Т-КЛЕТКИ С КОСТИМУЛИРУЮЩИМ ХИМЕРНЫМ АНТИГЕННЫМ РЕЦЕПТОРОМ, НАЦЕЛЕННЫЕ НА IL13Rα2 Российский патент 2021 года по МПК C07K14/725 C12N5/10 C12N5/783 C12N15/11 A61K35/17 A61P35/00 C12N15/63 

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

В отношении противоопухолевого лечения исследовали иммунотерапии на основе опухолеспецифичных Т-клеток, включая терапии с использованием генетически модифицированных Т-клеток. В некоторых случаях Т-клетки, используемые в таких терапиях, не остаются активными in vivo в течение достаточно длительного периода времени. В некоторых случаях опухолеспецифичность Т-клеток является относительно низкой. Следовательно, в данной области существует потребность в опухолеспецифичных противораковых терапиях с более долговременным противоопухолевым функционированием.

Злокачественные глиомы (MG), которые включают анапластическую астроцитому (АА степени III) и глиобластому (GBM степени IV), имеют в Соединенных Штатах коэффициент заболеваемости приблизительно 20000 новых диагностированных случаев в год. Согласно Американской ассоциации опухоли мозга общее число индивидов, живущих со злокачественной опухолью мозга, на основе данных переписи Соединенных Штатов 2010 года грубо составляет 140000 человек. Несмотря на то, что MG является редким заболеванием, она является высокоагрессивной и гетерогенной в отношении ее злокачественного характера и почти поголовно летальной. Современные терапии в отношении MG высокой степени согласно стандартам оказания медицинской помощи дают только кратковременную пользу, и данные опухоли мозга являются фактически неизлечимыми. В самом деле, даже с использованием современных хирургических и радиотерапевтических методик, которые часто усугубляют уже тяжелые клинические проявления, накладываемые расположением в центральной нервной системе (ЦНС), 5-летняя выживаемость является довольно низкой. Кроме того, для большинства пациентов, у которых заболевание рецидивирует, имеется мало терапевтических возможностей. Таким образом, существует значительная потребность в более эффективных терапиях, в частности, для тех пациентов, у которых заболевание рецидивировало/прогрессировало после терапий первой линии, и участие этой группы пациентов в клинических испытаниях оправдано.

Адоптивная Т-клеточная терапия (ACT) с использованием генетически модифицированных Т-клеток с химерным антигенным рецептором (CAR) может обеспечивать безопасный и эффективный способ уменьшения частоты рецидивов MG, так как Т-клетки с CAR могут быть генетически модифицированы для специфичного распознавания антигенно отличных популяций опухолей (Cartellieri et al. 2010 J Biomed Biotechnol 2010:956304; Ahmed et al. 2010 Clin Cancer Res 16:474; Sampson et al. 2014 Clin Cancer Res 20:972; Brown et al. 2013 Clin Cancer Res 2012 18:2199; Chow et al. 2013 Mol Ther 21:629), и Т-клетки могут мигрировать через паренхиму мозга к мишени и умерщвлять инфильтрирующие злокачественные клетки (Hong et al. 2010 Clin Cancer Res 16:4892; Brown et al. 2007 J Immunol 179:3332; Hong et al. 2010 Clin Cancer Res 16:4892; Yaghoubi 2009 Nat Clin PRact Oncol 6:53). Доклинические исследования продемонстрировали то, что Т-клетки CAR+, нацеленные на IL13Rα2, демонстрируют мощную, независимую от главного комплекса гистосовместимости (МНС), IL13Rα2-специфичную цитолитическую активность против как стволоподобных, так и дифференцированных глиомных клеток, и индуцируют регрессию прижившихся глиомных ксенотрансплантатов in vivo (Kahlon et al. 2004 Cancer Res 64:9160; Brown et al. 2012 Clin Cancer Res 18:2199).

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В данном документе описаны химерные трансмембранные иммунорецепторы (химерные антигенные рецепторы или «CAR»), которые содержат внеклеточный домен, трансмембранную область и внутриклеточный домен сигнализации. Внеклеточный домен составлен из лиганда - IL-13, который связывается с интерлейкин-13Rα2 (IL13Rα2) (рецептор α2 интерлейкина-13), и, возможно, спейсер, содержащий, например, часть человеческого домена Fc. Трансмембранная часть включает трансмембранный домен CD4, трансмембранный домен CD8, трансмембранный домен CD28, трансмембранный домен CD3 или трансмембранный домен 4IBB. Внутриклеточный домен сигнализации включает домен сигнализации из зета цепи комплекса человеческого CD3 (CD3ζ) и один или более чем один костимулирующий домен, например, костимулирующий домен 4-1ВВ. Внеклеточный домен обеспечивает то, что CAR, при экспрессии на поверхности Т-клетки, направляет активность Т-клетки на те клетки, которые экспрессируют IL13Rα2 - рецептор, экспрессируемый на поверхности опухолевых клеток, включая глиому. Важно то, что IL13Rα2-связывающая часть CAR включает модификацию аминокислот, такую как мутация E13Y, которая увеличивает специфичность связывания. Включение костимулирующего домена, такого как костимулирующий домен 4-1ВВ (CD137), расположенный последовательно с CD3ζ, во внутриклеточной области, обеспечивает принятие Т-клеткой костимулирующих сигналов. Т-клетки, например, специфичные для пациента аутологичные Т-клетки, могут быть генетически модифицированы для экспрессии CAR, описанных в данном документе, и данные генетически модифицированные клетки можно размножать и использовать в ACT. Можно использовать разные поднаборы Т-клеток. Кроме того, CAR могут экспрессироваться в других иммунных клетках, таких как клетки NK (натуральные киллеры). Когда пациента лечат описанной в данном документе иммунной клеткой, экспрессирующей CAR, данная клетка может быть аутологичной или аллогенной Т-клеткой. В некоторых случаях используемые клетки представляют собой центральные Т-клетки памяти (Т_СМ) CD4+ и CD8+, которые являются CD45RO+CD62L+, и применение таких клеток может улучшать долговременную сохранность клеток после адоптивного переноса по сравнению с применением других типов специфичных для пациента Т-клеток.

В данном документе описана молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая химерный антигенный рецептор (CAR)r, где химерный антигенный рецептор содержит: человеческий IL-13 или его вариант, имеющий 1-10 (например, 1 или 2) модификаций аминокислот; трансмембранный домен, выбранный из: трансмембранного домена CD4 или его варианта, имеющего 1-10 (например, 1 или 2) модификаций аминокислот, трансмембранного домена CD8 или его варианта, имеющего 1-10 (например, 1 или 2) модификаций аминокислот, трансмембранного домена CD28 или его варианта, имеющего 1-10 (например, 1 или 2) модификаций аминокислот, и трансмембранного домена CD3ζ или его варианта, имеющего 1-10 (например, 1 или 2) модификаций аминокислот; костимулирующий домен; и домен сигнализации CD3ζ или его вариант, имеющий 1-10 (например, 1 или 2) модификаций аминокислот.

В разных воплощениях костимулирующий домен выбран из группы, состоящей из: костимулирующего домена CD28 или его варианта, имеющего 1-10 (например, 1 или 2) модификаций аминокислот, костимулирующего домена 4-IBB или его варианта, имеющего 1-10 (например, 1 или 2) модификаций аминокислот, и костимулирующего домена ОХ40 или его варианта, имеющего 1-10 (например, 1 или 2) модификаций аминокислот. В некоторых воплощениях присутствует костимулирующий домена 4IBB или его вариант, имеющий 1-10 (например, 1 или 2) модификаций аминокислот.

Дополнительное воплощение CAR включает: вариант человеческого IL-13, имеющий 1-10 модификаций аминокислот, которые увеличивают специфичность связывания в отношении IL13Rα2 по сравнению с IL13Rα1; человеческий IL-13 или его вариант представляет собой вариант IL-13, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:3 с 1-5 модификациями аминокислот, при условии, что аминокислота в положении 11 SEQ ID NO:3 отличается от Е; два разных костимулирующих домена, выбранных из группы, состоящей из: костимулирующего домена CD28 или его варианта, имеющего 1-10 (например, 1 или 2) модификаций аминокислот, костимулирующего домена 4-IBB или его варианта, имеющего 1-10 (например, 1 или 2) модификаций аминокислот, и костимулирующего домена ОХ40 или его варианта, имеющего 1-10 (например, 1 или 2) модификаций аминокислот; два разных костимулирующих домена, выбранных из группы, состоящей из: костимулирующего домена CD28 или его варианта, имеющего 1-2 модификации аминокислот, костимулирующего домена 4-IBB или его варианта, имеющего 1-2 модификации аминокислот, и костимулирующего домена ОХ40 или его варианта, имеющего 1-2 модификации аминокислот; человеческий IL-13 или его вариант, имеющий 1-2 модификации аминокислот; трансмембранный домен, выбранный из: трансмембранного домена CD4 или его варианта, имеющего 1-2 модификации аминокислот, трансмембранного домена CD8 или его варианта, имеющего 1-2 модификации аминокислот, трансмембранного домена CD28 или его варианта, имеющего 1-2 модификации аминокислот, и трансмембранного домена CD3ζ или его варианта, имеющего 1-2 модификации аминокислот; костимулирующий домен; и домен сигнализации CD3ζ или его вариант, имеющий 1-2 модификации аминокислот; спейсерную область, расположенную между IL-13 или его вариантом и трансмембранным доменом (например, спейсерная область содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 4, 14-20, 50 и 52); спейсер содержит шарнирную область IgG; спейсерная область содержит 10-150 аминокислот; домен сигнализации 4-1 ВВ содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6; домен сигнализации CD3ζ содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7; и линкер из 3-15 аминокислот, который расположен между костимулирующим доменом и доменом сигнализации CD3ζ или его вариантом. В некоторых воплощениях, когда имеется два костимулирующих домена, один представляет собой костимулирующий домен 4-IBB, а другой костимулирующий домен выбран из: CD28 и CD28gg.

В некоторых воплощениях молекула нуклеиновой кислоты экспрессирует полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 10, 31-48 и 52; химерный антигенный рецептор содержит область IL-13/lgG4/CD4t/41-BB, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:11, и домен сигнализации CD3ζ, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:7; и химерный антигенный рецептор содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, 31-48 и 52.

Также раскрыта популяция человеческих Т-клеток, трансдуцированных вектором, содержащим экспрессионную кассету, кодирующую химерный антигенный рецептор, где химерный антигенный рецептор содержит: человеческий IL-13 или его вариант, имеющий 1-10 модификаций аминокислот; трансмембранный домен, выбранный из: трансмембранного домена CD4 или его варианта, имеющего 1-10 модификаций аминокислот, трансмембранного домена CD8 или его варианта, имеющего 1-10 модификаций аминокислот, трансмембранного домена CD28 или его варианта, имеющего 1-10 модификаций аминокислот, и трансмембранного домена CD3ζ или его варианта, имеющего 1-10 модификаций аминокислот; костимулирующий домен; и домен сигнализации CD3ζ или его вариант, имеющий 1-10 модификаций аминокислот. В разных воплощениях: популяция человеческих Т-клеток содержит вектор, экспрессирующий химерный антигенный рецептор, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 10, 31-48 и 52; популяция человеческих Т-клеток содержит центральные Т-клетки памяти (клетки Tcm) (например, по меньшей мере 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% клеток представляют собой клетки Tcm; по меньшей мере 15%, 20%, 25%, 30%, 35% клеток Tcm представляют собой CD4+; и по меньшей мере 15%, 20%, 25%, 30%, 35% клеток Tcm представляют собой клетки CD8+).

Также описан способ лечения рака у пациента, включающий введение популяции аутологических или аллогенных человеческих Т-клеток (например, аутологических или аллогенных Т-клеток, включающих клетки Tcm, например, по меньшей мере 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% клеток представляют собой клетки Tcm; по меньшей мере 15%, 20%, 25%, 30%, 35% клеток Tcm представляют собой CD4+; и по меньшей мере 15%, 20%, 25%, 30%, 35% клеток Tcm представляют собой клетки CD8+), трансдуцированных вектором, содержащим экспрессионную кассету, кодирующую химерный антигенный рецептор, где химерный антигенный рецептор содержит аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 10, 31-48 и 52. В разных воплощениях: популяция человеческих Т-клеток содержит центральные Т-клетки памяти; раковое заболевание представляет собой глиобластому; и трансдуцированные человеческие Т-клетки были получены способом, включающим получение Т-клеток от пациента, обработку Т-клеток для выделения центральных Т-клеток памяти и трансдуцирование по меньшей мере части центральных клеток памяти вирусным вектором, содержащим экспрессионную кассету, кодирующую химерный антигенный рецептор, где химерный антигенный рецептор содержит аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 10, 31-48 и 52.

Также описана: молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95% идентична аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 10 и SEQ ID NO: 10, 31-48 и 52; молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая идентична аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 10, 31-48 и 52, за исключением присутствия не более чем 5 замен, делеций или вставок аминокислот; молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая идентична аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 10 и SEQ ID NO: 10, 31-48 и 52, за исключением присутствия не более чем 5 замен аминокислот; и молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая идентична аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 10 и SEQ ID NO: 10, 31-48 и 52, за исключением присутствия не более чем 2 замен аминокислот.

Некоторые CAR, описанные в данном документе, например, CAR IL13(EQ)BBζ и CAR IL13(EQ)CD28 - ВВζ, имеют определенные полезные характеристики по сравнению с некоторыми другими CAR, нацеленными на IL13. Например, они имеют улучшенную селективность в отношении IL13Rα, вызывают меньшую продукцию цитокина Th2, в частности, меньшую продукцию IL13.

Т-клетки, экспрессирующие CAR, нацеленный на IL13Rα2, могут быть полезными при лечении раковых заболеваний, таких как глиобластома, а также других раковых заболеваний, при которых экспрессируется IL13Rα2, которые включают медуллобластому, рак молочной железы, рак головы и шеи, рак почки, рак яичника и саркому Капоши, но не ограничиваются ими. Таким образом, данное раскрытие включает способы лечения рака с использованием Т-клеток, экспрессирующих CAR, описанный в данном документе.

Данное раскрытие также включает молекулы нуклеиновой кислоты, которые кодируют любой из CAR, описанных в данном документе (например, векторы, которые включают последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую один из CAR), и выделенные Т-лимфоциты, которые экспрессируют любой из CAR, описанных в данном документе.

CAR, описанный в данном документе, может включать спейсерную область, расположенную между доменом IL13 и трансмембранным доменом. Можно использовать множество разных спейсеров. Некоторые из них включают по меньшей мере часть человеческой области Fc, например, шарнирную часть человеческой области Fc или домен CH3 или их варианты. В Таблице 1 ниже приведены разные спейсеры, которые можно использовать в CAR, описанных в данном документе.

Некоторые спейсерные области включают всю шарнирную область иммуноглобулина (например, lgG1, lgG2, lgG3, lgG4) или ее часть, т.е. последовательность, которая попадает между доменами СН1 и СН2 иммуноглобулина, например, шарнир Fc lgG4 или шарнир CD8. Некоторые спейсерные области включают домен CH3 иммуноглобулина или и домен CH3, и домен СН2. Последовательности, происходящие от иммуноглобулина, могут включать одну или более чем одну модификацию аминокислоты, например, 1, 2, 3, 4 или 5 замен, например, замены, которые уменьшают связывание вне мишени.

Термин «модификация аминокислоты» относится к замене, вставке и/или делеции аминокислоты в последовательности белка или пептида. Термин «замена аминокислоты» или «замена» относится к замене аминокислоты в конкретном положении в последовательности родительского белка или пептида другой аминокислотой. Замену можно делать для изменения аминокислоты в полученном белке неконсервативным образом (т.е. посредством изменения кодона от аминокислоты, принадлежащей к одной группе аминокислот, имеющих конкретный размер или характеристику, до аминокислоты, принадлежащей к другой группе) или консервативным образом (т.е. посредством изменения кодона от аминокислоты, принадлежащей к одной группе аминокислот, имеющих конкретный размер или характеристику, до аминокислоты, принадлежащей к той же самой группе). Такое консервативное изменение обычно приводит к меньшему изменению в структуре и функции образующегося в результате белка. Примеры разных групп аминокислот являются следующими: 1) аминокислоты с неполярными группами R: аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, триптофан, метионин; 2) аминокислоты с незаряженными полярными группами R: глицин, серии, треонин, цистеин, тирозин, аспарагин, глутамин; 3) аминокислоты с заряженными полярными группами R (отрицательно заряженными при рН 6,0): аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота; 4) основные аминокислоты (положительно заряженные при рН 6,0): лизин, аргинин, гистидин (при рН 6,0). Другой группой могут быть аминокислоты с фенильными группами: фенилаланин, триптофан и тирозин.

В некоторых воплощениях спейсер происходит из lgG1, lgG2, lgG3 или lgG4 и включает один или более чем один аминокислотный остаток, замененный аминокислотным остатков, отличным от остатка, присутствующего в немодифицированном спейсере. Один или более чем один замененный аминокислотный остаток выбран из одного или более чем одного аминокислотного остатка в положениях 220, 226, 228, 229, 230, 233, 234, 235, 234, 237, 238, 239, 243, 247, 267, 268, 280, 290, 292, 297, 298, 299, 300, 305, 309, 218, 326, 330, 331, 332, 333, 334, 336, 339 или их комбинации, но не ограничивается ими. В данной схеме нумерации, описанной с большими подробностями ниже, первая аминокислота в спейсере lgG4(L235E,N297Q) в Таблице 1 находится в положении 219, и первая аминокислота в спейсере lgG4(HL-CH3) в Таблице 1 находится в положении 219, как и первая аминокислота в последовательности шарнира IgG и в последовательности линкера на основе шарнира (HL) lgG4 в Таблице 1.

В некоторых воплощениях модифицированный спейсер происходит из lgG1, lgG2, lgG3 или lgG4, который включает одну или более чем одну из следующих замен аминокислотных остатков: C220S, C226S, S228P, C229S, P230S, Е233Р, V234A, L234V, L234F, L234A, L235A, L235E, G236A, G237A, P238S, S239D, F243L, P247I, S267E, H268Q, S280H, K290S, К290Е, K290N, R292P, N297A, N297Q, S298A, S298G, S298D, S298V, Т299А, Y300L, V305I, V309L, Е318А, К326А, K326W, К326Е, L328F, A330L, A330S, A331S, P331S, I332E, Е333А, E333S, E333S, К334А, A339D, A339Q, P396L или их комбинацию, но не ограничивается ими.

В некоторых воплощениях модифицированный спейсер происходит из области lgG4, которая включает один или более чем один аминокислотный остаток, замененный аминокислотным остатком, отличным от остатка, присутствующего в немодифицированной области. Один или более чем один замененный аминокислотный остаток выбран из одного или более чем одного аминокислотного остатка в положениях 220, 226, 228, 229, 230, 233, 234, 235, 234, 237, 238, 239, 243, 247, 267, 268, 280, 290, 292, 297, 298, 299, 300, 305, 309, 218, 326, 330, 331, 332, 333, 334, 336, 339 или их комбинации.

В некоторых воплощениях модифицированный спейсер происходит из области lgG4, которая включает одну или более чем одну из следующих замен аминокислотных остатков: 220S, 226S, 228Р, 229S, 230S, 233Р, 234А, 234V, 234F, 234А, 235А, 235Е, 236А, 237А, 238S, 239D, 243L, 247I, 267Е, 268Q, 280Н, 290S, 290Е, 290N, 292Р, 297А, 297Q, 298А, 298G, 298D, 298V, 299А, 300L, 305I, 309L, 318А, 326А, 326W, 326Е, 328F, 330L, 330S, 331S, 331S, 332Е, 333А, 333S, 333S, 334А, 339D, 339Q, 396L или их комбинацию, но не ограничивается ими, где аминокислота в немодифицированном спейсере заменена идентифицированными выше аминокислотами в указанном положении.

Для обсуждаемых в данном документе положений аминокислот в иммуноглобулине нумерация осуществляется согласно индексу EU (Европейский Союз) или схеме нумерации EU (Kabat et al. 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., United States Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, тем самым целиком включена посредством ссылки). Индекс EU или индекс EU по Kabat, или схема нумерации EU относится к нумерации EU антитела (Edelman et al. 1969 Proc Natl Acad Sci USA 63:78-85).

В CAR, направленном против IL13Rα2, можно использовать целый ряд трансмембранных доменов. Таблица 2 включает примеры подходящих трансмембранных доменов. Когда присутствует спейсерный домен, трансмембранный домен располагается ближе к карбоксильному концу относительно спейсерного домена.

Многие из CAR, описанных в данном документе, включают один или более чем один (например, два) костимулирующих домена. Костимулирующий(щие) домен(ны) располагается(ются) между трансмембранным доменом и доменом сигнализации CD3ζ. Таблица 3 включает примеры подходящих костимулирующих доменов, совместно с последовательностью домена сигнализации CD3ζ.

ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

Фиг. 1 представляет собой схематическое изображение CAR IL13(E13Y)-зетакин (слева), состоящего из варианта человеческого IL-13, специфичного в отношении IL13Rα2 (hulL-13(E13Y)), спейсера на основе Fc человеческого lgG4 (huγ₄Fc), частей в виде человеческого трансмембранного CD4 (huCD4 tm) и цитоплазматической цепи человеческого CD3Cζ (huCD3ζ cyt), как указано. Также показан CAR IL13(EQ)BBζ, который является таким же как и IL13(E13Y)-зетакин, за исключением двух точечных мутаций - L235E и N297Q, указанных красным, которые располагаются в домене СН2 спейсера на основе lgG4, и добавления костимулирующего цитоплазматического домена 4-1ВВ (4-1ВВ cyt).

На Фиг. 2А-В показаны открытые рамки считывания определенных векторов. А представляет собой диаграмму открытой рамки считывания кДНК из 2670 нуклеотидов конструкции IL13(EQ)BBZ-T2ACD19t, где показаны последовательности IL13Rα2-специфичного лиганда IL13(E13Y), шарнира Fc lgG4(EQ), трансмембранного CD4, цитоплазматического домена сигнализации 4-1ВВ, трехглицинового линкера и цитоплазматического домена сигнализации CD3ζ CAR IL13(EQ)BBZ, а также перескакивания рибосомы Т2А и усеченного CD19. Также показаны сигнальные последовательности человеческого рецептора альфа GM-CSF (гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор) и CD19, которые управляют поверхностной экспрессией CAR IL13(EQ)BBζ и CD19t. Б представляет собой диаграмму последовательностей, фланкированных длинными концевыми повторами (показанными как «R»), которые будут интегрированы в геном хозяина. В представляет собой карту плазмиды IL13(EQ)BBZ-T2A-CD19t_epHIV7.

На Фиг. 3 показана конструкцию pHIV7.

На Фиг. 4 показаны элементы pHIV7.

На Фиг. 5 показана схема получения IL13(EQ)BBζ/CD19t+Т_СМ.

На Фиг. 6А-В показаны результаты анализа экспрессии поверхностного трансгена и маркера Т-клеток посредством проточной цитометрии. IL13(EQ)BBζ/CD19t+Т_СМ HD006.5 и HD187.1 совместно окрашивали антителом против IL13-PE (фикоэритрин) и антителом против CD8-FITC (флуоресцеина изотиоцианат) для выявления клеток CD8+ CAR+ и CD4+ (т.е. CD8-негативных) CAR+ (А), или антителом против CD19-PE и антителом против CD4-FITC для выявления клеток CD4+CD19t+ и CD8+ (т.е. CD4-негативных) CAR+ (Б). IL13(EQ)BBζ/CD19t+T_CM HD006.5 и HD187.1 окрашивали антителами против CD3, TCR, CD4, CD8, CD62L и CD28, конъюгированными с флуорохромом (серые гистограммы) или изотипическими контролями (черные гистограммы) (В). Во всех случаях процентные доли основаны на жизнеспособных лимфоцитах (негативных в отношении DAPI (4',6-диамидин-2-фенилиндол)), которые окрашивались сильнее, чем изотипический контроль.

На Фиг. 7А-Б показана функциональная характеризация in vitro эффекторной функции IL13Rα2-специфичного IL13(EQ)BBZ+T_CM. IL13(EQ)BBZ/CD19t+T_CM HD006.5 и HD187.1 использовали в качестве эффекторов в 6-часовом анализе высвобождения ⁵¹Cr с использованием соотношения Е:Т (эффектор : мишень) 10:1 на основе экспрессии CD19t. IL13Rα2-позитивными опухолями-мишенями были К562, генетически модифицированная для экспрессии IL13Rα2 (K562-IL13Rα2), и линия первичной глиомы РВТ030-2, а IL13Rα2-негативной контрольной опухолью-мишенью была родительская линия К562 (А). IL13(EQ)BBZ/CD19t+T_CM HD006.5 и HD187.1 оценивали на антигензависимую продукцию цитокинов после совместной культуры в течение ночи при соотношении Е:Т 10:1 с использованием IL13Rα2-позитивных и негативных мишеней. Уровни цитокинов измеряли с использованием набора для анализа Bio-Plex Pro Human Cytokine TH1/TH2, и приводится уровень IFN-γ (Б).

На Фиг. 8А-В показан результат исследований, демонстрирующих регрессию прижившихся ксенотрансплантатов глиомной опухоли после адоптивного переноса IL13(EQ)BBζ/CD19t+T_CM. Опухолевые клетки EGFP-ffLuc+РВТ030-2 (1×10⁵) стереотактически имплантировали в правую часть переднего мозга мышей NSG. В сутки 5 мыши получали либо 2×10⁶ IL13(EQ)BBζ/CD19t+T_CM (1,1×10⁶ CAR+; n равно 6), либо 2×10⁶ имитации ТСМ (без CAR; n равно 6), либо PBS (фосфатно-солевой буферный раствор) (n равно 6). Репрезентативные мыши из каждой группы, демонстрирующие относительную опухолевую нагрузку с использованием Xenogen Living Image (А). Количественное измерение потока ffLuc (фотоны/с) показывает то, что IL13(EQ)BBζ/CD19t+T_CM индуцирует регрессию опухоли по сравнению с T_CM с имитацией трансдукции и с PBS (#р меньше 0,02; *р меньше 0,001, ANOVA (дисперсионный анализ) с повторными измерениями (Б). Кривая выживания Каплана-Мейера (n равно 6 на группу), демонстрирующая значимо улучшенное выживание (р равно 0,0008; логранговый критерий) для мышей, обработанных IL13(EQ)BBζ/CD19t+T_CM (В).

На Фиг. 9А-В показаны результаты исследований, сравнивающих противоопухолевую эффективность клонов CTL (цитолитический Т-лимфоцит) IL13(EQ)BBZ T_CM и IL13-зетакин. EGFP-ffLuc+РВТ030-2 TSs (1×10⁵) стереотактически имплантировали в правую часть переднего мозга мышей NSG. В сутки 8 мыши получали либо 1,6×10⁶ имитации T_CM (без CAR), либо 1,0×10⁶ CAR+IL13(EQ)BBζ T_CM (всего 1,6×10⁶ Т-клеток; 63% CAR), либо 1,0×10⁶ IL13-зетакин CD8+CTL, клон 2D7 (клональный CAR+), либо не получали обработки (n равно 6 на группу). Репрезентативные мыши из каждой группы, демонстрирующие относительную опухолевую нагрузку с использованием Xenogen Living Image (А). Линии линейной регрессии натурального log потока ffLuc (фотоны/с) с течение времени, значения Р приводятся для сравнений взаимодействия групп по времени (Б). Анализ выживания Каплана-Мейера (n равно 6 на группу) демонстрирует значительно улучшенное выживание (р равно 0,02; логранговый критерий) для мышей, обработанных IL13(EQ)BBζ T_CM по сравнению с IL13-зетакин CD8+CTL, клон 2D7 (В).

На Фиг. 10А-В показаны результаты исследований, сравнивающих противоопухолевую эффективность клонов CTL IL13(EQ)BBζ T_CM и IL13-зетакин. EGFP-ffLuc+ РВТ030-2 TSs (1×10⁵) стереотактически имплантировали в правую часть переднего мозга мышей NSG. В сутки 8 мыши получали либо 1,3×10⁶ имитирующих T_CM (без CAR; n равно 6), либо 1,0, 0,3 или 0,1×10⁶ CAR+ IL13(EQ)BBζ T_CM (78% CAR+; n равно 6-7), либо 1,0, 0,3 или 0,1×10⁶ клона 2D7 CTL IL13-зетакин CD8+ (клональный CAR+; n равно 6-7), либо не получали обработки (n равно 5). Xenogen Imaging репрезентативных мышей из каждой группы, демонстрирующее относительную опухолевую нагрузку (А). Линии линейной регрессии натурального log потока ffLuc (фотоны/с) показывают то, что IL13(EQ)BBζ T_CM достигают превосходящей регрессии опухоли по сравнению с первым поколением клона 2D7 CTL IL13-зетакин, имитирующими T_CM и только опухолью (Б). Средний поток на группу в сутки 27 после инъекции опухоли, демонстрирующий то, что доза 0,1×10⁶ IL13(EQ)BBζ T_CM превосходит по эффективности в десять раз большую дозу клона 2D7 CTL IL13-зетакин CD8+ - 1,0×10⁶ (р равно 0,043; двухвыборочный t-критерий Уелча) (В).

На Фиг. 11 показаны результаты исследований, демонстрирующих то, что IL13(EQ)BBζ T_CM показывают лучшую стойкость по сравнению с клонами CTL IL13-зетакин. Иммуногистохимия CD3, оценивающая стойкость Т-клеток в сайте опухоли через 7 суток после инфузии Т-клеток. Значительное число Т-клеток выявляется для IL13(EQ)BBζ T_CM (верхняя панель). В отличие от этого выявляется очень мало жизнеспособных Т-клеток CD3+IL13-зетакин (нижняя панель).

На Фиг. 12А-Г показаны результаты экспериментов, сравнивающих путь доставки Т-клеток CAR+ (в.ч. (внутричерепно) по сравнению с в.в. (внутривенно)) для больших установившихся опухолей. EGFP-ffLuc+РВТ030-2 TSs (1×10⁵) имплантировали в правую часть переднего мозга мышей NSG. В сутки 19 и 26 мышам в.в. инъецировали через хвостовую вену либо 5×10⁶ CAR+IL13(EQ)BBζ+T_CM (всего 11,8×10⁶ клеток; n равно 4), либо имитацию - T_CM (11,8×10⁶ клеток; n равно 4). В качестве альтернативы, в сутки 19, 22, 26 и 29 мышам в.ч. инъецировали либо 1×10⁶ CAR+IL13(EQ)BBζ+T_CM (всего 2,4×10⁶ клеток; n равно 4), либо имитацию - T_CM (2,4×10⁶ клеток; n равно 5). Средний поток ffLuc (фотоны/с) с течением времени показывает то, что IL13(EQ)BBζ T_CM, доставленный в.ч., опосредует регрессию опухоли в сутки 19 опухолей. В отличие от этого, Т-клетки, доставленные в.в., не демонстрируют уменьшения опухолевой нагрузки по сравнению с необработанными или имитирующими T_CM контролями (А). Кривая выживания Каплана-Мейера демонстрирует улучшенное выживание для мышей, обработанных в.ч. IL13(EQ)BBZ T_CM, по сравнению с мышами, обработанными в.в. введенными T_CM CAR+ (р равно 0,0003, логранговый критерий) (Б). Репрезентативное окрашивание Н&Е (гематоксилином и эозином) и IHC (иммуногистохимия) CD3 мышей, обработанных IL13(EQ)BBZ+T_CM в.в. (В) по сравнению с в.ч. (Г). Т-клетки CD3+ выявляли только в группе, обработанной в.ч., при отсутствии клеток CD3+, выявленных в опухоли или в окружающей паренхиме мозга для мышей, обработанных в.в.

На Фиг. 13А-Б показаны результаты исследований, демонстрирующих то, что Т-клетки CAR+, инъецированные внутричерепно, либо внутриопухолево (в.о.), либо внутрижелудочково (в.ж.), могут транспортироваться в опухоли на противоположном полушарии. EGFP-ffLuc+РВТ030-2 TSs (1×10⁵) стереотактически имплантировали в правую и левую части переднего мозга мышей NSG. В сутки 6 мышам в.ч. инъецировали в место правой опухоли 1,0×10⁶ IL13(EQ)BBζ+T_CM (всего 1,6×10⁶ клеток; 63% CAR; n равно 4). Схема экспериментальной модели множественной глиомы (A). IHC CD3, демонстрирующая Т-клетки, инфильтрующие в правый и левый сайты опухолей (Б).

На Фиг. 14А-В показаны результаты серии исследований, оценивающих костимулирующие домены IL13Rα2-специфичных CAR. Схема конструкций IL13Rα2-специфичных CAR, сравнивающая разные внутриклеточные эндодомены/домены сигнализации, включающая первое поколение CAR CD3z, не имеющее костимуляции, относительно второго поколения CAR, включающего либо 4-1ВВ, либо CD28, относительно третьего поколения CAR, содержащего и CD28, и 4-1ВВ. Все кассеты CAR также содержат последовательности перескакивания рибосомы Т2А и усеченного CD19 (CD19t) в качестве маркера трансдуцированных клеток (А). T_CM CD4 и CD8 трансдуцировали лентивирусом, и Т-клетки, экспрессирующие CAR, иммуномагнитно обогащали посредством антитела против CD19. Уровни экспрессии CD19 и IL13 (т.е. CAR), измеренные проточной цитометрией (Б). Стабильность каждой конструкции CAR определяли путем деления средней интенсивности флуоресценции (MFI) CAR (IL13) на MFI маркера трансдукции (CD19t) (В). CAR, содержащие 4-1 ВВ, демонстрировали наименьшие уровни экспрессии по сравнению с маркером трансдукции CD19t.

На Фиг. 15А-Б показаны результаты исследований, демонстрирующих то, что IL13Rα2-специфичные CAR, содержащие костимулирующий домен 4-1ВВ, продуцируют меньше цитокинов Th1 и Th2. Способность указанных Т-клеток с имитацией трансдукции или экспрессирующих CAR умерщвлять опухолевые клетки-мишени РВТ030-2, экспрессирующие IL13Rα2, определяли в 4-часовом анализе высвобождения 51Cr при указанных соотношениях эффектор : мишень. На (А) показан средний % высвобождения хрома плюс S.D. (стандартное отклонение) от лунок в тройной повторности. Как и ожидалось, Т-клетки с имитацией трансдукции не лизировали мишени эффективно. В отличие от этого, все Т-клетки, экспрессирующие CAR, лизировали опухолевые клетки аналогичным образом. Указанные Т-клетки с имитацией трансдукции или экспрессирующие CAR сокультивировали в течение ночи с опухолевыми клетками РВТ030-2, экспрессирующими IL13Rα2, в соотношении 10:1, и супернатанты анализировали на уровни IL-13 и IFN-γ посредством цитометрического анализа с использованием шариков (Б). Показаны средние значения плюс S.D. от лунок в тройной повторности. Интересно то, что Т-клетки, экспрессирующие CAR зета, 41ВВ-зета или CD28-41ВВ-зета, демонстрировали меньшую стимулированную антигеном продукцию цитокинов, чем Т-клетки, экспрессирующие CAR CD28-зета.

На Фиг. 16А-В показаны результаты ряда исследований по эффективности in vivo IL13Rα2-специфичных CAR. Мыши NSG получали внутричерепную инъекцию опухолевых клеток ffLuc+РВТ030-2 в сутки 0 и были рандомизированы на 6 групп (n равно 9-10 мышей на группу) для в.ч. обработки либо PBS (только опухоль), либо Т-клетками с имитацией трансдукции, либо Т-клетками, экспрессирующими указанный IL13Rα2-специфичный CAR в сутки 8. Затем проводили количественную биолюминесцентную визуализацию для отслеживания роста опухоли с течением времени. Биолюминесцентные изображения для репрезентативных мышей в каждой группе (А). Среднее плюс S.E. (стандартная ошибка среднего) общих уровней потока люциферазной активности с течением времени в каждой группе (Б). Уровни потока для каждой мыши в сутки 27. Все группы, обработанные Т-клетками с IL13Rα2-специфичными CAR, за исключением группы, обработанной Т-клетками, экспрессирующими CD28-CAR, демонстрируют статистически значимое уменьшение объема опухоли по сравнению с мышами, обработанными Т-клетками с имитацией трансдукции (В).

На Фиг. 17 показана аминокислотная последовательность IL13(EQ)BBζ/CD19t+(SEQ ID NO:10).

На Фиг. 18 показано сравнение последовательности IL13(EQ)41BBζ[IL13{EQ}41BBζ T2A-CD19t_epHIV7; pF02630] (SEQ ID NO:12) и CD19Rop_epHIV7 (pJ01683) (SEQ ID NO:13).

На Фиг. 19 показана аминокислотная последовательность IL13(EmY)-CD8h3-CD8tm2-41ВВ-зета (SEQ ID NO:31 с сигнальным пептидом GMSCFRa; SEQ ID NO:39 без сигнального пептида GMSCFRa).

На Фиг. 20 показана аминокислотная последовательность IL13(EmY)-CD8h3-CD28tm-CD28gg-41ВВ-зета (SEQ ID NO:32 с сигнальным пептидом GMSCFRa; SEQ ID NO:40 без сигнального пептида GMSCFRa).

На Фиг. 21 показана аминокислотная последовательность IL13(EmY)-lgG4(HL-CH3)-CD4tm-41ВВ-зета (SEQ ID NO:33 с сигнальным пептидом GMSCFRa; SEQ ID NO:41 без сигнального пептида GMSCFRa).

На Фиг. 22 показана аминокислотная последовательность IL13(EmY)-lgG4(L235E,N297Q)-CD8tm-41ВВ-зета (SEQ ID NO:34 с сигнальным пептидом GMSCFRa; SEQ ID NO:42 без сигнального пептида GMSCFRa).

На Фиг. 23 показана аминокислотная последовательность IL13(EmY)-линкер-CD28tm-CD28gg-41ВВ-зета (SEQ ID NO:35 с сигнальным пептидом GMSCFRa; SEQ ID NO:43 без сигнального пептида GMSCFRa).

На Фиг. 24 показана аминокислотная последовательность IL13(EmY)-HL-CD28m-CD28gg-41ВВ-зета (SEQ ID NO:36 с сигнальным пептидом GMSCFRa; SEQ ID NO:44 без сигнального пептида GMSCFRa).

На Фиг. 25 показана аминокислотная последовательность IL13(EmY)-lgG4(HL-CH3)-CD28tm-CD28gg-41ВВ-зета (SEQ ID NO:37 с сигнальным пептидом GMSCFRa; SEQ ID NO:45 без сигнального пептида GMSCFRa).

На Фиг. 26 показана аминокислотная последовательность IL13(EmY) lgG4(L235E,N297Q)-CD28tm-CD28gg-41ВВ-зета (SEQ ID NO:38 с сигнальным пептидом GMSCFRa; SEQ ID NO:46 без сигнального пептида GMSCFRa).

На Фиг. 27 показана аминокислотная последовательность IL13(EmY)-CD8h3-CD8tm-41ВВ-зета (SEQ ID NO:47 с сигнальным пептидом GMSCFRa; SEQ ID NO:48 без сигнального пептида GMSCFRa).

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Ниже описана структура, конструирование и характеризация разных IL13Rα2-специфичных химерных антигенных рецепторов. Химерный антиген (CAR) представляет собой рекомбинантную биомолекулу, которая содержит, как минимум, внеклеточный домен распознавания, трансмембранную область и внутриклеточный домен сигнализации. Термин «антиген», следовательно, не ограничивается молекулами, которые связываются антителами, но относится и к любой молекуле, которая может специфично связываться с мишенью. Например, CAR может включать лиганд, который специфично связывается с рецептором поверхности клетки. Внеклеточный домен распознавания (также именуемый внеклеточный домен или просто именуется по элементу распознавания, который он содержит) содержит элемент распознавания, который специфично связывается с молекулой, присутствующей на поверхности клетки клетки-мишени. Трансмембранная область заякоривает CAR в мембране. Внутриклеточный домен сигнализации содержит домен сигнализации из цепи зета человеческого комплекса CD3 и возможно содержит один или более чем один костимулирующий домен сигнализации. CAR может связываться и с антигеном, и трансдуцировать активацию Т-клетки, независимо от ограничения МНС. Таким образом, CAR представляют собой «универсальные» иммунорецепторы, которыми можно лечить группу пациентов с антигенпозитивными опухолями, независимо от их генотипа HLA (антиген лейкоцитов человека). Адоптивная иммунотерапия с использованием Т-лимфоцитов, которые экспрессируют опухолеспецифичный CAR, может быть мощной терапевтической стратегией для лечения рака.

Один описанный в данном документе IL13Rα2-специфичный CAR называется IL13(EQ)BBζ. Данный CAR включает целый ряд важных элементов, включая: лиганд IL13α2, имеющий аминокислотную замену, которая улучшает специфичность связывания с IL13Rα2; домен CD137 (4-1ВВ) последовательно с CD3C, для обеспечения полезной костимуляции; и область Fc lgG4, которая мутирована в двух сайтах в пределах области СН2 (L235E; N297Q) таким способом, который уменьшает связывание Fc рецепторами (FcR). Другой CAR, описанный в данном документе, содержит второй костимулирующий домен.

В некоторых случаях описанный в данном документе CAR, включающий CAR IL13(EQ)BBζ, может быть получен с использованием вектора, в котором после открытой рамки считывания CAR следует последовательность перепрыгивания рибосомы Т2А и усеченный CD19 (CD19t), у которого отсутствует цитоплазматический сигнальный хвост (усеченный в аминокислоте 323). При данной организации коэкспрессия CD19t дает инертный неиммуногенный маркер поверхности, который обеспечивает точное измерение генно-модифицированных клеток и делает возможными позитивную селекцию генно-модифицированных клеток, а также эффективное отслеживание и/или визуализацию терапевтических Т-клеток in vivo после адоптивного переноса. Коэкспрессия CD19t дает маркер иммунологического нацеливания трансдуцированных клеток in vivo с использованием клинически доступных антител и/или реактивов на основе иммунотоксинов для селективного удаления терапевтических клеток и, посредством этого, функционирования в качестве суицидного переключателя.

