Набор реактивов для оценки эффективности терапии ингибиторами тирозинкиназы при Ph-позитивных новообразованиях и способ его использования Российский патент 2021 года по МПК C12Q1/68 

Изобретение относится к молекулярной биологии и медицине, в частности, к гематологии, онкологии, и может применяться для оценки эффективности терапии Ph-позитивных онкогематологических заболеваний ингибиторами тирозинкиназы посредством количественной оценки уровня химерного транскрипта BCR-ABL1 в пробах крови человека с одновременным выявлением 8 мутаций гена BCR-ABL1 G250E, Y253H, E244K, E255V, T315I, F317L, F359I, F359V).

Одной из причин развития новообразований крови является возникновение хромосомной транслокации t(9;22), называемой также «филадельфийской хромосомой» (Ph-хромосомой). В результате транслокации в кроветворных клетках возникает характерный генетический дефект - химерный ген BCR-ABL1. Результатом экспрессии этого гена становится дефектный белок тирозинкиназа, обусловливающий бесконтрольное деление клеток. Выявление транскриптов BCR-ABL1 является важным как при диагностике, так и при мониторинге эффективности лечения хронического миелолейкоза (ХМЛ), а также отдельных форм острых лейкозов.

Для лечения Ph-позитивных новообразований крови на сегодняшний день разработаны препараты-ингибиторы тирозинкиназ (ИТК). Но в процессе лечения в опухолевых клетках часто возникают мутации гена BCR-ABL1, приводящие к формированию устойчивости, к тому или иному препарату. Мутации BCR-ABL1 препятствуют связыванию препаратов-ингибиторов ИТК с белком и тем самым не допуская ингибирование его активности лекарственным препаратом [Челышева Е.Ю., Шухов О.А., Лазарева О.В., Туркина А.Г. Мутации киназного домена гена Bcr-Abl при хроническом миелолейкозе. Клиническая онкогематология. 2012; 1:13-21; Савченко В.Г., Паровичникова Е.Н., Афанасьев Б.В., Троицкая В.В., Гаврилина О.А., Соколов А.Н. и др. Клинические рекомендации по диагностике и лечению острых лимфобластных лейкозов взрослых, 2018]. Это влечет за собой снижение эффективности терапии и прогрессию заболевания за счет разрастания резистентного клона опухолевых клеток. Показано, что почти у 40% пациентов, проходящих терапию препаратами первой линии, развивается резистентность.

В Клинических рекомендациях по диагностике и лечению ХМЛ определен порядок периодического мониторинга доли опухолевых клеток ХМЛ при помощи оценки уровня мРНК BCR-ABL1 в лейкоцитах крови, а также определения основных мутаций гена BCR-ABL1, обусловливающих устойчивость к ИТК. [Туркина А.Г., Зарицкий А.Ю., Шуваев В.А., Челышева Е.Ю., Ломаиа Е.Г., Морозова Е.В., Голенков А.К., Поспелова Т.И., Шухов О.А., Фоминых М.С., Гусарова Г.А., Кузьмина Л.А., Абдуллаев А.О., Мартынкевич И.С. Клинические рекомендации по диагностике и лечению хронического миелолейкоза. Клиническая онкогематология. 2017; 10(3):294-316].

Таким образом, выявление мутаций резистентности BCR-ABL1 имеет важное клиническое значение для диагностики и при мониторинге эффективности терапии ХМЛ.

На сегодняшний день одним из распространенных способов выявления мутаций на участках ДНК является секвенирование по Сэнгеру [Sanger F., Nicklen S., Coulson A.R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 1977;74(12): 5463-5467]. Он основан на принципе полимеразной цепной реакции в четырех параллельных реакциях с добавлением терминирующих дидезоксинуклеотидтрифосфатов (ddATP, ddTTP, ddCTP, ddGTP), которые при встраивании в цепь приводят к прекращению ее удлинения. В результате такой реакции формируются продукты ДНК различной длины, разделяемые впоследствии при помощи гель-электрофореза. Последовательность ДНК-полос в геле позволяет воссоздать цепочку нуклеотидов в исследуемой молекуле ДНК. Данный метод имеет ряд недостатков для клинической практики, включающих высокую стоимость анализа и трудозатраты для выявления единичных мутаций, необходимость приобретения дорогостоящего оборудования (доступного не каждой лаборатории), относительно невысокую чувствительность (около 20%) [Rohlin A., Wernersson J., Engwall Y., Wiklund L., Björk J., Nordling M. Parallel sequencing used in detection of mosaic mutations: comparison with four diagnostic DNA screening techniques. Hum Mutat. 2009; 30(6):1012-20; Solomon D.A. Integrating Molecular Diagnostics With Surgical Neuropathology. In: Practical Surgical Neuropathology: A Diagnostic Approach (Second Edition). 2018:71-89].

Также для детекции единичных мутаций в ДНК предложен метод анализа кривых плавления высокого разрешения (high resolution melting analysis, HRM) [US 2008/0003603 A1, 03.01.2008], основанный на свойстве двухцепочечных молекул ДНК к постепенному разрыву водородных связей («плавлению») с переходом в одноцепочечное состояние при медленном повышении температуры. Характер плавления зависит последовательности нуклеотидов в цепочках ДНК, формируя специфический профиль плавления, детектируемый при помощи интеркалирующего красителя в растворе. Изменение даже одного нуклеотида в составе небольшой ДНК-молекулы способно отразиться на профиле плавления, позволяя сделать заключение о наличии мутации или полиморфизма [Montgomery J., Wittwer C.T., Palais R., Zhou L. Simultaneous mutation scanning and genotyping by high-resolution DNA melting analysis. Nature Protocols, 2007;2(1):59-66; Gonzalez-Bosquet J., Calcei J., Wei J.S., et al. Detection of somatic mutations by high-resolution DNA melting (HRM) analysis in multiple cancers. PLoS One. 2011;6(1):e14522]. Недостатком данного способа является необходимость осуществления специальных надстроек дополнительных функций оборудования и программного обеспечения, затруднения идентификации в случае возникновения нехарактерной замены нуклеотида.

