Способ выявления вируса Mammarenavirus guanaritoense методом DETECTR с изотермической амплификацией Российский патент 2025 года по МПК C12Q1/68 C12Q1/6876 

Изобретение относится к биотехнологии и медицине, а именно к диагностике инфекционных заболеваний, в частности к проблеме выявления генетических маркеров вируса Mammarenavirus guanaritoense (GTOV).

РНК-содержащий вирус Mammarenavirus guanaritoense принадлежит роду Mammarenavirus, семейству Arenaviridae, относится к I группе патогенности (BSL-4), является возбудителем Венесуэльской геморрагической лихорадки (ВГЛ). Естественным резервуаром данного вируса являются грызуны Zygodontomys brevicauda, распространенные в восточной части Центральной Америки и в северной части Южной Америки. Изоляты GTOV также были обнаружены в Oligoryzomys delicatus и Sigmodon alstoni.

В период с 1989 года до 2006 известно о 618 случаях заражения GTOV. Из-за политического и экономического кризиса в Венесуэле в 2006-2021 годах эпидемиологические исследования практически не проводились. С 2021 года по настоящее время в штатах Венесуэлы Баринас и Португеса зарегистрировано 36 подтвержденных и 118 предположительных случаев заражения GTOV. Группой риска заражения являются рабочие фермерских хозяйств в областях распространенности данных грызунов.

Инкубационный период составляет 3-12 дней, летальность ВГЛ оценена в 33,3%. Наиболее распространенными симптомами ВГЛ являются лихорадка, головная боль, кашель, боль в горле, тошнота, рвота, диарея, носовое кровотечение, кровоточивость десен, меноррагия и мелена. Смерть происходит чаще всего вследствие диффузного отека легких и развития геморрагических симптомов. На данный момент не существует вакцинации против GTOV, а также эффективного лечения ВГЛ.

Симптоматически ВГЛ не отличается от других геморрагических лихорадок Южной Америки, анализы на общие показатели крови также не позволяют определить болезнь. Идентификация вируса возможна только при помощи лабораторных методов.

Для обнаружения вируса М. guanaritoense методами вирусной изоляции и культивирования и реакцией нейтрализации необходим наивысший уровень биобезопасности лаборатории BSL-4, утвержденный только в ограниченном количестве лабораторий в мире (https://doi.org/10.1007/s00705-022-05453-3), что является значительным препятствием для их применения.

Согласно Центру по контролю и профилактике заболеваний США (https://ndc.services.cdc.gov/case-definitions/viral-hemorrhagic-fever-2022/) вирусные геморрагические лихорадки обычно диагностируются методами иммуноферментного анализа (ИФА), вирусной изоляцией в клетках культуры из крови или тканей, иммуногистохимией и детектирование специфической РНК вируса методом ПНР с обратной транскрипцией из крови или тканей.

Недостатком тестирование крови на иммуноглобулины М (IgM) является возможная неспецифичность реакции относительно геморрагических лихорадок, вызываемых другими аренавирусами (doi: 10.1007/s00705-022-05453-3).

Примером теста ИФА на GTOV является https://cnphi.canada.ca/gts/reference-diagnostic-test/4607?labId=1021, рекомендуемого системой здравоохранения Канады. Среди его недостатков можно выделить длительное время анализа - 14 дней.

Кроме того, известным недостатком любого метода, основанного на выявлении антител IgM и IgG, является сам принцип работы метода, а именно выявление иммунной реакции организма на возбудитель заболевания, а не самого возбудителя [Основы иммуноанализа: учебное пособие/Н.Е. Максимова, Н.Н. Мочульская, В.В. Емельянов; под общ. ред. Н.Н. Мочульской; Министерство науки и высшего образования Российской Федерации, Уральский федеральный университет. - Екатеринбург: Изд-во Урал. ун-та, 2021. - 148 с.: ил. - Библиогр.: с. 147. - 30 экз. - ISBN 978-5-7996-3295-3].

Примером анализа на основе ПЦР может служить система, применяемая в Викторианской референс-лаборатории по диагностике инфекционных заболеваний в Австралии (Victorian Infectious Diseases Reference Laboratory) (https://www.vidrl.org.au/resources/test-handbook/tests/guanarito-virus-pcr/). Преимуществом анализа ПЦР является прямое специфическое выявление генетических маркеров вируса. Известным недостатком данного метода анализа является потребность в специальном оборудовании - амплификаторов и длительном времени анализа, занимаемого обычно более 1 часа, например, в системе мультиплексной ПЦР реального времени с обратной транскрипцией (https://doi.org/10.4269/ajtmh.2010.09-0636).

