Область изобретения
Данная заявка заявляет приоритет и преимущество по корейской патентной заявке №10-2017-0184738, поданной в Ведомство интеллектуальной собственности Республики Корея 29 декабря 2017 года, раскрытие которой включено в данный документ посредством ссылки.
Настоящее изобретение относится к AAV (от англ. adeno-associated virus -аденоассоциированный вирус) вектору, содержащему предварительно заданную последовательность гибридного гена HGF.
Предшествующий уровень техники
Генная терапия представляет собой способ, в котором терапевтические гены доставляют в клетки пациентов с использованием технологии рекомбинантных ДНК с индукцией генетических мутаций клеток-мишеней или экспрессией конкретных белков, осуществляя, таким образом, лечение генетических заболеваний, неизлечимых заболеваний и т.п.Вещества, которые переносят гены в живые организмы, называют носителями или векторами. Векторы главным образом подразделяют на вирусные векторы и невирусные векторы. Ретровирусы и аденовирусы представляют собой типичные типы вирусных векторов, и невирусные векторы включают «голую» ДНК, липосомы и т.п.
Фактор роста гепатоцитов (HGF - от англ. Hepatocyte growth factor) является одним из факторов роста, и исследование разных функций HGF продолжается. Их примеры выглядят следующим образом: (1) лечение заболевания сердца посредством HGF с использованием липосомы в качестве носителя (Aoki et al., Angiogenesis induced by hepatocyte growth factor in non-infarcted myocardium and infracted myocardium: up-regulation of essential transcription factor for angiogenesis, etc. Gene Therapy 7:417-427, 2000); (2) лечение заболевания печени посредством HGF с использованием AAV в качестве носителя (Suzumura et al., Adeno-associated virus vector-mediated production of hepatocyte growth factor attenuates liver fibrosis in mice. Hepatol. Int. 2:80-88, 2008); (3) лечение диабетической периферической нейропатии посредством HGF с использованием «голой» ДНК в качестве носителя (Kessler et al., Double-blind, placebo-controlled study of HGF gene therapy in diabetic neuropathy. Annals of Clinical and Translational Neurology 2:465-478, 2015); и (4) лечение бокового амиотрофического склероза посредством HGF с использованием «голой» ДНК в качестве носителя (Sufit et al., Open label study to assess the safety of VM202 in subjects with amyotrophic lateral sclerosis. Amyotroph Lateral Scler Frontotemporal Degener 18:269-278, 2017).
Подробное описание изобретения
Техническая проблема
Авторы настоящего изобретения проводили исследования и старались разработать систему доставки генов с повышенной эффективностью доставки гибридного гена HGF, который одновременно экспрессирует изоформы фактора роста гепатоцитов (HGF), включая fIHGF и dHGF. В результате, авторы настоящего изобретения установили, что эффективность доставки гена может быть значимо улучшена при использовании усеченного мутанта ранее известного гибридного гена HGF и аденоассоциированного вируса (AAV) в качестве системы доставки гена, и, таким образом, завершили настоящее изобретение.
Таким образом, одним аспектом настоящего изобретения является предложение вектора на основе аденоассоциированного вируса (AAV), в который введена чужеродная последовательность нуклеиновой кислоты, состоящая из заданной нуклеотидной последовательности.
Другим аспектом настоящего изобретения является предложение трансформанта, трансформированного описанным выше AAV вектором.
Еще одним аспектом настоящего изобретения является предложение композиции, содержащей описанный выше AAV вектор, для предупреждения или лечения диабетической периферической нейропатии (DPN - от англ. diabetic peripheral neuropathy) или бокового амиотрофического склероза (ALS - от англ. amyotrophic lateral sclerosis).
Другие цели и преимущества настоящего раскрытия станут более очевидными в сочетании со следующим подробным описанием изобретения, формулы изобретения и графических материалов.
Техническое решение
В соответствии с аспектом настоящего изобретения предложен вектор на основе аденоассоциированного вируса (AAV), в который введена чужеродная последовательность нуклеиновой кислоты, состоящая из нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 5.
Авторы настоящего изобретения проводили исследование и пытались разработать систему доставки гена с повышенной эффективностью доставки гибридного гена HGF, который одновременно экспрессирует изоформы фактора роста гепатоцитов (HGF), включая fIHGF и dHGF. В результате, авторы настоящего изобретения установили, что эффективность доставки гена можно значимо улучшить при использовании усеченного мутанта ранее известного гибридного гена HGF и аденоассоциированного вируса (AAV) в качестве системы доставки гена.
В том виде, в котором он используется в данном документе, термин «гибридный ген HGF» относится к последовательности гена, которая одновременно экспрессирует две или более изоформ HGF посредством селективного сплайсинга. Более конкретно, описанные выше две или более изоформ HGF включают по меньшей мере полноразмерную изоформу HGF (fIHGF) и вариант изоформы HGF с делецией (dHGF).
За счет вырожденности кодонов или рассмотрения предпочтительных кодонов в организме, где должны экспрессироваться гены HGF и dHGF, гибридный ген HGF по настоящему изобретению может иметь разные перестройки в кодирующей области в интервале, который не меняет аминокислотную последовательность белка, экспрессируемого с кодирующей области, или может также иметь разные перестройки или модификации в области, отличной от кодирующей области в пределах интервала, который не влияет на экспрессию гена, и такие измененные или модифицированные гены также включены в объем настоящего изобретения. Таким образом, настоящее изобретение также включает полинуклеотид, имеющий по существу такую же нуклеотидную последовательность, как и гибридный ген HGF SEQ ID NO: 5, и фрагменты данного гена. По существу такой же полинуклеотид означает полинуклеотид, обладающий гомологией последовательностей, составляющей по меньшей мере 80%, предпочтительно по меньшей мере 90% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 95%.
Описанный выше гибридный ген HGF может включать кДНК, соответствующую экзонам 1-18 человеческого гена HGF и интрону 4 человеческого гена HGF, вставленному между экзонами 4 и 5 данной кДНК, или ее фрагменты. Известно, что данная последовательность представляет собой HGF-X7, состоящую из нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 6 (см. KR 2017-0024614 (опубликовано 7 марта 2017 года)). Однако, при вставке в AAV вектор описанная выше нуклеотидная последовательность SEQ ID NO: 6 имеет ограничения, связанные с размером. Нуклеотидная последовательность SEQ ID NO: 5 по настоящему изобретению соответствует последовательности, демонстрирующей значимо повышенную эффективность доставки гена среди последовательностей, которые усечены в результате удаления части последовательности, соответствующей фрагменту интрона 4 нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 6. Конкретно, доставка нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 5 субъекту через введение в AAV вектор демонстрирует значимо повышенную эффективность доставки гена и эффективность экспрессии, по сравнению с применением ранее известного HGF-X8 SEQ ID NO: 7 через введение в AAV вектор.
Полинуклеотид может быть доставлен субъекту в состоянии «голой» ДНК или состоянии, при котором он содержится в системе доставки гена. Показано, что плазмида, вирусный вектор или т.п. могут быть использованы в качестве системы доставки гена, но, как описано выше, в настоящем изобретении в качестве системы доставки гена используют вектор на основе аденоассоциированного вируса (AAV).
Векторы AAA могут инфицировать неделящиеся клетки и могут инфицировать разные виды клеток. Подробные описания конструкции и применения AAA векторов раскрыты в патенте США №5139941 и №4797368. Результаты исследований по AAV в качестве системы доставки гена раскрыты в LaFace et al, Virology, 162:483486 (1988), Zhou et al., Exp.Hematol. (NY), 21:928-933 (1993); Walsh et al, J. Clin. Invest., 94:1440-1448 (1994); и Flotte et al., Gene Therapy, 2:29-37 (1995). Типично, вирусы AAV получают посредством совместной трансфекции плазмидой, содержащей последовательность целевого гена, фланкированную двумя концевыми повторами AAV (McLaughlin et al., J. Virol., 62:1963-1973 (1988); и Samulski et al., J. Virol., 63:3822-3828 (1989)), экспрессионной плазмидой, содержащей кодирующую последовательность AAV дикого типа без концевых повторов и плазмидой, содержащей ген хэлперного аденовируса (McCarty et al., J. Virol., 65:2936-2945 (1991)).
AAV вектор по настоящему изобретению можно использовать для доставки последовательности чужеродного гена в клетки посредством разных способов вирусного инфицирования, известных в данной области, и данные способы особым образом не ограничены.
AAV вектор по настоящему изобретению имеет серотип AAV, выбранный из группы, состоящей из AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAV14, AAV15 и AAV16.
В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения согласно настоящему изобретению предложен трансформант, трансформированный описанным выше AAV вектором.
AAV вектор по настоящему изобретению можно вводить в соответствующие клетки-хозяева, например, клетки млекопитающего, такие как клетки 293Т, или клетки насекомого или т.п., и трансформированные клетки-хозяева можно использовать для получения массовой репликации ДНК гена по настоящему изобретению или массовой продукции его белка.
В соответствии с аспектом настоящего изобретения предложена композиция, содержащая описанный выше AAV вектор, для предупреждения или лечения диабетической периферической нейропатии (DPN) или бокового амиотрофического склероза (ALS).
В том виде, в котором он используется в данном документе, термин «предупреждение» относится ко всем действиям подавления диабетической периферической нейропатии или бокового амиотрофического склероза посредством введения композиции по настоящему изобретению.
В том виде, в котором он используется в данном документе, термин «лечение» относится к (а) задержке или подавлению прогрессирования/развития диабетической периферической нейропатии или бокового амиотрофического склероза; (б) облегчению диабетической периферической нейропатии или бокового амиотрофического склероза; и (в) устранению диабетической периферической нейропатии или бокового амиотрофического склероза.
Композиция по настоящему изобретению может содержать фармацевтически приемлемый носитель.
