ЛЕЧЕНИЕ ПАЦИЕНТОВ С ТЯЖЕЛОЙ ФОРМОЙ БОЛЕЗНИ ФОН ВИЛЛЕБРАНДА, ПОДВЕРГАЮЩИХСЯ ПЛАНОВОМУ ХИРУРГИЧЕСКОМУ ВМЕШАТЕЛЬСТВУ, ПУТЕМ ВВЕДЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО ФФВ Российский патент 2022 года по МПК A61K38/36 A61P7/04 

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

[0001] Данная заявка заявляет приоритет по предварительной заявке на патент США № 62/546999, поданной 17 августа 2017 г., и предварительной заявке на патент США № 62/530024, поданной 7 июля 2017 г., которые включены в данный документ в полном объеме посредством ссылки.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[0002] Заболевания коагуляции крови, такие как болезнь фон Виллебранда (БфВ), как правило, являются результатом дефицита факторов в каскаде реакций коагуляции крови. Болезнь фон Виллебранда (БфВ) относится к группе заболеваний, вызванных дефицитом фактора фон Виллебранда. Фактор фон Виллебранда помогает тромбоцитам слипаться и прилипать к стенке кровеносного сосуда, что необходимо для нормального свертывания крови.

[0003] Болезнь фон Виллебранда (БфВ) - наиболее распространенное наследственное заболевание, связанное с кровотечением, с предполагаемым уровнем распространенности 1% (Veyradier A, et al., Medicine (Baltimore). 2016, 95(11):e3038). Однако, за исключением легких форм заболевания, только около 1/10,000 пациентов действительно нуждаются в лечении. Современное лечение этих коагулопатий включает заместительную терапию с использованием фармацевтических препаратов, содержащих нормальный фактор свертывания крови.

[0004] ФфВ представляет собой гликопротеин, циркулирующий в плазме в виде серии мультимеров размером около от 500 до 20,000 кДа. Полноразмерная кДНК ФфВ была клонирована; про-полипептид соответствует аминокислотным остаткам с 23 по 764 полноразмерного препро-ФфВ (Eikenboom et al. (1995) Haemophilia 1, 77 90). Мультимерные формы ФфВ состоят из полипептидных субъединиц 250 кДа, связанных вместе дисульфидными связями. ФфВ обеспечивает первоначальную адгезию тромбоцитов к субэндотелию поврежденной стенки сосуда, причем более крупные мультимеры проявляют повышенную гемостатическую активность. Мультимеризованный ФфВ связывается с гликопротеином Gp1bα на поверхности тромбоцитов посредством взаимодействия в домене A1 ФфВ, способствуя адгезии тромбоцитов. Другие сайты ФфВ опосредуют связывание со стенкой кровеносного сосуда. Таким образом, ФфВ образует мостик между тромбоцитом и стенкой сосуда, который необходим для адгезии тромбоцитов и первичного гемостаза в условиях высокого напряжения сдвига. Обычно эндотелиальные клетки секретируют крупные полимерные формы ФфВ, а те формы ФфВ, которые имеют более низкую молекулярную массу, возникают в результате протеолитического расщепления. Мультимеры исключительно больших молекулярных масс хранятся в теле Вейбеля-Паллада эндотелиальных клеток и высвобождаются при стимуляции агонистами, такими как тромбин и гистамин.

[0005] Для пациентов с БфВ рекомендуется их лечение с заменой фактора фон Виллебранда (ФфВ), учитывая необходимость длительного гемостаза, особенно при обширном хирургическом вмешательстве (Mannucci PM and Franchini M., Haemophilia, 2017, 23(2):182-187; National Institutes of Health. National Heart, Lung, and Blood Institute. The Diagnosis, Evaluation, and Management of von Willebrand Disease NIH Publication No. 08-5832; December, 2007). Плазмотерапия ФфВ содержит фактор VIII (FVIII) и обладает потенциалом для накопления ФVIII при повторном дозировании. VONVENDI® (фактор фон Виллебранда [рекомбинантный], Shire, Westlake Village, CA) является первым и единственным концентратом рекомбинантного ФфВ (ФфВ) (Turecek PL, et al. Hamostaseologie. 2009;29 (suppl 1):S32-38; Mannucci PM, et al. Blood, 2013;122(5):648-657; Gill JC, et al. Blood, 2015;126(17):2038-2046).

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0006] В данном изобретении предложены способы предварительного лечения пациента с тяжелой формой болезни фон Виллебранда перед хирургическим вмешательством путем введения пациенту 20-60 МЕ/кг рекомбинантного Фактора фон Виллебранда (рФфВ) в период от 12 часов до 24 часов, например 12 часов, 13 часов, 14 часов, 15 часов, 16 часов, 17 часов, 18 часов, 19 часов, 20 часов, 21 час, 22 часа, 23 часа, 24 часа, от 12 часов до 24 часов, от 14 часов до 24 часов, от 16 до 24 часов, от 18 часов до 24 часов, или от 20 часов до 24 часов до хирургического вмешательства, и без введения Фактора VIII (ФVIII) с рФфВ до хирургического вмешательства. В некоторых вариантах реализации изобретения способ предварительного лечения дополнительно включает введение субъекту 5-90 МЕ/кг рФфВ за 1 час до операции. В некоторых вариантах реализации изобретения субъекту вводят 70-200 МЕ/кг рФфВ после операции, с или без предварительного лечения, описанного выше. В некоторых случаях хирургическое вмешательство выбирается из группы, состоящей из обширного хирургического вмешательства, малого хирургического вмешательства или челюстно-лицевого хирургического вмешательства.

[0007] В некоторых вариантах реализации изобретения субъекту вводят 35-60 МЕ/кг рФфВ в период от 12 часов до 24 часов до обширного хирургического вмешательства. В других вариантах реализации изобретения субъекту вводят 15-90 МЕ/кг рФфВ за 1 час до обширного хирургического вмешательства. В другом варианте реализации изобретения субъекту вводят 150-220 МЕ/кг рФфВ после обширного хирургического вмешательства. В некоторых случаях субъекту, подвергающемуся обширному хирургическому вмешательству, вводят суммарную дозу 220-320 МЕ/кг. В некоторых случаях, когда хирургическое вмешательство представляет собой обширное хирургическое вмешательство, предварительное лечение включает введение по меньшей мере двух приблизительно равных доз рФфВ до хирургического вмешательства. Выражение «приблизительно равные», как используется в данном документе, относится к дозам, которые имеют концентрации в пределах 1-15%, 2-14%, 3-13%, 4-12%, 5-11%, 6-10%, 7-9%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17% 18%, 19%, 20% друг от друга.

[0008] В некоторых вариантах реализации изобретения субъекту вводят 50-60 МЕ/кг рФфВ в период от 12 часов до 24 часов до малого хирургического вмешательства. В других вариантах реализации изобретения субъекту вводят 5-50 МЕ/кг рФфВ за 1 час до малого хирургического вмешательства. В другом варианте реализации изобретения субъекту вводят 70-150 МЕ/кг рФфВ после малого хирургического вмешательства. В некоторых случаях субъекту, подвергающемуся малому хирургическому вмешательству, вводят суммарную дозу 100-220 МЕ/кг. В некоторых случаях, когда хирургическое вмешательство представляет собой малое хирургическое вмешательство, предварительное лечение включает введение по меньшей мере двух доз рФфВ до хирургического вмешательства, причем первая доза больше, чем вторая доза.

[0009] В некоторых вариантах реализации изобретения субъекту вводят 20-40 МЕ/кг рФфВ в период от 12 часов до 24 часов до челюстно-лицевого хирургического вмешательства. В других вариантах реализации изобретения субъекту вводят 20-50 МЕ/кг рФфВ за 1 час до челюстно-лицевого хирургического вмешательства. В другом варианте реализации изобретения субъекту вводят 10-50 МЕ/кг рФфВ во время челюстно-лицевого хирургического вмешательства. В другом варианте реализации изобретения субъекту вводят 70-150 МЕ/кг рФфВ после челюстно-лицевого хирургического вмешательства. В некоторых случаях субъекту, подвергающемуся челюстно-лицевого хирургического вмешательства, вводят суммарную дозу 70-190 МЕ/кг. В некоторых случаях, когда хирургическое вмешательство представляет собой челюстно-лицевое хирургическое вмешательство, предварительное лечение включает введение по меньшей мере двух приблизительно равных доз рФфВ до хирургического вмешательства.

[0010] Другие объекты, преимущества и варианты реализации изобретения будут очевидны из подробного описания, представленного ниже.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

[0011] На Фиг. 1 изображена общая гемостатическая эффективность (основной критерий оценки) у пациентов исследования.

[0012] На Фиг. 2 изображена интраоперационная гемостатическая эффективность (второстепенный критерий оценки) у пациентов исследования.

[0013] На Фиг. 3 представлены исходные персональные данные пациентов и клинические характеристики.

[0014] На Фиг. 4 представлены параметры ФK для ФфВ:РКо (VWF:RCo) (n=11)

[0015] На Фиг. 5А и Фиг. 5B изображены средние Уровни ФфВ:РКо и Эндогенного ФVIII:К (FVIII:C) в Ответ на рФфВ 50±5 МЕ рФфВ:РКо/кг у всех пациентов с БфВ С анализом данных ФK (n=11) (Фиг. 5А), и у подгруппы пациентов с БфВ типа 3 (n=5) (Фиг. 5B).

[0016] На Фиг. 6 представлены последовательности нуклеиновых кислот и аминокислот ФфВ.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Вступление

[0017] В данном изобретении предлагаются способы предварительного лечения пациента с тяжелой формой болезни фон Виллебранда перед хирургическим вмешательством путем введения пациенту 45-60 МЕ/кг рекомбинантного Фактора фон Виллебранда (рФфВ) без введения Фактора VIII с рФфВ до хирургического вмешательства. В некоторых случаях хирургическое вмешательство выбирается из группы, состоящей из обширного хирургического вмешательства, малого хирургического вмешательства или челюстно-лицевого хирургического вмешательства.

[0018] Раскрытие публикации заявки PCT № WO2012/171031 включено в данный документ в полном объеме посредством ссылки для всех целей.

Определения

[0019] Используемые в контексте данного документа и в прилагаемой формуле изобретения существительные в единственном числе включают соответствующие существительные во множественном числе, если в контексте явно не указано иное. Таким образом, например, ссылка на «антитело» включает в себя множество таких антител, а ссылка на «клетку-хозяина» включает ссылку на одну или более клеток-хозяев и их эквивалентов, известных специалистам в данной области, и так далее. Кроме того, следует отметить, что формула изобретения может быть составлена таким образом, чтобы исключать любой необязательный элемент. Как таковое, это утверждение предназначено для того, чтобы служить предшествующей основой для использования такой исключающей терминологии, как «лишь», «только» и т.п., в связи с перечислением элементов формулы изобретения или использованием «отрицательного» ограничения.

[0020] Прежде чем изобретение будет дополнительно описано, следует понимать, что данное изобретение не ограничивается конкретными описанными вариантами реализации изобретения, поскольку они, конечно, могут варьироваться. Также следует понимать, что используемая в данном документе терминология предназначена только для описания конкретных вариантов реализации изобретения и не предназначена для ограничения, поскольку объем данного изобретения будет ограничен только прилагаемой формулой изобретения.

[0021] Термин «пре-пропептид ФфВ», «препро-ФфВ» или «про-ФфВ» относится к незрелому полипептиду ФфВ, содержащему сигнальный пептид из около 22 аминокислотных остатков, пропептиду ФфВ из около 741 аминокислотных остатков, и зрелой субъединице ффВ содержащей около 2050 аминокислотных остатков. Субъединицы про-ФфВ могут димеризоваться через дисульфидные связи вблизи их карбоксильных концов в эндоплазматической сети с образованием хвостовых димеров, которые затем транспортируются в комплекс Гольджи. В комплексе Гольджи дополнительные дисульфидные связи «голова к голове» образуются вблизи аминоконцов субъединиц, образуя тем самым мультимеры. Протеолитическое расщепление пропептида ФфВ происходит посредством процессинга протеазы фурина, в результате чего образуется зрелый комплекс ФфВ/ФфВ-ПП (VWF/VWF-PP). Когда «р» включена в начале обозначения ФфВ, это относится к рекомбинантной версии. В некоторых вариантах реализации изобретения способы, описанные в данном документе, применяются к рекомбинантному ФфВ (рФфВ).

[0022] Термин «комплекс ФфВ» или «комплекс зр-ФфВ/ФфВ-ПП» относится к нековалентно связанной гетеродимерной структуре, содержащей зрелую субъединицу ФфВ и пропептид ФфВ. Комплекс ФфВ может быть получен как продукт расщепления фурином между пропептидной частью и зрелой частью ФфВ пре-пропептидного ФфВ. Когда «р» включена в начале обозначения ФфВ, это относится к рекомбинантной версии. В некоторых вариантах реализации изобретения способы, описанные в данном документе, применяются к рекомбинантному ФфВ (рФфВ). Использованный в контексте данного документа, «рФфВ» относится к рекомбинантному ФфВ.

[0023] Использованный в контексте данного документа, «рФVIII» относится к рекомбинантному ФVIII.

[0024] Термин «рекомбинантный» при использовании со ссылкой, например, на клетку или нуклеиновую кислоту, белок или вектор, указывает, что клетка, нуклеиновая кислота, белок или вектор были модифицированы путем введения гетерологичной нуклеиновой кислоты или белка или путем изменения природной нуклеиновой кислоты или белка, или то, что клетка получена из клетки, модифицированной таким образом. Таким образом, например, рекомбинантные клетки экспрессируют гены, которые не обнаружены в нативной (нерекомбинантной) форме клетки, или экспрессируют нативные гены, которые иначе ненормально экспрессируются, недостаточно экспрессируются или вообще не экспрессируются.

[0025] Используемый в контексте данного документа термин «рекомбинантный ФфВ» включает ФфВ, полученный с помощью технологии рекомбинантных ДНК. В некоторых вариантах реализации изобретения белки ФфВ по данному изобретению могут содержать конструкцию, например, приготовленную, как описано в WO 1986/06096, опубликованной 23 октября 1986 г. и в заявке на патент США № 07/559509, поданной 23 июля 1990 г., на имя Ginsburg et al., которая включена в данный документ посредством ссылки в отношении способов получения рекомбинантного ФфВ. ФфВ в данном изобретении может включать все потенциальные формы, включая мономерные и мультимерные формы. Следует также понимать, что данное изобретение охватывает различные формы ФфВ для использования в комбинации. Например, ФфВ по данному изобретению может включать разные мультимеры, разные производные и как биологически активные производные, так и биологически не активные производные.

[0026] В контексте данного изобретения рекомбинантный ФфВ включает любого представителя семейства ФфВ, например, от млекопитающего, такого как примат, человек, обезьяна, кролик, свинья, грызун, мышь, крыса, хомяк, песчанка, собака, кошачьи и их биологически активные производные. Также включены обладающие активностью мутантные и вариантные белки ФфВ, а также функциональные фрагменты и слитые белки белков ФфВ. Кроме того, ФфВ по данному изобретению может дополнительно содержать метки, которые облегчают очистку, обнаружение или и то и другое. Описанный в данном документе ФфВ может быть дополнительно модифицирован терапевтическим фрагментом или фрагментом, подходящим для визуализации in vitro или in vivo.

[0027] Используемый в данном документе термин «полученный из плазмы ФфВ (ппФфВ)» включает все формы белка, обнаруженного в крови, включая зрелый ФфВ, полученный от млекопитающего, обладающий свойством in vivo-стабилизации, например, связываться, по меньшей мере, с одной молекулой ФVIII.

[0028] Термин «высоко мультимерный ФфВ» или «высокомолекулярный ФфВ» относится к ФфВ, включающему, по меньшей мере, 10 субъединиц, или 12, 14 или 16 субъединиц, до около 20, 22, 24 или 26 субъединиц или более. Термин «субъединица» относится к мономеру ФфВ. Как известно в данной области техники, обычно димеры ФфВ полимеризуются с образованием мультимеров более крупного порядка (см. Turecek et al., Semin. Thromb. Hemost. 2010, 36(5): 510-521 которая включена в данный документ в полном объеме посредством ссылки для всех целей и, в частности, для всех идей, касающихся мультимерного анализа ФфВ).

[0029] Используемый в контексте данного документа термин «фактор VIII» или «ФVIII» относится к любой форме молекулы фактора VIII с типичными характеристиками фактора VIII свертывания крови, независимо от того, является ли она эндогенной для пациента, получена из плазмы крови или получена с использованием технологий рекомбинантной ДНК, включая все модифицированные формы фактора VIII. Фактор VIII (ФVIII) существует в природе и в терапевтических препаратах как гетерогенное распределение полипептидов, возникающих из одного генного продукта (см., например, Andersson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:2979-2983 (1986)). Коммерчески доступные примеры терапевтических препаратов, содержащих Фактор VIII, включают препараты, продаваемые под торговыми названиями HEMOFIL M, ADVATE и RECOMBINATE (доступны от Baxter Healthcare Corporation, Deerfield, Ill., U.S.A.).

[0030] В контексте данного документа, «активность ФVIII в плазме» и «активность ФVIII in vivo» используются взаимозаменяемо. Активность ФVIII in vivo, измеренная с использованием стандартных анализов, может представлять собой активность эндогенного ФVIII, активность терапевтически введенного ФVIII (рекомбинантного или полученного из плазмы) или активность как эндогенного, так и введенного ФVIII. Аналогично, «ФVIII плазмы» относится к эндогенному ФVIII или вводимому рекомбинантному или полученному из плазмы ФVIII.

[0031] Используемый в контексте данного документа термин «болезнь фон Виллебранда» относится к группе заболеваний, вызванных дефицитом фактора фон Виллебранда. Фактор фон Виллебранда помогает тромбоцитам слипаться и прилипать к стенке кровеносного сосуда, что необходимо для нормального свертывания крови. Как описано более подробно в данном документе, существует несколько типов болезни фон Виллебранда, включая тип 1, 2А, 2В, 2М и 3.

[0032] Термины «выделенный», «очищенный» или «биологически чистый» относятся к материалу, который по существу или в основном не содержит компонентов, которые обычно сопутствуют ему, как обнаруживается в его естественном состоянии. Чистота и однородность обычно определяются с использованием способов аналитической химии, таких как электрофорез в полиакриламидном геле или жидкостная хроматография высокого разрешения. ФфВ является по существу очищенным, преобладающим компонентом, присутствующим в приготовлении. Термин «очищенный» в некоторых вариантах реализации изобретения означает, что нуклеиновая кислота или белок дают в основном одну полосу в электрофоретическом геле. В других вариантах реализации изобретения это означает, что нуклеиновая кислота или белок имеет чистоту, по меньшей мере, 50%, более предпочтительно, по меньшей мере, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более. «Очистка» или «выделение» в других вариантах реализации изобретения означает удаление по меньшей мере одного загрязняющего компонента из композиции, подлежащей очистке. В этом смысле выделение не требует, чтобы очищенное соединение было гомогенным, например, на 100% чистым.

[0033] Используемый в контексте данного документа термин «введение» (и все грамматические эквиваленты) включает внутривенное введение, внутримышечное введение, подкожное введение, пероральное введение, введение в виде суппозитория, местное применение, внутрибрюшинный, внутриочаговый или интраназальный способ введения или имплантацию устройства для медленного высвобождения препарата, например, миниосмотического насоса, субъекту. Введение любым путем включает парентеральное и трансмукозальное введение (например, пероральное, назальное, вагинальное, ректальное или трансдермальное). Парентеральное введение включает, например, внутривенное, внутримышечное, внутриартериальное, внутрикожное, подкожное, внутрибрюшинное, интравентрикулярное и интракраниальное. Другие способы доставки включают, но не ограничиваются ими, использование липосомальных препаратов, внутривенных инфузий, трансдермальных пластырей и т.д.

[0034] Термины «терапевтически эффективное количество или доза» или «терапевтически достаточное количество или доза» или «эффективное или достаточное количество или доза» относятся к дозе, которая вызывает терапевтические эффекты, для которых она вводится. Например, терапевтически эффективное количество лекарственного средства, полезного для лечения гемофилии, может представлять собой количество, которое способно предотвратить или ослабить один или более симптомов, связанных с гемофилией. Точная доза будет зависеть от цели лечения и может быть установлена специалистом в данной области с использованием известных способов (см., например, Lieberman, Pharmaceutical Dosage Forms (vols. 1-3, 1992); Lloyd, The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding (1999); Pickar, Dosage Calculations (1999); и Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition, 2003, Gennaro, Ed., Lippincott, Williams & Wilkins).

[0035] Используемые в контексте данного документа термины «пациент» и «субъект» используются взаимозаменяемо и относятся к млекопитающему (предпочтительно человеку), которое имеет заболевание или может заболеть.

[0036] Используемый в контексте данного документа термин «около» обозначает приблизительный диапазон плюс или минус 10% от указанного значения. Например, выражение «около 20%» охватывает диапазон 18-22%.

[0037] Используемый в контексте данного документа термин «период полувыведения» относится к периоду времени, в течение которого количество вещества, подвергающегося распаду (или выведению из образца или у пациента), уменьшается вдвое.

Рекомбинантный фактор фон Виллебранда (рФфВ)

[0038] В данном изобретении используются композиции, содержащие фактор фон Виллебранда (рФфВ), для предварительного лечения субъекта с тяжелой БфВ, который подвергается хирургической процедуре, такой как, но не ограничиваясь этим, обширное хирургическое вмешательство, малое хирургическое вмешательство или стоматологическая операция.

[0039] В определенных вариантах реализации изобретения белки ФфВ по данному изобретению могут содержать конструкцию, например, приготовленную, как описано в WO 1986/06096, опубликованной 23 октября 1986 г. и в заявке на патент США № 07/559509, поданной 23 июля 1990 г., на имя Ginsburg et al., которая включена в данный документ посредством ссылки в отношении способов получения рекомбинантного ФфВ. ФфВ, полезный для данного изобретения, включает все потенциальные формы, включая мономерные и мультимерные формы. Одной из особенно полезных форм ФфВ являются гомомультимеры по меньшей мере двух ФфВ. Белки ФфВ могут представлять собой как биологически активные производные, так и иметь биологически не активную форму, в случае когда ФфВ может использоваться исключительно в качестве стабилизатора для ФVIII. Следует также понимать, что данное изобретение охватывает различные формы ФфВ для использования в комбинации. Например, композиция, полезная для данного изобретения, может включать разные мультимеры, разные производные и как биологически активные производные, так и биологически не активные производные.

[0040] При первичном гемостазе ФфВ служит мостиком между тромбоцитами и специфическими компонентами внеклеточного матрикса, такими как коллаген. Биологическая активность ФфВ в этом процессе может быть измерена с помощью различных анализов in vitro (Turecek et al., Semin. Thromb. Hemost. 28: 149-160, 2002). Анализ кофактора ристоцетина основан на агглютинации свежих или фиксированных формалином тромбоцитов, индуцированной антибиотиком ристоцетином в присутствии ФфВ.

[0041] Степень агглютинации тромбоцитов зависит от концентрации ФфВ и может быть измерена турбидиметрическим способом, например, с использованием агрегометра (Weiss et al., J. Clin. Invest. 52: 2708-2716, 1973; Macfarlane et al., Thromb. Diath. Haemorrh. 34: 306-308, 1975). Второй способ представляет собой анализ связывания коллагена, основанный на способе твердофазного ИФА (Brown et Bosak, Thromb. Res. 43: 303-311, 1986; Favaloro, Thromb. Haemost. 83: 127-135, 2000). Микротитрационный планшет покрыт коллагеном типа I или III. Затем ФфВ связывается с поверхностью коллагена и впоследствии детектируется с помощью меченного ферментом поликлонального антитела. Последним этапом является реакция субстрата, которую можно фотометрически фиксировать с помощью считывающего устройства ИФА. В соответствии с данным документом, специфическая Ристоцетин-Кофакторная активность ФфВ (ФфВ:РКо (VWF:RCo)) по данному изобретению, как правило, описывается в единицах мЕд/мкг ФфВ, измеренных с использованием анализов in vitro.

[0042] Преимущество композиций рФфВ по данному изобретению перед ппФфВ состоит в том, что рФфВ проявляет более высокую специфическую активность, чем ппФфВ. В некоторых вариантах реализации изобретения рФфВ по данному изобретению обладает специфической активностью, по меньшей мере, около 20, 22,5, 25, 27,5, 30, 32,5, 35, 37,5, 40, 42,5, 45, 47,5, 50, 52,5, 55, 57,5, 60. , 62,5, 65, 67,5, 70, 72,5, 75, 77,5, 80, 82,5, 85, 87,5, 90, 92,5, 95, 97,5, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150 или более мЕд/мкг.

[0043] РФфВ по данному изобретению является высоко мультимерным, включающим от около 10 до около 40 субъединиц. В дополнительных вариантах реализации изобретения мультимерный рФфВ, полученный с использованием способов согласно данному изобретению, содержит около 10-30, 12-28, 14-26, 16-24, 18-22, 20-21 субъединиц. В дополнительных вариантах реализации изобретения рФфВ присутствует в мультимерах, различающихся по размеру от димеров до мультимеров из более чем 40 субъединиц (>10 миллионов Дальтон). Самые большие мультимеры обеспечивают множество сайтов связывания, которые могут взаимодействовать как с рецепторами тромбоцитов, так и с сайтами повреждения субэндотелиального матрикса, и являются наиболее гемостатически активной формой ФфВ. Применение ADAMTS13 будет расщеплять сверхбольшие мультимеры рФфВ с течением времени, но во время производства (обычно посредством экспрессии в культуре клеток) композиции рФфВ по данному изобретению обычно не подвергаются действию ADAMTS13 и сохраняют свою высоко мультимерную структуру.

[0044] В одном варианте реализации изобретения композиция рФфВ, используемая в описанных в данном документе способах, имеет распределение олигомеров рФфВ, характеризующееся тем, что 95% олигомеров имеют от 6 субъединиц до 20 субъединиц. В других вариантах реализации изобретения композиция рФфВ имеет распределение олигомеров rVWF, характеризующееся тем, что 95% олигомеров имеют диапазон субъединиц, выбранный из вариаций 458-641, приведенных в Таблице 2 WO 2012/171031, которая включена в данный документ в полном объеме посредством ссылки для всех целей.

[0045] В одном варианте реализации изобретения композицию рФфВ можно охарактеризовать в соответствии с процентным содержанием молекул рФфВ, которые присутствуют в конкретном мультимере рФфВ высшего порядка или мультимере большего размера. Например, в одном варианте реализации изобретения, по меньшей мере, 20% молекул рФфВ в композиции рФфВ, используемой в описанных в данном документе способах, присутствуют в олигомерном комплексе, состоящем по меньшей мере из 10 субъединиц. В другом варианте реализации изобретения, по меньшей мере, 20% молекул рФфВ в композиции рФфВ, используемой в описанных в данном документе способах, присутствуют в олигомерном комплексе, состоящем по меньшей мере из 12 субъединиц. Еще в других вариантах реализации изобретения композиция рФфВ, используемая в способах, представленных в данном документе, имеет минимальный процент (например, имеет по меньшей мере X %) молекул рФфВ, присутствующих в конкретном мультимере рФфВ более высокого порядка или мультимере большего размера (например, мультимере по меньшей мере из Y субъединиц) в соответствии с любым из вариаций 134-457, приведенных в Таблицах с 3 по 5, которые включены в данный документ в полном объеме посредством ссылки для всех целей.

[0046] В соответствии с вышеизложенным, композиция рФфВ, вводимая субъекту (с ФVIII или без него), обычно содержит значительный процент высокомолекулярных (ВМ) мультимеров рФфВ. В дополнительных вариантах реализации изобретения композиция ВМ мультимеров рФфВ содержит по меньшей мере 10-80% декамеров рФфВ или мультимеров высшего порядка. В дополнительных вариантах реализации изобретения композиция содержит около 10-95%, 20-90%, 30-85%, 40-80%, 50-75%, 60-70% декамеров или мультимеров высшего порядка. В дополнительных вариантах реализации изобретения композиция ВМ мультимеров рФфВ содержит по меньшей мере 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% декамеров или мультимеров высшего порядка.

[0047] Оценка количества и процентного содержания мультимеров рФфВ может проводиться с использованием способов, известных в данной области, включая, но не ограничиваясь ими, способы с использованием электрофореза и эксклюзионной хроматографии для разделения мультимеров ФфВ по размеру, например, как обсуждалось Cumming et al., (J Clin Pathol. 1993 May; 46(5): 470-473, которая включена в данный документ в полном объеме посредством ссылки для всех целей и, в частности, для всех идей, связанных с оценкой мультимеров ФфВ). Такие подходы могут дополнительно включать способы иммуноблоттинга (такие как вестерн-блот), в которых гель иммуноблоттируется с радиоактивно меченным антителом против ФфВ с последующим хемилюминесцентным детектированием (см., например, Wen et al., (1993), J. Clin. Lab. Anal., 7: 317-323, которая включена в данный документ в полном объеме посредством ссылки для всех целей и, в частности, для всех идей, связанных с оценкой мультимеров ФфВ). Дополнительные исследования для ФфВ включают анализы Антигена ФфВ (ФфВ:Аг (VWF:Ag)), Ристоцетин-Кофакторной активности ФфВ (ФфВ:РКо (VWF:RCof)) и Коллаген-Связывающей Активности (ФфВ:КСА (VWF:CBA)), которые часто используются для диагностики и классификации болезни фон Виллебранда. (см., например, Favaloro et al., Pathology, 1997, 29(4): 341-456, которая включена в данный документ в полном объеме посредством ссылки для всех целей и, в частности, для всех идей, связанных с анализами для ФфВ).

[0048] В дополнительных вариантах реализации изобретения мультимеры рФфВ высшего порядка согласно изобретению стабильны в течение от около 1 до около 90 часов после введения. В еще дополнительных вариантах реализации изобретения мультимеры рФфВ высшего порядка стабильны в течение около 5-80, 10-70, 15-60, 20-50, 25-40, 30-35 часов после введения. В еще дополнительных вариантах реализации изобретения мультимеры рФфВ высшего порядка стабильны в течение по меньшей мере 3, 6, 12, 18, 24, 36, 48, 72 часов после введения. В некоторых вариантах реализации изобретения стабильность мультимеров рФфВ оценивают in vitro.

[0049] В одном варианте реализации изобретения мультимеры рФфВ высшего порядка, используемые в композициях и способах, представленных в данном документе, имеют период полувыведения по меньшей мере 12 часов после введения. В другом варианте реализации изобретения мультимеры рФфВ высшего порядка имеют период полувыведения по меньшей мере 24 часа после введения. В еще других вариантах реализации изобретения мультимеры рФфВ высшего порядка имеют период полувыведения, выбранный из вариаций 642-1045, приведенных в Таблице 6 WO 2012/171031, которая включена в данный документ в полном объеме посредством ссылки для всех целей.

[0050] В конкретных аспектах рФфВ (рекомбинантный или полученный из плазмы), используемый в соответствии с данным изобретением, не модифицируется какими-либо конъюгационными, посттрансляционными или ковалентными модификациями. В конкретных вариантах реализации изобретения рФфВ по данному изобретению не модифицирован водорастворимым полимером, включая, но не ограничиваясь этим, полиэтиленгликоль (ПЭГ), полипропиленгликоль, полиоксиалкилен, полисиаловую кислоту, гидроксиэтилкрахмал, поли-углеводный фрагмент, и тому подобное.

[0051] В других аспектах рФфВ (рекомбинантный или полученный из плазмы), используемый в соответствии с данным изобретением, модифицирован посредством конъюгации, посттрансляционной модификации или ковалентной модификации, включая модификации N- или C-концевых остатков, а также модификации выбранных боковых цепей, например, на свободных сульфгидрильных группах, первичных аминах и гидроксильных группах. В одном варианте реализации изобретения водорастворимый полимер связан с белком (напрямую или через линкер) лизиновой группой или другим первичным амином. В одном варианте реализации изобретения белки рФфВ по данному изобретению могут быть модифицированы путем конъюгации водорастворимого полимера, включая, но не ограничиваясь этим, полиэтиленгликоль (ПЭГ), полипропиленгликоль, полиоксиалкилен, полисиаловую кислоту, гидроксилэтилкрахмал, поли-углеводородный фрагмент и тому подобное.

[0052] Водорастворимые полимеры, которые можно использовать для модификации рФфВ и/или ФVIII, включают линейные и разветвленные структуры. Конъюгированные полимеры могут быть присоединены непосредственно к коагулятному белку коагуляции по изобретению или, альтернативно, могут быть присоединены через связующий фрагмент. Неограничивающие примеры конъюгации белка с водорастворимыми полимерами можно найти в патентах США № 4,640,835; 4,496,689; 4,301,144; 4,670,417; 4,791,192, и 4,179,337, а также в Abuchowski and Davis "Enzymes as Drugs," Holcenberg and Roberts, Eds., pp. 367 383, John Wiley and Sons, New York (1981), и Hermanson G., Bioconjugate Techniques 2^nd Ed., Academic Press, Inc. 2008.

[0053] Конъюгация белков может быть выполнена с помощью ряда хорошо известных в данной области подходов, например, см. Hermanson G., Bioconjugate Techniques 2^nd Ed., Academic Press, Inc. 2008. Примеры включают соединение через пептидную связь между карбоксильной группой на одном из коагулянтных белков или водорастворимом полимерном фрагменте и аминогруппой другого белка или фрагмента, или сложноэфирное соединение между карбоксильной группой с одной стороны и гидроксильной группой с другой стороны. Другое соединение, с помощью которого коагулянтный белок по данному изобретению может быть конъюгирован с водорастворимым полимерным веществом, происходит через основание Шиффа между свободной аминогруппой на полимерном фрагменте, реагирующей с альдегидной группой, образованной на невосстанавливающем конце полимера путем окисления периодатом (Jennings and Lugowski, J. Immunol. 1981; 127:1011-8; Femandes and Gregonradis, Biochim Biophys Acta. 1997; 1341; 26-34). Генерируемое основание Шиффа может быть стабилизировано путем специфического восстановления NaCNBH₃ с образованием вторичного амина. Альтернативным подходом является образование концевых свободных аминогрупп на полимере путем восстановительного аминирования NH₄Cl после предварительного окисления. Бифункциональные реагенты могут быть использованы для связывания двух аминогрупп или двух гидроксильных групп. Например, полимер, содержащий аминогруппу, может быть соединен с аминогруппой коагулянтного белка с помощью таких реагентов, как BS3 (Бис(сульфосукцинимидил)суберат/Pierce, Rockford, Ill.). Кроме того, гетеробифункциональные сшивающие реагенты, такие как Sulfo-EMCS ((N-эпсилон-малеимидокапроилокси) сульфосукцинимидный эфир/Pierce), могут быть использованы, например, для связывания аминогрупп и тиоловых групп. В других вариантах реализации изобретения группа, реагирующая с альдегидом, такая как ПЭГ алкоксид плюс диэтилацеталь бромацетальдегида; ПЭГ плюс ДМСО и уксусный ангидрид, а также ПЭГ хлорид плюс феноксид 4-гидроксибензальдегида, сукцинимидильные активные эфиры, активированный дитиокарбонат ПЭГ, 2,4,5-трихлорфенилхлорформиат и P-нитрофенилхлорформиат активированный ПЭГ, могут использоваться в конъюгации коагулянтного белка.

[0054] В некоторых аспектах рФфВ, используемый в способах по данному изобретению, созревал in vitro с фурином. В дополнительных вариантах реализации изобретения фурин представляет собой рекомбинантный фурин.

