Способ выявления РНК вируса Хунин методом ОТ-ПЦР в реальном времени Российский патент 2024 года по МПК C12Q1/68 C12Q1/686 

Изобретение относится к биотехнологии и медицине, а именно к мониторингу и диагностике вируса Хунин (JUNV) у здоровых, больных и лиц с подозрением на геморрагическую лихорадку, вызванную вирусом Хунин.

Вирус Хунин - возбудитель аргентинской геморрагической лихорадки (АГЛ). Является эндемичным для сельскохозяйственных районов Аргентины (McCormick J.B., 2008). Принадлежат к семейству Arenaviridae, рода Mammarenavirus. Данный род включает 43 вида вирусов (https://ictv.global/taxonomy/taxondetails?taxnode_id=202202569).

Первые случаи заболевания были зафиксированы в 1950-х годах (Burrell C.J. et. al., 2016) в регионе Ла-Пампа в Аргентине. С 1958 года по 1962 год площадь с населением, подверженным данной лихорадкой, составляла менее 16 000 км² преимущественно на северо-западе Буэнос-Айрес. После 1962 года эндемическая площадь увеличилась до 120 000 км² и далее расширялась на юго-восток (Yeliziotis I. et. al., 2020). По имеющимся данным, население, подверженное риску, оценивается более чем в 5 млн жителей, а эпидемический регион занимает площадь около 150 000 км² (Barradas J.S. et. al. 2011). С 1958 по 1987 год АГЛ была распространена среди сельских рабочих мужского пола в возрасте от 20 до 50 лет. Примерно 21 000 случаев со среднегодовым увеличением на 360 случаев в год было зарегистрировано только в период с 1983 по 1987 год. После 2018 года число заражений резко сократилось. Но лихорадка продолжает циркулировать. По данным на 1 июля 2022 года в Кордове было зарегистрировано два случая АГЛ (Kumar S. et. al., 2023).

В естественной среде вирус переносится грызунами из семейства Cricetidae, рода Calomys. Основными переносчиками являются виды С.musculinus и С.laucha.

Геном вируса Хунин представлен одноцепочечной РНК с отрицательной полярностью и состоит из 2-х сегментов - L-большого сегмента длиной около 7200 нуклеотидов и S-малого сегмента, составляющего порядка 3400 нуклеотидов. Оба имеют две неперекрывающиеся открытые рамки, которые в дальнейшем используются для синтеза мРНК. L-сегмент действует как регулятор репликации вируса. Он кодирует белок L - вирусную РНК-зависимую РНК-полимеразу и цинксвязывающий матричный белок (Z) из 94 аминокислот.S-сегмент кодирует предшественник вирусного гликопротеина (GPC) и вирусный нуклеокапсидный белок (NP) (Cajimat M.N.B., 2007).

Вирионы имеют различные формы: от сферических до плеоморфных диаметром 50 - 300 нм (в среднем 110 - 130 нм), с плотной липидной оболочкой и поверхностным слоем, покрытым булавовидными выступами длиной 8-10 нм, которые важны для прикрепления и проникновения в клетки-хозяева (https://ictv.global/report_9th/RNAneg/Arenaviridae).

В соответствии с анализом управления рисками в лаборатории при работе с вирусом Хунин, требуются обеспечения условий 4 уровня биобезопасности (https://www.cdc.gov/).

Инфицирование людей происходит при прямом контакте в результате порезов и ссадин на коже или оральным и назальным путями при вдыхании пыли, содержащей экскременты, слюну грызунов. Заражаются, в основном, во время полевых сельскохозяйственный работ - во время ручной и механической вспашки. У мужчин шансы заражения в 4 раза выше по сравнению с женщинами. Инфекция на 90% более распространена среди сельского населения, чем среди городского. Вероятность заражения детей в возрасте до 14 лет составляла 10% и была редкостью у детей в возрасте до 4 лет.

Инкубационный период составляет от 6 до 14 дней. Развивается заболевание с грипподобных симптомов - лихорадки, недомогания, головной боли, миалгии. Репликация вируса на начальном этапе в основномпроисходит в легких, затем, инфекция распространяется в другие паренхиматозные ткани (Gallo G.L. et. al., 2022). На 3-5-й день заболевания у больных может появиться петехиальная сыпь на мягком небе и туловище. Заболевание может прогрессировать до генерализованного отека с развитием плевральных выпотов и кровотечений из десен, носа, желудочно-кишечного тракта и матки, а также неврологических симптомов. АГЛ также связана с вегетативной нестабильностью, и у пациентов часто наблюдаются признаки постуральной гипотензии, а также периодические приливы крови к лицу и потливость. При осложнении АГЛ с большей вероятностью переходит в геморрагическую фазу. Примерно от 15% до 30% этих случаев заканчиваются смертельным исходом (Schwind V., 2016).