В России на данный момент не существует зарегистрированных тест-систем на основе ИФА или ПЦР для достоверной диагностики вируса М. guanaritoense.

Изобретение направлено на разработку изотермического способа идентификации генетического материала вируса М. guanaritoense в биологических образцах и других вирус содержащих пробах.

Технический результат - расширение арсенала средств, используемых для диагностики, контроля и профилактики возможных будущих эпидемий, обеспечение достоверной диагностики наличия РНК вируса М. guanaritoense.

Поставленная задача решалась следующим путем:

1) конструирование диагностических праймеров, гидовой РНК и флуоресцентно-меченного зонда на консервативный участок гена L-сегмента РНК-зависимой РНК-полимеразы вируса;

2) конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК и получение транскрибированной РНК, несущий специфический участок РНК-матрицы;

3) составление и оптимизация компонентов реакционной смеси и условий проведения анализа для совмещенной системы изотермической амплификации с обратной транскрипцией RT-RPA и системы детекции на основе платформы DETECTR (DNA endonuclease-targeted CRISPR trans reporter) с использованием Lba Cas12a (далее Cas12a).

Сущность изобретения поясняется чертежами, где на ФИГ. 1 представлены кривые флуоресценции, полученные в программе прибора CFX96 Touch (Bio-Rad, США) для случаев образцов с разведением ДНК (А) и РНК (Б) К+ при применении метода DETECTR, совмещенного в одной пробирке с изотермической рекомбиназной полимеразной амплификацией и обратной транскрипцией с использованием специфических праймеров, гидовой РНК и флуоресцентного зонда. В данном случае ДНК К+ представляет собой линейную ДНК, в состав которой входит детектируемый фрагмент вируса и фланкирующие последовательности, а РНК К+ содержит аналогичную транскрибированную последовательность. Отрицательный контрольный образец, не содержащий последовательность вируса GTOV, изображен черным цветом. В нем нет существенного роста флуоресцентного сигнала. Образцы, содержащие ДНК (А) или РНК (Б) К+, в состав которого входит вставка последовательности фрагмента генома вируса GTOV, изображены на А и Б следующими цветам, соответствующими концентрациям К+: 10² копий/мкл - красный, 10³ копий/мкл - светло-зеленый, 10⁴ копий/мкл - темно-зеленый, 10⁵ копий/мкл - голубой, 10⁶ копий/мкл - синий. В случаях более концентрированных образцов наблюдается значительный рост сигнала. Конечная точка значения флуоресценции на 40 минуте анализа превышает значение отрицательного контроля. При аппроксимации кривых флуоресценции линейными функциями, значение их коэффициента наклона больше, чем для случая отрицательного наклона. Поэтому результаты анализа образцов, содержащих ДНК К+ в концентрации более 100 копий/мкл и РНК К+ в концентрации более 1000 копий/мкл со вставкой GTOV, интерпретируются как положительные. Форма кривой флуоресценции зависит от концентрации РНК М. guanaritoense в образце, ее характерный вид - возрастающая зависимость значений флуоресцентного сигнала от времени, имеющая или не имеющая линейность по времени и достигающая или не достигающая насыщения по мере прохождения анализа.

Таким образом, результатом является получение достоверной диагностики наличия РНК вируса М. guanaritoense с помощью метода DETECTR на основе Lba Cas12a, совмещенного с изотермической амплификацией и обратной транскрипцией в одной пробирке.

Данный метод основан на определении наличия РНК вируса М. guanaritoense, выделенной из биологических образцов, по флуоресцентному сигналу при помощи реакции рекомбиназной полимеразной амплификации (RPA) с обратной транскрипцией с использованием специфических праймеров, совмещенной в одной пробирке с системой детекции на основе нуклеазы Cas12a, направляемой специфической гидовой РНК, частично комплементарной участку гена L-сегмента РНК-зависимой РНК-полимеразы данного вируса. Результатом применения данного метода является изменение зависимости флуоресцентного сигнала от времени. Анализ результатов проводят с помощью программного обеспечения прибора, способного считывать флуоресцентный сигнал от красителя FAM в изотермических условиях при +40°С в режиме «реального времени». Примером такого прибора является амплификатор CFX96 Touch (Bio-Rad, США). Результаты интерпретируют на основании наличия или отсутствия отличия кривой флуоресценции пробы от отрицательного контрольного образца, не содержащего РНК М. guanaritoense. Причем результат считается положительным, если уровень флуоресцентного сигнала и угол наклона кривой флуоресценции в пробе выше, чем в отрицательных контрольных образцах.