[0055] В дополнительных аспектах рФфВ, используемый в способах по данному изобретению, получают путем экспрессии в культуре клеток млекопитающих с использованием способов, известных в данной области. В конкретных вариантах реализации изобретения культура клеток млекопитающих содержит клетки CHO. В типовом варианте реализации изобретения рФфВ по данному изобретению содержит белок рФфВ, выделенный из системы экспрессии клеток CHO. В дополнительном варианте реализации изобретения удаление пропептида опосредуется in vitro посредством воздействия фурина на про-ФфВ. В еще одном дополнительном варианте реализации изобретения Фурин, используемый для удаления пропептида, представляет собой рекомбинантный фурин. В еще одном дополнительном варианте реализации изобретения полностью гликозилированные гликаны группы крови ABO отсутствуют.

[0056] В еще дополнительных вариантах реализации изобретения рФфВ используют в способах и композициях по данному изобретению путем экспрессии в подходящей эукариотической системе-хозяине. Примеры эукариотических клеток включают, но не ограничиваются ими, клетки млекопитающих, такие как CHO, COS, HEK 293, BHK, SK-Hep и HepG2; клетки насекомых, например клетки SF9, клетки SF21, клетки S2 и клетки High Five; и дрожжевые клетки, например клетки Saccharomyces или Schizosaccharomyces. В одном варианте реализации изобретения ФфВ может быть экспрессирован в клетках дрожжей, клетках насекомых, клетках птиц, клетках млекопитающих и тому подобное. Например, в клеточной линии человека, клеточной линии хомяка или клеточной линии мыши. В одном конкретном варианте реализации изобретения клеточная линия представляет собой клеточную линию CHO, BHK или HEK. Как правило, клетки млекопитающих, например клетки СНО из стабильной клеточной линии, можно использовать для экспрессии ФфВ по данному изобретению.

[0057] В некоторых вариантах реализации изобретения последовательность нуклеиновой кислоты, содержащая последовательность, которая кодирует ФфВ, может представлять собой вектор. Вектор может быть доставлен вирусом или может быть плазмидой. Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая белок, может представлять собой специфичный ген или его биологически функциональную часть. В одном варианте реализации изобретения белок представляет собой, по меньшей мере, биологически активную часть ФфВ. Широкий спектр векторов может быть использован для экспрессии ФфВ и может быть выбран из эукариотических векторов экспрессии. Примеры векторов для экспрессии у эукариот включают: (i) для экспрессии в дрожжах, векторы, такие как pAO, pPIC, pYES, pMET, с использованием промоторов, таких как AAOX1, GAP, GAL1, AUG1 и т.д.; (ii) для экспрессии в клетках насекомых, векторы, такие как pMT, pAc5, pIB, pMIB, pBAC и т.д., с использованием промоторов, таких как PH, p10, MT, Ac5, OpIE2, gp64, polh и т.д., и (iii) для экспрессии в клетках млекопитающих, векторы, такие как pSVL, pCMV, pRc/RSV, pcDNA3, pBPV и т.д., и векторы, полученные из вирусных систем, таких как вирус осповакцины, аденоассоциированные вирусы, вирусы герпеса, ретровирусы и т.д., с использованием промоторов таких как CMV, SV40, EF-1, UbC, RSV, ADV, BPV и β-актин.

[0058] В некоторых вариантах реализации данного изобретения последовательность нуклеиновой кислоты дополнительно содержит другие последовательности, подходящие для контролируемой экспрессии белка, такие как последовательности промотора, энхансеры, TATA-боксы, сайты инициации транскрипции, полилинкеры, сайты рестрикции, поли-A-последовательности, последовательности процессинга белка, селективные маркеры и тому подобное, которые обычно известны специалисту в данной области техники.

[0059] В некоторых вариантах реализации изобретения способы культивирования клеток по изобретению могут включать использование микроносителя. В некоторых вариантах реализации изобретения культуры клеток в соответствии с вариантами реализации изобретения могут быть получены в больших биореакторах в условиях, подходящих для обеспечения больших объемных удельных площадей поверхности культуры для достижения высокой плотности клеток и экспрессии белка. Одним из способов обеспечения таких условий роста является использование микроносителей для культивирования клеток в биореакторах с механическим перемешиванием. Концепция роста клеток на микроносителях была впервые описана van Wezel (van Wezel, A. L., Nature 216:64-5 (1967)) и позволяет прикреплять клетки на поверхности мелких твердых частиц, которые находятся во взвешенном состоянии в среде для выращивания. Эти способы обеспечивают высокое соотношение поверхности к объему и, таким образом, обеспечивают эффективное использование питательных веществ. Кроме того, для экспрессии секретируемых белков в эукариотических клеточных линиях увеличенное соотношение поверхности к объему обеспечивает более высокие уровни секреции и, следовательно, более высокий выход белка в надосадочной жидкости культуры. В конечном итоге, эти способы позволяют легко увеличить масштабы экспрессии эукариотических культур.

[0060] Клетки, экспрессирующие ФфВ, могут быть связаны со сферическим или пористым микроносителем во время роста культуры клеток. Микроноситель может представлять собой микроноситель, выбранным из группы микроносителей на основе декстрана, коллагена, пластика, желатина и целлюлозы и других, как описано в Butler (1988. In: Spier & Griffiths, Animal Cell Biotechnology 3:283-303). Также возможно выращивать клетки до биомассы на сферических микроносителях и пересевать клетки, когда они достигли конечной биомассы ферментера, и до продуцирования экспрессированного белка на пористом микроносителе или наоборот. Подходящие сферические микроносители могут включать микроносители с гладкой поверхностью, такие как Cytodex™ 1, Cytodex™ 2 и Cytode™ 3 (GE Healthcare), и макропористые микроносители, такие как Cytopore™. 1, Cytopore™ 2, Cytoline™ 1, и Cytoline™ 2 (GE Healthcare).

[0061] В некоторых вариантах реализации изобретения рФфВ экспрессируется в клетках, культивируемых в питательной среде для выращивания клеток, которые продуцируют высокомолекулярный рФфВ. Термины «раствор для культивирования клеток», «среда или питательная среда для культивирования клеток» и «надосадочная жидкость клеточной культуры» относятся к аспектам процессов культивирования клеток, обычно хорошо известным в данной области техники. В контексте данного изобретения раствор для культивирования клеток может включать среду для культивирования клеток и надосадочную жидкость клеточной культуры. Среда для культивирования клеток добавляется извне к раствору для культивирования клеток, необязательно вместе с витаминными добавками, чтобы обеспечить питательные вещества и другие компоненты для культивирования клеток, экспрессирующих ФфВ. Надосадочная жидкость клеточной культуры относится к раствору клеточной культуры, содержащему питательные вещества и другие компоненты из среды для культивирования клеток, а также продукты, высвобождаемые, метаболизируемые и/или выделяемые из клеток во время культивирования. В дополнительных вариантах реализации изобретения среда может не содержать животных белков и может быть с определенным химическим составом. Способы приготовления питательных сред, не содержащих животных белков, и с определенным химическим составом известны в данной области техники, например, в публикации патентов США 2008/0009040 и США 2007/0212770, которые оба включены в данный документ в полном объеме посредством ссылки для всех целей, и в частности, для всех идей, касающихся сред для культивирования клеток. Термин «не содержащий белка» и родственные термины относятся к белку, который получен из экзогенного источника или отличается от белка клеток в культуре, которые естественным образом выделяют белки во время роста. В другом варианте реализации изобретения среда для культивирования не содержит полипептидов. В другом варианте реализации изобретения среда для культивирования не содержит сыворотку. В другом варианте реализации изобретения среда для культивирования не содержит животных белков. В другом варианте реализации изобретения среда для культивирования не содержит животных компонентов. В другом варианте реализации изобретения среда для культивирования содержит белок, например, животный белок из сыворотки, такой как эмбриональная телячья сыворотка. В другом варианте реализации изобретения культура содержит рекомбинантные белки, добавленные экзогенно. В другом варианте реализации изобретения белки получены от сертифицированного животного, не содержащего патогенов. Используемый в контексте данного документа термин «с определенным химическим составом» означает, что среда не содержит каких-либо неопределенных добавок, таких как, например, экстракты животных компонентов, органов, желез, растений или дрожжей. Соответственно, каждый компонент среды с определенным химическим составом точно определен. В предпочтительном варианте реализации изобретения среды не содержат животных компонентов и белков.

[0062] В дополнительных вариантах реализации изобретения после очистки от культуры клеток млекопитающих рФVIII восстанавливают перед введением. В дополнительных вариантах реализации изобретения рФфВ обрабатывают фурином до или после восстановления. В дополнительных вариантах реализации изобретения Фурин представляет собой рекомбинантный фурин. В дополнительных вариантах реализации изобретения рФфВ по изобретению не подвергается воздействию ADAMTS13, в результате чего в композициях рФфВ по изобретению присутствуют ультрабольшие рФфВ (то есть содержащие 10 или более субъединиц).

[0063] В конкретных аспектах рФфВ, используемый в способах по данному изобретению, содержится в препарате, содержащем буфер, сахар и/или сахарный спирт (включая, но не ограничиваясь ими, трегалозу и маннит), стабилизатор (такой как глицин) и поверхностно-активное вещество (такое как полисорбат 80). В других вариантах реализации изобретения для препаратов, содержащих рФVIII, препарат может дополнительно включать натрий, гистидин, кальций и глутатион.

[0064] В одном аспекте препараты, содержащие рФфВ, лиофилизируют перед введением. Лиофилизация проводится с использованием способов, известных в данной области техники, и должна быть оптимизирована для разрабатываемой композиции [Tang et al., Pharm Res. 21: 191-200. (2004) и Chang et al., Pharm Res. 13:243-9 (1996)].

[0065] Способы приготовления фармацевтических препаратов могут включать одну или более из следующих стадий: добавление стабилизирующего агента, как описано в данном документе, к указанной смеси перед лиофилизацией, добавление по меньшей мере одного агента, выбранного из наполнителя, агента, регулирующего осмолярность, и поверхностно-активного вещества, как описано в данном документе для каждого из них, к указанной смеси до лиофилизации. Лиофилизированный препарат в одном аспекте, по меньшей мере, содержит один или более буфер, наполнитель и стабилизатор. В этом аспекте полезность поверхностно-активного вещества оценивается и выбирается в тех случаях, когда возникает проблема агрегации на стадии лиофилизации или во время восстановления. Подходящий буферный агент включен для поддержания препарата в стабильных зонах рН во время лиофилизации.

[0066] Стандартная практика восстановления для лиофилизированного материала заключается в добавлении объема чистой воды или стерильной воды для инъекций (воды д/и) (обычно эквивалентного объему, удаленному во время лиофилизации), хотя разбавленные растворы антибактериальных агентов иногда используются при производстве фармацевтических препаратов для парентеральное введение [Chen, Drug Development and Industrial Pharmacy, 18:1311-1354 (1992)]. Соответственно, предложены способы получения восстановленных рекомбинантных композиций ФфВ, включающие стадию добавления раствора для разведения к лиофилизированной рекомбинантной композиции ФфВ по изобретению.

[0067] Лиофилизированный материал может быть восстановлен в виде водного раствора. Могут быть использованы разнообразные водные носители, например, стерильная вода для инъекций, вода с консервантами для многократного использования или вода с подходящими количествами поверхностно-активных веществ (например, водная суспензия, которая содержит активное соединение в смеси с эксципиентами, подходящими для производства водных суспензии). В различных аспектах такими эксципиентами являются суспендирующие агенты, например, но не ограничиваясь этим, карбоксиметилцеллюлоза натрия, метилцеллюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза, альгинат натрия, поливинилпирролидон, трагакантовая камедь и аравийская камедь; диспергирующие или смачивающие агенты представляют собой природного происхождения фосфатид, например, но не ограничиваясь этим, лецитин, или продукты конденсации алкиленоксида с жирными кислотами, например, но не ограничиваясь этим, полиоксиэтиленстеарат, или продукты конденсации этиленоксида с алифатическими спиртами с длинной цепью например, но не ограничиваясь этим, гептадекаэтиленоксицетанол, или продукты конденсации этиленоксида с частичными эфирами, полученными из жирных кислот, и гекситом, такой как полиоксиэтиленсорбитолмоноолеат, или продукты конденсации этиленоксида с частичными эфирами, полученными из жирных кислот и гекситоловых ангидридов, например, но не ограничиваясь этим, полиэтилен сорбитанмоноолеат. В различных аспектах водные суспензии также содержат один или более консервантов, например, но не ограничиваясь этим, этил или н-пропил, п-гидроксибензоат.

[0068] В некоторых вариантах реализации изобретения композиции по данному изобретению представляют собой жидкие препараты для введения с использованием шприца или другого сосуда для хранения. В дополнительных вариантах реализации изобретения эти жидкие препараты получают из лиофилизированного материала, описанного в данном документе, восстановленного в виде водного раствора.

[0069] В дополнительном аспекте композиции по изобретению дополнительно содержат один или более фармацевтически приемлемых носителей. Фразы «фармацевтически» или «фармакологически» приемлемые относятся к молекулярным веществам и композициям, которые являются стабильными, ингибируют деградацию белка, такую как образование продуктов агрегации и распада белка, и, кроме того, не вызывают аллергических или других нежелательных явлений при введении с использованием способов, хорошо известных в данной области техники, как описано ниже. «Фармацевтически приемлемые носители» включают любые и все клинически полезные растворители, дисперсионные среды, оболочки, антибактериальные и противогрибковые агенты, изотонические и замедляющие абсорбцию агенты и тому подобное, включая агенты, описанные выше.

Производство Рекомбинантного ФфВ

[0070] Свободный зрелый рекомбинантный фактор фон Виллебранда (рФфВ) по данному изобретению может быть получен рекомбинантно. Специалисту в данной области техники будут понятны полезные способы экспрессии рекомбинантного белка в клетке-хозяине. В некоторых случаях способ включает в себя экспрессию последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей рФфВ, в клетке-хозяине, такой как клетке CHO, и культивирование полученной клетки-хозяина при определенных условиях для получения рФфВ, препро-ФфВ, про-VWF и тому подобное.

[0071] В некоторых вариантах реализации изобретения последовательность нуклеиновой кислоты, содержащая последовательность, которая кодирует ФфВ, может представлять собой вектор экспрессии. Вектор может быть доставлен вирусом или может быть плазмидой. Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая белок, может представлять собой специфичный ген или его биологически функциональную часть. В одном варианте реализации изобретения белок представляет собой, по меньшей мере, биологически активную часть ФфВ. Последовательность нуклеиновой кислоты может дополнительно содержать другие последовательности, подходящие для контролируемой экспрессии белка, такие как последовательности промотора, энхансеры, TATA-боксы, сайты инициации транскрипции, полилинкеры, сайты рестрикции, поли-A-последовательности, последовательности процессинга белка, селективные маркеры и тому подобное, которые обычно известны специалисту в данной области техники.

[0072] Широкий спектр векторов может быть использован для экспрессии ФфВ и может быть выбран из эукариотических векторов экспрессии. Примеры векторов для экспрессии у эукариот включают: (i) для экспрессии в дрожжах, векторы, такие как pAO, pPIC, pYES, pMET, с использованием промоторов, таких как AAOX1, GAP, GAL1, AUG1 и т.д.; (ii) для экспрессии в клетках насекомых, векторы, такие как pMT, pAc5, pIB, pMIB, pBAC и т.д., с использованием промоторов, таких как PH, p10, MT, Ac5, OpIE2, gp64, polh и т.д., и (iii) для экспрессии в клетках млекопитающих, векторы, такие как pSVL, pCMV, pRc/RSV, pcDNA3, pBPV и т.д., и векторы, полученные из вирусных систем, таких как вирус осповакцины, аденоассоциированные вирусы, вирусы герпеса, ретровирусы и т.д., с использованием промоторов таких как CMV, SV40, EF-1, UbC, RSV, ADV, BPV и β-актин.

[0073] В некоторых аспектах рФфВ, используемый в способах по данному изобретению, получают путем экспрессии в культуре клеток млекопитающих с использованием способов, известных в данной области. В конкретных вариантах реализации изобретения культура клеток млекопитающих содержит клетки CHO. В дополнительных вариантах реализации изобретения рФфВ коэкспрессируется с рекомбинантным Фактором VIII (рФVIII) в той же культуре. В таких вариантах реализации изобретения рФфВ и рФVIII очищают вместе (совместно очищают) или отдельно, используя способы, известные в данной области техники. В других вариантах реализации изобретения рФфВ экспрессируется в культуре, которая не содержит рФVIII.

[0074] В некоторых вариантах реализации изобретения рФфВ экспрессируется и выделяется из подходящей эукариотической системы-хозяина. Примеры эукариотических клеток включают, но не ограничиваются ими, клетки млекопитающих, такие как CHO, COS, HEK 293, BHK, SK-Hep и HepG2; клетки насекомых, например клетки SF9, клетки SF21, клетки S2 и клетки High Five; и дрожжевые клетки, например клетки Saccharomyces или Schizosaccharomyces. В одном варианте реализации изобретения ФфВ может быть экспрессирован в клетках дрожжей, клетках насекомых, клетках птиц, клетках млекопитающих и тому подобное. Например, в клеточной линии человека, клеточной линии хомяка или клеточной линии мыши. В одном конкретном варианте реализации изобретения клеточная линия представляет собой клеточную линию CHO, BHK или HEK. Как правило, клетки млекопитающих, например клетки СНО из стабильной клеточной линии, можно использовать для экспрессии ФфВ по данному изобретению. В некоторых случаях белок ФфВ экспрессируется и выделяется из системы экспрессии клеток СНО.

[0075] ФфВ может быть получен в системе культивирования клеток или в соответствии с любым способом культивирования клеток, известным специалистам в данной области техники. В некоторых вариантах реализации изобретения культуры клеток могут быть получены в больших биореакторах в условиях, подходящих для обеспечения больших объемных удельных площадей поверхности культуры для достижения высокой плотности клеток и экспрессии белка. Одним из способов обеспечения таких условий роста является использование микроносителей для культивирования клеток в биореакторах с механическим перемешиванием. Концепция роста клеток на микроносителях была впервые описана van Wezel (van Wezel, A. L., Nature 216:64-5) и позволяет прикреплять клетки на поверхности мелких твердых частиц, которые находятся во взвешенном состоянии в среде для выращивания. Эти способы обеспечивают высокое отношение поверхности к объему и, таким образом, обеспечивают эффективное использование питательных веществ. Кроме того, для экспрессии секретируемых белков в эукариотических клеточных линиях увеличенное соотношение поверхности к объему обеспечивает более высокие уровни секреции и, следовательно, более высокий выход белка в надосадочной жидкости культуры. В конечном итоге, эти способы позволяют легко увеличить масштабы экспрессии эукариотических культур.

[0076] Клетки, экспрессирующие ФфВ, могут быть связаны со сферическим или пористым микроносителем во время роста культуры клеток. Микроноситель может представлять собой микроноситель, выбранным из группы микроносителей на основе декстрана, коллагена, пластика, желатина и целлюлозы и других, как описано в Butler (1988. In: Spier & Griffiths, Animal Cell Biotechnology 3:283-303). Также возможно выращивать клетки до биомассы на сферических микроносителях и пересевать клетки, когда они достигли конечной биомассы ферментера, и до продуцирования экспрессированного белка на пористом микроносителе или наоборот. Подходящие сферические микроносители могут включать микроносители с гладкой поверхностью, такие как Cytodex™ 1, Cytodex™ 2 и Cytode™ 3 (GE Healthcare), и макропористые микроносители, такие как Cytopore™ 1, Cytopore™ 2, Cytoline™ 1, и Cytoline™ 2 (GE Healthcare).

[0077] В дополнительном варианте реализации изобретения пропептид ФфВ отщепляется от незрелого ФфВ in vitro посредством воздействия фурина на про-ФфВ. В некоторых вариантах реализации изобретения фурин, используемый для расщепления пропептида, представляет собой рекомбинантный фурин.

[0078] В некоторых вариантах реализации изобретения рФфВ экспрессируется в клетках, культивируемых в питательной среде для выращивания клеток, которые продуцируют высокомолекулярный рФфВ. Термины «раствор для культивирования клеток», «среда или питательная среда для культивирования клеток» и «надосадочная жидкость клеточной культуры» относятся к аспектам процессов культивирования клеток, обычно хорошо известным в данной области техники. В контексте данного изобретения раствор для культивирования клеток может включать среду для культивирования клеток и надосадочную жидкость клеточной культуры. Среда для культивирования клеток добавляется извне к раствору для культивирования клеток, необязательно вместе с витаминными добавками, чтобы обеспечить питательные вещества и другие компоненты для культивирования клеток, экспрессирующих ФфВ. Надосадочная жидкость клеточной культуры относится к раствору клеточной культуры, содержащему питательные вещества и другие компоненты из среды для культивирования клеток, а также продукты, высвобождаемые, метаболизируемые и/или выделяемые из клеток во время культивирования. В дополнительных вариантах реализации изобретения среда может не содержать животных белков и может быть с определенным химическим составом. Способы приготовления питательных сред не содержащих животных белков и с определенным химическим составом известны в данной области техники, например, в публикации патентов США 2006/0094104, США 2007/0212770 и США 2008/0009040, которые включены в данный документ в полном объеме посредством ссылки для всех целей, и в частности, для всех идей, касающихся сред для культивирования клеток. Термин «не содержащий белка» и родственные термины относятся к белку, который получен из экзогенного источника или отличается от белка клеток в культуре, которые естественным образом выделяют белки во время роста. В другом варианте реализации изобретения среда для культивирования не содержит полипептидов. В другом варианте реализации изобретения среда для культивирования не содержит сыворотку. В другом варианте реализации изобретения среда для культивирования не содержит животных белков. В другом варианте реализации изобретения среда для культивирования не содержит животных компонентов. В другом варианте реализации изобретения среда для культивирования содержит белок, например, животный белок из сыворотки, такой как эмбриональная телячья сыворотка. В другом варианте реализации изобретения культура содержит рекомбинантные белки, добавленные экзогенно. В другом варианте реализации изобретения белки получены от сертифицированного животного, не содержащего патогенов. Используемый в контексте данного документа термин «с определенным химическим составом» означает, что среда не содержит каких-либо неопределенных добавок, таких как, например, экстракты животных компонентов, органов, желез, растений или дрожжей. Соответственно, каждый компонент среды с определенным химическим составом точно определен. В предпочтительном варианте реализации изобретения среды не содержат животных компонентов и белков.

[0079] В некоторых вариантах реализации изобретения культура клеток, экспрессирующих ФфВ, может поддерживаться в течение по меньшей мере около 7 дней или по меньшей мере около 14 дней, 21 дня, 28 дней или по меньшей мере около 5 недель, 6 недель, 7 недель или по меньшей мере около 2 месяцев или 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 месяцев или дольше. Плотность клеток, при которой поддерживается клеточная культура для производства рекомбинантного белка ФфВ, будет зависеть от условий культивирования и среды, используемой для экспрессии белка. Специалист в данной области легко сможет определить оптимальную плотность клеток для культуры клеток, продуцирующих ФфВ. В одном варианте реализации изобретения культуру поддерживают при плотности клеток от около 0,5х10⁶ до 4х10⁷ клеток/мл в течение длительного периода времени. В других вариантах реализации изобретения плотность клеток поддерживается при концентрации от около 1,0х10⁶ до около 1,0х10⁷ клеток/мл в течение длительного периода времени. В других вариантах реализации изобретения плотность клеток поддерживается при концентрации от около 1,0х10⁶ до около 4,0х10⁶ клеток/мл в течение длительного периода времени. В других вариантах реализации изобретения плотность клеток поддерживается при концентрации от около 1,0х10⁶ до около 4,0х10⁶ клеток/мл в течение длительного периода времени. В еще других вариантах реализации изобретения плотность клеток может поддерживаться при концентрации от около 2,0х10⁶ до около 4,0х10⁶, или от около 1,0х10⁶ до около 2,5х10⁶, или от около 1,5х10⁶ до около 3,5х10⁶, или в любом другом подобном диапазоне, в течение длительного периода времени. После соответствующего времени в клеточной культуре, рФфВ может быть выделен из системы экспрессии с использованием способов, известных в данной области техники.

[0080] В конкретном варианте реализации изобретения плотность клеток в стабильной клеточной культуре для продуцирования рФфВ поддерживается при концентрации не более 2,5×10⁶ клеток/мл в течение длительного периода. В других конкретных вариантах реализации изобретения плотность клеток поддерживается на уровне не более 2,0×10⁶ клеток/мл, 1,5×10⁶ клеток/мл, 1,0×10⁶ клеток/мл, 0,5×10⁶ клеток/мл или менее. В одном варианте реализации изобретения плотность клеток поддерживается на уровне от 1,5×10⁶ клеток/мл до 2,5×10⁶ клеток/мл.

[0081] В одном варианте реализации культур клеток, описанных выше, раствор для культивирования клеток содержит добавку к питательной среде, содержащую медь. Такие растворы для культивирования клеток описаны, например, в патенте США № 8852888 и патенте США № 9409971, которая включена в данный документ в полном объеме посредством ссылки для всех целей и, в частности, для всех идей, относящихся к способам культивирования клеток и композициям для получения рекомбинантного ФфВ.

[0082] Полинуклеотидная и аминокислотная последовательности препро-ФфВ представлены в SEQ ID NO:1 и SEQ ID NO:2 соответственно и доступны по номерам доступа GenBank NM_000552 (Homo sapiens von Willebrand factor (VWF) mRNA) и NP_000543, соответственно. Аминокислотная последовательность, соответствующая зрелому белку ФфВ, представлена в SEQ ID NO: 3 (соответствует аминокислотам 764-2813 аминокислотной последовательности полноразмерного препро-ФфВ). В некоторых вариантах реализации изобретения ФфВ имеет, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 95%, по меньшей мере, 96%, по меньшей мере, 97%, по меньшей мере, 98%, по меньшей мере, 99% или, по меньшей мере, 100% идентичности относительно последовательности SEQ ID NO:3. В некоторых вариантах реализации изобретения рФфВ согласно изобретению имеет, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 95%, по меньшей мере, 96%, по меньшей мере, 97%, по меньшей мере, 98%, по меньшей мере, 99% или, по меньшей мере, 100% идентичности относительно последовательности SEQ ID NO:3. См., например, патент США № 8597910, публикацию патента США № 2016/0129090, а также Фиг. 6.

[0083] Одна форма полезного рФфВ обладает, по меньшей мере, свойством in vivo-стабилизации, например, может связывать, по меньшей мере, одну молекулу Фактора VIII (ФVIII) и, необязательно, имеет профиль гликозилирования, который является фармакологически приемлемым. Его конкретные примеры включают ФфВ без домена A2, таким образом, устойчивый к протеолизу (Lankhof et al., Thromb. Haemost. 77: 1008-1013, 1997) и фрагмент ффВ от Val 449 до Asn 730, включающий гликопротеин-lb-связывающий домен и сайты связывания для коллагена и гепарина (Pietu et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 164: 1339-1347, 1989). Определение способности ФфВ стабилизировать, по меньшей мере, одну молекулу ФVIII, в одном аспекте, проводят у млекопитающих с дефицитом ФфВ в соответствии со способами, известными в данной области техники.

[0084] РффВ по данному изобретению может быть получен любым способом, известным в данной области техники. Один конкретный пример раскрыт в WO 86/06096, опубликованном 23 октября 1986 г., и в заявке на патент США № 07/559509, поданной 23 июля 1990 г., которая включена в данный документ посредством ссылки в отношении способов получения рекомбинантного ФфВ. Таким образом, в данной области техники известны способы (i) получения рекомбинантной ДНК с помощью генной инженерии, например посредством обратной транскрипции РНК и/или амплификации ДНК, (ii) введения рекомбинантной ДНК в прокариотические или эукариотические клетки путем трансфекции, например, посредством электропорации или микроинъекции, (iii) культивирования трансформированных клеток, например, стабильное или периодическое, (iv) экспрессии ФфВ, например, конститутивно или при индукции, и (v) выделение ФфВ, например, из культуральной среды или путем сбора трансформированных клеток для получения (vi) очищенного рФфВ, например, с помощью анионообменной хроматографии или аффинной хроматографии. В одном аспекте рекомбинантный ФфВ получают в трансформированных клетках-хозяевах с использованием способов рекомбинантной ДНК, хорошо известных в данной области техники. Например, последовательности, кодирующие полипептид, могут быть вырезаны из ДНК с использованием подходящих рестрикционных ферментов. Альтернативно, молекула ДНК, в другом аспекте, синтезируется с использованием способов химического синтеза, таких как фосфорамидитный способ. Кроме того, в еще одном аспекте, используется комбинация этих подходов.

[0085] Изобретение также предоставляет векторы, кодирующие полипептиды по изобретению в соответствующем хозяине. Вектор содержит полинуклеотид, который кодирует полипептид, функционально связанный с соответствующими последовательностями контроля экспрессии. Способы осуществления этого оперативного связывания либо до, либо после того, как полинуклеотид вставлен в вектор, хорошо известны. Последовательности контроля экспрессии включают в себя промоторы, активаторы, энхансеры, операторы, сайты связывания рибосом, старт-сигналы, стоп-сигналы, кап-сигналы, сигналы полиаденилирования и другие сигналы, связанные с контролем транскрипции или трансляции. Полученный вектор, содержащий полинуклеотид, используется для трансформации подходящего хозяина. Эта трансформация может быть выполнено с использованием способов, хорошо известных в данной области техники.

[0086] Любые из большого количества доступных и хорошо известных клеток-хозяев используются в практике данного изобретения. Выбор конкретного хозяина зависит от ряда факторов, признанных в данной области техники, включая, например, совместимость с выбранным вектором экспрессии, токсичность пептидов, кодируемых молекулой ДНК, скорость трансформации, легкость восстановления пептидов, характеристики экспрессии, биобезопасность и стоимость. Баланс этих факторов должен быть достигнут при понимании того, что не все клетки-хозяева одинаково эффективны для экспрессии определенной последовательности ДНК. В рамках этих общих руководящих принципов полезные клетки-хозяева микроорганизмов включают, но не ограничиваются ими, клетки бактерий, дрожжей и других грибов, клетки насекомых, растений, клетки млекопитающих (включая человека) в культуре или других хозяев, известных в данной области техники.

[0087] Трансформированные клетки-хозяева культивируют в обычных условиях ферментации, таким образом экспрессируются желаемые соединения. Такие условия ферментации хорошо известны в данной области техники. В конце, полипептиды очищают от культуральной среды или самих клеток-хозяев способами, хорошо известными в данной области техники.

[0088] В зависимости от клетки-хозяина, используемой для экспрессии соединения по изобретению, углеводные (олигосахаридные) группы необязательно присоединяются к сайтам, которые, как известно, являются сайтами гликозилирования в белках. Как правило, O-связанные олигосахариды присоединяются к остаткам серина (Ser) или треонина (Thr), тогда как N-связанные олигосахариды присоединяются к остаткам аспарагина (Asn), когда они являются частью последовательности Asn-X-Ser/Thr, где X может быть любой аминокислотой, кроме пролина. Х предпочтительно представляет собой одну из 19 встречающихся в природе аминокислот, не считая пролина. Структуры N-связанных и O-связанных олигосахаридов и остатков сахара, обнаруженных в каждом типе, различны. Одним типом сахара, который обычно встречается как на N-связанных, так и на O-связанных олигосахаридах, является N-ацетилнейраминовая кислота (называемая сиаловой кислотой). Сиаловая кислота обычно является концевым остатком как N-связанных, так и O-связанных олигосахаридов и, в силу своего отрицательного заряда, в одном аспекте, придает кислотные свойства гликозилированному соединению. Такие сайты могут быть включены в линкер соединений по данному изобретению и предпочтительно гликозилированы клеткой во время рекомбинантной продукции полипептидных соединений (например, в клетках млекопитающих, таких как CHO, BHK, COS). В других аспектах, такие сайты гликозилируются с помощью синтетических или полусинтетических процедур, известных в данной области техники.

[0089] В некоторых вариантах реализации изобретения сиализацию (также называемую сиалилированием) можно проводить на колонке как часть процедур очистки, описанных в данном документе (включая способы анионного обмена, катионного обмена, эксклюзионную хроматографию по размеру и/или иммуноаффинную хроматографию). В некоторых вариантах реализации изобретения сиалилирование приводит к повышенной стабильности рФфВ по сравнению с рФфВ, который не подвергался сиалилированию. В некоторых вариантах реализации изобретения сиалилирование приводит к повышенной стабильности рФфВ в кровотоке (например, после введения субъекту) по сравнению с рФфВ, который не подвергался сиалилированию. В некоторых вариантах реализации изобретения повышенная стабильность сиалилированного рФфВ приводит к увеличению на 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или более по сравнению с рФфВ, который не подвергался сиалилированию. В некоторых вариантах реализации изобретения сиалилирование приводит к увеличению периода полувыведения для рФфВ по сравнению с рФфВ, который не подвергался сиалилированию. В некоторых вариантах реализации изобретения сиалилирование приводит к увеличению периода полувыведения рФфВ в кровотоке (например, после введения субъекту) по сравнению с рФфВ, который не подвергался сиалилированию. В некоторых вариантах реализации изобретения увеличенный период полувыведения сиалилированного рФфВ приводит к увеличению на 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или более по сравнению с рФфВ, который не подвергался сиалилированию. В некоторых вариантах реализации изобретения увеличенный период полувыведения сиалилированного рФфВ приводит к рФфВ, который стабилен в кровотоке в течение 1 часа, 2 часов, 3 часов, 4 часов, 6 часов, 12 часов, 24 часов или более (например, после введения субъекту) по сравнению с рФфВ, который не подвергался сиалилированию. В некоторых вариантах сиалилирование увеличивает количество 2,3-сиалилирования и/или 2,6-сиалилирования. В некоторых вариантах реализации изобретения сиалилирование усиливают добавлением 2,3-сиалилтрансферазы и/или 2,6-сиалилтрансферазы и CMP-NANA (натриевой соли цитидин-5'-монофосфо-N-ацетилнейраминовой кислоты) в качестве дополнительной стадии обработки буфером. В некоторых вариантах реализации изобретения сиалилирование усиливают добавлением 2,3-сиалилтрансферазы и CMP-NANA (натриевой соли цитидин-5'-монофосфо-N-ацетилнейраминовой кислоты) в качестве дополнительной стадии обработки буфером. В некоторых вариантах реализации изобретения 2,3-сиалилирование усиливают добавлением 2,3-сиалилтрансферазы и CMP-NANA (натриевой соли цитидин-5'-монофосфо-N-ацетилнейраминовой кислоты) в качестве дополнительной стадии обработки буфером.