Еще один метод, используемый для выявления мутаций резистентности BCR-ABL1 - высокоэффективная жидкостная хроматография. Данный способ совмещает принцип плавления гетеродуплексов ДНК с высокоточной хроматографией, позволяющей разделять молекулы ДНК отличного состава с точностью до 1 нуклеотида [Erbilgin Y., Çatal S., Eşkazan A.E., Hatırnaz Ö, Soysal T., Özbek U. ABL gene kinase domain mutation scanning by denaturing high performance liquid chromatography sequencing method. Turk J Haematol. 2011; 28(2):97-102]. Его чувствителньость несколько выше, чем у прямого секвенирования по Сэнгеру, но ниже, чем у полимеразной цепной реакции. Недостатком данного метода является многоступенчатый процесс проведения исследования, требующий специального оборудования, а также повышенный риск ложноотрицательных результатов при высокой нагрузке BCR-ABL1/ABL1 в образце [Deininger M., McGreevey L., Willis S. et al. Detection of ABL kinase domain mutations with denaturing high-performance liquid chromatography. 2004. Leukemia; 18:864-871].

Описан также способ детекции мутаций при помощи ПЦР с обратной транскрипцией и последующей гибридизацией продуктов реакции на биочип [патент RU2609641C1 от 02.02.2017]. Данный способ позволяет амплифицировать и обнаружить мутантные последовательности 11 участков гена ABL1, но его существенным недостатком является длительность выполнения анализа за счет введения дополнительного этапа гибридизации на биочип, в сравнении со стандартной ОТ-ПЦР, а также повышенная стоимость анализа из-за необходимости приобретения дополнительного оборудования - анализатора биочипов, снабженного ПЗС-камерой. При этом, в данном способе отсутствует определение мутации F317L, составляющей около 5,7% от всех мутаций и имеющей важное клиническое значение, поскольку приводит к резистентности к большинству используемых ИТК [Patel AB, O'Hare T, Deininger MW. Mechanisms of Resistance to ABL Kinase Inhibition in Chronic Myeloid Leukemia and the Development of Next Generation ABL Kinase Inhibitors. Hematol Oncol Clin North Am. 2017 Aug; 31(4):589-612]. Выявление мутаций при помощи высокоэффективных методов - секвенирования нового поколения, микрофлюидики, масс-спектрометрии, цифровой ПЦР - на сегодняшний день обладает большой трудоемкостью и повышенными требованиями к квалификации персонала лабораторий, а также высокой стоимостью оборудования и реагентов, длительностью аналитической процедуры.

К наиболее доступным, простым и чувствительным методам диагностики точечных мутаций ДНК относится метод аллель-специфичной полимеразной цепной реакции в реальном времени. Он позволяет оценивать единичные нуклеотидные замены за счет амплификации ДНК с праймерами, эффективно связывающимися только с ДНК, содержащей мишеневую мутацию. Оптимизация условий реакции позволяет достичь чувствительности анализа свыше 0,01%. На сегодняшний день с его помощью разработан ряд способов диагностики мутаций BCR-ABL1 для мониторинга эффективности терапии ХМЛ, охватывающих одну (патент RU 2620076 C1 от 21.11.2016, WO 2013/074883 A1 от 16.11.2012) или три (патент RU 2698461 C1 от 26.03.2019) мутации резистентности в параллельных постановках. Вместе с тем, эти три мутации, выявляемые зарегистрированным способом, покрывают не более 12% известных возможных клинически значимых мутаций резистетности [Tate J.G., Bamford S., Jubb H.C., Sondka Z., Beare D.M., Bindal N., Boutselakis H., Cole C.G., Creatore C., Dawson E., Fish P., Harsha B., Hathaway C., Jupe S.C., Kok C.Y., Noble K., Ponting L., Ramshaw C.C., Rye C.E., Speedy H.E., Stefancsik R., Thompson S.L., Wang S., Ward S., Campbell P.J., Forbes S.A. COSMIC: the Catalogue Of Somatic Mutations In Cancer. Nucleic Acids Res. 2019; 47(D1):D941-D947]. Отсутствие мультиплексной технологии одновременной детекции нескольких мутаций в одной смеси требует расхода ресурсов (реагентов, материалов), трудозатрат и объема исследуемого биологического материала пропорционально анализу каждой отдельной мутации. Кроме того, недостатками всех указанных выше способов является отсутствие возможности одновременного количественного определения уровня BCR-ABL1 и выявления мутаций химерной тирозинкиназы в одной аналитической постановке.

Наиболее близким к предлагаемому является набор реагентов для детекции однонуклеотидных замен генов JAK2, CALR и MPL, использующий метод полимеразной цепной реакции в реальном времени в мультиплекс-системе (патент RU2679653C1 от 01.08.2018). Авторами предложено проведение аллель-специфичной полимеразной цепной реакции, при которой праймеры и зонды для выявления мутаций на различных участках ДНК объединены попарно в мультиплексную систему. Это позволило им в четырех трех реакционных смесях одновременно произвести детекцию пяти мутаций, обусловливающих развитие Ph-негативных миелопролиферативных заболеваний (гены JAK2, MPL, CALR). Данный способ может быть применен для диагностики и мониторинга количества мутантных клеток при хронических Ph-негативных миелопролиферативных заболеваниях, но не позволяет получать данные о возможных причинах и предпосылках изменения эффективности терапии данных заболеваний, а также не позволяет применять его для диагностики мониторинга Ph-позитивных заболеваний. Недостаток этого способа заключается в том, что он не предусматривает возможность количественной оценки уровня экспрессии РНК химерных генов и не предоставляет информации о наличии резистентности к используемой терапии.

Задача заявляемого изобретения - разработка набора реактивов для мультиплексного ПЦР анализа уровня экспрессии химерных молекул РНК с одновременным выявлением мутаций резистентности к терапии ИТК, а также ускоренного и экономичного способа диагностики Ph-позитивных онкогематологических заболеваний на его основе.

Техническим результатом, достигаемым заявляемым изобретением, является изготовление набора реактивов для мультиплексной ПЦР в реальном времени, позволяющего в одной аналитической постановке произвести количественную оценку уровня химерного транскрипта BCR-ABL1 в пробе крови, а также выявление 8 мутаций резистентности к ИТК - G250E, Y253H, E244K, E255V, T315I, F317L, F359I, F359V - для оценки эффективности терапии, что позволит при сокращении времени исследования и затрат материалов получить более полную информацию о течении заболевания.