Глиомы экспрессируют рецепторы IL13 и, в частности, высокоаффинные рецепторы IL13. Однако, в отличие от рецептора IL13, глиомные клетки сверхэкспрессируют уникальную цепь IL13Rα2, способную к связыванию IL13 независимо от требования IL4Rβ или γс44. Подобно его гомологу - IL4, IL13 имеет плеотропную иммунорегуляторную активность вне ЦНС. И IL13, и IL4 стимулируют продукцию IgE В-лимфоцитами и подавляют продукцию провоспалительных цитокинов макрофагами.

Подробные исследования с использованием ауторадиографии с радиоактивно меченым IL13 продемонстрировали обильное связывание IL13 почти на всех исследованных злокачественных глиомных тканях. Это связывание является высокогомогенным в пределах срезов опухоли и при анализе одиночных клеток. Однако анализ с молекулярным зондом, специфичным в отношении мРНК IL13Rα2 не выявил экспрессии глиомоспецифичного рецептора элементами нормального мозга, и ауторадиография с радиоактивно меченым IL13 также не могла выявить специфичное связывание IL13 в нормальной ЦНС. Данные исследования свидетельствуют о том, что общий рецептор IL13Rα1/IL4β/γc не экспрессируется выявляемо в нормальной ЦНС. Следовательно, IL13Rα2 является очень специфичной мишенью поверхности клетки для глиомы и является подходящей мишенью для CAR, разработанных для лечения глиомы.

Связывание терапевтических молекул на основе IL13 с широко экспрессируемым рецепторным комплексом IL13Rα1/IL4β/γc, однако, имеет потенциал опосредования нежелательных токсичностей в нормальных тканях вне ЦНС, и, таким образом, ограничивает системное введение данных агентов. Замена аминокислоты - нативной глутаминовой кислоты на тирозин в альфа-спирали А IL13 в аминокислотном остатке 13 селективно уменьшает аффинность IL13 в отношении рецептора IL13Rα1/IL4β/γc. Связывание данного мутанта (названного IL13(E13Y)) с IL13Rα2, однако, увеличивается относительно IL13 дикого типа. Таким образом, данный минимально измененный аналог IL13 одновременно увеличивает специфичность и аффинность IL13 в отношении глиомных клеток. Следовательно, описанный в данном документе CAR включает IL13, содержащий мутацию (от Е до Y или от Е до некоторой другой аминокислоты, такой как K или R, или L, или V) в аминокислотном остатке 13 (согласно нумерации Debinski et al., 1999, Clin Cancer Res 5:3143s). Однако IL13, имеющий природную последовательность, также можно использовать, и он может быть полезным, особенно в ситуациях, когда модифицированные Т-клетки подлежат местному введению, как, например, посредством инъекции непосредственно в опухолевую массу.

CAR, описанный в данном документе, может быть получен любыми способами, известными в данной области, хотя предпочтительно его получают с использованием методик генной инженерии. Нуклеиновые кислоты, кодирующие несколько областей химерного рецептора, можно получать и собирать в полную кодирующую последовательность стандартными методиками молекулярного клонирования, известными в данной области (скрининг геномной библиотеки, ПЦР (полимеразная цепная реакция), лигирование с помощью праймеров, сайт-направленный мутагенез и т.д.), в зависимости от того, что является удобным. Образующаяся кодирующая область предпочтительно вставляется в экспрессионный вектор и используется для трансформации подходящей экспрессионной линии клетки-хозяина, предпочтительно линии клеток Т-лимфоцитов и наиболее предпочтительно аутологичной линии клеток Т-лимфоцитов.

Трансдуцировать вектором для экспрессии CAR можно разные поднаборы Т-клеток, выделенных из пациента, включая поднаборы не подвергавшихся селекции РВМС (одноядерные клетки периферической крови) или обогащенных CD3 Т-клеток, или обогащенных CD3 или Т-клеток памяти. Центральные Т-клетки памяти являются одним полезным поднабором Т-клеток. Центральные Т-клетки памяти могут быть выделены из одноядерных клеток периферической крови (РВМС) посредством селекции на клетки CD45RO+/CD62L+, используя, например, прибор CliniMACS® для иммуномагнитной селекции клеток, экспрессирующих желательные рецепторы. Клетки, обогащенные центральными Т-клетками памяти, можно активировать с использованием антител против CD3/CD28, трансдуцировать, например, лентивирусным вектором SIN, который управляет экспрессией IL13Rα2-специфичного CAR (например, IL13(EQ)BBζ), а также усеченного человеческого CD19 (CD19t), неиммуногенного маркера поверхности как для выявления in vivo, так и для потенциальной селекции ex vivo. Активированные/генетически модифицированные центральные Т-клетки памяти могут быть размножены in vitro с использованием IL-2/IL-15 и затем подвергнуты криоконсервации.

Пример 1: конструирование и структура IL13Rα2-специфичного CAR

Структура полезного IL13Rα2-специфичного CAR описывается ниже. Последовательность CAR с оптимизированными кодонами содержит связанный с мембраной лиганд - IL13, мутированный в одном сайте (E13Y) для уменьшения потенциального связывания с IL13Rα1, спейсер на основе Fc lgG4, содержащий две мутации (L235E; N297Q), которые значительно ослабляют модели распознавания, опосредованные рецептором Fc, трансмембранный домен CD4, костимулирующий цитоплазматический домен сигнализации 4-1ВВ и цитоплазматический домен сигнализации CD3ζ. Последовательность перескакивания рибосомы Т2А отделяет эту последовательность CAR IL13(EQ)BBζ от CD19t - инертного, неиммуногенного маркера поверхности клетки для выявления/селекции. Эта Т2А-связка приводит к координированной экспрессии и IL13(EQ)BBζ, и CD19t от одного транскрипта. Фиг. 1А представляет собой схематический рисунок открытой рамки считывания из 2670 нуклеотидов, кодирующей конструкцию IL13(EQ)BBZ-T2ACD19t. На этом рисунке показаны все: IL13Rα2-специфичный лиганд - IL13(E13Y), Fc lgG4(EQ), трансмембранный домен CD4, цитоплазматический домен сигнализации 4-1ВВ, трехглициновый линкер и цитоплазматический домен сигнализации CD3ζ CAR IL13(EQ)BBZ, а также последовательности перескакивания рибосомы Т2А и усеченного CD19. Также показаны сигнальные последовательности человеческого рецептора GM-CSF альфа и CD19, которые управляют поверхностной экспрессией CAR IL13(EQ)BBZ и CD19t. Таким образом, конструкция IL13(EQ)BBZ-T2ACD19t включает последовательность IL13Rα2-специфичного, оптимизированного в отношении шарнирной области, костимулирующего химерного иммунорецептора (обозначенного IL13(EQ)BBZ), последовательность перескакивания рибосомы Т2А и последовательность CD19t.

Последовательность IL13(EQ)BBZ получали посредством слияния лидерного пептида человеческого рецептора GM-CSF альфа с последовательностями лиганда IL13(E13Y), L235E/N2970-модифицированного шарнира Fc lgG4 (где двойная мутация препятствует распознаванию FcR), трансмембранного CD4, цитоплазматического домена сигнализации 4-1ВВ и цитоплазматического домена сигнализации CD3ζ. Данную последовательность синтезировали de novo после оптимизации кодонов. Последовательность Т2А получали в результате расщепления плазмиды, содержащей Т2А. Последовательность CD19t получали из последовательности, охватывающей последовательность лидерного пептида с трансмембранными компонентами (т.е. пары оснований 1-972) плазмиды, содержащей CD19. Все три фрагмента: 1) IL13(EQ)BBZ, 2) Т2А и 3) CD19t клонировали в сайт множественного клонирования лентивирусного вектора epHIV7. При трансфекции в подходящие клетки данный вектор интегрирует в геном клеток-хозяев последовательность, схематически показанную на Фиг. 1Б. На Фиг. 1В приведен схематический рисунок 9515 пар оснований самой плазмиды IL13(EQ)BBZ-T2A-CD19t_epHIV7.

Как схематически показано на Фиг. 2, CAR IL13(EQ)BBZ отличается в нескольких важных аспектах от описанного ранее IL13Rα2-специфичного CAR, названного IL13(E13Y)-зетакин (Brown et al. 2012 Clinical Cancer Research 18:2199). IL13(E13Y)-зетакин состоит из IL13Rα2-специфичного мутеина человеческого IL-13 (hulL-13(E13Y)), спейсера на основе Fc человеческого lgG4 (huy4Fc), трансмембранной части человеческого CD4 (huCD4 tm) и цитоплазматической части цепи человеческого CD3ζ (huCD3ζ cyt), как показано. В отличие от него, IL13(EQ)BBζ имеет две точечные мутации - L235E и N297Q, которые расположены в домене СН2 спейсера на основе lgG4, и костимулирующий цитоплазматический домен 4-1ВВ (4-1ВВ cyt).

Пример 2: конструирование и структура epHIV7, используемого для экспрессии IL13Rα2-специфичного CAR

Плазмида pHIV7 представляет собой родительскую плазмиду, из которой был получен клинический вектор IL13(EQ)BBZ-T2A-CD19t_epHIV7 в исследовательской лаборатории терапевтических средств на основе Т-клеток (TCTRL) в City of Норе (СОН). Вектор epHIV7, используемый для экспрессии CAR, получали из вектора pHIV7. Важно то, что в данном векторе для управления экспрессией CAR используется человеческий промотор EF1. И 5', и 3' последовательности данного вектора получали из pv653RSN, полученного из провируса НХВс2. Вытесняемые последовательности ДНК полипуринового участка (рРРТ) происходили из штамма pNL4-3 HIV-1 (вирус иммунодефицита человека-1) из репозитория реактивов СПИД (синдром приобретенного иммунодефицита человека) NIH (Национальный институт здравоохранения США). Последовательность посттранскрипционного регуляторного элемента лесного сурка (WPRE) была описана ранее.

Конструирование pHIV7 схематически показано на Фиг. 3. Вкратце, pv653RSN, содержащую 653 п.о. из gag-pol плюс 5' и 3' длинных концевых повторов (LTR) с находящимся между ними геном SL3-неомицинфосфотрансферазы (Neo), субклонировали в pBluesript следующим образом: на стадии 1 из последовательностей от 5' LTR до отвечающего элемента rev (RRE) создавали p5'HIV-1 51, и затем 5' LTR модифицировали посредством удаления последовательностей, расположенных выше ТАТА-бокса, и лигировали сначала с энхансером CMV (цитомегаловирус) и затем с репликатором SV40 (p5'HIV-2). На стадии 2 после клонирования 3' LTR в pBluesript с получением p3'HIV-1 делали делецию 400 п.о. в 3' LTR энхансера/промотора с удалением цис-регулирующих элементов в U3 HIV и образованием p3'HIV-2. На стадии 3 фрагменты, выделенные из p5'HIV-3 и p3'HIV-2, лигировали с получением pHIV-3. На стадии 4 p3'HIV-2 дополнительно модифицировали посредством удаления дополнительных, расположенных выше последовательностей HIV с получением p3'HIV-3, и к p3'HIV-3 добавляли фрагмент из 600 п.о. BamHI-Sall, содержащий WPRE, с получением p3'HIV-4. На стадии 5 уменьшали размер RRE pHIV-3 посредством ПЦР и лигировали с 5' фрагментом из pHIV-3 (не показано) и с p3'HIV-4 с получением pHIV-6. На стадии 6 фрагмент из 190 п.о. BgIII-BamHI, содержащий вытесняемую последовательность ДНК рРРТ из pNL4-3 (55) HIV-1, амплифицировали из pNL4-3 и размещали между последовательностями RRE и WPRE в pHIV6 с получением pHIV-7. Эту родительскую плазмиду pHIV7-GFP (GFP - зеленый флуоресцентный белок) использовали для упаковки родительского вектора с использованием четырехплазмидной системы.

Упаковочный сигнал - пси ψ - требуется для эффективной упаковки вирусного генома в вектор. RRE и WPRE усиливают транспорт РНК-транскрипта и экспрессию трансгена. Было продемонстрировано, что вытесняемая последовательность в комбинации с WPRE усиливает эффективность трансдукции лентивирусного вектора в клетках млекопитающих.

Хелперные функции, требующиеся для получения вирусного вектора, разделены на три отдельные плазмиды для уменьшения вероятности получения лентивируса, компетентного к репликации, посредством рекомбинации: 1) pCgp кодирует белок gag/pol, требующийся для сборки вирусного вектора; 2) pCMV-Rev2 кодирует белок Rev, который действует на последовательность RRE, помогая транспорту вирусного генома для эффективной упаковки и 3) pCMV-G кодирует гликопротеин вируса везикулостоматита (VSV), который требуется для инфективности вирусного вектора.

Имеется минимальная гомология последовательности ДНК между геномом вектора, кодируемого pHIV7, и хелперными плазмидами. Области гомологии включают область упаковочного сигнала из приблизительно 600 нуклеотидов, расположенную в последовательности gag/pol хелперной плазмиды pCgp; последовательность промотора CMV во всех трех хелперных плазмидах и последовательность RRE в хелперной плазмиде pCgp. Весьма маловероятно, что компетентный к репликации рекомбинантный вирус мог бы быть генерирован из-за гомологии в данных областях, так как потребовались бы многие события рекомбинации. Кроме того, у любых образующихся в результате рекомбинантов отсутствовали бы функциональные LTR и последовательности tat, требующиеся для репликации лентивируса.

Промотор CMV заменяли промотором EF1α-HTLV (EF1p), и новую плазмиду называли epHIV7 (Фиг. 4). EF1p имеет 563 п.о., и его вводили в epHIV7 с использованием Nrul и Nhel после вырезания промотора CMV.

Лентивирусный геном, исключая gag/pol и rev, которые необходимы для патогенности вируса дикого типа и требуются для продуктивной инфекции клеток-мишеней, удаляли из данной системы. Кроме того, конструкция вектора IL13(EQ)BBZ-T2ACD19t_epHIV7 не содержит интактный промотор 3'LTR, таким образом, образующийся экспрессируемый и подвергающийся обратной транскрипции в клетках-мишенях провирусный геном на основе ДНК будет иметь неактивные LTR. В результате этой конструкции из провируса не будут транскрибироваться последовательности, происходящие из HIV-I, и от их соответствующих промоторов будут экспрессироваться только терапевтические последовательности. Ожидается, что удаление активности промотора LTR в векторе SIN значительно уменьшает вероятность ненамеренной активации генов хозяина (56). В Таблице 4 обобщены разные регуляторные элементы, присутствующие в IL13(EQ)BBZ-T2ACD19t_epHIV7.

Пример 3: получение векторов для трансдукции Т-клеток пациента

Для каждой плазмиды (IL13(EQ)BBZ-T2A-CD19t_epHIV7, pCgp, pCMV-G и pCMV-Rev2) генерируется семенной банк, который используется для инокуляции ферментера для продукции достаточных количеств плазмидной ДНК. Плазмидную ДНК тестируют на идентичность, стерильность и уровень эндотоксинов до ее применения в продуцировании лентивирусного вектора.

Вкратце, клетки размножали от рабочей клетки 293Т (WCB), которая была протестирована на соответствие стерильности и отсутствию вирусного загрязнения. Флакон с клетками 293Т из WCB 293Т оттаивали. Клетки выращивали и размножали до тех пор, пока не образовалось достаточное число клеток для посева в подходящее число 10-слойных клеточных фабрик (CF) для продукции вектора и поддержания линии клеток. Для продукции можно использовать одну линию клеток.

Лентивирусный вектор продуцировали в подпартиях вплоть до 10 CF. В ту же самую неделю можно продуцировать две подпартии, что приводит к продукции приблизительно 20 л лентивирусного супернатанта/неделю. Материал, продуцированный из всех подпартий, объединяли во время фазы последующей переработки для того, чтобы получить одну партию продукта. Клетки 293Т высевали в CF в среду 293Т (DMEM (среда Игла, модифицированная по Дульбеко) с 10% FBS (фетальная телячья сыворотка)). Фабрики помещали в инкубатор при 37°C и выравнивали горизонтально для того, чтобы получать равномерное распределение клеток на всех слоях CF. Через двое суток клетки трансфицировали четырьмя лентивирусными плазмидами, описанными выше, с использованием способа с CaPO₄, который включает смесь Tris:EDTA, 2М CaCl₂, 2×HBS и четырех ДНК-плазмид. В сутки 3 после трансфекции собирали супернатант, содержащий секретированные лентивирусные векторы, очищали и концентрировали. После удаления супернатанта из CF из каждой CF отбирали клетки конечной продукции. Клетки из каждой фабрики трипсинизировали и собирали центрифугированием. Клетки ресуспендировали в среде для замораживания и криоконсервировали. Данные клетки позднее использовали для тестирования лентивируса, компетентного в отношении репликации (RCL).

Для очистки и приготовления векторов неочищенный супернатант осветляли фильтрованием через мембрану для удаления клеточных обломков. ДНК клетки-хозяина и остаточную плазмидную ДНК деградировали эндонуклеазным расщеплением (Benzonase®). Вирусный супернатант осветляли от клеточных обломков с использованием 0,45 мкм фильтра. Осветленный супернатант собирали в предварительно взвешенный контейнер, в который добавляли Benzonase® (конечная концентрация 50 U (единиц)/мл). Эндонуклеазное расщепление остаточной плазмидной ДНК и геномной ДНК хозяина проводится при 37°C в течение 6 ч. Для удаления из неочищенного супернатанта остаточных низкомолекулярных компонентов использовали концентрирование обработанного эндонуклеазой супернатанта с использованием исходной ультрафильтрации с тангенциальным потоком (TFF), концентрируя вирус ~ в 20 раз. Осветленный вирусный супернатант, обработанный эндонуклеазой, циркулировал через картридж на основе полых волокон с порогом отсечения молекулярной массы 500 кДа, и скорость тока продумывали так, чтобы поддерживать скорость сдвига ~4000 с^-1 или менее при максимизации скорости тока. Диафильтрацию супернатанта, обработанного нуклеазой, инициировали во время процесса концентрирования для поддержания эффективности работы картриджа. Устанавливали скорость замены пермеата 80% с использованием 4% лактозы в PBS (фосфатно-солевой буферный раствор) в качестве диафильтрационного буфера. Вирусный супернатант доводили до намеченного объема, обеспечивая 20-кратное концентрирование неочищенного супернатанта, и диафильтрацию продолжали с использованием 4 дополнительных замен объемов со скоростью замены пермеата 100%.

Дополнительное концентрирование вирусного продукта осуществляли с использованием методики высокоскоростного центрифугирования. Каждую подпартию лентивируса осаждали с использованием центрифуги Sorvall RC-26 plus при 6000 об/мин (RCF 6088) при 60°C в течение 16-20 ч. Вирусный осадок из каждой подпартии затем растворяли в объеме 50 мл с использованием 4% лактозы в PBS. Растворенный в данном буфере осадок представляет собой конечную композицию препарата вируса. Весь способ концентрирования вектора приводил приблизительно к 200-кратному уменьшению объема. После завершения получения всех подпартий материал затем помещали при -80°C, в то время как образцы из каждой подпартии тестировали на стерильность. После подтверждения стерильности образцов подпартии быстро оттаивали при 37°C с частым встряхиванием. Данный материал затем объединяли и вручную делили на аликвоты в боксе микробиологической безопасности класса II типа А/В3 в кабинете для получения вирусных векторов. Использовали конфигурацию заполнения 1 мл концентрированного лентивируса в стерильных криофлаконах класса 6 USP (фармакопея Соединенных Штатов) с наружной резьбой и О-кольцом. Системы контроля качества (QS) Центра разработки прикладных технологий (CATD) в СОН выпускали все материалы согласно политике и стандартному регламенту работы для CBG и в соответствии с современной надлежащей производственной практикой (cGMP).

Для обеспечения чистоты препарата лентивирусного вектора его тестировали на остаточные загрязнения ДНК хозяина и перенос остаточной ДНК хозяина и плазмиды. Среди других анализов идентичность вектора оценивали посредством ПЦР-ОТ (полимеразная цепная реакция с обратной транскриптазой) для того, чтобы убедиться, что присутствует правильный вектор. Для вектора, предназначенного для применения в данном исследовании, удовлетворяются все критерии выпуска.

Пример 4: получение Т-клеток, подходящих для применения в ACT

Т-лимфоциты получают от пациента посредством лейкафереза, и подходящий поднабор аллогенных или аутологических Т-клеток, например, центральных Т-клеток памяти (T_CM), генетически изменяют для экспрессии CAR, затем вводят обратно пациенту любым клинически приемлемым способом для осуществления противораковой терапии.

Краткий обзор стратегии изготовления T_CM проиллюстрирован на Фиг. 8 (схема изготовления IL13(EQ)BBζ/CD19t+T_CM). В частности, продукты афереза, полученные от участников исследования, подписавших информированное согласие, разделяли на фиколе, промывали и инкубировали в течение ночи. Затем клетки обедняли популяциями моноцитов, регуляторных Т-клеток и наивных Т-клеток с использованием реактивов на основе антитела против CD14, антитела против CD25 и антитела против CD45RA уровня качества GMP (Miltenyi Biotec) и прибора для разделения CliniMACS™. После обеднения негативные фракции клеток обогащаются в отношении клеток T_CM CD62L+ с использованием DREG56-биотина (клинический уровень качества СОН) и микрошариков против биотина (Miltenyi Biotec) на приборе для разделения CliniMACSTM.