[0090] В некоторых вариантах реализации изобретения 2,6-сиалилирование усиливают добавлением 2,6-сиалилтрансферазы и CMP-NANA (натриевой соли цитидин-5'-монофосфо-N-ацетилнейраминовой кислоты) в качестве дополнительной стадии обработки буфером. В некоторых вариантах реализации изобретения 2,3-сиалилирование и/или 2,6-сиалилирование усиливают добавлением 2,3-сиалилтрансферазы и/или 2,6-сиалилтрансферазы и CMP-NANA (натриевой соли цитидин-5'-монофосфо-N-ацетилнейраминовой кислоты) в качестве дополнительной стадии обработки буфером. В некоторых вариантах реализации изобретения CMP-NANA химически или ферментативно модифицирован для переноса модифицированной сиаловой кислоты в потенциально свободное положение. В некоторых вариантах реализации изобретения сиалилирование выполняют путем нанесения рФфВ на смолу, промывания одним или несколькими буферами, как описано в данном документе, для удаления нежелательных примесей, применения одного или нескольких буферов, содержащих сиалилтрансферазу и CMP-NANA, в условиях, которые допускают дополнительное сиалилирование, и промывания одним или более буферов для истощения избытка реагентов сиалилирования, и элюирования одним или несколькими буферами улучшенного рФфВ (например, рФфВ с увеличенным сиалилированием). В некоторых вариантах реализации изобретения процесс сиалилирования выполняют как часть способа катионного обмена, способа анионного обмена, способа эксклюзионной хроматографии по размеру или способа иммуноаффинной очистки, как описано в данном документе.

[0091] Альтернативно, соединения получают синтетическими способами, используя, например, способы твердофазного синтеза. Подходящие способы хорошо известны в данной области техники и включают способы, описанные в Merrifield (1973), Chem. Polypeptides, pp. 335-61 (Katsoyannis and Panayotis eds.); Merrifield (1963), J. Am. Chem. Soc. 85: 2149; Davis et al. (1985), Biochem. Intl. 10: 394-414; Stewart and Young (1969), Solid Phase Peptide Synthesis; патент США № 3941763; Finn et al. (1976), The Proteins (3rd ed.) 2: 105-253; и Erickson et al. (1976), The Proteins (3rd ed.) 2: 257-527 '. Твердофазный синтез является предпочтительным способом получения отдельных пептидов, поскольку он является наиболее экономически эффективным способом получения небольших пептидов.

[0092] Фрагменты, варианты и аналоги ФфВ могут быть получены в соответствии со способами, хорошо известными в данной области техники. Фрагменты полипептида могут быть получены с использованием, но не ограничиваясь этим, ферментативного расщепления (например, трипсина, химотрипсина), а также с использованием рекомбинантных средств для получения полипептидных фрагментов, имеющих специфическую аминокислотную последовательность. Могут быть получены полипептидные фрагменты, содержащие область белка, обладающую определенной активностью, такую как домен мультимеризации или любой другой идентифицируемый домен ффВ, известный в данной области техники.

[0093] Способы получения аналогов полипептидов также хорошо известны. Аналоги аминокислотной последовательности полипептида могут быть аналогами замены, инсерции, добавления или делеции. Аналоги делеции, включая фрагменты полипептида, лишены одного или нескольких остатков нативного белка, которые не являются необходимыми для функциональной или иммуногенной активности. Аналоги инсерции включают добавление, например, аминокислот(ты) в неконцевой точке в полипептиде. Этот аналог может включать, например и не ограниваясь этим, инсерцию иммунореактивного эпитопа или просто одного остатка. Аналоги добавления, включая фрагменты полипептида, включают добавление одной или более аминокислот на одном или обоих концах белка и включают, например, слитые белки. Комбинации вышеупомянутых аналогов также рассматриваются.

[0094] Аналоги замены обычно меняют одну аминокислоту дикого типа на другую в одном или нескольких сайтах белка и могут быть предназначены для модуляции одного или нескольких свойств полипептида без полной потери других функций или свойств. В одном аспекте, замены представляют собой консервативные замены. «Консервативная аминокислотная замена» представляет собой замену аминокислоты аминокислотой, имеющей боковую цепь или подобный химический характер. Подобные аминокислоты для проведения консервативных замен включают аминокислоты, имеющие кислую боковую цепь (глутаминовую кислоту, аспарагиновую кислоту); основную боковую цепь (аргинин, лизин, гистидин); полярную амидную боковая цепь (глутамин, аспарагин); гидрофобную алифатическую боковую цепь (лейцин, изолейцин, валин, аланин, глицин); ароматическую боковую цепь (фенилаланин, триптофан, тирозин); маленькую боковую цепь (глицин, аланин, серин, треонин, метионин); или алифатическую гидроксильную боковую цепь (серин, треонин).

[0095] В одном аспекте аналоги являются в основном гомологичными или в основном идентичными рекомбинантному ФфВ, из которого они получены. Аналоги включают те, которые сохраняют, по меньшей мере, некоторую биологическую активность полипептида дикого типа, например активность свертывания крови.

[0096] Рассматриваемые варианты полипептидов включают, но не ограничиваются ими, полипептиды, химически модифицированные такими способами, как убиквитинирование, гликозилирование, включая полисиалирование (или полисиалилирование), конъюгацию с терапевтическими или диагностическими агентами, введение метки, присоединение ковалентного полимера, такое как пегилирование (дериватизация с полиэтиленгликолем), введение неподдающихся гидролизу связей, и инсерцию или замену химическим синтезом аминокислот, таких как орнитин, которые обычно не встречаются в белках человека. Варианты сохраняют одинаковые или в основном одинаковые связывающие свойства немодифицированных молекул по данному изобретению. Такая химическая модификация может включать прямое или косвенное (например, через линкер) присоединение агента к полипептиду ФфВ. В случае непрямого присоединения предполагается, что линкер может быть гидролизуемым или негидролизуемым.

[0097] Получение аналогов пегилированного полипептида в одном аспекте включает стадии (а) взаимодействия полипептида с полиэтиленгликолем (таким как реакционноспособный сложный эфир или производное альдегида ПЭГ) в условиях, при которых полипептид связывающей конструкции становится связанным с одной или более группами ПЭГ, и (b) получение продукта(ов) реакции. Как правило, оптимальные условия реакции ацилирования определяются на основе известных параметров и желаемого результата. Например, чем больше соотношение ПЭГ: белок, тем больше процентное содержание полипегилированного продукта. В некоторых вариантах реализации изобретения связывающая конструкция имеет один фрагмент ПЭГ на N-конце. Полиэтиленгликоль (ПЭГ) может быть присоединен к фактору свертывания крови, чтобы, например, обеспечить более длительный период полувыведения in vivo. Группа ПЭГ может иметь любую подходящую молекулярную массу и быть линейной или разветвленной. Средняя молекулярная масса ПЭГ составляет от около 2 килоДальтон («кДа») до около 100 кДа, от около 5 кДа до около 50 кДа или от около 5 кДа до около 10 кДа. В некоторых аспектах группы ПЭГ присоединяются к фактору свертывания крови посредством ацилирования или восстановительного алкилирования через природную или сконструированную функциональную группу в фрагменте ПЭГ (например, альдегидную, амино, тиольную или сложноэфирную группу) с функциональной группой в факторе свертывания крови (например, альдегидной, амино- или сложноэфирной группой) или посредством любого другого способа, известного в данной области техники.

[0098] Способы получения полисиалилированного полипептида описаны в публикации патента США 20060160948, Fernandes et Gregoriadis; Biochim. Biophys. Acta 1341: 26-34, 1997, и Saenko et al., Haemophilia 12:42-51, 2006. Вкратце, раствор коломиновой кислоты (КК), содержащий 0,1 М NaIO₄, перемешивают в темноте при комнатной температуре для окисления КК. Активированный раствор КК диализируют, например, 0,05 М натрий-фосфатным буфером, рН 7,2 в темноте, и этот раствор добавляют к раствору рФфВ и инкубируют в течение 18 ч при комнатной температуре в темноте при осторожном встряхивании. Свободные реагенты необязательно отделяют от конъюгата рФфВ-полисиаловой кислоты, например, ультрафильтрацией/диафильтрацией. Конъюгация рФфВ с полисиаловой кислотой достигается с использованием глутаральдегида в качестве сшивающего реагента (Migneault et al., Biotechniques 37: 790-796, 2004).

[0099] Также предполагается, что в другом аспекте полипептиды пре-ФфВ и про-ФфВ обеспечат терапевтическое преимущество в композициях по настоящему данному изобретению. Например, в патенте США № 7005502 описан фармацевтический препарат, содержащий значительные количества про-ФфВ, который индуцирует образование тромбина in vitro. В дополнение к рекомбинантным, биологически активным фрагментам, вариантам или другим аналогам встречающегося в природе зрелого ФфВ данное изобретение предусматривает использование рекомбинантных биологически активных фрагментов, вариантов или аналогов препро-ФфВ (изложенных в SEQ ID NO:2) или про-ФфВ полипептидов (аминокислотные остатки с 23 по 764 SEQ ID NO:2) в препаратах, описанных в данном документе.

[00100] Полинуклеотиды, кодирующие фрагменты, варианты и аналоги, могут быть легко получены специалистом в данной области техники для кодирования биологически активных фрагментов, вариантов или аналогов встречающейся в природе молекулы, которые обладают такой же или сходной биологической активностью, что и встречающаяся в природе молекула. В различных аспектах эти полинуклеотиды получают с использованием способов ПЦР, ферментативного расщепления/лигирования молекулы, кодирующей ДНК, и тому подобного. Таким образом, специалист в данной области техники сможет генерировать единичные базовые изменения в цепи ДНК, чтобы привести к измененному кодону и миссенс-мутации, используя любой способ, известный в данной области техники, включая, но не ограничиваясь им, сайт-специфический мутагенез. Используемое в контексте данного документа выражение «умеренно жесткие условия гибридизации» означает, например, гибридизацию при 42°С в 50% формамиде и промывание при 60°С в 0,1 × SSC, 0,1% SDS. Специалистам в данной области технике понятно, что изменение в этих условиях происходит в зависимости от длины и содержания нуклеотидного основания GC в последовательностях, которые должны быть гибридизованы. Стандартные формулы в данной области техники подходят для определения точных условий гибридизации. См. Sambrook et al., 9.47-9.51 in Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989).

ФфВ Mультимеры

[0070] Оценка количества и процентного содержания мультимеров рФфВ может проводиться с использованием способов, известных в данной области техники, включая, но не ограничиваясь ими, способы с использованием электрофореза и эксклюзионной хроматографии для разделения мультимеров ФфВ по размеру, например, как обсуждалось Cumming et al., (J Clin Pathol., 1993 May; 46(5): 470-473, которая включена в данный документ в полном объеме посредством ссылки для всех целей и, в частности, для всех идей, связанных с оценкой мультимеров ФфВ). Такие подходы могут дополнительно включать способы иммуноблоттинга (такие как Вестерн-Блот), в которых гель иммуноблоттируется с радиоактивно меченным антителом против ФфВ с последующим хемилюминесцентным детектированием (см., например, Wen et al., J. Clin. Lab. Anal., 1993, 7: 317-323, которая включена в данный документ в полном объеме посредством ссылки для всех целей и, в частности, для всех идей, связанных с оценкой мультимеров ФфВ). Дополнительные анализы для ФфВ включают анализ Антигена ФфВ (ФфВ:Аг), Ристоцетин-Кофакторной активности ФфВ (ФфВ:РКо) и Коллаген-Связывающей Активности ФфВ (ФфВ:КСА), которые часто используются для диагностики и классификации болезни фон Виллебранда. (см., например, Favaloro et al., Pathology, 1997, 29(4): 341-456; Sadler, JE, Annu Rev Biochem, 1998, 67:395-424; и Turecek et al., Semin Thromb Hemost, 2010, 36:510-521, которые включены в данный документ в полном объеме посредством ссылки для всех целей и, в частности, для всех идей, связанных с оценкой мультимеров ФфВ). В некоторых вариантах реализации изобретения рФфВ, полученный с использованием данных способов, включает в себя любой паттерн мультимера, присутствующий в загружаемом образце рФфВ. В некоторых вариантах реализации изобретения рФфВ, полученный с использованием данных способов, включает физиологически встречающиеся паттерны мультимеров, а также паттерны ультрабольших ФфВ-мультимеров.

Исследования ФфВ

[0071] При первичном гемостазе ФфВ служит мостиком между тромбоцитами и специфическими компонентами внеклеточного матрикса, такими как коллаген. Биологическая активность ФфВ в этом процессе может быть измерена с помощью различных исследований in vitro (Turecek et al., Semin Thromb Hemost, 2010, 36: 510-521).

[0072] Анализ Ристоцетин-кофакторной активности ФфВ (ФфВ:РКо) основан на агглютинации свежих или фиксированных формалином тромбоцитов, индуцированной антибиотиком ристоцетином в присутствии ФфВ. Степень агглютинации тромбоцитов зависит от концентрации ФфВ и может быть измерена турбидиметрическим способом, например, с использованием агрегометра (Weiss et al., J. Clin. Invest., 1973, 52: 2708-2716; Macfarlane et al., Thromb. Diath. Haemorrh., 1975, 34: 306-308). В соответствии с данным документом, специфическая Ристоцетин-Кофакторная активность ФфВ (ФфВ:РКо) по данному изобретению, как правило, описывается в единицах мЕд/мкг ФфВ, измеренных с использованием анализов in vitro.

[0073] В некоторых вариантах реализации изобретения рФфВ, очищенный в соответствии со способами по данному изобретению обладает специфической активностью, по меньшей мере, около 20, 22,5, 25, 27,5, 30, 32,5, 35, 37,5, 40, 42,5, 45, 47,5, 50, 52,5, 55, 57,5, 60. , 62,5, 65, 67,5, 70, 72,5, 75, 77,5, 80, 82,5, 85, 87,5, 90, 92,5, 95, 97,5, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150 или более мЕд/мкг. В некоторых вариантах реализации изобретения рФфВ, используемый в описанных в данном документе способах, обладает специфической активностью от 20 мЕд/мкг до 150 мЕд/мкг. В некоторых вариантах реализации изобретения рФфВ обладает специфической активностью от 30 мЕд/мкг до 120 мЕд/мкг. В некоторых вариантах реализации изобретения рФфВ обладает специфической активностью от 40 мЕд/мкг до 90 мЕд/мкг. В некоторых вариантах реализации изобретения рФфВ обладает специфической активностью, выбранной из вариаций от 1 до 133, приведенных ниже в Таблице 3.

Таблица 3. Типовые варианты реализации изобретения по специфической активности рФфВ обнаруженной в композициях и использованной в способах, представленных в данном документе

(мЕд
/мкг) (мЕд/
мкг) (мЕд/
мкг) (мЕд/
мкг) 20 Вар. 1 110 Вар. 35 40-150 Вар. 68 70-120 Вар. 101 22,5 Вар. 2 115 Вар. 36 40-140 Вар. 69 70-110 Вар. 102 25 Вар. 3 120 Вар. 37 40-130 Вар. 70 70-100 Вар. 103 27,5 Вар. 4 125 Вар. 38 40-120 Вар. 71 70-90 Вар. 104 30 Вар. 5 130 Вар. 39 40-110 Вар. 72 70-80 Вар. 105 32,5 Вар. 6 135 Вар. 40 40-100 Вар. 73 80-150 Вар. 106 35 Вар. 7 140 Вар. 41 40-90 Вар. 74 80-140 Вар. 107 37,5 Вар. 8 145 Вар. 42 40-80 Вар. 75 80-130 Вар. 108 40 Вар. 9 150 Вар. 43 40-70 Вар. 76 80-120 Вар. 109 42,5 Вар. 10 20-150 Вар. 44 40-60 Вар. 77 80-110 Вар. 110 45 Вар. 11 20-140 Вар. 45 40-50 Вар. 78 80-100 Вар. 111 47,5 Вар. 12 20-130 Вар. 46 50-150 Вар. 79 80-90 Вар. 112 50 Вар. 13 20-120 Вар. 47 50-140 Вар. 80 90-150 Вар. 113 52,5 Вар. 14 20-110 Вар. 48 50-130 Вар. 81 90-140 Вар. 114 55 Вар. 15 20-100 Вар. 49 50-120 Вар. 82 90-130 Вар. 115 57,5 Вар. 16 20-90 Вар. 50 50-110 Вар. 83 90-120 Вар. 116 60 Вар. 17 20-80 Вар. 51 50-100 Вар. 84 90-110 Вар. 117 62,5 Вар. 18 20-70 Вар. 52 50-90 Вар. 85 90-100 Вар. 118 65 Вар. 19 20-60 Вар. 53 50-80 Вар. 86 100-150 Вар. 119 67,5 Вар. 20 20-50 Вар. 54 50-70 Вар. 87 100-140 Вар. 120 70 Вар. 21 20-40 Вар. 55 50-60 Вар. 88 100-130 Вар. 121 72,5 Вар. 22 30-150 Вар. 56 60-150 Вар. 89 100-120 Вар. 122 75 Вар. 23 30-140 Вар. 57 60-140 Вар. 90 100-110 Вар. 123 77,5 Вар. 24 30-130 Вар. 58 60-130 Вар. 91 110-150 Вар. 124 80 Вар. 25 30-120 Вар. 59 60-120 Вар. 92 110-140 Вар. 125 82,5 Вар. 26 30-110 Вар. 60 60-110 Вар. 93 110-130 Вар. 126 85 Вар. 27 30-100 Вар. 61 60-100 Вар. 94 110-120 Вар. 127 87,5 Вар. 28 30-90 Вар. 62 60-90 Вар. 95 120-150 Вар. 128 90 Вар. 29 30-80 Вар. 63 60-80 Вар. 96 120-140 Вар. 129 92,5 Вар. 30 30-70 Вар. 64 60-70 Вар. 97 120-130 Вар. 130 95 Вар. 31 30-60 Вар. 65 70-150 Вар. 98 130-150 Вар. 131 97,5 Вар. 32 30-50 Вар. 66 70-140 Вар. 99 130-140 Вар. 132 100 Вар. 33 30-40 Вар. 67 70-130 Вар. 100 140-150 Вар. 133 105 Вар. 34

Вар. = Вариация.

[0074] РФфВ по данному изобретению является высоко мультимерным, включающим от около 10 до около 40 субъединиц. В дополнительных вариантах реализации изобретения мультимерный рФфВ, полученный с использованием способов согласно данному изобретению, содержит около 10-30, 12-28, 14-26, 16-24, 18-22, 20-21 субъединиц. В некоторых вариантах реализации изобретения рФфВ присутствует в мультимерах, различающихся по размеру от димеров до мультимеров из более чем 40 субъединиц (>10 миллионов Дальтон). Самые большие мультимеры обеспечивают множество сайтов связывания, которые могут взаимодействовать как с рецепторами тромбоцитов, так и с сайтами повреждения субэндотелиального матрикса, и являются наиболее гемостатически активной формой ФфВ. В некоторых вариантах реализации изобретения рФфВ по данному изобретению содержит ультрабольшие мультимеры (УБМ). В целом, как правило, высокомолекулярные и ультрабольшие мультимеры считаются наиболее эффективными в гемостатическом отношении (см., например, Turecek, P., Hämostaseologie, (Vol. 37): Supplement 1, pages S15-S25 (2017)). В некоторых вариантах реализации изобретения рФфВ составляет от 500 кДа до 20,000 кДа. В некоторых вариантах реализации изобретения любой желаемый паттерн мультимера может быть получен с использованием описанных способов. В некоторых вариантах реализации изобретения, когда используются способы анионного обмена и/или катионного обмена, рН, проводимость и/или противоионная концентрация буферов на одной или более стадии(ях) промывки или градиентных буферов могут быть изменены для получения желаемого паттерна мультимера. В некоторых вариантах реализации изобретения затем применяют способы эксклюзионной хроматографии по размеру, критерии сбора могут быть использованы для получения желаемого паттерна мультимера. В некоторых вариантах реализации изобретения описанный паттерн мультимеров содержит ультрабольшие мультимеры. В некоторых вариантах реализации изобретения ультрабольшие мультимеры составляют по меньшей мере 10,000 кДа, по меньшей мере 11,000 кДа, по меньшей мере 12,000 кДа, по меньшей мере 13,000 кДа, по меньшей мере 14,000 кДа, по меньшей мере 15,000 кДа, по меньшей мере 16,000 кДа, по меньшей мере 17,000 кДа, по меньшей мере 18,000 кДа, по меньшей мере 19,000 кДа, по меньшей мере 20,000 кДа. В некоторых вариантах реализации изобретения ультрабольшие мультимеры составляют от 10,000 кДа до 20,000 кДа. В некоторых вариантах реализации изобретения ультрабольшие мультимеры составляют от 11,000 кДа до 20,000 кДа. В некоторых вариантах реализации изобретения ультрабольшие мультимеры составляют от 12,000 кДа до 20,000 кДа. В некоторых вариантах реализации изобретения ультрабольшие мультимеры составляют от 13,000 кДа до 20,000 кДа. В некоторых вариантах реализации изобретения ультрабольшие мультимеры составляют от 14,000 кДа до 20,000 кДа. В некоторых вариантах реализации изобретения ультрабольшие мультимеры составляют от 15,000 кДа до 20,000 кДа. В некоторых вариантах реализации изобретения ультрабольшие мультимеры составляют от 16,000 кДа до 20,000 кДа. В некоторых вариантах реализации изобретения ультрабольшие мультимеры составляют от 17,000 кДа до 20,000 кДа. В некоторых вариантах реализации изобретения ультрабольшие мультимеры составляют от 18,000 кДа до 20,000 кДа. В некоторых вариантах реализации изобретения ультрабольшие мультимеры составляют от 19,000 кДа до 20,000 кДа. В некоторых вариантах реализации изобретения рФфВ, полученный с использованием данных способов, включает в себя любой паттерн мультимера, присутствующий в загружаемом образце рФфВ. В некоторых вариантах реализации изобретения рФфВ, полученный с использованием данных способов, включает физиологически встречающиеся паттерны мультимеров, а также паттерны ультрабольших ФфВ-мультимеров.

[0075] В некоторых вариантах реализации изобретения композиция рФфВ, полученная описанным в данном документе способом очистки, имеет распределение олигомеров рФфВ, характеризующееся тем, что 95% олигомеров имеют от 6 субъединиц до 20 субъединиц. В некоторых вариантах реализации изобретения композиция рФфВ имеет распределение олигомеров rVWF, характеризующееся тем, что 95% олигомеров имеют диапазон субъединиц, выбранный из вариаций 458-641, приведенных в Таблице 4.

Таблица 4. Типовые варианты реализации изобретения по распределению олигомеров рФфВ обнаруженных в композициях и использованных в способах, представленных в данном документе

Субъединицы Субъединицы Субъединицы Субъединицы 2-40 Вар. 458 6-16 Вар. 504 12-20 Вар. 550 20-28 Вар. 596 2-38 Вар. 459 6-14 Вар. 505 12-18 Вар. 551 20-26 Вар. 597 2-36 Вар. 460 6-12 Вар. 506 12-16 Вар. 552 20-24 Вар. 598 2-34 Вар. 461 6-10 Вар. 507 12-14 Вар. 553 20-22 Вар. 599 2-32 Вар. 462 6-8 Вар. 508 14-40 Вар. 554 22-40 Вар. 600 2-30 Вар. 463 8-40 Вар. 509 14-38 Вар. 555 22-38 Вар. 601 2-28 Вар. 464 8-38 Вар. 510 14-36 Вар. 556 22-36 Вар. 602 2-26 Вар. 465 8-36 Вар. 511 14-34 Вар. 557 22-34 Вар. 603 2-24 Вар. 466 8-34 Вар. 512 14-32 Вар. 558 22-32 Вар. 604 2-22 Вар. 467 8-32 Вар. 513 14-30 Вар. 559 22-30 Вар. 605 2-20 Вар. 468 8-30 Вар. 514 14-28 Вар. 560 22-28 Вар. 606 2-18 Вар. 469 8-28 Вар. 515 14-26 Вар. 561 22-26 Вар. 607 2-16 Вар. 470 8-26 Вар. 516 14-24 Вар. 562 22-24 Вар. 608 2-14 Вар. 471 8-24 Вар. 517 14-22 Вар. 563 24-40 Вар. 609 2-12 Вар. 472 8-22 Вар. 518 14-20 Вар. 564 24-38 Вар. 610 2-10 Вар. 473 8-20 Вар. 519 14-18 Вар. 565 24-36 Вар. 611 2-8 Вар. 474 8-18 Вар. 520 14-16 Вар. 566 24-34 Вар. 612 4-40 Вар. 475 8-16 Вар. 521 16-40 Вар. 567 24-32 Вар. 613 4-38 Вар. 476 8-14 Вар. 522 16-38 Вар. 568 24-30 Вар. 614 4-36 Вар. 477 8-12 Вар. 523 16-36 Вар. 569 24-28 Вар. 615 4-34 Вар. 478 8-10 Вар. 524 16-34 Вар. 570 24-26 Вар. 616 4-32 Вар. 479 10-40 Вар. 525 16-32 Вар. 571 26-40 Вар. 617 4-30 Вар. 480 10-38 Вар. 526 16-30 Вар. 572 26-38 Вар. 618 4-28 Вар. 481 10-36 Вар. 527 16-28 Вар. 573 26-36 Вар. 619 4-26 Вар. 482 10-34 Вар. 528 16-26 Вар. 574 26-34 Вар. 620 4-24 Вар. 483 10-32 Вар. 529 16-24 Вар. 575 26-32 Вар. 621 4-22 Вар. 484 10-30 Вар. 530 16-22 Вар. 576 26-30 Вар. 622 4-20 Вар. 485 10-28 Вар. 531 16-20 Вар. 577 26-28 Вар. 623 4-18 Вар. 486 10-26 Вар. 532 16-18 Вар. 578 28-40 Вар. 624 4-16 Вар. 487 10-24 Вар. 533 18-40 Вар. 579 28-38 Вар. 625 4-14 Вар. 488 10-22 Вар. 534 18-38 Вар. 580 28-36 Вар. 626 4-12 Вар. 489 10-20 Вар. 535 18-36 Вар. 581 28-34 Вар. 627 4-10 Вар. 490 10-18 Вар. 536 18-34 Вар. 582 28-32 Вар. 628 4-8 Вар. 491 10-16 Вар. 537 18-32 Вар. 583 28-30 Вар. 629 6-40 Вар. 492 10-14 Вар. 538 18-30 Вар. 584 30-40 Вар. 630 6-38 Вар. 493 10-12 Вар. 539 18-28 Вар. 585 30-38 Вар. 631 6-36 Вар. 494 12-40 Вар. 540 18-26 Вар. 586 30-36 Вар. 632 6-34 Вар. 495 12-38 Вар. 541 18-24 Вар. 587 30-34 Вар. 633 6-32 Вар. 496 12-36 Вар. 542 18-22 Вар. 588 30-32 Вар. 634 6-30 Вар. 497 12-34 Вар. 543 18-20 Вар. 589 32-40 Вар. 635 6-28 Вар. 498 12-32 Вар. 544 20-40 Вар. 590 32-38 Вар. 636 6-26 Вар. 499 12-30 Вар. 545 20-38 Вар. 591 32-36 Вар. 637 6-24 Вар. 500 12-28 Вар. 546 20-36 Вар. 592 32-34 Вар. 638 6-22 Вар. 501 12-26 Вар. 547 20-34 Вар. 593 34-40 Вар. 639 6-20 Вар. 502 12-24 Вар. 548 20-32 Вар. 594 36-38 Вар. 640 6-18 Вар. 503 12-22 Вар. 549 20-30 Вар. 595 38-40 Вар. 641

Вар. = Вариация.

[0076] В некоторых вариантах реализации изобретения композиция рФфВ, полученная способами, представленными в данном документе документе, может быть охарактеризована в соответствии с процентным содержанием молекул рФфВ, которые присутствуют в конкретном мультимере рФфВ высшего порядка или мультимере большего размера. Например, в одном варианте реализации изобретения, по меньшей мере, 20% молекул рФфВ в композиции рФфВ, используемой в описанных в данном документе способах, присутствуют в олигомерном комплексе, состоящем по меньшей мере из 10 субъединиц. В другом варианте реализации изобретения, по меньшей мере, 20% молекул рФфВ в композиции рФфВ, используемой в описанных в данном документе способах, присутствуют в олигомерном комплексе, состоящем по меньшей мере из 12 субъединиц. Еще в других вариантах реализации изобретения композиция рФфВ, используемая в способах, представленных в данном документе, имеет минимальный процент (например, имеет по меньшей мере X %) молекул рФфВ, присутствующих в конкретном мультимере рФфВ высшего порядка или мультимере большего размера (например, мультимере по меньшей мере из Y субъединиц) в соответствии с любой из вариаций 134-457, приведенных в Таблицах с 5 по 7.

Таблица 5. Типовые варианты реализации изобретения по процентному содержанию молекул рФфВ, которые присутствуют в конкретном мультимере рФфВ высшего порядка или мультимере большего размера, обнаруженные в композициях и использованные в способах, представленных в данном документе

Минимальное Количество Субъединиц в Мультимере рФфВ 6 8 10 12 14 16 Минимальный Процент Молекул рФфВ 10% Вар. 134 Вар. 152 Вар. 170 Вар. 188 Вар. 206 Вар. 224 15% Вар. 135 Вар. 153 Вар. 171 Вар. 189 Вар. 207 Вар. 225 20% Вар. 136 Вар. 154 Вар. 172 Вар. 190 Вар. 208 Вар. 226 25% Вар. 137 Вар. 155 Вар. 173 Вар. 191 Вар. 209 Вар. 227 30% Вар. 138 Вар. 156 Вар. 174 Вар. 192 Вар. 210 Вар. 228 35% Вар. 139 Вар. 157 Вар. 175 Вар. 193 Вар. 211 Вар. 229 40% Вар. 140 Вар. 158 Вар. 176 Вар. 194 Вар. 212 Вар. 230 45% Вар. 141 Вар. 159 Вар. 177 Вар. 195 Вар. 213 Вар. 231 50% Вар. 142 Вар. 160 Вар. 178 Вар. 196 Вар. 214 Вар. 232 55% Вар. 143 Вар. 161 Вар. 179 Вар. 197 Вар. 215 Вар. 233 60% Вар. 144 Вар. 162 Вар. 180 Вар. 198 Вар. 216 Вар. 234 65% Вар. 145 Вар. 163 Вар. 181 Вар. 199 Вар. 217 Вар. 235 70% Вар. 146 Вар. 164 Вар. 182 Вар. 200 Вар. 218 Вар. 236 75% Вар. 147 Вар. 165 Вар. 183 Вар. 201 Вар. 219 Вар. 237 80% Вар. 148 Вар. 166 Вар. 184 Вар. 202 Вар. 220 Вар. 238 85% Вар. 149 Вар. 167 Вар. 185 Вар. 203 Вар. 221 Вар. 239 90% Вар. 150 Вар. 168 Вар. 186 Вар. 204 Вар. 222 Вар. 240 95% Вар. 151 Вар. 169 Вар. 187 Вар. 205 Вар. 223 Вар. 241

Вар. = Вариация.

Таблица 6. Типовые варианты реализации изобретения по процентному содержанию молекул рФфВ, которые присутствуют в конкретном мультимере рФфВ высшего порядка или мультимере большего размера, обнаруженные в композициях и использованные в способах, представленных в данном документе

Минимальное Количество Субъединиц в Мультимере рФфВ 18 20 22 24 26 28 Минимальный Процент Молекул рФфВ 10% Вар. 242 Вар. 260 Вар. 278 Вар. 296 Вар. 314 Вар. 332 15% Вар. 243 Вар. 261 Вар. 279 Вар. 297 Вар. 315 Вар. 333 20% Вар. 244 Вар. 262 Вар. 280 Вар. 298 Вар. 316 Вар. 334 25% Вар. 245 Вар. 263 Вар. 281 Вар. 299 Вар. 317 Вар. 335 30% Вар. 246 Вар. 264 Вар. 282 Вар. 300 Вар. 318 Вар. 336 35% Вар. 247 Вар. 265 Вар. 283 Вар. 301 Вар. 319 Вар. 337 40% Вар. 248 Вар. 266 Вар. 284 Вар. 302 Вар. 320 Вар. 338 45% Вар. 249 Вар. 267 Вар. 285 Вар. 303 Вар. 321 Вар. 339 50% Вар. 250 Вар. 268 Вар. 286 Вар. 304 Вар. 322 Вар. 340 55% Вар. 251 Вар. 269 Вар. 287 Вар. 305 Вар. 323 Вар. 341 60% Вар. 252 Вар. 270 Вар. 288 Вар. 306 Вар. 324 Вар. 342 65% Вар. 253 Вар. 271 Вар. 289 Вар. 307 Вар. 325 Вар. 343 70% Вар. 254 Вар. 272 Вар. 290 Вар. 308 Вар. 326 Вар. 344 75% Вар. 255 Вар. 273 Вар. 291 Вар. 309 Вар. 327 Вар. 345 80% Вар. 256 Вар. 274 Вар. 292 Вар. 310 Вар. 328 Вар. 346 85% Вар. 257 Вар. 275 Вар. 293 Вар. 311 Вар. 329 Вар. 347 90% Вар. 258 Вар. 276 Вар. 294 Вар. 312 Вар. 330 Вар. 348 95% Вар. 259 Вар. 277 Вар. 295 Вар. 313 Вар. 331 Вар. 349

Вар. = Вариация.

Таблица 7. Типовые варианты реализации изобретения по процентному содержанию молекул рФфВ, которые присутствуют в конкретном мультимере рФфВ высшего порядка или мультимере большего размера, обнаруженные в композициях и использованные в способах, представленных в данном документе

Минимальное Количество Субъединиц в Мультимере рФфВ 30 32 34 36 38 40 Минимальный Процент Молекул рФфВ 10% Вар. 350 Вар. 368 Вар. 386 Вар. 404 Вар. 422 Вар. 440 15% Вар. 351 Вар. 369 Вар. 387 Вар. 405 Вар. 423 Вар. 441 20% Вар. 352 Вар. 370 Вар. 388 Вар. 406 Вар. 424 Вар. 442 25% Вар. 353 Вар. 371 Вар. 389 Вар. 407 Вар. 425 Вар. 443 30% Вар. 354 Вар. 372 Вар. 390 Вар. 408 Вар. 426 Вар. 444 35% Вар. 355 Вар. 373 Вар. 391 Вар. 409 Вар. 427 Вар. 445 40% Вар. 356 Вар. 374 Вар. 392 Вар. 410 Вар. 428 Вар. 446 45% Вар. 357 Вар. 375 Вар. 393 Вар. 411 Вар. 429 Вар. 447 50% Вар. 358 Вар. 376 Вар. 394 Вар. 412 Вар. 430 Вар. 448 55% Вар. 359 Вар. 377 Вар. 395 Вар. 413 Вар. 431 Вар. 449 60% Вар. 360 Вар. 378 Вар. 396 Вар. 414 Вар. 432 Вар. 450 65% Вар. 361 Вар. 379 Вар. 397 Вар. 415 Вар. 433 Вар. 451 70% Вар. 362 Вар. 380 Вар. 398 Вар. 416 Вар. 434 Вар. 452 75% Вар. 363 Вар. 381 Вар. 399 Вар. 417 Вар. 435 Вар. 453 80% Вар. 364 Вар. 382 Вар. 400 Вар. 418 Вар. 436 Вар. 454 85% Вар. 365 Вар. 383 Вар. 401 Вар. 419 Вар. 437 Вар. 455 90% Вар. 366 Вар. 384 Вар. 402 Вар. 420 Вар. 438 Вар. 456 95% Вар. 367 Вар. 385 Вар. 403 Вар. 421 Вар. 439 Вар. 457

Вар. = Вариация.

[0077] В соответствии с вышеизложенным, рФфВ обычно содержит значительный процент высокомолекулярных (ВМ) мультимеров рФфВ. В дополнительных вариантах реализации изобретения композиция ВМ мультимеров рФфВ содержит по меньшей мере 10% - 80% декамеров рФфВ или мультимеров высшего порядка. В дополнительных вариантах реализации изобретения композиция содержит около 10-95%, 20-90%, 30-85%, 40-80%, 50-75%, 60-70% декамеров или мультимеров высшего порядка. В дополнительных вариантах реализации изобретения композиция ВМ мультимеров рФфВ содержит по меньшей мере 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% декамеров или мультимеров высшего порядка.