Фармацевтически приемлемый носитель, содержащийся в фармацевтической композиции по настоящему изобретению, представляет собой фармацевтически приемлемый носитель, который обычно используется для препарата, и его примеры могут включать лактозу, дектсрозу, сахарозу, сорбит, маннит, крахмал, гуммиарабик, фосфат кальция, альгинат, желатин, силикат кальция, микрокристаллическую целлюлозу, поливинилпирролидон, целлюлозу, воду, сироп, метил целлюлозу, метилгидроксибензоат, пропилгидроксибензоат, тальк, стеарат магния и минеральные масла, но не ограничиваются ими. Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может дополнительно содержать, помимо приведенных выше ингредиентов, смазывающее вещество, увлажнитель, подсластитель, корригент, эмульгатор, суспендирующий агент, консервант и т.п. Подходящие фармацевтически приемлемые носители и препараты подробно описаны в Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995).
Фармацевтическую композицию по настоящему изобретению предпочтительно можно вводить парентерально, и, например, можно использовать внутривенное введение, внутрибрюшинное введение, внутримышечную инъекцию, подкожное введение, интратекальное введение, интрацеребровентрикулярную инъекцию, внутримозговую инъекцию или местное введение.
Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может быть приготовлена и введена в виде инъекции. Соответствующая доза фармацевтической композиции по настоящему изобретению варьирует в зависимости от факторов, таких как способ приготовления, способ введения, возраст пациента, масса тела и пол, тяжесть симптомов заболевания, время введения, путь введения, скорость выведения и чувствительность ответа. Обычный квалифицированный практик может легко определять и прописывать дозу, эффективную для желательного лечения. Согласно воплощению настоящего изобретения AAV вектор по настоящему изобретению вводят в количестве 1×108 - 1×1012 GC/сайт.
Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению приготовлена с использованием фармацевтически приемлемого носителя и/или вспомогательного вещества согласно способу, который может легко реализовать обычный специалист в области, к которой относится настоящее изобретение, и фармацевтическая композиция может быть получена в единичной лекарственной форме или может быть вставлена в многодозный контейнер. Препарат может находиться в виде раствора, суспензии или эмульсии в масляной или водной среде, или экстракта, порошка, гранулы, таблетки или капсулы, и препарат может дополнительно содержать диспергирующее средство или стабилизатор.
В одном воплощении настоящего изобретения описанная выше диабетическая периферическая нейропатия представляет собой полинейропатию или очаговую нейропатию.
В одном воплощении настоящего изобретения упомянутая выше полинейропатия представляет собой по меньшей мере одну диабетическую периферическую нейропатию, выбранную из группы, состоящей из гипергликемической нейропатии, дистальной симметричной полинейропатии, автономной нейропатии, острой сенсорной нейропатии, острой болезненной сенсорной нейропатии и хронической сенсомоторной нейропатии. Более конкретно, упомянутая очаговая нейропатия представляет собой по меньшей мере одну диабетическую периферическую нейропатию, выбранную из группы, состоящей из краниальной нейропатии, туловищной нейропатии, нейропатии конечностей, грудопоясничной радикулоневропатии и нейропатии пояснично-крестцового сплетения.
Эффекты, обеспечивающие преимущество
Признаки и преимущества настоящего изобретения кратко обобщены следующим образом.
(а) Согласно настоящему изобретению предложен вектор на основе аденоассоциированного вируса (AAV), в который введена чужеродная последовательность нуклеиновой кислоты, состоящая из заранее установленной нуклеотидной последовательности.
(б) Согласно настоящему изобретению предложен трансформант, трансформированный описанным выше AAV вектором.
(в) Согласно настоящему изобретению предложена композиция, содержащая описанный выше вектор AAV, для предотвращения или лечения диабетической периферической нейропатии (DPN) или бокового амиотрофического склероза (ALS).
(г) При применении AAV вектора по настоящему изобретению можно доставлять субъекту гибридный ген HGF с высокой эффективностью доставки.
Краткое описание графических материалов
Фиг. 1 представляет собой блок-схему, показывающую способ получения усеченных мутантов HGF-X7 из pCK-HGF-X7.
Фиг. 2 представляет собой блок-схему, показывающую способ клонирования усеченных мутантов HGF-X7 в векторы рСА.
Фиг. 3 представляет собой график, показывающий уровень экспрессии белка HGF в клетках С2С12, инфицированных AAV-pCA-HGF-X7-d3 и AAV-pCA-HGF-X7-d4, соответственно.
Фиг. 4 представляет собой график, показывающий уровень экспрессии белка HGF в клетках С2С12, инфицированных AAV2-pCA-HGF-X7-d4 и AAV2-pCA-HGF-X8.
Фиг. 5 представляет собой график, показывающий замедление прогрессирования заболевания после внутримышечной инъекции AAV6-pCA-HGF-X7-d4 у мышей с ALS.
Фиг. 6 представляет собой график, показывающий степень улучшения коэффициента выживаемости после внутримышечной инъекции AAV6-pCA-HGF-X7-d4 у мышей с ALS.
Фиг. 7 представляет собой график, показывающий степень замедления потери массы после внутримышечной инъекции AAV6-pCA-HGF-X7-d4 у мышей с ALS.
На Фиг. 8 изображены графики, показывающие результаты исследования коэффициента выживаемости и анализа поведенческого теста после интратекального введения AAV1-pCA-HGF-X7-d4 у мышей с ALS.
Способ осуществления изобретения
Далее в данном документе, настоящее изобретение будет описано более подробно со ссылкой на примеры. Данные примеры предназначены только для более конкретной иллюстрации настоящего изобретения, и специалистам в данной области будет очевидно, что объем настоящего изобретения не ограничен данными примерами в соответствии с сущностью настоящего изобретения.
Примеры
Пример анализа 1: Получение производных HGF-X7
Для конструирования AAV вектора, экспрессирующего две изоформы HGF четыре производных получали из SEQ ID NO: 1 (pCK-HGF-X7) посредством сайт-направленного мутагенеза. Подробное описание данного способа выглядит следующим образом. Сначала, проводили ПЦР (полимеразная цепная реакция) (набор для сайт-направленного мутагенеза, Stratagene, США), используя ДНК SEQ ID NO: 1 в качестве матрицы. Последовательности праймеров, которые были использованы, выглядят следующим образом.
Из колоний, полученных посредством доставки ПЦР-продуктов в С-клетки, отбирали колонии, содержащие pCK-HGF-X7-d1, pCK-HGF-X7-d2, pCK-HGF-X7-d3 и pCK-HGF-X7-d4, и из них выделяли плазмидную ДНК (см. Фиг. 1).
Пример анализа 2: Конструирование производных pCA-HGF-X7
Для получения AAV, содержащих четыре производных, полученных в Примере анализа 1, данные производные клонировали в соответствующие векторы рСА (система, не содержащая хэлперного AAV, Agilent, США). Сначала, pCK-HGF-X7-d1, pCK-HGF-X7-d2, pCK-HGF-X7-d3 и pCK-HGF-X7-d4 в Примере анализа 1 расщепляли эндонуклеазами рестрикции Clal и Sall с получением четырех типов фрагментов HGF-X7-d1, HGF-X7-d2, HGF-X7-d3 и HGF-X7-d4. Векторы рСА также расщепляли посредством эндонуклеаз рестрикции Clal и Sail и затем подвергали лигированию с четырьмя типами фрагментов HGF-X7-d1, HGF-X7-d2, HGF-X7-d3 и HGF-X7-d4, конструируя, таким образом, pCA-HGF-X7-d1, pCA-HGF-X7-d2, рСА-HGF-X7-d3 и pCA-HGF-X7-d4, соответственно (см. Фиг. 2).
Пример анализа 3: Получение производных AAV-pCA-HGF-X7
Соответствующие пладмидные ДНК, сконструированные в Примере анализа 2, использовали для получения AAV. Для получения AAV клетки 239Т (АТСС) получали днем ранее и стабилизировали в течение 24 часов. Клетки 293Т трансфицировали плазмидными ДНК, сконструированными в Примере анализа 2, pHelper в качестве ДНК, необходимой для получения AAV, и pAAV-RC (система, не содержащая хэлперного AAV, Agilent, США), и, спустя трое суток, собирали AAV. Титры собранных AAV измеряли, используя набор для титрования (набор для титрования AAVpro, Takara, JP). AAV получали, используя в общей сложности четыре серотипа (AAV1, AAV2, AAV5 и AAV6).
Пример анализа 4: Проверка экспрессии hHGF или ее отсутствия производных AAV-pCA-HGF-X7
4-1. Способы
Из AAV, полученных в Примере анализа 3, AAV2-pCA-HGF-X7-d3 и AAV2-pCA-HGF-X7-d4 анализировали для исследования экспрессии hHGF. Сначала, клетки С2С12 (АТСС) высевали в количестве 8x104 клеток/лунка в 12-луночный планшет, и клетки стабилизировали в течение 24 часов. Клетки С2С12 соответственно инфицировали эквивалетными титрами AAV2-pCA-HGF-X7-d3 и AAV2-pCA-HGF-X7-d4. Супернатант собирали через двое суток после инфицирования, и количество белка HGF анализировали посредством проведения ELISA (от англ. enzyme-linked immunosorbent assay - твердофазный иммуноферментный анализ) HGF (системы R&D, США).
4-2. Результаты
В результате анализа, подтвердили, что оба AAV2-pCA-HGF-X7-d3 и AAV2-pCA-HGF-X7-d4 экспрессировали белок HGF. Главным образом, подтвердили, что уровень экспрессии HGF AAV2-pCA-HGF-X7-d4 был выше, чем уровень экспрессии HGF AAV2-pCA-HGF-X7-d3 (см. Фиг. 3).
Пример анализа 5: Сравнение экспрессии hHGF у AAV-pCA-HGF-X7-d4 и AAV-pCA-HGF-X8
5-1. Способы
AAV2-pCA-HGF-X7-d4 и AAV2-pCA-HGF-X8 тестировали для сравнения уровня экспрессии hHGF следующим образом. Сначала, клетки С2С12 (АТСС) высевали в количестве 8x104 клеток/лунка в 12-луночный планшет, и клетки стабилизировали в течение 24 часов. Клетки С2С12 соответственно инфицировали эквивалентными титрами AAV2-pCA-HGF-X7-d4 и AAV2-pCA-HGF-X8. Супернатант собирали через двое суток после инфицирования, и количество белка HGF анализировали посредством проведения ELISA HGF (системы R&D, США).
