СПОСОБ МУЛЬТИПЛЕКСНОГО ВЫЯВЛЕНИЯ ГЕНОВ ТОКСИНОВ Российский патент 2021 года по МПК C12N15/10 C12Q1/68 C40B50/06 

Описание патента на изобретение RU2746100C1

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к области исследований в медицине, микробиологии. Данное изобретение может быть применено для выявления генов токсинов для защиты человека или животных, с целью поиска бактерий, входящих в список, определенный санитарными правилами в отношении 3-4 групп патогенности, и выяснения профиля их опасности по содержанию генов токсинов, генов антибиотикорезистентности и генно-инженерных векторов для использования в составе сети Национального интеграционного центра мониторинга биологических угроз.

Уровень техники

Из уровня техники известен способ видовой и штаммовой идентификации бифидобактерий филотипа Bifidobacterium longum, отличающийся тем, что основан на комбинации и полиморфизме генов токсин-антитоксин суперсемейства RelBE и характеризующийся тем, что для идентификации проводят амплификацию с геномной ДНК с использованием набора видо- и штаммоспецифических олигонуклеотидов, ПЦР продукты анализируют в агарозном геле, а размер полученного фрагмента определяют с помощью ДНК-маркера, видовую идентификацию проводят с использованием специфичных олигонуклеотидов, причем исследуемые штаммы относят к виду В. longum в случае наработки целевого фрагмента размером 275 п. н.; штаммовую идентификацию проводят с использованием олигонуклеотидов, исследуемый штамм признают идентичным штамму В. longum subsp.infantis АТСС 15697 в случае наработки фрагментов при использовании олигонуклеотидов ReB1N-ReB1C, ReB2N-ReB2C и ReB3.1N-ReB3.2C; исследуемый штамм признают идентичным штамму В. longum subsp.infantis АТСС 55813 в случае наработки фрагментов при использовании олигонуклеотидов ReB3.1N-ReB3.1C и ReB9.1N-ReB9.1C; исследуемый штамм признают идентичным штамму В. longum subsp.infantis CCUG 52486 в случае наработки фрагментов при использовании олигонуклеотидов ReB3.1N-ReB3.1C, ReB3.4N-ReB3.4C и ReB9.1N-ReB9.2C; исследуемый штамм признают идентичным штамму В. longum DJO10A в случае наработки фрагментов при использовании олигонуклеотидов ReB3.1N-ReB3.1C; исследуемый штамм признают идентичным штамму Bifidobacterium sp.(В. longum) 12_1_47BFAA в случае наработки фрагментов при использовании олигонуклеотидов ReB3.1N-ReB3.1C и ReB4N-ReB4C; исследуемый штамм признают идентичным штамму В. longum subsp.longum F8 в случае наработки фрагментов при использовании олигонуклеотидов ReB2N-ReB2C и ReB3.3N-ReBC; исследуемый штамм признают идентичным штамму В. longum NCC2705 в случае наработки фрагментов при использовании олигонуклеотидов ReB3.1N-ReB3.2C; исследуемый штамм признают идентичным штамму В. longum subsp.longum JDM301 в случае наработки фрагментов при использовании олигонуклеотидов ReB8N-ReB8C, ReB2N-ReB2C и ReB3.1N-ReB3.1C; исследуемый штамм признают идентичным штамму В. longum subsp.longum BBMN68 в случае наработки фрагментов при использовании олигонуклеотидов ReB3.1N-ReB3.1C и ReB3.4N-ReB3.4C; исследуемый штамм признают идентичным штамму В. longum subsp.infantis 157F в случае наработки фрагментов только при использовании олигонуклеотидов ReB3.1N-ReB3.1C, ReB4N-ReB4C и ReB5N-ReB5C; исследуемый штамм признают идентичным штамму В. longum subsp.longum JCM 1217 в случае наработки фрагментов при использовании олигонуклеотидов ReB3.1N-ReB3.1C и ReB3.5N-ReB3.4C; исследуемый штамм признают идентичным штамму В. longum subsp.longum КАСС 91563 в случае наработки фрагментов при использовании олигонуклеотидов ReB10N-ReB10C и ReB3.1N-ReB3.4C (RU 2527069 С2, 27.08.2014).