В начале 90-х USAMRIID разработали аттенуированную вакцину в отношении Хунин инфекции - Candid#l. После чего, национальный институт вирусных заболеваний человека Аргентины произвел собственную вакцину Хунин, также называемую Candid#1 и по свойствам сопоставимую с произведенной ранее вакциной в США. В результате исследований вакцины производства Аргентины, национальный регулирующий орган Аргентины (ANMAT) лицензировал ее. Обе вакцина введены тысячам людей и активно применяются для работников сельского хозяйства (Maiztegui J.I. et. al., 1998). Также, помимо аттенуированных вакцин, разработки идут в направлении ДНК-вакцин, векторных рекомбинантных вакцин и вакцин на основе РНК-репликонов (Сизикова Т.Е. и др., 2018).

Несмотря на то, что вакцинация значительно снизила число заболевания АГЛ, вирус Хунин по-прежнему циркулирует среди населения Аргентины. Заболевания возникают в связи с изменениями в способах посева урожая основных сельскохозяйственных культур Аргентины - кукурузы, сои и подсолнечника, т.е. в результате антропогенного фактора в связи с чем, периодически увеличивается популяция мышей (Chiappero М.В. et. al., 2018; MacLachlan N.J. et. al., 2017).

Диагностируют вирус Хунин по наличию вирусной РНК в биологических образцах методом ОТ-ПЦР. В качестве анализируемых образцов для диагностики могут выступать пробы образцов цельной крови, плазмы крови, образцы мочи, спинномозговой жидкости, печени и почек, селезенки (https://www.who.int/ru). Метод диагностики предусматривает экстракцию РНК из биологических образцов с последующим проведением полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией для целевых фрагментов РНК генома вируса Хунин с использованием набора праймеров и зонда.

Однако, не существует готовых наборов для выявления РНК вируса Хунин методом ОТ-ПЦР в реальном времени, зарегистрированных на территории России. В настоящее время вирус Хунин вызвал несколько известных вспышек лихорадки, тем не менее, из-за высокого уровня смертности патоген представляет проблему общественного здравоохранения. Для того, чтобы сдержать распространение болезни, требуются инструменты для своевременной диагностики заболевших, а также для выявления носителей вируса Хунин еще до появления первых симптомов.

Целью создания настоящего изобретения является расширение арсенала средств эпиднадзора для мониторинга носительства вируса Хунин.

Технической задачей изобретения является разработка высокочувствительного способа идентификации РНК вируса Хунин в биологических образцах.

Поставленная задача решалась путем:

- конструирования диагностических праймеров и флуоресцентно-меченного зонда на специфические для JUNV кДНК фрагменты, полученные с РНК матрицы;

- конструирования рекомбинантной плазмидной ДНК и М82-фага, несущих специфический участок РНК-матрицы;

- оптимизации концентраций компонентов реакционной смеси и условий проведения ПЦР.

Авторами предложен способ выявления вируса Хунин, согласно которому, выделенную из биологических образцов РНК анализируют в одной пробирке при помощи реакции обратной транскрипции и дальнейшей полимеразной цепной реакции полученных кДНК, при помощи олигонуклеот идных праймеров и соответствующего флуоресцентно-меченого зонда, комплементарных участку гена L, кодирующего РНК-зависимую РНК-полимеразу вируса Хунин.

Анализ результатов проводят с помощью программного обеспечения используемого прибора для проведения ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени». Результаты интерпретируют на основании наличия или отсутствия пересечения кривой флуоресценции с установленной на соответствующем уровне пороговой линией, что соответствует наличию или отсутствию значения порогового цикла Ct, причем результат считают положительным в случае, если кривая накопления флуоресценции для соответствующего образца имеет характерную «сигмовидную» форму и пересекает пороговую линию.

На начальном этапе были подобраны и синтезированы пара специфических олигонуклеотидных праймеров и зонд для гибридизационно-флуоресцентной детекции продуктов ПЦР. Для этого в базе данных GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) был выбран наиболее консервативный участок генома JUNV. Были проанализированы все имеющиеся в базе данных последовательности. Также были подобраны праймеры и флуоресцентный зонд для внутреннего контрольного образца ПЦР. Последовательности олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентного зонда представлены в Таблице 1 и Таблице 2.