Технический результат достигается тем, что в наборе реактивов для оценки эффективности терапии ИТК при Ph-позитивных новообразованиях, содержащем специфичные праймеры и флуоресцентно-меченые ДНК-зонды, новым является то, что одновременно с проведением количественного анализа уровня BCR-ABL1 с использованием олигонуклеотидных праймеров и зондов (5-3'-):

BCR-ABL1p210 - F1: TCCGCTGACCATCAACAAGGA

BCR-ABL1p210 - F2: TCCGCTGACCATCAATAAGGA

BCR-ABL1p230 - F: TGGAGGAGGTGGGCATCTAC

BCR-ABL1p210/p230 - R: CACTCAGACCCTGAGGCTCAA

BCR-ABL1p210/p230 - Probe: FAM-CCCTTCAGCGGCCAGTAGCATCTGA-BHQ1

ABL1 - F: GGCCAGTGGAGATAACACTC

ABL1 - R: GATGTAGTTGCTTGGGACCCA

ABL1 - Probe: HEX-CCATTTTTGGTTTGGGCTTCACACCATT-BHQ1

в набор включены оригинальные олигонуклеотидные молекулы для дополнительной детекции мутаций резистентности к терапии ИТК следующего состава

Мутация Олигонуклеотиды

G250E - F: ATGAAGCACAAGCTGCGAGA

G250E - R: CTTCAAGGTCTTCACGGCCA

G250E - P: HEX-AGGGCGTGTGGAAGAAATACAGCCTGA-BHQ1

E253/255 - F: TGGTGTGTCCCCCAACTACGA

Y253H - R: CCCTCGTACACCTCCCATTG

E255K - R: CACACGCCCTCGTACACATT

E255V - R: CACACGCCCTCGTACAACA

E253/255 - P: HEX-TGCTTCATGGTGATGTCCGTGCGTTCCA-BHQ1

T315I - F: AGCCCCCGTTCTATATCATGAT

T315I - R: TTCACCTCCTGCTGGTTGCA

T315I - P: FAM-ACCTACGGGAACCTCCTGGACTACCTGA-BHQ1

F317L - F1: CCGTTCTATATCATCACTGAGCTA

F317L - F2: CGTTCTATATCATCACTGAGCTG

F317L - R: TGGCTGACGAGATCTGAGTG

F317L - P: FAM-ACCTGAGGGAGTGCAACCGGCA-BHQ1

F359I - F: GGAGTACCTGGAGAAGAAAATCG

F359V - F: GGAGTACCTGGAGAAGAAAACCA

F359 - R: TGCTCAGGCCAAAATCAGCTA

F359 - P: FAM-ATCTTGCTGCCCGAAACTGCCTGGTA-BHQ1

Технический результат достигается также за счет попарного объединения комплектов праймеров и зондов для выявления мутаций BCR-ABL1 в единых реакционных смесях, где новым является их уникальное сочетание, не препятствующее взаимному протеканию реакций и не способствующее перекрестному неспецифическому связыванию:

1. G250E + F317L

2. Y253H + T315I

3. E255K + F359I

4. E255V + F359V.

Количественную оценку доли химерной кДНК рассчитывают исходя из значений пороговых циклов Ct в реакциях амплификации фрагментов BCR-ABL1 и ABL1, где количество копий ABL1 рассчитывают по формуле:

N_(ABL1) =9⋅10¹¹ ⋅ e^{(-0,655*Ct(ABL1))} (1),

количество копий транскрипта BCR-ABL1 - по формуле:

N_(BCR-ABL1) = 10¹¹ ⋅ e^{(-0,672*Ct(BCR-ABL1))} (2),

долю химерных транскриптов - по формуле:

IS(%) = (N_(BCR-ABL1) / N_(ABL1)) ⋅ 1,265⋅100 (3),

а оценку наличия мутаций гена ABL1 - по соотношению значений Ct в реакциях детекции мутаций и реакции ABL1 по правилу: если разность Ct(мутации) - Ct(ABL1) меньше критического значения, результат анализа на наличие мутации считается положительным.

Заявляемая группа изобретений соответствует требованию единства изобретения, поскольку группа разнообъектных изобретений образует единый изобретательский замысел, причем один из заявляемых объектов - диагностический набор на основе мультиплексной ПЦР в реальном времени, предназначен для использования в другом - способ его использования оценки эффективности терапии ингибиторами тирозинкиназы при Ph-позитивных новообразованиях, при этом заявка относится к объектам изобретения одного вида, одинакового назначения, обеспечивающим получение одного и того же технического результата.

Способ использования заявленного набора

Применению заявляемого набора реагентов предшествует выделение тотальной РНК из лейкоцитов крови любым доступным методом, позволяющим получить РНК в количестве и качестве, достаточном для проведения ПЦР в реальном времени, а также реакция обратной транскрипции для получения комплементарной ДНК (кДНК). Например, возможно использование для выделения метода гуанидин-фенол-хлороформной экстракции РНК с последующим осаждением из водной фазы при помощи спиртов и проведение обратной транскрипции с использованием MMLV-обратной транскриптазы. Количество кДНК, помещаемое в реакцию должно содержать не менее 10000 молекул ABL1, а объем смеси кДНК, используемой для анализа заявляемым способом составлять не менее 100 мкл.

Для достижения оптимального количества молекул РНК (кДНК) в исследуемом образце рекомендуется производить выделение из 2,5⋅10¹⁰ лейкоцитов крови (что соответствует приблизительно 5 мл венозной крови здорового человека). Расчет возможно производить при помощи камеры Горяева или другого доступного приспособления для подсчета клеток.

Полученную кДНК в объеме не менее 70 мкл используют для постановки реакции ПЦР-РВ, содержащей компоненты согласно таблице 1.

Таблица 1.