Из уровня техники известно создание и скрининг библиотек генов http://www.bio.bsu.by/molbiol/files/lections/Razdel4.pdf. Указанный источник информации раскрывает получение библиотек ДНК: геномная библиотека - это совокупность всех нуклеотидных последовательностей геномной ДНК организма, клонированная в виде фрагментов в векторах. С последующим скринингом с помощью метода гибридизации колоний, иммуннодетекции продуктов генов. Кроме того раскрыто получение связанных библиотек - метод "прогулки по хромосоме". А также раскрыто и секвенирование - определение первичной структуры (последовательности нуклеотидов) молекулы ДНК. Данный источник информации выбран в качестве прототипа.

Недостатками ранее известных способов является их низкая производительность, сложность проведения анализа и избирательность. Например, при использовании указанных олигонуклеотидов для выявления одного штамма Bifidobacterium longum может потребоваться проведение более 10 специфических амплификаций.

Эра открытия новых патогенных микроорганизмов, не только не закончилась, а напротив, благодаря новым возможностям приобрела возможность изучать эволюционные и эпидемически значимые механизмы изменчивости, позволяющие патогенам более изощренно и с большей динамикой угрожать человечеству биологической катастрофой. Каждое новое инфекционное заболевание в 21 веке как никогда раньше может быть серьезным вызовом для современной медицины и ставит под угрозу безопасность населения отдельных территорий и суверенных государств. Изменение окружающей среды, вырубка тропических лесов, таяние льдов в Антарктике, увеличение плотности населения и повсеместное использование антибиотиков - все это не полный перечень актуальных факторов, провоцирующих появление новых патогенов и придание патогенам новых, эпидемически значимых свойств. Эпидемии гриппа, вызываемые новыми штаммами вируса; респираторные синдромы, вызываемые новыми короновирусами; вспышки инфекций, причиной которых является гемолитическая кишечная палочка; возникновение резистентных к антибиотикам супербактерий - примеры того, какие опасности могут поджидать человечество. В число первоочередных мер, которые необходимо предпринять для противодействия новым патогенам, входит разработка способов их быстрой и точной идентификации. Классические методы, широко используемые для типирования микроорганизмов в лабораториях, такие как ПЦР, ИФА и МАПДИ имеют ограничения по объему и качеству данных, которые можно получить о свойствах инфекционных агентов, содержащихся в интересуемом образце. Таким образом, остро стоит необходимость разработки методов, позволяющих осуществлять выявление и идентификацию новых патогенов методами секвенирования следующего поколения (next generation sequencing или NGS).

Осуществление изобретения

Заявленный способ включает следующие приемы:

1) на первом этапе выполняют создание ДНК-библиотек их выделенной геномной ДНК бактерий для последующего секвенирования на платформах высокопроизводительного секвенирования. Данный этап включает следующие стадии:

• ферментативной фрагментации ДНК;

• восстановления концов с целью получения двухцепочечной 5'-фосфорилированной ДНК с выступающим 3'-аденозином;

• лигирования специфических адаптеров по технологии быстрого ТА-лигирования;

• амплификации полученных ДНК-библиотек с внешних универсальных адаптерных последовательностей;

• отбор ДНК-библиотек целевой длины с применением силикатных парамагнитных частиц.

Применение различных специфических адаптеров для лигирования позволяет мультиплексировать образы для совместного секвенирования в рамках одного запуска платформы. Вариации методики отбора с использованием магнитных частиц позволяет варьировать длину получаемых ДНК-библиотек для анализа с помощью высокопроизводительного секвенирования на различных NGS и TGS платформах (в том числе Illumina, Ion Torrent, BGI, Oxford Nanopore и др.).