5-2. Результаты
В результате анализа подтвердили, что как AAV2-pCA-HGF-X7-d4, так и AAV2-pCA-HGF-X8 экспрессировали белок HGF, но AAV2-pCA-HGF-X7-d4 демонстрировал значимо более высокий уровень экспрессии HGF в примерно 9-10 раз, по сравнению с AAV2-pCA-HGF-X8 (см. Фиг. 4).
Пример анализа 6: Эффект внутримышечной инъекции AAV-pCA-HGF-X7-d4 в мышиных моделях ALS
6-1. Способы
6-1-1. Изготовление мышиных моделей ALS и доставка гена
Широко используемые модели hSOD1-G93A использовали в качестве моделей ALS. Модели получали посредством скрещивания мышей с ALS (Jackson Laboratory, США), подвергали генотипированию и затем исследовали на наличие или отсутствие Tg. Спустя десять недель после рождения, мышей распределяли по двум группам (Tg-AAV6-MCS: 8 животных, Tg-AAV6-pCA-HGF-X7-d4: 7 животных). Отбирали индивиды без Tg и использовали в качестве отрицательного контроля (без Tg: 5 животных). Мышам в возрасте 90 дней вводили AAV в количестве 1×108 GC/сайт через мышцу бедра, переднюю большеберцовую мышцу и икроножную мышцу. В общей сложности вводили 3×108 GC/голова.
6-1-2. Измерение скорости прогрессирования заболевания, коэффициента выживаемости и массы
Для оценки эффективности определяли скорость прогрессирования заболевания и массу, и наблюдали за тем, выживали индивиды или нет.Заболевание ALS в конечном итоге вызывает смерть по мере прогрессирования заболевания, и, таким образом, три индикатора, приведенных выше, являются репрезентативными критериями анализа, которые широко используются в анализах животных с ALS. Скорость прогрессирования заболевания измеряли в соответствии со следующими стандартами и выражали численно.
Оценка симптомов в баллах
5 баллов: нормально
4 балла: поддерживалось равновесие нижней части тела на протяжении 1-2 секунд при хватании за мышиный хвост.
3 балла: поддерживалось равновесие нижней части тела на протяжении меньше чем 1 секунда при хватании за мышиный хвост, но ходьба была в норме
2 балла: равновесие нижней части тела не поддерживалось, волочение ног
1 балл: равновесие нижней части тела не поддерживалось, ходьба на кончиках лап.
0 баллов: смерть
6-2. Результаты
Подтверждали, что заболевание ухудшалось со временем у мышей с ALS (группа введения AAV6-MCS). Однако, подтвердили, что прогрессирование заболевания замедлялось в результате введения AAV6-pCA-HGF-X7-d4. Когда прогрессирование заболевания выражали численно, мыши с ALS имели средний балл по шкале оценки симптомов 2,36 на всем протяжении периода анализа, тогда как группа, которой вводили AAV6-pCA-HGF-X7-d4, демонстрировала средний балл по шкале оценки симптомов 2,88, показывая более высокое значение, чем значение в случае мышей с ALS (группа введения AAV6-MCS) (см. Фиг. 5).
Также подтверждали, что введение AAV6-pCA-HGF-X7-d4 приводило к значительному эффекту улучшения в коэффициенте выживаемости. В этом отношении, группа, которой вводили AAV6-MCS, жили в среднем 139 дней с момента рождения, тогда как группа, которой вводили AAV6-pCA-HGF-X7-d4, жила в среднем 147 дней, указывая на увеличение примерно на 8 дней (см. Фиг. 6).
Наконец подтвердили, что мыши с ALS (AAV6-MCS) имели заметное увеличение в потере массы вследствие потери мышечной массы, но введение AAV6-pCA-HGF-X7-d4 замедляло потерю массы. А именно, посредством относительного сравнения массы подтвердили, что мыши с ALS имели среднее изменение массы, составляющее примерно 34% с момента введения до конца анализа, но введение AAV6-pCA-HGF-X7-d4 демонстрировало среднее изменение массы, составляющее 22%, указывая на более медленную потерю массы (см. Фиг. 7).
Пример анализа 7: Эффект интратекального введения AAV-pCA-HGF-X7-d4 мышиным моделям ALS
7-1. Способы
7-1-1. Изготовление мышиных моделей ALS и доставка гена
Широко используемые модели hSOD1-G93A использовали в качестве моделей ALS. Модели получали посредством скрещивания мышей с ALS (Jackson Laboratory, США), подвергали генотипированию и затем исследовали на наличие или отсутствие Tg. Индивидов, сохраняющих предварительно установленный уровень мутантного гена, отбирали и использовали в анализе. Индивидов без Tg использовали в качестве отрицательного контроля (13 животных). Индивидов с Tg распределяли по группам Tg-AAV1-MCS и Tg-AAV1-pCA-HGF-X7-d4, содержащим 14 и 16 животных, соответственно. В возрасте 60 дней мышам один раз интратекально вводили AAV в количестве 5×109 GC/сайт.
7-1-2. Исследование коэффициента выживаемости и анализ поведенческого теста
Для подробного исследования эффективности, коэффициента выживаемости, исследовали один из наиболее важных показателей при ALS, и для исследования индивидуальной двигательной способности у индивидов, страдающих от заболевания ALS, проводили тесты «вращающийся стержень» и «висящая проволока». Кроме того, для исследования силы мышечной функции измеряли силу захвата.
Коэффициент выживаемости исследовали посредством проверки выживания или гибели индивидов каждый день. В отношении теста «вращающийся стержень», использовали способ ускорения, при котором мышь помещали на вращающийся стержень, и затем измеряли то, как долго мышь проведет на вращающемся стержне, и, в частности, скорость вращающегося стержня усиливали с течением времени.
В отношении теста «висящая проволока», мышь помещали на структуру с решетчатой структурой, и затем данную структуру переворачивали и измеряли время, которое индивид проводил, вися на данной структуре вниз головой.
В отношении теста силы захвата, передние и задние лапы мыши помещали на устройство измерения силы и затем измеряли силу мышц.
Данные выражены в виде среднее плюс/минус SEM (от англ. Standard error of the mean - стандартная ошибка среднего), и статистический анализ для каждого набора данных проводили, используя однофакторный дисперсионный анализ в каждом случае с последующим ретроспективным анализом с критерием Тьюки (*: р меньше 0,05, **: р меньше 0,01, ***: р меньше 0,001, ****: р меньше 0,0001).
7-2. Результаты
Подтвердили, что эффект лечения наблюдался при интратекальном введении AAV1-pCA-HGF-X7-d4. Сначала, в результате исследования выживаемости группа введения AAV1-pCA-HGF-X7-d4 демонстрировала значимое увеличение выживаемости, по сравнению с группой введения AAV1-MCS. Подтвердили, что мыши имели среднюю продолжительность жизни 144 дня при введении AAV1-MCS, тогда как индивиды, которым вводили AAV1-pCA-HGF-X7-d4, демонстрировали среднюю продолжительность жизни 160 дней, указывая на увеличение, составляющее примерно 16 дней.
Наблюдалось, что двигательная активность действительно повышалась. В тесте «вращающийся стержень» отрицательный контроль оставался на вращающемся стержне на протяжении в среднем 226 секунд, тогда как данный период времени значимо уменьшался до 112 секунд в группе Tg-AAV1-MCS. Однако, данный период времени улучшался в среднем до 151 секунды в случае тестируемой группы, которой вводили AAV1-pCA-HGF-X7-d4. Похожие эффекты лечения также наблюдали в тестах «висящая проволока» и силы захвата. В частности, на последней стадии прогресирования заболевания (на сутки 137 с рождения), время, проведенное в подвешенном состоянии на проволоке, составляло примерно 31 секунду в группе введения AAV1-pCA-HGF-X7-d4, что указывало на большое увеличение, по сравнению с примерно 7 секундами в группе введения AAV1-MCS. Также в результатах измерения силы захвата, группа введения AAV1-MCS демонстрировала силу приблизительно 28 г, но сила значимо увеличивалась до 66 г в группе введения pCA-HGF-X7-d4 (см. Фиг. 8).