[0078] Оценка количества и процентного содержания мультимеров рФфВ может проводиться с использованием способов, известных в данной области техники, включая, но не ограничиваясь ими, способы с использованием электрофореза и эксклюзионной хроматографии для разделения мультимеров рФфВ по размеру, например, как обсуждалось Cumming et al, (J Clin Pathol. 1993 May; 46(5): 470-473, которая включена в данный документ в полном объеме посредством ссылки для всех целей и, в частности, для всех идей, связанных с оценкой мультимеров рФфВ). Такие подходы могут дополнительно включать способы иммуноблоттинга (такие как вестерн-блот), в которых гель иммуноблоттируется с радиоактивно меченным антителом против ФфВ с последующим хемилюминесцентным детектированием (см., например, Wen et al., (1993), J. Clin. Lab. Anal., 7: 317-323, которая включена в данный документ в полном объеме посредством ссылки для всех целей и, в частности, для всех идей, связанных с оценкой мультимеров рФфВ). Дополнительные анализы для ФфВ включают анализ Антигена ФфВ (ФфВ:Аг), Ристоцетин-Кофакторной активности ФфВ (ФфВ:РКо) и Коллаген-Связывающей Активности ФфВ (ФфВ:КСА), которые часто используются для диагностики и классификации болезни фон Виллебранда. (см., например, Favaloro et al., Pathology, 1997, 29(4): 341-456, которая включена в данный документ в полном объеме посредством ссылки для всех целей и, в частности, для всех идей, связанных с анализами для ФфВ).

[0079] В некоторых вариантах реализации изобретения соотношение прокоагулянтной активности рФVIII (МЕ рФVIII:К (rFVIII:C)) к ристоцетин-кофакторной активности рФфВ (МЕ рФфВ:РКо (rVWF:RCo)) для рФфВ, полученного в соответствии со способами по данному изобретению, составляет от 3:1 до 1:5. В дополнительных вариантах реализации изобретения соотношение составляет от 2:1 до 1:4. В дополнительных вариантах реализации изобретения соотношение составляет от 5:2 до 1:4. В дополнительных вариантах реализации изобретения соотношение составляет от 3:2 до 1:3. В еще дополнительных вариантах реализации изобретения соотношение составляет около 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 2:1, 2:3, 2:4, 2:5, 3:1, 3:2, 3:4, или 3:5. В дополнительных вариантах реализации изобретения соотношение составляет от 1:1 до 1:2. В еще дополнительных вариантах реализации изобретния соотношение составляет 1,1:1, 1,2:1, 1,3:1, 1,4:1, 1,5:1, 1,6:1, 1,7:1, 1,8:1, 1,9:1 или 2:1. В некоторых вариантах реализации изобретния соотношение прокоагулянтной активности рФVIII (МЕ рФVIII:К) к ристоцетин-кофакторной активности рФфВ (МЕ рФфВ:РКо) в композиции, полезной для способа, описанного в данном документе, выбрано из вариантов с 1988 по 2140, приведенных в Таблице 8.

Таблица 8. Типовые варианты реализации изобретения по соотношению прокоагулянтной активности рФVIII (МЕ рФVIII:К) к ристоцетин-кофакторной активности рФфВ (МЕ рФфВ:РКо), обнаруженные в композициях и использованные в способах, представленных в данном документе

(МЕ рФVIII:
К) к (МЕ рФфВ:
РКо) (МЕ рФVIII:
К) к (МЕ рФфВ:
РКо) (МЕ рФVIII:К) к (МЕ рФфВ:
РКо) (МЕ рФVIII:К) к (МЕ рФфВ:
РКо) 4:1 Вар. 1988 3:1-3:5 Вар. 2027 4:3-1:4 Вар. 2065 4:5-2:3 Вар. 2103 3:1 Вар. 1989 3:1-2:3 Вар. 2028 4:3-1:3 Вар. 2066 4:5-3:4 Вар. 2104 2:1 Вар. 1990 3:1-3:4 Вар. 2029 4:3-2:5 Вар. 2067 3:4-1:6 Вар. 2105 3:2 Вар. 1991 3:1-4:5 Вар. 2030 4:3-1:2 Вар. 2068 3:4-1:5 Вар. 2106 4:3 Вар. 1992 3:1-5:6 Вар. 2031 4:3-3:5 Вар. 2069 3:4-1:4 Вар. 2107 1:1 Вар. 1993 3:1-1:1 Вар. 2032 4:3-2:3 Вар. 2070 3:4-1:3 Вар. 2108 5:6 Вар. 1994 3:1-4:3 Вар. 2033 4:3-3:4 Вар. 2071 3:4-2:5 Вар. 2109 4:5 Вар. 1995 3:1-3:2 Вар. 2034 4:3-4:5 Вар. 2072 3:4-1:2 Вар. 2110 3:4 Вар. 1996 3:1-2:1 Вар. 2035 4:3-5:6 Вар. 2073 3:4-3:5 Вар. 2111 2:3 Вар. 1997 2:1-1:6 Вар. 2036 4:3-1:1 Вар. 2074 3:4-2:3 Вар. 2112 3:5 Вар. 1998 2:1-1:5 Вар. 2037 1:1-1:6 Вар. 2075 2:3-1:6 Вар. 2113 1:2 Вар. 1999 2:1-1:4 Вар. 2038 1:1-1:5 Вар. 2076 2:3-1:5 Вар. 2114 2:5 Вар. 2000 2:1-1:3 Вар. 2039 1:1-1:4 Вар. 2077 2:3-1:4 Вар. 2115 1:3 Вар. 2001 2:1-2:5 Вар. 2040 1:1-1:3 Вар. 2078 2:3-1:3 Вар. 2116 1:4 Вар. 2002 2:1-1:2 Вар. 2041 1:1-2:5 Вар. 2079 2:3-2:5 Вар. 2117 1:5 Вар. 2003 2:1-3:5 Вар. 2042 1:1-1:2 Вар. 2080 2:3-1:2 Вар. 2118 1:6 Вар. 2004 2:1-2:3 Вар. 2043 1:1-3:5 Вар. 2081 2:3-3:5 Вар. 2119 4:1-1:6 Вар. 2005 2:1-3:4 Вар. 2044 1:1-2:3 Вар. 2082 3:5-1:6 Вар. 2120 4:1-1:5 Вар. 2006 2:1-4:5 Вар. 2045 1:1-3:4 Вар. 2083 3:5-1:5 Вар. 2121 4:1-1:4 Вар. 2007 2:1-5:6 Вар. 2046 1:1-4:5 Вар. 2084 3:5-1:4 Вар. 2122 4:1-1:3 Вар. 2008 2:1-1:1 Вар. 2047 1:1-5:6 Вар. 2085 3:5-1:3 Вар. 2123 4:1-2:5 Вар. 2009 2:1-4:3 Вар. 2048 5:6-1:6 Вар. 2086 3:5-2:5 Вар. 2124 4:1-1:2 Вар. 2010 2:1-3:2 Вар. 2049 5:6-1:5 Вар. 2087 3:5-1:2 Вар. 2125 4:1-3:5 Вар. 2011 3:2-1:6 Вар. 2050 5:6-1:4 Вар. 2088 1:2-1:6 Вар. 2126 4:1-2:3 Вар. 2012 3:2-1:5 Вар. 2051 5:6-1:3 Вар. 2089 1:2-1:5 Вар. 2127 4:1-3:4 Вар. 2013 3:2-1:4 Вар. 2052 5:6-2:5 Вар. 2090 1:2-1:4 Вар. 2128 4:1-4:5 Вар. 2014 3:2-1:3 Вар. 2053 5:6-1:2 Вар. 2091 1:2-1:3 Вар. 2129 4:1-5:6 Вар. 2015 3:2-2:5 Вар. 2054 5:6-3:5 Вар. 2092 1:2-2:5 Вар. 2130 4:1-1:1 Вар. 2016 3:2-1:2 Вар. 2055 5:6-2:3 Вар. 2093 2:5-1:6 Вар. 2131 4:1-4:3 Вар. 2017 3:2-3:5 Вар. 2056 5:6-3:4 Вар. 2094 2:5-1:5 Вар. 2132 4:1-3:2 Вар. 2018 3:2-2:3 Вар. 2057 5:6-4:5 Вар. 2095 2:5-1:4 Вар. 2133 4:1-2:1 Вар. 2019 3:2-3:4 Вар. 2058 4:5-1:6 Вар. 2096 2:5-1:3 Вар. 2134 4:1-3:1 Вар. 2020 3:2-4:5 Вар. 2059 4:5-1:5 Вар. 2097 1:3-1:6 Вар. 2135 3:1-1:6 Вар. 2021 3:2-5:6 Вар. 2060 4:5-1:4 Вар. 2098 1:3-1:5 Вар. 2136 3:1-1:5 Вар. 2022 3:2-1:1 Вар. 2061 4:5-1:3 Вар. 2099 1:3-1:4 Вар. 2137 3:1-1:4 Вар. 2023 3:2-4:3 Вар. 2062 4:5-2:5 Вар. 2100 1:4-1:6 Вар. 2138 3:1-1:3 Вар. 2024 4:3-1:6 Вар. 2063 4:5-1:2 Вар. 2101 1:4-1:5 Вар. 2139 3:1-2:5 Вар. 2025 4:3-1:5 Вар. 2064 4:5-3:5 Вар. 2102 1:5-1:6 Вар. 2140 3:1-1:2 Вар. 2026

Вар. = Вариация.

[0080] В дополнительных вариантах реализации изобретения мультимеры рФфВ высшего порядка согласно изобретению стабильны в течение от около 1 до около 90 часов после введения. В еще дополнительных вариантах реализации изобретения мультимеры рФфВ высшего порядка стабильны в течение около 5-80, 10-70, 15-60, 20-50, 25-40, 30-35 часов после введения. В еще дополнительных вариантах реализации изобретения мультимеры рФфВ высшего порядка стабильны в течение по меньшей мере 3, 6, 12, 18, 24, 36, 48, 72 часов после введения. В некоторых вариантах реализации изобретения стабильность мультимеров рФфВ оценивают in vitro.

[0081] В одном варианте реализации изобретения мультимеры рФфВ высшего порядка, используемые в композициях и способах, представленных в данном документе, имеют период полувыведения по меньшей мере 12 часов после введения. В другом варианте реализации изобретения мультимеры рФфВ высшего порядка имеют период полувыведения по меньшей мере 24 часа после введения. В еще других вариантах реализации изобретения мультимеры рФфВ высшего порядка имеют период полувыведения, выбранный из вариаций 642-1045, приведенных в Таблице 9.

Таблица 9. Типовые варианты реализации изобретения по периоду полувыведения мультимеров рФфВ высшего порядка, обнаруженных в композициях, полученных способами, представленными в данном документе

Часы Часы Часы Часы по меньшей мере 1 Вар. 642 4-22 Вар. 743 14-78 Вар. 844 24-30 Вар. 945 по меньшей мере 2 Вар. 643 4-20 Вар. 744 14-72 Вар. 845 24-27 Вар. 946 по меньшей мере 3 Вар. 644 4-18 Вар. 745 14-66 Вар. 846 27-90 Вар. 947 по меньшей мере 4 Вар. 645 4-16 Вар. 746 14-60 Вар. 847 27-84 Вар. 948 по меньшей мере 5 Вар. 646 4-14 Вар. 747 14-54 Вар. 848 27-78 Вар. 949 по меньшей мере 6 Вар. 647 4-12 Вар. 748 14-48 Вар. 849 27-72 Вар. 950 по меньшей мере 7 Вар. 648 4-10 Вар. 749 14-45 Вар. 850 27-66 Вар. 951 по меньшей мере 8 Вар. 649 4-8 Вар. 750 14-42 Вар. 851 27-60 Вар. 952 по меньшей мере 9 Вар. 650 4-6 Вар. 751 14-39 Вар. 852 27-54 Вар. 953 по меньшей мере 10 Вар. 651 6-90 Вар. 752 14-36 Вар. 853 27-48 Вар. 954 по меньшей мере 11 Вар. 652 6-84 Вар. 753 14-33 Вар. 854 30-90 Вар. 955 по меньшей мере 12 Вар. 653 6-78 Вар. 754 14-30 Вар. 855 30-84 Вар. 956 по меньшей мере 14 Вар. 654 6-72 Вар. 755 14-27 Вар. 856 30-78 Вар. 957 по меньшей мере 16 Вар. 655 6-66 Вар. 756 14-24 Вар. 857 30-72 Вар. 958 по меньшей мере 18 Вар. 656 6-60 Вар. 757 14-22 Вар. 858 30-66 Вар. 959 по меньшей мере 20 Вар. 657 6-54 Вар. 758 14-20 Вар. 859 30-60 Вар. 960 по меньшей мере 22 Вар. 658 6-48 Вар. 759 14-18 Вар. 860 30-54 Вар. 961 по меньшей мере 24 Вар. 659 6-45 Вар. 760 14-16 Вар. 861 30-48 Вар. 962 по меньшей мере 27 Вар. 660 6-42 Вар. 761 16-90 Вар. 862 30-45 Вар. 963 по меньшей мере 30 Вар. 661 6-39 Вар. 762 16-84 Вар. 863 30-42 Вар. 964 по меньшей мере 33 Вар. 662 6-36 Вар. 763 16-78 Вар. 864 30-39 Вар. 965 по меньшей мере 36 Вар. 663 6-33 Вар. 764 16-72 Вар. 865 30-36 Вар. 966 по меньшей мере 39 Вар. 664 6-30 Вар. 765 16-66 Вар. 866 30-33 Вар. 967 по меньшей мере 42 Вар. 665 6-27 Вар. 766 16-60 Вар. 867 33-90 Вар. 968 по меньшей мере 45 Вар. 666 6-24 Вар. 767 16-54 Вар. 868 33-84 Вар. 969 по меньшей мере 48 Вар. 667 6-22 Вар. 768 16-48 Вар. 869 33-78 Вар. 970 по меньшей мере 54 Вар. 668 6-20 Вар. 769 16-45 Вар. 870 33-72 Вар. 971 по меньшей мере 60 Вар. 669 6-18 Вар. 770 16-42 Вар. 871 33-66 Вар. 972 по меньшей мере 66 Вар. 670 6-16 Вар. 771 16-39 Вар. 872 33-60 Вар. 973 по меньшей мере 72 Вар. 671 6-14 Вар. 772 16-36 Вар. 873 33-54 Вар. 974 по меньшей мере 78 Вар. 672 6-12 Вар. 773 16-33 Вар. 874 33-48 Вар. 975 по меньшей мере 84 Вар. 673 6-10 Вар. 774 16-30 Вар. 875 33-45 Вар. 976 по меньшей мере 90 Вар. 674 6-8 Вар. 775 16-27 Вар. 876 33-42 Вар. 977 2-90 Вар. 675 8-90 Вар. 776 16-24 Вар. 877 33-29 Вар. 978 2-84 Вар. 676 8-84 Вар. 777 16-22 Вар. 878 33-36 Вар. 979 2-78 Вар. 677 8-78 Вар. 778 16-20 Вар. 879 36-90 Вар. 980 2-72 Вар. 678 8-72 Вар. 779 16-18 Вар. 880 36-84 Вар. 981 2-66 Вар. 679 8-66 Вар. 780 18-90 Вар. 881 36-78 Вар. 982 2-60 Вар. 680 8-60 Вар. 781 18-84 Вар. 882 36-72 Вар. 983 2-54 Вар. 681 8-54 Вар. 782 18-78 Вар. 883 36-66 Вар. 984 2-48 Вар. 682 8-48 Вар. 783 18-72 Вар. 884 36-60 Вар. 985 2-45 Вар. 683 8-45 Вар. 784 18-66 Вар. 885 36-54 Вар. 986 2-42 Вар. 684 8-42 Вар. 785 18-60 Вар. 886 36-48 Вар. 987 2-39 Вар. 685 8-39 Вар. 786 18-54 Вар. 887 36-45 Вар. 988 2-36 Вар. 686 8-36 Вар. 787 18-48 Вар. 888 36-42 Вар. 989 2-33 Вар. 687 8-33 Вар. 788 18-45 Вар. 889 36-39 Вар. 990 2-30 Вар. 688 8-30 Вар. 789 18-42 Вар. 890 39-90 Вар. 991 2-27 Вар. 689 8-27 Вар. 790 18-39 Вар. 891 39-84 Вар. 992 2-24 Вар. 690 8-24 Вар. 791 18-36 Вар. 892 39-78 Вар. 993 2-22 Вар. 691 8-22 Вар. 792 18-33 Вар. 893 39-72 Вар. 994 2-20 Вар. 692 8-20 Вар. 793 18-30 Вар. 894 39-66 Вар. 995 2-18 Вар. 693 8-18 Вар. 794 18-27 Вар. 895 39-60 Вар. 996 2-16 Вар. 694 8-16 Вар. 795 18-24 Вар. 896 39-54 Вар. 997 2-14 Вар. 695 8-14 Вар. 796 18-22 Вар. 897 39-48 Вар. 998 2-12 Вар. 696 8-12 Вар. 797 18-20 Вар. 898 39-45 Вар. 999 2-10 Вар. 697 8-10 Вар. 798 20-90 Вар. 899 39-42 Вар. 1000 2-8 Вар. 698 10-90 Вар. 799 20-84 Вар. 900 42-90 Вар. 1001 2-6 Вар. 699 10-84 Вар. 800 20-78 Вар. 901 42-84 Вар. 1002 2-4 Вар. 700 10-78 Вар. 801 20-72 Вар. 902 42-78 Вар. 1003 3-90 Вар. 701 10-72 Вар. 802 20-66 Вар. 903 42-72 Вар. 1004 3-84 Вар. 702 10-66 Вар. 803 20-60 Вар. 904 42-66 Вар. 1005 3-78 Вар. 703 10-60 Вар. 804 20-54 Вар. 905 42-60 Вар. 1006 3-72 Вар. 704 10-54 Вар. 805 20-48 Вар. 906 42-54 Вар. 1007 3-66 Вар. 705 10-48 Вар. 806 20-45 Вар. 907 42-48 Вар. 1008 3-60 Вар. 706 10-45 Вар. 807 20-42 Вар. 908 42-45 Вар. 1009 3-54 Вар. 707 10-42 Вар. 808 20-39 Вар. 909 45-90 Вар. 1010 3-48 Вар. 708 10-39 Вар. 809 20-36 Вар. 910 45-84 Вар. 1011 3-45 Вар. 709 10-36 Вар. 810 20-33 Вар. 911 45-78 Вар. 1012 3-42 Вар. 710 10-33 Вар. 811 20-30 Вар. 912 45-72 Вар. 1013 3-39 Вар. 711 10-30 Вар. 812 20-27 Вар. 913 45-66 Вар. 1014 3-36 Вар. 712 10-27 Вар. 813 20-24 Вар. 914 45-60 Вар. 1015 3-33 Вар. 713 10-24 Вар. 814 20-22 Вар. 915 45-54 Вар. 1016 3-30 Вар. 714 10-22 Вар. 815 22-90 Вар. 916 45-48 Вар. 1017 3-27 Вар. 715 10-20 Вар. 816 22-84 Вар. 917 48-90 Вар. 1018 3-24 Вар. 716 10-18 Вар. 817 22-78 Вар. 918 48-84 Вар. 1019 3-22 Вар. 717 10-16 Вар. 818 22-72 Вар. 919 48-78 Вар. 1020 3-20 Вар. 718 10-14 Вар. 819 22-66 Вар. 920 48-72 Вар. 1021 3-18 Вар. 719 10-12 Вар. 820 22-60 Вар. 921 48-66 Вар. 1022 3-16 Вар. 720 12-90 Вар. 821 22-54 Вар. 922 48-60 Вар. 1023 3-14 Вар. 721 12-84 Вар. 822 22-48 Вар. 923 48-54 Вар. 1024 3-12 Вар. 722 12-78 Вар. 823 22-45 Вар. 924 54-90 Вар. 1025 3-10 Вар. 723 12-72 Вар. 824 22-42 Вар. 925 54-84 Вар. 1026 3-8 Вар. 724 12-66 Вар. 825 22-39 Вар. 926 54-78 Вар. 1027 3-6 Вар. 725 12-60 Вар. 826 22-36 Вар. 927 54-72 Вар. 1028 3-4 Вар. 726 12-54 Вар. 827 22-33 Вар. 928 54-66 Вар. 1029 4-90 Вар. 727 12-48 Вар. 828 22-30 Вар. 929 54-60 Вар. 1030 4-84 Вар. 728 12-45 Вар. 829 22-27 Вар. 930 60-90 Вар. 1031 4-78 Вар. 729 12-42 Вар. 830 22-24 Вар. 931 60-84 Вар. 1032 4-72 Вар. 730 12-39 Вар. 831 24-90 Вар. 932 60-78 Вар. 1033 4-66 Вар. 731 12-36 Вар. 832 24-84 Вар. 933 60-72 Вар. 1034 4-60 Вар. 732 12-33 Вар. 833 24-78 Вар. 934 60-66 Вар. 1035 4-54 Вар. 733 12-30 Вар. 834 24-72 Вар. 935 66-90 Вар. 1036 4-48 Вар. 734 12-27 Вар. 835 24-66 Вар. 936 66-84 Вар. 1037 4-45 Вар. 735 12-24 Вар. 836 24-60 Вар. 937 66-78 Вар. 1038 4-42 Вар. 736 12-22 Вар. 837 24-54 Вар. 938 66-72 Вар. 1039 4-39 Вар. 737 12-20 Вар. 838 24-48 Вар. 939 72-90 Вар. 1040 4-36 Вар. 738 12-18 Вар. 839 24-45 Вар. 940 72-84 Вар. 1041 4-33 Вар. 739 12-16 Вар. 840 24-42 Вар. 941 72-78 Вар. 1042 4-30 Вар. 740 12-14 Вар. 841 24-39 Вар. 942 78-90 Вар. 1043 4-27 Вар. 741 14-90 Вар. 842 24-36 Вар. 943 78-84 Вар. 1044 4-24 Вар. 742 14-84 Вар. 843 24-33 Вар. 944 84-90 Вар. 1045

Вар. = Вариация.

[0082] В некоторых вариантах реализации изобретения про-рФфВ и/или очищенный рФфВ, очищенный в соответствии с данным изобретением, не модифицируется какими-либо конъюгационными, посттрансляционными или ковалентными модификациями. В конкретных вариантах реализации изобретения про-рФфВ и/или очищенный рФфВ по данному изобретению не модифицирован водорастворимым полимером, включая, но не ограничиваясь этим, полиэтиленгликоль (ПЭГ), полипропиленгликоль, полиоксиалкилен, полисиаловую кислоту, гидроксиэтилкрахмал, поли-углеводный фрагмент, и тому подобное.

[0083] В некоторых вариантах реализации изобретения про-рФфВ и/или очищенный рФфВ, очищенный в соответствии с данным изобретением, модифицирован посредством конъюгации, посттрансляционной модификации или ковалентной модификации, включая модификации N- или C-концевых остатков, а также модификации выбранных боковых цепей, например, на свободных сульфгидрильных группах, первичных аминах и гидроксильных группах. В одном варианте реализации изобретения водорастворимый полимер связан с белком (напрямую или через линкер) лизиновой группой или другим первичным амином. В некоторых вариантах реализации изобретения про-рФфВ и/или очищенный рФфВ по данному изобретению могут быть модифицированы путем конъюгации водорастворимого полимера, включая, но не ограничиваясь этим, полиэтиленгликоль (ПЭГ), полипропиленгликоль, полиоксиалкилен, полисиаловую кислоту, гидроксилэтилкрахмал, поли-углеводородный фрагмент и тому подобное.

[0084] Водорастворимые полимеры, которые можно использовать для модификации про-рФфВ и/или очищенного рФфВ, включают линейные и разветвленные структуры. Конъюгированные полимеры могут быть присоединены непосредственно к коагулятному белку коагуляции по изобретению или, альтернативно, могут быть присоединены через связующий фрагмент. Неограничивающие примеры конъюгации белков с водорастворимыми полимерами можно найти в патентах США № 4640835; 4496689; 4301144; 4670417; 4791192, и 4179337, а также в Abuchowski and Davis “Enzymes as Drugs,” Holcenberg and Roberts, Eds., pp. 367 383, John Wiley and Sons, New York (1981), и Hermanson G., Bioconjugate Techniques 2^nd Ed., Academic Press, Inc. 2008.

[0085] Конъюгация белков может быть выполнена с помощью ряда хорошо известных в данной области подходов, например, см. Hermanson G., Bioconjugate Techniques 2^nd Ed., Academic Press, Inc. 2008. Примеры включают соединение через пептидную связь между карбоксильной группой на одном из коагулянтных белков или водорастворимом полимерном фрагменте и аминогруппой другого белка или фрагмента, или сложноэфирное соединение между карбоксильной группой с одной стороны и гидроксильной группой с другой стороны. Другое соединение, с помощью которого коагулянтный белок по данному изобретению может быть конъюгирован с водорастворимым полимерным веществом, происходит через основание Шиффа между свободной аминогруппой на полимерном фрагменте, реагирующей с альдегидной группой, образованной на невосстанавливающем конце полимера путем окисления периодатом (Jennings and Lugowski, J. Immunol. 1981; 127:1011-8; Femandes and Gregonradis, Biochim Biophys Acta. 1997; 1341; 26-34). Генерируемое основание Шиффа может быть стабилизировано путем специфического восстановления NaCNBH₃ с образованием вторичного амина. Альтернативным подходом является образование концевых свободных аминогрупп на полимере путем восстановительного аминирования NH₄Cl после предварительного окисления. Бифункциональные реагенты могут быть использованы для связывания двух аминогрупп или двух гидроксильных групп. Например, полимер, содержащий аминогруппу, может быть соединен с аминогруппой коагулянтного белка с помощью таких реагентов, как BS3 (Бис(сульфосукцинимидил)суберат/Pierce, Rockford, Ill.). Кроме того, гетеробифункциональные сшивающие реагенты, такие как Sulfo-EMCS (N-ε-Малеимидокапроилокси) сульфосукцинимидный эфир/Pierce), могут быть использованы, например, для связывания аминогрупп и тиоловых групп. В других вариантах реализации изобретения группа, реагирующая с альдегидом, такая как ПЭГ алкоксид плюс диэтилацеталь бромацетальдегида; ПЭГ плюс ДМСО и уксусный ангидрид, а также ПЭГ хлорид плюс феноксид 4-гидроксибензальдегида, сукцинимидильные активные эфиры, активированный дитиокарбонат ПЭГ, 2,4,5-трихлорфенилхлорформиат и P-нитрофенилхлорформиат активированный ПЭГ, могут использоваться в конъюгации коагулянтного белка.

[0086] Другой способ измерения биологической активности ФфВ представляет собой анализ связывания коллагена, основанный на способе твердофазного ИФА (Brown et Bosak, Thromb. Res., 1986, 43:303-311; Favaloro, Thromb. Haemost., 2000, 83 127-135). Микротитрационный планшет покрыт коллагеном типа I или III. Затем ФфВ связывается с поверхностью коллагена и впоследствии детектируется с помощью меченного ферментом поликлонального антитела. Последним этапом является реакция субстрата, которую можно фотометрически фиксировать с помощью считывающего устройства ИФА.

[0087] Иммунологические анализы факторов фон Виллебранда (ФфВ: Aг) представляют собой иммуноанализы, которые измеряют концентрацию белка ФфВ в плазме. Они не дают никаких указаний относительно функции ФфВ. Существует ряд способов измерения ФфВ:Aг, и они включают как твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА), так и автоматизированный иммуноанализ с латексной агглютинацией (ЛА, (LIA)). Многие лаборатории в настоящее время используют полностью автоматизированный иммуноанализ с латексной агглютинацией. Исторически в лабораториях использовались различные способы, включая электроиммуноанализ по Лореллу 'Ракетный Иммуноэлектрофорез Лорелла', но сегодня они редко используются в большинстве лабораторий.

Наборы

[0088] В качестве дополнительного аспекта, изобретение включает наборы, которые содержат одну или более лиофилизированных композиций, упакованных таким образом, который облегчает их использование для введения субъектам. В одном варианте реализации изобретения такой набор включает фармацевтический препарат, описанный в данном документе (например, композицию, содержащую терапевтический белок или пептид), упакованный в емкость, такую как герметичный флакон или резервуар, с этикеткой, прикрепленной к емкости или включенной в упаковку, которая описывает применение соединения или композиции при осуществлении способа. В одном варианте реализации изобретения фармацевтический препарат упакован в емкость так, что количество свободного пространства в емкости (например, количество воздуха между жидким препаратом и верхней частью емкости) очень мало. Предпочтительно количество свободного пространства незначительно (например, почти отсутствует). В одном варианте реализации изобретения набор содержит одну емкость, содержащую терапевтическую композицию белка или пептида, и вторую емкость, содержащую физиологически приемлемый раствор для восстановления композиции. В одном аспекте фармацевтический препарат упакован в стандартную лекарственную форму. Набор может дополнительно включать устройство, подходящее для введения фармацевтического препарата в соответствии с конкретным путем введения. Предпочтительно набор содержит этикетку, которая описывает использование фармацевтических препаратов.

рФфВ для способов предварительного лечения пациентов с БфВ, Подвергшихся Хирургическому Вмешательству

[0089] Одним из преимуществ введения рФфВ субъектам с тяжелой формой БфВ для подготовки к хирургическому вмешательству является то, что более высокая специфическая активность рФфВ по сравнению с ппФфВ обеспечивает гибкость в отношении количества вводимого рФфВ и количества повторных дозировок субъекту. Как будет понятно и как будет более подробно обсуждается в данном документе, совместно вводимый ФVIII может быть рекомбинантным или полученным из плазмы.

[0090] Однократное или многократное введение рФфВ проводится с учетом уровней дозы и схемы, которые выбирает лечащий врач. Для профилактики или лечения заболевания подходящая дозировка зависит от типа заболевания, которое нужно лечить (например, болезнь фон Виллебранда), тяжести и течения заболевания, от того, вводится ли лекарство в профилактических или терапевтических целях, от предшествующей терапии, истории болезни пациента и реакции на препарат, а также мнения лечащего врача.

[0091] В некоторых аспектах рФфВ вводят субъекту до хирургического вмешательства в диапазоне от 20 до 60 МЕ/кг, например, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 20-60, 35-70, 20-40, 35-60, 45-60, 45-55, 45-50, 50-60, 55-60 или 50-55 МЕ/кг. В некоторых вариантах реализации изобретения рФфВ вводят от 12 часов до 24 часов, например, 12 часов, 13 часов, 14 часов, 15 часов, 16 часов, 17 часов, 18 часов, 19 часов, 20 часов, 21 час, 22 часа, 23 часа, 24 часа, 12 часов и 24 часа, 14 часов и 24 часа, 16 и 24 часа, 18 часов и 24 часа, или 20 часов и 24 часа до хирургического вмешательства. В некоторых аспектах фактор VIII (ФVIII) не вводится вместе с рФфВ до хирургического вмешательства.

[0092] В некоторых вариантах реализации изобретения рФфВ вводят субъекту в диапазоне 5-90 МЕ/кг, например, 5-90, 5-50, 10-90, 15-90, 20-90, 30-90, 40-90 50-90, 60-90, 70-90, 80-90, 5-80, 10-70, 20-60, 30-50, 35-60, 5-50, 5-40, 5-30. 5-20, 10-90, 10-50 или 20-40 МЕ/кг за 1 час до операции. В других вариантах реализации изобретения рФфВ вводят в дозе 70-200 МЕ/кг, например, 70-200, 80-200, 90-200, 100-200, 110-200, 120-200, 130-200, 130 -200, 140-200, 150-200, 160-200, 170-200, 180-200, 190-200, 70-170, 80-180, 60-160, 50-150, 40-140, 30, 130, 20-120, 10-110, 70-100 или 70-90 МЕ/кг после операции. В некоторых случаях хирургическое вмешательство выбирается из группы, состоящей из обширного хирургического вмешательства, малого хирургического вмешательства или челюстно-лицевого хирургического вмешательства.

[0093] В некоторых вариантах реализации изобретения субъекту вводят 35-60 МЕ/кг рФфВ в период от 12 часов до 24 часов до обширного хирургического вмешательства. В других вариантах реализации изобретения субъекту вводят 15-90 МЕ/кг рФфВ за 1 час до обширного хирургического вмешательства. В другом варианте реализации изобретения субъекту вводят 150-220 МЕ/кг рФфВ после обширного хирургического вмешательства. В некоторых случаях субъекту, подвергающемуся обширному хирургическому вмешательству, вводят суммарную дозу 220-320 МЕ/кг.

[0094] В некоторых вариантах реализации изобретения субъекту вводят 50-60 МЕ/кг рФфВ в период от 12 часов до 24 часов до малого хирургического вмешательства. В других вариантах реализации изобретения субъекту вводят 5-50 МЕ/кг рФфВ за 1 час до малого хирургического вмешательства. В другом варианте реализации изобретения субъекту вводят 70-150 МЕ/кг рФфВ после малого хирургического вмешательства. В некоторых случаях субъекту, подвергающемуся малому хирургическому вмешательству, вводят суммарную дозу 100-220 МЕ/кг.

[0095] В некоторых вариантах реализации изобретения субъекту вводят 20-40 МЕ/кг рФфВ в период от 12 часов до 24 часов до челюстно-лицевого хирургического вмешательства. В других вариантах реализации изобретения субъекту вводят 20-50 МЕ/кг рФфВ за 1 час до челюстно-лицевого хирургического вмешательства. В другом варианте реализации изобретения субъекту вводят 10-50 МЕ/кг рФфВ во время челюстно-лицевого хирургического вмешательства. В другом варианте реализации изобретения субъекту вводят 20-50 МЕ/кг рФфВ после челюстно-лицевого хирургического вмешательства. В некоторых случаях субъекту, подвергающемуся челюстно-лицевого хирургического вмешательства, вводят суммарную дозу 70-190 МЕ/кг.

[0096] Композиции рФфВ могут содержаться в фармацевтических препаратах, как описано в данном документе. Такие препараты можно вводить перорально, местно, трансдермально, парентерально, путем ингаляционного спрея, вагинально, ректально или путем интракраниальной инъекции. Используемый в контексте данного документа термин парентеральный включает подкожные инъекции, внутривенные, внутримышечные, интрацистернальные инъекции или способы инфузии. Предполагается также введение внутривенной, внутрикожной, внутримышечной, интрамаммарной, интраперитонеальной, интратекальной, ретробульбарной, внутрилегочной инъекции и/или хирургичесая имплантация в конкретном месте. Как правило, композиции в основном не содержат пирогенов, а также других примесей, которые могут быть вредными для реципиента.