Сущность изобретения поясняется чертежом, где на Фиг. 1 представлены кривые флуоресценции, отражающие динамику образования продукта реакции при анализе контрольных образцов. Каждая кривая выше пороговой линии отображает положительный результат на выявление в образце РНК вируса Хунин, каждая кривая ниже пороговой линии отображает отрицательные контроли, не содержащие РНК данного патогена.

Подбор и анализ свойств олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентного зонда проводился с использованием программного обеспечения Oligonucleotide Properties Calculator и MFold.

Для контроля качества прохождения этапов обратной транскрипции и ПЦР в состав методики были введены рекомбинантные положительные контрольные образцы К+ и ПКО, а также внутренний контрольный образец - ВКО. Матрицу для создания рекомбинантных положительных контрольных образцов получали синтетическим методом на основе ампликона, включающего в себя диагностическую область-мишень и фланкирующие последовательности нуклеотидов. Ампликон получали методом ПЦР в один шаг. Конечный ПЦР-продукт лигировали в плазмидный вектор pGEM-T («Promega», USA) под контролем промотора Т7 РНК полимеразы и трансформировали им Escherichia coli (штамм XLl-Blue). Рекомбинантныеплазмиды из индивидуальных клонов проверяли на правильность ориентации целевой последовательности и отсутствие мутаций в области посадки праймеров и зонда. Проверку осуществляли методом секвенирования по Сэнгеру с помощью прибора для автоматического капиллярного секвенирования ABI PRISM 3500×1 («Applied Biosystems», США).

Соответствующие заданным критериям рекомбинантные плазмиды использовали для приготовления положительного контрольного образца этапа ПЦР (К+). Для этого определяли концентрацию ДНК в растворе рекомбинантной плазмиды и разводили в 1×ТЕ-буфере (рН 8.0) со стабилизаторами натрия азида 0,05% и ДНК спермы лосося 0,02 мг/мл до рабочей концентрации 1*10⁷ копий/мл. Также, плазмиды использовались для получения рекомбинантного РНК-содержащего положительного контрольного образца (ПКО) с защитной белковой оболочкой MS2-фага. Для полученного продукта производили определение концентрации методом цифровой капельной ПЦР (ddPCR) («BioRad», USA). Рабочая концентрации составила 1*10⁷ копий/мл, которую использовали в качестве ПКО в дальнейшем анализе.

Оценку предела обнаружения метода производили на разведениях ПКО, из которых экстрагировали РНК с помощью набора для выделения нуклеиновых кислот «Рибо-Преп» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии, Россия), а затем с помощью специфических праймеров и флуоресцентных зондов определяли минимальное разведение, детектируемое как положительное в 100% случаев. Определенная таким образом аналитическая чувствительность метода составила 1*10³ копий/мл.

Свойство изобретения специфически определять РНК вируса Хунин достигнуто путем подбора праймеров и зондов к высококонсервативным фрагментам РНК вируса, что минимизирует возможность перекрестных реакций с нуклеиновыми кислотами человека, близкородственных микроорганизмов, других инфекционных возбудителей.

Аналитическую специфичность оценивали при помощи тестирования образцов нуклеиновых кислот человека и следующих вирусов: вируса кори, вируса Конго-Крымской геморрагической лихорадки, вируса клещевого энцефалита, вируса парагриппа человека типа 4b, риновируса человека 17 типа, коронавируса SARS-CoV-2, аденовируса человека 6 типа, вируса Коксаки человека типа В1, эховируса человека 4 типа (вирус ECHO 4 типа), парэховируса человека 1 типа, вируса герпеса человека 5 типа, вируса эпидемического паротита, вируса краснухи. Неспецифические реакции отсутствуют.

Таким образом, в результате проведенных исследований был разработан и апробирован способ выявления РНК вируса Хунин в различных видах биологического материала. Технический результат достигается путем определения РНК JUNV, включающим выделение РНК исследуемой пробы, проведение обратной транскрипции и ПЦР с учетом результатов в режиме реального времени, согласно изобретению.

Подготовку проб проводили согласно МУ 1.3.2569-09 «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности». Материалом для исследования могут служить клинические и биологические образцы.

Экстракция производится из 100 мкл полученной суспензии образца с лизирующим буфером на основе 6 моль гуанидинизотиоцианата в объеме, указанном в инструкции к набору для выделения РНК, и последующим инкубированием 5 минут при температуре (65±1)°С. Выделение РНК осуществляют с помощью наборов «Рибо-преп» и «Рибо-Сорб» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии, Россия) в соответствии с инструкциями к наборам. Во все пробирки, включая контроль выделения, до этапа прогревания в лизирующем буфере добавляют 10 мкл ВКО. После выделения РНК приступают к постановке ОТ-ПЦР.