Состав реакционных смесей для проведения ПЦР-РВ

BCR-ABL1 p210 Вода деионизированная - 9,7 мкл
MgCl₂ (25 мМ) - 2,0 мкл
Буфер для ПЦР (10Х) - 2,5 мкл
дНТФ (2,5 мМ) - 0,38 мкл
BCR-ABL1 - F1 (0,1 мМ) - 0,075 мкл
BCR-ABL1 - F2 (0,1 мМ) - 0,075 мкл
BCR-ABL1 - R (0,1 мМ) - 0,075 мкл
BCR-ABL1 - P (0,1 мМ) - 0,075 мкл
Taq-полимераза (5 ед/мкл) - 0,2 мкл BCR-ABL1 p230 Вода деионизированная - 9,7 мкл
MgCl₂ (25 мМ) - 2,0 мкл
Буфер для ПЦР (10Х) - 2,5 мкл
дНТФ (2,5 мМ) - 0,38 мкл
BCR-ABL1 - F (0,1 мМ) - 0,075 мкл
BCR-ABL1 - R (0,1 мМ) - 0,075 мкл
BCR-ABL1 - P (0,1 мМ) - 0,075 мкл
Taq-полимераза (5 ед/мкл) - 0,2 мкл

ABL1 Вода деионизированная - 9,7 мкл
MgCl₂ (25 мМ) - 2,0 мкл
Буфер для ПЦР (10Х) - 2,5 мкл
дНТФ (2,5 мМ) - 0,39 мкл
ABL1 - F (0,1 мМ) - 0,075 мкл
ABL1 - R (0,1 мМ) - 0,075 мкл
ABL1 - P (0,1 мМ) - 0,075 мкл
Taq-полимераза (5 ед/мкл) - 0,2 мкл G250E + F317L Вода деионизированная - 9,48 мкл
MgCl₂ (25 мМ) - 2,0 мкл
Буфер для ПЦР (10Х) - 2,5 мкл
дНТФ (2,5 мМ) - 0,40 мкл
G250E - F (0,1 мМ) - 0,06 мкл
G250E - R (0,1 мМ) - 0,06 мкл
G250E - P (0,1 мМ) - 0,06 мкл
F317L - F (0,1 мМ) - 0,06 мкл
F317L - R (0,1 мМ) - 0,06 мкл
F317L - P (0,1 мМ) - 0,06 мкл
Taq-полимераза (5 ед/мкл) - 0,2 мкл Y253H + T315I Вода деионизированная - 9,54 мкл
MgCl₂ (25 мМ) - 2,0 мкл
Буфер для ПЦР (10Х) - 2,5 мкл
дНТФ (2,5 мМ) - 0,40 мкл
E255 - F (0,1 мМ) - 0,06 мкл
Y253H - R (0,1 мМ) - 0,06 мкл
E255 - P (0,1 мМ) - 0,06 мкл
T315I - F (0,1 мМ) - 0,06 мкл
T315I - R (0,1 мМ) - 0,06 мкл
T315I - P (0,1 мМ) - 0,06 мкл
Taq-полимераза (5 ед/мкл) - 0,2 мкл

E255K + F359I Вода деионизированная - 9,54 мкл
MgCl₂ (25 мМ) - 2,0 мкл
Буфер для ПЦР (10Х) - 2,5 мкл
дНТФ (2,5 мМ) - 0,40 мкл
E255 - F (0,1 мМ) - 0,06 мкл
E255K - R (0,1 мМ) - 0,06 мкл
E255 - P (0,1 мМ) - 0,06 мкл
F359 - F (0,1 мМ) - 0,06 мкл
F359I - R (0,1 мМ) - 0,06 мкл
F359 - P (0,1 мМ) - 0,06 мкл
Taq-полимераза (5 ед/мкл) - 0,2 мкл E255V + F359V Вода деионизированная - 9,54 мкл
MgCl₂ (25 мМ) - 2,0 мкл
Буфер для ПЦР (10Х) - 2,5 мкл
дНТФ (2,5 мМ) - 0,40 мкл
E255 - F (0,1 мМ) - 0,06 мкл
E255V - R (0,1 мМ) - 0,06 мкл
E255 - P (0,1 мМ) - 0,06 мкл
F359 - F (0,1 мМ) - 0,06 мкл
F359V - R (0,1 мМ) - 0,06 мкл
F359 - P (0,1 мМ) - 0,06 мкл
Taq-полимераза (5 ед/мкл) - 0,2 мкл

Для проведения анализа 40 мкл раствора кДНК используют для постановки следующих реакций:

1. BCR-ABL1 p210 или p230 (в зависимости от варианта транскрипта у данного пациента) - 2 пробирки,

2. ABL1 - 2 пробирки,

внося по 10 мкл раствора в каждую реакционную смесь. Оставшийся раствор кДНК используют для постановки реакций на выявление мутаций. Образец вносят по 10 мкл в следующие реакционные смеси:

1. G250E + F317L - 1 пробирка,

2. Y253H + T315I - 1 пробирка,

3. E255K + F359I - 1 пробирка,

4. E255V + F359V - 1 пробирка,

5. ABL1 - 1 пробирка.

Условия реакции для всех смесей: предварительная денатурация 95°С - 5 минут; 50 циклов реакции в режиме 95°С - 15 сек, 60°С - 40 сек (детекция флуоресценции).

Детекцию флуоресценции производят по следующим каналам:

BCR-ABL1 - FAM,

ABL1 - HEX,

G250E + F317L - FAM + HEX,

Y253H + T315I - FAM + HEX,

E255K + F359I - FAM + HEX,

E255V + F359V - FAM + HEX.

По окончании реакции анализируют графики уровня флуоресцентного сигнала в пробах. Устанавливают пороговый уровень флуоресценции, выше которого сигнал считается положительным (если он не устанавливается или не рассчитывается прибором автоматически). Номер цикла, в котором график интенсивности флуоресценции для данной пробы пересек пороговый уровень и стал положительным, называют пороговым циклом - Ct. Полученные значения Ct для реакций BCR-ABL1, ABL1 вносят в формулы для расчета (1), (2) и (3).

Результат количественного определения уровня BCR-ABL1 считается валидным, если расчетное количество молекул ABL1 в пробах до разведения превышает 10000.

Результат выявления мутаций резистентности в клетках легче всего интерпретируем при количестве молекул ABL1 от 1000 до 10000. При большем количестве молекул возможно наличие неспецифического сигнала в реакциях с мутациями. Но, в любом случае, для выявления мутаций резистентности BCR-ABL1 производят оценку разности Ct в каждой из аллель-специфичных реакций (G250E, F317L, Y253H, T315I, E255K, F359I, E255V, F359V) (при наличии сигнала) и Ct в реакции ABL1. Если Ct(мутации)-Ct(ABL1) превышает критическое значение, указанное в таблице 2, результат исследования на мутацию считается отрицательным. Если же Ct(мутации)-Ct(ABL1) ниже критического значения, результат теста на данную мутацию признается положительным.

