Рекомбинантная плазмида pVNV-GL-RBDind, обеспечивающая синтез и секрецию рекомбинантного рецептор-связывающего домена (RBD) коронавируса SARS-CoV-2 линии B.1.617 в клетках млекопитающих Российский патент 2021 года по МПК C12N15/50 C07K14/165 C07K1/36 C07K1/16 

Область техники

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения белка RBD (с англ.: receptor-binding-domain) - рекомбинантного структурного домена гликопротеина spike сарбековируса SARS-CoV-2 линии B.1.617. Получаемый белок RBD предназначен для непосредственного производства вакцинного препарата против SARS-CoV-2 линии B.1.617 (Yang et al., 2020; Min, Sun 2021). Способ включает дизайн генетических конструкций, методы трансфекции клеточных линий, очистки и оценки экспрессии целевого белка.

Уровень техники

Рецептор-связывающий домен RBD является частью субъединицы S1 белка S (spike). Использование рекомбинантного структурного домена RBD в качестве антигена при производстве вакцинных препаратов против SARS-CoV-2 имеет ряд преимуществ, связанных с выработкой большого числа нейтрализующих антител в ответ на введение антигена (Zhou et al., 2019; Shang et al., 2020; Song et al., 2018; Yang et al., 2020; Min, Sun 2021; Yang, Du, 2011), что было продемонстрировано рядом научных исследований, а также высокой консервативностью региона. На данный момент известно 13 кандидатных вакцин, основанных на использовании домена RBD (https://www.who.int/publications/m/item/draft-landscape-of-covid-19-candidate-vaccines).

В связи с высоким молекулярно-генетическим полиморфизмом вируса SARS-CoV-2 и появлением новых линий с мутациями, ассоциированными с повышенной трансмиссивностью и тяжестью течения инфекционного заболевания (https://www.ecdc.europa.eu/en/covid-19/variants-concern; https://www.gisaid.org), а также вероятностью снижения эффективности ранее разработанных вакцин, в изобретении использован вариант антигена RBD линии B.1.617 коронавируса SARS-CoV-2.

Известен патент «Способ получения штамма клеток яичника китайского хомячка, продуцента рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2, штамм клеток яичника китайского хомячка, продуцент рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2, способ получения рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2, тест-система для иммуноферментного анализа сыворотки или плазмы крови человека и ее применение» (RU 2723008 C9, https://patents.google.com/patent/RU2723008C9), однако основным назначением получаемого рекомбинантного белка - применение для диагностических целей, а не для использования в составе вакцинных препаратов. К недостаткам данного способа также следует отнести относительно низкий уровень экспрессии целевого белка (до 10 мг/л), что связано, прежде всего, с особенностями проведённого дизайна молекулярно-генетической векторной конструкции.

Наиболее близким по сущности к заявленному изобретению является изобретение «SARS-CoV-2-RBD eucaryotic protein expression vector and its preparation method and use» (CN 112831523 A, https://patents.google.com/patent/CN112831523A), где для экспрессии белка использован вектор pcDNA3.1, содержащий сигнальный пептид tPA. Экспрессия осуществляется в клетках 293F. Отличием является использование другой экспрессионной системы. К недостаткам данного способа следует отнести используемый дизайн ДНК, кодирующей последовательность RBD, не учитывающий современные представления о молекулярно-генетическом полиморфизме вируса SARS-CoV-2.

Также известен патент «SARS-CoV-2N/S1(RBD) recombinant protein and its preparation method and application» (CN 111607003 A, https://patents.google.com/patent/CN111607003A), в котором приводится способ получения и применение рекомбинантных белков нуклеокапсида (N) и RBD. К недостаткам данного изобретения относится выбранная экспрессионная система (прокариотическая), не позволяющая проводить полноценные посттрансляционные преобразования (фолдинг, гликозилирование и пр.). К недостаткам также следует отнести используемый дизайн фрагмента RBD, не учитывающий современные представления о молекулярно-генетическом полиморфизме вируса SARS-CoV-2.

Раскрытие изобретения

Задачей настоящего изобретения являлась разработка экспрессионной системы и структуры антигена для получения рекомбинантного белка RBD, соответствующего линии B.1.617 коронавируса SARS-CoV-2.

Техническим результатом изобретения является получение экспрессионной генетической конструкции, содержащей нуклеотидную последовательность домена RBD с оптимизированными кодонами и обеспечивающей экспрессию белка RBD линии B.1.617 SARS-CoV-2 в клетках млекопитающих.

Поставленная техническая проблема решается получением кодон-оптимизированной нуклеотидной последовательности, имеющей последовательность SEQ ID NO: 1, кодирующей белок RBD SARS-CoV-2, а также тем, что получена генетическая конструкция pVNV-GL-RBDind (фиг. 1), содержащая оптимизированную нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:2 и обеспечивающая экспрессию белка RBD в клетках млекопитающих.

Поставленная техническая проблема решается также тем, что разработан способ получения белка RBD с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:3, включающий культивирование клеток эукариот и экспрессию целевого белка, выделение белка с помощью аффинной хроматографии и скрининг экспрессии.

Изобретение имеет ряд преимуществ по сравнению с близкими по сущности аналогами. Использование белка RBD, характерного для линии B.1.617 коронавируса SARS-CoV-2, позволит его использовать для создания эффективных вакцинных препаратов, действующих в том числе против высокопатогенной и высококонтагиозной линии B.1.617 (включая B.1.617.1 и B.1.617.2). Проведенная оптимизация кодонов фрагмента ДНК, кодирующего белок RBD, обеспечивает высокий уровень экспрессии белка. Экспрессия белка в эукариотических системах позволяет получать белок с необходимыми посттрансляционными модификациями. Использование в составе продуцируемого белка последовательности HisTag делает возможным оптимизацию способа выделения и очистки белка RBD.