[0097] В одном аспекте препараты по изобретению вводят путем начальной разовой дозы с последующей непрерывной инфузией для поддержания терапевтических циркулирующих уровней лекарственного продукта. В качестве другого примера, заявляемое соединение вводят в виде однократной дозы. Специалисты в данной области техники легко оптимизируют эффективные дозировки и схемы введения, определенные надлежащей медицинской практикой и клиническим состоянием отдельного пациента. Путь введения может быть, но не ограничивается этим, внутривенным, интраперитонеальным, подкожным или внутримышечным введением. Частота дозирования зависит от фармакокинетических параметров агентов и пути введения. Оптимальный фармацевтический препарат определяется специалистом в данной области техники в зависимости от пути введения и желаемой дозы. См., например, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18^th Ed., 1990, Mack Publishing Co., Easton, Pa. 18042 страницы 1435-1712, которая включена в данный документ в полном объеме посредством ссылки для всех целей и, в частности, для всех идей, связанных с препаратами, путями введения и дозировками для фармацевтических продуктов. Такие препараты влияют на физическое состояние, стабильность, скорость высвобождения in vivo и скорость выведения in vivo вводимых агентов. В зависимости от пути введения подходящая доза рассчитывается в зависимости от веса тела, участка поверхности тела или размера органа. Подходящие дозировки могут быть определены путем использования установленных анализов для определения уровня доз в крови в сочетании с соответствующими данными о зависимости между дозой и эффектом. Окончательный режим дозирования определяется лечащим врачом с учетом различных факторов, которые изменяют действие лекарств, например, специфическая активность лекарства, тяжесть повреждения и реакция пациента, возраст, состояние, масса тела, пол и диета пациента, тяжесть любой инфекции, время введения и другие клинические факторы. В качестве примера, типичная доза рекомбинантного ФфВ по данному изобретению составляет приблизительно 50 МЕ/кг, что равно 500 мкг/кг. По мере проведения исследований будет появляться дополнительная информация относительно соответствующих уровней дозировки и продолжительности лечения различных заболеваний и состояний.

[0098] Практика данного изобретения может использовать, если не указано иное, обычные способы и описания органической химии, полимерной технологии, молекулярной биологии (включая рекомбинантные способы), клеточной биологии, биохимии и иммунологии, которые известны специалистам в данной области техники. Такие обычные способы включают синтез полимерной матрицы, гибридизацию, лигирование и обнаружение гибридизации с использованием метки. Конкретные иллюстрации подходящих способов можно получить обратившись к приведенному ниже примеру. Однако, конечно, также могут быть использованы другие эквивалентные обычные процедуры. Такие обычные способы и описания можно найти в стандартных лабораторных руководствах, таких как Genome Analysis: A Laboratory Manual Series (Vols. I-IV), Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cells: A Laboratory Manual, PCR Primer: A Laboratory Manual, и Molecular Cloning: A Laboratory Manual (все из Cold Spring Harbor Laboratory Press), Stryer, L. (1995) Biochemistry (4^th Ed.) Freeman, Highly stabilized York, Gait, "Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach" 1984, IRL Press, London, Nelson and Cox (2000), Lehninger, Principles of Biochemistry 3^rd Ed., W. H. Freeman Pub., Highly stabilized York, N.Y. и Berg et al. (2002) Biochemistry, 5^th Ed., W. H. Freeman Pub., Highly stabilized York, N.Y., каждая из которых включена в данный документ в полном объеме посредством ссылки для всех целей.

[0099] Следует отметить, что используемые в контексте данного документа и в прилагаемой формуле изобретения существительные в единственном числе включают соответствующие существительные во множественном числе, если в контексте явно не указано иное. Таким образом, например, ссылка на «полимеразу» относится к одному агенту или смесям таких агентов, а ссылка на «способ» включает ссылку на эквивалентные стадии и способы, известные специалистам в данной области техники, и так далее.

[00100] Следует отметить, что используемые в контексте данного документа и в прилагаемой формуле изобретения существительные в единственном числе включают соответствующие существительные во множественном числе, если в контексте явно не указано иное. Таким образом, например, ссылка на «полимеразу» относится к одному агенту или смесям таких агентов, а ссылка на «способ» включает ссылку на эквивалентные стадии и способы, известные специалистам в данной области техники, и так далее.

[00101] Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют то же значение, которое обычно понимают специалисты в области техники, к которой относится это изобретение. Все публикации, упомянутые в данном документе, включены в данный документ посредством ссылки с целью описания и раскрытия устройств, композиций, препаратов и способов, которые описаны в публикации и которые могут использоваться в связи с данным изобретением.

[00102] Когда предоставляется диапазон значений, подразумевается, что каждое промежуточное значение, с точностью до десятой доли нижнего предела, если в контексте явно не указано иное, между верхним и нижним пределом этого диапазона и любым другим установленным или промежуточным значением в указанном диапазоне находится в пределах изобретения. Верхний и нижний пределы этих меньших диапазонов могут независимо включаться в меньшие диапазоны, также охватываемые изобретением, с учетом любого специально исключенного предела в указанном диапазоне. Если указанный диапазон включает один или оба предела, диапазоны, исключающие оба этих включенных пределов, также включены в изобретение.

[00103] В вышеприведенном описании изложены многочисленные конкретные детали, чтобы обеспечить более полное понимание данного изобретения. Однако для специалиста в данной области техники будет очевидно, что данное изобретение может быть осуществлено без одной или более этих конкретных деталей. В других случаях общеизвестные признаки и процедуры, хорошо известные специалистам в данной области техники, не были описаны во избежание затруднения понимания изобретения.

[00104] Хотя данное изобретение описано, прежде всего, со ссылкой на конкретные варианты реализации изобретения, также предполагается, что другие варианты реализации изобретения станут очевидными для специалистов в данной области техники после прочтения данного описания, и предполагается, что такие варианты реализации изобретения должны содержаться согласно способу по данному изобретению.

Лиофилизированные Препараты ФфВ

[00105] Данный способ также предусматриваеи препараты рФфВ для использования в способах лечения, представленных в данном документе. В некоторых вариантах реализации изобретения композицию рФфВ используют для производства фармацевтической композиции. В некоторых вариантах реализации изобретения рФфВ может быть приготовлен в виде лиофилизированного препарата.

[00106] В некоторых вариантах реализации изобретения композиции, содержащие полипептид ФфВ по изобретению, лиофилизируют после очистки и перед введением субъекту. Лиофилизация проводится с использованием способов, известных в данной области техники, и должна быть оптимизирована для разрабатываемой композиции (Tang et al., Pharm Res. 21:191-200, (2004) и Chang et al., Pharm Res. 13:243-9 (1996)).

[00107] Цикл лиофилизации, в одном аспекте, состоит из трех этапов: замораживание, первичное высушивание и вторичное высушивание (A. P. Mackenzie, Phil Trans R Soc London, Ser B, Biol 278:167 (1977)). На стадии замораживания раствор охлаждают, чтобы инициировать образование льда. Кроме того, эта стадия вызывает кристаллизацию наполнителя. Лед испаряется на стадии первичного высушивания, которая проводится путем понижения давления в камере ниже давления паров льда, с использованием вакуума и подачи тепла для ускорения сублимации. В конечном итоге, адсорбированную или связанную воду удаляют на стадии вторичного высушивания при пониженном давлении в камере и при повышенной температуре хранения. Процесс производит материал, известный как лиофилизированная масса. После этого лиофилизированную массу можно восстановить либо стерильной водой, либо подходящим раствором для разведения для инъекций.

[00108] Цикл лиофилизации не только определяет конечное физическое состояние эксципиентов, но также влияет на другие параметры, такие как время восстановления, внешний вид, стабильность и конечное содержание влаги. Структура композиции в замороженном состоянии проходит через несколько преобразований (например, стеклование, смачивание и кристаллизацию), которые происходят при определенных температурах, и структуру можно использовать для понимания и оптимизации процесса лиофилизации. Температура стеклования (Tс и/или Tс') может предоставить информацию о физическом состоянии растворенного вещества и может быть определена с помощью дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК (DSC)). Tс и Tс' являются важным параметром, который необходимо учитывать при разработке цикла лиофилизации. Например, Tс' важна для первичного высушивания. Кроме того, в высушенном состоянии, температура стеклования предоставляет информацию о температуре хранения конечного продукта.

Фармацевтические Препараты и Эксципиенты В Целом

[00109] Эксципиенты представляют собой добавки, которые либо придают, либо усиливают стабильность и доставку лекарственного продукта (например, белка). Независимо от причины их включения эксципиенты являются неотъемлемым компонентом препарата и поэтому должны быть безопасными и хорошо переносимыми пациентами. Для белковых лекарственных средств выбор эксципиентов особенно важен, поскольку они могут влиять как на эффективность, так и на иммуногенность лекарственного средства. Следовательно, белковые препараты должны быть разработаны с соответствующим выбором эксципиентов, которые обеспечивают подходящую стабильность, безопасность и конкурентоспособность.

[00110] Лиофилизированный препарат в одном аспекте, по меньшей мере, содержит один или более буфер, наполнитель и стабилизатор. В этом аспекте полезность поверхностно-активного вещества оценивается и выбирается в тех случаях, когда возникает проблема агрегации на стадии лиофилизации или во время восстановления. Подходящий буферный агент включен для поддержания препарата в стабильных зонах рН во время лиофилизации. Сравнение эксципиентов, рассматриваемых для жидких и лиофилизированных белковых препаратов, приведено в Таблице 10.

Таблица 10: Эксципиенты лиофилизированных белковых препаратов

Эксципиент Функция в лиофилизированном препарате Буфер Поддержание рН препарата во время лиофилизации и восстановления Агент, регулирующий тоничность /стабилизатор Стабилизаторы включают крио- и лиопротекторы
Примеры включают полиолы, сахара и полимеры
Криопротекторы защищают белок от повреждающего действия замораживания
Лиопротектанты стабилизируют белки в лиофилизированном состоянии Наполнитель Используется для улучшения внешнего вида препарата и предотвращения сдувания
Обеспечивает структурную прочность лиофилизированной массы
Примеры включают маннит и глицин Поверхностно-активное вещество Используется, если агрегация во время процесса лиофилизации является проблемой
Может служить для снижения времени восстановления
Примеры включают полисорбат 20 и 80 Антиоксидант Обычно не используется, молекулярные реакции в лиофилизированной массе значительно замедляются Ионы металлов/хелатирующий агент Могут включаться в препарат, если только конкретный ион металла включен в качестве кофактора или если металл необходим для активности протеазы
Хелатирующие агенты обычно не нужны в лио препаратах Консервант Только для многодозовых препаратов
Обеспечивает защиту от роста микроорганизмов в препаратах
Обычно включается в восстановитель (например, бактериостатическую воду для инъекций (bWFI))

[00111] Основной проблемой при разработке препаратов для белков является стабилизация продукта от стрессов производства, доставки и хранения. Роль эксципиентов в препаратах заключается в обеспечении стабилизации от этих стрессов. Эксципиенты также используются для снижения вязкости белковых препаратов с высокой концентрацией, чтобы обеспечить их доставку и повысить удобство для пациента. В целом, эксципиенты могут быть классифицированы на основе механизмов, с помощью которых они стабилизируют белки от различных химических и физических стрессов. Некоторые эксципиенты используются для смягчения последствий определенного стресса или для регулирования конкретной восприимчивости специфического белка. Другие эксципиенты оказывают более общее влияние на физическую и ковалентную стабильность белков. Описанные в данном документе эксципиенты организованы либо по химическому типу, либо по их функциональной роли в препаратах. Краткое описание режимов стабилизации приводится при обсуждении каждого типа эксципиента.

[00112] Учитывая приведенные в данном документе указания и рекомендации, специалисты в данной области техники будут знать, какое количество или диапазон эксципиента может быть включено в любой конкретный препарат для получения биофармацевтического препарата по изобретению, который способствует сохранению стабильности биофармацевтического средства (например, белка). Например, количество и тип соли, которая должна быть включена в биофармацевтический препарат по изобретению, выбирается на основе желаемой осмоляльности (например, изотонической, гипотонической или гипертонической) конечного раствора, а также количества и осмоляльности других компонентов, которые могут быть включены в препарат.

[00113] Например, включение около 5% сорбитола позволяет достичь изотоничности, тогда как для достижения изотоничности необходимо около 9% эксципиента сахарозы. Выбор количества или диапазона концентраций одного или нескольких эксципиентов, которые могут быть включены в биофармацевтический препарат по изобретению, приведен в качестве примера выше со ссылкой на соли, полиолы и сахара. Однако специалистам в данной области техники будет понятно, что соображения, описанные в данном документе и далее иллюстрируемые со ссылкой на специфические эксципиенты, в равной степени применимы ко всем типам и комбинациям эксципиентов, включая, например, соли, аминокислоты, другие агенты, регулирующие тоничность, поверхностно-активные вещества, стабилизаторы, наполнители, криопротекторы, лиопротекторы, антиоксиданты, ионы металлов, хелатообразующие агенты и/или консерванты.

[00114] Кроме того, если конкретный эксципиент указан в молярной концентрации, специалисты в данной области техники поймут, что эквивалентный процент (%) мас./об. (например, (граммы вещества в пробе раствора/мл раствора) X 100%) раствора также рассматривается.

[00115] Конечно, специалист в данной области техники должен понимать, что концентрации эксципиентов, описанные в данном документе, имеют взаимозависимость в пределах конкретного препарата. Например, концентрация наполнителя может быть снижена там, где, например, существует высокая концентрация белка или где, например, существует высокая концентрация стабилизирующего агента. Кроме того, специалист в данной области техники должен признать, что для поддержания изотоничности конкретного препарата, в котором нет наполнителя, концентрация стабилизирующего агента должна быть соответственно отрегулирована (например, будет использовано «тонизирующее» количество стабилизатора). Общие эксципиенты известны в данной области техники и могут быть найдены в Powell et al., Compendium of Excipients fir Parenteral Formulations (1998), PDA J. Pharm. Sci. Technology, 52:238-311.

Фармацевтические Буферы и Буферные Агенты

[00116] Стабильность фармакологически активного белкового препарат обычно максимальна в узком диапазоне pH. Этот диапазон рН оптимальной стабильности должен быть выявлен на ранних стадиях исследований перед приготовлением препарата. Несколько подходов, таких как исследования стабильности способом «ускоренного старения» и калориметрические скрининговые исследования, полезны в этой области (Remmele R.L. Jr., et al., Biochemistry, 38(16): 5241-7 (1999)). Как только приготовление препарата завершено, белок должен быть изготовлен и храниться в течение всего срока годности. Следовательно, буферные агенты почти всегда используются для контроля pH в препарате.

[00117] Буферная емкость буферных частиц максимальна при pH, равном pKa, и уменьшается по мере увеличения или уменьшения pH от этой величины. Девяносто процентов буферной емкости находится в пределах одной единицы pH от ее pKa. Буферная емкость также увеличивается пропорционально с увеличением концентрации буфера.

[00118] При выборе буфера необходимо учитывать несколько факторов. Прежде всего, необходимо определить вид буфера и его концентрацию на основе его pKa и желаемого pH препарата. Не менее важно обеспечить совместимость буфера с белком и другими эксципиентами препарата и не катализировать какие-либо реакции деградации. Третьим важным аспектом, который следует учитывать, является ощущение жжения и раздражения, которое буфер может вызывать при введении. Например, известно, что цитрат вызывает жжение при инъекции (Laursen T, et al., Basic Clin Pharmacol Toxicol., 98(2): 218-21 (2006)). Вероятность жжения и раздражения выше у лекарственных средств, которые вводятся подкожным (п/к) или внутримышечным (в/м) способами, когда раствор лекарственного средства остается на месте в течение относительно более длительного периода времени, чем при введении в/в способом, когда при введении препарат быстро растворяется в крови. Для препаратов, которые вводят путем прямой в/в инфузии, необходимо контролировать общее количество буфера (и любого другого компонента препарата). Нужно быть особенно осторожным в отношении ионов калия, вводимых в форме калий-фосфатного буфера, который может вызывать у пациента реакции со стороны сердечно-сосудистой системы (Hollander-Rodriguez JC, et al., Am. Fam. Physician., 73(2): 283-90 (2006)).

[00119] Буферы для лиофилизированных препаратов требуют дополнительного рассмотрения. Некоторые буферы, такие как фосфат натрия, могут кристаллизоваться из аморфной фазы белка во время замораживания, что приводит к сдвигам рН. Другие распространенные буферы, такие как ацетат и имидазол, могут сублимироваться или испаряться во время процесса лиофилизации, тем самым сдвигая рН препарата во время лиофилизации или после восстановления.

[00120] Буферная система, присутствующая в композициях, выбирается таким образом, чтобы она была физиологически совместимой и поддерживала желаемый уровень pH фармацевтического препарата. В одном варианте реализации изобретения pH раствора составляет от 2,0 до 12,0. Например, pH раствора может составлять 2,0, 2,3, 2,5, 2,7, 3,0, 3,3, 3,5, 3,7, 4,0, 4,3, 4,5, 4,7, 5,0, 5,3, 5,5, 5,7, 6,0, 6,3, 6,5, 6,7, 7,0, 7,3, 7,5, 7,7, 8,0, 8,3, 8,5, 8,7, 9,0, 9,3, 9,5, 9,7, 10,0, 10,3, 10,5, 10,7, 11,0, 11,3, 11,5, 11,7 или 12,0.

[00121] Буферное соединение для поддержания рН может присутствовать в любом количестве, подходящем для поддержания рН препарата на заданном уровне. В одном варианте реализации изобретения концентрация буферного раствора для поддержания рН составляет от 0,1 до 500 мМ (1 М). Например, предполагается, что буферный агент для поддержания рН составляет по меньшей мере 0,1, 0,5, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,2, 1,5, 1,7, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200 или 500 мМ.

[00122] Типовые буферные агенты для поддержания рН, используемые для буферизации препарата, как изложено в данном документе, включают, но не ограничиваются ими, органические кислоты, глицин, гистидин, глутамат, сукцинат, фосфат, ацетат, цитрат, трис, ГЭПЭС и аминокислоты или смеси аминокислот, включая, но не ограничиваясь этим, аспартат, гистидин и глицин. В одном варианте реализации изобретения буферный агент представляет собой цитрат.

Фармацевтические Стабилизаторы и Наполнители

[00123] В одном аспекте к данным фармацевтическим препаратам добавлен стабилизатор (или комбинация стабилизаторов), чтобы предотвратить или уменьшить вызванную хранением агрегацию и химическую деградацию. Белесоватый или мутный раствор при восстановлении указывает на то, что белок выпал в осадок или, по крайней мере, агрегировал. Термин «стабилизатор» означает эксципиент, способный предотвращать агрегацию или физическую деградацию, включая химическую деградацию (например, автолиз, дезамидирование, окисление и т.д.) в водном состоянии. Рассматриваемые стабилизаторы включают, но не ограничиваются ими, сахарозу, трегалозу, маннозу, мальтозу, лактозу, глюкозу, рафинозу, целлобиозу, гентиобиозу, изомальтозу, арабинозу, глюкозамин, фруктозу, маннит, сорбит, глицин, аргинин HCl, поли-гидрокси соединения, включая полисахариды, такие как декстран, крахмал, гидроксиэтилкрахмал, циклодекстрины, N-метилпирролиден, целлюлозу и гиалуроновую кислоту, хлорид натрия (Carpenter et al., Develop. Biol. Standard 74:225, (1991)). В данных препаратах стабилизатор вводят в концентрации около 0,1, 0,5, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,2, 1,5, 1,7, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 500, 700, 900 или 1000 мМ. В одном варианте реализации данного изобретения маннит и трегалоза используются в качестве стабилизирующих агентов.

[00124] При желании в препараты также включают соответствующие количества наполнителей и агентов, регулирующих осмоляльность. Наполнители включают, например, но не ограничиваясь ими, маннит, глицин, сахарозу, полимеры, такие как декстран, поливинилпирролидон, карбоксиметилцеллюлоза, лактоза, сорбит, трегалоза или ксилит. В одном варианте реализации изобретения наполнитель представляет собой маннит. Наполнитель вводится в концентрации около 0,1, 0,5, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,2, 1,5, 1,7, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 500, 700, 900 или 1000 мМ.

Фармацевтические Поверхностно-Активные Вещества

[00125] Белки имеют высокую склонность к взаимодействию с поверхностями, что делает их восприимчивыми к адсорбции и денатурации на границах раздела воздух-жидкость, флакон-жидкость и жидкость-жидкость (силиконовое масло). Было обнаружено, что этот путь деградации обратно зависит от концентрации белка и приводит либо к образованию растворимых и нерастворимых белковых агрегатов, либо к снижению количества белка в растворе в результате адсорбции на поверхности. В дополнение к адсорбции на поверхности емкости поверхностно индуцированная деградация усугубляется физическим перемешиванием, что может происходить при транспортировке и обращении с продуктом.

[00126] Поверхностно-активные вещества обычно используются в белковых препаратах для предотвращения поверхностно индуцированной деградации. Поверхностно-активные вещества представляют собой амфипатические молекулы со способностью вытеснения конкурирующих белков в межфазных положениях. Гидрофобные части молекул поверхностно-активного вещества занимают межфазные позиции (например, воздух/жидкость), в то время как гидрофильные части молекул остаются ориентированными к основному растворителю. При достаточных концентрациях (обычно около критической мицеллярной концентрации детергента) поверхностный слой молекул поверхностно-активного вещества служит для предотвращения адсорбции молекул белка на границе раздела. Таким образом, поверхностно индуцированная деградация сводится к минимуму. Поверхностно-активные вещества, рассматриваемые в данном документе, включают, но не ограничиваются этим, сложные эфиры жирных кислот и сорбитанполиэтоксилатов, например, полисорбат 20 и полисорбат 80. Они отличаются только длиной алифатической цепи, которая придает гидрофобный характер молекулам C-12 и C-18 соответственно. Соответственно, полисорбат-80 является более поверхностно-активным и имеет более низкую критическую мицеллярную концентрацию, чем полисорбат-20.

[00127] Детергенты также могут влиять на термодинамическую конформационную стабильность белков. В данном случае снова, эффекты данного детергентного эксципиента будут специфичными для белка. Например, было показано, что полисорбаты снижают стабильность некоторых белков и увеличивают стабильность других. Детергентная дестабилизация белков может быть объяснена тем, что гидрофобные хвосты молекул детергента могут вступать в специфическое связывание с белком в частично или полностью развернутом состоянии. Эти типы взаимодействий могут вызвать сдвиг в конформационном равновесии в сторону более развернутого состояния белка (например, увеличение воздействия гидрофобных участков молекулы белка в дополнение к связывающему полисорбату). Альтернативно, если нативное состояние белка имеет некоторые гидрофобные поверхности, связывание детергента с нативным состоянием может стабилизировать эту конформацию.

[00128] Другим аспектом полисорбатов является то, что они по своей природе подвержены окислительной деградации. Часто, в качестве исходного вещества, они содержат достаточное количество пероксидов, чтобы вызвать окисление боковых цепей белковых остатков, особенно метионина. Потенциал окислительного повреждения в результате добавления стабилизатора подчеркивает тот факт, что в препаратах следует использовать самые низкие эффективные концентрации эксципиентов. Для поверхностно-активных веществ эффективная концентрация для данного белка будет зависеть от механизма стабилизации.

[00129] Поверхностно-активные вещества также добавляют в соответствующих количествах для предотвращения явления агрегации на поверхности во время замораживания и высушивания (Chang, B, J. Pharm. Sci. 85:1325, (1996)). Таким образом, типовые поверхностно-активные вещества включают, но не ограничиваются этим, анионные, катионные, неионные, цвиттер-ионные и амфотерные поверхностно-активные вещества, включая поверхностно-активные вещества, полученные из аминокислот, встречающихся в природе. Анионные поверхностно-активные вещества включают, но не ограничиваются ими, лаурилсульфат натрия, диоктилсульфосукцинат натрия и диоктилсульфонат натрия, хенодезоксихолевую кислоту, натриевую соль N-лауроилсаркозина, натриевую соль додецилсульфата лития, натриевую соль 1-октансульфоновой кислоты, гидрат холата натрия, деоксилат натрия и натриевую соль гликодезоксихолевой кислоты. Катионные поверхностно-активные вещества включают, но не ограничиваются ими, хлорид бензалкония или хлорид бензетония, моногидрат цетилпиридиния хлорида и бромид гексадецилтриметиламмония. Цвиттер-ионные поверхностно-активные вещества включают, но не ограничиваются ими, CHAPS, CHAPSO, SB3-10 и SB3-12. Неионные поверхностно-активные вещества включают, но не ограничиваются ими, дигитонин, Тритон Х-100, Тритон х-114, ТВИН-20 и ТВИН-80. Поверхностно-активные вещества также включают, но не ограничиваются ими, лауромакрогол 400, полиоксил 40 стеарат, полиоксиэтилен гидрогенизированное касторовое масло 10, 40, 50 и 60, глицеринмоностеарат, полисорбат 40, 60, 65 и 80, соевый лецитин и другие фосфолипиды, такие как диолилфосфатидилхолин (DOPC), димиристоилфосфатидилглицерин (DMPG), димиристоилфосфатидилхолин (DMPC) и (диолеилфосфатидилглицерин) DOPG; эфир сахарозы и жирных кислот, метилцеллюлозу и карбоксиметилцеллюлозу. Поэтому композиции, содержащие эти поверхностно-активные вещества, либо по отдельности, либо в виде смеси в различных соотношениях, дополнительно представляются. В одном варианте реализации данного изобретения поверхностно-активное вещество представляет собой ТВИН-80. В данные препараты поверхностно-активное вещество вводят в концентрации от около 0,01 до около 0,5 г/л. В представленных препаратах концентрация поверхностно-активного вещества составляет 0,005, 0,01, 0,02, 0,03, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 или 1,0 г/л.

Фармацевтические Соли

[00130] Соли часто добавляют для увеличения ионной силы препарата, что может быть важно для растворимости белка, физической стабильности и изотоничности. Соли могут влиять на физическую стабильность белков различными способами. Ионы могут стабилизировать нативное состояние белков путем связывания с заряженными остатками на поверхности белка. Альтернативно, соли могут стабилизировать денатурированное состояние путем связывания с пептидными группами вдоль основной цепи белка (-CONH-). Соли также могут стабилизировать нативную конформацию белка путем экранирования отталкивающих электростатических взаимодействий между остатками в молекуле белка. Соли в белковых препаратах могут также экранировать электростатические взаимодействия между белковыми молекулами, которые могут приводить к агрегации и нерастворимости белка. В представленных препаратах концентрация соли находится в пределах 0,1, 1, 10, 20, 30, 40, 50, 80, 100, 120, 150, 200, 300 и 500 мМ.

Другие Распространенные Эксципиенты: Фармацевтические Аминокислоты

[00131] Аминокислоты нашли универсальное применение в белковых препаратах в качестве буферов, наполнителей, стабилизаторов и антиоксидантов. Таким образом, в одном аспекте гистидин и глутаминовая кислота используются для буферизации белковых препаратов в диапазоне рН 5,5-6,5 и 4,0-5,5 соответственно. Имидазольная группа гистидина имеет pKa=6,0, а карбоксильная группа боковой цепи глутаминовой кислоты имеет pKa 4,3, что делает эти аминокислоты пригодными для буферизации в их соответствующих диапазонах pH. Глутаминовая кислота особенно полезна в таких случаях. Гистидин обычно содержится в коммерческих белковых препаратах, и эта аминокислота обеспечивает альтернативу цитрату, буферу, который как известно вызывает чувство жжения при инъекции. Интересно отметить, что гистидин также обладает стабилизирующим эффектом в отношении агрегации при использовании в высоких концентрациях как в жидких, так и в лиофилизированных формах (Chen B, et al., Pharm Res., 20(12): 1952-60 (2003)). Гистидин также изучался другими исследователями в отношении снижения вязкости препарата с высокой концентрацией белка. Однако в том же исследовании авторы наблюдали увеличение агрегации и обесцвечивания в гистидинсодержащих препаратах во время исследований замораживания-оттаивания антитела в емкостях из нержавеющей стали. Еще одно предостережение в отношении гистидина заключается в том, что он подвергается фотоокислению в присутствии ионов металлов (Tomita M, et al., Biochemistry, 8(12): 5149-60 (1969)). Использование метионина в качестве антиоксиданта в препаратах кажется многообещающим; было обнаружено, что он эффективен против ряда окислительных стрессов (Lam XM, et al., J Pharm ScL, 86(11): 1250-5 (1997)).

[00132] В различных аспектах предложены препараты, которые включают одну или более аминокислот: глицин, пролин, серин, аргинин и аланин, которые как было показано, стабилизируют белки по механизму преимущественного исключения. Глицин также является обычно используемым наполнителем в лиофилизированных препаратах. Было показано, что аргинин является эффективным средством в ингибировании агрегации и применяется как в жидких, так и в лиофилизированных препаратах.

[00133] В представленных препаратах концентрация аминокислот находится в пределах 0,1, 1, 10, 20, 30, 40, 50, 80, 100, 120, 150, 200, 300 и 500 мМ. В одном варианте реализации данного изобретения аминокислота представляет собой глицин.

Другие Общие Компоненты Эксципиента: Фармацевтические Антиоксиданты

[00134] Окисление белковых остатков возникает из целого ряда различных источников. Помимо добавления специфических антиоксидантов, предотвращение окислительного повреждения белка включает в себя тщательный контроль ряда факторов на протяжении всего процесса производства и хранения продукта, таких как атмосферный кислород, температура, воздействие света и химическое загрязнение. Следовательно, изобретение предусматривает использование фармацевтических антиоксидантов, включая, но не ограничиваясь ими, восстанавители, акцепторы кислорода/свободных радикалов или хелатирующие агенты. Антиоксиданты в терапевтических белковых препаратах, в одном аспекте, являются водорастворимыми и остаются активными в течение всего срока годности продукта. Восстанавливающие агенты и акцепторы кислорода/свободных радикалов работают путем удаления активных форм кислорода в растворе. Хелатообразующие агенты, такие как ЭДТА, эффективны, связывая примеси микроэлементов, которые способствуют образованию свободных радикалов. Например, ЭДТА использовалась в жидком препарате кислотного фактора роста фибробластов для ингибирования катализируемого ионами металла окисления остатков цистеина.

[00135] В дополнение к эффективности различных эксципиентов для предотвращения окисления белка, возможность самих антиоксидантов вызывать другие ковалентные или физические изменения белка вызывает беспокойство. Например, восстанавливающие агенты могут вызвать нарушение внутримолекулярных дисульфидных связей, что может привести к перетасовке дисульфидов. Было показано, что в присутствии ионов переходных металлов аскорбиновая кислота и ЭДТА способствуют окислению метионина в ряде белков и пептидов (Akers MJ, and Defelippis MR. Peptides and Proteins as Parenteral Solutions. In: Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins. Sven Frokjaer, Lars Hovgaard, editors. Pharmaceutical Science. Taylor and Francis, UK (1999)); Fransson J.R., /. Pharm. Sci. 86(9): 4046-1050 (1997); Yin J, et al., Pharm Res., 21(12): 2377-83 (2004)). Сообщалось, что тиосульфат натрия снижает уровни метионинового окисления, вызванного светом и температурой, в rhuMab HER2; однако образование аддукта тиосульфат-белок также сообщалось в этом исследовании (Lam XM, Yang JY, et al., J Pharm Sci. 86(11): 1250-5 (1997)). Выбор подходящего антиоксиданта производится в соответствии с конкретными стрессами и чувствительностью белка. Антиоксиданты, рассматриваемые в определенных аспектах, включают, но не ограничиваются ими, восстанавливающие агенты и акцепторы кислорода/свободных радикалов, ЭДТА и тиосульфат натрия.

Другие Распространенные Компоненты Эксципиента: Фармацевтические Ионы Металлов

[00136] В целом, ионы переходных металлов нежелательны в белковых препаратах, поскольку они могут катализировать физические и химические реакции деградации белков. Однако конкретные ионы металлов включаются в препараты, когда они являются кофакторами белков, и в препараты суспензий белков, где они образуют координационные комплексы (например, цинковая суспензия инсулина). Недавно было предложено использование ионов магния (10 -120 мМ) для ингибирования изомеризации аспарагиновой кислоты в изоаспарагиновую кислоту (WO 2004039337).

[00137] Двумя примерами, в которых ионы металлов придают стабильность или повышенную активность в белках, являются дезоксирибонуклеаза человека (рчДНКаза, Pulmozyme®) и Фактор VIII. В случае рчДНКаза ионы Ca⁺² (до 100 мМ) повышали стабильность фермента через специфический сайт связывания (Chen B, et al., / Pharm Sci., 88(4): 477-82 (1999)). Фактически, удаление ионов кальция из раствора с ЭГТК вызывало увеличение дезамидирования и агрегации. Однако этот эффект наблюдался только с ионами Ca⁺² ; другие двухвалентные катионы Mg⁺², Mn⁺² и Zn⁺² как было обнаружено, дестабилизируют рчДНКазу. Подобные эффекты наблюдались в Факторе VIII. Ионы Ca⁺² и Sr⁺² стабилизировали белок, тогда как другие, такие как Mg⁺², Mn⁺² и Zn⁺², Cu⁺² и Fe⁺², дестабилизировали фермент (Fatouros, A., et al., Int. J. Pharm., 155, 121-131 (1997). В отдельном исследовании с Фактором VIII значительное увеличение скорости агрегации наблюдалось в присутствии ионов Al⁺³ (Derrick TS, et al., /. Pharm. Sci., 93(10): 2549-57 (2004)). Авторы отмечают, что другие вспомогательные вещества, такие как буферные соли, часто загрязнены ионами Al⁺³ и иллюстрируют необходимость использования эксципиентов соответствующего качества в лекарственных препаратах.

Другие Распространенные Компоненты Эксципиента: Фармацевтические Консерванты

[00138] Консерванты необходимы при разработке многоразовых парентеральных препаратов, которые включают более одного извлечения из одной эмкости. Их основная функция заключается в подавлении роста микробов и обеспечении стерильности продукта в течение всего срока годности или срока использования лекарственного препарата. Обычно используемые консерванты включают, но не ограничиваются этим, бензиловый спирт, фенол и м-крезол. Хотя консерванты имеют долгую историю применения, разработка белковых препаратов, которые включают консерванты, может быть сложной задачей. Консерванты почти всегда оказывают дестабилизирующее действие (агрегацию) на белки, и это стало основным фактором, ограничивающим их использование в многодозовых белковых препаратах (Roy S, et al., J Pharm ScL, 94(2): 382-96 (2005)).

[00139] На сегодняшний день большинство белковых препаратов были разработаны только для одноразового использования. Тем не менее, когда возможны многодозовые препараты, они имеют дополнительное преимущество, заключающееся в обеспечении удобства для пациентов и увеличении конкурентоспособности препарата. Хорошим примером является гормон роста человека (hGH), где разработка препаратов содержащих консерванты привела к коммерциализации более удобных, многоразовых шприц-ручек. В настоящее время на рынке доступно по меньшей мере четыре таких шприц-ручки, содержащих препараты hGH с консервантами. Нордитропин® (Norditropin®, жидкий, Novo Nordisk), Нутропин AQ® (Nutropin AQ®, жидкий, Genentech) и Генотропин (лиофилизированный - двухкамерный картридж, Pharmacia & Upjohn) содержат фенол, в то время как Соматропин® (Somatropin® (Eli Lilly)) содержит м-крезол.

[00140] При разработке содержащих консерванты лекарственных форм препарата необходимо учитывать несколько аспектов. Эффективная концентрация консерванта в лекарственном препарате должна быть оптимизирована. Это требует тестирования данного консерванта в лекарственной форме с диапазонами концентраций, которые придают антимикробную эффективность без ущерба для стабильности белка. Например, три консерванта были успешно проверены при разработке жидкого препарата для рецептора интерлейкина-1 (Тип I) с использованием дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК). Консерванты были ранжированы по степени их влияния на стабильность при концентрациях, обычно используемых в зарегистрированных препаратах (Remmele RL Jr., et al., Pharm Res., 15(2): 200-8 (1998)).

