радиоиммунологический анализ (RIA) и/или иммунофлуоресценцию. Например, при использовании ELISA белок, кодируемый биомаркером по настоящему изобретению, вносят на планшет, покрытый антителами по настоящему раскрытию, и затем добавляют образец антител, например, культуральные супернатанты клеток, продуцирующих антитела, или очищенные антитела. Затем добавляют вторичное антитело, распознающее первичное антитело, которое помечено щелочной фосфатазой и подобными ферментами, планшет инкубируют и промывают и измеряют оптическую плотность для оценки антиген-связывающей активности после добавления субстрата фермента, такого как п-нитрофенилфосфат. В качестве белка можно использовать фрагмент белка, например, фрагмент, содержащий С-конец, или фрагмент, содержащий N-конец. Для оценки активности антитела по настоящему изобретению можно использовать BIAcore (GE Healthcare).

[0073]

При использовании этих способов приводят в контакт антитело по настоящему изобретению и пробу, предположительно содержащую Ang2, и Ang2 выявляют или количественно анализируют путем обнаружения или количественного анализа иммунного комплекса, образованного между вышеупомянутым антителом и белком.

[0074]

Способы количественного анализа на основе масс-спектрометрии, например, но без ограничения, подходы на основе мониторинга множественных реакций (MRM) в комбинации с внутренними стандартами, мечеными стабильными изотопами, являются альтернативой иммунологическим анализам для количественного определения белков. Эти подходы не требуют применения антител и поэтому анализ можно выполнять, экономя средства и время, более эффективным образом (см., например, Addona et al., Nat. Biotechnol., 27:633-641, 2009; Kuzyk et al., Mol. Cell Proteomics, 8:1860-1877, 2009; Paulovich et al., Proteomics Clin. Appl., 2:1386-1402, 2008). Кроме того, MRM предлагает превосходные возможности мультиплексирования, позволяя одновременное параллельное количественное определение многочисленных белков. Основная теория этих способов была хорошо обоснована и широко использована в применении к метаболизму лекарственных средств и фармакокинетическому анализу малых молекул.

[0075]

Создание профиля ответа

Способы, описанные в данном документе, также можно применять для создания профиля ответа для субъекта с диагнозом почечно-клеточного рака в отношении комбинированной терапии, включающей соединение ленватиниба (например, ленватиниба мезилат) и эверолимус. Профиль может включать, например, информацию об исходном уровне экспрессии Ang2 до начала лечения ленватинибом или его фармацевтически приемлемой солью; и/или гистологичский анализ любой почечно-клеточной раковой опухоли. Полученную информацию (профиль ответа на терапию ленватинибом) можно использовать для прогнозирования того, нуждается ли субъект (например, больной человек), который страдает от, у которого есть подозрение на или существует опасность развития почечно-клеточного рака, в комбинированной терапии, включающей соединение ленватиниба (например, ленватиниба мезилат) и эверолимус.

[0076]

Понятно, что профиль ответа на соединение ленватиниба (например, ленватиниба мезилат) может быть записан в электронной форме (например, электронная запись пациента, сохраненная на компьютере или другом электронном (машиночитаемом) носителе, таком как DVD, CD или дискета) или в письменной форме. Профиль ответа на соединение ленватиниба (например, ленватиниба мезилат) может также включать информацию для нескольких (например, двух, трех, четырех, пяти, 10, 20, 30, 50 или 100 или более) субъектов (например, больных людей). Такие мульти-субъектные профили ответа можно использовать, например, в анализе (например, статистическом анализе) специфических характеристик когорт субъектов.

[0077]

Чувствительность субъекта к комбинированной терапии, включающей ленватиниб или его фармацевтически приемлемую соль (например, ленватиниба мезилат) и эверолимус, можно классифицировать несколькими способами и классификация зависит от заболевания субъекта, тяжести заболевания и специфического лекарства, которое вводят субъекту. В простейшем смысле чувствительность представляет собой любую регрессию в течении заболевания по сравнению с состоянием до лечения, и нечувствительность представляет собой отсутствие любых изменений в течении заболевания по сравнению с состоянием до лечения. Чувствительность субъекта (например, человека), страдающего почечно-клеточным раком, можно классифицировать на основании одного или нескольких из числа объективных клинических признаков, таких как, но без ограничения, размер опухоли, клиническая эффективность (CB), выживаемость без прогрессирования заболевания (PFS), общая выживаемость (OS), % максимального уменьшения размеров опухоли (MTS) или частота объективных ответов (ORR).