Для упрощения подготовки и стандартизации выполнения анализа в тест-систему входят 8 реактивов:

1) Реактив Amp 1RT - буферный раствор, содержащий фермент для обратной транскрипции. Представляет из себя буферный раствор, содержащий 50 мМ Трис-HCl, рН 8,0 (при 25°С), 100 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 5 мМ дитиотреитол, 50% (v/v) глицерин и 0,1% (v/v) NP-40, ингибитор РНКаз, M-MuLV - RH ревертазу и HS-Taq ДНК-полимеразу;

2) Реактив Amp 1В - буферный раствор, содержащий 100 мМ Трис-HCl, рН 8,3 (при 25°С), 150 мМ КС1, 0,6 мМ каждого дезоксинуклеозидтрифосфата, 10 мМ MgC12, 8 мМ дитиотрейтола, стабилизаторы и усилители ферментов;

3) Реактив Amp 2 "JUNV" - содержит олигонуклеотидные праймеры и флуоресцентно-меченые олигонуклеотидные зонды к РНК вируса Хунин и к ВКО;

4) К+"JUNV" - положительный контроль этапа ПЦР. Представляет из себя смесь двух плазмидных ДНК: плазмиды, содержащей фрагмент вируса Хунин и плазмиды, содержащей фрагмент ВКО, с которых, при помощи реактива Атр2, амплифицируются специфические фрагменты;

5) К- отрицательный контроль этапа ПЦР. Представляет из себя дистиллированную воду;

6) ПКО "JUNV" - положительный контрольный образец этапа экстракции и обратной транскрипции нуклеиновых кислот.Представляет из себя псевдовирусные частицы на основе МS2-фага, содержащие РНК с фрагментом РНК вируса Хунин, которые после выделения и обратной транскрипции в кДНК, амплифицируются при помощи реактива Amp 2;

7) ОКО - отрицательный контрольный образец этапа экстракции нуклеиновых кислот. Представляет из себя дистиллированную воду;

8) ВКО - внутренний контрольный образец этапа экстракции. Представляет из себя плазмиду, содержащую фрагмент ВКО, которая амплифицируются при помощи реактива Amp 2 "JUNV".

Реактивы ПКО, ВКО и ОКО хранятся при температуре +4°С, остальные хранятся при температуре от - 22°С до - 18°С.

Для постановки реакции ОТ-ПЦР в реальном времени нужно взять необходимое количество микропробирок объемом 0,2 мл, соответствующее числу исследуемых проб; плюс четыре пробирки для положительных и отрицательных контролей. Подготовить ПЦР-смесь из расчета на одну реакцию: 1 мкл реактив Amp 1RT, 12,5 мкл реактив Amp 1 В, 1,5 мкл реактив Amp2. Смесь вортексируют и осаждают на настольной центрифуге. По 15 мкл полученной смеси вносят в пробирки, затем добавляют в каждую по 10 мкл РНК-пробы, экстрагированной из исследуемого материала. Готовят 4 контрольные реакции. Для этого в пробирку для положительного контроля ПЦР вносят 10 мкл К+, в пробирку для положительного контроля обратной транскрипции вносят 10 мкл образца, экстрагированного из ПКО. В пробирку для отрицательного контроля ПЦР вносят 10 мкл К-, в пробирку для отрицательного контроля экстракции вносят 10 мкл пробы, экстрагированной из ОКО. Конечный объем реакционной смеси составляет 25 мкл. Микропробирки переносят в программируемый амплификатор с функцией детекции флуоресценции в режиме «реального времени» по каналам (FAM/SybrGreen/Green и JOE/ HEX). Режим амплификации представлен в таблице 3.

Детекцию флуоресцентного сигнала производят при 60°С по каналам Green (FAM) и Yellow (JOE/HEX). Учет и анализ результатов проводят с помощью программного обеспечения прибора на основании отсутствия или наличия сигнала флуоресценции в исследуемых пробах по детектируемым каналам. Результаты интерпретируют на основании наличия (или отсутствия) пересечения кривой флуоресценции с установленной на соответствующем уровне пороговой линией, что соответствует наличию (или отсутствию) значения порогового цикла (Ct) в соответствующей графе в таблице результатов. Результат считают положительным в случае, если кривая накопления флуоресценции для соответствующего образца имеет характерную «сигмовидную» форму и пересекает пороговую линию. Накопление флуоресцентного сигнала по каналу HEX свидетельствует о наличии в исследуемом материале РНК JUNV. При этом результат считается валидным, если параллельно в пробе по каналу FAM регистрируется накопление флуоресцентного сигнала ВКО, а в образцах К+ и ПКО - по каналу HEX. Сигнал по каналу HEX в образцах К- и ОКО должен отсутствовать.