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> HELIXMITH CO., LTD
<120> ВЕКТОР НА ОСНОВЕ АДЕНОАССОЦИИРОВАННОГО ВИРУСА (AAV), ИМЕЮЩИЙ ГИБРИДНЫЙ ГЕН HGF, ВВЕДЕННЫЙ В НЕГО
<130> PP180055
<150> KR 10-2017-0184738
<151> 2017-12-29
<160> 15
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 7377
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> pCK-HGF-X7
<400> 1
cgcgttgaca ttgattattg actagttatt aatagtaatc aattacgggg tcattagttc 60
atagcccata tatggagttc cgcgttacat aacttacggt aaatggcccg cctggctgac 120
cgcccaacga cccccgccca ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa 180
tagggacttt ccattgacgt caatgggtgg agtatttacg gtaaactgcc cacttggcag 240
tacatcaagt gtatcatatg ccaagtccgc cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc 300
ccgcctggca ttatgcccag tacatgacct tacgggactt tcctacttgg cagtacatct 360
acgtattagt catcgctatt accatggtga tgcggttttg gcagtacacc aatgggcgtg 420
gatagcggtt tgactcacgg ggatttccaa gtctccaccc cattgacgtc aatgggagtt 480
tgttttggca ccaaaatcaa cgggactttc caaaatgtcg taataacccc gccccgttga 540
cgcaaatggg cggtaggcgt gtacggtggg aggtctatat aagcagagct cgtttagtga 600
accgtcagat cgcctggaga cgccatccac gctgttttga cctccataga agacaccggg 660
accgatccag cctccgcggc cgggaacggt gcattggaac gcggattccc cgtgccaaga 720
gtgacgtaag taccgcctat agactctata ggcacacccc tttggctctt atgcatgcta 780
tactgttttt ggcttggggc ctatacaccc ccgcttcctt atgctatagg tgatggtata 840
gcttagccta taggtgtggg ttattgacca ttattgacca ctcccctatt ggtgacgata 900
ctttccatta ctaatccata acatggctct ttgccacaac tatctctatt ggctatatgc 960
caatactctg tccttcagag actgacacgg actctgtatt tttacaggat ggggtcccat 1020
ttattattta caaattcaca tatacaacaa cgccgtcccc cgtgcccgca gtttttatta 1080
aacatagcgt gggatctcca cgcgaatctc gggtacgtgt tccggacatg ggctcttctc 1140
cggtagcggc ggagcttcca catccgagcc ctggtcccat gcctccagcg gctcatggtc 1200
gctcggcagc tccttgctcc taacagtgga ggccagactt aggcacagca caatgcccac 1260
caccaccagt gtgccgcaca aggccgtggc ggtagggtat gtgtctgaaa atgagctcgg 1320
agattgggct cgcaccgctg acgcagatgg aagacttaag gcagcggcag aagaagatgc 1380
aggcagctga gttgttgtat tctgataaga gtcagaggta actcccgttg cggtgctgtt 1440
aacggtggag ggcagtgtag tctgagcagt actcgttgct gccgcgcgcg ccaccagaca 1500
taatagctga cagactaaca gactgttcct ttccatgggt cttttctgca gtcaccgtcc 1560
ttgacacgaa gcttgctagc accatgtggg tgaccaaact cctgccagcc ctgctgctgc 1620
agcatgtcct cctgcatctc ctcctgctcc ccatcgccat cccctatgca gagggacaaa 1680
ggaaaagaag aaatacaatt catgaattca aaaaatcagc aaagactacc ctaatcaaaa 1740
tagatccagc actgaagata aaaaccaaaa aagtgaatac tgcagaccaa tgtgctaata 1800
gatgtactag gaataaagga cttccattca cttgcaaggc ttttgttttt gataaagcaa 1860
gaaaacaatg cctctggttc cccttcaata gcatgtcaag tggagtgaaa aaagaatttg 1920
gccatgaatt tgacctctat gaaaacaaag actacattag aaactgcatc attggtaaag 1980
gacgcagcta caagggaaca gtatctatca ctaagagtgg catcaaatgt cagccctgga 2040
gttccatgat accacacgaa cacaggtaag aacagtatga agaaaagaga tgaagcctct 2100
gtctttttta catgttaaca gtctcatatt agtccttcag aataattcta caatcctaaa 2160
ataacttagc caacttgctg aattgtatta cggcaaggtt tatatgaatt catgactgat 2220
atttagcaaa tgattaatta atatgttaat aaaatgtagc caaaacaata tcttacctta 2280
atgcctcaat ttgtagatct cggtatttgt ggatcctggg taggaaacac atttgaatgg 2340
tatttactaa gatactaaaa tccttggact tcactctaat tttagtgcca tttagaactc 2400
aaggtctcag taaaagtaga aataaagcct gttaacaaaa cacaaactga atattaaaaa 2460
tgtaactgga ttttcaaaga aatgtttact ggtattacct gtagatgtat attctttatt 2520
atgatctttt gtgtaaagtc tggcagacaa atgcaatatc taattgttga gtccaatatc 2580
acaagcagta caaaagtata aaaaagactt ggccttttct aatgtgttaa aatactttat 2640
gctggtaata acactaagag tagggcacta gaaattttaa gtgaagataa tgtgttgcag 2700
ttactgcact caatggctta ctattataaa ccaaaactgg gatcactaag ctccagtcag 2760
tcaaaatgat caaaattatt gaagagaata agcaattctg ttctttatta ggacacagta 2820
gatacagact acaaagtgga gtgtgcttaa taagaggtag catttgttaa gtgtcaatta 2880
ctctattatc ccttggagct tctcaaaata accatataag gtgtaagatg ttaaaggtta 2940
tggttacact cagtgcacag gtaagctaat aggctgagag aagctaaatt acttactggg 3000
gtctcacagt aagaaagtga gctgaagttt cagcccagat ttaactggat tctgggctct 3060
ttattcatgt tacttcatga atctgtttct caattgtgca gaaaaaaggg ggctatttat 3120
aagaaaagca ataaacaaac aagtaatgat ctcaaataag taatgcaaga aatagtgaga 3180
tttcaaaatc agtggcagcg atttctcagt tctgtcctaa gtggccttgc tcaatcacct 3240
gctatctttt agtggagctt tgaaattatg tttcagacaa cttcgattca gttctagaat 3300
gtttgactca gcaaattcac aggctcatct ttctaacttg atggtgaata tggaaattca 3360
gctaaatgga tgttaataaa attcaaacgt tttaaggaca gatggaaatg acagaatttt 3420
aaggtaaaat atatgaagga atataagata aaggattttt ctaccttcag caaaaacata 3480
cccactaatt agtaaaatta ataggcgaaa aaaagttgca tgctcttata ctgtaatgat 3540
tatcatttta aaactagctt tttgccttcg agctatcggg gtaaagacct acaggaaaac 3600
tactgtcgaa atcctcgagg ggaagaaggg ggaccctggt gtttcacaag caatccagag 3660
gtacgctacg aagtctgtga cattcctcag tgttcagaag ttgaatgcat gacctgcaat 3720
ggggagagtt atcgaggtct catggatcat acagaatcag gcaagatttg tcagcgctgg 3780
gatcatcaga caccacaccg gcacaaattc ttgcctgaaa gatatcccga caagggcttt 3840
gatgataatt attgccgcaa tcccgatggc cagccgaggc catggtgcta tactcttgac 3900
cctcacaccc gctgggagta ctgtgcaatt aaaacatgcg ctgacaatac tatgaatgac 3960
actgatgttc ctttggaaac aactgaatgc atccaaggtc aaggagaagg ctacaggggc 4020
actgtcaata ccatttggaa tggaattcca tgtcagcgtt gggattctca gtatcctcac 4080
gagcatgaca tgactcctga aaatttcaag tgcaaggacc tacgagaaaa ttactgccga 4140
aatccagatg ggtctgaatc accctggtgt tttaccactg atccaaacat ccgagttggc 4200
tactgctccc aaattccaaa ctgtgatatg tcacatggac aagattgtta tcgtgggaat 4260
ggcaaaaatt atatgggcaa cttatcccaa acaagatctg gactaacatg ttcaatgtgg 4320
gacaagaaca tggaagactt acatcgtcat atcttctggg aaccagatgc aagtaagctg 4380
aatgagaatt actgccgaaa tccagatgat gatgctcatg gaccctggtg ctacacggga 4440
aatccactca ttccttggga ttattgccct atttctcgtt gtgaaggtga taccacacct 4500
acaatagtca atttagacca tcccgtaata tcttgtgcca aaacgaaaca attgcgagtt 4560
gtaaatggga ttccaacacg aacaaacata ggatggatgg ttagtttgag atacagaaat 4620
aaacatatct gcggaggatc attgataaag gagagttggg ttcttactgc acgacagtgt 4680
ttcccttctc gagacttgaa agattatgaa gcttggcttg gaattcatga tgtccacgga 4740
agaggagatg agaaatgcaa acaggttctc aatgtttccc agctggtata tggccctgaa 4800
ggatcagatc tggttttaat gaagcttgcc aggcctgctg tcctggatga ttttgttagt 4860
acgattgatt tacctaatta tggatgcaca attcctgaaa agaccagttg cagtgtttat 4920
ggctggggct acactggatt gatcaactat gatggcctat tacgagtggc acatctctat 4980
ataatgggaa atgagaaatg cagccagcat catcgaggga aggtgactct gaatgagtct 5040
gaaatatgtg ctggggctga aaagattgga tcaggaccat gtgaggggga ttatggtggc 5100
ccacttgttt gtgagcaaca taaaatgaga atggttcttg gtgtcattgt tcctggtcgt 5160
ggatgtgcca ttccaaatcg tcctggtatt tttgtccgag tagcatatta tgcaaaatgg 5220
atacacaaaa ttattttaac atataaggta ccacagtcat agcggccgct ctagagggcc 5280
cgtttaaacc cgctgatcag cctcgactgt gccttctagt tgccagccat ctgttgtttg 5340
cccctccccc gtgccttcct tgaccctgga aggtgccact cccactgtcc tttcctaata 5400
aaatgaggaa attgcatcgc attgtctgag taggtgtcat tctattctgg ggggtggggt 5460
ggggcaggac agcaaggggg aggattggga agacaatagc aggcatgctg gggagtcgaa 5520
attcagaaga actcgtcaag aaggcgatag aaggcgatgc gctgcgaatc gggagcggcg 5580
ataccgtaaa gcacgaggaa gcggtcagcc cattcgccgc caagctcttc agcaatatca 5640