[0078]

ʺКлиническая эффективностьʺ относится к наличию одного из следующих состояний -полный ответ (CR), частичный ответ (PR) или стабильное заболевание (SD) с 6 месяцами или более выживаемости без прогрессирования заболевания (PFS). ʺПолный ответʺ означает полное исчезновение всех целевых поражений. ʺЧастичный ответʺ означает по меньшей мере 30% уменьшение суммы наибольшего диаметра (LD) целевых поражений, принимая в качестве эталона исходный суммированный LD. ʺПрогрессирующее заболеваниеʺ (PD) означает по меньшей мере 20% увеличение суммы LD целевых поражений, принимая в качестве эталона наименьший суммированный LD, задокументированный с момента начала лечения, или появление одного или нескольких новых поражений. ʺСтабильное заболеваниеʺ означает как недостаточное уменьшение размеров целевых поражений для определения PR, так и недостаточное увеличение для определения прогрессирующего заболевания (PD), принимая в качестве эталона наименьший суммированный LD с момента начала лечения.

[0079]

ʺОбщую выживаемостьʺ (OS) определяют как время с момента рандомизации до смерти по любой причине. ʺРандомизацияʺ означает случайный отбор пациента в тестируемую группу или контрольную группу при определении плана лечения для пациента.

[0080]

ʺВыживаемость без прогрессирования заболеванияʺ (PFS) относится ко времени от даты рандомизации до даты первого документированного свидетельства прогрессирования заболевания или смерти, в зависимости от того, что произойдет раньше.

[0081]

ʺ% максимального уменьшения размеров опухолиʺ (MTS) означает процент изменения суммы диаметров целевых поражений, принимая в качестве эталона исходную сумму диаметров.

[0082]

ʺЧастота объективных ответовʺ (ORR) сравнивает субъектов с полным ответом (CR) или частичным ответом (PR) с субъектами со стабильным заболеванием (SD) или прогрессирующим заболеванием (PD).

[0083]

Наборы

В данной заявке также предложены наборы. В определенных вариантах осуществления набор может включать в себя антитело или антитела, которые можно использовать для обнаружения Ang2 или его концентрации или уровней экспрессии. Антитела в наборе могут быть моноклональными или поликлональными и могут быть дополнительно конъюгированы с поддающейся обнаружению меткой. Набор может факультативно содержать инструкции для обнаружения и/или измерения концентрации Ang2 в биологической пробе.

[0084]

Наборы могут необязательно включать в себя, например, контрольный образец (например, эталон концентраций для белка Ang2). В некоторых случаях, контрольный образец может быть вкладышем (например, бумажным вкладышем или электронным носителем, таким как CD, DVD или дискета), содержащим уровень экспрессии или диапазоны уровня экспрессии Ang2, по которым можно прогнозировать необходимость в комбинированной терапии, включающей соединение ленватиниба (например, ленватиниба мезилат) и эверолимус.

[0085]

В некоторых вариантах осуществления наборы могут включать в себя один или несколько реагентов для обработки биологической пробы (например, калибровочные реагенты, буферы, растворители, цветные реагенты, реагенты для остановки реакции). Например, набор может включать в себя реагенты для выделения белка из биологической пробы и/или реагенты для обнаружения присутствия и/или количества Ang2 в биологической пробе (например, антитело, которое связывается с Ang2, и/или антитело, которое связывается с антителом, связывающимся с Ang2).

[0086]

В определенных вариантах осуществления набор включает в себя по меньшей мере один микропланшет (например, 96-луночный планшет, т.е. 12 полосок по 8 лунок). Микропланшет может быть предоставлен с соответствующей ему крышкой планшета. Микропланшет может быть выполнен из полистирола или из любого другого подходящего материала. На микропланшете может быть антитело, которое используют для идентификации присутствия Ang2, нанесенное на внутреннюю поверхность каждой лунки. Антитело может быть конъюгировано с поддающейся обнаружению меткой. Набор может также включать по меньшей мере одну липкую ленту.

[0087]

В некоторых вариантах осуществления наборы могут включать пакет компьютерных программ для анализа результатов, например, профиля экспрессии или анализа микроматриц.