Таким образом, заявляемый способ выявления позволяет достоверно выявлять РНК вируса Хунин в клинических пробах.

--->

<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing

1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">

<ST26SequenceListing originalFreeTextLanguageCode="ru"

nonEnglishFreeTextLanguageCode="ru" dtdVersion="V1_3"

fileName="Последовательности_Способ выявления РНК вируса Хунин

методом ОТ-ПЦР.xml" softwareName="WIPO Sequence"

softwareVersion="2.3.0" productionDate="2023-10-27">

<ApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>0000</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2023-09-25</FilingDate>

</ApplicationIdentification>

<ApplicantFileReference>0000</ApplicantFileReference>

<EarliestPriorityApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>0000</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2023-09-25</FilingDate>

</EarliestPriorityApplicationIdentification>

<ApplicantName languageCode="ru">Федеральное бюджетное учреждение

науки «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт

эпидемиологии и микробиологии им. Пастера Федеральной службы по

надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия

человека»</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>Department of Epidemiology, Pasteur Institute,

Federal Service on Consumers&apos; Rights Protection and Human

Well-Being Surveillance</ApplicantNameLatin>

<InventorName languageCode="ru">Дедков Владимир

Георгиевич</InventorName>

<InventorNameLatin>Dedkov Vladimir Gueorguievich</InventorNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">Способ выявления РНК вируса Хунин

методом ОТ-ПЦР в реальном времени </InventionTitle>

<InventionTitle languageCode="en">Method for detecting Junin virus

RNA by real-time RT-PCR </InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>3</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>26</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..26</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q7">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>tgggctgataaacttgtttaatttag</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="2">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>24</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..24</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q5">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>tgatgtgatacctgtcacttatac</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="3">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>26</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..26</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q9">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>misc_feature</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>&gt;26</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier id="q10">

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Non-fluorescent Black Hole Quencher 1

(2-[N-(2-hydroxyethyl)-4-[[2-methoxy-5-methyl-4-[(4-methyl-2-

nitrophenyl)diazenyl]phenyl]diazenyl]anilino]ethanol) at

3&apos;-end</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>misc_feature</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>&lt;1</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier id="q11">

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Rhodamine 6G

(9-[2-(ethoxycarbonyl)phenyl]-N-ethyl-6-(ethylamino)-2

7-dimethyl-3H-xanthen-3-iminium chloride) fluorophore at 5&apos;

end</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>tcatggaagcacaccatttccagcag</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Изобретение относится к области биотехнологии. Описан способ выявления РНК вируса Хунин методом ОТ-ПЦР в реальном времени, включающий экстракцию РНК из биологических образцов, с последующим проведением двухстадийной реакции ОТ-ПЦР для целевых фрагментов РНК генома вируса с использованием набора олигонуклеотидных праймеров и соответствующего флуоресцентно-меченого зонда, комплементарных участку гена L, кодирующего РНК-зависимую РНК-полимеразу вируса Хунин, в качестве прямого праймера используется последовательность tgggctgataaacttgtttaatttag, в качестве обратного праймера - tgatgtgatacctgtcacttatac, а в качестве зонда - последовательность tcatggaagcacaccatttccagcag, у которого на 5'-конце расположена флуоресцирующая метка R6G, а на 3'-конце нефлуоресцирующий гаситель BHQ1. Способ предназначен для мониторинга и диагностики вируса Хунин у здоровых, больных и лиц с подозрением на геморрагическую лихорадку, вызванную вирусом Хунин. 1 ил., 3 табл., 1 пр.

Способ выявления РНК вируса Хунин методом ОТ-ПЦР в реальном времени, включающий экстракцию РНК из биологических образцов, с последующим проведением двухстадийной реакции обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции для целевых фрагментов РНК генома вируса с использованием набора олигонуклеотидных праймеров и соответствующего флуоресцентно-меченого зонда, комплементарных участку гена L, кодирующего РНК-зависимую РНК-полимеразу вируса Хунин, отличающийся тем, что в качестве прямого праймера используется последовательность tgggctgatаааcttgtttaatttag, в качестве обратного праймера - tgatgtgatасctgtcacttatac, а в качестве зонда - последовательность tcatggaagcacaccatttccagcag, у которого на 5'-конце расположена флуоресцирующая метка R6G, а на 3'-конце нефлуоресцирующий гаситель BHQ1.