[00141] Разработка жидких препаратов, содержащих консерванты, является более сложной задачей, чем лиофилизированные препараты. Лиофилизированные лекарственные продукты могут быть лиофилизированы без консерванта и восстановлены раствором для разведения, содержащим консервант, во время использования. Это сокращает время, в течение которого консервант находится в контакте с белком, значительно минимизируя связанные с этим риски стабильности. При использовании жидких препаратов эффективность и стабильность консерванта должны поддерживаться в течение всего срока годности препарата (- 18-24 месяца). Важно отметить, что эффективность консерванта должна быть продемонстрирована в конечном препарате, содержащем активное лекарственное средство и все эксципиенты.

[00142] Некоторые консерванты могут вызывать реакции в месте инъекции, что является еще одним фактором, который необходимо учитывать при выборе консерванта. В клинических испытаниях, которые были сосредоточены на оценке консервантов и буферов в Нордитропине, наблюдалось снижение восприятия боли в препаратах, содержащих фенол и бензиловый спирт, по сравнению с препаратом, содержащим м-крезол (Kappelgaard A.M., Horm Res. 62 Suppl 3:98-103 (2004)). Интересно, что среди обычно используемых консервантов бензиловый спирт обладает анестезирующими свойствами (Minogue SC, and Sun DA., AnesthAnalg., 100(3): 683-6 (2005)). В различных аспектах использование консервантов обеспечивает преимущество, которое перевешивает любые побочные эффекты.

Способы Приготовления Фармацевтических Препаратов

[00143] Данное изобретение также предусматривает способы приготовления фармацевтических препаратов.

[00144] Данные способы дополнительно включают одну или более из следующих стадий: добавление стабилизирующего агента, как описано в данном документе, к указанной смеси перед лиофилизацией, добавление к указанной смеси перед лиофилизацией по меньшей мере одного агента, выбранного из наполнителя, агента, регулирующего осмоляльность, и поверхностно-активного вещества, согласно тому как указано для каждого из них в данном документе.

[00145] Стандартная практика восстановления для лиофилизированного материала заключается в добавлении объема чистой воды или стерильной воды для инъекций (воды д/и) (обычно эквивалентного объему, удаленному во время лиофилизации), хотя разбавленные растворы антибактериальных агентов иногда используются при производстве фармацевтических препаратов для парентеральное введение (Chen, Drug Development and Industrial Pharmacy, 18:1311-1354 (1992)]. Соответственно, предлагаются способы получения восстановленных композиций рФфВ, включающие стадию добавления раствора для разведения к лиофилизированной композиции рФфВ по изобретению.

[00146] Лиофилизированный материал может быть восстановлен в виде водного раствора. Разнообразные водные носители, например, стерильная вода для инъекций, вода с консервантами для многократного использования или вода с подходящими количествами поверхностно-активных веществ (например, водная суспензия, которая содержит активное соединение в смеси с эксципиентами, подходящими для производства водных суспензии). В различных аспектах такими эксципиентами являются суспендирующие агенты, например, но не ограничиваясь этим, карбоксиметилцеллюлоза натрия, метилцеллюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза, альгинат натрия, поливинилпирролидон, трагакантовая камедь и аравийская камедь; диспергирующие или смачивающие агенты представляют собой природного происхождения фосфатид, например, но не ограничиваясь этим, лецитин, или продукты конденсации алкиленоксида с жирными кислотами, например, но не ограничиваясь этим, полиоксиэтиленстеарат, или продукты конденсации этиленоксида с алифатическими спиртами с длинной цепью например, но не ограничиваясь этим, гептадекаэтиленоксицетанол, или продукты конденсации этиленоксида с частичными эфирами, полученными из жирных кислот, и гекситом, такой как полиоксиэтиленсорбитолмоноолеат, или продукты конденсации этиленоксида с частичными эфирами, полученными из жирных кислот и гекситоловых ангидридов, например, но не ограничиваясь этим, полиэтилен сорбитанмоноолеат. В различных аспектах водные суспензии также содержат один или более консервантов, например, но не ограничиваясь этим, этил или н-пропил, п-гидроксибензоат.

Типовой Препарат рФфВ для Введения

[00147] В некоторых вариантах реализации изобретения данные способы предусматривают улучшенный препарат, который позволяет получить конечный продукт с высокой эффективностью (высокой концентрацией рФфВ и повышенной долгосрочной стабильностью), чтобы уменьшить объем для терапии (от 100 МЕ/мл до 10000 МЕ/мл). В некоторых вариантах реализации изобретения концентрация рФфВ в препарате для введения составляет от около 100 МЕ/мл до 10000 МЕ/мл. В некоторых вариантах реализации изобретения концентрация рФфВ в препарате для введения составляет от около 500 МЕ/мл до 10000 МЕ/мл. В некоторых вариантах реализации изобретения концентрация рФфВ в препарате для введения составляет от около 1000 МЕ/мл до 10000 МЕ/мл. В некоторых вариантах реализации изобретения концентрация рФфВ в препарате для введения составляет от около 2000 МЕ/мл до 10000 МЕ/мл. В некоторых вариантах реализации изобретения концентрация рФфВ в препарате для введения составляет от около 3000 МЕ/мл до 10000 МЕ/мл. В некоторых вариантах реализации изобретения концентрация рФфВ в препарате для введения составляет от около 4000 МЕ/мл до 10000 МЕ/мл. В некоторых вариантах реализации изобретения концентрация рФфВ в препарате для введения составляет от около 5000 МЕ/мл до 10000 МЕ/мл. В некоторых вариантах реализации изобретения концентрация рФфВ в препарате для введения составляет от около 6000 МЕ/мл до 10000 МЕ/мл. В некоторых вариантах реализации изобретения концентрация рФфВ в препарате для введения составляет от около 7000 МЕ/мл до 10000 МЕ/мл. В некоторых вариантах реализации изобретения концентрация рФфВ в препарате для введения составляет от около 8000 МЕ/мл до 10000 МЕ/мл. В некоторых вариантах реализации изобретения концентрация рФфВ в препарате для введения составляет от около 9000 МЕ/мл до 10000 МЕ/мл.

[00148] В некоторых вариантах реализации изобретения препарат для введения содержит одно или более цвиттер-ионных соединений, включая, например, такие аминокислоты, как Гистидин, Глицин, Аргинин. В некоторых вариантах реализации изобретения препарат для введения сожержит компонент с амфипатической характеристикой, имеющий минимум одну гидрофобную и одну гидрофильную группу, включая, например, полисорбат 80, октилпиранозид, дипептиды и/или амфипатические пептиды. В некоторых вариантах реализации изобретения препарат для введения содержит невосстанавливающий сахар или сахарный спирт или дисахариды, включая, например, сорбит, маннит, сахарозу или трегалозу. В некоторых вариантах реализации изобретения препарат для введения содержит нетоксичную водорастворимую соль, включая, например, хлорид натрия, что приводит к физиологической осмоляльности. В некоторых вариантах реализации изобретения препарат для введения имеет рН в диапазоне от 6,0 до 8,0. В некоторых вариантах реализации изобретения препарат для введения имеет рН около 6,0, около 6,5, около 7, около 7,5 или около 8,0. В некоторых вариантах реализации изобретения препарат для введения содержит один или более двухвалентных катионов, которые стабилизируют рФфВ, включая, например, Ca2+, Mg2+, Zn2+, Mn2+ и/или их комбинации. В некоторых вариантах реализации изобретения препарат для введения содержит от около 1 до около 50 мМ Глицина, от около 1 до около 50 мМ Гистидина, от около нуля до около 300 мМ хлорида натрия (например, менее чем 300 мМ натрия), от около 0,01% до около 0,05% полисорбата 20 (или полисорбата 80) и от около 0,5% до около 20% (мас./мас.) сахарозы с рН около 7,0 и имеет физиологическую осмолярность в момент введения.

[00149] В некоторых вариантах реализации изобретения препарат для введения может быть лиофилизирован. В некоторых вариантах реализации изобретения препарат для введения является стабильным и может храниться в жидком состоянии при температуре от около 2°C до около 8°C, а также при температуре от около 18°C до около 25°C. В некоторых вариантах реализации изобретения препарат для введения является стабильным и может храниться в жидком состоянии при температуре от около 2°C до около 8°C. В некоторых вариантах реализации изобретения препарат для введения является стабильным и может храниться в жидком состоянии при температуре от около 18°C до около 25°C.

Введение препарата/Дозирование

[00150] Для введения композиций человеку или тестируемым животным в одном аспекте композиции содержат один или более фармацевтически приемлемых носителей. Фразы «фармацевтически» или «фармакологически» приемлемые относятся к молекулярным веществам и композициям, которые являются стабильными, ингибируют деградацию белка, такую как образование продуктов агрегации и распада белка, и, кроме того, не вызывают аллергических или других нежелательных явлений при введении с использованием способов, хорошо известных в данной области техники, как описано ниже. «Фармацевтически приемлемые носители» включают любые и все клинически полезные растворители, дисперсионные среды, оболочки, антибактериальные и противогрибковые агенты, изотонические и замедляющие абсорбцию агенты и тому подобное, включая агенты, описанные выше.

[00151] Фармацевтические препараты вводят перорально, местно, трансдермально, парентерально, путем ингаляционного спрея, вагинально, ректально или путем интракраниальной инъекции. Используемый в контексте данного документа термин парентеральный включает подкожные инъекции, внутривенные, внутримышечные, интрацистернальные инъекции или способы инфузии. Предполагается также введение внутривенной, внутрикожной, внутримышечной, интрамаммарной, интраперитонеальной, интратекальной, ретробульбарной и/или внутрилегочной инъекции в конкретном месте. Как правило, композиции в основном не содержат пирогенов, а также других примесей, которые могут быть вредными для реципиента.

[00152] Согласно данному изобретению рФфВ вводят в отсутствие Фактора VIII (ФVIII). В некоторых вариантах реализации изобретения ФVIII не вводят.

[00153] В некоторых вариантах реализации изобретения рФфВ до хирургического вмешательства, как обсуждается в данном документе. В некоторых вариантах реализации изобретения рФфВ вводят по меньшей мере за 12 часов, по меньшей мере 13 часов, по меньшей мере 14 часов, по меньшей мере 15 часов, по меньшей мере 16 часов, по меньшей мере 17 часов, по меньшей мере 18 часов, по меньшей мере 19 часов, по меньшей мере 20 часов, по меньшей мере 21 час, по меньшей мере 22 часа, по меньшей мере 23 часа или по меньшей мере 24 часа до хирургического вмешательства. В некоторых вариантах реализации изобретения хирургическое вмешательство представляет собой малое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения хирургическое вмешательство представляет собой обширное хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения ФVIII не вводят.

[00154] В некоторых вариантах реализации изобретения 35-60 МЕ/кг рФфВ вводят по меньшей мере за 12 часов, по меньшей мере 13 часов, по меньшей мере 14 часов, по меньшей мере 15 часов, по меньшей мере 16 часов, по меньшей мере 17 часов, по меньшей мере 18 часов, по меньшей мере 19 часов, по меньшей мере 20 часов, по меньшей мере 21 час, по меньшей мере 22 часа, по меньшей мере 23 часа или по меньшей мере 24 часа до хирургического вмешательства. В некоторых вариантах реализации изобретения 50-60 МЕ/кг рФфВ вводят по меньшей мере за 12 часов, по меньшей мере 13 часов, по меньшей мере 14 часов, по меньшей мере 15 часов, по меньшей мере 16 часов, по меньшей мере 17 часов, по меньшей мере 18 часов, по меньшей мере 19 часов, по меньшей мере 20 часов, по меньшей мере 21 час, по меньшей мере 22 часа, по меньшей мере 23 часа или по меньшей мере 24 часа до хирургического вмешательства. В некоторых вариантах реализации изобретения 20-40 МЕ/кг рФфВ вводят по меньшей мере за 12 часов, по меньшей мере 13 часов, по меньшей мере 14 часов, по меньшей мере 15 часов, по меньшей мере 16 часов, по меньшей мере 17 часов, по меньшей мере 18 часов, по меньшей мере 19 часов, по меньшей мере 20 часов, по меньшей мере 21 час, по меньшей мере 22 часа, по меньшей мере 23 часа или по меньшей мере 24 часа до хирургического вмешательства. В некоторых вариантах реализации изобретения хирургическое вмешательство представляет собой обширное хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения хирургическое вмешательство представляет собой малое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения хирургическое вмешательство представляет собой челюстно-лицевое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения ФVIII не вводят.

[00155] В некоторых вариантах реализации изобретения около 50-60 МЕ/кг рФфВ вводят в период от 12 часов до 24 часов до хирургического вмешательства. В некоторых вариантах реализации изобретения около 50-60 МЕ/кг рФфВ вводят в период от 12 часов до 24 часов до хирургического вмешательства и хирургическое вмешательство представляет собой малое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 55-60 МЕ/кг рФфВ вводят в период от 12 часов до 24 часов до хирургического вмешательства и хирургическое вмешательство представляет собой малое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 50-55 МЕ/кг рФфВ вводят в период от 12 часов до 24 часов до хирургического вмешательства и хирургическое вмешательство представляет собой малое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 50 МЕ/кг, около 52 МЕ/кг, около 54 МЕ/кг, около 56 МЕ/кг, около 58 МЕ/кг или около 60 МЕ/кг рФфВ вводят в период от 12 часов до 24 часов до хирургического вмешательства и хирургическое вмешательство представляет собой малое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения ФVIII не вводят.

[00156] В некоторых вариантах реализации изобретения около 35-60 МЕ/кг рФфВ вводят в период от 12 часов до 24 часов до хирургического вмешательства. В некоторых вариантах реализации изобретения около 35-55 МЕ/кг рФфВ вводят в период от 12 часов до 24 часов до хирургического вмешательства и хирургическое вмешательство представляет собой обширное хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 30-60 МЕ/кг рФфВ вводят в период от 12 часов до 24 часов до хирургического вмешательства и хирургическое вмешательство представляет собой обширное хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 40-60 МЕ/кг рФфВ вводят в период от 12 часов до 24 часов до хирургического вмешательства и хирургическое вмешательство представляет собой обширное хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 45-60 МЕ/кг рФфВ вводят в период от 12 часов до 24 часов до хирургического вмешательства и хирургическое вмешательство представляет собой обширное хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 50-60 МЕ/кг рФфВ вводят в период от 12 часов до 24 часов до хирургического вмешательства и хирургическое вмешательство представляет собой обширное хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 35 МЕ/кг, около 40 МЕ/кг, около 45 МЕ/кг, около 50 МЕ/кг, около 55 МЕ/кг или около 60 МЕ/кг рФфВ вводят в период от 12 часов до 24 часов до хирургического вмешательства и хирургическое вмешательство представляет собой обширное хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения ФVIII не вводят.

[00157] В некоторых вариантах реализации изобретения около 20-40 МЕ/кг рФфВ вводят в период от 12 часов до 24 часов до указанного хирургического вмешательства и указанное хирургическое вмешательство представляет собой челюстно-лицевое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 20 МЕ/кг рФфВ вводят в период от 12 часов до 24 часов до указанного хирургического вмешательства и указанное хирургическое вмешательство представляет собой челюстно-лицевое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 25 МЕ/кг рФфВ вводят в период от 12 часов до 24 часов до указанного хирургического вмешательства и указанное хирургическое вмешательство представляет собой челюстно-лицевое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 30 МЕ/кг рФфВ вводят в период от 12 часов до 24 часов до указанного хирургического вмешательства и указанное хирургическое вмешательство представляет собой челюстно-лицевое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 35 МЕ/кг рФфВ вводят в период от 12 часов до 24 часов до указанного хирургического вмешательства и указанное хирургическое вмешательство представляет собой челюстно-лицевое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 40 МЕ/кг рФфВ вводят в период от 12 часов до 24 часов до указанного хирургического вмешательства и указанное хирургическое вмешательство представляет собой челюстно-лицевое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения ФVIII не вводят.

[00158] В некоторых вариантах реализации изобретения способ включает второй этап предварительного лечения введения рФфВ за 1 час до хирургического вмешательства. В некоторых вариантах реализации изобретения около 5-50 МЕ/кг рФфВ вводят за 1 час до хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой малое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 5 МЕ/кг рФфВ вводят за 1 час до хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой малое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 10 МЕ/кг рФфВ вводят за 1 час до хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой малое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 15 МЕ/кг рФфВ вводят за 1 час до хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой малое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 20 МЕ/кг рФфВ вводят за 1 час до хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой малое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 25 МЕ/кг рФфВ вводят за 1 час до хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой малое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 30 МЕ/кг рФфВ вводят за 1 час до хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой малое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 35 МЕ/кг рФфВ вводят за 1 час до хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой малое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 40 МЕ/кг рФфВ вводят за 1 час до хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой малое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 45 МЕ/кг рФфВ вводят за 1 час до хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой малое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 50 МЕ/кг рФфВ вводят за 1 час до хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой малое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения ФVIII не вводят.

[00159] В некоторых вариантах реализации изобретения около 15-90 МЕ/кг рФфВ вводят за 1 час до хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой обширное хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 15 МЕ/кг рФфВ вводят за 1 час до хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой обширное хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 20 МЕ/кг рФфВ вводят за 1 час до хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой обширное хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 25 МЕ/кг рФфВ вводят за 1 час до хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой обширное хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 30 МЕ/кг рФфВ вводят за 1 час до хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой обширное хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 35 МЕ/кг рФфВ вводят за 1 час до хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой обширное хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 40 МЕ/кг рФфВ вводят за 1 час до хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой обширное хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 45 МЕ/кг рФфВ вводят за 1 час до хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой обширное хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 50 МЕ/кг рФфВ вводят за 1 час до хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой обширное хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 55 МЕ/кг рФфВ вводят за 1 час до хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой обширное хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 60 МЕ/кг рФфВ вводят за 1 час до хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой обширное хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 65 МЕ/кг рФфВ вводят за 1 час до хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой обширное хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 70 МЕ/кг рФфВ вводят за 1 час до хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой обширное хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 75 МЕ/кг рФфВ вводят за 1 час до хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой обширное хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 80 МЕ/кг рФфВ вводят за 1 час до хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой обширное хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 85 МЕ/кг рФфВ вводят за 1 час до хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой обширное хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 90 МЕ/кг рФфВ вводят за 1 час до хирургического вмешательства, причемв случае если хирургическое вмешательство представляет собой обширное хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения ФVIII не вводят.

[00160] В некоторых вариантах реализации изобретения около 20-50 МЕ/кг рФфВ вводят за 1 час до хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой челюстно-лицевое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 25-50 МЕ/кг рФфВ вводят за 1 час до хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой челюстно-лицевое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 30-50 МЕ/кг рФфВ вводят за 1 час до хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой челюстно-лицевое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 25-40 МЕ/кг рФфВ вводят за 1 час до хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой челюстно-лицевое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 40-50 МЕ/кг рФфВ вводят за 1 час до хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой челюстно-лицевое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 20 МЕ/кг рФфВ вводят за 1 час до хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой челюстно-лицевое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 25 МЕ/кг рФфВ вводят за 1 час до хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой челюстно-лицевое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 30 МЕ/кг рФфВ вводят за 1 час до хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой челюстно-лицевое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 35 МЕ/кг рФфВ вводят за 1 час до хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой челюстно-лицевое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 40 МЕ/кг рФфВ вводят за 1 час до хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой челюстно-лицевое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 45 МЕ/кг рФфВ вводят за 1 час до хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой челюстно-лицевое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 50 МЕ/кг рФфВ вводят за 1 час до хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой челюстно-лицевое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения ФVIII не вводят.

[00161] В некоторых вариантах реализации изобретения способ включает введения рФфВ во время хирургического вмешательства. В некоторых вариантах реализации изобретения около 10-50 МЕ/кг рФфВ вводят во время указанного хирургического вмешательства и указанное хирургическое вмешательство представляет собой челюстно-лицевое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 20-50 МЕ/кг рФфВ вводят во время указанного хирургического вмешательства и указанное хирургическое вмешательство представляет собой челюстно-лицевое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 30-50 МЕ/кг рФфВ вводят во время указанного хирургического вмешательства и указанное хирургическое вмешательство представляет собой челюстно-лицевое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 40-50 МЕ/кг рФфВ вводят во время указанного хирургического вмешательства и указанное хирургическое вмешательство представляет собой челюстно-лицевое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 20-40 МЕ/кг рФфВ вводят во время указанного хирургического вмешательства и указанное хирургическое вмешательство представляет собой челюстно-лицевое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 30-40 МЕ/кг рФфВ вводят во время указанного хирургического вмешательства и указанное хирургическое вмешательство представляет собой челюстно-лицевое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения 10 МЕ/кг рФфВ вводят во время указанного хирургического вмешательства и указанное хирургическое вмешательство представляет собой челюстно-лицевое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 15 МЕ/кг рФфВ вводят во время указанного хирургического вмешательства и указанное хирургическое вмешательство представляет собой челюстно-лицевое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 20 МЕ/кг рФфВ вводят во время указанного хирургического вмешательства и указанное хирургическое вмешательство представляет собой челюстно-лицевое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 25 МЕ/кг рФфВ вводят во время указанного хирургического вмешательства и указанное хирургическое вмешательство представляет собой челюстно-лицевое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 30 МЕ/кг рФфВ вводят во время указанного хирургического вмешательства и указанное хирургическое вмешательство представляет собой челюстно-лицевое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 35 МЕ/кг рФфВ вводят во время указанного хирургического вмешательства и указанное хирургическое вмешательство представляет собой челюстно-лицевое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 40 МЕ/кг рФфВ вводят во время указанного хирургического вмешательства и указанное хирургическое вмешательство представляет собой челюстно-лицевое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 45 МЕ/кг рФфВ вводят во время указанного хирургического вмешательства и указанное хирургическое вмешательство представляет собой челюстно-лицевое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 50 МЕ/кг рФфВ вводят во время указанного хирургического вмешательства и указанное хирургическое вмешательство представляет собой челюстно-лицевое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения ФVIII не вводят.

[00162] В некоторых вариантах реализации изобретения около 70-220 МЕ/кг рФфВ вводят после хирургического вмешательства. В некоторых вариантах реализации изобретения около 90-220 МЕ/кг рФфВ вводят после хирургического вмешательства. В некоторых вариантах реализации изобретения около 110-220 МЕ/кг рФфВ вводят после хирургического вмешательства. В некоторых вариантах реализации изобретения около 120-220 МЕ/кг рФфВ вводят после хирургического вмешательства. В некоторых вариантах реализации изобретения около 140-220 МЕ/кг рФфВ вводят после хирургического вмешательства. В некоторых вариантах реализации изобретения около 150-200 МЕ/кг рФфВ вводят после хирургического вмешательства. В некоторых вариантах реализации изобретения около 160-220 МЕ/кг рФфВ вводят после хирургического вмешательства. В некоторых вариантах реализации изобретения около 180-220 МЕ/кг рФфВ вводят после хирургического вмешательства. В некоторых вариантах реализации изобретения около 180-200 МЕ/кг рФфВ вводят после хирургического вмешательства. В некоторых вариантах реализации изобретения около 180-190 МЕ/кг рФфВ вводят после хирургического вмешательства. В некоторых вариантах реализации изобретения около 190-220 МЕ/кг рФфВ вводят после хирургического вмешательства. В некоторых вариантах реализации изобретения около 190-210 МЕ/кг рФфВ вводят после хирургического вмешательства. В некоторых вариантах реализации изобретения около 200-220 МЕ/кг рФфВ вводят после хирургического вмешательства. В некоторых вариантах реализации изобретения около 210-220 МЕ/кг рФфВ вводят после хирургического вмешательства. В некоторых вариантах реализации изобретения около 80 МЕ/кг рФфВ вводят после хирургического вмешательства. В некоторых вариантах реализации изобретения около 90 МЕ/кг рФфВ вводят после хирургического вмешательства. В некоторых вариантах реализации изобретения около 100 МЕ/кг рФфВ вводят после хирургического вмешательства. В некоторых вариантах реализации изобретения около 110 МЕ/кг рФфВ вводят после хирургического вмешательства. В некоторых вариантах реализации изобретения около 120 МЕ/кг рФфВ вводят после хирургического вмешательства. В некоторых вариантах реализации изобретения около 130 МЕ/кг рФфВ вводят после хирургического вмешательства. В некоторых вариантах реализации изобретения около 140 МЕ/кг рФфВ вводят после хирургического вмешательства. В некоторых вариантах реализации изобретения около 150 МЕ/кг рФфВ вводят после хирургического вмешательства. В некоторых вариантах реализации изобретения около 160 МЕ/кг рФфВ вводят после хирургического вмешательства. В некоторых вариантах реализации изобретения около 170 МЕ/кг рФфВ вводят после хирургического вмешательства. В некоторых вариантах реализации изобретения около 180 МЕ/кг рФфВ вводят после хирургического вмешательства. В некоторых вариантах реализации изобретения около 190 МЕ/кг рФфВ вводят после хирургического вмешательства. В некоторых вариантах реализации изобретения около 200 МЕ/кг рФфВ вводят после хирургического вмешательства. В некоторых вариантах реализации изобретения около 210 МЕ/кг рФфВ вводят после хирургического вмешательства. В некоторых вариантах реализации изобретения около 220 МЕ/кг рФфВ вводят после хирургического вмешательства. В некоторых вариантах реализации изобретения ФVIII не вводят.

[00163] В некоторых вариантах реализации изобретения около 70-150 МЕ/кг рФфВ вводят после хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой малое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 80-150 МЕ/кг рФфВ вводят после хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой малое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 90-150 МЕ/кг рФфВ вводят после хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой малое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 100-150 МЕ/кг рФфВ вводят после хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой малое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 110-150 МЕ/кг рФфВ вводят после хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой малое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 120-150 МЕ/кг рФфВ вводят после хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой малое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 130-150 МЕ/кг рФфВ вводят после хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой малое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 100-140 МЕ/кг рФфВ вводят после хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой малое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 90-140 МЕ/кг рФфВ вводят после хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой малое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 140-150 МЕ/кг рФфВ вводят после хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой малое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 70 МЕ/кг рФфВ вводят после хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой малое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 80 МЕ/кг рФфВ вводят после хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой малое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 90 МЕ/кг рФфВ вводят после хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой малое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 100 МЕ/кг рФфВ вводят после хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой малое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 110 МЕ/кг рФфВ вводят после хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой малое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 120 МЕ/кг рФфВ вводят после хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой малое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 130 МЕ/кг рФфВ вводят после хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой малое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 140 МЕ/кг рФфВ вводят после хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой малое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 150 МЕ/кг рФфВ вводят после хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой малое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой малое хирургическое вмешательство, предварительное лечение включает введение по меньшей мере двух доз рФфВ до хирургического вмешательства. В некоторых реализации изобретения, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой малое хирургическое вмешательство, предварительное лечение включает введение по меньшей мере двух доз рФфВ до хирургического вмешательства, причем первая доза больше, чем вторая доза. В некоторых вариантах реализации изобретения ФVIII не вводят.

[00164] В некоторых вариантах реализации изобретения около 150-220 МЕ/кг рФфВ вводят после хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой обширное хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 160-220 МЕ/кг рФфВ вводят после хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой обширное хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 170-220 МЕ/кг рФфВ вводят после хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой обширное хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 180-220 МЕ/кг рФфВ вводят после хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой обширное хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 180-210 МЕ/кг рФфВ вводят после хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой обширное хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 190-220 МЕ/кг рФфВ вводят после хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой обширное хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 190-210 МЕ/кг рФфВ вводят после хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой обширное хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 200-220 МЕ/кг рФфВ вводят после хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой обширное хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 150 МЕ/кг рФфВ вводят после хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой обширное хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 160 МЕ/кг рФфВ вводят после хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой обширное хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 170 МЕ/кг рФфВ вводят после хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой обширное хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 180 МЕ/кг рФфВ вводят после хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой обширное хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 190 МЕ/кг рФфВ вводят после хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой обширное хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 200 МЕ/кг рФфВ вводят после хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой обширное хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 210 МЕ/кг рФфВ вводят после хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой обширное хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 220 МЕ/кг рФфВ вводят после хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой обширное хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения, в случаях если хирургическое вмешательство представляет собой обширное хирургическое вмешательство, предварительное лечение включает введение по меньшей мере двух приблизительно равных доз рФфВ до хирургического вмешательства. В некоторых вариантах реализации изобретения ФVIII не вводят.

[00165] В некоторых вариантах реализации изобретения около 20-50 МЕ/кг рФфВ вводят после хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой челюстно-лицевое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 25-50 МЕ/кг рФфВ вводят после хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой челюстно-лицевое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 30-50 МЕ/кг рФфВ вводят после хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой челюстно-лицевое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 25-40 МЕ/кг рФфВ вводят после хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой челюстно-лицевое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 30-40 МЕ/кг рФфВ вводят после хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой челюстно-лицевое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 40-50 МЕ/кг рФфВ вводят после хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой челюстно-лицевое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 45-50 МЕ/кг рФфВ вводят после хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой челюстно-лицевое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 20 МЕ/кг рФфВ вводят после хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой челюстно-лицевое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 25 МЕ/кг рФфВ вводят после хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой челюстно-лицевое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 30 МЕ/кг рФфВ вводят после хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой челюстно-лицевое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 35 МЕ/кг рФфВ вводят после хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой челюстно-лицевое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 40 МЕ/кг рФфВ вводят после хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой челюстно-лицевое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 45 МЕ/кг рФфВ вводят после хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой челюстно-лицевое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 50 МЕ/кг рФфВ вводят после хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой челюстно-лицевое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой челюстно-лицевое хирургическое вмешательство, предварительное лечение включает введение по меньшей мере двух приблизительно равных доз рФфВ до хирургического вмешательства. В некоторых вариантах реализации изобретения ФVIII не вводят.

[00166] В некоторых вариантах реализации изобретения вводят суммарную дозу около 100-220 МЕ/кг рФфВ, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой малое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения вводят суммарную дозу около 110-220 МЕ/кг рФфВ, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой малое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения вводят суммарную дозу около 120-220 МЕ/кг рФфВ, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой малое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения вводят суммарную дозу около 130-220 МЕ/кг рФфВ, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой малое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения вводят суммарную дозу около 140-220 МЕ/кг рФфВ, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой малое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения вводят суммарную дозу около 150-220 МЕ/кг рФфВ, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой малое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения вводят суммарную дозу около 160-220 МЕ/кг рФфВ, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой малое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения вводят суммарную дозу около 170-220 МЕ/кг рФфВ, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой малое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения вводят суммарную дозу около 180-220 МЕ/кг рФфВ, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой малое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения вводят суммарную дозу около 190-220 МЕ/кг рФфВ, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой малое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения вводят суммарную дозу около 180-210 МЕ/кг рФфВ, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой малое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения вводят суммарную дозу около 190-210 МЕ/кг рФфВ, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой малое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения вводят суммарную дозу около 200-220 МЕ/кг рФфВ, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой малое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения вводят суммарную дозу около 210-220 МЕ/кг рФфВ, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой малое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения вводят суммарную дозу около 100 МЕ/кг рФфВ, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой малое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения вводят суммарную дозу около 110 МЕ/кг рФфВ, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой малое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения вводят суммарную дозу около 120 МЕ/кг рФфВ, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой малое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения вводят суммарную дозу около 130 МЕ/кг рФфВ, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой малое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения вводят суммарную дозу около 140 МЕ/кг рФфВ, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой малое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения вводят суммарную дозу около 150 МЕ/кг рФфВ, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой малое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения вводят суммарную дозу около 160 МЕ/кг рФфВ, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой малое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения вводят суммарную дозу около 170 МЕ/кг рФфВ, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой малое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения вводят суммарную дозу около 180 МЕ/кг рФфВ, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой малое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения вводят суммарную дозу около 190 МЕ/кг рФфВ, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой малое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения вводят суммарную дозу около 200 МЕ/кг рФфВ, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой малое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения вводят суммарную дозу около 210 МЕ/кг рФфВ, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой малое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения вводят суммарную дозу около 220 МЕ/кг рФфВ, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой малое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения ФVIII не вводят.

[00167] В некоторых вариантах реализации изобретения вводят суммарную дозу около 220-320 МЕ/кг рФфВ, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой обширное хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения вводят суммарную дозу около 230-320 МЕ/кг рФфВ, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой обширное хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения вводят суммарную дозу около 240-320 МЕ/кг рФфВ, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой обширное хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения вводят суммарную дозу около 250-320 МЕ/кг рФфВ, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой обширное хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения вводят суммарную дозу около 260-320 МЕ/кг рФфВ, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой обширное хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения вводят суммарную дозу около 270-320 МЕ/кг рФфВ, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой обширное хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения вводят суммарную дозу около 280-320 МЕ/кг рФфВ, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой обширное хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения вводят суммарную дозу около 280-310 МЕ/кг рФфВ, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой обширное хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения вводят суммарную дозу около 290-310 МЕ/кг рФфВ, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой обширное хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения вводят суммарную дозу около 290-320 МЕ/кг рФфВ, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой обширное хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения вводят суммарную дозу около 300-320 МЕ/кг рФфВ, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой обширное хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения вводят суммарную дозу около 300-310 МЕ/кг рФфВ, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой обширное хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения вводят суммарную дозу около 220 МЕ/кг рФфВ, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой обширное хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения вводят суммарную дозу около 230 МЕ/кг рФфВ, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой обширное хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения вводят суммарную дозу около 240 МЕ/кг рФфВ, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой обширное хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения вводят суммарную дозу около 250 МЕ/кг рФфВ, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой обширное хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения вводят суммарную дозу около 260 МЕ/кг рФфВ, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой обширное хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения вводят суммарную дозу около 270 МЕ/кг рФфВ, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой обширное хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения вводят суммарную дозу около 280 МЕ/кг рФфВ, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой обширное хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения вводят суммарную дозу около 290 МЕ/кг рФфВ, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой обширное хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения вводят суммарную дозу около 300 МЕ/кг рФфВ, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой обширное хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения вводят суммарную дозу около 310 МЕ/кг рФфВ, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой обширное хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения вводят суммарную дозу около 320 МЕ/кг рФфВ, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой обширное хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения ФVIII не вводят.