[0088]

Описываемые здесь наборы могут, необязательно, также включать инструкции по проведению комбинированной терапии, включающей соединение ленватиниба и эверолимус, где по концентрации Ang2 судят о том, нуждается ли субъект, который страдает от, у которого есть подозрение на или существует опасность развития почечно-клеточного рака, в комбинированной терапии, включающей соединение ленватиниба (например, ленватиниба мезилат) и эверолимус.

[Примеры]

[0089]

Пример 1: Биомаркер для идентифицирования подгруппы пациентов с диагнозом почечно-клеточного рака, нуждающихся в комбинированной терапии ленватинибом и эверолимусом.

[0090]

Цель: Исследование ленватиниба Фазы II выполняли на пациентах с диагнозом метастатического почечно-клеточного рака (RCC), прошедших VEGF-прицельную терапию. Важность ангиогенеза при RCC подчеркивает необходимость понимания клинических механизмов ухода от антиангиогенной терапии, такой как терапия эверолимусом. Этот клинический анализ биомаркера проводили для выявления прогностических маркеров клинической эффективности у пациентов с RCC при лечении комбинированной терапией с использованием ленватиниба и эверолимуса по сравнению с монотерапией эверолимусом.

Целью данного анализа было измерение уровня Ang2 в пробах крови, таких как сыворотка, взятых у пациентов в клинических испытаниях как до, так и после лечения ленватинибом, эверолимусом или их комбинацией, и для выявления биомаркеров в крови, которые можно использовать для прогнозирования того, будут ли пациенты нуждаться в комбинированной терапии.

[0091]

Материалы и способы: Пациенты с диагнозом метастатического почечно-клеточного рака (RCC), уже прошедшие VEGF-прицельную терапию, получали ленватиниба мезилат (ʺленватинибʺ), эверолимус или их комбинацию до прогрессирования заболевания или развития неконтролируемого токсикоза. Пациенты получали ленватиниб в дозе 24 мг (в пересчете на свободное основание ленватиниба; тот же принцип применяется и далее) перорально один раз в день, эверолимус в дозе 10 мг перорально один раз в день, или 18 мг ленватиниба и 5 мг эверолимуса перорально один раз в день. 153 пациента прошли лечение и у них оценили эффективность и молекулярный корреляционный анализ. Данное исследование представляло собой часть многоцентрового исследования ленватиниба Фазы II (NCT01136733). Для анализа биомаркера брали пробы сыворотки до и после лечения. Пробы сыворотки брали в Цикле 1 на День 1 (до лечения), в Цикле 2 на День 15, и на День 1 каждого цикла, после Цикла 2, и при прекращении лечения. Продолжительность каждого цикла составляла 4 недели (28 дней). Иммуноферментный набор для определения Ang2 (EIDIA Co., Ltd.) использовали для количественного анализа уровня Ang2 в сыворотке крови. Оценивали связь между концентрацией Ang2 в Цикле 1 на День 1 ("исходный уровень") и клиническими результатами, такими как выживаемость без прогрессирования заболевания (PFS) и общая выживаемость (OS). PFS определяют как время от даты рандомизации до даты первого документированного свидетельства прогрессирования заболевания или смерти, в зависимости от того, что произойдет раньше. PFS основан на отчетных данных исследователей с использованием RECIST 1.1. OS определяют как время с момента рандомизации до смерти по любой причине. ʺРандомизацияʺ означает случайный отбор пациента в тестируемую группу или контрольную группу при определении плана лечения для пациента.

[0092]