2) второй этап включает целевое обогащение (отбора) молекул ДНК-библиотек, несущих участки анализируемых генов токсинов с использованием метода жидкостной гибридизации ДНК-зонд. В качестве зондов используются оптимизированные по структуре синтетические одноцепочечные молекулы ДНК (олигонуклеотиды), несущие на 5' или 3' конце модификацию, позволяющую им обратимо связываться со специализированными парамагнитными силикатными частицами (например, в виде модификации биотина, алкиновой группы, азидной группы и аналогичных групп клик-химии). Олигонуклеотидные зонды в соответствующих буферных и температурных условиях образуют совместно с целевыми молекулами ДНК устойчивые комплементарные пары (дуплексы). Данные целевые дуплексы впоследствии связываются с суперпарамагнитными частицами, содержащие группы, реакционно активные относительно модификаций синтетических зондов. Например, молекулы биотина зондов образует ковалентную связь со стрептавидином на поверхности магнитных частиц, в результате чего молекулы ДНК, образовавшие дуплексы ДНК-зонд, оказываются связанными с магнитными частицами. Далее производится отмывка несвязавшихся нецелевых молекул ДНК. Целые молекулы ДНК впоследствии освобождаются с поверхности магнитных частиц и могут быть проанализированы методами NGS секвенирования.

Указанный этап включает следующие стадии:

• жидкостная гибридизация синтезированных ДНК-библиотек с зондами;

• захват гибридных дуплексов с помощью суперпарамагнитных частиц;

• отмывка несвязавшихся нецелевых молекул ДНК;

• освобождение связавшихся ДНК-библиотек с поверхности магнитных частиц;

• ПЦР амлификация обогащенных ДНК-библиотек;

• квантификация амплифицированных ДНК-библиотек для последующего NGS секвенования.

Задачей настоящего изобретения является высокоэффективное выделение целевых групп генов токсинов из сложных смесей разнородной входящей ДНК (смеси геномной ДНК различного состава и видового происхождения) с последующим целевым высокопроизводительным секвенированием на различных NGS и TGS платформах (в том числе Illumina, Ion Torrent, BGI, Oxford Nanopore и др.), для выявления фрагментов генов токсинов, присутствующих в исходной смеси.

Технический результат заключается в существенном увеличении относительной представленности целевых фрагментов генов токсинов в итоговой смеси ДНК, анализируемой методами высокопроизводительного секвенирования, по сравнению с входящей ДНК (т.н. обогащение целевыми фрагментами). Например, в результате применения метода на смеси геномной ДНК токсигенных штаммов бактерий происходит увеличение представленности целевых фрагментов с 0,001% в исходной смеси, до 50% и более в итоговой анализируемой пробе.

Раскрытие изобретения

Указанный технический результат реализуется за счет следующих приемов на примере пробоподготовки для платформы Illumina.

Способ мультиплексного выявления генов токсинов, реализуется следующим образом: на первом этапе выполняют подготовку ДНК-библиотек, при этом данный этап включает следующие приемы:

• выполняют ферментативную фрагментацию ДНК с применением неспецифических экзонуклеаз;

• выполняют восстановление концов с целью получения двухцепочечной 5'-фосфорилированной ДНК с выступающим 3'-аденозином;

• осуществляют лигирование специфических Y-образных адаптеров по технологии быстрого ТА-лигирования с применением Т4-ДНК л и газы, или аналогичных;

• осуществляют амплификации полученных ДНК-библиотек с применением праймеров, комплементарных внешним последовательностям специфических Y-образных адаптеров;

• выполняют отбор ДНК-библиотек целевой длины с применением силикатных парамагнитных частиц;

на втором этапе выполняют целевое обогащение молекул ДНК-библиотек, несущих участки анализируемых генов токсинов с использованием метода жидкостной гибридизации ДНК-зонд, при этом указанный второй этап содержит следующие приемы:

• осуществляют жидкостную гибридизацию синтезированных ДНК-библиотек с зондами, при этом смешивают ДНК-библиотеки со специфическими зондами для обогащения фрагментами целевых генов токсинов с применением коммерчески доступных буферов для гибридизации (например, HybBuf, Roche). Смесь для гибридизации инкубируют в твердотельном термостате, или амплификаторе при температуре от 35°С до 60°С в течение 10-50 часов;

• осуществляют захват гибридных дуплексов с помощью суперпарамагнитных частиц, связывающих дуплексы ДНК-зонд, при этом происходит смешивание раствора после гибридизации с суперпарамагнитными частицами;

• выполняют отмывку несвязавшихся нецелевых молекул ДНК, при этом выполняют серию промывок суперпарамагнитных частиц, несущих на себе связавшиеся дуплексы ДНК-зонд, с применением растворов для удаления несвязавшихся нецелевых молекул ДНК;

• выполняют освобождение связавшихся ДНК-библиотек с поверхности магнитных частиц, для чего отделяют обогащенные целевые фракции ДНК с суперпарамагнитных частиц, путем прогревания смеси при 95°С в течение 10-15 минут;

• затем осуществляю ПЦР амлификацию обогащенных ДНК-библиотек с внешних универсальных праймеров, комплементарных внешним последовательностям специфических Y-образных адаптеров;

• после чего выполняют квантификацию амплифицированных ДНК-библиотек для последующего NGS секвенирования флуориметрическим и/или спектрофотометрическим методами.

Подробное раскрытие осуществления изобретения

На первом этапе выполняют создание ДНК-библиотек. Для этого выделенная из исследуемого образца ДНК фрагментируется, проводится очистка фрагментированной ДНК, восстановление концов и лигирование адаптеров, амплификация с фланкирующих праймеров с последующей очисткой на магнитных частицах. В дальнейшем приготовленные библиотеки нормализуются и объединяются для последующего обогащения.

При этом данный этап включает следующие стадии:

• ферментативной фрагментации ДНК с применением неспецифических экзонуклеаз;

• восстановления концов с целью получения двухцепочечной 5'-фосфорилированной ДНК с выступающим 3'-аденозином;

• лигирования специфических адаптеров (для выбранной платформы секвенирования) по технологии быстрого ТА-лигирования с применением Т4-ДНК лигазы, или аналогичных;

• амплификации полученных ДНК-библиотек с внешних универсальных адаптерных последовательностей;

• отбор ДНК-библиотек целевой длины с применением силикатных парамагнитных частиц.

Применение различных адаптеров для лигирования позволяет мультиплексировать образы для совместного обогащения и секвенирования в рамках одного запуска платформы. На этапе после лигирования адаптеров (до ПЦР) может проводиться процедура отбора ДНК-библиотек по длине (двухсторонний size-select) с применением магнитных частиц (AMPure ХР, Beckman Coulter, или аналогичных) с получением библиотек со вставкой необходимой длины. Например, возможен отбор фракции библиотек со средней длиной вставки 450-500 п. о., что соответствует суммарной длине библиотеки 570-620 п.о. с учетом длины адаптерных последовательностей. Такая длина ДНК-библиотек оптимальна для последующего секвенирования на платформе Illumina MiSeq или HiSeq с длиной прочтения 2×250 п.о. Вариации методики отбора с использованием магнитных частиц позволяет варьировать длину получаемых ДНК-библиотек для анализа с помощью высокопроизводительного секвенирования на различных NGS и TGS платформах (в том числе Illumina, Ion Torrent, BGI, Oxford Nanopore и др.).