cgggtagcca acgctatgtc ctgatagcgg tccgccacac ccagccggcc acagtcgatg 5700
aatccagaaa agcggccatt ttccaccatg atattcggca agcaggcatc gccatgggtc 5760
acgacgagat cctcgccgtc gggcatgctc gccttgagcc tggcgaacag ttcggctggc 5820
gcgagcccct gatgctcttc gtccagatca tcctgatcga caagaccggc ttccatccga 5880
gtacgtgctc gctcgatgcg atgtttcgct tggtggtcga atgggcaggt agccggatca 5940
agcgtatgca gccgccgcat tgcatcagcc atgatggata ctttctcggc aggagcaagg 6000
tgagatgaca ggagatcctg ccccggcact tcgcccaata gcagccagtc ccttcccgct 6060
tcagtgacaa cgtcgagcac agctgcgcaa ggaacgcccg tcgtggccag ccacgatagc 6120
cgcgctgcct cgtcttgcag ttcattcagg gcaccggaca ggtcggtctt gacaaaaaga 6180
accgggcgcc cctgcgctga cagccggaac acggcggcat cagagcagcc gattgtctgt 6240
tgtgcccagt catagccgaa tagcctctcc acccaagcgg ccggagaacc tgcgtgcaat 6300
ccatcttgtt caatcatgcg aaacgatcct catcctgtct cttgatcaga tcttgatccc 6360
ctgcgccatc agatccttgg cggcaagaaa gccatccagt ttactttgca gggcttccca 6420
accttaccag agggcgcccc agctggcaat tccggttcgc ttgctgtcca taaaaccgcc 6480
cagtctagct atcgccatgt aagcccactg caagctacct gctttctctt tgcgcttgcg 6540
ttttcccttg tccagatagc ccagtagctg acattcatcc ggggtcagca ccgtttctgc 6600
ggactggctt tctacgtgaa aaggatctag gtgaagatcc tttttgataa tctcatgacc 6660
aaaatccctt aacgtgagtt ttcgttccac tgagcgtcag accccgtaga aaagatcaaa 6720
ggatcttctt gagatccttt ttttctgcgc gtaatctgct gcttgcaaac aaaaaaacca 6780
ccgctaccag cggtggtttg tttgccggat caagagctac caactctttt tccgaaggta 6840
actggcttca gcagagcgca gataccaaat actgttcttc tagtgtagcc gtagttaggc 6900
caccacttca agaactctgt agcaccgcct acatacctcg ctctgctaat cctgttacca 6960
gtggctgctg ccagtggcga taagtcgtgt cttaccgggt tggactcaag acgatagtta 7020
ccggataagg cgcagcggtc gggctgaacg gggggttcgt gcacacagcc cagcttggag 7080
cgaacgacct acaccgaact gagataccta cagcgtgagc tatgagaaag cgccacgctt 7140
cccgaaggga gaaaggcgga caggtatccg gtaagcggca gggtcggaac aggagagcgc 7200
acgagggagc ttccaggggg aaacgcctgg tatctttata gtcctgtcgg gtttcgccac 7260
ctctgacttg agcgtcgatt tttgtgatgc tcgtcagggg ggcggagcct atggaaaaac 7320
gccagcaacg cggccttttt acggttcctg gccttttgct ggccttttgc tcacatg 7377
<210> 2
<211> 3479
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> HGF-X7-d1
<400> 2
atgtgggtga ccaaactcct gccagccctg ctgctgcagc atgtcctcct gcatctcctc 60
ctgctcccca tcgccatccc ctatgcagag ggacaaagga aaagaagaaa tacaattcat 120
gaattcaaaa aatcagcaaa gactacccta atcaaaatag atccagcact gaagataaaa 180
accaaaaaag tgaatactgc agaccaatgt gctaatagat gtactaggaa taaaggactt 240
ccattcactt gcaaggcttt tgtttttgat aaagcaagaa aacaatgcct ctggttcccc 300
ttcaatagca tgtcaagtgg agtgaaaaaa gaatttggcc atgaatttga cctctatgaa 360
aacaaagact acattagaaa ctgcatcatt ggtaaaggac gcagctacaa gggaacagta 420
tctatcacta agagtggcat caaatgtcag ccctggagtt ccatgatacc acacgaacac 480
aggtaagaac agtatgaaga aaagagatga agcctctgtc ttttttacat gttaacagtc 540
tcatattagt ccttcagaat aattctacaa tcctaaaata acttagccaa cttgctgaat 600
tgtattacgg caaggtttat atgaattcat gactgatatt tagcaaatga ttaattaata 660
tgttaataaa atgtagccaa aacaatatct taccttaatg cctcaatttg tagatctcgg 720
tatttgtgga tcctattatg atcttttgtg taaagtctgg cagacaaatg caatatctaa 780
ttgttgagtc caatatcaca agcagtacaa aagtataaaa aagacttggc cttttctaat 840
gtgttaaaat actttatgct ggtaataaca ctaagagtag ggcactagaa attttaagtg 900
aagataatgt gttgcagtta ctgcactcaa tggcttacta ttataaacca aaactgggat 960
cactaagctc cagtcagtca aaatgatcaa aattattgaa gagaataagc aattctgttc 1020
tttattagga cacagtagat acagactaca aagtggagtg tgcttaataa gaggtagcat 1080
ttgttaagtg tcaattactc tattatccct tggagcttct caaaataacc atataaggtg 1140
taagatgtta aaggttatgg ttacactcag tgcacaggta agctaatagg ctgagagaag 1200
ctaaattact tactggggtc tcacagtaag aaagtgagct gaagtttcag cccagattta 1260
actggattct gggctcttta ttcatgttac ttcatgaatc tgtttctcaa ttgtgcagaa 1320
aaaagggggc tatttataag aaaagcaata aacaaacaag taatgatctc aaataagtaa 1380
tgcaagaaat agtgagattt caaaatcagt ggcagcgatt tctcagttct gtcctaagtg 1440
gccttgctca atcacctgct atcttttagt ggagctttga aattatgttt cagacaactt 1500
cgattcagtt ctagaatgtt tgactcagca aattcacagg ctcatctttc taacttgatg 1560
gtgaatatgg aaattcagct aaatggatgt taataaaatt caaacgtttt aaggacagat 1620
ggaaatgaca gaattttaag gtaaaatata tgaaggaata taagataaag gatttttcta 1680
ccttcagcaa aaacataccc actaattagt aaaattaata ggcgaaaaaa agttgcatgc 1740
tcttatactg taatgattat cattttaaaa ctagcttttt gccttcgagc tatcggggta 1800
aagacctaca ggaaaactac tgtcgaaatc ctcgagggga agaaggggga ccctggtgtt 1860
tcacaagcaa tccagaggta cgctacgaag tctgtgacat tcctcagtgt tcagaagttg 1920
aatgcatgac ctgcaatggg gagagttatc gaggtctcat ggatcataca gaatcaggca 1980
agatttgtca gcgctgggat catcagacac cacaccggca caaattcttg cctgaaagat 2040
atcccgacaa gggctttgat gataattatt gccgcaatcc cgatggccag ccgaggccat 2100
ggtgctatac tcttgaccct cacacccgct gggagtactg tgcaattaaa acatgcgctg 2160
acaatactat gaatgacact gatgttcctt tggaaacaac tgaatgcatc caaggtcaag 2220
gagaaggcta caggggcact gtcaatacca tttggaatgg aattccatgt cagcgttggg 2280
attctcagta tcctcacgag catgacatga ctcctgaaaa tttcaagtgc aaggacctac 2340
gagaaaatta ctgccgaaat ccagatgggt ctgaatcacc ctggtgtttt accactgatc 2400
caaacatccg agttggctac tgctcccaaa ttccaaactg tgatatgtca catggacaag 2460
attgttatcg tgggaatggc aaaaattata tgggcaactt atcccaaaca agatctggac 2520
taacatgttc aatgtgggac aagaacatgg aagacttaca tcgtcatatc ttctgggaac 2580
cagatgcaag taagctgaat gagaattact gccgaaatcc agatgatgat gctcatggac 2640
cctggtgcta cacgggaaat ccactcattc cttgggatta ttgccctatt tctcgttgtg 2700
aaggtgatac cacacctaca atagtcaatt tagaccatcc cgtaatatct tgtgccaaaa 2760
cgaaacaatt gcgagttgta aatgggattc caacacgaac aaacatagga tggatggtta 2820
gtttgagata cagaaataaa catatctgcg gaggatcatt gataaaggag agttgggttc 2880
ttactgcacg acagtgtttc ccttctcgag acttgaaaga ttatgaagct tggcttggaa 2940
ttcatgatgt ccacggaaga ggagatgaga aatgcaaaca ggttctcaat gtttcccagc 3000
tggtatatgg ccctgaagga tcagatctgg ttttaatgaa gcttgccagg cctgctgtcc 3060
tggatgattt tgttagtacg attgatttac ctaattatgg atgcacaatt cctgaaaaga 3120
ccagttgcag tgtttatggc tggggctaca ctggattgat caactatgat ggcctattac 3180
gagtggcaca tctctatata atgggaaatg agaaatgcag ccagcatcat cgagggaagg 3240
tgactctgaa tgagtctgaa atatgtgctg gggctgaaaa gattggatca ggaccatgtg 3300
agggggatta tggtggccca cttgtttgtg agcaacataa aatgagaatg gttcttggtg 3360
tcattgttcc tggtcgtgga tgtgccattc caaatcgtcc tggtattttt gtccgagtag 3420
catattatgc aaaatggata cacaaaatta ttttaacata taaggtacca cagtcatag 3479
<210> 3
<211> 3279
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> HGF-X7-d2
<400> 3
atgtgggtga ccaaactcct gccagccctg ctgctgcagc atgtcctcct gcatctcctc 60
ctgctcccca tcgccatccc ctatgcagag ggacaaagga aaagaagaaa tacaattcat 120
gaattcaaaa aatcagcaaa gactacccta atcaaaatag atccagcact gaagataaaa 180
accaaaaaag tgaatactgc agaccaatgt gctaatagat gtactaggaa taaaggactt 240
ccattcactt gcaaggcttt tgtttttgat aaagcaagaa aacaatgcct ctggttcccc 300
ttcaatagca tgtcaagtgg agtgaaaaaa gaatttggcc atgaatttga cctctatgaa 360
aacaaagact acattagaaa ctgcatcatt ggtaaaggac gcagctacaa gggaacagta 420
tctatcacta agagtggcat caaatgtcag ccctggagtt ccatgatacc acacgaacac 480
aggtaagaac agtatgaaga aaagagatga agcctctgtc ttttttacat gttaacagtc 540
tcatattagt ccttcagaat aattctacaa tcctaaaata acttagccaa cttgctgaat 600
tgtattacgg caaggtttat atgaattcat gactgatatt tagcaaatga ttaattaata 660
