Способ получения состава для антимикробного покрытия на основе ассоциатов нанокристаллов сульфида серебра с молекулами метиленового голубого Российский патент 2021 года по МПК C30B29/46 C01G5/00 B82B3/00 B82Y5/00 B82Y40/00 C09D5/00 C09D5/14 C09D7/41 A61K31/10 

Изобретение относится к области получения антимикробных составов, точнее к области получения составов, содержащих нанокристаллы сульфида серебра, для добавок в лакокрасочные материалы и их использования при дезинфекции различных поверхностей.

Резистентность отдельных видов бактерий к большинству современных антибиотиков и недостатки ультрафиолетовой бактерицидной обработки для дезинфекции помещений, заполненных медицинским (технологическим) оборудованием делают актуальными разработку, создание и производство антимикробных составов, лишенных недостатков, присущих современным методам дезинфекции поверхностей помещений.

Общеизвестно, что ионы серебра и некоторых других металлов обладают выраженной способностью инактивировать вирусы некоторых штаммов гриппа, энтеро- и аденовирусов, оказывают значительный терапевтический эффект при лечении ряда вирусных заболеваний человека и животных, особенно при лечении коллоидным серебром, по сравнению со стандартной терапией. Поэтому перспективным подходом к созданию нового поколения антимикробных составов является использование коллоидных наночастиц металлов и полупроводниковых нанокристаллов, а также гибридных ассоциатов на их основе.

На сегодняшний день в патентной литературе имеются данные о реализованных подходах к созданию антимикробных составов и покрытий на основе наночастиц серебра [RU 2474471 C2, 12.05.2011; RU 2412967 C2, 23.08.2006], наночастиц диоксида кремния [WO 2015126278 A1, 27.08.2015] и наночастиц меди и оксида меди [RU 2446810 C2, 06.07.2010].

Так, в патенте RU 2474471 C2 от 12.05.2011 предложен метод получения антимикробного состава на основе наночастиц серебра, включающий растворение 3,5-10,1 мМ нитрата серебра AgNO₃ в 0,1-3% водном растворе карбоксиметилхитина со средневесовой молекулярной массой 50000-450000 дальтон, выполняющего роль полимера-стабилизатора. Восстановление ионов серебра в наночастицы серебра в указанных условиях осуществляется под действием гамма-излучения дозой 2-12 кГр (килогрей), приводящего к генерации сольватированных электронов в растворителе, взаимодействующих с ионами серебра. Для подавления побочных радикальных реакций в раствор добавляют спирты: изопропиловый спирт, или этанол, или этиленгликоль. Для получения металл-полимерных пленок полученный раствор подвергают испарению воды до достижения влажности 10%.

Недостатками данного способа являются наличие сложных технологических процедур с использованием гамма-излучения, наличие побочных радикальных реакций, продукты которых могут повысить токсичность состава.

В патенте RU 2412967 C2 от 23.08.2006 описан антимикробный состав на основе композиции, содержащей наночастицы серебра, получаемой в результате смешивания водных растворов наночастиц серебра 100-500 ч./млн, нитрата серебра до 500 ч./млн, 0,1-10% хитозана и его производных с возможным добавлением коллоидного водного раствора наночастиц оксида цинка в количестве от 0,000001 до 25%, от общей массы состава. Указанная композиция по заявлениям авторов обладает устойчивым бактерицидным и антигрибковым действием и может добавляться в дисперсионные краски на водной основе, обеспечивая защиту наружных и внутренних поверхностей зданий от бактериальных и грибковых поражений.

К недостаткам данного патента можно отнести отсутствие данных об антимикробном действии предложенного состава.

Альтернативным подходом в создании антимикробных составов является использование композиции, описанной в патенте WO 2015126278 A1 от 27.08.2015, включающей наноразмерные частицы неорганического вещества, активное вещество, связующее и растворитель, отличающаяся тем, что в качестве неорганического вещества содержит диоксид кремния 0,5-3,0%, в качестве активного вещества содержит смесь четвертичного аммонийного соединения 0,5-3,0% и хлоргексидина (водного 20%) 3,0-8,0%, в качестве растворителя содержит смесь этилцеллозольв 20,0-50.0% и бутилцеллозольв до 100%, а в качестве связующего содержит смесь смолы полиметилфенилсилоксановой 5,0-20,0% и сополимера бутилметакрилата и метилметакрилата 1,70- 10,0%.