На втором этапе выполняют целевое обогащения (отбора) молекул ДНК-библиотек, несущих участки анализируемых генов токсинов с использованием метода жидкостной гибридизации «ДНК-зонд». В качестве зондов используются оптимизированные по структуре синтетические одноцепочечные молекулы ДНК (праймеры) несущие на 5' или 3' конце модификацию в виде молекулы биотина. ДНК зонды в соответствующих буферных и температурных условиях образуют совместно с целевыми молекулами ДНК устойчивые комплементарные пары (дуплексы). Данные целевые дуплексы впоследствии связываются с покрытыми стрептавидином суперпарамагнитными частицами. Молекулы биотина зондов образует ковалентную связь со стрептавидином на поверхности магнитных частиц, в результате чего молекулы ДНК, образовавшие дуплексы ДНК-зонд, оказываются связанными с магнитными частицами. Далее производится отмывка несвязавшихся нецелевых молекул ДНК. Целые молекулы ДНК впоследствии освобождаются с поверхности магнитных частиц и могут быть проанализированы методами NGS секвенирования. Панель зондов синтезирована в виде 5'-биотинилированных олигонуклеотидов (см. таблицу 1) методом твердофазного синтеза на автоматическом синтезаторе ABI 3900. Данная панель использована для отработки методики обогащения.

Указанный второй этап включает следующие стадии:

• жидкостная гибридизация синтезированных ДНК-библиотек с зондами. В рамках стадии происходит смешивание ДНК-библиотек со специфическими зондами для гибридизации в присутствии необходимых буферных условий. Смесь для гибридизации инкубируется в твердотельном термостате, или амплификаторе при выбранной температуре в течение 10-50 часов.

• захват гибридных дуплексов с помощью специфических суперпарамагнитных частиц, связывающих дуплексы ДНК-зонд. В рамках стадии происходит смешивание раствора после гибридизации со специфическими суперпарамагнитными частицами

• отмывка несвязавшихся нецелевых молекул ДНК. В рамках стадии происходит серия промывок суперпарамагнитных частиц, несущих на себе связавшиеся дуплексы ДНК-зонд, с применением растворов для удаления несвязавшихся нецелевых молекул ДНК.

• освобождение связавшихся ДНК-библиотек с поверхности магнитных частиц. В рамках стадии происходит отделение обогащенной целевой фракции ДНК с суперпарамагнитных частиц. Например, путем прогревания смеси при 95°С в течение 10-15 минут.

• ПЦР амлификация обогащенных ДНК-библиотек с внешних универсальных адаптерных последовательностей;

• квантификация амплифицированных ДНК-библиотек для последующего NGS секвенирования флуориметрическим и/или спектрофотометрическим методами.

Готовые ДНК-библиотеки подвергались процедуре гибридизации с применением разработанной панели зондов и набора для гибридизации SeqCap EZ Hybridization and Wash Kit (Roche). Образцы подвергались следующей процедуре: гибридизация ДНК-библиотек с зондами при 40°С в течение 24-48 часов, отмывку несвязавшейся ДНК, пост-гибридизацонную амплификацию с внешних фланкирующих праймеров. Набор реактивов SeqCap EZ Hybridization and Wash Kit включает буферы, блокирующие олигонуклеотиды, праймеры и полимеразу для проведения всех этапов гибридизации и ПЦР.

Промышленная применимость

Заявленный способ может быть осуществлен специалистом на практике и при осуществлении обеспечивает реализацию заявленного назначения. Возможность осуществления на практике следует из того, что для каждого признака, включенного в формулу изобретения на основании описания, известен материальный эквивалент, что позволяет сделать вывод о соответствии критерию «промышленная применимость» для изобретения и критерию «полнота раскрытия» для изобретения.