Преимуществом представленного способа обнаружения РНК вируса М. guanaritoense методом DETECTR с изотермической амплификацией над ПЦР с обратной транскрипцией является отсутствие необходимости в специальном оборудовании - термоциклерах или амплификаторах "реального времени", поскольку все реакции, в том числе амплификация, протекают при одной температуре +40°С. Кроме того сокращается время проведения анализа.

Принцип работы метода DETECTR заключается в следующем. В основе диагностической платформы DETECTR лежит способность фермента Cas12a к коллатеральной нуклеазной активности. Она проявляется в том случае, когда комплекс Cas12a с гидовой РНК специфически распознает и взаимодействует с мишенью - дцДНК, и после активации нуклеазной активности становится способным расщеплять любые одноцепочечные ДНК. Таким образом, если в качестве одноцепочечных ДНК использовать ДНК-зонды, меченные с одного конца флуорофором (FAM) и с другой стороны гасителем (BHQ1), то при их расщеплении происходит высвобождение флуорофора от гасителя и появление флуоресцентного сигнала. Так получается система, способная реагировать на наличие в растворе дцДНК последовательности-мишени возрастанием флуоресцентного сигнала от расщепленных зондов. Поскольку М. guanaritoense является РНК-содержащим вирусом, для получения кДНК была использована реакция обратной транскрипции. Для амплификации кДНК и получения дцДНК последовательности-мишени в детектируемом количестве использована изотермическая рекомбиназная полимеразная амплификация.

На начальном этапе были подобраны и синтезированы пара специфических олигонуклеотидных праймеров, специфическая гидовая РНК и неспецифический зонд для флуоресцентной детекции продуктов амплификации при помощи Cas12a. Для этого в базе данных NCBI Mega BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) на основе анализа всех последовательностей был выбран наиболее уникальный и консервативный участок генома вируса М. guanaritoense - фрагмент гена, кодирующего L-сегмент РНК-зависимой РНК-полимеразы, длиной 149 пар нуклеотидов. Подбор олигонуклеотидных праймеров проводился согласно рекомендациям TwistAmp® DNA Amplification Kits, Assay Design Manual и анализировался с использованием программного обеспечения Multiple Primer Analyzer (Thermo Fisher Scientific) и SnapGene. Для подбора специфической гидовой РНК для Lba Cas12a на выбранную мишень использовался инструмент CRISPRscan (https://www.crisprscan.org/sequence/). Последовательности олигонуклеотидных праймеров, гидовой РНК и флуоресцентного зонда представлены в Таблице 1.

Для контроля качества прохождения диагностики в состав методики был введен положительный контрольный образец РНК К+. Матрицу для создания рекомбинантного положительного контрольного образца получали синтетическим методом на основе ампликона, включающего в себя диагностическую область-мишень и фланкирующие последовательности нуклеотидов. Ампликон получали методом ПЦР в один шаг. Конечный ПЦР-продукт лигировали в плазмидный вектор рЕТ под контролем промотора Т7 РНК полимеразы и трансформировали им Escherichia coli (штамм Turbo, New England BioLabs, США). Рекомбинантные плазмиды из индивидуальных клонов проверяли на правильность ориентации целевой последовательности и отсутствие мутаций в области посадки праймеров и гидовой РНК. Проверку осуществляли методом секвенирования по Сэнгеру с помощью прибора для автоматического капиллярного секвенирования ABI PRISM 3500xl (Applied Biosystems, США).

Соответствующие заданным критериям рекомбинантные плазмиды использовали для приготовления положительного контрольного образца РНК К+, который представляет собой транскрибированную РНК, содержащую вставку выбранного участка L-сегмента РНК-зависимой РНК-полимеразы вируса М. guanaritoense.