После обогащения клетки T_CM готовят в виде препарата в полной X-Vivo15 плюс 50 IU (Международные единицы)/мл IL-2 и 0,5 нг/мл IL-15 и переносят в тефлоновый мешок для культуры клеток, где они стимулируются шариками Dynal ClinEx™ Vivo CD3/CD28. Вплоть до пяти суток после стимулирования клетки трансдуцируются лентивирусным вектором IL13(EQ)BBZ-T2A-CD19t_epHIV7 при множественности инфекции (MOI) от 1,0 до 0,3. Культуры поддерживаются в течение вплоть до 42 суток с добавлением полной X-Vivo15 и цитокина IL-2 и IL-15 по мере необходимости для размножения клеток (поддерживая плотность клеток от 3×10⁵ до 2×10⁶ жизнеспособных клеток/мл) и дополнением цитокинами каждый понедельник, среду и пятницу культуры). При данных условиях клетки типично размножаются до приблизительно 10⁹ клеток в пределах 21 суток. В конце периода культивирования клетки отбирают, дважды промывают и готовят в криоконсервирующей среде клинического уровня качества (Cryostore CS5, BioLife Solutions).

В сутки инфузии Т-клеток криоконсервированный и высвобожденный продукт оттаивают, промывают и готовят для повторной инфузии. Криоконсервированные флаконы, содержащие высвобожденный клеточный продукт, удаляют из хранилища с жидким азотом, оттаивают, охлаждают и промывают промывочным буфером на основе PBS/2%-ного человеческого сывороточного альбумина (HSA). После центрифугирования супернатант удаляется и клетки ресуспендируются в инфузионном разбавителе на основе нормального физиологического раствора, не содержащего консерванты (PFNS)/2% HSA. Образцы удаляются для тестирования для контроля качества.

Два квалификационных прогона на клетках, полученных от здоровых доноров, осуществляли с использованием производственной платформы, описанной выше. Каждому продукту доклинического квалификационного прогона присваивали номер донора-человека (HD) - HD006.5 и HD187.1. Важно то, что как показано в Таблице 5, данные клетки квалификационных прогонов размножались более чем 80 раз в пределах 28 суток, и размноженные клетки экспрессировали трансгены IL13(EQ)BBγ/CD19t.

Пример 5: анализ экспрессии трансгена поверхности и маркера Т-клеток в IL13(EQ)BBy/CD19t+T_CM посредством проточной цитометрии

В доклинических исследованиях использовали продукты двух доклинических квалификационных прогонов, описанные в Примере 4, как описано ниже. На Фиг. 6А-В показаны результаты анализа экспрессии трансгена поверхности и маркера Т-клеток посредством проточной цитометрии. IL13(EQ)BBγ/CD19t+T_CM HD006.5 и HD187.1 совместно окрашивали антителом против IL13-PE и антителом против CD8-FITC для выявления клеток CD8+ CAR+ и CD4+ (т.е. CD8-негативных) CAR+ (Фиг. 6А), или антителом против CD19-PE и антителом против CD4-FITC для выявления клеток CD4+ CD19t+ и CD8+ (т.е. CD4-негативных) CAR+ (Фиг. 6Б). IL13(EQ)BBγ/CD19t+T_CM HD006.5 и HD187.1 окрашивали антителами против CD3, TCR, CD4, CD8, CD62L и CD28, конъюгированными с флуорохромом (серые гистограммы), или изотипическими контролями (черные гистограммы). (Фиг. 6В). На каждой из Фиг. 6А-В указанные процентные доли основаны на жизнеспособных лимфоцитах (негативных в отношении DAPI), которые окрашивались сильнее, чем изотипический контроль.

Пример 6: Эффекторная активность IL13(EQ)BBγ/CD19t+T_CM

Оценивали эффекторную активность IL13(EQ)BBγ/CD19t+T_CM, и результаты данного анализа показаны на Фиг. 7А-Б. Вкратце, IL13(EQ)BBγ/CD19t+T_CM HD006.5 и HD187.1 использовали в качестве эффекторов в 6-часовом анализе высвобождения ⁵¹Cr с использованием соотношения 10Е:1Т на основе экспрессии CD19t. IL13Rα2-позитивными опухолями-мишенями были К562, генетически модифицированная для экспрессии IL13Rα2 (K562-IL13Rα2), и линия первичной глиомы РВТ030-2, а IL13Rα2-негативной контрольной опухолью-мишенью была родительская линия К562 (Фиг. 7А). IL13(EQ)BBγ/CD19t+HD006.5 и HD187.1 оценивали на антигензависимую продукцию цитокинов после совместной культуры в течение ночи при соотношении 10Е:1Т с использованием таких же IL13Rα2-позитивных и негативных мишеней, как описано выше. Уровни цитокинов измеряли с использованием набора для анализа Bio-Plex Pro Human Cytokine TH1/TH2, и показаны уровни IFN-γ (Фиг. 7Б).

Пример 7: противоопухолевая активность IL13(EQ)BBγ/CD19t+T_CM in vivo

Описанные ниже исследования демонстрируют то, что IL13(EQ)BBγ/CD19t+T_CM показывают противоопухолевую эффективность в мышиных моделях in vivo. В частности, авторы изобретения оценили противоопухолевую эффективность IL13(EQ)BBγ/CD19t+T_CM относительно линии РВТ030-2 IL13Rα2+ сфер первичной глиобластомной опухоли с малым числом пассажей, которую генетически модифицировали для экспрессии репортерных генов: и EGFP (усиленный зеленый флуоресцентный белок), и люциферазы светляка (ffLuc) (РВТ030-2 EGFP:ffLuc) (6). Ряд первичных линий (РВТ) из образцов глиобластомы пациента выращивали в виде сфер опухоли (TSs) в бессывороточных средах. Данные размноженные линии TS демонстрируют характеристики, подобные стволовым клеткам, включающие экспрессию маркеров стволовых клеток, многолинейную дифференциацию и способность к инициации ортотопических опухолей у иммунодефицитных мышй (NSG) при малом числе клеток. Модель TS-инициированного ксенотрансплантата РВТ030-2 EGFP:ffLuc (0,1×10⁶ клеток; 5 суток после приживления) ранее использовали для оценки противоопухолевой активности in vivo Т-клеток, экспрессирующих IL13Rα2-специфичный CAR, у мышей NSG, при этом было показано, что три инъекции 2×10⁶ цитолитических Т-лимфоцитов (CTL) на протяжении 2 недель уменьшают рост опухоли. Однако в данных экспериментах большинство опухолей РВТ030-2 в конечном счете давали рецидив. По сравнению с этим однократная инъекция IL13(EQ)BBγ/CD19t+T_CM (1,1×10⁶ CAR+ T_CM; общее число TCM 2×10⁶) демонстрировала надежную противоопухолевую активность против TS-инициированных опухолей РВТ030-2 EGFP:ffLuc (0,1×10⁶ клеток; 5 суток после приживления), как показано на Фиг. 8А-В. По сравнению с мышами NSG, обработанными либо PBS, либо TCM с имитацией трансдукции (без CAR), IL13(EQ)BBγ/CD19t+ T_CM значимо уменьшают поток ffLuc (р меньше 0,001 в моменты времени больше, чем 18 суток) и значительно улучшают выживание (р равно 0,0008).

Вкратце, опухолевые клетки EGFP-ffLuc+РВТ030-2 (1×10⁵) стереотактически имплантировали в правую часть переднего мозга мышей NSG. В сутки 5 мыши получали либо 2×10⁶ IL13(EQ)BBζ/CD19t+ T_CM (1,1×10⁶ CAR+; n равно 6), либо 2×10⁶ имитации трансдукции TCM (без CAR; n равно 6), либо PBS (фосфатно-солевой буферный раствор) (n равно 6). На Фиг. 8А показаны репрезентативные мыши из каждой группы, демонстрирующие относительную опухолевую нагрузку с использованием Xenogen Living Image. Количественное измерение потока ffLuc (фотоны/с) показывает то, что IL13(EQ)BBζ/CD19t+ T_CM индуцируют регрессию опухоли по сравнению с TCM с имитацией трансдукции и с PBS (#р меньше 0,02; *р меньше 0,001, ANOVA с повторными измерениями) (Фиг. 8Б). Как показано на Фиг. 8В, кривая выживания Каплана-Мейера (n равно 6 на группу) демонстрирует значимо улучшенное выживание (р равно 0,0008; логранговый критерий) для мышей, обработанных IL13(EQ)BBγ/CD19t+ T_CM.

Пример 8: сравнение клонов CTL IL13(EQ)BBζ+ T_CM и не T_CM IL13-зетакин CD8+ по противоопухолевой эффективности и стойкости Т-клеток

В исследованиях, описанных ниже, сравниваются IL13(EQ)BBζ+ T_CM и созданные ранее IL13Rα2-специфичные человеческие CTL CD8+ (CTL IL13-зетакин CD8+ (описанные в Brown et al. 2012 Clin Cancer Res 18:2199 и Kahlon et al. 2004 Cancer Res 64:9160). В IL13-зетакин используется стимулирующий домен CD3ζ, отсутствует костимулирующий домен и используется тот же самый вариант IL13, что и в IL13(EQ)BBζ+.

Получали ряд первичных линий (РВТ) из образцов глиобластомы пациента, выращенных в виде сфер опухолей (TSs) в бессывороточных средах (Brown et al. 2012 Clin Cancer Res 18:2199; Brown et al. 2009 Cancer Res 69:8886). Данные размноженные линии TS демонстрируют характеристики, подобные стволовым клеткам, включающие экспрессию маркеров стволовых клеток, многолинейную дифференциацию и способность к инициации ортотопических опухолей у иммунодефицитных мышей (NSG) при малом числе клеток. Для экспериментов, описанных ниже, использовали IL13Rα2+ линию TS первичной глиобластомы с малым числом пассажей РВТ030-2, которая была генетически модифицирована для экспрессии репортерных генов: и EGFP, и люциферазы светляка (ffLuc) (РВТ030-2 EGFP:ffLuc) (Brown et al. 2012 Clin Cancer Res 18:2199).

Сначала сравнивали одну дозу (1×10⁶ Т-клеток CAR) продукта IL13(EQ)BBζ+T_CM с клонами CTL IL13-зетакин CD8+, оцениваемыми относительно TS-инициированных ксенотрансплантатов РВТ030-2 EGFP:ffLuc в сутки 8 (0,1×10⁶ клеток). В то время как и Т-клетки с IL13Rα2-специфичным CAR (CTL с IL13-зетакин и IL13(EQ)BBζ+ T_CM) демонстрировали противоопухолевую активность против прижившихся опухолей РВТ030-2 по сравнению с необработанным контролем или контролем в виде T_CM с имитацией трансдукции (CAR-негативным) (Фиг. 9А и 9Б), IL13(EQ)BBZ+ T_CM опосредовали значимо улучшенное выживание и надежную ремиссию опухоли с мышами, живущими больше 150 суток, по сравнению с первым поколением клонов CTL IL13-зетакин CD8+ авторов изобретения (Фиг. 9В).

Для дальнейшего сравнения терапевтических эффективностей данных двух Т-клеточных продуктов IL13Rα2-CAR осуществляли титрование дозы - 1,0, 0,3 и 0,1×10⁶ Т-клеток с CAR относительно TS-инициированных опухолей РВТ030-2 EGFP:ffLuc в сутки 8 (Фиг. 10А-В). Наивысшая доза (1×10⁶) клона 2D7 CTL IL13-зетакин CD8+ опосредовала противоопухолевые ответы при измерении потока посредством Xenogen у 3 из 6 животных (Фиг. 10В), но при меньших дозах Т-клеток с CAR не наблюдали значимых противоопухолевых ответов. По сравнению с этим, инъекция продукта IL13(EQ)BBζ+T_CM опосредовала полную регрессию опухоли у большинства мышей при всех уровнях дозы, включая обработку всего лишь 0,1×10⁶ Т-клеток с CAR. Эти данные демонстрируют то, что IL13(EQ)BBζ+T_CM являются по меньшей мере в 10 раз более эффективными по противоопухолевой эффективности, чем клоны CTL IL13-зетакин CD8+. Улучшенная противоопухолевая эффективность обусловлена улучшенной стойкостью Т-клеток в микроокружении опухоли. Оценка Т-клеток CD3+ через 7 суток после в.ч. инъекции выявила значимое число IL13(EQ)BBζ+T_CM в микроокружении опухоли, тогда как присутствовало очень мало CTL первого поколения IL13-зета (Фиг. 11).

Пример 9: сравнение пути доставки Т-клеток с CAR для лечения больших, РВТ опухолей, инициированных TS

Ниже описаны исследования, в которых сравнивается влияние пути доставки - внутривенного (в.в.) или внутричерепного (в.ч.) - на противоопухолевую активность против линий инвазивных первичных РВТ. В пилотных исследованиях (данные не показаны) неожиданно наблюдали то, что в.в. введенные IL13(EQ)BBζ+Tcm не давали терапевтической пользы по сравнению с PBS для лечения маленьких (сутки 5) опухолей РВТ030-2 EGFP:ffLuc. Это отличается от надежной терапевтической эффективности, наблюдаемой с в.ч. введенными Т-клетками CAR+. Обоснованием является то, что в сутки 5 опухоли РВТ030-2 возможно были слишком маленькими для рекрутирования терапевтических Т-клеток с периферии - делали сравнение в.в. относительно в.ч. доставки против больших опухолей РВТ030-2 EGFP:ffLuc в сутки 19. Для этих исследований мышей с прижившимися РВТ030-2 обрабатывали либо двумя в.в. инфузиями (5×10⁶ CAR+ T_CM; сутки 19 и 26), либо четырьмя в.ч. инфузиями (1×10⁶ CAR+T_CM; сутки 19, 22, 26 и 29) IL13(EQ)BBZ+T_CM, или T_CM с имитацией трансдукции (без CAR). Здесь также не отслеживали терапевтической пользы посредством визуализации Xenogen или анализом выживания Каплана-Мейера в отношении в.в. введенных Т-клеток CAR+(Фиг. 12А и 12Б). В отличие от этого, для в.ч. введенных IL13(EQ)BBζ+ T_CM наблюдали мощную противоопухолевую активность (Фиг. 12А-Б). Затем отбирали мозги из когорты мышей 7 суток после инъекции Т-клеток и оценивали на человеческие клетки CD3+ посредством IHC. Неожиданно, для мышей, обработанных в.в. либо TCM с имитацией трансдукции, либо IL13(EQ)BBζ+T_CM, в опухоли или в других областях мозга мыши, где типично находятся человеческие Т-клетки (т.е. мягкая и паутинная оболочки мозга), не было выявляемых человеческих Т-клеток CD3+ (Фиг. 12В), свидетельствуя о недостатке в тропизме в опухоль. Это отличается от значительного числа Т-клеток, выявленного у мышей, обработанных в.ч. (Фиг. 12Г).

Цитокины, происходящие из опухоли, в частности, MCP-1/CCL2, являются важными в рекрутировании Т-клеток в опухоль. Таким образом, оценивали клетки опухоли РВТ030-2, и обнаружили, что данная линия продуцирует высокие уровни MCP-1/CCL2, сравнимые с клетками U251T (данные не показаны) - линией глиомы, для которой ранее было показано, что она привлекает в.в. введенные эффекторные Т-клетки CD8+к в.ч. прижившимся опухолям. Злокачественные глиомы представляют собой высокоинвазивные опухоли и часто являются множественными по проявлению. В исследованиях, описанных выше, установлено то, что IL13BBZ Т_СМ могут устранять инфильтрующие опухоли, такие как РВТ030-2, и опосредовать долговременную надежную противоопухолевую активность. Также проверили способность Т-клеток с CAR, доставленных внутричерепно, к транспорту в многоочаговое заболевание. Для этого исследования РВТ030-2 EGFP:ffLuc TSs имплантировали как в левое, так и в правое полушария (Фиг. 13А), и Т-клетки CAR+ инъецировали только сайт правой опухоли. Ободряющим было то, что для всех оцененных мышей (n равно 3) авторы изобретения выявили Т-клетки посредством IHC против CD3 через 7 суток после инфузии Т-клеток как в месте инфекции (т.е. в правой опухоли), так и в опухоли на левом полушарии (Фиг. 13Б). Эти данные дают доказательство того, что Т-клетки CAR+ способны транспортироваться к и инфильтровать очаги опухоли в удаленных сайтах. Аналогичные данные также наблюдали во второй модели опухоли с использованием линии клеток глиомы U251T (данные не показаны).

Пример 10: сравнение костимулирующих доменов

Провели ряд исследований для оценки разных костимулирующих доменов. Разные оцененные CAR схематически описаны на Фиг. 14А и включали CAR первого поколения CD3ζ, не имеющий костимулирующего домена, два CAR второго поколения, включающие либо костимулирующий домен 4-1ВВ, либо костимулирующий домен CD28, и CAR третьего поколения, содержащий и костимулирующий домен CD28, и костимулирующий домен 4-1ВВ. Все конструкции CAR также содержат последовательность перескакивания рибосомы Т2А и последовательность усеченного CD19 (CD19t) в качестве маркера трансдуцированных клеток.

Т_СМ CD4 и CD8 лентивирусно трансдуцировали, и Т-клетки, экспрессирующие CAR, иммуномагнитно обогащали посредством антитела против CD19. Уровни экспрессии CD19 и IL13 (т.е. CAR) измеряются посредством проточной цитометрии. Результаты показаны на Фиг. 14Б. Стабильность каждой конструкции CAR определяли путем деления средней интенсивности флуоресценции (MFI) CAR (IL13) на MFI маркера трансдукции (CD19t) (Фиг. 14В). Два CAR, включающие костимулирующий домен 4-1ВВ, демонстрировали наименьшие уровни экспрессии по сравнению с маркером трансдукции CD19t.

Способность указанных Т-клеток с имитацией трансдукции или экспрессирующих CAR умерщвлять опухолевые клетки-мишени РВТ030-2, экспрессирующие IL13Rα2, определяли в 4-часовом анализе высвобождения ⁵¹Cr при указанных соотношениях эффектор : мишень. Результаты данного исследования представлены на Фиг. 15А (показан средний % высвобождения хрома плюс/минус S.D. от лунок в тройной повторности). Как и ожидалось, Т-клетки с имитацией трансдукции не лизировали мишени эффективно. В отличие от этого, все Т-клетки, экспрессирующие CAR, лизировали опухолевые клетки аналогичным образом. На Фиг. 15Б показаны результаты исследования, в котором указанные Т-клетки с имитацией трансдукции или экспрессирующие CAR сокультивировали в течение ночи с опухолевыми клетками РВТ030-2, экспрессирующими IL13Rα2, в соотношении 10:1, и супернатанты анализировали на уровни IL-13 и IFN-γ посредством цитометрического анализа с использованием шариков. Интересно то, что Т-клетки, экспрессирующие CAR зета, 41ВВ-зета или CD28-41ВВ-зета, демонстрировали меньшую стимулированную антигеном продукцию цитокинов, чем Т-клетки, экспрессирующие CAR СР28-зета.

Эффективность in vivo разных CAR проверяли следующим образом. Вкратце, мыши NSG получали внутричерепную инъекцию опухолевых клеток ffLuc+РВТ030-2 в сутки 0 и были рандомизированы на 6 групп (n равно 9-10 мышей на группу) для в.ч. обработки либо PBS (только опухоль), либо Т-клетками с имитацией трансдукции, либо Т-клетками, экспрессирующими указанный IL13Ra2-специфичный CAR, в сутки 8. Затем проводили количественную биолюминесцентную визуализацию для отслеживания роста опухоли с течением времени. Биолюминесцентные изображения для репрезентативных мышей в каждой группе (Фиг. 16А). Уровни потока для каждой мыши в сутки 27 (Фиг. 16Б). Все группы, обработанные Т-клетками с IL13Rα2-специфичными CAR, за исключением группы, обработанной Т-клетками, экспрессирующими CD28-CAR, демонстрируют статистически значимое уменьшение объема опухоли по сравнению с мышами, обработанными Т-клетками с имитацией трансдукции (Фиг. 16В).

Пример 11: аминокислотная последовательность IL13(EQ)BBζ/CD19t

Полная аминокислотная последовательность IL13(EQ)BBζ/CD19t показана на Фиг. 17. Полная последовательность (SEQ ID NO:1) включает: сигнальный пептид GMCSF из 22 аминокислот (SEQ ID NO:2), последовательность IL-13 из 112 аминокислот (SEQ ID NO:3, замена аминокислоты E13Y показана жирным шрифтом); последовательность lgG4 из 229 аминокислот (SEQ ID NO:4, с заменами аминокислот L235E и N297Q, показанными жирным шрифтом), трансмембранную последовательность CD4 из 22 аминокислот (SEQ ID NO:5), последовательность 4-1ВВ из 42 аминокислот (SEQ ID NO:6), 3-аминокислотный Gly линкер; последовательность CD3ζ из 112 аминокислот (SEQ ID NO:7), последовательность Т2А из 24 аминокислот (SEQ ID NO:8) и последовательность CD19t из 323 аминокислот (SEQ ID NO:9).