СПОСОБ МУЛЬТИПЛЕКСНОГО ВЫЯВЛЕНИЯ ГЕНОВ ТОКСИНОВ

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

Похожие патенты RU2746100C1

название год авторы номер документа
ПРЯМОЙ ЗАХВАТ, АМПЛИФИКАЦИЯ И СЕКВЕНИРОВАНИЕ ДНК-МИШЕНИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ИММОБИЛИЗИРОВАННЫХ ПРАЙМЕРОВ 2011
  • Мюллюкангас Самуэль
  • Буенростро Джейсон
  • Джи Хэнли П.
RU2565550C2
Способ пробоподготовки образцов изолятов коронавируса SARS-CoV-2 и олигонуклеотидные праймеры для его реализации 2021
  • Хафизов Камиль Фаридович
  • Акимкин Василий Геннадьевич
  • Котов Иван Андреевич
  • Борисова Надежда Ивановна
  • Колесников Антон Алексеевич
RU2762759C1
РЕАГЕНТНО-ПРОГРАММНЫЙ КОМПЛЕКС ДЛЯ ПРОВЕДЕНИЯ ТАРГЕТНОГО АНАЛИЗА 2019
  • Щетинин Алексей Михайлович
  • Почтовый Андрей Андреевич
  • Кузнецова Надежда Анатольевна
  • Спешилов Глеб Игоревич
  • Ремизов Тимофей Андреевич
  • Мануйлов Виктор Александрович
  • Гинцбург Александр Леонидович
  • Ткачук Артем Петрович
  • Гущин Владимир Алексеевич
RU2744443C1
КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ ДЛЯ УЛУЧШЕНИЯ ОБОГАЩЕНИЯ БИБЛИОТЕК 2019
  • Слэттер, Эндрю Ф.
  • Чжао, Цзюньхуа
  • Дисэнтис, Грейс
  • Гросс, Стефен М.
  • Хоган, Хейли М.
  • Ли, Цзянь-Сэнь
  • Миллер, Оливер Дж.
RU2809771C2
СПОСОБЫ И СРЕДСТВА ПОЛУЧЕНИЯ БИБЛИОТЕКИ ДЛЯ СЕКВЕНИРОВАНИЯ 2019
  • Стимерс, Фрэнк Дж.
  • Похолок, Дмитрий К.
  • Кристиансен, Лена
RU2815513C2
Способ создания кольцевой формы NGS библиотеки для высокопроизводительного секвенирования на платформах технологии DNBSEQ 2020
  • Кривой Андрей Анатольевич
  • Черанев Валерий Владимирович
  • Коростин Дмитрий Олегович
RU2746960C1
БИБЛИОТЕКИ ДЛЯ СЕКВЕНИРОВАНИЯ НОВОГО ПОКОЛЕНИЯ 2014
  • Ким Дэ Хюнь
RU2698125C2
Способ диагностики врожденного нефротического синдрома финского типа у детей с использованием технологии секвенирования нового поколения 2016
  • Баранов Александр Александрович
  • Намазова-Баранова Лейла Сеймуровна
  • Савостьянов Кирилл Викторович
  • Пушков Александр Алексеевич
  • Цыгин Алексей Николаевич
  • Маргиева Теа Валикоевна
RU2621162C1
НАПРАВЛЯЕМЫЙ ОЛИГОНУКЛЕОТИДАМИ И ОТСЛЕЖИВАЕМЫЙ КОМБИНАТОРНЫЙ СИНТЕЗ КОДИРУЕМЫХ МОЛЕКУЛ-ЗОНДОВ 2017
  • Воттс, Ричард Эдвард
RU2769571C2
ТАГМЕНТАЦИЯ С ПРИМЕНЕНИЕМ ИММОБИЛИЗОВАННЫХ ТРАНСПОСОМ С ЛИНКЕРАМИ 2018
  • Десантис, Грейс
  • Гросс, Стивен М.
  • Ли, Цзянь-Сень
  • Моррелл, Натали
  • Слаттер, Эндрю
  • Шен, Кевин
  • Сноу, Саманта
RU2783536C2

Реферат патента 2021 года СПОСОБ МУЛЬТИПЛЕКСНОГО ВЫЯВЛЕНИЯ ГЕНОВ ТОКСИНОВ

Изобретение относится к области медицины и микробиологии. Предложен способ мультиплексного выявления генов токсинов. На первом этапе осуществляют синтез ДНК-библиотек. На втором этапе выполняют целевое обогащение молекул ДНК-библиотек, несущих участки анализируемых генов токсинов с использованием метода жидкостной гибридизации ДНК-зонд. Выполняют квантификацию амплифицированных ДНК-библиотек для последующего NGS секвенирования флуориметрическим методом. Изобретение обеспечивает увеличение относительной представленности целевых фрагментов генов токсинов в итоговой смеси ДНК, анализируемой методами высокопроизводительного секвенирования по сравнению с входящей ДНК. 1 табл.