Недостатком подобного подхода является отсутствие данных о возможности смешивания разработанного состава с дисперсионными красками.

В патенте RU 2446810 C2, 06.07.2010 предлагается использование наночастиц меди с размером частиц 33.8÷103 нм; толщиной оксидной пленки 6÷10 нм и наночастиц оксида меди с размером частиц 77÷124 нм в качестве антимикробного агента. Приводятся данные, свидетельствующие об антимикробном действии указанной композиции. Однако нет данных о гидрофильности предлагаемого агента.

В патенте RU 2538262, 10.01.2015 предложен способ синтеза полупроводниковых квантовых точек сульфида серебра и их ассоциатов с биологически-активными молекулами в том числе с метиленовым голубым, диспергированных в инертном фотографическом желатине. В данном патенте предлагается использование данного состава в качестве люминесцентных меток, а также в качестве компонентов при создании солнечных батарей, лазеров, светодиодов и др., однако сведений о антимикробной активности данных составов не приводится. При этом использование фотографического желатина в качестве пассиватора накладывает ряд ограничений как по росту кристаллов, так и по сферам их применения, так как желатин является благоприятной средой для развития бактерий.

Прототипом настоящего изобретения является способ водного синтеза коллоидных нанокристаллов сульфида серебра, пассивированных тиогликолевой кислотой, описанный в работах [Effect of thioglycolic acid molecules on luminescence properties of Ag₂S quantum dots / O.V. Ovchinnikov, I.G. Grevtseva, M.S. Smirnov et al. // Optical and Quantum Electronics (2020) 52:198; M.S. Smirnov, O.V. Ovchinnikov, I.G. Grevtseva, A.I. Zvyagin, A.S. Perepelitsa, R.A. Ganeev, Photoinduced Degradation of the Optical Properties of Colloidal Ag₂S and CdS Quantum Dots Passivated by Thioglycolic Acid, Optics and Spectroscopy 124 (5) (2018) 681-686], позволяющий получать гидрофильные коллоидные растворы нанокристаллов Ag₂S средним размером 1.7-3.1 нм, обладающие рекомбинационной размерно-зависимой люминесценцией в области 800-1400 нм, который заключается в одноструйном последовательном сливании растворов нитрата серебра, тиогликолевой кислоты и раствора сульфида натрия при интенсивном перемешивании в термостатируемом реакторе и последующей промывке с помощью центрифугирования от продуктов реакции.

Задачей данного изобретения является разработка способа получения состава для антимикробного покрытия на основе ассоциатов нанокристаллов сульфида серебра с молекулами метиленового голубого. Гидрофильность, получаемого по предлагаемому способу, состава позволяет использовать его для обработки поверхностей помещений, а также обеспечивает совместимость с водо-дисперсионными красками для получения антимикробного действия. Разработанные составы не являются летучими, не обладают запахом, не являются токсичными и остаются длительное время эффективными.

Технический результат настоящего изобретения заключается в расширении арсенала способов создания антимикробных и фотобактерицидных составов для дезинфекции различных поверхностей.

Технический результат достигается тем, что в способе получения состава для антимикробного покрытия на основе ассоциатов нанокристаллов сульфида серебра с молекулами метиленового голубого, включающем синтез нанокристаллов Ag₂S посредством сливания раствора тиогликолевой кислоты и нитрата серебра при температуре 30°С и при постоянном перемешивании, с последующим покапельным титрованием водным раствором NaOH, а затем добавлением водного раствора сульфида натрия, с дельнейшим перемешиванием, добавлением к раствору в объемном соотношении 1:1 ацетона; центрифугированием, последующим декантированием жидкости, добавлением к осадку растворителя, а также раствора метиленового голубого в 96%-ном этаноле, согласно изобретению, синтез ведут путем добавления к 0,027-0,03 М водному раствору тиогликолевой кислоты 0,0135-0,0154 М водного раствора нитрата серебра при постоянном перемешивании со скоростью 300-600 об/мин при обеспечении молярного соотношения 2:1 соответственно, покапельное титрование ведут 0,1 М водным раствором NaOH до рН=9, а затем добавляют 0,02-0,023 М водного раствора сульфида натрия температурой от 15 до 25°С при объемном соотношении раствор тиогликолевой кислоты: раствор нитрата серебра: раствор сульфида натрия -2:2:1 соответственно, с дельнейшим перемешиванием по меньшей мере в течение 20 минут, осаждают, а также отделяют от водорастворимых продуктов реакции путем центрифугирования со скоростью 5000 об/мин в течение 30 минут, к получившемуся осадку добавляют 50% водно-этанольный раствор, взятый в объеме, равном сумме объемов смешиваемых растворов нитрата серебра, тиогликолевой кислоты и сульфида натрия, использованных для синтеза, приливают раствор метиленового голубого в 96%-ном этаноле в количестве, обеспечивающем молярное соотношение 10^-1-10^-3 (ν_красит/ν_нк).