Результаты: Из проб, взятых у 153 пациентов, для анализа исходного уровня использовали пробы максимум от 147 пациентов. Корреляционный анализ исходных уровней Ang2 и OS показал значимую связь между более низкими уровнями Ang2 и более продолжительной OS при комбинированной терапии с использованием ленватиниба и эверолимуса (HR 1,94, P=0,002), монотерапии ленватинибом (HR 2,12, P<0,001) и монотерапии эверолимусом (HR 1,65, P<0,001). Однако, при дихотомическом анализе пациентов с RCC в подгруппах с высоким (> 3760 пг/мл) по сравнению с низким (≦ 3760 пг/мл) исходным Ang2 (пороговое значение задано как 33^ий процентиль), у пациентов с RCC, имевших более высокий исходный уровень Ang2, при комбинированной терапии наблюдали улучшенный результат (OS) по сравнению с группой исследования, где применялась монотерапия эверолимусом (отношение рисков=0,43, p=0,008, медианная OS=21,7 месяца по сравнению с 12,2 месяца) (Фигура 1). У пациентов с RCC, имевших более высокий исходный уровень Ang2, при комбинированной терапии также наблюдали более продолжительную PFS по сравнению с группой исследования, где применялась монотерапия эверолимусом (отношение рисков=0,53, p=0,043, медианная PFS=6,9 месяца по сравнению с 5,5 месяца) (Фигура 2), что согласуется с анализом OS. У пациентов с RCC, имевших низкий исходный уровень Ang2, комбинированная терапия не показала значимого улучшения OS по сравнению с монотерапией эверолимусом (отношение рисков=0,90, p=0,864, медианная OS: не достигнута ни в одной из двух групп исследования) (Фигура 1), хотя при комбинированной терапии наблюдали более продолжительную PFS по сравнению с группой исследования, где применялась монотерапия эверолимусом (отношение рисков=0,30, p=0,006, медианная PFS=20,1 месяца по сравнению с 5,6 месяца). При использовании порогового значения, заданного как 25^ый процентиль (3565 пг/мл) или 70^ый процентиль (5650 пг/мл), для дихотомического анализа той же группы пациентов с RCC, у пациентов, имевших более высокий исходный уровень Ang2, при комбинированной терапии по-прежнему наблюдали улучшенный результат (OS) по сравнению группой исследования, где применялась монотерапия эверолимусом (Для порогового значения, заданного как 25^ый процентиль: отношение рисков=0,42, p=0,005, медианная OS=21,8 месяца по сравнению с 12,2 месяца. Для порогового значения, заданного как 70^ый процентиль: отношение рисков=0,39, p=0,031, медианная OS=21,7 месяца по сравнению с 12,2 месяца).

[0093]

Конкретные варианты осуществления

Конкретными вариантами осуществления настоящего изобретения являются следующие:

(1) Способ идентифицирования субъекта-человека, который страдает от, у которого есть подозрение на или существует опасность развития почечно-клеточного рака, нуждающегося в комбинированной терапии, включающей ленватиниб или его фармацевтически приемлемую соль и эверолимус, причем способ включает:

анализ биологической пробы, взятой у субъекта-человека перед получением им комбинированной терапии, включающей ленватиниб или его фармацевтически приемлемую соль и эверолимус, и определение того, что концентрация белка ангиопоэтина-2 (Ang2) в биологической пробе выше контрольного уровня; и

идентифицирование субъекта-человека, имеющего высокую концентрацию белка Ang2 в биологической пробе, как нуждающегося в комбинированной терапии, включающей ленватиниб или его фармацевтически приемлемую соль и эверолимус.

(2) Способ по (1), где биологическая проба выбрана из группы, состоящей из пробы крови, пробы сыворотки, пробы плазмы, архивной пробы опухоли почечно-клеточного рака и пробы биопсии почечно-клеточного рака.

(3) Способ по (1) или (2), где биологическая проба представляет собой пробу сыворотки.

(4) Способ по любому одному из (1)-(3), где почечно-клеточный рак представляет собой распространенный почечно-клеточный рак или метастатический почечно-клеточный рак.

(5) Способ по любому одному из (1)-(4), где субъект-человек, который страдает от, у которого есть подозрение на или существует опасность развития почечно-клеточного рака, уже проходил лечение по меньшей мере одной VEGF-прицельной терапией.

(6) Способ по любому одному из (1)-(5), где контрольный уровень представляет собой предварительно установленное пороговое значение.

(7) Способ по (6), где предварительно установленное пороговое значение представляет собой концентрацию белка Ang2, которую определяют на основании анализа характеристических кривых обнаружения, прогнозируя ответ опухоли с более высокой положительной прогностической ценностью по сравнению с отсутствием порога, и где концентрация белка Ang2, равная или ниже предварительно установленного порогового значения, является низкой концентрацией Ang2, а значение выше, чем предварительно установленное пороговое значение, является высокой концентрацией Ang2.

(8) Способ по (7), где ответ опухоли представляет собой частоту объективных ответов, частоту клинической эффективности или % максимального уменьшения размеров опухоли на по меньшей мере 30%.