Реализация метода DETECTR с изотермической амплификацией происходила следующим образом. Для одной реакции на 25 мкл составляется 14 мкл смеси для RT-RPA и 10 мкл смеси DETECTR. Смесь RT-RPA составляют с использованием реагентов из набора TwistAmp® Liquid Basic (TwistDx™, UK): по 0,72 мкл каждого праймера RPA_GTOV_F и RPA_GTOV_R (ДНК-Синтез, Россия) в концентрации 10 мкМ, 7,5 мкл 2х Reaction Buffer (TwistDx™, UK), 0,675 мкл dNTPs в концентрации 10 мМ каждого (New England Biolabs, США), 1,5 мкл 10х Basic E-mix (TwistDx™, UK), 0,3 мкл обратной транскриптазы M-MuLV в концентрации 200,000 U/ml (New England Biolabs, США), 0,75 мкл 20x Core Reaction Mix (TwistDx™, UK), 0,75 мкл 280 мМ MgOAc (TwistDx™, UK), 1,085 мкл ультрачистой воды Milli-Q. Для получения смеси DETECTR смешивают по 2,5 мкл 1 мкМ EnGen Lba Casl2a (Cpf1) (New England Biolabs, США), 1 мкМ gRNA GTOV (ГенТерра, Россия), 10х NEBuffer™ r2.1 (New England Biolabs, США), 10 мкМ флуоресцентно-меченный зонд FB-short-Cas12 (ГенТерра, Россия).

Анализ проводится следующим образом: в оптически прозрачную пробирку объемом 200 мкл вносят 14 мкл смеси RT-RPA и каплю опускают на дно пробирки. Затем 10 мкл смеси DETECTR наносят на внутреннюю поверхность крышки. В смесь RT-RPA добавляется 1 мкл РНК, пипетируется и пробирка аккуратно закрывается. Закрытые пробы ставятся в термостат на +40°С на 30 минут. После прохождения изотермической амплификации с обратной транскрипцией пробирки откручиваются на центрифуге микроспин (BioSan FV-2400) для сбрасывания с крышки смеси DETECTR. Общая реакционная смесь перемешивается на вортексе с осаждением капель. После этого пробы переносятся в прибор для регистрации флуоресцентного сигнала. На амплификаторе CFX96 Touch (Bio-Rad, США) или приборе с аналогичными возможностями выставляется программа анализа DETECTR (Таблица 2) со считыванием сигнала от флуоресцентного красителя FAM через каждые 60 секунд в течение 40 минут при постоянной температуре +40°С.

Тестирование метода DETECTR с изотермической амплификацией в одной пробирке проведено на РНК К+. Для получения РНК К+ использовался набор для транскрипции Т7 RiboMAX™ Express Large Scale RNA Production System (Promega, США). Продукты транскрипции очищены при помощи AMPure ХР Bead-Based Reagent (Beckman Coulter, США). Концентрация РНК К+ определена при помощи Nanodrop One (Thermo Fisher Scientific, США) и она разбавлена в РНК-буфере (из комплекта реагентов для выделения РНК/ДНК из клинического материала «РИБО-преп» (АмплиСенс®, ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии, Россия)) до рабочей концентрации 1*10⁶ копий/мкл, что соответствует 1*10⁹ копий/мл или ≈1,7 пМ.

Оценку предела обнаружения производили на разведениях РНК К+ и определяли как минимальную концентрацию РНК, содержащую вставку вируса GTOV и детектируемую данным методом как положительный результат в 100% случаев. Лимит детекции составил 10³ копий/мкл РНК К+, содержащей вставку вируса М. guanaritoense.

--->

<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing

1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">

<ST26SequenceListing originalFreeTextLanguageCode="ru"

nonEnglishFreeTextLanguageCode="ru" dtdVersion="V1_3"

fileName="Способ выявления вируса Mammarenavirus guanaritoense

методом DETECTR с изотермической амплификацией.xml"

softwareName="WIPO Sequence" softwareVersion="2.3.0"

productionDate="2024-04-27">

<ApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText></ApplicationNumberText>

<FilingDate>2024-04-27</FilingDate>

</ApplicationIdentification>

<ApplicantFileReference></ApplicantFileReference>

<ApplicantName languageCode="ru">Федеральное бюджетное учреждение

науки «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт

эпидемиологии и микробиологии им. Пастера Федеральной службы по

надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия

человека»</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>Department of Epidemiology, Pasteur Institute,