В результате получают гидрофильный коллоидный раствор ассоциатов нанокристаллов сульфида серебра с катионами метиленового голубого.

Фиг. 1 Приведена (а) электронная фотография НК Ag₂S, (б) гистограмма распределения по размеру НК Ag₂S и (в) рентгеновская дифракция.

На фиг. 2 представлены спектры: а) поглощения коллоидных НК Ag₂S -1; поглощения гибридных ассоциатов с катионами метиленового голубого (МВ⁺), в молярном соотношении 10^-2 (ν_красит/ν_нк) - 2; катионов метиленового голубого (МВ⁺) в спиртовом растворе - 3; б) люминесценция НК Ag₂S - 1'; ассоциатов с катионами МВ⁺, в молярном соотношении 10^-2 (ν_красит/ν_НК) - 2'; катионов метиленового голубого (МВ⁺) в спиртовом растворе - 3'.

На Фиг. 3 показаны фотографии, демонстрирующие антимикробное действие коллоидных растворов гибридных ассоциатов НК Ag₂S с катионами метиленового голубого (МВ⁺), в молярном соотношении 10^-2 (ν_красит/ν_нк) на бактерии рода Micrococcus corallines (а) и Bacillus subtilis (б) и фотографии посевов бактерий рода Micrococcus corallinus (в) и Bacillus subtilis (г) в отсутствие растворов гибридных ассоциатов.

Физический принцип функционирования предложенного состава для получения антимикробного покрытия заключается в следующем. Предлагаемый состав обеспечивает антимикробное действие за счет нескольких факторов: продуцирование активных форм кислорода, включая фотосенсибилизацию синглетного кислорода катионами метиленового голубого (МВ⁺), и образование свободных радикалов на поверхности нанокристаллов, которые взаимодействуют с бактериальными мембранными липидами, что приводит к нарушению мембранных функций ["Green" synthesis of Ag2_S nanoparticles, study of their properties and bioimaging applications / Borovaya M., Naumenko A., Horiunova I., Plokhovska S., Blume Y., Yemets A. 11 Appl Nanosci (2020). https://doi.org/10.1007/s13204-020-01365-3].

Пример 1.

Для получения состава антимикробного покрытия на основе ассоциатов нанокристаллов сульфида серебра размером 2,5-2,7 нм с катионами метиленового голубого проводится следующая последовательность операций. Для водного синтеза полупроводниковых коллоидных нанокристаллов Ag₂S, пассивированных тиогликолевой кислотой, используется 0,229-0,262 г нитрата серебра, растворенных в 100 мл дистиллированной воды, 0,250-0,276 г тиогликолевой кислоты, растворенных в 100 мл дистиллированной воды, при обеспечении молярного соотношения 2:1 соответственно, 0,080-0,090 г сульфида натрия, растворенных в 50 мл дистиллированной воды температурой 15-25°С; раствор тиогликолевой кислоты заливается в термостатируемый реактор при температуре 30°C далее при постоянном перемешивании со скоростью 300-600 об/мин вливается раствор нитрата серебра и покапельно титруется 0,1М раствор гидроксида натрия для повышения уровня рН до 9 с последующим добавлением раствора сульфида натрия и постоянным перемешиванием в течение 20 минут для обеспечения однородности распределения при росте нанокристаллов и предотвращения их агломерации.