(9) Способ по (6), где предварительно установленное пороговое значение представляет собой концентрацию белка Ang2, которую определяют на основании прогнозирования выживаемости с использованием имитационных моделей с целью выделения двух групп по разные стороны от порогового значения, и где концентрация белка Ang2, равная или ниже предварительно установленного порогового значения, является низкой концентрацией Ang2, а значение выше предварительно установленного порогового значения является высокой концентрацией Ang2.

(10) Способ по (9), где выживаемость представляет собой общую выживаемость.

(11) Способ по (6), где предварительно установленное пороговое значение представляет собой концентрацию белка Ang2 в диапазоне от 3565 до 5650 пг/мл, и где концентрация белка Ang2, равная или ниже предварительно установленного порогового значения, является низкой концентрацией Ang2, и значение выше, чем предварительно установленное пороговое значение, является высокой концентрацией Ang2.

(12) Способ по любому одному из (1)-(11), где концентрацию белка Ang2 измеряют иммунологическим способом.

(13) Способ по (12), где иммунологический способ выбран из группы, состоящей из иммуноферментного анализа, радиоиммунологического анализа, хемилюминесцентного иммунологического анализа, электрохемилюминесцентного иммунологического анализа, латексного турбидиметрического иммунологического анализа, латексного фотометрического иммунологического анализа, иммунохроматографического анализа и вестерн-блоттинга.

(14) Способ по любому одному из (1)-(12), где концентрацию белка измеряют с помощью иммуноферментного анализа.

(15) Способ по любому одному из (1)-(14), где фармацевтически приемлемая соль ленватиниба представляет собой ленватиниба мезилат.

(16) Способ по любому одному из (1)-(15), дополнительно включающий получение комбинированной терапии субъектом-человеком.

(17) Способ лечения субъекта-человека, который страдает от, у которого есть подозрение на или существует опасность развития почечно-клеточного рака, включающий в себя получение субъектом-человеком комбинированной терапии, включающей эверолимус и ленватиниб или его фармацевтически приемлемую соль, где перед этим в биологической пробе, взятой у субъекта-человека, был выявлен исходный уровень содержания белка Ang2 выше контрольного.

(18) Способ по (17), где почечно-клеточный рак представляет собой распространенный почечно-клеточный рак или метастатический почечно-клеточный рак.

(19) Ленватиниб или его фармацевтически приемлемаю соль для сопутствующего использования с эверолимусом в лечении почечно-клеточного рака у субъекта-человека, где субъекта-человека идентифицируют с помощью способа по (1) как субъекта, который нуждается в комбинированной терапии, включающей ленватиниб или его фармацевтически приемлемую соль и эверолимус.

(20) Средство обнаружения белка Ang2 для применения в целях идентифицирования субъекта-человека, который страдает от, у которого есть подозрение на или существует опасность развития почечно-клеточного рака, нуждающегося в комбинированной терапии, включающей ленватиниб или его фармацевтически приемлемую соль и эверолимус.

(21) Средство обнаружения белка Ang2 по (20), где средство обнаружения белка Ang2 представляет собой антитело к Ang2.

[0094]

Другие варианты осуществления

Несмотря на то, что настоящее изобретение было описано в сочетании с его подробным описанием, предшествующее описание предназначено для иллюстрации и не ограничивает объем настоящего изобретения, который определяется объемом прилагаемой формулы изобретения. Другие аспекты, преимущества и модификации находятся в пределах объема нижеследующей формулы изобретения.

Группа изобретений относится к области медицины, а именно к онкологии, и предназначена для лечения почечно-клеточного рака у субъекта-человека. Способ идентифицирования субъекта-человека, который страдает от, у которого есть подозрение на или существует опасность развития почечно-клеточного рака, нуждающегося в комбинированной терапии, содержащей ленватиниб или его фармацевтически приемлемую соль и эверолимус, включает анализ биологической пробы, взятой у субъекта-человека перед получением им комбинированной терапии, включающей ленватиниб или его фармацевтически приемлемую соль и эверолимус, и определение того, что концентрация белка ангиопоэтина-2 (Ang2) в биологической пробе выше контрольного уровня; и идентифицирование субъекта-человека, имеющего высокую концентрацию белка Ang2 в биологической пробе, как нуждающегося в комбинированной терапии, включающей ленватиниб или его фармацевтически приемлемую соль и эверолимус. Другое воплощение представляет применение ленватиниба или его фармацевтически приемлемой соли в комбинации с эверолимусом в лечении почечно-клеточного рака у субъекта-человека, где субъекта-человека идентифицируют с помощью указанного способа как субъекта, который нуждается в комбинированной терапии, включающей ленватиниб или его фармацевтически приемлемую соль и эверолимус. Использование группы изобретений позволяет повысить эффективность лечения почечно-клеточного рака у субъекта-человека. 2 н. и 11 з.п. ф-лы, 2 ил., 1 пр.