Federal Service on Consumers&apos; Rights Protection and Human

Well-Being Surveillance</ApplicantNameLatin>

<InventorName languageCode="ru">Капитонова Марина

Анатольевна</InventorName>

<InventorNameLatin>Kapitonova Marina

Anatol&apos;evna</InventorNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">Способ выявления вируса

Mammarenavirus guanaritoense методом DETECTR с изотермической

амплификацией</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>4</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>32</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..32</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q2">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>aaaagcttgaagccctctgttaagaccatcgg</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="2">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>33</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..33</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q4">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>cgaaatttgacaatggatgaaaaagttgtagtt</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="3">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>44</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>RNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..44</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other RNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q6">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>taatttctactaagtgtagatagggacttcatcagaaggcaagt</INS

DSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="4">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>5</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..5</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q8">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>misc_feature</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>&lt;1</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier id="q9">

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>6-Carboxyfluorescein (6-FAM)

[1-(3-Fluoranthenyl)-1H-pyrrole-2 5-dione] at

5`-end</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>6- Карбоксифлуоресцеин (6-FAM)

[1-(3-Флуорантенил)-1H-пиррол-2 5-дион] на 5`-

конце</NonEnglishQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>misc_feature</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>&gt;5</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier id="q10">

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Non-fluorescent Black Hole Quencher 1

(2-[N-(2-hydroxyethyl)-4-[[2-methoxy-5-methyl-4-[(4-methyl-2-

nitrophenyl)diazenyl]phenyl]diazenyl]anilino]ethanol) at

3`-end</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>Не флуоресцентный тушитель Black

Hole Quencher 1

(2-[N-(2-гидроксиэтил)-4-[[2-метокси-5-метил-4-[(4-метил-2-

нитрофенил)диазенил]фенил]диазенил]анилино]этанол) на

3`-конце</NonEnglishQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>ttatt</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Изобретение относится к области биотехнологии. Описан способ выявления вируса Mammarenavirus guanaritoense при помощи метода DETECTR, включающий экстракцию РНК из биологических образцов с последующим проведением детекции целевых фрагментов РНК генома вируса. В ходе осуществления способа проводят изотермическую рекомбиназную полимеразную амплификацию с обратной транскрипцией, совмещенную в одной пробирке с флуоресцентной детекцией, посредством предварительного пространственного разделения реакционных смесей для амплификации нуклеиновых кислот и флуоресцентной детекции DETECTR по пробирке с последующим их перемешиванием, с использованием нуклеазы LbaCas12a, праймеров и зонда. Технический результат заключается в расширении арсенала средств, используемых для диагностики, контроля и профилактики возможных будущих эпидемий, обеспечении достоверной диагностики наличия РНК вируса М. guanaritoense. 1 ил., 2 табл.

Способ выявления вируса Mammarenavirus guanaritoense при помощи метода DETECTR, включающий экстракцию РНК из биологических образцов с последующим проведением детекции целевых фрагментов РНК генома вируса, отличающийся тем, что дополнительно проводят изотермическую рекомбиназную полимеразную амплификацию с обратной транскрипцией, совмещенную в одной пробирке с флуоресцентной детекцией, посредством предварительного пространственного разделения реакционных смесей для амплификации нуклеиновых кислот и флуоресцентной детекции DETECTR по пробирке с последующим их перемешиванием, с использованием нуклеазы LbaCas12a, специфических праймеров

RPA_GTOV_F 5'-AAAAGCTTGAAGCCCTCTGTTAAGACCATCGG-3',

RPA_GTOV_R 5'-CGAAATTTGACAATGGATGAAAAAGTTGTAGTT-3',

гидовой РНК

gRNA_GTOV 5'-UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUAGGGACUUCAUCAGAAGGCAAGU-3'

и флуоресцентно-меченого ДНК-зонда FB-short-Cas12 5'-FAM-TTATT-BHQ1-3',

где результаты интерпретируют на основании наличия или отсутствия отличия кривой флуоресценции пробы от отрицательного контрольного образца, не содержащего РНК Mammarenavirus guanaritoense, причем результат считается положительным, если уровень флуоресцентного сигнала и угол наклона кривой флуоресценции в пробе выше, чем в отрицательных контрольных образцах.