Последовательность зрелого химерного антигенного рецептора (SEQ ID NO:10) включает: последовательность IL-13 из 112 аминокислот (SEQ ID NO:3, замена аминокислоты E13Y показана жирным шрифтом); последовательность lgG4 из 229 аминокислот (SEQ ID NO:4, с заменами аминокислот L235E и N297Q, показанными жирным шрифтом), последовательность CD4 из 22 аминокислот (SEQ ID NO:5), последовательность 4-1ВВ из 42 аминокислот (SEQ ID NO:6), 3-аминокислотный Gly линкер и последовательность CD3ζ, из 112 аминокислот (SEQ ID NO:7). В пределах данной последовательности CAR (SEQ ID NO:10) присутствует последовательность IL-13/lgG4/CD4t/41-BB (SEQ ID NO:11), которая включает: последовательность IL-13 из 112 аминокислот (SEQ ID NO:3, замена аминокислоты E13Y показана жирным шрифтом); последовательность lgG4 из 229 аминокислот (SEQ ID NO:4, с заменами аминокислот L235E и N297Q, показанными жирным шрифтом), последовательность CD4 из 22 аминокислот (SEQ ID NO:5) и последовательность 4-1ВВ из 42 аминокислот (SEQ ID NO:6). Последовательность IL-13/lgG4/CD4t/4-1BB (SEQ ID NO:11) может быть соединена с последовательностью CD3ζ из 112 аминокислот (SEQ ID NO:7) посредством линкера, такого как GlyGlyGly линкер. Последовательности CAR (SEQ ID NO:10) может предшествовать сигнальный пептид GMCSF из 22 аминокислот (SEQ ID NO:2).

На Фиг. 18 показано сравнение последовательностей IL13(EQ)41BBζ[IL13{EQ}41BBζ T2A-CD19t_epHIV7; pF02630] (SEQ ID NO:12) и CD19Rop_epHIV7 (pJ01683) (SEQ ID NO:13).

Пример 12: аминокислотная последовательность IL13(EQ)BBζ/CD19t

На Фиг. 19-26 показаны аминокислотные последовательности дополнительных CAR, направленных против IL13Rα2, в каждом случае отмечены разные домены, за исключением спейсера GlyGlyGly, расположенного между определенными внутриклеточными доменами. Каждый включает человеческий IL13 с заменой Glu до Туr (SEQ ID NO:3, показанная замена аминокислоты E13Y выделена). В экспрессионном векторе, используемом для экспрессии данных CAR, экспресируемая аминокислотная последовательность может включать последовательность Т2А из 24 аминокислот (SEQ ID NO:8); и последовательность CD19t из 323 аминокислот (SEQ ID NO:9) для обеспечения координированной экспрессии последовательности усеченного CD19 на поверхности клеток, экспрессирующих CAR.

Ряд CAR, содержащих домен в виде человеческого IL13(E13Y), домен в виде CD28 tm, костимулирующий домен CD28gg, костимулирующий домен 4-1ВВ и домен в виде CD3ζ, в качестве остова CAR, и включающих либо спейсер HL (22 аминокислоты), спейсер в виде шарнира CD8 (48 аминокислот), спейсер в виде lgG4-HL-CH3 (129 аминокислот) или спейсер в виде lgG4(EQ) (229 аминокислот), тестировали на их способность опосредовать IL13Rα2-специфичное умерщвление при оценке в 72-часовом анализе сокультуры. За исключением HL (22 аминокислоты), который, по-видимому, давал плохую экспрессию CAR в данной системе, все были активны.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> CITY OF HOPE

<120> Т-КЛЕТКИ С КОСТИМУЛИРУЮЩИМ ХИМЕРНЫМ АНТИГЕННЫМ РЕЦЕПТОРОМ, НАЦЕЛЕННЫЕ

НА IL13R(альфа)2

<130> 40056-0002WO1

<140> PCT/US2015/051089

<141> 2015-09-18

<150> 62/053,068

<151> 2014-09-19

<160> 54

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 889

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид"

<400> 1

Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro

1 5 10 15

Ala Phe Leu Leu Ile Pro Gly Pro Val Pro Pro Ser Thr Ala Leu Arg

20 25 30

Tyr Leu Ile Glu Glu Leu Val Asn Ile Thr Gln Asn Gln Lys Ala Pro

35 40 45

Leu Cys Asn Gly Ser Met Val Trp Ser Ile Asn Leu Thr Ala Gly Met

50 55 60

Tyr Cys Ala Ala Leu Glu Ser Leu Ile Asn Val Ser Gly Cys Ser Ala

65 70 75 80

Ile Glu Lys Thr Gln Arg Met Leu Ser Gly Phe Cys Pro His Lys Val

85 90 95

Ser Ala Gly Gln Phe Ser Ser Leu His Val Arg Asp Thr Lys Ile Glu

100 105 110

Val Ala Gln Phe Val Lys Asp Leu Leu Leu His Leu Lys Lys Leu Phe

115 120 125

Arg Glu Gly Arg Phe Asn Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro

130 135 140

Cys Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro

145 150 155 160

Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr

165 170 175

Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn

180 185 190

Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg

195 200 205

Glu Glu Gln Phe Gln Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val

210 215 220

Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser

225 230 235 240

Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys

245 250 255

Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu

260 265 270

Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe

275 280 285

Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu

290 295 300

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe

305 310 315 320

Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly

325 330 335

Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr

340 345 350

Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Met Ala Leu Ile Val

355 360 365

Leu Gly Gly Val Ala Gly Leu Leu Leu Phe Ile Gly Leu Gly Ile Phe

370 375 380

Phe Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe

385 390 395 400

Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg

405 410 415

Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Gly Gly Gly Arg Val

420 425 430

Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn

435 440 445

Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val

450 455 460

Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg

465 470 475 480

Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys

485 490 495

Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg

500 505 510

Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys

515 520 525

Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Leu Glu

530 535 540

Gly Gly Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu

545 550 555 560

Glu Asn Pro Gly Pro Arg Met Pro Pro Pro Arg Leu Leu Phe Phe Leu

565 570 575

Leu Phe Leu Thr Pro Met Glu Val Arg Pro Glu Glu Pro Leu Val Val

580 585 590

Lys Val Glu Glu Gly Asp Asn Ala Val Leu Gln Cys Leu Lys Gly Thr

595 600 605

Ser Asp Gly Pro Thr Gln Gln Leu Thr Trp Ser Arg Glu Ser Pro Leu

610 615 620

Lys Pro Phe Leu Lys Leu Ser Leu Gly Leu Pro Gly Leu Gly Ile His

625 630 635 640

Met Arg Pro Leu Ala Ile Trp Leu Phe Ile Phe Asn Val Ser Gln Gln

645 650 655

Met Gly Gly Phe Tyr Leu Cys Gln Pro Gly Pro Pro Ser Glu Lys Ala

660 665 670

Trp Gln Pro Gly Trp Thr Val Asn Val Glu Gly Ser Gly Glu Leu Phe

675 680 685

Arg Trp Asn Val Ser Asp Leu Gly Gly Leu Gly Cys Gly Leu Lys Asn

690 695 700

Arg Ser Ser Glu Gly Pro Ser Ser Pro Ser Gly Lys Leu Met Ser Pro

705 710 715 720

Lys Leu Tyr Val Trp Ala Lys Asp Arg Pro Glu Ile Trp Glu Gly Glu

725 730 735

Pro Pro Cys Val Pro Pro Arg Asp Ser Leu Asn Gln Ser Leu Ser Gln

740 745 750

Asp Leu Thr Met Ala Pro Gly Ser Thr Leu Trp Leu Ser Cys Gly Val

755 760 765

Pro Pro Asp Ser Val Ser Arg Gly Pro Leu Ser Trp Thr His Val His

770 775 780

Pro Lys Gly Pro Lys Ser Leu Leu Ser Leu Glu Leu Lys Asp Asp Arg

785 790 795 800

Pro Ala Arg Asp Met Trp Val Met Glu Thr Gly Leu Leu Leu Pro Arg

805 810 815

Ala Thr Ala Gln Asp Ala Gly Lys Tyr Tyr Cys His Arg Gly Asn Leu

820 825 830

Thr Met Ser Phe His Leu Glu Ile Thr Ala Arg Pro Val Leu Trp His

835 840 845

Trp Leu Leu Arg Thr Gly Gly Trp Lys Val Ser Ala Val Thr Leu Ala

850 855 860

Tyr Leu Ile Phe Cys Leu Cys Ser Leu Val Gly Ile Leu His Leu Gln

865 870 875 880

Arg Ala Leu Val Leu Arg Arg Lys Arg

885

<210> 2

<211> 22

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид"

<400> 2

Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro

1 5 10 15

Ala Phe Leu Leu Ile Pro

20

<210> 3

<211> 112

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид"

<400> 3

Gly Pro Val Pro Pro Ser Thr Ala Leu Arg Tyr Leu Ile Glu Glu Leu

1 5 10 15

Val Asn Ile Thr Gln Asn Gln Lys Ala Pro Leu Cys Asn Gly Ser Met

20 25 30

Val Trp Ser Ile Asn Leu Thr Ala Gly Met Tyr Cys Ala Ala Leu Glu

35 40 45

Ser Leu Ile Asn Val Ser Gly Cys Ser Ala Ile Glu Lys Thr Gln Arg

50 55 60

Met Leu Ser Gly Phe Cys Pro His Lys Val Ser Ala Gly Gln Phe Ser

65 70 75 80

Ser Leu His Val Arg Asp Thr Lys Ile Glu Val Ala Gln Phe Val Lys

85 90 95

Asp Leu Leu Leu His Leu Lys Lys Leu Phe Arg Glu Gly Arg Phe Asn

100 105 110

<210> 4

<211> 229

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид"

<400> 4

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe

1 5 10 15

Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

20 25 30

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

35 40 45

Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

50 55 60

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Gln Ser

65 70 75 80

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

85 90 95

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser

100 105 110

Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

115 120 125

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln

130 135 140

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

145 150 155 160

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

165 170 175

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu

180 185 190

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

195 200 205

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

210 215 220

Leu Ser Leu Gly Lys

225

<210> 5

<211> 22

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 5

Met Ala Leu Ile Val Leu Gly Gly Val Ala Gly Leu Leu Leu Phe Ile

1 5 10 15

Gly Leu Gly Ile Phe Phe

20

<210> 6

<211> 42

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид"

<400> 6

Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met

1 5 10 15

Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe

20 25 30

Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu

35 40

<210> 7

<211> 112

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид"

<400> 7

Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly

1 5 10 15

Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr

20 25 30

Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys

35 40 45

Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys

50 55 60

Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg

65 70 75 80

Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala

85 90 95

Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

100 105 110

<210> 8

<211> 24

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид"

<400> 8

Leu Glu Gly Gly Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp

1 5 10 15

Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Arg

20

<210> 9

<211> 323

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид"

<400> 9

Met Pro Pro Pro Arg Leu Leu Phe Phe Leu Leu Phe Leu Thr Pro Met

1 5 10 15

Glu Val Arg Pro Glu Glu Pro Leu Val Val Lys Val Glu Glu Gly Asp

20 25 30

Asn Ala Val Leu Gln Cys Leu Lys Gly Thr Ser Asp Gly Pro Thr Gln

35 40 45

Gln Leu Thr Trp Ser Arg Glu Ser Pro Leu Lys Pro Phe Leu Lys Leu

50 55 60

Ser Leu Gly Leu Pro Gly Leu Gly Ile His Met Arg Pro Leu Ala Ile

65 70 75 80

Trp Leu Phe Ile Phe Asn Val Ser Gln Gln Met Gly Gly Phe Tyr Leu

85 90 95

Cys Gln Pro Gly Pro Pro Ser Glu Lys Ala Trp Gln Pro Gly Trp Thr

100 105 110

Val Asn Val Glu Gly Ser Gly Glu Leu Phe Arg Trp Asn Val Ser Asp

115 120 125

Leu Gly Gly Leu Gly Cys Gly Leu Lys Asn Arg Ser Ser Glu Gly Pro

130 135 140

Ser Ser Pro Ser Gly Lys Leu Met Ser Pro Lys Leu Tyr Val Trp Ala

145 150 155 160

Lys Asp Arg Pro Glu Ile Trp Glu Gly Glu Pro Pro Cys Val Pro Pro

165 170 175

Arg Asp Ser Leu Asn Gln Ser Leu Ser Gln Asp Leu Thr Met Ala Pro

180 185 190

Gly Ser Thr Leu Trp Leu Ser Cys Gly Val Pro Pro Asp Ser Val Ser

195 200 205

Arg Gly Pro Leu Ser Trp Thr His Val His Pro Lys Gly Pro Lys Ser

210 215 220

Leu Leu Ser Leu Glu Leu Lys Asp Asp Arg Pro Ala Arg Asp Met Trp

225 230 235 240

Val Met Glu Thr Gly Leu Leu Leu Pro Arg Ala Thr Ala Gln Asp Ala

245 250 255

Gly Lys Tyr Tyr Cys His Arg Gly Asn Leu Thr Met Ser Phe His Leu

260 265 270

Glu Ile Thr Ala Arg Pro Val Leu Trp His Trp Leu Leu Arg Thr Gly

275 280 285

Gly Trp Lys Val Ser Ala Val Thr Leu Ala Tyr Leu Ile Phe Cys Leu

290 295 300

Cys Ser Leu Val Gly Ile Leu His Leu Gln Arg Ala Leu Val Leu Arg

305 310 315 320

Arg Lys Arg

<210> 10

<211> 520

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид"

<400> 10

Gly Pro Val Pro Pro Ser Thr Ala Leu Arg Tyr Leu Ile Glu Glu Leu

1 5 10 15

Val Asn Ile Thr Gln Asn Gln Lys Ala Pro Leu Cys Asn Gly Ser Met

20 25 30

Val Trp Ser Ile Asn Leu Thr Ala Gly Met Tyr Cys Ala Ala Leu Glu

35 40 45

Ser Leu Ile Asn Val Ser Gly Cys Ser Ala Ile Glu Lys Thr Gln Arg

50 55 60

Met Leu Ser Gly Phe Cys Pro His Lys Val Ser Ala Gly Gln Phe Ser

65 70 75 80

Ser Leu His Val Arg Asp Thr Lys Ile Glu Val Ala Gln Phe Val Lys

85 90 95

Asp Leu Leu Leu His Leu Lys Lys Leu Phe Arg Glu Gly Arg Phe Asn

100 105 110

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe

115 120 125

Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

130 135 140

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

145 150 155 160

Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

165 170 175

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Gln Ser

180 185 190

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

195 200 205

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser

210 215 220

Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

225 230 235 240

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln

245 250 255

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

260 265 270

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

275 280 285

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu

290 295 300

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

305 310 315 320

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

325 330 335

Leu Ser Leu Gly Lys Met Ala Leu Ile Val Leu Gly Gly Val Ala Gly

340 345 350

Leu Leu Leu Phe Ile Gly Leu Gly Ile Phe Phe Lys Arg Gly Arg Lys

355 360 365

Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr

370 375 380

Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu

385 390 395 400

Gly Gly Cys Glu Leu Gly Gly Gly Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala

405 410 415

Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu

420 425 430

Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly

435 440 445

Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu

450 455 460

Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser

465 470 475 480

Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly

485 490 495

Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu

500 505 510

His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

515 520

<210> 11

<211> 405

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид"

<400> 11

Gly Pro Val Pro Pro Ser Thr Ala Leu Arg Tyr Leu Ile Glu Glu Leu

1 5 10 15

Val Asn Ile Thr Gln Asn Gln Lys Ala Pro Leu Cys Asn Gly Ser Met

20 25 30

Val Trp Ser Ile Asn Leu Thr Ala Gly Met Tyr Cys Ala Ala Leu Glu

35 40 45

Ser Leu Ile Asn Val Ser Gly Cys Ser Ala Ile Glu Lys Thr Gln Arg

50 55 60

Met Leu Ser Gly Phe Cys Pro His Lys Val Ser Ala Gly Gln Phe Ser

65 70 75 80

Ser Leu His Val Arg Asp Thr Lys Ile Glu Val Ala Gln Phe Val Lys

85 90 95

Asp Leu Leu Leu His Leu Lys Lys Leu Phe Arg Glu Gly Arg Phe Asn

100 105 110

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe

115 120 125

Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

130 135 140

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

145 150 155 160

Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

165 170 175

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Gln Ser

180 185 190

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

195 200 205

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser

210 215 220

Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

225 230 235 240

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln

245 250 255

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

260 265 270

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

275 280 285

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu

290 295 300

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

305 310 315 320

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

325 330 335

Leu Ser Leu Gly Lys Met Ala Leu Ile Val Leu Gly Gly Val Ala Gly

340 345 350

Leu Leu Leu Phe Ile Gly Leu Gly Ile Phe Phe Lys Arg Gly Arg Lys

355 360 365

Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr

370 375 380

Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu

385 390 395 400

Gly Gly Cys Glu Leu

405

<210> 12

<211> 7754

<212> DNA

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид"