Формула изобретения RU 2 746 100 C1

Способ мультиплексного выявления генов токсинов реализуется следующим образом: на первом этапе синтез ДНК-библиотек, при этом данный этап включает следующие приемы:

- выполняют ферментативную фрагментацию ДНК с применением экзонуклеаз;

- выполняют восстановление концов с целью получения двухцепочечной 5'-фосфорилированной ДНК с выступающим 3'-аденозином;

- осуществляют лигирование Y-образных адаптеров по технологии быстрого ТА-лигирования с применением Т4-ДНК лигазы;

- осуществляют амплификацию полученных ДНК-библиотек с применением праймеров, комплементарных внешним последовательностям Y-образных адаптеров;

- выполняют отбор ДНК-библиотек целевой длины с применением силикатных парамагнитных частиц;

на втором этапе выполняют целевое обогащение молекул ДНК-библиотек, несущих участки анализируемых генов токсинов с использованием метода жидкостной гибридизации ДНК-зонд, при этом указанный второй этап включает следующие приемы:

- осуществляют жидкостную гибридизацию синтезированных ДНК-библиотек с зондами, при этом смешивают ДНК-библиотеки с зондами для гибридизации, при этом смесь для гибридизации инкубируют в амплификаторе при температуре от 35°С до 60°С в течение 10-50 часов;

- осуществляют захват гибридных дуплексов с помощью суперпарамагнитных частиц, связывающих дуплексы ДНК-зонд, при этом смешивают раствор после гибридизации с суперпарамагнитными частицами;

- выполняют отмывку несвязавшихся нецелевых молекул ДНК, при этом выполняют серию промывок суперпарамагнитных частиц, несущих на себе связавшиеся дуплексы ДНК-зонд, с применением растворов для удаления несвязавшихся нецелевых молекул ДНК;

- выполняют освобождение связавшихся ДНК-библиотек с поверхности магнитных частиц, для чего отделяют обогащенные целевые фракции ДНК с суперпарамагнитных частиц путем прогревания смеси при 95°С в течение 10-15 минут;

- затем осуществляют ПЦР амлификацию обогащенных ДНК-библиотек с применением праймеров, комплементарных внешним последовательностям Y-образных адаптеров;

- выполняют квантификацию амплифицированных ДНК-библиотек для последующего NGS секвенирования флуориметрическим методом.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2021 года RU2746100C1

EP 3130673 A1, 15.02.2017
US 20180030435 A1, 01.02.2018
ОГУРЦОВ А.Н
Молекулярная биотехнология микробиологических систем: учеб
пособие
- Харьков: НТУ "ХПИ", 2012
Приспособление в пере для письма с целью увеличения на нем запаса чернил и уменьшения скорости их высыхания 1917
  • Латышев И.И.
SU96A1
CHARBONNEAU A.R.L
et al
Defining the ABC of gene essentiality in streptococci
BMC Genomics
Автомобиль-сани, движущиеся на полозьях посредством устанавливающихся по высоте колес с шинами 1924
  • Ф.А. Клейн
SU2017A1
CHANDRA P.K
et al
Analyzing ligation mixtures using a

RU 2 746 100 C1

Авторы

Спешилов Глеб Игоревич

Почтовый Андрей Андреевич

Кузнецова Надежда Анатольевна

Щетинин Алексей Михайлович

Ремизов Тимофей Андреевич

Мануйлов Виктор Александрович

Гинцбург Александр Леонидович

Ткачук Артем Петрович

Гущин Владимир Алексеевич

Даты

2021-04-07Публикация

2019-12-17Подача