tgttaataaa atgtagccaa aacaatatct taccttaatg cctcaatttg tagatctcgg 720
tatttgtgga tcctttacta ttataaacca aaactgggat cactaagctc cagtcagtca 780
aaatgatcaa aattattgaa gagaataagc aattctgttc tttattagga cacagtagat 840
acagactaca aagtggagtg tgcttaataa gaggtagcat ttgttaagtg tcaattactc 900
tattatccct tggagcttct caaaataacc atataaggtg taagatgtta aaggttatgg 960
ttacactcag tgcacaggta agctaatagg ctgagagaag ctaaattact tactggggtc 1020
tcacagtaag aaagtgagct gaagtttcag cccagattta actggattct gggctcttta 1080
ttcatgttac ttcatgaatc tgtttctcaa ttgtgcagaa aaaagggggc tatttataag 1140
aaaagcaata aacaaacaag taatgatctc aaataagtaa tgcaagaaat agtgagattt 1200
caaaatcagt ggcagcgatt tctcagttct gtcctaagtg gccttgctca atcacctgct 1260
atcttttagt ggagctttga aattatgttt cagacaactt cgattcagtt ctagaatgtt 1320
tgactcagca aattcacagg ctcatctttc taacttgatg gtgaatatgg aaattcagct 1380
aaatggatgt taataaaatt caaacgtttt aaggacagat ggaaatgaca gaattttaag 1440
gtaaaatata tgaaggaata taagataaag gatttttcta ccttcagcaa aaacataccc 1500
actaattagt aaaattaata ggcgaaaaaa agttgcatgc tcttatactg taatgattat 1560
cattttaaaa ctagcttttt gccttcgagc tatcggggta aagacctaca ggaaaactac 1620
tgtcgaaatc ctcgagggga agaaggggga ccctggtgtt tcacaagcaa tccagaggta 1680
cgctacgaag tctgtgacat tcctcagtgt tcagaagttg aatgcatgac ctgcaatggg 1740
gagagttatc gaggtctcat ggatcataca gaatcaggca agatttgtca gcgctgggat 1800
catcagacac cacaccggca caaattcttg cctgaaagat atcccgacaa gggctttgat 1860
gataattatt gccgcaatcc cgatggccag ccgaggccat ggtgctatac tcttgaccct 1920
cacacccgct gggagtactg tgcaattaaa acatgcgctg acaatactat gaatgacact 1980
gatgttcctt tggaaacaac tgaatgcatc caaggtcaag gagaaggcta caggggcact 2040
gtcaatacca tttggaatgg aattccatgt cagcgttggg attctcagta tcctcacgag 2100
catgacatga ctcctgaaaa tttcaagtgc aaggacctac gagaaaatta ctgccgaaat 2160
ccagatgggt ctgaatcacc ctggtgtttt accactgatc caaacatccg agttggctac 2220
tgctcccaaa ttccaaactg tgatatgtca catggacaag attgttatcg tgggaatggc 2280
aaaaattata tgggcaactt atcccaaaca agatctggac taacatgttc aatgtgggac 2340
aagaacatgg aagacttaca tcgtcatatc ttctgggaac cagatgcaag taagctgaat 2400
gagaattact gccgaaatcc agatgatgat gctcatggac cctggtgcta cacgggaaat 2460
ccactcattc cttgggatta ttgccctatt tctcgttgtg aaggtgatac cacacctaca 2520
atagtcaatt tagaccatcc cgtaatatct tgtgccaaaa cgaaacaatt gcgagttgta 2580
aatgggattc caacacgaac aaacatagga tggatggtta gtttgagata cagaaataaa 2640
catatctgcg gaggatcatt gataaaggag agttgggttc ttactgcacg acagtgtttc 2700
ccttctcgag acttgaaaga ttatgaagct tggcttggaa ttcatgatgt ccacggaaga 2760
ggagatgaga aatgcaaaca ggttctcaat gtttcccagc tggtatatgg ccctgaagga 2820
tcagatctgg ttttaatgaa gcttgccagg cctgctgtcc tggatgattt tgttagtacg 2880
attgatttac ctaattatgg atgcacaatt cctgaaaaga ccagttgcag tgtttatggc 2940
tggggctaca ctggattgat caactatgat ggcctattac gagtggcaca tctctatata 3000
atgggaaatg agaaatgcag ccagcatcat cgagggaagg tgactctgaa tgagtctgaa 3060
atatgtgctg gggctgaaaa gattggatca ggaccatgtg agggggatta tggtggccca 3120
cttgtttgtg agcaacataa aatgagaatg gttcttggtg tcattgttcc tggtcgtgga 3180
tgtgccattc caaatcgtcc tggtattttt gtccgagtag catattatgc aaaatggata 3240
cacaaaatta ttttaacata taaggtacca cagtcatag 3279
<210> 4
<211> 3079
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> HGF-X7-d3
<400> 4
atgtgggtga ccaaactcct gccagccctg ctgctgcagc atgtcctcct gcatctcctc 60
ctgctcccca tcgccatccc ctatgcagag ggacaaagga aaagaagaaa tacaattcat 120
gaattcaaaa aatcagcaaa gactacccta atcaaaatag atccagcact gaagataaaa 180
accaaaaaag tgaatactgc agaccaatgt gctaatagat gtactaggaa taaaggactt 240
ccattcactt gcaaggcttt tgtttttgat aaagcaagaa aacaatgcct ctggttcccc 300
ttcaatagca tgtcaagtgg agtgaaaaaa gaatttggcc atgaatttga cctctatgaa 360
aacaaagact acattagaaa ctgcatcatt ggtaaaggac gcagctacaa gggaacagta 420
tctatcacta agagtggcat caaatgtcag ccctggagtt ccatgatacc acacgaacac 480
aggtaagaac agtatgaaga aaagagatga agcctctgtc ttttttacat gttaacagtc 540
tcatattagt ccttcagaat aattctacaa tcctaaaata acttagccaa cttgctgaat 600
tgtattacgg caaggtttat atgaattcat gactgatatt tagcaaatga ttaattaata 660
tgttaataaa atgtagccaa aacaatatct taccttaatg cctcaatttg tagatctcgg 720
tatttgtgga tcctaaggtg taagatgtta aaggttatgg ttacactcag tgcacaggta 780
agctaatagg ctgagagaag ctaaattact tactggggtc tcacagtaag aaagtgagct 840
gaagtttcag cccagattta actggattct gggctcttta ttcatgttac ttcatgaatc 900
tgtttctcaa ttgtgcagaa aaaagggggc tatttataag aaaagcaata aacaaacaag 960
taatgatctc aaataagtaa tgcaagaaat agtgagattt caaaatcagt ggcagcgatt 1020
tctcagttct gtcctaagtg gccttgctca atcacctgct atcttttagt ggagctttga 1080
aattatgttt cagacaactt cgattcagtt ctagaatgtt tgactcagca aattcacagg 1140
ctcatctttc taacttgatg gtgaatatgg aaattcagct aaatggatgt taataaaatt 1200
caaacgtttt aaggacagat ggaaatgaca gaattttaag gtaaaatata tgaaggaata 1260
taagataaag gatttttcta ccttcagcaa aaacataccc actaattagt aaaattaata 1320
ggcgaaaaaa agttgcatgc tcttatactg taatgattat cattttaaaa ctagcttttt 1380
gccttcgagc tatcggggta aagacctaca ggaaaactac tgtcgaaatc ctcgagggga 1440
agaaggggga ccctggtgtt tcacaagcaa tccagaggta cgctacgaag tctgtgacat 1500
tcctcagtgt tcagaagttg aatgcatgac ctgcaatggg gagagttatc gaggtctcat 1560
ggatcataca gaatcaggca agatttgtca gcgctgggat catcagacac cacaccggca 1620
caaattcttg cctgaaagat atcccgacaa gggctttgat gataattatt gccgcaatcc 1680
cgatggccag ccgaggccat ggtgctatac tcttgaccct cacacccgct gggagtactg 1740
tgcaattaaa acatgcgctg acaatactat gaatgacact gatgttcctt tggaaacaac 1800
tgaatgcatc caaggtcaag gagaaggcta caggggcact gtcaatacca tttggaatgg 1860
aattccatgt cagcgttggg attctcagta tcctcacgag catgacatga ctcctgaaaa 1920
tttcaagtgc aaggacctac gagaaaatta ctgccgaaat ccagatgggt ctgaatcacc 1980
ctggtgtttt accactgatc caaacatccg agttggctac tgctcccaaa ttccaaactg 2040
tgatatgtca catggacaag attgttatcg tgggaatggc aaaaattata tgggcaactt 2100
atcccaaaca agatctggac taacatgttc aatgtgggac aagaacatgg aagacttaca 2160
tcgtcatatc ttctgggaac cagatgcaag taagctgaat gagaattact gccgaaatcc 2220
agatgatgat gctcatggac cctggtgcta cacgggaaat ccactcattc cttgggatta 2280
ttgccctatt tctcgttgtg aaggtgatac cacacctaca atagtcaatt tagaccatcc 2340
cgtaatatct tgtgccaaaa cgaaacaatt gcgagttgta aatgggattc caacacgaac 2400
aaacatagga tggatggtta gtttgagata cagaaataaa catatctgcg gaggatcatt 2460
gataaaggag agttgggttc ttactgcacg acagtgtttc ccttctcgag acttgaaaga 2520
ttatgaagct tggcttggaa ttcatgatgt ccacggaaga ggagatgaga aatgcaaaca 2580
ggttctcaat gtttcccagc tggtatatgg ccctgaagga tcagatctgg ttttaatgaa 2640
gcttgccagg cctgctgtcc tggatgattt tgttagtacg attgatttac ctaattatgg 2700
atgcacaatt cctgaaaaga ccagttgcag tgtttatggc tggggctaca ctggattgat 2760
caactatgat ggcctattac gagtggcaca tctctatata atgggaaatg agaaatgcag 2820
ccagcatcat cgagggaagg tgactctgaa tgagtctgaa atatgtgctg gggctgaaaa 2880
gattggatca ggaccatgtg agggggatta tggtggccca cttgtttgtg agcaacataa 2940
aatgagaatg gttcttggtg tcattgttcc tggtcgtgga tgtgccattc caaatcgtcc 3000
tggtattttt gtccgagtag catattatgc aaaatggata cacaaaatta ttttaacata 3060
taaggtacca cagtcatag 3079
<210> 5
<211> 2879
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> HGF-X7-d4
<400> 5
atgtgggtga ccaaactcct gccagccctg ctgctgcagc atgtcctcct gcatctcctc 60
ctgctcccca tcgccatccc ctatgcagag ggacaaagga aaagaagaaa tacaattcat 120
gaattcaaaa aatcagcaaa gactacccta atcaaaatag atccagcact gaagataaaa 180