1. Способ идентифицирования субъекта-человека, который страдает от, у которого есть подозрение на или существует опасность развития почечно-клеточного рака, нуждающегося в комбинированной терапии, включающей ленватиниб или его фармацевтически приемлемую соль и эверолимус, причем способ включает:

анализ биологической пробы, взятой у субъекта-человека перед получением им комбинированной терапии, включающей ленватиниб или его фармацевтически приемлемую соль и эверолимус, и определение того, что концентрация белка ангиопоэтина-2 (Ang2) в биологической пробе выше контрольного уровня; и

идентифицирование субъекта-человека, имеющего высокую концентрацию белка Ang2 в биологической пробе, как нуждающегося в комбинированной терапии, включающей ленватиниб или его фармацевтически приемлемую соль и эверолимус,

где субъект-человек, который страдает от, у которого есть подозрение на или существует опасность развития почечно-клеточного рака, уже проходил лечение по меньшей мере одной VEGF-прицельной терапией,

где контрольный уровень представляет собой предварительно установленное пороговое значение, которое представляет собой концентрацию белка Ang2, определенную на основании прогнозирования выживаемости с использованием имитационных моделей для выявления двух групп по разные стороны от порогового значения, и

где концентрация белка Ang2, равная или ниже предварительно установленного порогового значения, является низкой концентрацией Ang2, а значение выше предварительно установленного порогового значения является высокой концентрацией Ang2.

2. Способ по п. 1, где биологическая проба выбрана из группы, состоящей из пробы крови, пробы сыворотки, пробы плазмы, архивной пробы опухоли почечно-клеточного рака и пробы биопсии почечно-клеточного рака.

3. Способ по п. 1 или 2, где биологическая проба представляет собой пробу сыворотки.

4. Способ по любому из пп. 1-3, где почечно-клеточный рак представляет собой распространенный почечно-клеточный рак или метастатический почечно-клеточный рак.

5. Способ по любому из пп. 1-4, где имитационная модель представляет собой анализ характеристических кривых обнаружения.

6. Способ по любому из пп. 1-4, где выживаемость представляет собой общую выживаемость.

7. Способ по любому из пп. 1-4, где предварительно установленное пороговое значение представляет собой концентрацию белка Ang2 в диапазоне от 3565 до 5650 пг/мл и где концентрация белка Ang2, равная или ниже предварительно установленного порогового значения, является низкой концентрацией Ang2, а значение выше предварительно установленного порогового значения является высокой концентрацией Ang2.

8. Способ по любому из пп. 1-7, где концентрацию белка Ang2 измеряют иммунологическим способом.

9. Способ по п. 8, где иммунологический способ выбран из группы, состоящей из ферментного иммуноанализа, радиоиммуноанализа, хемилюминесцентного иммуноанализа, электрохемилюминесцентного иммуноанализа, латексного турбидиметрического иммуноанализа, латексного фотометрического иммуноанализа, иммунохроматографического анализа и вестерн-блоттинга.

10. Способ по пп. 1-8, где концентрацию белка измеряют с помощью иммуноферментного анализа.

11. Способ по пп. 1-10, где фармацевтически приемлемая соль ленватиниба представляет собой ленватиниба мезилат.

12. Способ по любому из пп. 1-11, дополнительно включающий получение комбинированной терапии субъектом-человеком.

13. Применение ленватиниба или его фармацевтически приемлемой соли в комбинации с эверолимусом в лечении почечно-клеточного рака у субъекта-человека, где субъекта-человека идентифицируют с помощью способа по п. 1 как субъекта, который нуждается в комбинированной терапии, включающей ленватиниб или его фармацевтически приемлемую соль и эверолимус.