Таблица 2

Пороговые значения разности Ct(реакции на мутацию)-Ct(ABL1)

Выявляемая мутация X Критическое значение Ct(X)-Ct(ABL1) G250E 10 Y253H 11,50

E255K 10 E255V 10 T315I 9 F317L 11,50 F359I 10 F359V 10

Примеры испытания предлагаемого набора для количественного анализа уровня BCR-ABL1 в пробах крови доноров и пациентов с подтвержденным диагнозом ХМЛ представлены в таблицах 3-6. Выделение РНК из лейкоцитов периферической крови производилось методом гуанидин-фенол-хлороформной экстракции, обратная транскрипция осуществлялась с применением набора реагентов Реверта-L (AmpliSens, Россия). Реакция производилась по схеме, описанной выше.

Таблица 3

Результат тестирования набора реагентов для выявления уровня BCR-ABL1 в образцах крови здоровых доноров

№ Ct (p210), среднее Ct (p230), среднее Ct (ABL1), среднее Копий (p210) Копий (p230) Копий (ABL1) Доля BCR-ABL1, % 1 N/A N/A 22,14 0 0 45504 0 2 N/A N/A 22,62 0 0 33096 0 3 N/A N/A 22,57 0 0 34198 0 4 N/A N/A 24,25 0 0 11425 0 5 N/A N/A 23,25 0 0 21959 0 6 N/A N/A 24,44 0 0 10231 0 7 38,5 N/A 24,2 1 0 11837 0,003 8 N/A N/A 24,29 0 0 11178 0 9 N/A N/A 24,14 0 0 12227 0 10 N/A N/A 23,34 0 0 20650 0 11 37,17 N/A 23,23 2 0 23493 0,008 12 N/A N/A 23,96 0 0 13757 0 13 N/A N/A 24,38 0 0 10448 0

Во всех исследованных пробах здоровых людей не было выявлено наличие химерного транскрипта BCR-ABL1 выше клинически значимого уровня в 0,01%. Согласно литературным данным, выявление единичных молекул BCR-ABL1 возможно у здоровых людей [Ismail S.I., Naffa R.G., Yousef A.M., Ghanim M.T. Incidence of bcr‑abl fusion transcripts in healthy individuals. Mol Med Rep. 2014; 9(4):1271-6; Meza-Espinoza J.P., Vásquez-Jiménez E.A., Barajas-Torres R.L., Magaña-Torres M.T., González-García J.R. BCR/ABL1 Transcripts in Healthy Individuals: A Comparative Analysis Between First-Degree Relatives of Patients with Chronic Myelogenous Leukemia and Subjects without Antecedents of the Disease. Ann Clin Lab Sci. 2019;49(6):703-709], поэтому выявленные значения уровня химерного транскрипта ниже 0,01% свидетельствует о высокой аналитический чувствительности набора, но у лиц без симптомов онкогематологического заболевания не могут служить основанием для постановки диагноза.

Произведено сравнение результатов исследования уровня BCR-ABL1 в образцах крови пациентов с ХМЛ при помощи предлагаемого набора реагентов с набором реагентов «АмплиСенс® Лейкоз Квант M-bcr-FRT» (AmpliSens, Москва, Россия). Было показано, что результаты исследования, полученные предлагаемым набором, согласуются с данными, полученными при помощи коммерческого набора реагентов (Таблица 4).

Таблица 4.

Сравнительные результаты исследования уровня BCR-ABL1 в пробах крови пациентов с ХМЛ, полученные при помощи предлагаемого набора реагентов и зарегистрированного набора реагентов «АмплиСенс® Лейкоз Квант M-bcr-FRT».

№ «АмплиСенс® Лейкоз Квант
M-bcr-FRT». Предлагаемый набор реагентов Ct (BCR-ABL1) Ct (ABL1) Копий BCR-ABL1 Копий ABL1 IS, % Ct (BCR-ABL1) Ct (ABL1) Копий BCR-ABL1 Копий ABL1 IS, % 1 32,7 22,8 30 30389 0,12 33,6 23,1 15 24967 0,08 2 24,3 22,7 8203 32446 31,98 25,3 23,9 4275 14308 37,79 3 25,6 23,6 3356 17995 23,59 25,6 23,4 3379 19466 21,96 4 NA 21,5 0 70279 0,00 NA 20,9 0 100758 0,00 5 20,1 21,1 136112 91329 100,00 21,3 21,3 62846 77028 100,00 6 26,0 20,3 2514 149265 2,130 27,1 21,2 1217 82783 1,859

Была проведена оценка уровня специфичности предлагаемого набора в отношении выявляемых мутаций. Представленные в таблице 5 результаты свидетельствуют об отсутствии ложноположительных результатов исследования мутаций при анализе крови доноров, что указывает на высокую специфичность набора

Таблица 5

Результат тестирования набора реагентов для выявления мутаций гена BCR-ABL1 в пробах крови здоровых добровольных доноров

№ образца Ct (ABL1) Ct (G250E) / Ct (F317L) Ct (Y253H) / Ct (T315I) Ct (E255K) / Ct (F359I) Ct (E255V) / Ct (F359V) 1 21,68 42,25 /47,90 33,50 / 33,70 39,80 / 44,50 N/A / N/A

2 27,17 N/A / N/A N/A / N/A N/A / N/A N/A / N/A 3 21,32 41,32 / N/A 32,90 / 37,15 39,72 / 41,88 39,81 / 44,98 4 27,10 N/A / N/A N/A / 36,70 N/A / N/A N/A / N/A 5 26,61 N/A / 39,41 38,46 / N/A N/A / N/A N/A / N/A 6 25,46 N/A / N/A 39,14 / N/A N/A / N/A N/A / N/A 7 25,51 N/A / N/A 38,38 / N/A 41,02 / N/A N/A / N/A 8 23,96 N/A / 38,75 37,18 / N/A 38,8 / N/A N/A / N/A 9 25,43 N/A / 42,6 37,34/ 36,80 37,66 / N/A 35,42 / N/A 10 20,88 39,08 / N/A 32,85 / 31,23 35,43 / N/A 39,88 / N/A 11 24,38 N/A / N/A 37,96 / N/A N/A / N/A N/A / N/A 12 25,28 N/A / N/A 38,29 / N/A N/A / N/A N/A / N/A 13 25,65 N/A / 41,48 41,31 / N/A N/A / N/A N/A / N/A 14 26,44 N/A / N/A 39,74 / N/A N/A / N/A N/A / N/A

Было также произведено тестирование набора на образцах кДНК, полученной из проб крови пациентов с подтвержденным диагнозом ХМЛ и проходящих курс терапии ИТК. Среди исследуемых были пациенты как проявляющие резистентность к терапии, так и отвечающие на лечение адекватно. Постановку реакции производили по схеме, описанной выше. Результаты ПЦР-РВ представлены в таблице 6, демонстрация графикой флуоресценции изображена на Рис 2.