[00168] В некоторых вариантах реализации изобретения вводят суммарную дозу около 70-190 МЕ/кг рФфВ, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой челюстно-лицевое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения вводят суммарную дозу около 80-190 МЕ/кг рФфВ, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой челюстно-лицевое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения вводят суммарную дозу около 90-190 МЕ/кг рФфВ, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой челюстно-лицевое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения вводят суммарную дозу около 100-190 МЕ/кг рФфВ, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой челюстно-лицевое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения вводят суммарную дозу около 110-190 МЕ/кг рФфВ, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой челюстно-лицевое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения вводят суммарную дозу около 120-190 МЕ/кг рФфВ, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой челюстно-лицевое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения вводят суммарную дозу около 130-190 МЕ/кг рФфВ, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой челюстно-лицевое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения вводят суммарную дозу около 140-190 МЕ/кг рФфВ, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой челюстно-лицевое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения вводят суммарную дозу около 150-190 МЕ/кг рФфВ, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой челюстно-лицевое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения вводят суммарную дозу около 160-190 МЕ/кг рФфВ, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой челюстно-лицевое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения вводят суммарную дозу около 170-190 МЕ/кг рФфВ, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой челюстно-лицевое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения вводят суммарную дозу около 180-190 МЕ/кг рФфВ, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой челюстно-лицевое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения вводят суммарную дозу около 70 МЕ/кг рФфВ, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой челюстно-лицевое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения вводят суммарную дозу около 80 МЕ/кг рФфВ, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой челюстно-лицевое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения вводят суммарную дозу около 90 МЕ/кг рФфВ, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой челюстно-лицевое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения вводят суммарную дозу около 100 МЕ/кг рФфВ, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой челюстно-лицевое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения вводят суммарную дозу около 110 МЕ/кг рФфВ, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой челюстно-лицевое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения вводят суммарную дозу около 120 МЕ/кг рФфВ, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой челюстно-лицевое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения вводят суммарную дозу около 130 МЕ/кг рФфВ, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой челюстно-лицевое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения вводят суммарную дозу около 140 МЕ/кг рФфВ, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой челюстно-лицевое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения вводят суммарную дозу около 150 МЕ/кг рФфВ, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой челюстно-лицевое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения вводят суммарную дозу около 160 МЕ/кг рФфВ, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой челюстно-лицевое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения вводят суммарную дозу около 170 МЕ/кг рФфВ, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой челюстно-лицевое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения вводят суммарную дозу около 180 МЕ/кг рФфВ, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой челюстно-лицевое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения вводят суммарную дозу около 190 МЕ/кг рФфВ, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой челюстно-лицевое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения ФVIII не вводят.

[00169] В некоторых вариантах реализации изобретения, в случаях если хирургическое вмешательство представляет собой обширное хирургическое вмешательство, предварительное лечение включает введение по меньшей мере двух приблизительно равных доз рФфВ до хирургического вмешательства. В некоторых вариантах реализации изобретения дозировка представляет собой дозировку, указанную выше. В некоторых вариантах реализации изобретения ФVIII не вводят. В некоторых вариантах реализации изобретения, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой малое хирургическое вмешательство, предварительное лечение включает введение по меньшей мере двух доз рФфВ до хирургического вмешательства. В некоторых реализации изобретения, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой малое хирургическое вмешательство, предварительное лечение включает введение по меньшей мере двух доз рФфВ до хирургического вмешательства, причем первая доза больше, чем вторая доза. В некоторых вариантах реализации изобретения дозировка представляет собой дозировку, указанную выше. В некоторых вариантах реализации изобретения ФVIII не вводят. В некоторых вариантах реализации изобретения, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой челюстно-лицевое хирургическое вмешательство, предварительное лечение включает введение по меньшей мере двух приблизительно равных доз рФфВ до хирургического вмешательства. В некоторых вариантах реализации изобретения дозировка представляет собой дозировку, указанную выше. В некоторых вариантах реализации изобретения ФVIII не вводят.

[00170] Обычно на БфВ Типа 1 указывают <30 МЕ/дл ФфВ:РКо, <30 МЕ/дл ФфВ:Аг, низкий или нормальный ФVIII, и >0,5-0,7 МЕ/дл Соотношение ФфВ:РКо/ФфВ:Аг. На БфВ Типа 2А указывают <30 МЕ/дл ФфВ:РКо, <30-200 МЕ/дл ФфВ:Аг, низкий или нормальный ФVIII, и <0,5-0,7 МЕ/дл Соотношение ФфВ:РКо/ФфВ:Аг. На БфВ Типа 2В указывают <30-200 МЕ/дл ФфВ:РКо, <30 МЕ/дл ФфВ:Аг, низкий или нормальный ФVIII, и <0,5-0,7 МЕ/дл Соотношение ФфВ:РКо/ФфВ:Аг. На БфВ Типа 2М указывают <30 МЕ/дл ФфВ:РКо, <30-200 МЕ/дл ФфВ:Аг, низкий или нормальный ФVIII, и <0,5-0,7 МЕ/дл Соотношение ФфВ:РКо/ФфВ:Аг. На БфВ Типа 2N указывают 30-2000 МЕ/дл ФфВ:РКо, 30-200 МЕ/дл ФфВ:Аг, очень низкий ФVIII, и >0,5-0,7 МЕ/дл Соотношение ФфВ:РКо/ФфВ:Аг. На БфВ Типа 3 указывают <3 МЕ/дл ФфВ:РКо, <3 МЕ/дл ФфВ:Аг, крайне низкий (<10 МЕ/дл) ФVIII, и Соотношение ФфВ:РКо/ФфВ:Аг не применимо. На норму указывают 50-200 МЕ/дл ФфВ:РКо, 50-200 МЕ/дл ФфВ:Аг, нормальный ФVIII, и >0,5-0,7 МЕ/дл Соотношение ФфВ:РКо/ФфВ:Аг. В некоторых вариантах реализации изобретения субъект имеет БфВ Типа 3. В некоторых вариантах реализации изобретения субъект имеет тяжелую БфВ типа 1. В некоторых вариантах реализации изобретения субъект имеет тяжелую БфВ типа 2.

Хирургические Вмешательства

[00171] Хирургическое вмешательство в соответствии со способами данного изобретения может быть обширным хирургическим вмешательством или малым хирургическим вмешательством.

[00172] Как правило, обширное хирургическое вмешательство включает любую инвазивную оперативную процедуру, при которой выполняется более обширная резекция, например, вводится в полость тела, удаляются органы или изменяется нормальная анатомия. Как правило, если мезенхимальный барьер открыт (например, плевральная полость, брюшина, оболочки головного мозга), хирургическое вмешательство считается обширным. В некоторых вариантах реализации изобретения обширное хирургическое вмешательство представляет собой операцию, при которой ожидаемая кровопотеря превышает 500 мл, характерны значительные перемещения жидкости и, как правило, необходима по меньшей мере одна ночь в больнице. Типовые обширные хирургические вмешательства включают, но не ограничиваются ими, бариатрические операции/шунтирование желудка, миотомию перегородки, панкреатэктомию, восстановление расслоения грудной аорты, эзофагэктомию, цистэктомию мочевого пузыря, коронарную реваскуляризацию, хирургическое лечение остеомиелита позвоночника, хирургическое восстановление желудочков сердца, краниэктомию, лапароскопические операции (кроме холецистэктомии и перевязки маточных труб), открытую резекция органов, замену крупных суставов, мастэктомию с реконструкцией, и/или спинальную, торакальную, сосудистую и/или интракраниальную хирургию. Дополнительные примеры обширных хирургических вмешательств включают, но не ограничиваются ими, остеотомию верхней или нижней челюсти, ларингэктомию, резекцию большой доброкачественной или злокачественной опухоли и/или диссекцию лимфатического узла, требующую поведения ночи в больнице (с или без реконструктивной хирургии), мастэктомию с немедленной реконструкцией ткани (с или без биопсии лимфатического узла или подмышечной диссекции), лапароскопическое или открытое восстановление или резекцию (например, желудка, тонкой кишки, толстой кишки, печени, поджелудочной железы, селезенки, надпочечников или печени), открытую холецистэктомию, удаление крупных инцизионных, эпигастральных или вентральных грыж, гистероскопическую резекциюя или абляцию, гистерэктомию и/или операцию на придатках, лапароскопию при обширном эндометриозе, хирургию брюшного или трансвагинального тазового дна, интракраниальную хирургию, спинальную ламинэктомия и/или спондилосиндес, замену коленного сустава, замену тазобедренного сустава, замену плечевого сустава, замену локтевого сустава, удаление или проверку импланта на предмет инфекции или неисправности, ампутацию, реконструкцию свободного лоскута (пластическая хирургия), панникулэктомию, медиастиноскопия, резекцию легкого, резекция пищевода, массивную резекцию средостения (торакоскопическую или открытую), пластику хиатальной грыжи (торакоскопическую или открытую), резекцию опухоли мочевого пузыря (трансуретральную или открытую), резекцию опухоли предстательной железы (трансуретральную или открытую), резекцию почки (лапароскопическую или открытую), резекцию мочеточника (лапароскопическую или открытую), резекцию яичка (транскротальную или брюшную), операцию периферического артериального шунтирования, удаление аневризмы аорты (эндоваскулярное или открытое) и/или эндартерэктомию сонной артерии.

[00173] Малое хирургическое вмешательство представляет собой любую инвазивная оперативную процедуру, при которой производиться резекция только кожи или слизистых оболочек и соединительной ткани, например, венесекция сосудов для установки катетера, имплантация помп в подкожную клетчатку. Малое хирургическое вмешательство обычно включает любую процедуру, которая может быть безопасно выполнена в амбулаторных условиях, без использования общей анестезии или потребности в респираторной помощи. В некоторых вариантах реализации изобретения малое хирургическое вмешательство представляет собой операцию, при которой ожидаемая кровопотеря составляет менее 500 мл, минимальное перемещение жидкости и, как правило, проводится на амбулаторной основе (дневной хирургический стационар/выписка в тот же день). Такие амбулаторные хирургические вмешательства могут включать, но не ограничиваются ими, операцию по удалению катаракты, операцию на молочных железах без реконструкции, лапароскопическую холецистэктомию и перевязку маточных труб, а также большинство кожных, поверхностных, эндоскопических и артроскопических процедур. Дополнительные примеры малых хирургических вмешательств включают, но не ограничиваются ими, удаление зуба, удаление миндалин, аденоидэктомию, септопластику, турбинэктомию, ринопластику, биопсию тканей глотки, биопсию гортани, незначительное иссечение лазером или другими средствами, операцию на среднем ухе, мастоидэктомию, кохлеарную имплантацию, эндоскопическую операцию пазухи носа, небольшие резекции доброкачественных и злокачественных образований (выполненные амбулаторно; например, нижней челюсти, бранхиогенной кисты, опухоли язычка мягкого неба), тиреоидэктомию, люмпэктомию молочной железы (с или без биопсии лимфатического узла или подмышечной диссекции), мастэктомию (с или без биопсии лимфатического узла или подмышечной дессекции), удаление паховой грыжи (лапароскопическим или открытым доступом), удаление пупочной грыжи (лапароскопическим или открытым доступом), лапароскопическую холецистэктомия, геморроидэктомию, дилатацию, кюретаж, диагностическую гистероскопию, лапароскопию, термическую баллонную аблацию эндометрия, перевязку маточных труб, лечение эндометриоза, ограниченное лапароскопией, вставку трансвагинальной ленты, дискэктомию, удаление катаракты, большинство офтальмологических процедур, артроскопическую хирургию (включая восстановление ACL), стандартное удаление имплантов (не из-за инфекции), операцию на сухожилиях, бунионэктомию, раскрытие запястного канала, освобождение контрактуры Дюпюитрена, операцию на крупных сухожилиях, операцию на мелких сухожилиях, небольшие ротационные лоскуты и кожные трансплантаты, удаление базалиомы, иссечение липомы, маммопластику и другие операции по поводу доброкачественных новообразований молочной железы, косметическую хирургия молочной железы, бронхоскопию, цистоскопию, уретероскопию, реноскопию на предмет камня, реноскопию на предмет сужения канала, реноскопию с целью биопсии, удаление гидроцеле, удаление варикоцеле, вазэктомию, циркумцизию, и/или удаление варикозно измененных вен.

[00174] Стоматологические операции включают, но не ограничиваются ими, различные стоматологические процедуры и операции на полости рта, включая, например, удаление зубов.

[00175] В некоторых вариантах реализации изобретения хирургическое вмешательство представляет собой обширное хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения хирургическое вмешательство представляет собой малое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения хирургическое вмешательство представляет собой челюстно-лицевое хирургическое вмешательство.

ПРИМЕРЫ

ПРИМЕР 1: Гемостатическая эффективность и безопасность рФфВ

[00176] В данном исследовании оценивали гемостатическую эффективность и безопасность рФфВ с или без ADVATE (антигемофильного фактора [рекомбинантного]), Baxalta US Inc., Westlake Village, CA (рФVIII) у пациентов с тяжелой формой БфВ, подвергающихся плановому хирургическому вмешательству.

Способы

[00177] Фаза 3, открытое, неконтролируемое, нерандомизированное исследование в 14 местах в 10 странах (NCT02283268) у пациентов ≥18 лет, у которых была тяжелая форма БфВ и которые должны были подвергнуться плановому хирургическому вмешательству. Пациенты наблюдались в течение 14 дней после операции.

Лечение

[00178] За 12-24 ч до операции рФфВ 40-60 МЕ/кг рФфВ:РКо вводили внутривенно для повышения уровней эндогенного ФVIII:К до ≥30 МЕ/дл (малое хирургическое вмешательство/стоматологическая операция) или ≥60 МЕ/дл (обширное хирургическое вмешательство). Уровни ФVIII:К оценивали в течение 3 часов после начала операции. Если были достигнуты целевые уровни ФVIII:С, только рФфВ вводили за 1 ч до операции для достижения пиковых уровней, описанных в Таблице 2. Если были достигнуты целевые уровни ФVIII:С, только рФфВ вводили за 1 ч до операции для достижения пиковых уровней, описанных в Таблице 2. Интраоперационные и послеоперационные дозы были установлены индивидуально для поддержания целевых минимальных уровней в соответствии с фармакокинетическими (ФK) и фармакодинамическими (ФД) результатами, а также интенсивностью и продолжительностью гемостатической проблемы.

Таблица 2. Целевые уровни ФфВ:РКо и ФVIII:К: Рекомендации для Предотвращение Сильного Кровотечения Во Время и После Хирургического Вмешательства

Тип Хирургического Вмешательства Целевой Пиковый Уровень в Плазме ФфВ:РКо (МЕ/дл) Целевой Пиковый Уровень в Плазме ФVIII:К* (МЕ/дл) Расчет Дозы рффВ (МЕ ФфВ:РКо Требуется)† Малое/Стоматологическое 50-60 40-50 ΔФфВ:РКо × ВТ (кг)/ПВ‡ Обширное 100 80-100 ΔФфВ:РКо × ВТ (кг)/ПВ‡

ВС=вес тела; ФVIII:К=активность фактора VIII; ПВ=постепенное восстановление; рФфВ=рекомбинантный фактор фон Виллебранда; ФфВ:РКо=ристоцетин-кофакторная активность фактора фон Виллебранда.

*Для достижения рекомендуемых целевых пиковых уровней в плазме ФVIII:К может потребоваться дополнительный рФVIII.

†Вводился в пределах 1 ч до операции.

‡Если ПВ не было доступно, допускали, что ПВ составляет 2,0 МЕ/дл на МЕ/кг.

ΔФфВ:РКо=целевая пиковая концентрация ФфВ:РКо - исходная концентрация ФфВ в плазме:РКо.

Исследование

[00179] Общая гемостатическая эффективность (первичный результат) оценивалась исследователем через 24 часа после последней периоперационной инфузии или по завершении исследования, в зависимости от того, что наступило раньше (Таблица 3). Интраоперационная гемостатическая эффективность была оценена хирургом (Таблица 3), наряду с фактической интраоперационной и прогнозируемой кровопотерей. Оценки безопасности включали нежелательные явления (НЯ) и антитела против рФфВ, рФVIII, белков яичника китайского хомячка (CHO), мышиного иммуноглобулина G (IgG) и рФурина.

Таблица 3. Общая* и Интраоперационная† Шкала Оценки Гемостатической Эффективности

Оценка Исследование Отлично Гемостаз, достигнутый с помощью рФфВ с или без рФVIII, был таким же хорошим или лучшим, чем ожидалось для типа хирургического вмешательства, выполняемого у гемостатически нормального субъекта Хорошо Гемостаз, достигнутый с помощью рФфВ с или без рФVIII, был вероятно таким же хорошим, как ожидалось для типа хирургического вмешательства, выполняемого у гемостатически нормального субъекта Удовлетворительно Гемостаз, достигнутый с помощью рФфВ с или без рФVIII был явно менее оптимальным для типа выполняемого хирургического вмешательства, но сохранялся без необходимости замены концентрата рФфВ Неудовлетворительно Пациент перенес неконтролируемое кровотечение, которое было результатом неадекватного терапевтического ответа, несмотря на правильную дозировку, необходимость замены концентрата рФфВ

рФVIII=рекомбинантный фактор VIII; рФфВ=рекомбинантный фактор фон Виллебранда.

*Согласно оценке исследователя.

†Согласно оценке хирурга.

Статистика

[00180] Описательный анализ включал точечные оценки и ДИ с доверительной вероятностью 90% для числа пациентов с гемостатической эффективностью, оцененной как «отлично/хорошо» с использованием теста Клоппера-Пирсона. ФK/ФД и безопасность были обобщены с использованием описательной статистики.

Результаты

Пациенты

Таблица 4. Исходные Персональные Данные Пациентов и Клинические Характеристики

Параметр Кол-во=15 Пол, кол-во (%) Мужской 7 (46,7) Женский 8 (53,3) Средний возраст (диапазон), лет 40 (20-70) Средний вес (диапазон), кг 73,5 (52,0-127,2). Средний ИМТ (диапазон), кг/м² 25,6 (17,1-38,0). Тип БфВ, кол-во (%) 1 3 (20,0) 2A 2 (13,3) 2B 1 (6,7) 2M 1 (6,7) 3 8 (53,3) Классификация хирургического вмешательства, кол-во (%) Обширное 10 (66,7) Малое 4 (26,7) Стоматологическое 1 (6,7) Среднее (SD) ФVIII:К, МЕ/дл Все типы БфВ (кол-во=11) 20,6 (23,7) БфВ Типа 3 (кол-во=5) 1,8 (1,1) Среднее (SD) ФфВ:РКо, МЕ/дл Все типы БфВ (кол-во=11) 9,7 (11,0) БфВ Типа 3 (кол-во=5) <8 (0,0)

ИМТ=индекс массы тела; ФVIII:К=активность фактора VIII; БфВ=болезнь фон Виллебранда; ФфВ:РКо=ристоцетин-кофакторная активность фактора фон Виллебранда.

[00181] Общая гемостатическая эффективность была оценена как «отличная» или «хорошая» для всех 15 пациентов (ДИ с доверительной вероятностью 90%: 81,9-100,0) (Фигура 1).

Эффективность

[00182] Общая гемостатическая эффективность была оценена как «отличная» или «хорошая» для всех 15 пациентов (ДИ с доверительной вероятностью 90%: 81,9-100,0) (Фигура 1).

[00183] Интраоперационная гемостатическая эффективность была оценена как «отлично» или «хорошо» для всех 15 пациентов (ДИ с доверительной вероятностью 90%: 81,9-100,0) (Фигура 2). Среди 8 пациентов с БфВ типа 3 общая и интраоперационная гемостатическая эффективность были оценены как «отлично» для 7 пациентов и «хорошо» для 1 пациента. Средняя ± SD фактическая интраоперационная кровопотеря по сравнению с прогнозируемой кровопотерей составляла 70 ± 45% и была оценена как «отлично» для 13 пациентов и «хорошо» для 2 пациентов.

ЭКСПОЗИЦИЯ

[00184] Пациенты получили в общей сложности 104 инфузии рФфВ для предотвращения или лечения кровотечения, вызванного хирургическим вмешательством; средняя суммарная доза рФфВ при хирургическом вмешательстве составила 220,4 МЕ/кг (диапазон 63,8-648,4 МЕ/кг) (Таблица 4). 93 (89,4%) инфузий только рФфВ: 15 (за 12-24 ч до операции), 12 (за 1 ч до операции) и 66 (после операции). 11 (10,6%) инфузий рФфВ с рФVIII: 3 (за 1 ч до операции), 1 (во время операции) и 7 (после операции). 5 пациентов получили 11 инфузий рФфВ с рФVIII, и 6 из 7 послеоперационных инфузий рФфВ с рФVIII были у 1 пациента.

[00185] Из 10 пациентов, подвергшихся обширному хирургическому вмешательству, 7 (70%) не нуждались в совместном введении с рФVIII.

Таблица 5. Средняя Экспозиция рФфВ В Общем и по Классификации Хирургического Вмешательства

Классификация Хирургического Вмешательства Малое (кол-во=4) Обширное (кол-во=10) Стоматологическое (кол-во=1) Всего (Кол-во=15) Среднее общее количество инфузий* (диапазон) 3 (2-4) 7,5 (4-15) 5 6 (2-15) Средняя экспозиция (диапазон), д 3 (2-4) 6,5 (4-15) 4 6 (2-15) Средняя доза за 12-24 ч до операции (диапазон), МЕ/кг 57,2 (55,0-59,9) 49,3 (37,4-57,6). 36,1 55,0 (36,1-59,9) Средняя доза за 1 ч до операции (диапазон), МЕ/кг 39,3 (8,0-46,4) 37,6 (15,7-82,7) 18,1 35,8 (8,0-82,7). Средняя интраоперационная доза (диапазон), МЕ/кг 0 0 18,1 18,1 Средняя послеоперационная доза (диапазон), МЕ/кг 79,3 (42,8-115,9) 214,8 (47,7-533,3) 36,1 189,8 (36,1-533,3) Средняя суммарная доза при хирургическом вмешательстве (диапазон), МЕ/кг 119,9 (63,8-217,3) 307,6 (125,2-648,4) 108,4 220,4 (63,8-648,4)

рФфВ=рекомбинантный фактор фон Виллебранда

*Общее количество предоперационных инфузий, предоперационных начальных нагрузочных доз, предоперационных дополнительных нагрузочных доз, интраоперационных доз и послеоперационных доз.

Безопасность

[00186] 6 пациентов сообщили о 12 возникающих при лечении НЯ; ни одино не считается связанным с лечением. У пациентов были серьезные НЯ (дивертикулит и тромбоз глубоких вен [ТГВ]; каждое имело место у 1 пациента); ни одно явление не было сочтено связанным с фактор-заместительной терапией.

[00187] Серьезный ТГВ произошел в послеоперационный день 8 (первоначально сообщалось о несерьезном ТГВ в послеоперационный день 4). Явление было бессимптомным и наблюдалось после профилактического дуплексного сканирования. Явление было оценено как маловероятно связанное с рФфВ и не связанное с рФVIII или процедурами исследования; причинно связанное с обширной операцией пациента (полная замена тазобедренного сустава) и текущим ожирением в анамнезе. Послеоперационные уровни ФVIII:К никогда не превышали 150 МЕ/дл. Событие привело к размещению кавального фильтра и впоследствии разрешилось без осложнений. Не было серьезных аллергических реакций; нейтрализующих антител против рФVIII, белков CHO, мышиного IgG или рФурина.

[00188] Один пациент с БфВ типа 3, у которого было интраоперационное переливание эритроцитарной массы во время обширной операции по замене коленного сустава, дал положительный результат на связывающие антител против ффВ на 7-й день после операции.

[00189] Параметры ФK для ФфВ:РКо для пациентов, которые прошли ФK-анализ (n=11), представлены на Фиг. 4. Средние концентрации ФфВ:РКо, ФфВ:Аг и коллаген-связывающей ФфВ (ФфВ:КС) достигли пиковых уровней к 30 мин и постепенно снижались в течение 72 ч после инфузии (Фиг. 4).

[00190] Введение только рФфВ привело к существенной быстрой стабилизации уровней эндогенного ФVIII:К через 6-12 ч после инфузии, при этом пиковые уровни ФVIII:К были достигнуты к 24 ч среди всех обследованных пациентов (n=11; Фиг. 5А), а также в подгруппе пациентов с БфВ типа 3 (n=5) (Фиг. 5B). В целом, пациенты достигли среднего значения ФVIII:К > 60 МЕ/дл к 6 ч после инфузии (Фиг. 5А), и пациенты с более высоким исходным уровнем ФVIII:К (например, с БфВ типа 1 или типа 2) смогли достичь целевых уровней быстрее. Несмотря на то, что средние уровни ФVIII:К составляли <2 МЕ/дл в начале исследования, введение только рФфВ позволило пациентам с БфВ типа 3 быстро достичь целевых уровней ФфВ:РКо и ФVIII:К, при этом уровень ФVIII:К >60 МЕ/дл достигался к 12 ч после инфузии (Фиг. 5B).

Выводы

[00191] В этом хирургическом исследовании общая и интраоперационная гемостатическая эффективность была оценена как «отличная» или «хорошая» для всех 15 пациентов. При обширных операциях общая гемостатическая эффективность была «отличной» у 7 пациентов и «хорошей» у 3 пациентов, а интраоперационная эффективность была «отличной» у 8 пациентов и «хорошей» у 2 пациентов. Почти 90% инфузий для достижения интраоперационного и послеоперационного гемостаза были сделаны только с рФфВ; 70% обширных операций были проведены только с рФфВ. РффВ нацелен на первичную дисфункцию БфВ и позволяет врачам сосредоточиться на достижении оптимальной эффективности, не заботясь о накоплении ФVIII. Эти данные подтверждают безопасное и эффективное использование рФфВ при обширных и малых хирургических вмешательствах.

ПРИМЕР 2: Рекомбинантный Фактор Фон Виллебранда У Пациентов С Тяжелой Формой Болезни Фон Виллебранда, Подвергающихся Хирургическому Вмешательству

[00192] В этом примере представлены результаты исследования, посвященного лечению пациентов с тяжелой формой Болезни Виллебранда (БфВ), подвергающихся хирургическому вмешательству.

КРИТЕРИИ ЭФФЕКТИВНОСТИ:

Первичные Критерии Эффективности:

[00193] Общая Гемостатическая Эффективность, Оцененная Исследователем (Врачом Гематологом) [Сроки: 24 часа после последней периоперационной инфузии или при посещении по завершению исследования на День 14 (± 2 дня), в зависимости от того, что наступит раньше). Гемостатическая эффективность оценивалась по шкале отлично - хорошо - удовлетворительно - неудовлетворительно.

Отлично: Интра- и послеоперационный гемостаз, достигнутый с использованием рФфВ с ADVATE или без него, был таким же хорошим или лучшим, чем ожидалось для типа хирургического вмешательства, выполняемого у гемостатически нормального субъекта.

Хорошо: Интра- и послеоперационный гемостаз, достигнутый с помощью рФфВ с ADVATE или без него, вероятно, был таким же хорошим, как ожидалось для типа хирургического вмешательства, выполняемого у гемостатически нормального субъекта.

Удовлетворительно: Интра- и послеоперационный гемостаз, достигнутый с помощью рФфВ с или без ADVATE был явно меньше оптимального для типа хирургического вмешательства, но сохранялся без необходимости замены концентрата рФфВ.

Неудовлетворительно: Участник перенес неконтролируемое кровотечение, которое было результатом неадекватного терапевтического ответа, несмотря на правильную дозировку, необходимость замены концентрата рФфВ.

Вторичные Критерии Эффективности:

[00194] №1: Интраоперационная Фактическая и Прогнозируемая Кровопотеря согласно Оценке Врача-Хирурга [Сроки: День 0 (по окончанию операции)]. Прогнозируемая кровопотеря была оценена врачом-хирургом до операции на основе гемостатически нормального пациента того же пола, возраста, роста и сопутствующих заболеваний, что и участник. Фактическая кровопотеря была оценена исходя из расчетной кровопотери, включая потери в марлевые тампоны, салфетки и отсасывание во время операции, согласно записи анестезиолога.

[00195] №2: Интраоперационная Фактическая Кровопотеря По Сравнению С Прогнозируемой Кровопотерей [Сроки: День 0 (по окончанию операции)]. Фактическая кровопотеря относительно прогнозируемой кровопотери была рассчитана как [Фактическая кровопотеря (мл)], деленная на [Прогнозируемая Кровопотеря (мл) умноженная на 100].

[00196] №3: Оценка Интраоперационной Фактической и Прогнозируемой Кровопотери согласно Оценке Врача-Хирурга [Сроки: День 0 (по окончанию операции)]

Гемостатическая эффективность оценивалась по шкале отлично - хорошо - удовлетворительно - неудовлетворительно.

Отлично: Интраоперационная кровопотеря была меньше или равна максимальной кровопотере, ожидаемой для типа хирургического вмешательства, выполняемого у гемостатически нормального субъекта (≤ 100%).

Хорошо: Интраоперационная кровопотеря была на 50% больше максимальной ожидаемой кровопотери для типа хирургического вмешательства, выполняемого у гемостатически нормального субъекта (101-150%). Удовлетворительно: Интраоперационная кровопотеря составляла более 50% от максимальной ожидаемой кровопотери для типа хирургического вмешательства, выполняемого у гемостатически нормального субъекта (> 150%).

Неудовлетворительно: Неконтролируемое кровотечение, которое явилось результатом неадекватного терапевтического ответа, несмотря на правильное дозирование, что требует изменения режима замены фактора свертывания крови.

[00197] №4: Оценка Интраоперационной Гемостатической Эффективности согласно Оценке Врача-Хирурга [Сроки: День 0 (по окончанию операции)]

Гемостатическая эффективность оценивалась по шкале отлично - хорошо - удовлетворительно - неудовлетворительно.

Отлично: Интраоперационный гемостаз, достигнутый с использованием рФфВ с ADVATE или без него, был таким же хорошим или лучшим, чем ожидалось для типа хирургического вмешательства, выполняемого у гемостатически нормального субъекта.

Хорошо: Интраоперационный гемостаз, достигнутый с помощью рФфВ с ADVATE или без него, вероятно, был таким же хорошим, как ожидалось для типа хирургического вмешательства, выполняемого у гемостатически нормального субъекта.

Удовлетворительно: Интраоперационный гемостаз, достигнутый с помощью рФфВ с или без ADVATE был явно меньше оптимального для типа хирургического вмешательства, но сохранялся без необходимости замены концентрата рФфВ.

Неудовлетворительно: Участник перенес неконтролируемое кровотечение, которое было результатом неадекватного терапевтического ответа, несмотря на правильную дозировку, необходимость замены концентрата рФфВ.

[00198] №5: Суточная Интра- и Послеоперационная Скорректированная по Весу Доза РФфВ С ADVATE Или Без Него [Сроки: Ежедневно, от дня операции до послеоперационного Дня 14 (± 2 дня)]

[00199] №6: Возникновение Нежелательных Явлений [Сроки: От первой инфузии исследуемого препарата до завершения исследования (т.е. через 14 (± 2) дней после операции)]. Оценивались нежелательные явления, возникшие в ходе лечении (НЯВЛ) и серьезные нежелательные явления, возникшие в ходе лечении (СНЯВЛ).

[00200] №7: Возникновение Тромботических Явлений [Сроки: От первой инфузии исследуемого препарата до завершения исследования (т.е. через 14 (± 2) дней после операции)]. Нежелательные явления, возникшие в ходе лечения (НЯВЛ) и серьезные нежелательные явления, возникшие в ходе лечении (СНЯВЛ) оценивались на наличие тромботических явлений.

[00201] №8: Возникновение Тяжелых Аллергических Реакций (например, Анафилаксии) [Сроки: От первой инфузии исследуемого препарата до завершения исследования (т.е. через 14 (± 2) дней после операции)]. Нежелательные явления, возникшие в ходе лечении (НЯВЛ) и серьезные нежелательные явления, возникшие в ходе лечении (СНЯВЛ) оценивались на наличие тяжелых аллергических реакций.

[00202] №9: Число Участников, Которые Вырабатывали Ингибирующие и Суммарные Связывающие Антитела к Фактору Фон Виллебранда (Ффв) и Ингибирующие Антитела к Фактору VIII (ФVIII) [Сроки: Тестирование проводилось на протяжении всего исследования во время скрининга, до ФК инфузии, до операции, после операции в случае сильного кровотечения или необъяснимого кровотечения, на день 7 после операции и при посещении по завершению исследования (т.е. через 14 (± 2) дней после операции)]. Участников лечили рекомбинантным Фактором фон Виллебранда (рФфВ) с ADVATE или без него.

[00203] №10: Число Участников, Которые Вырабатывали Антитела к Белкам Яичника Китайского Хомяка (СНО), Мышиному Иммуноглобулину G (IgG) или Рекомбинантному Фурину (рФурину) [Сроки: Тестирование проводилось на протяжении всего исследования во время скрининга, до ФК инфузии, до операции, после операции в случае сильного кровотечения или необъяснимого кровотечения, на день 7 после операции и при посещении по завершению исследования (т.е. через 14 (± 2) дней после операции)]. Участников лечили рекомбинантным Фактором фон Виллебранда (рФфВ) с ADVATE или без него.