По завершении синтеза раствор смешивают в объемном соотношении 1:1 с ацетоном (добавляя 250 мл ацетона), заливают в центрифужные пробирки объемом 10 мл и подвергают центрифугированию со скоростью 5000 об/мин в течение 30 минут для осаждения нанокристаллов и последующего отделения их от водорастворимых продуктов реакции путем слива промывного раствора с дальнейшим растворением осадка в 50% водно-этанольном растворе, взятом в объеме, равном сумме объемов смешиваемых растворов нитрата серебра, тиогликолевой кислоты и сульфида натрия, использованных для синтеза, и составляющем в данном случае 250 мл.

По завершении промывки от продуктов реакции и добавления к осадку 50% водно-этанольного раствора, приливают раствор метиленового голубого в 96%-ном этаноле в молярном соотношении 10^-1-10^-3 (ν_красит/ν_HK), для чего к 250 мл очищенного раствора наночастиц Ag₂S добавляют 10 мл 96%-ного этанольного раствора, содержащего 0,024-0,000216 г метиленового голубого.

Разработанный состав используется для получения противомикробного покрытия на основе ассоциатов нанокристаллов сульфида серебра с метиленовым голубым и представляет собой гибридные ассоциаты коллоидных нанокристаллов Ag₂S средним размером 2,5-2,7 нм и ассоциатов с катионами МВ⁺ в молярном соотношении 10^-1-10^-3 (ν_красит/ν_KH).

Формирование коллоидных НК Ag₂S подтверждается данными рентгеновской дифракции и просвечивающей электронной микроскопии (фиг. 1), а также проявлениями квантового размерного эффекта в спектре оптического поглощения, имеющем коротковолновый сдвиг по сравнению со спектром поглощения массивных кристаллов Ag₂S (фиг. 2). Наличие гибридной ассоциации НК Ag₂S с катионами МВ⁺ подтверждается перераспределением интенсивности в спектре люминесценции ассоциатов НК Ag₂S с катионами МВ⁺, характерное для гибридных ассоциатов НК Ag₂S с катионами МВ⁺ при переносе энергии возбуждения (фиг. 2).

Фотосенсибилизация активных форм кислорода предлагаемым составом подтверждалась наличием полосы с максимумом в районе 1270 нм, соответствующей люминесценции синглетного кислорода (фиг. 2).

Для исследования антимикробного действия использовался следующий подход [МУК 4.2.2316-08 Методы контроля бактериологических питательных сред]. Готовили водные суспензии семисуточных чистых культур микроорганизмов (Bacillus subtilis и Micrococcus corallinus) путем смыва стерильной водой клеточной биомассы с агаризованных питательных сред. Полученные суспензии клеток (10⁸ ед/см³) смешивали с разработанными композициями: коллоидные растворы нанокристаллов (НК) и их гибридные ассоциаты с катионами метиленового голубого в соотношении 1:1. Далее полученные смеси высевали в чашки Петри на универсальную питательную среду (МПА). Для обоих видов бактерий делались посевы контрольных образцов (без обработки суспензий клеток коллоидными растворами НК). Чашки Петри помещали в термостат и вели выращивание культур в течение 72 ч при температуре 35°С. Для исследования фотобактерицидной активности наночастиц (НЧ) и гибридных ассоциатов на их основе отдельные участки питательной среды с образцами посевов во время культивирования в термостате подвергались фотозасветке в течение 30 мин излучением с длиной волны 365 нм. По окончании выращивания (72 ч) чашки Петри с образцами посевов (контрольные и опытные) извлекались из термостата и подвергались сравнительному анализу.

Исследование антимикробного действия гибридных ассоциатов НЧ Ag₂S с катионами метиленового голубого на грамположительные бактерии Micrococcus corallinus и Bacillus subtilis (Фиг. 3) показало, что присутствие НЧ подавляет рост бактериальных клеток, ограничивая их развитие. Количество колониеобразующих единиц в чашках Петри контрольных образцов значительно превышало этот показатель в опытных образцах.

При росте бактерий Micrococcus corallinus наблюдается нарушение пигментации бактерий и ограничение областей роста до нескольких отдельных участков диаметром 4-6 мм. Фотозасветка не оказывает дополнительного действия на наблюдаемую картину (участок, подверженный фотозасветке, обведен черным маркером на фотографиях).