Таблица 6

Результат тестирования набора реагентов для выявления мутаций гена ABL1 в пробах крови пациентов с ХМЛ

№ п/п Доля BCR-ABL1 Ct (ABL1') Ct (G250E) / Ct (F317L) Ct (Y253H) / Ct (T315I) Ct (E255K) / Ct (F359I) Ct (E255V) / Ct (F359V) Заключение 1 100,00 26,68 N/A / N/A 36,79 / 38,34 N/A / N/A N/A / N/A Нет мутаций 2 5,85 23,39 44,05/43,85 35,78 / 35,00 35,25 / 36,03 34,47 / 35,41 Нет мутаций 3 26,68 27,00 N/A / N/A 36,61 / 37,77 N/A / N/A N/A / N/A Нет мутаций 4 83,67 21,04 40,99/33,67 34,44 / 33,08 34,88 / 35,80 33,85 / 41,79 Нет мутаций 5 100,00 24,14 47,32/N/A 38,58 / N/A 44,79 / 42,40 42,21 / 42,16 Нет мутаций 6 92,70 25,70 N/A / 48,45 41,74 / N/A 40,78 / 41,88 44,58 / 44,64 Нет мутаций 7 49,70 23,94 40,82/39,68 36,35 / 34,49 34,08 / 34,10 33,78 / 35,13 Нет мутаций

8 26,89 22,95 42,67/42,94 34,34 / N/A 39,39/36,75 40,42/39,76 Нет мутаций 9 15,59 23,42 45,66/44,31 34,19 / N/A 41,72/37,65 43,24/42,95 Y253H 10 29,13 23,85 43,51/42,97 35,36 / 38,08 34,78/35,42 36,68/37,71 Нет мутаций 11 39,78 22,96 40,84/41,91 36,72 / 39,91 37,40/37,41 37,36/37,45 Нет мутаций 12 100,00 22,66 42,90/44,75 34,47 / 37,14 34,42/36,04 35,42/35,69 Нет мутаций 13 100,00 19,32 48,36/49,75 34,69 / N/A 35,42 / N/A 35,51 / N/A Нет мутаций 14 7,01 25,61 N/A / N/A 37,81 / 35,22 36,67/37,29 34,96/36,75 Нет мутаций 15 7,03 22,48 42,41/33,84 37,33 / 46,63 37,06/42,86 38,84/39,14 F317L

При наличии мутации в пробах №9 и №15 отмечается рост флуоресценции в реакционной смеси с разностью Ct(мутации) - Ct(ABL1) менее критического значения.

Клинический пример, пациент А

Пациент А, подтвержденный диагноз ХМЛ с выявлением химерного транскрипта BCR-ABL1 p210. Получает терапию ИТК первой линии. Необходимо произвести оценку уровня BCR-ABL1 в крови через 3 месяца на фоне лечения, а также выявить возможное наличие мутаций резистентности в опухолевых клетках. Для этого образец тотальной РНК, выделенной из лейкоцитов крови подвергли реакции обратной транскрипции с использованием набора реагентов Реверта-L (Amplisens, Россия). Полученную кДНК использовали для постановки ПЦР с использованием разработанного набора. Для анализа приготовили следующие реакционные смеси:

1. BCR-ABL1 p210 (FAM) (2 повторности)

2. ABL1 (HEX) (2 повторности)

3. G250E + F317L

4. Y253H + T315I

5. E255K + F359I

6. E255V + F359V

Детекцию флуоресцентного сигнала осуществляли по каналам FAM и HEX.

Результаты анализа представлены в таблице 7, а вид анализируемых графиков флуоресценции изображен на Фиг. 2.

Таблица 7.

Средние значения пороговых циклов флуоресценции для образца А.

Мишень для ПЦР Пороговый цикл Ct ABL1 22,08

BCR-ABL1 p210 26,48 G250E / F317L 39,56 / 38,99 Y253H / T315I 41,07 / 40,90 E255K / F359I 39,85 / 37,51 E255V / F359V 41,91 / 39,30

На основе полученных данных, был произведен расчет количества молекул ABL1 по формуле (1).

N_(ABL1) = 9⋅10¹¹ ⋅ e^{(-0,655*22,08)} = 47130.

47013 > 10000, поэтому полученный результат уровня BCR-ABL1 можно считать валидным.

Количество молекул BCR-ABL1 рассчитали по формуле (2):

N_(BCR-ABL1) = 10¹¹ ⋅ e^{(-0,672*26,48)} = 1870.

Долю молекул BCR-ABL1 в образце рассчитывали по формуле (3):

IS(%) = (1870 / 47130) ⋅ 1,265 ⋅ 100 = 5,02%

Для оценки наличия мутаций резистентности рассчитали разность Ct для каждой реакции на мутацию и Ct(ABL1). Полученные значения сравнили с критическими значениями из таблицы 2. Разность Ct(мутации) и Ct(ABL1) для всех реакций на выявление мутации была больше критического значения.

Заключение: Доля химерного транскрипта BCR-ABL1 в крови пациента на момент исследования составляет 5,02%. Мутаций резистентности G250E, Y253H, E255K, E255V, T315I, F317L, F359I, F359V не выявлено.