<400> 12

gttagaccag atctgagcct gggagctctc tggctaacta gggaacccac tgcttaagcc 60

tcaataaagc ttgccttgag tgcttcaagt agtgtgtgcc cgtctgttgt gtgactctgg 120

taactagaga tccctcagac ccttttagtc agtgtggaaa atctctagca gtggcgcccg 180

aacagggact tgaaagcgaa agggaaacca gaggagctct ctcgacgcag gactcggctt 240

gctgaagcgc gcacggcaag aggcgagggg cggcgactgg tgagtacgcc aaaaattttg 300

actagcggag gctagaagga gagagatggg tgcgagagcg tcagtattaa gcgggggaga 360

attagatcga tgggaaaaaa ttcggttaag gccaggggga aagaaaaaat ataaattaaa 420

acatatagta tgggcaagca gggagctaga acgattcgca gttaatcctg gcctgttaga 480

aacatcagaa ggctgtagac aaatactggg acagctacaa ccatcccttc agacaggatc 540

agaagaactt agatcattat ataatacagt agcaaccctc tattgtgtgc atcaaaggat 600

agagataaaa gacaccaagg aagctttaga caagatagag gaagagcaaa acaaaagtaa 660

gaaaaaagca cagcaagcag cagctgacac aggacacagc aatcaggtca gccaaaatta 720

ccctatagtg cagaacatcc aggggcaaat ggtacatcag gccatatcac ctagaacttt 780

aaatgcatgg gtaaaagtag tagaagagaa ggctttcagc ccagaagtga tacccatgtt 840

ttcagcatta tcagaaggag ccaccccaca agatttaaac accatgctaa acacagtggg 900

gggacatcaa gcagccatgc aaatgttaaa agagaccatc aatgaggaag ctgcaggcaa 960

agagaagagt ggtgcagaga gaaaaaagag cagtgggaat aggagctttg ttccttgggt 1020

tcttgggagc agcaggaagc actatgggcg cagcgtcaat gacgctgacg gtacaggcca 1080

gacaattatt gtctggtata gtgcagcagc agaacaattt gctgagggct attgaggcgc 1140

aacagcatct gttgcaactc acagtctggg gcatcaagca gctccaggca agaatcctgg 1200

ctgtggaaag atacctaaag gatcaacagc tcctggggat ttggggttgc tctggaaaac 1260

tcatttgcac cactgctgtg ccttggatct acaaatggca gtattcatcc acaattttaa 1320

aagaaaaggg gggattgggg ggtacagtgc aggggaaaga atagtagaca taatagcaac 1380

agacatacaa actaaagaat tacaaaaaca aattacaaaa attcaaaatt ttcgggttta 1440

ttacagggac agcagagatc cagtttgggg atcaattgca tgaagaatct gcttagggtt 1500

aggcgttttg cgctgcttcg cgaggatctg cgatcgctcc ggtgcccgtc agtgggcaga 1560

gcgcacatcg cccacagtcc ccgagaagtt ggggggaggg gtcggcaatt gaaccggtgc 1620

ctagagaagg tggcgcgggg taaactggga aagtgatgtc gtgtactggc tccgcctttt 1680

tcccgagggt gggggagaac cgtatataag tgcagtagtc gccgtgaacg ttctttttcg 1740

caacgggttt gccgccagaa cacagctgaa gcttcgaggg gctcgcatct ctccttcacg 1800

cgcccgccgc cctacctgag gccgccatcc acgccggttg agtcgcgttc tgccgcctcc 1860

cgcctgtggt gcctcctgaa ctgcgtccgc cgtctaggta agtttaaagc tcaggtcgag 1920

accgggcctt tgtccggcgc tcccttggag cctacctaga ctcagccggc tctccacgct 1980

ttgcctgacc ctgcttgctc aactctacgt ctttgtttcg ttttctgttc tgcgccgtta 2040

cagatccaag ctgtgaccgg cgcctacggc tagcgccgcc accatgctgc tgctggtgac 2100

cagcctgctg ctgtgcgagc tgccccaccc cgcctttctg ctgatccctg gccccgtgcc 2160

ccctagcacc gccctgcgct acctgatcga ggaactggtg aacatcaccc agaaccagaa 2220

agcccccctg tgcaacggca gcatggtgtg gagcatcaac ctgaccgccg gcatgtactg 2280

tgccgccctg gaaagcctga tcaacgtgag cggctgcagc gccatcgaga aaacccagcg 2340

gatgctgtcc ggcttctgcc cccacaaggt gtccgccgga cagttcagca gcctgcacgt 2400

gcgggacacc aagatcgagg tggcccagtt cgtgaaggac ctgctgctgc acctgaagaa 2460

gctgttccgg gagggccggt tcaactacaa gaccaccccc cctgtgctgg acagcgacgg 2520

cagcttcttc ctgtacagca ggctgaccgt ggacaagagc cggtggcagg aaggcaacgt 2580

ctttagctgc agcgtgatgc acgaggccct gcacaaccac tacacccaga agagcctgtc 2640

cctgagcctg ggcaagcggg tgaagttcag ccggtccgcc gacgcccctg cctaccagca 2700

gggccagaac cagctgtaca acgagctgaa cctgggcagg cgggaggaat acgacgtgct 2760

ggacaagcgg agaggccggg accctgagat gggcggcaag cctcggcgga agaaccccca 2820

ggaaggcctg tataacgaac tgcagaaaga caagatggcc gaggcctaca gcgagatcgg 2880

catgaagggc gagcggaggc ggggcaaggg ccacgacggc ctgtatcagg gcctgtccac 2940

cgccaccaag gatacctacg acgccctgca catgcaggcc ctgcccccaa ggtctagacc 3000

cgggctgcag gaattcgata tcaagcttat cgataatcaa cctctggatt acaaaatttg 3060

tgaaagattg actggtattc ttaactatgt tgctcctttt acgctatgtg gatacgctgc 3120

tttaatgcct ttgtatcatg ctattgcttc ccgtatggct ttcattttct cctccttgta 3180

taaatcctgg ttgctgtctc tttatgagga gttgtggccc gttgtcaggc aacgtggcgt 3240

ggtgtgcact gtgtttgctg acgcaacccc cactggttgg ggcattgcca ccacctgtca 3300

gctcctttcc gggactttcg ctttccccct ccctattgcc acggcggaac tcatcgccgc 3360

ctgccttgcc cgctgctgga caggggctcg gctgttgggc actgacaatt ccgtggtgtt 3420

gtcggggaaa tcatcgtcct ttccttggct gctcgcctgt gttgccacct ggattctgcg 3480

cgggacgtcc ttctgctacg tcccttcggc cctcaatcca gcggaccttc cttcccgcgg 3540

cctgctgccg gctctgcggc ctcttccgcg tcttcgcctt cgccctcaga cgagtcggat 3600

ctccctttgg gccgcctccc cgcatcgata ccgtcgacta gccgtacctt taagaccaat 3660

gacttacaag gcagctgtag atcttagcca ctttttaaaa gaaaaggggg gactggaagg 3720

gctaattcac tcccaaagaa gacaagatct gctttttgcc tgtactgggt ctctctggtt 3780

agaccagatc tgagcctggg agctctctgg ctaactaggg aacccactgc ttaagcctca 3840

ataaagcttg ccttgagtgc ttcaagtagt gtgtgcccgt ctgttgtgtg actctggtaa 3900

ctagagatcc ctcagaccct tttagtcagt gtggaaaatc tctagcagaa ttcgatatca 3960

agcttatcga taccgtcgac ctcgaggggg ggcccggtac ccaattcgcc ctatagtgag 4020

tcgtattaca attcactggc cgtcgtttta caacgtcgtg actgggaaaa ccctggcgtt 4080

acccaactta atcgccttgc agcacatccc cctttcgcca gctggcgtaa tagcgaagag 4140

gcccgcaccg atcgcccttc ccaacagttg cgcagcctga atggcgaatg gaaattgtaa 4200

gcgttaatat tttgttaaaa ttcgcgttaa atttttgtta aatcagctca ttttttaacc 4260

aataggccga aatcggcaaa atcccttata aatcaaaaga atagaccgag atagggttga 4320

gtgttgttcc agtttggaac aagagtccac tattaaagaa cgtggactcc aacgtcaaag 4380

ggcgaaaaac cgtctatcag ggcgatggcc cactacgtga accatcaccc taatcaagtt 4440

ttttggggtc gaggtgccgt aaagcactaa atcggaaccc taaagggagc ccccgattta 4500

gagcttgacg gggaaagccg gcgaacgtgg cgagaaagga agggaagaaa gcgaaaggag 4560

cgggcgctag ggcgctggca agtgtagcgg tcacgctgcg cgtaaccacc acacccgccg 4620

cgcttaatgc gccgctacag ggcgcgtcag gtggcacttt tcggggaaat gtgcgcggaa 4680

cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta tccgctcatg agacaataac 4740

cctgataaat gcttcaataa tattgaaaaa ggaagagtat gagtattcaa catttccgtg 4800

tcgcccttat tccctttttt gcggcatttt gccttcctgt ttttgctcac ccagaaacgc 4860

tggtgaaagt aaaagatgct gaagatcagt tgggtgcacg agtgggttac atcgaactgg 4920

atctcaacag cggtaagatc cttgagagtt ttcgccccga agaacgtttt ccaatgatga 4980

gcacttttaa agttctgcta tgtggcgcgg tattatcccg tattgacgcc gggcaagagc 5040

aactcggtcg ccgcatacac tattctcaga atgacttggt tgagtactca ccagtcacag 5100

aaaagcatct tacggatggc atgacagtaa gagaattatg cagtgctgcc ataaccatga 5160

gtgataacac tgcggccaac ttacttctga caacgatcgg aggaccgaag gagctaaccg 5220

cttttttgca caacatgggg gatcatgtaa ctcgccttga tcgttgggaa ccggagctga 5280

atgaagccat accaaacgac gagcgtgaca ccacgatgcc tgtagcaatg gcaacaacgt 5340

tgcgcaaact attaactggc gaactactta ctctagcttc ccggcaacaa ttaatagact 5400

ggatggaggc ggataaagtt gcaggaccac ttctgcgctc ggcccttccg gctggctggt 5460

ttattgctga taaatctgga gccggtgagc gtgggtctcg cggtatcatt gcagcactgg 5520

ggccagatgg taagccctcc cgtatcgtag ttatctacac gacggggagt caggcaacta 5580

tggatgaacg aaatagacag atcgctgaga taggtgcctc actgattaag cattggtaac 5640

tgtcagacca agtttactca tatatacttt agattgattt aaaacttcat ttttaattta 5700

aaaggatcta ggtgaagatc ctttttgata atctcatgac caaaatccct taacgtgagt 5760

tttcgttcca ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa aggatcttct tgagatcctt 5820

tttttctgcg cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc accgctacca gcggtggttt 5880

gtttgccgga tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt aactggcttc agcagagcgc 5940

agataccaaa tactgttctt ctagtgtagc cgtagttagg ccaccacttc aagaactctg 6000

tagcaccgcc tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc agtggctgct gccagtggcg 6060

ataagtcgtg tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt accggataag gcgcagcggt 6120

cgggctgaac ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga gcgaacgacc tacaccgaac 6180

tgagatacct acagcgtgag ctatgagaaa gcgccacgct tcccgaaggg agaaaggcgg 6240

acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg cacgagggag cttccagggg 6300

gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca cctctgactt gagcgtcgat 6360

ttttgtgatg ctcgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa cgccagcaac gcggcctttt 6420

tacggttcct ggccttttgc tggccttttg ctcacatgtt ctttcctgcg ttatcccctg 6480

attctgtgga taaccgtatt accgcctttg agtgagctga taccgctcgc cgcagccgaa 6540

cgaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga gcgcccaata cgcaaaccgc 6600

ctctccccgc gcgttggccg attcattaat gcagctggca cgacaggttt cccgactgga 6660

aagcgggcag tgagcgcaac gcaattaatg tgagttagct cactcattag gcaccccagg 6720

ctttacactt tatgcttccg gctcgtatgt tgtgtggaat tgtgagcgga taacaatttc 6780

acacaggaaa cagctatgac catgattacg ccaagctcga aattaaccct cactaaaggg 6840

aacaaaagct ggagctccac cgcggtggcg gcctcgaggt cgagatccgg tcgaccagca 6900

accatagtcc cgcccctaac tccgcccatc ccgcccctaa ctccgcccag ttccgcccat 6960

tctccgcccc atggctgact aatttttttt atttatgcag aggccgaggc cgcctcggcc 7020

tctgagctat tccagaagta gtgaggaggc ttttttggag gcctaggctt ttgcaaaaag 7080

cttcgacggt atcgattggc tcatgtccaa cattaccgcc atgttgacat tgattattga 7140

ctagttatta atagtaatca attacggggt cattagttca tagcccatat atggagttcc 7200

gcgttacata acttacggta aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat 7260

tgacgtcaat aatgacgtat gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc 7320

aatgggtgga gtatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc 7380

caagtacgcc ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt 7440

acatgacctt atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta 7500

ccatggtgat gcggttttgg cagtacatca atgggcgtgg atagcggttt gactcacggg 7560

gatttccaag tctccacccc attgacgtca atgggagttt gttttggcac caaaatcaac 7620

gggactttcc aaaatgtcgt aacaactccg ccccattgac gcaaatgggc ggtaggcgtg 7680

tacggaattc ggagtggcga gccctcagat cctgcatata agcagctgct ttttgcctgt 7740

actgggtctc tctg 7754

<210> 13

<211> 8732

<212> DNA

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид"