Краткое описание фигур

Вектор pVNV-GL-RBDind проиллюстрирован на фиг. 1, где показаны основные структурно-функциональные регионы:

- cat promoter (76-178);

- участок начала репликации ori (1018-1644);

- CMV энхансер (2035-2414);

- IR/DR-L (1760-2024);

- Chimeric intron (2693-3701) - предназначен для усиления экспрессии целевого гена;

- Chicken β-actin promoter (2417-2692);

- Chimeric intron (2693-3701);

- лидерный пептид GL (3773-3823), обеспечивающий экспорт белка из клетки;

- нуклеотидная последовательность гена RBD (SEQ ID NO:1) (3827-4528);

- последовательность 6His - предназначен для последующего выделения и очистки рекомбинантного белка с помощью аффинной хроматографии (4529-4546);

- последовательность NeoR/KanR (5679-6473);

- SV40 poly(A) signal - необходим для полиаденилирования (6647-6768);

- последовательность IR/DR-R (6802-7097);

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения

Ниже приведены примеры 1-3 конкретного осуществления изобретения.

Осуществление изобретения

Пример 1. Конструирование рекомбинантной плазмиды pVNV-GL-RBDind для синтеза RBDind SARS-CoV-2 в клетках млекопитающих

Последовательность гена, кодирующего домен RBDind (308V - 541F) коронавируса SARS-CoV-2 (GenBank MZ149976) заимствовали из базы данных GenBank и проводили оптимизацию частот встречаемости кодонов для млекопитающих при помощи сервиса JCat (http://www.jcat.de/), при этом индекс адаптации кодонов CAI достиг 0,83.

На основе вектора pVNV получали конструкцию pVNV-GL-RBDind (фиг. 1), содержащую нуклеотидную последовательность RBDind (SEQ ID NO:1), последовательность 6His и лидерный пептид GL белка люциферазы гауссии (MGVKVLFALICIAVAEA).

Нуклеотидную последовательность сигнального пептида GL, 6His и сайтов рестрикции PspCI и EcoICRI вводили в последовательность RBDind одновременно с помощью ПЦР. Использовались пары праймеров F_RBDind_ PspCI и R_RBDH_EcoICRI (таблица 1).

Таблица 1 - Нуклеотидные последовательности праймеров

Название праймера Нуклеотидная последовательность 5'-3' F_RBDind_ PspCI 5ˋ-aaaaaacacgtgggaagccctggccccggccgccaccATGGGAGTGAA-3ˋ R_RBDH_EcoICRI 5ˋ-ACTTCCATCACCACCATCATCACTAAGTCGACCGAGctcaaaaaa-3ˋ

Пример 2. Создание ДНК-конструкции (pVNV-GL-RBDind).

2.1. Амплификация методом ПЦР нуклеотидной последовательности, кодирующей RBDind SARS-CoV-2

Амплификацию фрагментов проводили по стандартному протоколу. Реакционная смесь, объемом 50 мкл содержала 10×буфер, 25 мМ dNTP, олигонуклеотидные праймеры (таблица 1) в количестве 10 пмоль каждого, 5 ед. а Pfu-полимеразы, 1 мкл раствора плазмидной ДНК. Реакцию проводили в амплификаторе Veriti™ 96-Well Thermal Cycler. Температурно-временной профиль ПЦР: плавление - 95°С - 5 мин. (1 цикл). 95°С - 30 секунд. Отжиг - 58°С - 30 секунд, элонгация - 72°С - 30 секунд (30 циклов).

2.2. Выделение ДНК из агарозного геля

После визуализации под УФ-излучением фрагменты ДНК необходимой длины, разделенные в агарозном геле, вырезали из геля и элюировали при помощи набора «Евроген» Cleanup Standard (Россия) в соответствии с рекомендациями производителя.

2.3. Ферментативный гидролиз вектора pVNV и ПЦР-продукта (последовательность участка генома SARS-CoV-2, кодирующей RBDind)

Для клонирования гена RBDind SARS-CoV-2 в составе вектора pVNV были использованы эндонуклеазы рестрикции PspCI и EcoICRI (фирма «Сибэнзим», Россия) с прилагаемыми к ним буферами. Реакционную смесь готовили в соответствии с активностью фермента (2-5 е.а. на 1 мкг ДНК) и концентрации плазмидной ДНК. Условия реакции: температура, состав буфера и длительность проведения ферментативного гидролиза ДНК подбирали в соответствии с инструкциями производителя “Сибэнзим”.

2.4. Лигирование ПЦР-продукта (последовательность участка генома SARS-CoV-2, кодирующей RBDind) и вектора pVNV

Реакцию лигирования проводили в течение 30 мин. при комнатной температуре, используя смесь из 2 мкг ампликонов с ДНК-матрицы, 1 мкг векторной плазмиды и 20 е.а. ДНК-лигазы фага Т4 в прилагаемом к коммерческому набору реакционном буфере. Полученную лигазную смесь использовали для трансформирования культуры компетентных клеток E. coli штамм Neb Stable.

2.5. Heat-shock трансформация

К «компетентным» клеткам E. coli штамм Neb Stable добавляли 10 мкл лигазной смеси (отношение 1:10), инкубировали на льду в течение 30 мин. После этого клетки подвергали «температурному шоку» при 42°С в течение 45 сек. Охлаждали клетки на льду в течение 2 мин, затем добавляли 200 мкл среды SOB и инкубировали при 37°С в течение 60 мин. По окончании инкубации трансформированные клетки высевали на чашку Петри с твёрдой питательной средой LB, содержащей антибиотик.