Клинический пример, пациент Б

Образец кДНК пациента Б с диагнозом ХМЛ, проявляющий признаки устойчивости к терапии ИТК первой линии. Необходимо произвести оценку уровня BCR-ABL1 в крови на фоне лечения, а также выявить возможное наличие мутаций резистентности в опухолевых клетках. Для этого образец тотальной РНК, выделенной из лейкоцитов крови подвергли реакции обратной транскрипции с использованием набора реагентов Реверта-L (Amplisens, Россия). Полученную кДНК использовали для постановки ПЦР с использованием разработанного набора. Для анализа приготовили следующие реакционные смеси:

1. BCR-ABL1 p210 (FAM) (2 повторности)

2. ABL1 (HEX) (2 повторности)

3. G250E + F317L

4. Y253H + T315I

5. E255K + F359I

6. E255V + F359V

ПЦР-РВ осуществляли в описанном выше температурном режиме: предварительная денатурация 95°С - 5 минут; 50 циклов реакции в режиме 95°С - 15 сек, 60°С - 40 сек (детекция флуоресценции).

Детекцию гена ABL1 осуществляли по каналу HEX, а мутаций - одновременно по каналам HEX и FAM. Результаты анализа представлены в таблице 8, а вид анализируемых графиков флуоресценции изображен на Фиг. 3.

Таблица 8

Значения пороговых циклов флуоресценции для образца Б

Мишень для ПЦР Пороговый цикл Ct ABL1 22,48 BCR-ABL1 p210 26,23 G250E / F317L 42,41 / 33,84 Y253H / T315I 37,33 / 46,63 E255K / F359I 37,06 / 42,86 E255V / F359V 38,84 / 39,14

На основе полученных данных, был произведен расчет количества молекул ABL1 по формуле (1).

N(ABL1) = 9 ⋅ 10¹¹ ⋅ e^{(-0,655*22,48)} = 38644.

38644 > 10000, поэтому полученный результат уровня BCR-ABL1 можно считать валидным.

Количество молекул BCR-ABL1 рассчитали по формуле (2):

N(BCR-ABL1) = 10¹¹ ⋅ e^{(-0,672*26,23)} = 2147.

Долю молекул BCR-ABL1 образце рассчитывали по формуле (3):

IS(%) = (2147 / 38644) ⋅ 1,265 ⋅ 100 = 7,03%

Для оценки наличия мутаций резистентности рассчитали разность Ct для каждой реакции на мутацию и Ct(ABL1). Полученные значения сравнили с критическими значениями из таблицы 2.

G250E: 42,41-22,48 = 19,93 > 10

Y253H: 37,33-22,48 = 14,85 > 11,50

E255K: 37,06-22,48 = 14,58 > 10

E255V: 38,84-22,48 = 16,36 > 10

T315I: 46,63-22,48 = 24,15 > 9

F317L: 33,84-22,48 = 11,36 < 11,50

F359I: 42,86-22,48 = 20,38 > 10

F359V: 39,14-22,48 = 16,66 > 10

Заключение: Доля химерного транскрипта BCR-ABL1 p210 в крови пациента на момент исследования составляет 7,03%. Обнаружена мутация гена BCR-ABL1 F317L. Мутаций G250E, Y253H, E255K, E255V, T315I, F359I, F359V не выявлено.

Полученный результат подтвержден секвенированием.

Клинический пример, пациент В

Пациент В с диагнозом ХМЛ, проявляющий признаки устойчивости к терапии ИТК первой линии. Необходимо произвести оценку уровня BCR-ABL1 в крови на фоне лечения, а также выявить возможное наличие мутаций резистентности в опухолевых клетках. Для этого образец тотальной РНК, выделенной из лейкоцитов крови подвергли реакции обратной транскрипции с использованием набора реагентов Реверта-L (Amplisens, Россия). Полученную кДНК использовали для постановки ПЦР с использованием разработанного набора. Для анализа приготовили следующие реакционные смеси:

1. BCR-ABL1 p210 (FAM) (2 повторности)

2. ABL1 (HEX) (2 повторности)

3. G250E + F317L

4. Y253H + T315I

5. E255K + F359I

6. E255V + F359V

Детекцию флуоресцентного сигнала осуществляли по каналам FAM и HEX.

Результаты анализа представлены в таблице 9, а вид анализируемых графиков флуоресценции изображен на Фиг. 4.

Таблица 9

Значения пороговых циклов флуоресценции для образца В

Мишень для ПЦР Пороговый цикл Ct ABL1 23,42 BCR-ABL1 p210 26,10 G250E / F317L 45,66 / 44,31 Y253H / T315I 34,19 / N/A E255K / F359I 41,72 / 37,65 E255V / F359V 43,24 / 42,95

На основе полученных данных, был произведен расчет количества молекул ABL1 по формуле (1).

N_(ABL1) = 9 ⋅ 10¹¹ ⋅ e^{(-0,655*23,42)} = 19594.

19594 > 10000, поэтому полученный результат уровня BCR-ABL1 можно считать валидным.

Количество молекул BCR-ABL1 рассчитали по формуле (2):

N_(BCR-ABL1) = 10¹¹ ⋅ e^{(-0,672*26,10)} = 2414.

Долю молекул BCR-ABL1 образце рассчитывали по формуле (3):

IS(%) = (2414 / 19594)⋅1,265⋅100 = 15,59%

Для оценки наличия мутаций резистентности рассчитали разность Ct для каждой реакции на мутацию и Ct(ABL1). Полученные значения сравнили с критическими значениями из таблицы 2.

G250E: 45,66-23,42 = 22,24 > 10

Y253H: 34,19-23,42 = 10,77 < 11,50

E255K: 41,72-23,42 = 18,30 > 10

E255V:43,24-23,42 = 19,82 > 10

T315I: результат отрицательный

F317L: 44,31-23,42 = 20,89 > 10

F359I: 37,65-23,42 = 14,23 > 10

F359V: 42,9-23,42 = 19,48 > 10

Заключение: Доля химерного транскрипта BCR-ABL1 p210 в крови пациента на момент исследования составляет 15,59%. Обнаружена мутация гена BCR-ABL1 Y253H. Мутаций G250E, E255K, E255V, T315I, F317L, F359I, F359V не выявлено.

Полученный результат подтвержден секвенированием.

Краткое описание чертежей

фиг. 1. График ПЦР в реальном времени образца крови здорового донора. 1 - ABL1, 2 - BCR-ABL1.

фиг. 2. График ПЦР в реальном времени образца крови пациента с ХМЛ. 1 - ABL1, 2 - BCR-ABL1.

фиг. 3. График флуоресценции в ПЦР-РВ образца Б. 1 - ABL1, 2 - BCR-ABL1 p210, 3 - F317L, 4 - другие мутации.