Для бактерий Bacillus subtilis наблюдается полное подавление роста клеток, о котором можно судить по отсутствию колоний бактериальной культуры, на фоне чего определение фотобактерицидного действия малозаметно.

Изобретение относится к области получения антимикробных составов и может быть использовано в качестве противомикробных добавок в лакокрасочные материалы и самостоятельного использования при дезинфекции различных поверхностей. Способ получения состава для антимикробного покрытия на основе ассоциатов нанокристаллов сульфида серебра (НК Ag₂S) с молекулами метиленового голубого включает сливание растворов тиогликолевой кислоты и нитрата серебра при температуре 30°С при постоянном перемешивании с последующим покапельным титрованием водным раствором NaOH, добавлением водного раствора сульфида натрия с дальнейшим перемешиванием с образованием НК Ag₂S, добавление к полученной смеси ацетона в объемном соотношении 1:1 и последующее центрифугирование, при этом используют 0,027-0,03 Μ водный раствор тиогликолевой кислоты, 0,0135-0,0154 Μ водный раствор нитрата серебра, и постоянное перемешивание ведут со скоростью 300-600 об/мин при обеспечении молярного соотношения 2:1, соответственно, покапельное титрование ведут 0,1 Μ водным раствором NaOH до рН 9, а затем добавляют 0,02-0,023 Μ водный раствор сульфида натрия с температурой от 15 до 25°С при объемном соотношении раствор тиогликолевой кислоты : раствор нитрата серебра : раствор сульфида натрия - 2:2:1, соответственно, дальнейшее перемешивание ведут, по меньшей мере, в течение 20 мин, центрифугирование полученного раствора ацетона с НК Ag₂S проводят со скоростью 5000 об/мин в течение 30 мин для осаждения НК Ag₂S, которые далее отделяют от водорастворимых продуктов реакции декантированием, а к отделенному осадку НК Ag₂S добавляют 50% водно-этанольного раствора в объеме, равном сумме объемов смешиваемых растворов нитрата серебра, тиогликолевой кислоты и сульфида натрия, и приливают раствор метиленового голубого в 96%-ном этаноле в молярном соотношении V_красит/V_нк, составляющем 10^-1-10^-3. Получаемый состав обладает гидрофильностью и подтвержденным экспериментами противомикробным действием. 3 ил., 1 пр.

Способ получения состава для антимикробного покрытия на основе ассоциатов нанокристаллов сульфида серебра (НК Ag₂S) с молекулами метиленового голубого, включающий сливание растворов тиогликолевой кислоты и нитрата серебра при температуре 30°С при постоянном перемешивании с последующим покапельным титрованием водным раствором NaOH, добавлением водного раствора сульфида натрия с дальнейшим перемешиванием с образованием НК Ag₂S, добавление к полученной смеси ацетона в объемном соотношении 1:1 и последующее центрифугирование, отличающийся тем, что используют 0,027-0,03 Μ водный раствор тиогликолевой кислоты, 0,0135-0,0154 Μ водный раствор нитрата серебра, и постоянное перемешивание ведут со скоростью 300-600 об/мин при обеспечении молярного соотношения 2:1, соответственно, покапельное титрование ведут 0,1 Μ водным раствором NaOH до рН 9, а затем добавляют 0,02-0,023 Μ водный раствор сульфида натрия с температурой от 15 до 25°С при объемном соотношении раствор тиогликолевой кислоты : раствор нитрата серебра : раствор сульфида натрия - 2:2:1, соответственно, дальнейшее перемешивание ведут, по меньшей мере, в течение 20 мин, центрифугирование полученного раствора ацетона с НК Ag₂S проводят со скоростью 5000 об/мин в течение 30 мин для осаждения НК Ag₂S, которые далее отделяют от водорастворимых продуктов реакции декантированием, а к отделенному осадку НК Ag₂S добавляют 50% водно-этанольного раствора в объеме, равном сумме объемов смешиваемых растворов нитрата серебра, тиогликолевой кислоты и сульфида натрия, и приливают раствор метиленового голубого в 96%-ном этаноле в молярном соотношении V_красит/V_нк, составляющем 10^-1-10^-3.