<400> 13

gttagaccag atctgagcct gggagctctc tggctaacta gggaacccac tgcttaagcc 60

tcaataaagc ttgccttgag tgcttcaagt agtgtgtgcc cgtctgttgt gtgactctgg 120

taactagaga tccctcagac ccttttagtc agtgtggaaa atctctagca gtggcgcccg 180

aacagggact tgaaagcgaa agggaaacca gaggagctct ctcgacgcag gactcggctt 240

gctgaagcgc gcacggcaag aggcgagggg cggcgactgg tgagtacgcc aaaaattttg 300

actagcggag gctagaagga gagagatggg tgcgagagcg tcagtattaa gcgggggaga 360

attagatcga tgggaaaaaa ttcggttaag gccaggggga aagaaaaaat ataaattaaa 420

acatatagta tgggcaagca gggagctaga acgattcgca gttaatcctg gcctgttaga 480

aacatcagaa ggctgtagac aaatactggg acagctacaa ccatcccttc agacaggatc 540

agaagaactt agatcattat ataatacagt agcaaccctc tattgtgtgc atcaaaggat 600

agagataaaa gacaccaagg aagctttaga caagatagag gaagagcaaa acaaaagtaa 660

gaaaaaagca cagcaagcag cagctgacac aggacacagc aatcaggtca gccaaaatta 720

ccctatagtg cagaacatcc aggggcaaat ggtacatcag gccatatcac ctagaacttt 780

aaatgcatgg gtaaaagtag tagaagagaa ggctttcagc ccagaagtga tacccatgtt 840

ttcagcatta tcagaaggag ccaccccaca agatttaaac accatgctaa acacagtggg 900

gggacatcaa gcagccatgc aaatgttaaa agagaccatc aatgaggaag ctgcaggcaa 960

agagaagagt ggtgcagaga gaaaaaagag cagtgggaat aggagctttg ttccttgggt 1020

tcttgggagc agcaggaagc actatgggcg cagcgtcaat gacgctgacg gtacaggcca 1080

gacaattatt gtctggtata gtgcagcagc agaacaattt gctgagggct attgaggcgc 1140

aacagcatct gttgcaactc acagtctggg gcatcaagca gctccaggca agaatcctgg 1200

ctgtggaaag atacctaaag gatcaacagc tcctggggat ttggggttgc tctggaaaac 1260

tcatttgcac cactgctgtg ccttggatct acaaatggca gtattcatcc acaattttaa 1320

aagaaaaggg gggattgggg ggtacagtgc aggggaaaga atagtagaca taatagcaac 1380

agacatacaa actaaagaat tacaaaaaca aattacaaaa attcaaaatt ttcgggttta 1440

ttacagggac agcagagatc cagtttgggg atcaattgca tgaagaatct gcttagggtt 1500

aggcgttttg cgctgcttcg cgaggatctg cgatcgctcc ggtgcccgtc agtgggcaga 1560

gcgcacatcg cccacagtcc ccgagaagtt ggggggaggg gtcggcaatt gaaccggtgc 1620

ctagagaagg tggcgcgggg taaactggga aagtgatgtc gtgtactggc tccgcctttt 1680

tcccgagggt gggggagaac cgtatataag tgcagtagtc gccgtgaacg ttctttttcg 1740

caacgggttt gccgccagaa cacagctgaa gcttcgaggg gctcgcatct ctccttcacg 1800

cgcccgccgc cctacctgag gccgccatcc acgccggttg agtcgcgttc tgccgcctcc 1860

cgcctgtggt gcctcctgaa ctgcgtccgc cgtctaggta agtttaaagc tcaggtcgag 1920

accgggcctt tgtccggcgc tcccttggag cctacctaga ctcagccggc tctccacgct 1980

ttgcctgacc ctgcttgctc aactctacgt ctttgtttcg ttttctgttc tgcgccgtta 2040

cagatccaag ctgtgaccgg cgcctacggc tagcgccgcc accatgctgc tgctggtgac 2100

cagcctgctg ctgtgcgagc tgccccaccc cgcctttctg ctgatccccg acatccagat 2160

gacccagacc acctccagcc tgagcgccag cctgggcgac cgggtgacca tcagctgccg 2220

ggccagccag gacatcagca agtacctgaa ctggtatcag cagaagcccg acggcaccgt 2280

caagctgctg atctaccaca ccagccggct gcacagcggc gtgcccagcc ggtttagcgg 2340

cagcggctcc ggcaccgact acagcctgac catctccaac ctggaacagg aagatatcgc 2400

cacctacttt tgccagcagg gcaacacact gccctacacc tttggcggcg gaacaaagct 2460

ggaaatcacc ggcagcacct ccggcagcgg caagcctggc agcggcgagg gcagcaccaa 2520

gggcgaggtg aagctgcagg aaagcggccc tggcctggtg gcccccagcc agagcctgag 2580

cgtgacctgc accgtgagcg gcgtgagcct gcccgactac ggcgtgagct ggatccggca 2640

gccccccagg aagggcctgg aatggctggg cgtgatctgg ggcagcgaga ccacctacta 2700

caacagcgcc ctgaagagcc ggctgaccat catcaaggac aacagcaaga gccaggtgtt 2760

cctgaagatg aacagcctgc agaccgacga caccgccatc tactactgcg ccaagcacta 2820

ctactacggc ggcagctacg ccatggacta ctggggccag ggcaccagcg tgaccgtgag 2880

cagcgagagc aagtacggcc ctccctgccc cccttgccct gcccccgagt tcctgggcgg 2940

acccagcgtg ttcctgttcc cccccaagcc caaggacacc ctgatgatca gccggacccc 3000

cgaggtgacc tgcgtggtgg tggacgtgag ccaggaagat cccgaggtcc agttcaattg 3060

gtacgtggac ggcgtggagg tgcacaacgc caagaccaag cccagggaag agcagttcaa 3120

cagcacctac cgggtggtgt ccgtgctgac cgtgctgcac caggactggc tgaacggcaa 3180

agaatacaag tgcaaggtgt ccaacaaggg cctgcccagc agcatcgaga aaaccatcag 3240

caaggccaag ggccagcctc gggagcccca ggtgtacacc ctgccccctt cccaggaaga 3300

gatgaccaag aatcaggtgt ccctgacctg cctggtgaag ggcttctacc ccagcgacat 3360

cgccgtggag tgggagagca acggccagcc cgagaacaac tacaagacca ccccccctgt 3420

gctggacagc gacggcagct tcttcctgta cagcaggctg accgtggaca agagccggtg 3480

gcaggaaggc aacgtcttta gctgcagcgt gatgcacgag gccctgcaca accactacac 3540

ccagaagagc ctgtccctga gcctgggcaa gatggccctg atcgtgctgg gcggcgtggc 3600

cgggctgctg ctgttcatcg gcctgggcat ctttttccgg gtgaagttca gccggtccgc 3660

cgacgcccct gcctaccagc agggccagaa ccagctgtac aacgagctga acctgggcag 3720

gcgggaggaa tacgacgtgc tggacaagcg gagaggccgg gaccctgaga tgggcggcaa 3780

gcccaggcgg aagaaccctc aggaaggcct gtataacgaa ctgcagaaag acaagatggc 3840

cgaggcctac agcgagatcg gcatgaaggg cgagcggcgg aggggcaagg gccacgacgg 3900

cctgtaccag ggcctgagca ccgccaccaa ggatacctac gacgccctgc acatgcaggc 3960

cctgcccccc aggtgacccg ggctgcagga attcgatatc aagcttatcg ataatcaacc 4020

tctggattac aaaatttgtg aaagattgac tggtattctt aactatgttg ctccttttac 4080

gctatgtgga tacgctgctt taatgccttt gtatcatgct attgcttccc gtatggcttt 4140

cattttctcc tccttgtata aatcctggtt gctgtctctt tatgaggagt tgtggcccgt 4200

tgtcaggcaa cgtggcgtgg tgtgcactgt gtttgctgac gcaaccccca ctggttgggg 4260

cattgccacc acctgtcagc tcctttccgg gactttcgct ttccccctcc ctattgccac 4320

ggcggaactc atcgccgcct gccttgcccg ctgctggaca ggggctcggc tgttgggcac 4380

tgacaattcc gtggtgttgt cggggaaatc atcgtccttt ccttggctgc tcgcctgtgt 4440

tgccacctgg attctgcgcg ggacgtcctt ctgctacgtc ccttcggccc tcaatccagc 4500

ggaccttcct tcccgcggcc tgctgccggc tctgcggcct cttccgcgtc ttcgccttcg 4560

ccctcagacg agtcggatct ccctttgggc cgcctccccg catcgatacc gtcgactagc 4620

cgtaccttta agaccaatga cttacaaggc agctgtagat cttagccact ttttaaaaga 4680

aaagggggga ctggaagggc taattcactc ccaaagaaga caagatctgc tttttgcctg 4740

tactgggtct ctctggttag accagatctg agcctgggag ctctctggct aactagggaa 4800

cccactgctt aagcctcaat aaagcttgcc ttgagtgctt caagtagtgt gtgcccgtct 4860

gttgtgtgac tctggtaact agagatccct cagacccttt tagtcagtgt ggaaaatctc 4920

tagcagaatt cgatatcaag cttatcgata ccgtcgacct cgaggggggg cccggtaccc 4980

aattcgccct atagtgagtc gtattacaat tcactggccg tcgttttaca acgtcgtgac 5040

tgggaaaacc ctggcgttac ccaacttaat cgccttgcag cacatccccc tttcgccagc 5100

tggcgtaata gcgaagaggc ccgcaccgat cgcccttccc aacagttgcg cagcctgaat 5160

ggcgaatgga aattgtaagc gttaatattt tgttaaaatt cgcgttaaat ttttgttaaa 5220

tcagctcatt ttttaaccaa taggccgaaa tcggcaaaat cccttataaa tcaaaagaat 5280

agaccgagat agggttgagt gttgttccag tttggaacaa gagtccacta ttaaagaacg 5340

tggactccaa cgtcaaaggg cgaaaaaccg tctatcaggg cgatggccca ctacgtgaac 5400

catcacccta atcaagtttt ttggggtcga ggtgccgtaa agcactaaat cggaacccta 5460

aagggagccc ccgatttaga gcttgacggg gaaagccggc gaacgtggcg agaaaggaag 5520

ggaagaaagc gaaaggagcg ggcgctaggg cgctggcaag tgtagcggtc acgctgcgcg 5580

taaccaccac acccgccgcg cttaatgcgc cgctacaggg cgcgtcaggt ggcacttttc 5640

ggggaaatgt gcgcggaacc cctatttgtt tatttttcta aatacattca aatatgtatc 5700

cgctcatgag acaataaccc tgataaatgc ttcaataata ttgaaaaagg aagagtatga 5760

gtattcaaca tttccgtgtc gcccttattc ccttttttgc ggcattttgc cttcctgttt 5820

ttgctcaccc agaaacgctg gtgaaagtaa aagatgctga agatcagttg ggtgcacgag 5880

tgggttacat cgaactggat ctcaacagcg gtaagatcct tgagagtttt cgccccgaag 5940

aacgttttcc aatgatgagc acttttaaag ttctgctatg tggcgcggta ttatcccgta 6000

ttgacgccgg gcaagagcaa ctcggtcgcc gcatacacta ttctcagaat gacttggttg 6060

agtactcacc agtcacagaa aagcatctta cggatggcat gacagtaaga gaattatgca 6120

gtgctgccat aaccatgagt gataacactg cggccaactt acttctgaca acgatcggag 6180

gaccgaagga gctaaccgct tttttgcaca acatggggga tcatgtaact cgccttgatc 6240

gttgggaacc ggagctgaat gaagccatac caaacgacga gcgtgacacc acgatgcctg 6300

tagcaatggc aacaacgttg cgcaaactat taactggcga actacttact ctagcttccc 6360

ggcaacaatt aatagactgg atggaggcgg ataaagttgc aggaccactt ctgcgctcgg 6420

cccttccggc tggctggttt attgctgata aatctggagc cggtgagcgt gggtctcgcg 6480

gtatcattgc agcactgggg ccagatggta agccctcccg tatcgtagtt atctacacga 6540

cggggagtca ggcaactatg gatgaacgaa atagacagat cgctgagata ggtgcctcac 6600

tgattaagca ttggtaactg tcagaccaag tttactcata tatactttag attgatttaa 6660

aacttcattt ttaatttaaa aggatctagg tgaagatcct ttttgataat ctcatgacca 6720

aaatccctta acgtgagttt tcgttccact gagcgtcaga ccccgtagaa aagatcaaag 6780

gatcttcttg agatcctttt tttctgcgcg taatctgctg cttgcaaaca aaaaaaccac 6840

cgctaccagc ggtggtttgt ttgccggatc aagagctacc aactcttttt ccgaaggtaa 6900

ctggcttcag cagagcgcag ataccaaata ctgttcttct agtgtagccg tagttaggcc 6960

accacttcaa gaactctgta gcaccgccta catacctcgc tctgctaatc ctgttaccag 7020

tggctgctgc cagtggcgat aagtcgtgtc ttaccgggtt ggactcaaga cgatagttac 7080

cggataaggc gcagcggtcg ggctgaacgg ggggttcgtg cacacagccc agcttggagc 7140

gaacgaccta caccgaactg agatacctac agcgtgagct atgagaaagc gccacgcttc 7200

ccgaagggag aaaggcggac aggtatccgg taagcggcag ggtcggaaca ggagagcgca 7260

cgagggagct tccaggggga aacgcctggt atctttatag tcctgtcggg tttcgccacc 7320

tctgacttga gcgtcgattt ttgtgatgct cgtcaggggg gcggagccta tggaaaaacg 7380

ccagcaacgc ggccttttta cggttcctgg ccttttgctg gccttttgct cacatgttct 7440

ttcctgcgtt atcccctgat tctgtggata accgtattac cgcctttgag tgagctgata 7500

ccgctcgccg cagccgaacg accgagcgca gcgagtcagt gagcgaggaa gcggaagagc 7560

gcccaatacg caaaccgcct ctccccgcgc gttggccgat tcattaatgc agctggcacg 7620

acaggtttcc cgactggaaa gcgggcagtg agcgcaacgc aattaatgtg agttagctca 7680

ctcattaggc accccaggct ttacacttta tgcttccggc tcgtatgttg tgtggaattg 7740

tgagcggata acaatttcac acaggaaaca gctatgacca tgattacgcc aagctcgaaa 7800

ttaaccctca ctaaagggaa caaaagctgg agctccaccg cggtggcggc ctcgaggtcg 7860

agatccggtc gaccagcaac catagtcccg cccctaactc cgcccatccc gcccctaact 7920

ccgcccagtt ccgcccattc tccgccccat ggctgactaa ttttttttat ttatgcagag 7980

gccgaggccg cctcggcctc tgagctattc cagaagtagt gaggaggctt ttttggaggc 8040

ctaggctttt gcaaaaagct tcgacggtat cgattggctc atgtccaaca ttaccgccat 8100

gttgacattg attattgact agttattaat agtaatcaat tacggggtca ttagttcata 8160

gcccatatat ggagttccgc gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc 8220

ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag 8280

ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt atttacggta aactgcccac ttggcagtac 8340

atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg 8400

cctggcatta tgcccagtac atgaccttat gggactttcc tacttggcag tacatctacg 8460

tattagtcat cgctattacc atggtgatgc ggttttggca gtacatcaat gggcgtggat 8520

agcggtttga ctcacgggga tttccaagtc tccaccccat tgacgtcaat gggagtttgt 8580

tttggcacca aaatcaacgg gactttccaa aatgtcgtaa caactccgcc ccattgacgc 8640

aaatgggcgg taggcgtgta cggaattcgg agtggcgagc cctcagatcc tgcatataag 8700

cagctgcttt ttgcctgtac tgggtctctc tg 8732

<210> 14

<211> 10

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид"

<400> 14

Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly

1 5 10

<210> 15

<211> 12

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид"

<400> 15

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro

1 5 10

<210> 16

<211> 22

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид"

<400> 16

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

Ser Gly Gly Gly Ser Gly

20

<210> 17

<211> 39

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид"

<400> 17

Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn

1 5 10 15

Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu

20 25 30

Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro

35

<210> 18

<211> 48

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид"

<400> 18

Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro

1 5 10 15

Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro

20 25 30

Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp

35 40 45

<210> 19

<211> 45

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид"

<400> 19

Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala

1 5 10 15

Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly

20 25 30

Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp

35 40 45

<210> 20

<211> 129

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид"

<400> 20

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

20 25 30

Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr

35 40 45

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

50 55 60

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

65 70 75 80

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys

85 90 95

Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

100 105 110

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly

115 120 125

Lys

<210> 21

<211> 21

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 21

Leu Cys Tyr Leu Leu Asp Gly Ile Leu Phe Ile Tyr Gly Val Ile Leu

1 5 10 15

Thr Ala Leu Phe Leu

20

<210> 22

<211> 27

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 22

Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu

1 5 10 15

Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val

20 25

<210> 23

<211> 21

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 23

Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu

1 5 10 15

Ser Leu Val Ile Thr

20

<210> 24

<211> 23

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 24

Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu

1 5 10 15

Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr

20

<210> 25

<211> 24

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 25

Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu

1 5 10 15

Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys

20

<210> 26

<211> 27

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 26

Ile Ile Ser Phe Phe Leu Ala Leu Thr Ser Thr Ala Leu Leu Phe Leu

1 5 10 15

Leu Phe Phe Leu Thr Leu Arg Phe Ser Val Val

20 25

<210> 27

<211> 41

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 27

Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr

1 5 10 15

Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro

20 25 30

Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser

35 40

<210> 28

<211> 41

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 28

Arg Ser Lys Arg Ser Arg Gly Gly His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr

1 5 10 15

Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro

20 25 30

Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser

35 40

<210> 29

<211> 42

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 29

Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met

1 5 10 15

Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe

20 25 30

Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu

35 40

<210> 30

<211> 42

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 30

Ala Leu Tyr Leu Leu Arg Arg Asp Gln Arg Leu Pro Pro Asp Ala His

1 5 10 15

Lys Pro Pro Gly Gly Gly Ser Phe Arg Thr Pro Ile Gln Glu Glu Gln

20 25 30

Ala Asp Ala His Ser Thr Leu Ala Lys Ile

35 40

<210> 31

<211> 362

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид"

<400> 31

Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro

1 5 10 15

Ala Phe Leu Leu Ile Pro Gly Pro Val Pro Pro Ser Thr Ala Leu Arg

20 25 30

Tyr Leu Ile Glu Glu Leu Val Asn Ile Thr Gln Asn Gln Lys Ala Pro

35 40 45

Leu Cys Asn Gly Ser Met Val Trp Ser Ile Asn Leu Thr Ala Gly Met

50 55 60

Tyr Cys Ala Ala Leu Glu Ser Leu Ile Asn Val Ser Gly Cys Ser Ala

65 70 75 80

Ile Glu Lys Thr Gln Arg Met Leu Ser Gly Phe Cys Pro His Lys Val

85 90 95

Ser Ala Gly Gln Phe Ser Ser Leu His Val Arg Asp Thr Lys Ile Glu

100 105 110

Val Ala Gln Phe Val Lys Asp Leu Leu Leu His Leu Lys Lys Leu Phe

115 120 125

Arg Glu Gly Arg Phe Asn Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg

130 135 140

Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg

145 150 155 160

Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly

165 170 175

Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr

180 185 190

Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Lys Arg Gly

195 200 205

Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val

210 215 220

Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu

225 230 235 240

Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Gly Gly Gly Arg Val Lys Phe Ser Arg

245 250 255

Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn

260 265 270

Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg

275 280 285

Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro

290 295 300

Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala

305 310 315 320

Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His

325 330 335

Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp

340 345 350

Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

355 360

<210> 32

<211> 410

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид"

<400> 32

Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro

1 5 10 15

Ala Phe Leu Leu Ile Pro Gly Pro Val Pro Pro Ser Thr Ala Leu Arg

20 25 30

Tyr Leu Ile Glu Glu Leu Val Asn Ile Thr Gln Asn Gln Lys Ala Pro

35 40 45

Leu Cys Asn Gly Ser Met Val Trp Ser Ile Asn Leu Thr Ala Gly Met

50 55 60

Tyr Cys Ala Ala Leu Glu Ser Leu Ile Asn Val Ser Gly Cys Ser Ala

65 70 75 80

Ile Glu Lys Thr Gln Arg Met Leu Ser Gly Phe Cys Pro His Lys Val

85 90 95

Ser Ala Gly Gln Phe Ser Ser Leu His Val Arg Asp Thr Lys Ile Glu

100 105 110

Val Ala Gln Phe Val Lys Asp Leu Leu Leu His Leu Lys Lys Leu Phe

115 120 125

Arg Glu Gly Arg Phe Asn Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg

130 135 140

Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg

145 150 155 160

Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly

165 170 175

Leu Asp Phe Ala Cys Asp Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val

180 185 190

Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp

195 200 205

Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Gly Gly His Ser Asp Tyr Met Asn Met

210 215 220

Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala

225 230 235 240

Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Gly Gly Gly Lys Arg Gly

245 250 255

Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val

260 265 270

Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu

275 280 285

Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Gly Gly Gly Arg Val Lys Phe Ser Arg

290 295 300

Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn

305 310 315 320

Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg

325 330 335

Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro

340 345 350

Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala

355 360 365

Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His

370 375 380

Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp

385 390 395 400

Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

405 410

<210> 33

<211> 442

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид"

<400> 33

Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro

1 5 10 15

Ala Phe Leu Leu Ile Pro Gly Pro Val Pro Pro Ser Thr Ala Leu Arg

20 25 30

Tyr Leu Ile Glu Glu Leu Val Asn Ile Thr Gln Asn Gln Lys Ala Pro

35 40 45

Leu Cys Asn Gly Ser Met Val Trp Ser Ile Asn Leu Thr Ala Gly Met

50 55 60

Tyr Cys Ala Ala Leu Glu Ser Leu Ile Asn Val Ser Gly Cys Ser Ala

65 70 75 80

Ile Glu Lys Thr Gln Arg Met Leu Ser Gly Phe Cys Pro His Lys Val

85 90 95

Ser Ala Gly Gln Phe Ser Ser Leu His Val Arg Asp Thr Lys Ile Glu

100 105 110

Val Ala Gln Phe Val Lys Asp Leu Leu Leu His Leu Lys Lys Leu Phe

115 120 125

Arg Glu Gly Arg Phe Asn Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro

130 135 140

Cys Pro Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gln Pro Arg

145 150 155 160

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys

165 170 175

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

180 185 190

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

195 200 205

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

210 215 220

Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser

225 230 235 240

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

245 250 255

Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Met Ala Leu Ile Val Leu Gly Gly Val

260 265 270

Ala Gly Leu Leu Leu Phe Ile Gly Leu Gly Ile Phe Phe Lys Arg Gly

275 280 285

Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val

290 295 300

Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu

305 310 315 320

Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Gly Gly Gly Arg Val Lys Phe Ser Arg

325 330 335

Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn

340 345 350

Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg

355 360 365

Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro

370 375 380

Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala

385 390 395 400

Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His

405 410 415

Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp

420 425 430

Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

435 440

<210> 34

<211> 541

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид"

<400> 34

Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro

1 5 10 15

Ala Phe Leu Leu Ile Pro Gly Pro Val Pro Pro Ser Thr Ala Leu Arg

20 25 30

Tyr Leu Ile Glu Glu Leu Val Asn Ile Thr Gln Asn Gln Lys Ala Pro

35 40 45

Leu Cys Asn Gly Ser Met Val Trp Ser Ile Asn Leu Thr Ala Gly Met

50 55 60

Tyr Cys Ala Ala Leu Glu Ser Leu Ile Asn Val Ser Gly Cys Ser Ala

65 70 75 80

Ile Glu Lys Thr Gln Arg Met Leu Ser Gly Phe Cys Pro His Lys Val

85 90 95

Ser Ala Gly Gln Phe Ser Ser Leu His Val Arg Asp Thr Lys Ile Glu

100 105 110

Val Ala Gln Phe Val Lys Asp Leu Leu Leu His Leu Lys Lys Leu Phe

115 120 125

Arg Glu Gly Arg Phe Asn Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro

130 135 140

Cys Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro

145 150 155 160

Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr

165 170 175

Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn

180 185 190

Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg

195 200 205

Glu Glu Gln Phe Gln Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val

210 215 220

Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser

225 230 235 240

Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys

245 250 255

Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu

260 265 270

Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe

275 280 285

Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu

290 295 300

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe

305 310 315 320

Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly

325 330 335

Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr

340 345 350

Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Ile Tyr Ile Trp Ala

355 360 365

Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr

370 375 380

Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met

385 390 395 400

Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe

405 410 415

Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Gly Gly Gly Arg Val Lys

420 425 430

Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln

435 440 445

Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu

450 455 460

Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg

465 470 475 480

Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met

485 490 495

Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly

500 505 510

Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp

515 520 525

Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

530 535 540

<210> 35

<211> 373

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид"

<400> 35

Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro

1 5 10 15

Ala Phe Leu Leu Ile Pro Gly Pro Val Pro Pro Ser Thr Ala Leu Arg

20 25 30

Tyr Leu Ile Glu Glu Leu Val Asn Ile Thr Gln Asn Gln Lys Ala Pro

35 40 45

Leu Cys Asn Gly Ser Met Val Trp Ser Ile Asn Leu Thr Ala Gly Met

50 55 60

Tyr Cys Ala Ala Leu Glu Ser Leu Ile Asn Val Ser Gly Cys Ser Ala

65 70 75 80

Ile Glu Lys Thr Gln Arg Met Leu Ser Gly Phe Cys Pro His Lys Val

85 90 95

Ser Ala Gly Gln Phe Ser Ser Leu His Val Arg Asp Thr Lys Ile Glu

100 105 110

Val Ala Gln Phe Val Lys Asp Leu Leu Leu His Leu Lys Lys Leu Phe

115 120 125

Arg Glu Gly Arg Phe Asn Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly

130 135 140

Met Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser

145 150 155 160

Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg

165 170 175

Ser Arg Gly Gly His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro

180 185 190

Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe

195 200 205

Ala Ala Tyr Arg Ser Gly Gly Gly Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu

210 215 220

Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu

225 230 235 240

Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys

245 250 255

Glu Leu Gly Gly Gly Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro

260 265 270

Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly

275 280 285

Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro

290 295 300

Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr

305 310 315 320

Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly

325 330 335

Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln

340 345 350

Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln

355 360 365

Ala Leu Pro Pro Arg

370

<210> 36

<211> 385

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид"

<400> 36

Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro

1 5 10 15

Ala Phe Leu Leu Ile Pro Gly Pro Val Pro Pro Ser Thr Ala Leu Arg

20 25 30

Tyr Leu Ile Glu Glu Leu Val Asn Ile Thr Gln Asn Gln Lys Ala Pro

35 40 45

Leu Cys Asn Gly Ser Met Val Trp Ser Ile Asn Leu Thr Ala Gly Met

50 55 60

Tyr Cys Ala Ala Leu Glu Ser Leu Ile Asn Val Ser Gly Cys Ser Ala

65 70 75 80

Ile Glu Lys Thr Gln Arg Met Leu Ser Gly Phe Cys Pro His Lys Val

85 90 95

Ser Ala Gly Gln Phe Ser Ser Leu His Val Arg Asp Thr Lys Ile Glu

100 105 110

Val Ala Gln Phe Val Lys Asp Leu Leu Leu His Leu Lys Lys Leu Phe

115 120 125

Arg Glu Gly Arg Phe Asn Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro

130 135 140

Cys Pro Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Met Phe Trp Val

145 150 155 160

Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr

165 170 175

Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Gly Gly

180 185 190

His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg

195 200 205

Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg

210 215 220

Ser Gly Gly Gly Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys

225 230 235 240

Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys

245 250 255

Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Gly Gly

260 265 270

Gly Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln

275 280 285

Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu

290 295 300

Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly

305 310 315 320

Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln

325 330 335

Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu

340 345 350

Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr

355 360 365

Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro

370 375 380

Arg

385

<210> 37

<211> 492

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид"

<400> 37

Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro

1 5 10 15

Ala Phe Leu Leu Ile Pro Gly Pro Val Pro Pro Ser Thr Ala Leu Arg

20 25 30

Tyr Leu Ile Glu Glu Leu Val Asn Ile Thr Gln Asn Gln Lys Ala Pro

35 40 45

Leu Cys Asn Gly Ser Met Val Trp Ser Ile Asn Leu Thr Ala Gly Met

50 55 60

Tyr Cys Ala Ala Leu Glu Ser Leu Ile Asn Val Ser Gly Cys Ser Ala

65 70 75 80

Ile Glu Lys Thr Gln Arg Met Leu Ser Gly Phe Cys Pro His Lys Val

85 90 95

Ser Ala Gly Gln Phe Ser Ser Leu His Val Arg Asp Thr Lys Ile Glu

100 105 110

Val Ala Gln Phe Val Lys Asp Leu Leu Leu His Leu Lys Lys Leu Phe

115 120 125

Arg Glu Gly Arg Phe Asn Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro

130 135 140

Cys Pro Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gln Pro Arg

145 150 155 160

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys

165 170 175

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

180 185 190

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

195 200 205

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

210 215 220

Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser

225 230 235 240

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

245 250 255

Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Met Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly

260 265 270

Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile

275 280 285

Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Gly Gly His Ser Asp Tyr Met

290 295 300

Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro

305 310 315 320

Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Gly Gly Gly Lys

325 330 335

Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg

340 345 350

Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro

355 360 365

Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Gly Gly Gly Arg Val Lys Phe

370 375 380

Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu

385 390 395 400

Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp

405 410 415

Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys

420 425 430

Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala

435 440 445

Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys

450 455 460

Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr

465 470 475 480

Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

485 490

<210> 38

<211> 592

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид"

<400> 38

Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro

1 5 10 15

Ala Phe Leu Leu Ile Pro Gly Pro Val Pro Pro Ser Thr Ala Leu Arg

20 25 30

Tyr Leu Ile Glu Glu Leu Val Asn Ile Thr Gln Asn Gln Lys Ala Pro

35 40 45

Leu Cys Asn Gly Ser Met Val Trp Ser Ile Asn Leu Thr Ala Gly Met

50 55 60

Tyr Cys Ala Ala Leu Glu Ser Leu Ile Asn Val Ser Gly Cys Ser Ala

65 70 75 80

Ile Glu Lys Thr Gln Arg Met Leu Ser Gly Phe Cys Pro His Lys Val

85 90 95

Ser Ala Gly Gln Phe Ser Ser Leu His Val Arg Asp Thr Lys Ile Glu

100 105 110

Val Ala Gln Phe Val Lys Asp Leu Leu Leu His Leu Lys Lys Leu Phe

115 120 125

Arg Glu Gly Arg Phe Asn Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro

130 135 140

Cys Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro

145 150 155 160

Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr

165 170 175

Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn

180 185 190

Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg

195 200 205

Glu Glu Gln Phe Gln Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val

210 215 220

Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser

225 230 235 240

Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys

245 250 255

Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu

260 265 270

Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe

275 280 285

Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu

290 295 300

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe

305 310 315 320

Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly

325 330 335

Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr

340 345 350

Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Met Phe Trp Val Leu

355 360 365

Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val

370 375 380

Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Gly Gly His

385 390 395 400

Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys

405 410 415

His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser

420 425 430

Gly Gly Gly Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln

435 440 445

Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser

450 455 460

Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Gly Gly Gly

465 470 475 480

Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly

485 490 495

Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr

500 505 510

Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys

515 520 525

Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys

530 535 540

Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg

545 550 555 560

Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala

565 570 575

Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

580 585 590

<210> 39

<211> 340

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид"

<400> 39

Gly Pro Val Pro Pro Ser Thr Ala Leu Arg Tyr Leu Ile Glu Glu Leu

1 5 10 15

Val Asn Ile Thr Gln Asn Gln Lys Ala Pro Leu Cys Asn Gly Ser Met

20 25 30

Val Trp Ser Ile Asn Leu Thr Ala Gly Met Tyr Cys Ala Ala Leu Glu

35 40 45

Ser Leu Ile Asn Val Ser Gly Cys Ser Ala Ile Glu Lys Thr Gln Arg

50 55 60

Met Leu Ser Gly Phe Cys Pro His Lys Val Ser Ala Gly Gln Phe Ser

65 70 75 80

Ser Leu His Val Arg Asp Thr Lys Ile Glu Val Ala Gln Phe Val Lys

85 90 95

Asp Leu Leu Leu His Leu Lys Lys Leu Phe Arg Glu Gly Arg Phe Asn

100 105 110

Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro

115 120 125

Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro

130 135 140

Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp

145 150 155 160

Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu

165 170 175

Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr

180 185 190

Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu

195 200 205

Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu

210 215 220

Leu Gly Gly Gly Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala

225 230 235 240

Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg

245 250 255

Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu

260 265 270

Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn

275 280 285

Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met

290 295 300

Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly

305 310 315 320

Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala

325 330 335

Leu Pro Pro Arg

340

<210> 40

<211> 388

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид"