2.6. Отбор клонов для рестрикционного анализа

Клетки E. coli штамма Neb Stable, трансформированные ДНК-вакцинной конструкцией селективно культивировали в 10 мл жидкой питательной среды LB с добавлением антибиотика в рабочей концентрации 25 мкг/мл.

2.7. Определение нуклеотидной последовательности ДНК

Секвенирование проводили по методу Сэнгера. Использовался набор CEQ2000Dye Terminator Cycle Sequencing Kit и 16-капилярный автоматический секвенатор ABI 3130xl.

Пример 3. Трансфекция клеточной линии CHO-K1, рекомбинантной плазмидой pVNV-GL-RBDind

Клетки CHO-K1 культивировали в CO₂-инкубаторе при содержании углекислого газа 5% и влажности 80%. Трансфекцию проводили при достижении плотности монослоя 80%.

При достижении 80% плотности монослоя проводили трансфекцию клеток плазмидой pVNV-GL-RBDind с помощью реагента Lipofectamine 3000 (ThermoFisher).

Пример 4. Получение рекомбинантного белка RBDind

Клетки CHO-K1, трансфецированные плазмидой pVNV-GL-RBDind, культивировали на роллерных установках и собирали культуральную среду. Наличие целевого белка определяли с помощью ДСН-ПААГ и иммуноблоттинга с использованием сывороток переболевших COVID-19.

Культуральную жидкость центрифугировали, фильтровали с использованием фильтров с диаметром пор 0,22 мкм. Рекомбинантный белок выделяли с помощью аффинной хроматографии с использованием коммерческого набора Ni Sepharose 6 Fast Flow (Cytiva, США) по протоколу, рекомендованному производителем.

Полученные фракции анализировали с помощью вертикального гель-электрофореза в денатурирующих условиях, при условии, что целевой белок имеет молекулярный вес около 36 кДа. Фракции с целевым белком диализовали против фосфатно-солевого буфера, далее проводили стерилизующую фильтрацию. Концентрация белка, определенная спектрофотометрически, составила 5-10 мг на литр культуральной среды.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Общество с ограниченной ответственностью «Эс Джи»

<120> Рекомбинантная плазмида pVNV-GL-RBDind, обеспечивающая синтез и

секрецию рекомбинантного рецептор-связывающего домена (RBD)