accaaaaaag tgaatactgc agaccaatgt gctaatagat gtactaggaa taaaggactt 240
ccattcactt gcaaggcttt tgtttttgat aaagcaagaa aacaatgcct ctggttcccc 300
ttcaatagca tgtcaagtgg agtgaaaaaa gaatttggcc atgaatttga cctctatgaa 360
aacaaagact acattagaaa ctgcatcatt ggtaaaggac gcagctacaa gggaacagta 420
tctatcacta agagtggcat caaatgtcag ccctggagtt ccatgatacc acacgaacac 480
aggtaagaac agtatgaaga aaagagatga agcctctgtc ttttttacat gttaacagtc 540
tcatattagt ccttcagaat aattctacaa tcctaaaata acttagccaa cttgctgaat 600
tgtattacgg caaggtttat atgaattcat gactgatatt tagcaaatga ttaattaata 660
tgttaataaa atgtagccaa aacaatatct taccttaatg cctcaatttg tagatctcgg 720
tatttgtgga tccttataag aaaagcaata aacaaacaag taatgatctc aaataagtaa 780
tgcaagaaat agtgagattt caaaatcagt ggcagcgatt tctcagttct gtcctaagtg 840
gccttgctca atcacctgct atcttttagt ggagctttga aattatgttt cagacaactt 900
cgattcagtt ctagaatgtt tgactcagca aattcacagg ctcatctttc taacttgatg 960
gtgaatatgg aaattcagct aaatggatgt taataaaatt caaacgtttt aaggacagat 1020
ggaaatgaca gaattttaag gtaaaatata tgaaggaata taagataaag gatttttcta 1080
ccttcagcaa aaacataccc actaattagt aaaattaata ggcgaaaaaa agttgcatgc 1140
tcttatactg taatgattat cattttaaaa ctagcttttt gccttcgagc tatcggggta 1200
aagacctaca ggaaaactac tgtcgaaatc ctcgagggga agaaggggga ccctggtgtt 1260
tcacaagcaa tccagaggta cgctacgaag tctgtgacat tcctcagtgt tcagaagttg 1320
aatgcatgac ctgcaatggg gagagttatc gaggtctcat ggatcataca gaatcaggca 1380
agatttgtca gcgctgggat catcagacac cacaccggca caaattcttg cctgaaagat 1440
atcccgacaa gggctttgat gataattatt gccgcaatcc cgatggccag ccgaggccat 1500
ggtgctatac tcttgaccct cacacccgct gggagtactg tgcaattaaa acatgcgctg 1560
acaatactat gaatgacact gatgttcctt tggaaacaac tgaatgcatc caaggtcaag 1620
gagaaggcta caggggcact gtcaatacca tttggaatgg aattccatgt cagcgttggg 1680
attctcagta tcctcacgag catgacatga ctcctgaaaa tttcaagtgc aaggacctac 1740
gagaaaatta ctgccgaaat ccagatgggt ctgaatcacc ctggtgtttt accactgatc 1800
caaacatccg agttggctac tgctcccaaa ttccaaactg tgatatgtca catggacaag 1860
attgttatcg tgggaatggc aaaaattata tgggcaactt atcccaaaca agatctggac 1920
taacatgttc aatgtgggac aagaacatgg aagacttaca tcgtcatatc ttctgggaac 1980
cagatgcaag taagctgaat gagaattact gccgaaatcc agatgatgat gctcatggac 2040
cctggtgcta cacgggaaat ccactcattc cttgggatta ttgccctatt tctcgttgtg 2100
aaggtgatac cacacctaca atagtcaatt tagaccatcc cgtaatatct tgtgccaaaa 2160
cgaaacaatt gcgagttgta aatgggattc caacacgaac aaacatagga tggatggtta 2220
gtttgagata cagaaataaa catatctgcg gaggatcatt gataaaggag agttgggttc 2280
ttactgcacg acagtgtttc ccttctcgag acttgaaaga ttatgaagct tggcttggaa 2340
ttcatgatgt ccacggaaga ggagatgaga aatgcaaaca ggttctcaat gtttcccagc 2400
tggtatatgg ccctgaagga tcagatctgg ttttaatgaa gcttgccagg cctgctgtcc 2460
tggatgattt tgttagtacg attgatttac ctaattatgg atgcacaatt cctgaaaaga 2520
ccagttgcag tgtttatggc tggggctaca ctggattgat caactatgat ggcctattac 2580
gagtggcaca tctctatata atgggaaatg agaaatgcag ccagcatcat cgagggaagg 2640
tgactctgaa tgagtctgaa atatgtgctg gggctgaaaa gattggatca ggaccatgtg 2700
agggggatta tggtggccca cttgtttgtg agcaacataa aatgagaatg gttcttggtg 2760
tcattgttcc tggtcgtgga tgtgccattc caaatcgtcc tggtattttt gtccgagtag 2820
catattatgc aaaatggata cacaaaatta ttttaacata taaggtacca cagtcatag 2879
<210> 6
<211> 3679
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> HGF-X7
<400> 6
atgtgggtga ccaaactcct gccagccctg ctgctgcagc atgtcctcct gcatctcctc 60
ctgctcccca tcgccatccc ctatgcagag ggacaaagga aaagaagaaa tacaattcat 120
gaattcaaaa aatcagcaaa gactacccta atcaaaatag atccagcact gaagataaaa 180
accaaaaaag tgaatactgc agaccaatgt gctaatagat gtactaggaa taaaggactt 240
ccattcactt gcaaggcttt tgtttttgat aaagcaagaa aacaatgcct ctggttcccc 300
ttcaatagca tgtcaagtgg agtgaaaaaa gaatttggcc atgaatttga cctctatgaa 360
aacaaagact acattagaaa ctgcatcatt ggtaaaggac gcagctacaa gggaacagta 420
tctatcacta agagtggcat caaatgtcag ccctggagtt ccatgatacc acacgaacac 480
aggtaagaac agtatgaaga aaagagatga agcctctgtc ttttttacat gttaacagtc 540
tcatattagt ccttcagaat aattctacaa tcctaaaata acttagccaa cttgctgaat 600
tgtattacgg caaggtttat atgaattcat gactgatatt tagcaaatga ttaattaata 660
tgttaataaa atgtagccaa aacaatatct taccttaatg cctcaatttg tagatctcgg 720
tatttgtgga tcctgggtag gaaacacatt tgaatggtat ttactaagat actaaaatcc 780
ttggacttca ctctaatttt agtgccattt agaactcaag gtctcagtaa aagtagaaat 840
aaagcctgtt aacaaaacac aaactgaata ttaaaaatgt aactggattt tcaaagaaat 900
gtttactggt attacctgta gatgtatatt ctttattatg atcttttgtg taaagtctgg 960
cagacaaatg caatatctaa ttgttgagtc caatatcaca agcagtacaa aagtataaaa 1020
aagacttggc cttttctaat gtgttaaaat actttatgct ggtaataaca ctaagagtag 1080
ggcactagaa attttaagtg aagataatgt gttgcagtta ctgcactcaa tggcttacta 1140
ttataaacca aaactgggat cactaagctc cagtcagtca aaatgatcaa aattattgaa 1200
gagaataagc aattctgttc tttattagga cacagtagat acagactaca aagtggagtg 1260
tgcttaataa gaggtagcat ttgttaagtg tcaattactc tattatccct tggagcttct 1320
caaaataacc atataaggtg taagatgtta aaggttatgg ttacactcag tgcacaggta 1380
agctaatagg ctgagagaag ctaaattact tactggggtc tcacagtaag aaagtgagct 1440
gaagtttcag cccagattta actggattct gggctcttta ttcatgttac ttcatgaatc 1500
tgtttctcaa ttgtgcagaa aaaagggggc tatttataag aaaagcaata aacaaacaag 1560
taatgatctc aaataagtaa tgcaagaaat agtgagattt caaaatcagt ggcagcgatt 1620
tctcagttct gtcctaagtg gccttgctca atcacctgct atcttttagt ggagctttga 1680
aattatgttt cagacaactt cgattcagtt ctagaatgtt tgactcagca aattcacagg 1740
ctcatctttc taacttgatg gtgaatatgg aaattcagct aaatggatgt taataaaatt 1800
caaacgtttt aaggacagat ggaaatgaca gaattttaag gtaaaatata tgaaggaata 1860
taagataaag gatttttcta ccttcagcaa aaacataccc actaattagt aaaattaata 1920
ggcgaaaaaa agttgcatgc tcttatactg taatgattat cattttaaaa ctagcttttt 1980
gccttcgagc tatcggggta aagacctaca ggaaaactac tgtcgaaatc ctcgagggga 2040
agaaggggga ccctggtgtt tcacaagcaa tccagaggta cgctacgaag tctgtgacat 2100
tcctcagtgt tcagaagttg aatgcatgac ctgcaatggg gagagttatc gaggtctcat 2160
ggatcataca gaatcaggca agatttgtca gcgctgggat catcagacac cacaccggca 2220
caaattcttg cctgaaagat atcccgacaa gggctttgat gataattatt gccgcaatcc 2280
cgatggccag ccgaggccat ggtgctatac tcttgaccct cacacccgct gggagtactg 2340
tgcaattaaa acatgcgctg acaatactat gaatgacact gatgttcctt tggaaacaac 2400
tgaatgcatc caaggtcaag gagaaggcta caggggcact gtcaatacca tttggaatgg 2460
aattccatgt cagcgttggg attctcagta tcctcacgag catgacatga ctcctgaaaa 2520
tttcaagtgc aaggacctac gagaaaatta ctgccgaaat ccagatgggt ctgaatcacc 2580
ctggtgtttt accactgatc caaacatccg agttggctac tgctcccaaa ttccaaactg 2640
tgatatgtca catggacaag attgttatcg tgggaatggc aaaaattata tgggcaactt 2700
atcccaaaca agatctggac taacatgttc aatgtgggac aagaacatgg aagacttaca 2760
tcgtcatatc ttctgggaac cagatgcaag taagctgaat gagaattact gccgaaatcc 2820
agatgatgat gctcatggac cctggtgcta cacgggaaat ccactcattc cttgggatta 2880
ttgccctatt tctcgttgtg aaggtgatac cacacctaca atagtcaatt tagaccatcc 2940
cgtaatatct tgtgccaaaa cgaaacaatt gcgagttgta aatgggattc caacacgaac 3000
aaacatagga tggatggtta gtttgagata cagaaataaa catatctgcg gaggatcatt 3060
gataaaggag agttgggttc ttactgcacg acagtgtttc ccttctcgag acttgaaaga 3120
ttatgaagct tggcttggaa ttcatgatgt ccacggaaga ggagatgaga aatgcaaaca 3180
ggttctcaat gtttcccagc tggtatatgg ccctgaagga tcagatctgg ttttaatgaa 3240