<400> 40

Gly Pro Val Pro Pro Ser Thr Ala Leu Arg Tyr Leu Ile Glu Glu Leu

1 5 10 15

Val Asn Ile Thr Gln Asn Gln Lys Ala Pro Leu Cys Asn Gly Ser Met

20 25 30

Val Trp Ser Ile Asn Leu Thr Ala Gly Met Tyr Cys Ala Ala Leu Glu

35 40 45

Ser Leu Ile Asn Val Ser Gly Cys Ser Ala Ile Glu Lys Thr Gln Arg

50 55 60

Met Leu Ser Gly Phe Cys Pro His Lys Val Ser Ala Gly Gln Phe Ser

65 70 75 80

Ser Leu His Val Arg Asp Thr Lys Ile Glu Val Ala Gln Phe Val Lys

85 90 95

Asp Leu Leu Leu His Leu Lys Lys Leu Phe Arg Glu Gly Arg Phe Asn

100 105 110

Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro

115 120 125

Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro

130 135 140

Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp

145 150 155 160

Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu

165 170 175

Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser

180 185 190

Arg Gly Gly His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly

195 200 205

Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala

210 215 220

Ala Tyr Arg Ser Gly Gly Gly Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr

225 230 235 240

Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu

245 250 255

Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu

260 265 270

Leu Gly Gly Gly Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala

275 280 285

Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg

290 295 300

Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu

305 310 315 320

Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn

325 330 335

Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met

340 345 350

Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly

355 360 365

Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala

370 375 380

Leu Pro Pro Arg

385

<210> 41

<211> 420

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид"

<400> 41

Gly Pro Val Pro Pro Ser Thr Ala Leu Arg Tyr Leu Ile Glu Glu Leu

1 5 10 15

Val Asn Ile Thr Gln Asn Gln Lys Ala Pro Leu Cys Asn Gly Ser Met

20 25 30

Val Trp Ser Ile Asn Leu Thr Ala Gly Met Tyr Cys Ala Ala Leu Glu

35 40 45

Ser Leu Ile Asn Val Ser Gly Cys Ser Ala Ile Glu Lys Thr Gln Arg

50 55 60

Met Leu Ser Gly Phe Cys Pro His Lys Val Ser Ala Gly Gln Phe Ser

65 70 75 80

Ser Leu His Val Arg Asp Thr Lys Ile Glu Val Ala Gln Phe Val Lys

85 90 95

Asp Leu Leu Leu His Leu Lys Lys Leu Phe Arg Glu Gly Arg Phe Asn

100 105 110

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Gly Gly Gly Ser

115 120 125

Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

130 135 140

Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr

145 150 155 160

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

165 170 175

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

180 185 190

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys

195 200 205

Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

210 215 220

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly

225 230 235 240

Lys Met Ala Leu Ile Val Leu Gly Gly Val Ala Gly Leu Leu Leu Phe

245 250 255

Ile Gly Leu Gly Ile Phe Phe Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr

260 265 270

Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu

275 280 285

Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu

290 295 300

Leu Gly Gly Gly Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala

305 310 315 320

Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg

325 330 335

Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu

340 345 350

Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn

355 360 365

Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met

370 375 380

Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly

385 390 395 400

Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala

405 410 415

Leu Pro Pro Arg

420

<210> 42

<211> 519

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид"

<400> 42

Gly Pro Val Pro Pro Ser Thr Ala Leu Arg Tyr Leu Ile Glu Glu Leu

1 5 10 15

Val Asn Ile Thr Gln Asn Gln Lys Ala Pro Leu Cys Asn Gly Ser Met

20 25 30

Val Trp Ser Ile Asn Leu Thr Ala Gly Met Tyr Cys Ala Ala Leu Glu

35 40 45

Ser Leu Ile Asn Val Ser Gly Cys Ser Ala Ile Glu Lys Thr Gln Arg

50 55 60

Met Leu Ser Gly Phe Cys Pro His Lys Val Ser Ala Gly Gln Phe Ser

65 70 75 80

Ser Leu His Val Arg Asp Thr Lys Ile Glu Val Ala Gln Phe Val Lys

85 90 95

Asp Leu Leu Leu His Leu Lys Lys Leu Phe Arg Glu Gly Arg Phe Asn

100 105 110

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe

115 120 125

Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

130 135 140

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

145 150 155 160

Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

165 170 175

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Gln Ser

180 185 190

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

195 200 205

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser

210 215 220

Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

225 230 235 240

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln

245 250 255

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

260 265 270

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

275 280 285

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu

290 295 300

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

305 310 315 320

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

325 330 335

Leu Ser Leu Gly Lys Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys

340 345 350

Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Lys Arg Gly Arg Lys Lys

355 360 365

Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr

370 375 380

Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly

385 390 395 400

Gly Cys Glu Leu Gly Gly Gly Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp

405 410 415

Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn

420 425 430

Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg

435 440 445

Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly

450 455 460

Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu

465 470 475 480

Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu

485 490 495

Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His

500 505 510

Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

515

<210> 43

<211> 351

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид"

<400> 43

Gly Pro Val Pro Pro Ser Thr Ala Leu Arg Tyr Leu Ile Glu Glu Leu

1 5 10 15

Val Asn Ile Thr Gln Asn Gln Lys Ala Pro Leu Cys Asn Gly Ser Met

20 25 30

Val Trp Ser Ile Asn Leu Thr Ala Gly Met Tyr Cys Ala Ala Leu Glu

35 40 45

Ser Leu Ile Asn Val Ser Gly Cys Ser Ala Ile Glu Lys Thr Gln Arg

50 55 60

Met Leu Ser Gly Phe Cys Pro His Lys Val Ser Ala Gly Gln Phe Ser

65 70 75 80

Ser Leu His Val Arg Asp Thr Lys Ile Glu Val Ala Gln Phe Val Lys

85 90 95

Asp Leu Leu Leu His Leu Lys Lys Leu Phe Arg Glu Gly Arg Phe Asn

100 105 110

Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Met Phe Trp Val Leu Val

115 120 125

Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala

130 135 140

Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Gly Gly His Ser

145 150 155 160

Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His

165 170 175

Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Gly

180 185 190

Gly Gly Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro

195 200 205

Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys

210 215 220

Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Gly Gly Gly Arg

225 230 235 240

Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln

245 250 255

Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp

260 265 270

Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro

275 280 285

Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp

290 295 300

Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg

305 310 315 320

Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr

325 330 335

Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

340 345 350

<210> 44

<211> 363

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид"

<400> 44

Gly Pro Val Pro Pro Ser Thr Ala Leu Arg Tyr Leu Ile Glu Glu Leu

1 5 10 15

Val Asn Ile Thr Gln Asn Gln Lys Ala Pro Leu Cys Asn Gly Ser Met

20 25 30

Val Trp Ser Ile Asn Leu Thr Ala Gly Met Tyr Cys Ala Ala Leu Glu

35 40 45

Ser Leu Ile Asn Val Ser Gly Cys Ser Ala Ile Glu Lys Thr Gln Arg

50 55 60

Met Leu Ser Gly Phe Cys Pro His Lys Val Ser Ala Gly Gln Phe Ser

65 70 75 80

Ser Leu His Val Arg Asp Thr Lys Ile Glu Val Ala Gln Phe Val Lys

85 90 95

Asp Leu Leu Leu His Leu Lys Lys Leu Phe Arg Glu Gly Arg Phe Asn

100 105 110

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Gly Gly Gly Ser

115 120 125

Ser Gly Gly Gly Ser Gly Met Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly

130 135 140

Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe

145 150 155 160

Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Gly Gly His Ser Asp Tyr Met Asn

165 170 175

Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr

180 185 190

Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Gly Gly Gly Lys Arg

195 200 205

Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro

210 215 220

Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu

225 230 235 240

Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Gly Gly Gly Arg Val Lys Phe Ser

245 250 255

Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr

260 265 270

Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys

275 280 285

Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn

290 295 300

Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu

305 310 315 320

Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly

325 330 335

His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr

340 345 350

Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

355 360

<210> 45

<211> 470

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид"

<400> 45

Gly Pro Val Pro Pro Ser Thr Ala Leu Arg Tyr Leu Ile Glu Glu Leu

1 5 10 15

Val Asn Ile Thr Gln Asn Gln Lys Ala Pro Leu Cys Asn Gly Ser Met

20 25 30

Val Trp Ser Ile Asn Leu Thr Ala Gly Met Tyr Cys Ala Ala Leu Glu

35 40 45

Ser Leu Ile Asn Val Ser Gly Cys Ser Ala Ile Glu Lys Thr Gln Arg

50 55 60

Met Leu Ser Gly Phe Cys Pro His Lys Val Ser Ala Gly Gln Phe Ser

65 70 75 80

Ser Leu His Val Arg Asp Thr Lys Ile Glu Val Ala Gln Phe Val Lys

85 90 95

Asp Leu Leu Leu His Leu Lys Lys Leu Phe Arg Glu Gly Arg Phe Asn

100 105 110

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Gly Gly Gly Ser

115 120 125

Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

130 135 140

Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr

145 150 155 160

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

165 170 175

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

180 185 190

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys

195 200 205

Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

210 215 220

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly

225 230 235 240

Lys Met Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr

245 250 255

Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys

260 265 270

Arg Ser Arg Gly Gly His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg

275 280 285

Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp

290 295 300

Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Gly Gly Gly Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu

305 310 315 320

Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln

325 330 335

Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly

340 345 350

Cys Glu Leu Gly Gly Gly Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala

355 360 365

Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu

370 375 380

Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp

385 390 395 400

Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu

405 410 415

Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile

420 425 430

Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr

435 440 445

Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met

450 455 460

Gln Ala Leu Pro Pro Arg

465 470

<210> 46

<211> 570

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид"

<400> 46

Gly Pro Val Pro Pro Ser Thr Ala Leu Arg Tyr Leu Ile Glu Glu Leu

1 5 10 15

Val Asn Ile Thr Gln Asn Gln Lys Ala Pro Leu Cys Asn Gly Ser Met

20 25 30

Val Trp Ser Ile Asn Leu Thr Ala Gly Met Tyr Cys Ala Ala Leu Glu

35 40 45

Ser Leu Ile Asn Val Ser Gly Cys Ser Ala Ile Glu Lys Thr Gln Arg

50 55 60

Met Leu Ser Gly Phe Cys Pro His Lys Val Ser Ala Gly Gln Phe Ser

65 70 75 80

Ser Leu His Val Arg Asp Thr Lys Ile Glu Val Ala Gln Phe Val Lys

85 90 95

Asp Leu Leu Leu His Leu Lys Lys Leu Phe Arg Glu Gly Arg Phe Asn

100 105 110

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe

115 120 125

Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

130 135 140

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

145 150 155 160

Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

165 170 175

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Gln Ser

180 185 190

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

195 200 205

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser

210 215 220

Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

225 230 235 240

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln

245 250 255

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

260 265 270

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

275 280 285

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu

290 295 300

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

305 310 315 320

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

325 330 335

Leu Ser Leu Gly Lys Met Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val

340 345 350

Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp

355 360 365

Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Gly Gly His Ser Asp Tyr Met Asn Met

370 375 380

Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala

385 390 395 400

Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Gly Gly Gly Lys Arg Gly

405 410 415

Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val

420 425 430

Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu

435 440 445

Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Gly Gly Gly Arg Val Lys Phe Ser Arg

450 455 460

Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn

465 470 475 480

Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg

485 490 495

Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro

500 505 510

Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala

515 520 525

Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His

530 535 540

Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp

545 550 555 560

Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

565 570

<210> 47

<211> 363

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид"

<400> 47

Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro

1 5 10 15

Ala Phe Leu Leu Ile Pro Gly Pro Val Pro Pro Ser Thr Ala Leu Arg

20 25 30

Tyr Leu Ile Glu Glu Leu Val Asn Ile Thr Gln Asn Gln Lys Ala Pro

35 40 45

Leu Cys Asn Gly Ser Met Val Trp Ser Ile Asn Leu Thr Ala Gly Met

50 55 60

Tyr Cys Ala Ala Leu Glu Ser Leu Ile Asn Val Ser Gly Cys Ser Ala

65 70 75 80

Ile Glu Lys Thr Gln Arg Met Leu Ser Gly Phe Cys Pro His Lys Val

85 90 95

Ser Ala Gly Gln Phe Ser Ser Leu His Val Arg Asp Thr Lys Ile Glu

100 105 110

Val Ala Gln Phe Val Lys Asp Leu Leu Leu His Leu Lys Lys Leu Phe

115 120 125

Arg Glu Gly Arg Phe Asn Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg

130 135 140

Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg

145 150 155 160

Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly

165 170 175

Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr

180 185 190

Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Gly Gly Gly Lys Arg

195 200 205

Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro

210 215 220

Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu

225 230 235 240

Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Gly Gly Gly Arg Val Lys Phe Ser

245 250 255

Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr

260 265 270

Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys

275 280 285

Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn

290 295 300

Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu

305 310 315 320

Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly

325 330 335

His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr

340 345 350

Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

355 360

<210> 48

<211> 341

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид"

<400> 48

Gly Pro Val Pro Pro Ser Thr Ala Leu Arg Tyr Leu Ile Glu Glu Leu

1 5 10 15

Val Asn Ile Thr Gln Asn Gln Lys Ala Pro Leu Cys Asn Gly Ser Met

20 25 30

Val Trp Ser Ile Asn Leu Thr Ala Gly Met Tyr Cys Ala Ala Leu Glu

35 40 45

Ser Leu Ile Asn Val Ser Gly Cys Ser Ala Ile Glu Lys Thr Gln Arg

50 55 60

Met Leu Ser Gly Phe Cys Pro His Lys Val Ser Ala Gly Gln Phe Ser

65 70 75 80

Ser Leu His Val Arg Asp Thr Lys Ile Glu Val Ala Gln Phe Val Lys

85 90 95

Asp Leu Leu Leu His Leu Lys Lys Leu Phe Arg Glu Gly Arg Phe Asn

100 105 110

Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro

115 120 125

Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro

130 135 140

Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp

145 150 155 160

Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu

165 170 175

Ser Leu Val Ile Thr Gly Gly Gly Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu

180 185 190

Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu

195 200 205

Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys

210 215 220

Glu Leu Gly Gly Gly Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro

225 230 235 240

Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly

245 250 255

Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro

260 265 270

Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr

275 280 285

Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly

290 295 300

Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln

305 310 315 320

Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln

325 330 335

Ala Leu Pro Pro Arg

340

<210> 49

<211> 112

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 49

Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly

1 5 10 15

Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr

20 25 30

Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys

35 40 45

Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys

50 55 60

Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg

65 70 75 80

Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala

85 90 95

Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

100 105 110

<210> 50

<211> 107

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид"

<400> 50

Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu

1 5 10 15

Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe

20 25 30

Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu

35 40 45

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe

50 55 60

Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly

65 70 75 80

Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr

85 90 95

Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

100 105

<210> 51

<211> 229

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид"

<400> 51

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe

1 5 10 15

Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

20 25 30

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

35 40 45

Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

50 55 60

Glu Val His Gln Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser

65 70 75 80

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

85 90 95

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser

100 105 110

Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

115 120 125

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln

130 135 140

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

145 150 155 160

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

165 170 175

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu

180 185 190

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

195 200 205

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

210 215 220

Leu Ser Leu Gly Lys

225

<210> 52

<211> 12

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид"

<400> 52

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro

1 5 10

<210> 53

<211> 229

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид"

<400> 53

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe

1 5 10 15

Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

20 25 30

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

35 40 45

Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

50 55 60

Glu Val His Gln Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser

65 70 75 80

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

85 90 95

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser

100 105 110

Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

115 120 125

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln

130 135 140

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

145 150 155 160

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

165 170 175

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu

180 185 190

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

195 200 205

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

210 215 220

Leu Ser Leu Gly Lys

225

<210> 54

<211> 28

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 54

Met Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser

1 5 10 15

Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val

20 25

<---

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложены молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие химерные антигенные рецепторы (CAR), и содержащие их векторы экспрессии. CAR включают внеклеточный домен, который включает IL-13 или его вариант, который связывается с интерлейкин-13Rα2 (IL13Rα2), трансмембранную область, костимулирующий домен и внутриклеточный домен сигнализации. Также предложена популяция человеческих Т-клеток, экспрессирующих CAR, нацеленные на IL13Rα2. Популяция человеческих Т-клеток содержит центральные Т-клетки памяти. Кроме того, изобретение относится к композиции для лечения рака, содержащей указанную популяцию Т-клеток. Изобретение обеспечивает улучшенную противоопухолевую эффективность, обусловленную улучшенной стойкостью Т-клеток в микроокружении опухоли. 6 н. и 4 з.п. ф-лы, 5 табл., 12 пр., 27 ил.

1. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая химерный антигенный рецептор, где молекула нуклеиновой кислоты экспрессирует полипептид, содержащий аминокислотную последовательность: GPVPPSTALRYLIEELVNITQNQKAPLCNGSMVWSINLTAGMYCAALESLINVSGCSAIEKTQRMLSGFCPHKVSAGQFSSLHVRDTKIEVAQFVKDLLLHLKKLFREGRFNESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFQSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKMALIVLGGVAGLLLFIGLGIFFKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTIQEEDGCSCRFPEEEEGGCELGGGRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO:10).

2. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая химерный антигенный рецептор, содержащая молекулу по п. 1 и дополнительно содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую сигнальную последовательность GMSCFRa, расположенную перед нуклеотидной последовательностью, кодирующей химерный антигенный рецептор.

3. Молекула нуклеиновой кислоты по п. 2, где сигнальная последовательность GMSCFRa содержит аминокислотную последовательность MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIP (SEQ ID NO:2).

4. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая химерный антигенный рецептор, содержащая молекулу по п. 1 и дополнительно содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую последовательность перескакивания рибосомы Т2А и усеченный CD19, расположенные после нуклеотидной последовательности, кодирующей химерный антигенный рецептор.

5. Молекула нуклеиновой кислоты по п. 4, в которой последовательность перескакивания рибосомы Т2А содержит последовательность LEGGGEGRGSLLTCGDVEENPGPR (SEQ ID NO:8) и в которой усеченный CD19 содержит аминокислотную последовательность MPPPRLLFFLLFLTPMEVRPEEPLVVKVEEGDNAVLQCLKGTSDGPTQQLTWSRESPLKPFLKLSLGLPGLGIHMRPLAIWLFIFNVSQQMGGFYLCQPGPPSEKAWQPGWTVNVEGSGELFRWNVSDLGGLGCGLKNRSSEGPSSPSGKLMSPKLYVWAKDRPEIWEGEPPCVPPRDSLNQSLSQDLTMAPGSTLWLSCGVPPDSVSRGPLSWTHVHPKGPKSLLSLELKDDRPARDMWVMETGLLLPRATAQDAGKYYCHRGNLTMSFHLEITARPVLWHWLLRTGGWKVSAVTLAYLIFCLCSLVGILHLQRALVLRRKR (SEQ ID NO:9).

6. Вектор экспрессии, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-5.

7. Популяция человеческих Т-клеток, экспрессирующих химерные антигенные рецепторы, нацеленные на IL13Rα2, содержащая вектор, экспрессирующий химерный антигенный рецептор, содержащий аминокислотную последовательность GPVPPSTALRYLIEELVNITQNQKAPLCNGSMVWSINLTAGMYCAALESLINVSGCSAIEKTQRMLSGFCPHKVSAGQFSSLHVRDTKIEVAQFVKDLLLHLKKLFREGRFNESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFQSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKMALIVLGGVAGLLLFIGLGIFFKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTIQEEDGCSCRFPEEEEGGCELGGGRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 10),

где популяция человеческих Т-клеток содержит центральные Т-клетки памяти.

8. Композиция для лечения рака у пациента, содержащая популяцию аутологичных или аллогенных человеческих Т-клеток, трансдуцированных вектором, содержащим экспрессионную кассету, кодирующую химерный антигенный рецептор, где химерный антигенный рецептор содержит аминокислотную последовательность GPVPPSTALRYLIEELVNITQNQKAPLCNGSMVWSINLTAGMYCAALESLINVSGCSAIEKTQRMLSGFCPHKVSAGQFSSLHVRDTKIEVAQFVKDLLLHLKKLFREGRFNESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFQSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKMALIVLGGVAGLLLFIGLGIFFKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTIQEEDGCSCRFPEEEEGGCELGGGRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 10),

где популяция человеческих Т-клеток содержит центральные Т-клетки памяти.

9. Композиция по п. 8, где раковое заболевание представляет собой глиобластому.

10. Композиция по п. 8, где трансдуцированные человеческие Т-клетки были получены способом, включающим обработку Т-клеток, полученных от пациента, для выделения центральных Т-клеток памяти и трансдуцирование по меньшей мере части центральных клеток памяти вирусным вектором, содержащим экспрессионную кассету, кодирующую химерный антигенный рецептор, где химерный антигенный рецептор содержит аминокислотную последовательность GPVPPSTALRYLIEELVNITQNQKAPLCNGSMVWSINLTAGMYCAALESLINVSGCSAIEKTQRMLSGFCPHKVSAGQFSSLHVRDTKIEVAQFVKDLLLHLKKLFREGRFNESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFQSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKMALIVLGGVAGLLLFIGLGIFFKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTIQEEDGCSCRFPEEEEGGCELGGGRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 10).