фиг. 4. График флуоресценции в ПЦР-РВ образца В. 1 - ABL1, 2 - BCR-ABL1 p210, 3 - Y253H, 4 - другие мутации.

Перечень последовательностей

SEQ ID NO 1: tccgctgaccatcaacaagga

SEQ ID NO 2: tccgctgaccatcaataagga

SEQ ID NO 3: tggaggaggtgggcatctac

SEQ ID NO 4: cactcagaccctgaggctcaa

SEQ ID NO 5: cccttcagcggccagtagcatctga

SEQ ID NO 6: ggccagtggagataacactc

SEQ ID NO 7: gatgtagttgcttgggaccca

SEQ ID NO 8: ccatttttggtttgggcttcacaccatt

SEQ ID NO 9: atgaagcacaagctgcgaga

SEQ ID NO 10: cttcaaggtcttcacggcca

SEQ ID NO 11: agggcgtgtggaagaaatacagcctga

SEQ ID NO 12: tggtgtgtcccccaactacga

SEQ ID NO 13: ccctcgtacacctcccattg

SEQ ID NO 14: cacacgccctcgtacacatt

SEQ ID NO 15: cacacgccctcgtacaaca

SEQ ID NO 16: tgcttcatggtgatgtccgtgcgttcca

SEQ ID NO 17: agcccccgttctatatcatgat

SEQ ID NO 18: ttcacctcctgctggttgca

SEQ ID NO 19: acctacgggaacctcctggactacctga

SEQ ID NO 20: ccgttctatatcatcactgagcta

SEQ ID NO 21: cgttctatatcatcactgagctg

SEQ ID NO 22: tggctgacgagatctgagtg

SEQ ID NO 23: acctgagggagtgcaaccggca

SEQ ID NO 24: ggagtacctggagaagaaaatcg

SEQ ID NO 25: ggagtacctggagaagaaaacca

SEQ ID NO 26: tgctcaggccaaaatcagcta

SEQ ID NO 27: atcttgctgcccgaaactgcctggta.

Изобретение относится к молекулярной биологии, биотехнологии и медицине, в частности к гематологии, онкологии, и может применяться для оценки эффективности терапии Ph-позитивных онкогематологических заболеваний. Набор для мультиплексного ПЦР анализа уровня экспрессии химерных молекул РНК с одновременным выявлением мутаций резистентности к терапии ИТК, а также ускоренного и экономичного способа диагностики Ph-позитивных онкогематологических заболеваний на его основе содержит буферный раствор, дезоксинуклеотидтрифосфаты, специфичные праймеры, TaqMan зонды, Taq-полимеразу, MgCI₂ и воду в оптимальных соотношениях, обеспечивающих оптимальную работу фермента. Способ оценки эффективности терапии ингибиторами тирозинкиназ при Ph-позитивных новообразованиях с использованием заявленного набора включает также проведение амплификации в следующем температурном режиме: предварительная денатурация 95°С – 5 минут; 50 циклов реакции в режиме 95°С – 15 с, 60°С – 40 с. Количественную оценку доли химерной ДНК рассчитывают исходя из значений пороговых циклов Ct в реакциях амплификации фрагментов BCR-ABL1 и ABL1, где количество копий ABL1 рассчитывают по формуле: IS(%)=(N(BCR-ABL1)/N(ABL1))⋅1,265⋅100. При определении уровня BCR-ABL1 выше 1% делается вывод о наличии резистентости пациента к используемым препаратам ИТК. В случае если одновременно выявленная разность значений Ct (исследуемой мутации) и Ct(ABL1) для любой из выявляемых мутаций меньше заданного критического порога, делается вывод, что выявленная мутация или комбинация мутаций является причиной данной резистентности. Техническим результатом, достигаемым заявляемым изобретением, является изготовление набора реактивов для мультиплексной ПЦР в реальном времени, позволяющего в одной аналитической постановке произвести количественную оценку уровня химерного транскрипта BCR-ABL1 в пробе крови, а также выявление 8 мутаций резистентности к ИТК - G250E, Y253H, E244K, E255V, T315I, F317L, F359I, F359V - для оценки эффективности терапии, что позволит при сокращении времени исследования и затрат материалов получить более полную информацию о течении заболевания. 2 н.п. ф-лы, 9 табл., 4 ил., 3 пр.

1. Набор реактивов для оценки эффективности терапии ингибиторами тирозинкиназ при Ph-позитивных новообразованиях для проведения полимеразной цепной мультиплексной реакции в реальном времени по технологии Taq-man зондов с использованием реакционной смеси, включающей также солевой буферный раствор, ионы Mg2+, смесь дезоксинуклеозидтрифосфатов и Taq-ДНК-полимеразу, отличающийся тем, что олигонуклеотидные праймеры и флуоресцентные зонды представлены последовательностями SEQ ID NO 1 - 27.

2. Способ оценки эффективности терапии ингибиторами тирозинкиназ при Ph-позитивных новообразованиях с использованием набора по п. 1, включающий проведение полимеразной цепной реакции в режиме реального времени путем смешивания буферного раствора, солей Mg²⁺, дезоксинуклеотидтрифосфатов, специфичных праймеров, TaqMan зондов, Taq-полимеразы и воды в оптимальных объемах и последующей амплификации в следующем режиме: предварительная денатурация 95°С - 5 минут; 50 циклов реакции в режиме 95°С - 15 с, 60°С - 40 с (детекция флуоресценции), отличающийся объединением в мультиплексный вариант реакции олигонуклеотидных реагентов, при котором в одной аналитической постановке одновременно осуществляется оценка уровней химерных транскриптов BCR-ABL1 p210 и p230, а также выявление восьми мутаций гена BCR-ABL1 в мультиплексных смесях G250E+F317L, Y253H+T315I, E255K+F359I и E255V+F359V, где количественную оценку доли химерного транскрипта оценивают по формуле IS(%)=(количество копий молекул BCR-ABL1)/(количество копий молекул ABL1)⋅1,265⋅100, а присутствие мутации - по соотношению значений Ct (исследуемой мутации) и Ct(ABL1), и при определении уровня BCR-ABL1 выше 1% в сочетании с разностью Ct (исследуемой мутации) и Ct(ABL1) меньше заданного критического порога, приведенного в таблице 2, делается вывод о наличии резистентости пациента к используемым препаратам ИТК, причиной которой является выявленная мутация или комбинация мутаций.