gcttgccagg cctgctgtcc tggatgattt tgttagtacg attgatttac ctaattatgg 3300
atgcacaatt cctgaaaaga ccagttgcag tgtttatggc tggggctaca ctggattgat 3360
caactatgat ggcctattac gagtggcaca tctctatata atgggaaatg agaaatgcag 3420
ccagcatcat cgagggaagg tgactctgaa tgagtctgaa atatgtgctg gggctgaaaa 3480
gattggatca ggaccatgtg agggggatta tggtggccca cttgtttgtg agcaacataa 3540
aatgagaatg gttcttggtg tcattgttcc tggtcgtgga tgtgccattc caaatcgtcc 3600
tggtattttt gtccgagtag catattatgc aaaatggata cacaaaatta ttttaacata 3660
taaggtacca cagtcatag 3679
<210> 7
<211> 2730
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> HGF-X8
<400> 7
atgtgggtga ccaaactcct gccagccctg ctgctgcagc atgtcctcct gcatctcctc 60
ctgctcccca tcgccatccc ctatgcagag ggacaaagga aaagaagaaa tacaattcat 120
gaattcaaaa aatcagcaaa gactacccta atcaaaatag atccagcact gaagataaaa 180
accaaaaaag tgaatactgc agaccaatgt gctaatagat gtactaggaa taaaggactt 240
ccattcactt gcaaggcttt tgtttttgat aaagcaagaa aacaatgcct ctggttcccc 300
ttcaatagca tgtcaagtgg agtgaaaaaa gaatttggcc atgaatttga cctctatgaa 360
aacaaagact acattagaaa ctgcatcatt ggtaaaggac gcagctacaa gggaacagta 420
tctatcacta agagtggcat caaatgtcag ccctggagtt ccatgatacc acacgaacac 480
aggtaagaac agtatgaaga aaagagatga agcctctgtc ttttttacat gttaacagtc 540
tcatattagt ccttcagaat aattctacaa tcctaaaata acttagccaa cttgctgaat 600
tgtattacgg caaggtttat atgaattcat gactgatatt tagcaaatga ttaattaata 660
tgttaataaa atgtagccaa aacaatatct taccttaatg cctcaatttg tagatctcgg 720
tatttgtgga tccttatgtt tcagacaact tcgattcagt tctagaatgt ttgactcagc 780
aaattcacag gctcatcttt ctaacttgat ggtgaatatg gaaattcagc taaatggatg 840
ttaataaaat tcaaacgttt taaggacaga tggaaatgac agaattttaa ggtaaaatat 900
atgaaggaat ataagataaa ggatttttct accttcagca aaaacatacc cactaattag 960
taaaattaat aggcgaaaaa aagttgcatg ctcttatact gtaatgatta tcattttaaa 1020
actagctttt tgccttcgag ctatcggggt aaagacctac aggaaaacta ctgtcgaaat 1080
cctcgagggg aagaaggggg accctggtgt ttcacaagca atccagaggt acgctacgaa 1140
gtctgtgaca ttcctcagtg ttcagaagtt gaatgcatga cctgcaatgg ggagagttat 1200
cgaggtctca tggatcatac agaatcaggc aagatttgtc agcgctggga tcatcagaca 1260
ccacaccggc acaaattctt gcctgaaaga tatcccgaca agggctttga tgataattat 1320
tgccgcaatc ccgatggcca gccgaggcca tggtgctata ctcttgaccc tcacacccgc 1380
tgggagtact gtgcaattaa aacatgcgct gacaatacta tgaatgacac tgatgttcct 1440
ttggaaacaa ctgaatgcat ccaaggtcaa ggagaaggct acaggggcac tgtcaatacc 1500
atttggaatg gaattccatg tcagcgttgg gattctcagt atcctcacga gcatgacatg 1560
actcctgaaa atttcaagtg caaggaccta cgagaaaatt actgccgaaa tccagatggg 1620
tctgaatcac cctggtgttt taccactgat ccaaacatcc gagttggcta ctgctcccaa 1680
attccaaact gtgatatgtc acatggacaa gattgttatc gtgggaatgg caaaaattat 1740
atgggcaact tatcccaaac aagatctgga ctaacatgtt caatgtggga caagaacatg 1800
gaagacttac atcgtcatat cttctgggaa ccagatgcaa gtaagctgaa tgagaattac 1860
tgccgaaatc cagatgatga tgctcatgga ccctggtgct acacgggaaa tccactcatt 1920
ccttgggatt attgccctat ttctcgttgt gaaggtgata ccacacctac aatagtcaat 1980
ttagaccatc ccgtaatatc ttgtgccaaa acgaaacaat tgcgagttgt aaatgggatt 2040
ccaacacgaa caaacatagg atggatggtt agtttgagat acagaaataa acatatctgc 2100
ggaggatcat tgataaagga gagttgggtt cttactgcac gacagtgttt cccttctcga 2160
gacttgaaag attatgaagc ttggcttgga attcatgatg tccacggaag aggagatgag 2220
aaatgcaaac aggttctcaa tgtttcccag ctggtatatg gccctgaagg atcagatctg 2280
gttttaatga agcttgccag gcctgctgtc ctggatgatt ttgttagtac gattgattta 2340
cctaattatg gatgcacaat tcctgaaaag accagttgca gtgtttatgg ctggggctac 2400
actggattga tcaactatga tggcctatta cgagtggcac atctctatat aatgggaaat 2460
gagaaatgca gccagcatca tcgagggaag gtgactctga atgagtctga aatatgtgct 2520
ggggctgaaa agattggatc aggaccatgt gagggggatt atggtggccc acttgtttgt 2580
gagcaacata aaatgagaat ggttcttggt gtcattgttc ctggtcgtgg atgtgccatt 2640
ccaaatcgtc ctggtatttt tgtccgagta gcatattatg caaaatggat acacaaaatt 2700
attttaacat ataaggtacc acagtcatag 2730
<210> 8
<211> 40
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> прямой праймер d1
<400> 8
tctcggtatt tgtggatcct attatgatct tttgtgtaaa 40
<210> 9
<211> 40
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> обратный праймер d1
<400> 9
tttacacaaa agatcataat aggatccaca aataccgaga 40
<210> 10
<211> 40
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> прямой праймер d2
<400> 10
tctcggtatt tgtggatcct ttactattat aaaccaaaac 40
<210> 11
<211> 40
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> обратный праймер d2
<400> 11
gttttggttt ataatagtaa aggatccaca aataccgaga 40
<210> 12
<211> 40
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> прямой праймер d3
<400> 12
tctcggtatt tgtggatcct aaggtgtaag atgttaaagg 40
<210> 13
<211> 40
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> обратный праймер d3
<400> 13
cctttaacat cttacacctt aggatccaca aataccgaga 40
<210> 14
<211> 40
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> прямой праймер d4
<400> 14
tctcggtatt tgtggatcct tataagaaaa gcaataaaca 40
<210> 15
<211> 40
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> обратный праймер d4
<400> 15
tgtttattgc ttttcttata aggatccaca aataccgaga 40
1
<---
Изобретение относится к биотехнологии. Описан экспрессионный вектор на основе аденоассоциированного вируса (AAV), содержащий чужеродную последовательность нуклеиновой кислоты, состоящую из а) нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 5 или б) кодон-модифицированной нуклеотидной последовательности, обладающей гомологией последовательностей по меньшей мере 80% с SEQ ID NO: 5, где указанная кодон-модифицированная нуклеотидная последовательность кодирует ту же самую аминокислотную последовательность как кодирующая область SEQ ID NO: 5. Также описана клетка-хозяин, содержащая AAV вектор по п. 1 и продуцирующая белок, кодируемый нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 5. Представлена композиция, содержащая AAV вектор по п. 1, для предупреждения или лечения бокового амиотрофического склероза (ALS) или диабетической периферической нейропатии (DPN). Применение AAV вектора по настоящему изобретению делает возможной доставку гибридного гена HGF субъекту с высоким выходом доставки. 3 н. и 1 з.п. ф-лы, 8 ил., 1 табл., 7 пр.
1. Экспрессионный вектор на основе аденоассоциированного вируса (AAV), содержащий чужеродную последовательность нуклеиновой кислоты, состоящую из а) нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 5 или б) кодон-модифицированной нуклеотидной последовательности, обладающей гомологией последовательностей по меньшей мере 80% с SEQ ID NO: 5, где указанная кодон-модифицированная нуклеотидная последовательность кодирует ту же самую аминокислотную последовательность как кодирующая область SEQ ID NO: 5.
2. Клетка-хозяин, содержащая AAV вектор по п. 1 и продуцирующая белок, кодируемый нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 5.
3. Композиция, содержащая AAV вектор по п. 1, для предупреждения или лечения бокового амиотрофического склероза (ALS) или диабетической периферической нейропатии (DPN).
4. Композиция по п. 3, где диабетическая периферическая нейропатия представляет собой полинейропатию или очаговую нейропатию.
| RU 2016104614 A, 18.08.2017 | |||
| WO 2010129021 A1, 11.11.2010 | |||
| RU 2015152546 A, 20.06.2017. |