коронавируса SARS-CoV-2 линии B.1.617 в клетках млекопитающих

<212> RNA

<213> Homo sapiens

<223> Кодон-оптимизированная нуклеотидная последовательность RBDind

<210> 1

<211> 702

<400>

1 GTGGAAAAGG GCATCTACCA GACCAGCAAC TTCCGGGTGC AGCCCACCGA ATCCATCGTG CGGTTCCCCA

61 ATATCACCAA TCTGTGCCCC TTCGGCGAGG TGTTCAATGC CACCAGATTC GCCTCTGTGT ACGCCTGGAA

121 CCGGAAGCGG ATCAGCAATT GCGTGGCCGA CTACTCCGTG CTGTACAACT CCGCCAGCTT CAGCACCTTC

181 AAGTGCTACG GCGTGTCCCC TACCAAGCTG AACGACCTGT GCTTCACAAA CGTGTACGCC GACAGCTTCG

241 TGATCCGGGG AGATGAAGTG CGGCAGATTG CCCCTGGACA GACAGGCAAG ATCGCCGACT ACAACTACAA

301 GCTGCCCGAC GACTTCACCG GCTGTGTGAT TGCCTGGAAC AGCAACAACC TGGACTCCAA AGTCGGCGGC

361 AACTACAATT ACCGGTACCG GCTGTTCCGG AAGTCCAATC TGAAGCCCTT CGAGCGGGAC ATCTCCACCG

421 AGATCTATCA GGCCGGCAGC ACCCCTTGTA ACGGCGTGCA GGGCTTCAAC TGCTACTTCC CACTGCAGTC

481 CTACGGCTTT CAGCCCACAA ATGGCGTGGG CTATCAGCCC TACAGAGTGG TGGTGCTGAG CTTCGAACTG

541 CTGCATGCCC CTGCCACAGT GTGCGGCCCT AAGAAAAGCA CCAATCTCGT GAAGAACAAA TGCGTGAACT TC

<223> Нуклеотидная последовательность вектора pVNV-GL-RBDind

<210> 2

<211> 7110

<400> TCAATACTGA CCATTTAAAT CATACCTGAC CTCCATAGCA GAAAGTCAAA AGCCTCCGAC

CGGAGGCTTT TGACTTGATC GGCACGTAAG AGGTTCCAAC TTTCACCATA ATGAAATAAG ATCACTACCG

GGCGTATTTT TTGAGTTATC GAGATTTTCA GGAGCTAAGG AAGCTAAAAT GAGCCATATT CAACGGGAAA

CGTCTTGCTC GAGGCCGCGA TTAAATTCCA ACATGGATGC TGATTTATAT GGGTATAAAT GGGCTCGCGA

TAATGTCGGG CAATCAGGTG CGACAATCTA TCGATTGTAT GGGAAGCCCG ATGCGCCAGA GTTGTTTCTG

AAACATGGCA AAGGTAGCGT TGCCAATGAT GTTACAGATG AGATGGTCAG GCTAAACTGG CTGACGGAAT

TTATGCCTCT TCCGACCATC AAGCATTTTA TCCGTACTCC TGATGATGCA TGGTTACTCA CCACTGCGAT

CCCAGGGAAA ACAGCATTCC AGGTATTAGA AGAATATCCT GATTCAGGTG AAAATATTGT TGATGCGCTG

GCAGTGTTCC TGCGCCGGTT GCATTCGATT CCTGTTTGTA ATTGTCCTTT TAACGGCGAT CGCGTATTTC

GTCTGGCTCA GGCGCAATCA CGAATGAATA ACGGTTTGGT TGGTGCGAGT GATTTTGATG ACGAGCGTAA

TGGCTGGCCT GTTGAACAAG TCTGGAAAGA AATGCATAAG CTTTTGCCAT TCTCACCGGA TTCAGTCGTC

ACTCATGGTG ATTTCTCACT TGATAACCTT ATTTTTGACG AGGGGAAATT AATAGGTTGT ATTGATGTTG

GACGAGTCGG AATCGCAGAC CGATACCAGG ATCTTGCCAT CCTATGGAAC TGCCTCGGTG AGTTTTCTCC

TTCATTACAG AAACGGCTTT TTCAAAAATA TGGTATTGAT AATCCTGATA TGAATAAATT GCAGTTTCAC

TTGATGCTCG ATGAGTTTTT CTAATGAGGG CCCAAATGTA ATCACCTGGC TCACCTTCGG GTGGGCCTTT

CTGCGTTGCT GGCGTTTTTC CATAGGCTCC GCCCCCCTGA CGAGCATCAC AAAAATCGAT GCTCAAGTCA

GAGGTGGCGA AACCCGACAG GACTATAAAG ATACCAGGCG TTTCCCCCTG GAAGCTCCCT CGTGCGCTCT

CCTGTTCCGA CCCTGCCGCT TACCGGATAC CTGTCCGCCT TTCTCCCTTC GGGAAGCGTG GCGCTTTCTC

ATAGCTCACG CTGTAGGTAT CTCAGTTCGG TGTAGGTCGT TCGCTCCAAG CTGGGCTGTG TGCACGAACC

CCCCGTTCAG CCCGACCGCT GCGCCTTATC CGGTAACTAT CGTCTTGAGT CCAACCCGGT AAGACACGAC

TTATCGCCAC TGGCAGCAGC CACTGGTAAC AGGATTAGCA GAGCGAGGTA TGTAGGCGGT GCTACAGAGT

TCTTGAAGTG GTGGCCTAAC TACGGCTACA CTAGAAGAAC AGTATTTGGT ATCTGCGCTC TGCTGAAGCC

AGTTACCTCG GAAAAAGAGT TGGTAGCTCT TGATCCGGCA AACAAACCAC CGCTGGTAGC GGTGGTTTTT

TTGTTTGCAA GCAGCAGATT ACGCGCAGAA AAAAAGGATC TCAAGAAGAT CCTTTGATTT TCTACCGAAG

AAAGGCCCAC CCGTGAAGGT GAGCCAGTGA GTTGATTGCA GTCCAGTTAC GCTGGAGTCT GAGGCTCGTC

CTGAATGGAT GGAAGTTTAC ATACACTTAA GTTGGAGTCA TTAAAACTCG TTTTTCAACT ACTCCACAAA

TTTCTTGTTA ACAAACAATA GTTTTGGCAA GTCAGTTAGG ACATCTACTT TGTGCATGAC ACAAGTCATT

TTTCCAACAA TTGTTTACAG ACAGATTATT TCACTTATAA TTCACTGTAT CACAATTCCA GTGGGTCAGA

AGTTTACATA CACTAAGTTG ACTGTGCCTT TAAACAGCTT GGAAAATTCC AGAAAATGAT GTCATGGCTT

TAGAAGCTTC ATTGGACATT GATTATTGAC TAGTTATTAA TAGTAATCAA TTACGGGGTC ATTAGTTCAT

AGCCCATATA TGGAGTTCCG CGTTACATAA CTTACGGTAA ATGGCCCGCC TGGCTGACCG CCCAACGACC

CCCGCCCATT GACGTCAATA ATGACGTATG TTCCCATAGT AACGCCAATA GGGACTTTCC ATTGACGTCA

ATGGGTGGAC TATTTACGGT AAACTGCCCA CTTGGCAGTA CATCAAGTGT ATCATATGCC AAGTACGCCC

CCTATTGACG TCAATGACGG TAAATGGCCC GCCTGGCATT ATGCCCAGTA CATGACCTTA TGGGACTTTC

CTACTTGGCA GTACATCTAC GTATTAGTCA TCGCTATTAC CATGGGTCGA GGTGAGCCCC ACGTTCTGCT

TCACTCTCCC CATCTCCCCC CCCTCCCCAC CCCCAATTTT GTATTTATTT ATTTTTTAAT TATTTTGTGC

AGCGATGGGG GCGGGGGGGG GGGGGGCGCG CGCCAGGCGG GGCGGGGCGG GGCGAGGGGC GGGGCGGGGC

GAGGCGGAGA GGTGCGGCGG CAGCCAATCA GAGCGGCGCG CTCCGAAAGT TTCCTTTTAT GGCGAGGCGG

CGGCGGCGGC GGCCCTATAA AAAGCGAAGC GCGCGGCGGG CGGGAGTCGC TGCGTTGCCT TCGCCCCGTG

CCCCGCTCCG CGCCGCCTCG CGCCGCCCGC CCCGGCTCTG ACTGACCGCG TTACTCCCAC AGGTGAGCGG

GCGGGACGGC CCTTCTCCTC CGGGCTGTAA TTAGCGCTTG GTTTAATGAC GGCTCGTTTC TTTTCTGTGG

CTGCGTGAAA GCCTTAAAGG GCTCCGGGAG GGCCCTTTGT GCGGGGGGGA GCGGCTCGGG GGGTGCGTGC

GTGTGTGTGT GCGTGGGGAG CGCCGCGTGC GGCCCGCGCT GCCCGGCGGC TGTGAGCGCT GCGGGCGCGG

CGCGGGGCTT TGTGCGCTCC GCGTGTGCGC GAGGGGAGCG CGGCCGGGGG CGGTGCCCCG CGGTGCGGGG

GGGCTGCGAG GGGAACAAAG GCTGCGTGCG GGGTGTGTGC GTGGGGGGGT GAGCAGGGGG TGTGGGCGCG

GCGGTCGGGC TGTAACCCCC CCCTGCACCC CCCTCCCCGA GTTGCTGAGC ACGGCCCGGC TTCGGGTGCG

GGGCTCCGTG CGGGGCGTGG CGCGGGGCTC GCCGTGCCGG GCGGGGGGTG GCGGCAGGTG GGGGTGCCGG

GCGGGGCGGG GCCGCCTCGG GCCGGGGAGG GCTCGGGGGA GGGGCGCGGC GGCCCCGGAG CGCCGGCGGC

TGTCGAGGCG CGGCGAGCCG CAGCCATTGC CTTTTATGGT AATCGTGCGA GAGGGCGCAG GGACTTCCTT

TGTCCCAAAT CTGGCGGAGC CGAAATCTGG GAGGCGCCGC CGCACCCCCT CTAGCGGGCG CGGGCGAAGC

GGTGCGGCGC CGGCAGGAAG GAAATGGGCG GGGAGGGCCT TCGTGCGTCG CCGCGCCGCC GTCCCCTTCT

CCATCTCCAG CCTCGGGGCT GCCGCAGGGG GACGGCTGCC TTCGGGGGGG ACGGGGCAGG GCGGGGTTCG

GCTTCTGGCG TGTGACCGGC GGCTCTAGAG CCTCTGCTAA CCATGTTCAT GCCTTCTTCT TTTTCCTACA

GCTCCTGGGC AACGTTAGCC TCGAGAATTC GTCCTGCTGC GCACGTGGGA AGCCCTGGCC CCGGCCGCCA

CCATGGGAGT GAAGGTGCTG TTCGCCCTGA TCTGTATTGC CGTGGCCGAA GCTTCTGTGG AAAAGGGCAT

CTACCAGACC AGCAACTTCC GGGTGCAGCC CACCGAATCC ATCGTGCGGT TCCCCAATAT CACCAATCTG

TGCCCCTTCG GCGAGGTGTT CAATGCCACC AGATTCGCCT CTGTGTACGC CTGGAACCGG AAGCGGATCA

GCAATTGCGT GGCCGACTAC TCCGTGCTGT ACAACTCCGC CAGCTTCAGC ACCTTCAAGT GCTACGGCGT

GTCCCCTACC AAGCTGAACG ACCTGTGCTT CACAAACGTG TACGCCGACA GCTTCGTGAT CCGGGGAGAT

GAAGTGCGGC AGATTGCCCC TGGACAGACA GGCAAGATCG CCGACTACAA CTACAAGCTG CCCGACGACT

TCACCGGCTG TGTGATTGCC TGGAACAGCA ACAACCTGGA CTCCAAAGTC GGCGGCAACT ACAATTACCG

GTACCGGCTG TTCCGGAAGT CCAATCTGAA GCCCTTCGAG CGGGACATCT CCACCGAGAT CTATCAGGCC

GGCAGCACCC CTTGTAACGG CGTGCAGGGC TTCAACTGCT ACTTCCCACT GCAGTCCTAC GGCTTTCAGC

CCACAAATGG CGTGGGCTAT CAGCCCTACA GAGTGGTGGT GCTGAGCTTC GAACTGCTGC ATGCCCCTGC

CACAGTGTGC GGCCCTAAGA AAAGCACCAA TCTCGTGAAG AACAAATGCG TGAACTTCCA TCACCACCAT

CATCACTAAG TCGACCGAGC TCAGCCTCGA CTGTGCCTTC TAGTTGCCAG CCATCTGTTG TTTGCCCCTC

CCCCGTGCCT TCCTTGACCC TGGAAGGTGC CACTCCCACT GTCCTTTCCT AATAAAATGA GGAAATTGCA

TCGCATTGTC TGAGTAGGTG TCATTCTATT CTGGGGGGTG GGGTGGGGCA GGACAGCAAG GGGGAGGATT

GGGAAGACAA TAGCAGGCAT GCTGGGGATG CGGTGGGCTC TATGGCTTCT GAGGCGGAAA GAACCAGCTG

GGGCTCTAGG GGGTATCCCC ACGCGCCCTG TAGCGGCGCA TTAAGCGCGG CGGGTGTGGT GGTTACGCGC

AGCGTGACCG CTACACTTGC CAGCGCCCTA GCGCCCGCTC CTTTCGCTTT CTTCCCTTCC TTTCTCGCCA

CGTTCGCCGG CTTTCCCCGT CAAGCTCTAA ATCGGGGGCT CCCTTTAGGG TTCCGATTTA GTGCTTTACG

GCACCTCGAC CCCAAAAAAC TTGATTAGGG TGATGGTTCA CGTAGTGGGC CATCGCCCTG ATAGACGGTT

TTTCGCCCTT TGACGTTGGA GTCCACGTTC TTTAATAGTG GACTCTTGTT CCAAACTGGA ACAACACTCA

ACCCTATCTC GGTCTATTCT TTTGATTTAT AAGGGATTTT GCCGATTTCG GCCTATTGGT TAAAAAATGA

GCTGATTTAA CAAAAATTTA ACGCGAATTA ATTCTGTGGA ATGTGTGTCA GTTAGGGTGT GGAAAGTCCC

CAGGCTCCCC AGCAGGCAGA AGTATGCAAA GCATGCATCT CAATTAGTCA GCAACCAGGT GTGGAAAGTC

CCCAGGCTCC CCAGCAGGCA GAAGTATGCA AAGCATGCAT CTCAATTAGT CAGCAACCAT AGTCCCGCCC

CTAACTCCGC CCATCCCGCC CCTAACTCCG CCCAGTTCCG CCCATTCTCC GCCCCATGGC TGACTAATTT

TTTTTATTTA TGCAGAGGCC GAGGCCGCCT CTGCCTCTGA GCTATTCCAG AAGTAGTGAG GAGGCTTTTT

TGGAGGCCTA GGCTTTTGCA AAAAGCTCCC GGGAGCTTGT ATATCCATTT TCGGATCTGA TCAAGAGACA

GGATGAGGAT CGTTTCGCAT GATTGAACAA GATGGATTGC ACGCAGGTTC TCCGGCCGCT TGGGTGGAGA

GGCTATTCGG CTATGACTGG GCACAACAGA CAATCGGCTG CTCTGATGCC GCCGTGTTCC GGCTGTCAGC

GCAGGGGCGC CCGGTTCTTT TTGTCAAGAC CGACCTGTCC GGTGCCCTGA ATGAACTGCA GGACGAGGCA

GCGCGGCTAT CGTGGCTGGC CACGACGGGC GTTCCTTGCG CAGCTGTGCT CGACGTTGTC ACTGAAGCGG

GAAGGGACTG GCTGCTATTG GGCGAAGTGC CGGGGCAGGA TCTCCTGTCA TCTCACCTTG CTCCTGCCGA

GAAAGTATCC ATCATGGCTG ATGCAATGCG GCGGCTGCAT ACGCTTGATC CGGCTACCTG CCCATTCGAC

CACCAAGCGA AACATCGCAT CGAGCGAGCA CGTACTCGGA TGGAAGCCGG TCTTGTCGAT CAGGATGATC

TGGACGAAGA GCATCAGGGG CTCGCGCCAG CCGAACTGTT CGCCAGGCTC AAGGCGCGCA TGCCCGACGG

CGAGGATCTC GTCGTGACCC ATGGCGATGC CTGCTTGCCG AATATCATGG TGGAAAATGG CCGCTTTTCT

GGATTCATCG ACTGTGGCCG GCTGGGTGTG GCGGACCGCT ATCAGGACAT AGCGTTGGCT ACCCGTGATA

TTGCTGAAGA GCTTGGCGGC GAATGGGCTG ACCGCTTCCT CGTGCTTTAC GGTATCGCCG CTCCCGATTC

GCAGCGCATC GCCTTCTATC GCCTTCTTGA CGAGTTCTTC TGAGCGGGAC TCTGGGGTTC GAAATGACCG

ACCAAGCGAC GCCCAACCTG CCATCACGAG ATTTCGATTC CACCGCCGCC TTCTATGAAA GGTTGGGCTT

CGGAATCGTT TTCCGGGACG CCGGCTGGAT GATCCTCCAG CGCGGGGATC TCATGCTGGA GTTCTTCGCC

CACCCCAACT TGTTTATTGC AGCTTATAAT GGTTACAAAT AAAGCAATAG CATCACAAAT TTCACAAATA

AAGCATTTTT TTCACTGCAT TCTAGTTGTG GTTTGTCCAA ACTCATTAAT GTATCTTATC ATGTCTGTAT

ACCGTCGACC TCTAGCTGCT TGTGGAAGGC TACTCGAAAT GTTTGACCCA AGTTAAACAA TTTAAAGGCA

ATGCTACCAA ATACTAATTG AGTGTATGTA AACTTCTGAC CCACTGGGAA TGTGATGAAA GAAATAAAAG

CTGAAATGAA TCATTCTCTC TACTATTATT CTGATATTTC ACATTCTTAA AATAAAGTGG TGATCCTAAC

TGACCTAAGA CAGGGAATTT TTACTAGGAT TAAATGTCAG GAATTGTGAA AAAGTGAGTT TAAATGTATT

TGGCTAAGGT GTATGTAAAC TTCCGACTTC AACTGTATAG GGTTCCTCTA

<223> Аминокислотная последовательность RBDind

<210> 3

<211> 234

<400>

1 VEKGIYQTSN FRVQPTESIVR FPNITNLCPFG EVFNATRFAS VYAWNRKRIS

61 NCVADYSVLY NSASFSTFKCY GVSPTKLNDL CFTNVYADSF VIRGDEVRQI

121 APGQTGKIAD YNYKLPDDFT GCVIAWNSNN LDSKVGGNYN YRYRLFRKSN

241 LKPFERDISTE IYQAGSTPCN GVQGFNCYFP LQSYGFQPTN GVGYQPYRV

301 VVLSFELLHA PATVCGPKKS TNLVKNKCVN F

<---

Изобретение относится к биотехнологии. Способ включает дизайн генетических конструкций, методы трансфекции клеточных линий, очистки и оценки экспрессии целевого белка. Получают генетическую конструкцию pVNV-GL-RBDind, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую белок RBD SARS-CoV-2 линии B.1.617, и обеспечивающую экспрессию белка этого RBD в клетках млекопитающих и дальнейшую очистку с помощью аффинной хроматографии. Изобретение может быть использовано для получения белка RBD – рекомбинантного структурного домена гликопротеина spike сарбековируса SARS-CoV-2 линии B.1.617. Получаемый белок RBD предназначен для непосредственного производства вакцинного препарата против SARS-CoV-2 линии B.1.617. 1 ил., 1 табл., 4 пр.

Нуклеотидная последовательность вектора pVNV-GL-RBDind, предназначенного для синтеза и секреции белка RBD вируса SARS-CoV-2 линии B.1.617 в клетках млекопитающих:

TCAATACTGACCATTTAAATCATACCTGACCTCCATAGCAGAAAGTCAAAAGCCTCCGACCGGAGGCTTTTGACTTGATCGGCACGTAAGAGGTTCCAACTTTCACCATAATGAAATAAGATCACTACCGGGCGTATTTTTTGAGTTATCGAGATTTTCAGGAGCTAAGGAAGCTAAAATGAGCCATATTCAACGGGAAACGTCTTGCTCGAGGCCGCGATTAAATTCCAACATGGATGCTGATTTATATGGGTATAAATGGGCTCGCGATAATGTCGGGCAATCAGGTGCGACAATCTATCGATTGTATGGGAAGCCCGATGCGCCAGAGTTGTTTCTGAAACATGGCAAAGGTAGCGTTGCCAATGATGTTACAGATGAGATGGTCAGGCTAAACTGGCTGACGGAATTTATGCCTCTTCCGACCATCAAGCATTTTATCCGTACTCCTGATGATGCATGGTTACTCACCACTGCGATCCCAGGGAAAACAGCATTCCAGGTATTAGAAGAATATCCTGATTCAGGTGAAAATATTGTTGATGCGCTGGCAGTGTTCCTGCGCCGGTTGCATTCGATTCCTGTTTGTAATTGTCCTTTTAACGGCGATCGCGTATTTCGTCTGGCTCAGGCGCAATCACGAATGAATAACGGTTTGGTTGGTGCGAGTGATTTTGATGACGAGCGTAATGGCTGGCCTGTTGAACAAGTCTGGAAAGAAATGCATAAGCTTTTGCCATTCTCACCGGATTCAGTCGTCACTCATGGTGATTTCTCACTTGATAACCTTATTTTTGACGAGGGGAAATTAATAGGTTGTATTGATGTTGGACGAGTCGGAATCGCAGACCGATACCAGGATCTTGCCATCCTATGGAACTGCCTCGGTGAGTTTTCTCCTTCATTACAGAAACGGCTTTTTCAAAAATATGGTATTGATAATCCTGATATGAATAAATTGCAGTTTCACTTGATGCTCGATGAGTTTTTCTAATGAGGGCCCAAATGTAATCACCTGGCTCACCTTCGGGTGGGCCTTTCTGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGATGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATTTTCTACCGAAGAAAGGCCCACCCGTGAAGGTGAGCCAGTGAGTTGATTGCAGTCCAGTTACGCTGGAGTCTGAGGCTCGTCCTGAATGGATGGAAGTTTACATACACTTAAGTTGGAGTCATTAAAACTCGTTTTTCAACTACTCCACAAATTTCTTGTTAACAAACAATAGTTTTGGCAAGTCAGTTAGGACATCTACTTTGTGCATGACACAAGTCATTTTTCCAACAATTGTTTACAGACAGATTATTTCACTTATAATTCACTGTATCACAATTCCAGTGGGTCAGAAGTTTACATACACTAAGTTGACTGTGCCTTTAAACAGCTTGGAAAATTCCAGAAAATGATGTCATGGCTTTAGAAGCTTCATTGGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGACTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGGTCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCGGGAGTCGCTGCGTTGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTCCGCGCCGCCTCGCGCCGCCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGTTACTCCCACAGGTGAGCGGGCGGGACGGCCCTTCTCCTCCGGGCTGTAATTAGCGCTTGGTTTAATGACGGCTCGTTTCTTTTCTGTGGCTGCGTGAAAGCCTTAAAGGGCTCCGGGAGGGCCCTTTGTGCGGGGGGGAGCGGCTCGGGGGGTGCGTGCGTGTGTGTGTGCGTGGGGAGCGCCGCGTGCGGCCCGCGCTGCCCGGCGGCTGTGAGCGCTGCGGGCGCGGCGCGGGGCTTTGTGCGCTCCGCGTGTGCGCGAGGGGAGCGCGGCCGGGGGCGGTGCCCCGCGGTGCGGGGGGGCTGCGAGGGGAACAAAGGCTGCGTGCGGGGTGTGTGCGTGGGGGGGTGAGCAGGGGGTGTGGGCGCGGCGGTCGGGCTGTAACCCCCCCCTGCACCCCCCTCCCCGAGTTGCTGAGCACGGCCCGGCTTCGGGTGCGGGGCTCCGTGCGGGGCGTGGCGCGGGGCTCGCCGTGCCGGGCGGGGGGTGGCGGCAGGTGGGGGTGCCGGGCGGGGCGGGGCCGCCTCGGGCCGGGGAGGGCTCGGGGGAGGGGCGCGGCGGCCCCGGAGCGCCGGCGGCTGTCGAGGCGCGGCGAGCCGCAGCCATTGCCTTTTATGGTAATCGTGCGAGAGGGCGCAGGGACTTCCTTTGTCCCAAATCTGGCGGAGCCGAAATCTGGGAGGCGCCGCCGCACCCCCTCTAGCGGGCGCGGGCGAAGCGGTGCGGCGCCGGCAGGAAGGAAATGGGCGGGGAGGGCCTTCGTGCGTCGCCGCGCCGCCGTCCCCTTCTCCATCTCCAGCCTCGGGGCTGCCGCAGGGGGACGGCTGCCTTCGGGGGGGACGGGGCAGGGCGGGGTTCGGCTTCTGGCGTGTGACCGGCGGCTCTAGAGCCTCTGCTAACCATGTTCATGCCTTCTTCTTTTTCCTACAGCTCCTGGGCAACGTTAGCCTCGAGAATTCGTCCTGCTGCGCACGTGGGAAGCCCTGGCCCCGGCCGCCACCATGGGAGTGAAGGTGCTGTTCGCCCTGATCTGTATTGCCGTGGCCGAAGCTTCTGTGGAGAAGGGCATCTACCAGACCAGCAACTTCCGCGTGCAGCCCACCGAGAGCATCGTGCGCTTCCCCAACATCACCAACCTGTGCCCCTTCGGCGAGGTGTTCAACGCCACCCGCTTCGCCAGCGTGTACGCCTGGAACCGCAAGCGCATCAGCAACTGCGTGGCCGACTACAGCGTGCTGTACAACAGCGCCAGCTTCAGCACCTTCAAGTGCTACGGCGTGAGCCCCACCAAGCTGAACGACCTGTGCTTCACCAACGTGTACGCCGACAGCTTCGTGATCCGCGGCGACGAGGTGCGCCAGATCGCCCCCGGCCAGACCGGCAAGATCGCCGACTACAACTACAAGCTGCCCGACGACTTCACCGGCTGCGTGATCGCCTGGAACAGCAACAACCTGGACAGCAAGGTGGGCGGCAACTACAACTACCGCTACCGCCTGTTCCGCAAGAGCAACCTGAAGCCCTTCGAGCGCGACATCAGCACCGAGATCTACCAGGCCGGCAGCACCCCCTGCAACGGCGTGCAGGGCTTCAACTGCTACTTCCCCCTGCAGAGCTACGGCTTCCAGCCCACCAACGGCGTGGGCTACCAGCCCTACCGCGTGGTGGTGCTGAGCTTCGAGCTGCTGCACGCCCCCGCCACCGTGTGCGGCCCCAAGAAGAGCACCAACCTGGTGAAGAACAAGTGCGTGAACTTCCATCACCACCATCATCACTAAGTCGACCGAGCTCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCTGAGGCGGAAAGAACCAGCTGGGGCTCTAGGGGGTATCCCCACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTAATTCTGTGGAATGTGTGTCAGTTAGGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCAGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCTGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTCCCGGGAGCTTGTATATCCATTTTCGGATCTGATCAAGAGACAGGATGAGGATCGTTTCGCATGATTGAACAAGATGGATTGCACGCAGGTTCTCCGGCCGCTTGGGTGGAGAGGCTATTCGGCTATGACTGGGCACAACAGACAATCGGCTGCTCTGATGCCGCCGTGTTCCGGCTGTCAGCGCAGGGGCGCCCGGTTCTTTTTGTCAAGACCGACCTGTCCGGTGCCCTGAATGAACTGCAGGACGAGGCAGCGCGGCTATCGTGGCTGGCCACGACGGGCGTTCCTTGCGCAGCTGTGCTCGACGTTGTCACTGAAGCGGGAAGGGACTGGCTGCTATTGGGCGAAGTGCCGGGGCAGGATCTCCTGTCATCTCACCTTGCTCCTGCCGAGAAAGTATCCATCATGGCTGATGCAATGCGGCGGCTGCATACGCTTGATCCGGCTACCTGCCCATTCGACCACCAAGCGAAACATCGCATCGAGCGAGCACGTACTCGGATGGAAGCCGGTCTTGTCGATCAGGATGATCTGGACGAAGAGCATCAGGGGCTCGCGCCAGCCGAACTGTTCGCCAGGCTCAAGGCGCGCATGCCCGACGGCGAGGATCTCGTCGTGACCCATGGCGATGCCTGCTTGCCGAATATCATGGTGGAAAATGGCCGCTTTTCTGGATTCATCGACTGTGGCCGGCTGGGTGTGGCGGACCGCTATCAGGACATAGCGTTGGCTACCCGTGATATTGCTGAAGAGCTTGGCGGCGAATGGGCTGACCGCTTCCTCGTGCTTTACGGTATCGCCGCTCCCGATTCGCAGCGCATCGCCTTCTATCGCCTTCTTGACGAGTTCTTCTGAGCGGGACTCTGGGGTTCGAAATGACCGACCAAGCGACGCCCAACCTGCCATCACGAGATTTCGATTCCACCGCCGCCTTCTATGAAAGGTTGGGCTTCGGAATCGTTTTCCGGGACGCCGGCTGGATGATCCTCCAGCGCGGGGATCTCATGCTGGAGTTCTTCGCCCACCCCAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATTAATGTATCTTATCATGTCTGTATACCGTCGACCTCTAGCTGCTTGTGGAAGGCTACTCGAAATGTTTGACCCAAGTTAAACAATTTAAAGGCAATGCTACCAAATACTAATTGAGTGTATGTAAACTTCTGACCCACTGGGAATGTGATGAAAGAAATAAAAGCTGAAATGAATCATTCTCTCTACTATTATTCTGATATTTCACATTCTTAAAATAAAGTGGTGATCCTAACTGACCTAAGACAGGGAATTTTTACTAGGATTAAATGTCAGGAATTGTGAAAAAGTGAGTTTAAATGTATTTGGCTAAGGTGTATGTAAACTTCCGACTTCAACTGTATAGGGTTCCTCTA.