[00204] №11: Фармакокинетика: Площадь Под Кривой Зависимости Концентрации в Плазме от Времени от 0 до 72 Часов После Инфузии (AUC 0-72 Ч/Доза) [Сроки: Измерения ФК проводились в течение 30 минут до инфузии и после инфузии через 30 (± 5) минут, 60 (± 5) минут, 6 (± 1) часов, 12 (± 1) часов, 24 (± 2) часа, 48 (± 2) часов и 72 (± 2) часа.] Эта оценка требовалась только для пациентов, подвергающихся обширному хирургическому вмешательству. Субъекты получали ФK инфузию в дозе 50±5 МЕ/кг рФфВ:РКо в течение 42 дней до операции. Площадь под кривой зависимости концентрации в плазме/время от 0 до 72 часов после инфузии была рассчитана с использованием линейного правила трапеции. Для расчета AUC(0-72ч) уровни через 72 часа были линейно интерполированы/экстраполированы из 2 ближайших точек времени отбора проб. ФK-анализ проводили для следующих аналитов: Ристоцетин-Кофакторной Активности ФфВ (ФфВ:РКо), Активности Антигена ФфВ (ФфВ:Аг), Коллаген-Связывающей Активности ФфВ (ФфВ:КС), Активности ФфВ, измеренной тест системой INNOVANCE VWF Ac (ФфВ:Ак (VWF:Ac)), Коагулянтной Активности ФVIII (ФVIII:К)

[00205] №12: Фармакокинетика: Площадь Под Кривой Зависимости Концентрации в Плазме От Времени от 0 до Бесконечности (AUC 0-∞/Доза) [Сроки: Измерения ФК проводились в течение 30 минут до инфузии и после инфузии через 30 (± 5) минут, 60 (± 5) минут, 6 (± 1) часов, 12 (± 1) часов, 24 (± 2) часа, 48 (± 2) часов и 72 (± 2) часа.] Эта оценка требовалась только для пациентов, подвергающихся обширному хирургическому вмешательству. Субъекты получали ФK инфузию в дозе 50±5 МЕ/кг рФфВ:РКо в течение 42 дней до операции. Площадь под кривой зависимости концентрации в плазме/время от 0 до бесконечности и площадь под первым моментом этой кривой от 0 до бесконечности рассчитывали как сумму AUC или AUMC от времени 0 до времени последней возможной количественной оценки концентрации плюс поправка хвоста распределения рассчитанного как Ct/λz и Ct/λz(t+1/λz) соответственно, где Ct - последняя возможная количественная оценка концентрации, t - время последней возможной количественной оценки концентрации, а λz - константа скорости распределения в конечной фазе. ФK-анализ проводили для следующих аналитов: Ристоцетин-Кофакторной Активности ФфВ (ФфВ:РКо), Активности Антигена ФфВ (ФфВ:Аг), Коллаген-Связывающей Активности ФфВ (ФфВ:КС), Активности ФфВ, измеренной тест системой INNOVANCE VWF Ac (ФфВ:Ак (VWF:Ac)), Коагулянтной Активности ФVIII (ФVIII:К)

[00206] №13: Фармакокинетика: Среднее Время Удержания (СВУ) [Сроки: Измерения ФК проводились в течение 30 минут до инфузии и после инфузии через 30 (± 5) минут, 60 (± 5) минут, 6 (± 1) часов, 12 (± 1) часов, 24 (± 2) часа, 48 (± 2) часов и 72 (± 2) часа.] Эта оценка требовалась только для пациентов, подвергающихся обширному хирургическому вмешательству. Субъекты получали ФK инфузию в дозе 50±5 МЕ/кг рФфВ:РКо в течение 42 дней до операции. Среднее время удержания рассчитывалось как площадь под первым моментом фармакокинетической кривой от 0 до бесконечности, деленная на площадь под кривой зависимости от времени от 0 до бесконечности минус Т/2, где Т - продолжительность инфузии. ФK-анализ проводили для следующих аналитов: Ристоцетин-Кофакторной Активности ФфВ (ФфВ:РКо), Активности Антигена ФфВ (ФфВ:Аг), Коллаген-Связывающей Активности ФфВ (ФфВ:КС), Активности ФфВ, измеренной тест системой INNOVANCE VWF Ac (ФфВ:Ак)

[00207] №14: Фармакокинетика: Клиренс (Кл) [Сроки: Измерения ФК проводились в течение 30 минут до инфузии и после инфузии через 30 (± 5) минут, 60 (± 5) минут, 6 (± 1) часов, 12 (± 1) часов, 24 (± 2) часа, 48 (± 2) часов и 72 (± 2) часа.] Эта оценка требовалась только для пациентов, подвергающихся обширному хирургическому вмешательству. Субъекты получали ФK инфузию в дозе 50±5 МЕ/кг рФфВ:РКо в течение 42 дней до операции. Клиренс рассчитывали как дозу (МЕ/кг), деленную на площадь под кривой зависимости от времени от 0 до бесконечности. ФK-анализ проводили для следующих аналитов: Ристоцетин-Кофакторной Активности ФфВ (ФфВ:РКо), Активности Антигена ФфВ (ФфВ:Аг), Коллаген-Связывающей Активности ФфВ (ФфВ:КС), Активности ФфВ, измеренной тест системой INNOVANCE VWF Ac (ФфВ:Ак)

[00208] №15: Фармакокинетика: Постепенное Восстановление (ПВ) [Сроки: Измерения ФК проводились в течение 30 минут до инфузии и после инфузии через 30 (± 5) минут, 60 (± 5) минут, 6 (± 1) часов, 12 (± 1) часов, 24 (± 2) часа, 48 (± 2) часов и 72 (± 2) часа.] Эта оценка требовалась только для пациентов, подвергающихся обширному хирургическому вмешательству. Субъекты получали ФK инфузию в дозе 50±5 МЕ/кг рФфВ:РКо в течение 42 дней до операции. Постепенное восстановление рассчитывали как (Cмакс минус Cдо инфузии), деленное на дозу (МЕ/кг), где кг относится к массе тела на момент введения дозы, а Cмакс - наблюдаемая максимальная концентрация перед коррекцией для значений до инфузии. ФK-анализ проводили для следующих аналитов: Ристоцетин-Кофакторной Активности ФфВ (ФфВ:РКо), Активности Антигена ФфВ (ФфВ:Аг), Коллаген-Связывающей Активности ФфВ (ФфВ:КС), Активности ФфВ, измеренной тест системой INNOVANCE VWF Ac (ФфВ:Ак)

[00209] №16: Фармакокинетика: Период Полувыведения (T1/2) [Сроки: Измерения ФК проводились в течение 30 минут до инфузии и после инфузии через 30 (± 5) минут, 60 (± 5) минут, 6 (± 1) часов, 12 (± 1) часов, 24 (± 2) часа, 48 (± 2) часов и 72 (± 2) часа.] Эта оценка требовалась только для пациентов, подвергающихся обширному хирургическому вмешательству. Субъекты получали ФK инфузию в дозе 50±5 МЕ/кг рФфВ:РКо в течение 42 дней до операции. Конечный период полувыведения (T1/2) рассчитывали как ln2/λz, где λz - константа скорости терминальной элиминации, рассчитанная в WinNonlin NCA с использованием, по меньшей мере, трех количественных оценок концентрации. ФK-анализ проводили для следующих аналитов: Ристоцетин-Кофакторной Активности ФфВ (ФфВ:РКо), Активности Антигена ФфВ (ФфВ:Аг), Коллаген-Связывающей Активности ФфВ (ФфВ:КС), Активности ФфВ, измеренной тест системой INNOVANCE VWF Ac (ФфВ:Ак)

[00210] №17: Фармакокинетика: Объем Распределения в Равновесном Состоянии (ОбРС) [Сроки: Измерения ФК проводились в течение 30 минут до инфузии и после инфузии через 30 (± 5) минут, 60 (± 5) минут, 6 (± 1) часов, 12 (± 1) часов, 24 (± 2) часа, 48 (± 2) часов и 72 (± 2) часа.] Эта оценка требовалась только для пациентов, подвергающихся обширному хирургическому вмешательству. Субъекты получали ФK инфузию в дозе 50±5 МЕ/кг рФфВ:РКо в течение 42 дней до операции. ОбРС был рассчитан как клиренс, умноженный на среднее время удержания. ФK-анализ проводили для следующих аналитов: Ристоцетин-Кофакторной Активности ФфВ (ФфВ:РКо), Активности Антигена ФфВ (ФфВ:Аг), Коллаген-Связывающей Активности ФфВ (ФфВ:КС), Активности ФфВ, измеренной тест системой INNOVANCE VWF Ac (ФфВ:Ак)

Критерии Отбора

[00211] Возраст, Соответствующий Критериям Включения в Исследование: 18 лет и старше; Пол, Соответствующий Критериям Включения в Исследование: Все

Критерии Включения:

[00212] Диагноз тяжелая форма болезни фон Виллебранда (БфВ), как указано ниже, и когда запланировано плановое хирургическое вмешательство:

1. Тип 1 (Ристоцетин кофакторная актривность Фактора фон Виллебранда (ФфВ:РКо) <20 МЕ/дл), или

2. Тип 2A (подтвержденный по паттерну мультимеров), Тип 2B (согласно генотипу), Тип 2N (ФVIII:К<10% и наличие в истории болезни генетических факторов), Тип 2M, или

3. Тип 3 (Антиген Фактора фон Виллебранда (ФфВ:Аг) ≤ 3 МЕ/дл)

[00213] БфВ в анамнезе с необходимостью заместительной терапии с концентратом Фактором фон Виллебранда (ФфВ) для контроля кровотечения.

[00214] В случае БфВ типа 3 (Антиген ФфВ/ФфВ:Аг ≤ 3 МЕ/дл), когда участник имеет в истории болезни по меньшей мере 20 дней экспозиции концентратов фактора свертывания ФфВ/ФVIII (включая криопреципитат или свежезамороженную плазму).

[00215] В случае БфВ типа 1 или типа 2, когда участник имеет в истории болезни по меньшей мере 5 дней экспозиции препарата или подвергся обширному хирургическому вмешательству, требующего концентратов фактора свертывания ФфВ/ФVIII (включая криопреципитат или свежезамороженную плазму).

[00216] Участник должен быть не моложе 18 лет.

[00217] Если участница является женщиной с детородным потенциалом, то она предъявляет отрицательный тест на беременность.

[00218] Если необходимо, участник соглашается применять адекватные средства контрацепции в течение всего периода исследования.

[00219] Участник готов и способен соблюдать требования протокола.

Отдельные Критерии Исключения:

[00220] Диагностирована псевдо БфВ или другое наследственное или приобретенное нарушение коагуляции (например, качественные и количественные нарушения тромбоцитов или повышенное протромбиновое время [ПТВ (PT)] / международное нормализованное отношение [МНО (INR)] > 1,4).

[00221] Наличие в анамнезе или присутствие при скрининге ингибитор ФфВ.

[00222] Наличие в анамнезе или присутствие ингибитора фактора VIII (ФVIII) с титром ≥ 0,4 БЕ (по Бетезда-анализу модифицированного по Неймегену) или ≥ 0,6 БЕ (по Бетезда-анализу).

[00223] Наличие известной гиперчувствительности к любому из компонентов исследуемых препаратов, таким как белкам мыши или хомяка.

[00224] В истории болезни имеются иммунологические нарушения, за исключением сезонного аллергического ринита/конъюнктивита, легкой астмы, пищевой аллергии или аллергии на животных.

[00225] В истории болезни имеется тромбоэмболическое событие.

[00226] ВИЧ-положительный участник с абсолютным количеством клеток CD4<200/мм³.

[00227] Количество тромбоцитов < 100 000/мл.

[00228] Диагностировано серьезное заболевание печени, о чем свидетельствует любое из следующего: сывороточная аланинаминотрансфераза (АЛТ) в 5 раз выше верхнего предела нормы; гипоальбуминемия; портальная гипертензия (например, наличие спленомегалии неизвестной этиологии, варикозное расширение вен пищевода в анамнезе) или цирроз печени, классифицируемый как субкомпенсированный (класс В) и декомпенсированный (класс С).

[00229] Диагностирована почечная недостаточность с уровнем креатинина в сыворотке ≥ 2,5 мг/дл.

[00230] Участник получал иммуномодулирующее лекарственное средство, исключая местное лечение (например, мази, назальные спреи), в течение 30 дней до подписания информированного согласия.

[00231] Участница была беременна или кормила грудью на момент получения информированного согласия.

[00232] Участник принимал участие в другом клиническом исследовании, включающем исследуемый препарат (ИП (IP)), отличный от рФфВ с ADVATE или без него, или исследуемое устройство в течение 30 дней до включения, или планировал участвовать в другом клиническом исследовании с использованием ИП или исследуемого устройства в течение курса данного исследования. Тем не менее, подходящие пациенты, участвующие в профилактическом исследовании рФфВ (071301), могут быть включены в исследование.

[00233] Наличие прогрессирующей смертельной болезни и/или если продолжительность жизни участника составляет менее 3 месяцев.

РЕЗУЛЬТАТЫ:

[00234] Включение в исследование проводилось в 14 исследовательских центрах в 10 странах (США, Австралия, Тайвань, Германия, Россия, Испания, Украина, Великобритания, Италия, Турция).

Таблица 6: Исследуемые Группы

Описание Рекомбинантный Фактор фон Виллебранда (рФфВ) Участники, подвергшиеся хирургическому вмешательству и получавшие Рекомбинантный Фактор фон Виллебранда (рФфВ)

Таблица 6: Участник: Общее Исследование

Рекомбинантный Фактор фон Виллебранда (рФфВ) НАЧАЛИ 15 ЗАВЕРШИЛИ 14 НЕ ЗАВЕРШИЛИ 1 ДОСРОЧНОЕ ИСКЛЮЧЕНИЕ СУБЪЕКТОВ 1

Таблица 7: Исходные Измерения:

Рекомбинантный Фактор фон Виллебранда (рФфВ) Все Участники, которые Прошли Исследование
[Единицы измерения: Участники] 15 Возраст
[Единицы измерения: Годы]
Медиана (Полный Диапазон) 40,0
(от 20,0 до 70,0) Пол: Женский, Мужской
[Единицы измерения: Участники]
Количество Участников Женщин 8  53,3% Мужчин 7  46,7%

Первичный Результат: Результат №1

Таблица 8: Критерии Эффективности

[00235] 1. Первичный: Общая Гемостатическая Эффективность, Оцененная Исследователем (Врачом Гематологом) [Сроки: 24 часа после последней периоперационной инфузии или при посещении по завершению исследования на День 14 (± 2 дня), в зависимости от того, что наступило раньше).

Таблица 9: Первичный Результат №1

Тип Измерения Первичный Название Измерения Общая Гемостатическая Эффективность, Оцененная Исследователем (Врачом Гематологом) Описание Измерения Гемостатическая эффективность оценивалась по шкале отлично - хорошо - удовлетворительно - неудовлетворительно.
Отлично: Интра- и послеоперационный гемостаз, достигнутый с использованием рФфВ с ADVATE или без него, был таким же хорошим или лучшим, чем ожидалось для типа хирургического вмешательства, выполняемого у гемостатически нормального субъекта.
Хорошо: Интра- и послеоперационный гемостаз, достигнутый с помощью рФфВ с ADVATE или без него, вероятно, был таким же хорошим, как ожидалось для типа хирургического вмешательства, выполняемого у гемостатически нормального субъекта.
Удовлетворительно: Интра- и послеоперационный гемостаз, достигнутый с помощью рФфВ с или без ADVATE был явно меньше оптимального для типа хирургического вмешательства, но сохранялся без необходимости замены концентрата рФфВ.
Неудовлетворительно: Участник перенес неконтролируемое кровотечение, которое было результатом неадекватного терапевтического ответа, несмотря на правильную дозировку, необходимость замены концентрата рФфВ. Сроки Исследования 24 часа после последней периоперационной инфузии или при посещении по завершению исследования на День 14 (± 2 дня), в зависимости от того, что наступит раньше

Результат №1, Описание Выборки

[00236] Количество участников, подвергшихся обширному, малому хирургическому вмешательству или челюстно-лицевого хирургического вмешательства, и количество участников с болезнью фон Виллебранда типа 1, 2А, 2В, 2М и 3 суммируется до общего числа участников, которые прошли исследование. Для анализа использовался полный набор данных анализа, включая всех участников, которые получили исследуемый препарат и имели по меньшей мере 1 оценку гемостатической эффективности.

Таблица 10: Результат №1, Исследуемые Группы

Описание Рекомбинантный Фактор фон Виллебранда (рФфВ) Участники, подвергшиеся хирургическому вмешательству и получавшие Рекомбинантный Фактор фон Виллебранда (рФфВ) Малое Хирургическое Вмешательство Все участники, которые перенесли малое хирургическое вмешательство. Обширное Хирургическое Вмешательство Все участники, которые перенесли обширное хирургическое вмешательство. Стоматологическая Операция Все участники, которые перенесли челюстно-лицевое хирургическое вмешательство. Болезнь фон Виллебранда Типа 1 Все участники с Болезнью фон Виллебранда Типа 1. Болезнь фон Виллебранда Типа 2A Все участники с Болезнью фон Виллебранда Типа 2A. Болезнь фон Виллебранда Типа 2B Все участники с Болезнью фон Виллебранда Типа 2B. Болезнь фон Виллебранда Типа 2M Все участники с Болезнью фон Виллебранда Типа 2M. Болезнь фон Виллебранда Типа 3 Все участники с Болезнью фон Виллебранда Типа 3.

Таблица 11: Результат №1, Измеренные Значения

Рекомбинантный Фактор фон Виллебранда (рФфВ) Малое Хирургическое Вмешательство Обширное Хирургическое Вмешательство Стоматоло
гическая Операция Болезнь фон Виллебранда Типа 1 Болезнь фон Виллебранда Типа 2A Болезнь фон Виллебранда Типа 2B Болезнь фон Виллебранда Типа 2M Болезнь фон Виллебранда Типа 3 Участники, которые Прошли Исследование 15 4 10 1 3 2 1 1 8 Общая Гемостатическая Эффективность, Оцененная Исследователем (Врачом Гематологом)
[Единицы измерения: Участники]
Количество Участников Отлично 11  73,3% 4 100,0% 7  70,0% 0   0,0% 2  66,7% 1  50,0% 1 100,0% 0   0,0% 7  87,5% Хорошо 4  26,7% 0   0,0% 3   30,0% 1 100,0% 1  33,3% 1  50,0% 0   0,0% 1 100,0% 1  12,5% Удовлетворительно 0   0,0% 0   0,0% 0   0,0% 0   0,0% 0   0,0% 0   0,0% 0   0,0% 0   0,0% 0   0,0% Неудовлетворительно 0   0,0% 0   0,0% 0   0,0% 0   0,0% 0   0,0% 0   0,0% 0   0,0% 0   0,0% 0   0,0%

Вторичный Результат: Результат №2

[00237] 2. Вторичный: Интраоперационная Фактическая и Прогнозируемая Кровопотеря согласно Оценке Врача-Хирурга [Сроки: День 0 (по окончанию операции)]

Таблица 12: Первичный Результат №2

Тип Измерения Вторичный Название Измерения Интраоперационная Фактическая и Прогнозируемая Кровопотеря согласно Оценке Врача-Хирурга Описание Измерения Прогнозируемая кровопотеря была оценена врачом-хирургом до операции на основе гемостатически нормального пациента того же пола, возраста, роста и сопутствующих заболеваний, что и участник.
Фактическая кровопотери была оценена исходя из расчетной кровопотери, включая потери в марлевые тампоны, салфетки и отсасывание во время операции, согласно записи анестезиолога. Сроки Исследования День 0 (по окончанию операции)

Результат №2, Описание Выборки

[00238] Для прогнозируемой кровопотери количество участников, которые прошли исследование, составило 14, так как для одного участника (включенного в группу, сообщившую о хирургическом вмешательстве) прогнозируемая кровопотеря не была оценена. Для анализа использовался полный набор данных анализа, включая всех участников, которые получили исследуемый препарат и имели по меньшей мере 1 оценку гемостатической эффективности.

Таблица 13: Результат №2, Исследуемые Группы

Описание Рекомбинантный Фактор фон Виллебранда (рФфВ) Участники, подвергшиеся хирургическому вмешательству и получавшие Рекомбинантный Фактор фон Виллебранда (рФфВ) Малое Хирургическое Вмешательство Все участники, которые перенесли малое хирургическое вмешательство. Обширное Хирургическое Вмешательство Все участники, которые перенесли обширное хирургическое вмешательство. Стоматологическая Операция Все участники, которые перенесли челюстно-лицевое хирургическое вмешательство. Болезнь фон Виллебранда Типа 1 Все участники с Болезнью фон Виллебранда Типа 1. Болезнь фон Виллебранда Типа 2A Все участники с Болезнью фон Виллебранда Типа 2A. Болезнь фон Виллебранда Типа 2B Все участники с Болезнью фон Виллебранда Типа 2B. Болезнь фон Виллебранда Типа 2M Все участники с Болезнью фон Виллебранда Типа 2M. Болезнь фон Виллебранда Типа 3 Все участники с Болезнью фон Виллебранда Типа 3.

Таблица 26: Результат №2, Измеренные Значения

Рекомбинантный Фактор фон Виллебранда (рФфВ) Малое Хирургическое Вмешательство Обширное Хирургическое Вмешательство Стоматологическая Операция Болезнь фон Виллебранда Типа 1 Болезнь фон Виллебранда Типа 2A Болезнь фон Виллебранда Типа 2B Болезнь фон Виллебранда Типа 2M Болезнь фон Виллебранда Типа 3 Участники, которые Прошли Исследование 15 4 10 1 3 2 1 1 8 Интраоперационная Фактическая и Прогнозируемая Кровопотеря согласно Оценке Врача-Хирурга [Единицы измерения: мл] Среднее (Стандартное Отклонение) Фактическая кровопотеря Участники, которые Прошли Исследование 15 4 10 1 3 2 1 1 8 Фактическая кровопотеря 94,3 (177,88) 0,0 (0,00) 127,0 (209,27) 145,0 [1] 115,0 (103,32) 42,5 (53,03) 50,0 [1] 50,0 [1] 110,6 (240,87) Прогнозируемая кровопотеря Участники, которые Прошли Исследование 14 4 9 1 3 1 1 1 8 Прогнозируемая кровопотеря 106,1 (161,82) 2,5 (5,00) 152,8 (186,33) 100,0 [1] 100,0 (100,00) 10,0 [1] 50,0 [1] 50,0 [1] 134,4 (206,46)

[1] Стандартное отклонение рассчитать невозможно, так как был проанализирован только один участник.

Статистический Анализ Не Предоставлен Для Интраоперационной Фактической И Прогнозируемой Кровопотери согласно Оценке Врача-Хирурга

Вторичный Результат: Результат №3

[00239] 3. Вторичный: Интраоперационная Фактическая Кровопотеря По Сравнению С Прогнозируемой Кровопотерей [Сроки: День 0 (по окончанию операции)]

Таблица 14: Результат №3

Тип Измерения Вторичный Название Измерения Интраоперационная Фактическая Кровопотеря По Сравнению С Прогнозируемой Кровопотерей Описание Измерения Фактическая кровопотеря относительно прогнозируемой кровопотери была рассчитана как [Фактическая кровопотеря (мл)], деленная на [Прогнозируемая Кровопотеря (мл) умноженная на 100]. Сроки Исследования День 0 (по окончанию операции)

Результат №3, Описание Выборки

[00240] Количество участников, которые прошли исследование, составило 11, так как для 3 участников фактическая и прогнозируемая кровопотеря были равны нулю, а для 1 участника прогнозируемая кровопотеря не была оценена. Следовательно, «фактическая кровопотеря относительно прогнозируемой кровопотери» не может быть рассчитана. Полный набор данных анализа был использован для анализа данного критерия эффективности.

Таблица 15: Результат №3, Исследуемые Группы

Описание Рекомбинантный Фактор фон Виллебранда (рФфВ) Участники, подвергшиеся хирургическому вмешательству и получавшие Рекомбинантный Фактор фон Виллебранда (рФфВ) Малое Хирургическое Вмешательство Все участники, которые перенесли малое хирургическое вмешательство. Обширное Хирургическое Вмешательство Все участники, которые перенесли обширное хирургическое вмешательство. Стоматологическая Операция Все участники, которые перенесли челюстно-лицевое хирургическое вмешательство. Болезнь фон Виллебранда Типа 1 Все участники с Болезнью фон Виллебранда Типа 1. Болезнь фон Виллебранда Типа 2A Все участники с Болезнью фон Виллебранда Типа 2A. Болезнь фон Виллебранда Типа 2B Все участники с Болезнью фон Виллебранда Типа 2B. Болезнь фон Виллебранда Типа 2M Все участники с Болезнью фон Виллебранда Типа 2M. Болезнь фон Виллебранда Типа 3 Все участники с Болезнью фон Виллебранда Типа 3.

Таблица 16: Измеренные Значения

Рекомбинантный Фактор фон Виллебранда (рФфВ) Малое Хирургическое Вмешательство Обширное Хирургическое Вмешательство Стоматологическая Операция Болезнь фон Виллебранда Типа 1 Болезнь фон Виллебранда Типа 2A Болезнь фон Виллебранда Типа 2B Болезнь фон Виллебранда Типа 2M Болезнь фон Виллебранда Типа 3 Участники, которые Прошли Исследование 11 1 9 1 2 1 1 1 6 Интраоперационная Фактическая Кровопотеря По Сравнению С Прогнозируемой Кровопотерей
[Единицы измерения: Процент]
Среднее (Стандартное Отклонение) 69,6 (44,77) 0,0 ^[1] 68,9 (34,48) 145,0 ^[1] 122,5 (31,82) 50,0 ^[1] 100,0 ^[1] 100,0 ^[1] 45,0 (38,92)

[1] Стандартное отклонение рассчитать невозможно, так как был проанализирован только один участник.

Статистический Анализ Не Предоставлен Для Интраоперационной Фактической Кровопотери Относительно Прогнозируемой Кровопотери

Вторичный Результат: Результат №4

[00241] 4. Вторичный: Оценка Интраоперационной Фактической и Прогнозируемой Кровопотери согласно Оценке Врача-Хирурга [Сроки: День 0 (по окончанию операции)]

Таблица 17: Результат №4

Тип Измерения Вторичный Название Измерения Оценка Интраоперационной Фактической и Прогнозируемой Кровопотери согласно Оценке Врача-Хирурга Описание Измерения Гемостатическая эффективность оценивалась по шкале отлично - хорошо - удовлетворительно - неудовлетворительно.
Отлично: Интраоперационная кровопотеря была меньше или равна максимальной кровопотере, ожидаемой для типа хирургического вмешательства, выполняемого у гемостатически нормального субъекта (≤ 100%).
Хорошо: Интраоперационная кровопотеря была на 50% больше максимальной ожидаемой кровопотери для типа хирургического вмешательства, выполняемого у гемостатически нормального субъекта (101-150%). Удовлетворительно: Интраоперационная кровопотеря составляла более 50% от максимальной ожидаемой кровопотери для типа хирургического вмешательства, выполняемого у гемостатически нормального субъекта (> 150%).
Неудовлетворительно: Неконтролируемое кровотечение, которое явилось результатом неадекватного терапевтического ответа, несмотря на правильное дозирование, что требует изменения режима замены фактора свертывания крови. Сроки Исследования День 0 (по окончанию операции)

Таблица 18: Результат №4, Описание Выборки

Количество участников, подвергшихся обширному, малому хирургическому вмешательству или челюстно-лицевого хирургического вмешательства, и количество участников с болезнью фон Виллебранда типа 1, 2А, 2В, 2М и 3 суммируется до общего числа участников, которые прошли исследование. Для анализа использовался полный набор данных анализа, включая всех участников, которые получили исследуемый препарат и имели по меньшей мере 1 оценку гемостатической эффективности.

Таблица 19: Результат №4, Исследуемые Группы

Описание Рекомбинантный Фактор фон Виллебранда (рФфВ) Участники, подвергшиеся хирургическому вмешательству и получавшие Рекомбинантный Фактор фон Виллебранда (рФфВ) Малое Хирургическое Вмешательство Все участники, которые перенесли малое хирургическое вмешательство. Обширное Хирургическое Вмешательство Все участники, которые перенесли обширное хирургическое вмешательство. Стоматологическая Операция Все участники, которые перенесли челюстно-лицевое хирургическое вмешательство. Болезнь фон Виллебранда Типа 1 Все участники с Болезнью фон Виллебранда Типа 1. Болезнь фон Виллебранда Типа 2A Все участники с Болезнью фон Виллебранда Типа 2A. Болезнь фон Виллебранда Типа 2B Все участники с Болезнью фон Виллебранда Типа 2B. Болезнь фон Виллебранда Типа 2M Все участники с Болезнью фон Виллебранда Типа 2M. Болезнь фон Виллебранда Типа 3 Все участники с Болезнью фон Виллебранда Типа 3.

Таблица 20: Результат №4, Измеренные Значения

Рекомбинантный Фактор фон Виллебранда (рФфВ) Малое Хирургическое Вмешательство Обширное Хирургическое Вмешательство Стоматологическая Операция Болезнь фон Виллебранда Типа 1 Болезнь фон Виллебранда Типа 2A Болезнь фон Виллебранда Типа 2B Болезнь фон Виллебранда Типа 2M Болезнь фон Виллебранда Типа 3 Участники, которые Прошли Исследование 15 4 10 1 3 2 1 1 8 Оценка Интраоперационной Фактической и Прогнозируемой Кровопотери согласно Оценке Врача-Хирурга
[Единицы измерения: Участники]
Количество Участников Отлично 13  86,7% 4 100,0% 8   80,0% 1 100,0% 3 100,0% 1  50,0% 1 100,0% 1 100,0% 7  87,5% Хорошо 2  13,3% 0   0,0% 2  20,0% 0   0,0% 0   0,0% 1  50,0% 0   0,0% 0   0,0% 1  12,5% Удовлетворительно 0   0,0% 0   0,0% 0   0,0% 0   0,0% 0   0,0% 0   0,0% 0   0,0% 0   0,0% 0   0,0% Неудовлетворительно 0   0,0% 0   0,0% 0   0,0% 0   0,0% 0   0,0% 0   0,0% 0   0,0% 0   0,0% 0   0,0%

Статистический Анализ Не Предоставлен Для Интраоперационной Фактической И Прогнозируемой Оценки Кровопотери согласно Оценке Врача-Хирурга

Вторичный Результат: Результат №5

[00242] 5. Вторичный: Оценка Интраоперационной Гемостатической Эффективности согласно Оценке Врача-Хирурга [Сроки: День 0 (по окончанию операции)]

Таблица 21: Результат №5

Тип Измерения Вторичный Название Измерения Оценка Интраоперационной Гемостатической Эффективности согласно Оценке Врача-Хирурга Описание Измерения Гемостатическая эффективность оценивалась по шкале отлично - хорошо - удовлетворительно - неудовлетворительно.
Отлично: Интраоперационный гемостаз, достигнутый с использованием рФфВ с ADVATE или без него, был таким же хорошим или лучшим, чем ожидалось для типа хирургического вмешательства, выполняемого у гемостатически нормального субъекта.
Хорошо: Интраоперационный гемостаз, достигнутый с помощью рФфВ с ADVATE или без него, вероятно, был таким же хорошим, как ожидалось для типа хирургического вмешательства, выполняемого у гемостатически нормального субъекта.
Удовлетворительно: Интраоперационный гемостаз, достигнутый с помощью рФфВ с или без ADVATE был явно меньше оптимального для типа хирургического вмешательства, но сохранялся без необходимости замены концентрата рФфВ.
Неудовлетворительно: Участник перенес неконтролируемое кровотечение, которое было результатом неадекватного терапевтического ответа, несмотря на правильную дозировку, необходимость замены концентрата рФфВ. Сроки Исследования День 0 (по окончанию операции)

Таблица 22: Результат №5, Описание Выборки

Количество участников, подвергшихся обширному, малому хирургическому вмешательству или челюстно-лицевого хирургического вмешательства, и количество участников с болезнью фон Виллебранда типа 1, 2А, 2В, 2М и 3 суммируется до общего числа участников, которые прошли исследование. Для анализа использовался полный набор данных анализа, включая всех участников, которые получили исследуемый препарат и имели по меньшей мере 1 оценку гемостатической эффективности.

Таблица 23: Результат №5, Исследуемые Группы

Описание Рекомбинантный Фактор фон Виллебранда (рФфВ) Участники, подвергшиеся хирургическому вмешательству и получавшие Рекомбинантный Фактор фон Виллебранда (рФфВ) Малое Хирургическое Вмешательство Все участники, которые перенесли малое хирургическое вмешательство. Обширное Хирургическое Вмешательство Все участники, которые перенесли обширное хирургическое вмешательство. Стоматологическая Операция Все участники, которые перенесли челюстно-лицевое хирургическое вмешательство. Болезнь фон Виллебранда Типа 1 Все участники с Болезнью фон Виллебранда Типа 1. Болезнь фон Виллебранда Типа 2A Все участники с Болезнью фон Виллебранда Типа 2A. Болезнь фон Виллебранда Типа 2B Все участники с Болезнью фон Виллебранда Типа 2B. Болезнь фон Виллебранда Типа 2M Все участники с Болезнью фон Виллебранда Типа 2M. Болезнь фон Виллебранда Типа 3 Все участники с Болезнью фон Виллебранда Типа 3.

Таблица 24: Результат №5, Измеренные Значения

Рекомбинантный Фактор фон Виллебранда (рФфВ) Малое Хирургическое Вмешательство Обширное Хирургическое Вмешательство Стоматологическая Операция Болезнь фон Виллебранда Типа 1 Болезнь фон Виллебранда Типа 2A Болезнь фон Виллебранда Типа 2B Болезнь фон Виллебранда Типа 2M Болезнь фон Виллебранда Типа 3 Участники, которые Прошли Исследование 15 4 10 1 3 2 1 1 8 Оценка Интраоперационной Гемостатической Эффективности согласно Оценке Врача-Хирурга
[Единицы измерения: Участники]
Количество Участников Отлично 13  86,7% 4 100,0% 8   80,0% 1 100,0% 3 100,0% 1  50,0% 1 100,0% 1 100,0% 7  87,5% Хорошо 2  13,3% 0   0,0% 2  20,0% 0   0,0% 0   0,0% 1  50,0% 0   0,0% 0   0,0% 1  12,5% Удовлетворительно 0   0,0% 0   0,0% 0   0,0% 0   0,0% 0   0,0% 0   0,0% 0   0,0% 0   0,0% 0   0,0% Неудовлетворительно 0   0,0% 0   0,0% 0   0,0% 0   0,0% 0   0,0% 0   0,0% 0   0,0% 0   0,0% 0   0,0%

Статистический Анализ Не Предоставлен для Интраоперационной Оценки Гемостатической Эффективности согласно Оценке Врача-Хирурга

Вторичный Результат: Результат №6

[00243] 6. Вторичный: Суточная Интра- И Послеоперационная Скорректированная по Весу Доза РФфВ С ADVATE или Без него [Сроки: Ежедневно, от дня операции до послеоперационного Дня 14 (± 2 дня)]

Таблица 25: Результат №6

Тип Измерения Вторичный Название Измерения Суточная Интра- и Послеоперационная Скорректированная по Весу Доза РФфВ С ADVATE или Без него Описание Измерения Текст не введен. Сроки Исследования Ежедневно, от дня операции до послеоперационного Дня 14 (± 2 дня)]

Таблица 25: Результат №6, Описание Выборки

Количество участников, которые прошли исследование, было различным для временных точек в зависимости от индивидуального лечения. Для анализа использовался полный набор данных анализа, включая всех участников, которые получили исследуемый препарат и имели по меньшей мере 1 оценку гемостатической эффективности.

Таблица 40: Результат №6, Исследуемые Группы

Описание Рекомбинантный Фактор фон Виллебранда (рФфВ) Участники, подвергшиеся хирургическому вмешательству и получавшие Рекомбинантный Фактор фон Виллебранда (рФфВ)

Таблица 26: Результат №6, Измеренные Значения

Рекомбинантный Фактор фон Виллебранда (рФфВ) Участники, которые Прошли Исследование 15 Суточная Интра- И Послеоперационная Скорректированная по Весу Доза РФфВ С ADVATE или Без него
[Единицы измерения: МЕ/кг]
Медиана (Межквартильный Размах) интраоперационный период Участники, которые Прошли Исследование 1 интраоперационный период 18,1
(от 18,1 до 18,1) послеоперационный день 1 Участники, которые Прошли Исследование 3 послеоперационный день 1 23,5
(от 16,9 до 47,2) послеоперационный день 2 Участники, которые Прошли Исследование 11 послеоперационный день 2 42,3
(от 23,2 до 50,6) послеоперационный день 3 Участники, которые Прошли Исследование 12 послеоперационный день 3 28,6
(от 20,6 до 48,9) послеоперационный день 4 Участники, которые Прошли Исследование 9 послеоперационный день 4 33,9
(от 23,2 до 44,3) послеоперационный день 5 Участники, которые Прошли Исследование 7 послеоперационный день 5 31,5
(от 18,8 до 47,2) послеоперационный день 6 Участники, которые Прошли Исследование 5 послеоперационный день 6 23,2
(от 18,8 до 23,6) послеоперационный день 7 Участники, которые Прошли Исследование 5 послеоперационный день 7 23,8
(от 23,6 до 50,8) послеоперационный день 8 Участники, которые Прошли Исследование 7 послеоперационный день 8 33,9
(от 23,6 до 53,6) послеоперационный день 9 Участники, которые Прошли Исследование 3 послеоперационный день 9 23,6
(от 16,3 до 53,6) послеоперационный день 10 Участники, которые Прошли Исследование 3 послеоперационный день 10 23,6
(от 16,3 до 34,8) послеоперационный день 11 Участники, которые Прошли Исследование 3 послеоперационный день 11 23,6
(от 16,3 до 53,6) послеоперационный день 12 Участники, которые Прошли Исследование 4 послеоперационный день 12 29,3
(от 20,1 до 44,2) послеоперационный день 13 Участники, которые Прошли Исследование 1 послеоперационный день 13 16,3
(от 16,3 до 16,3) послеоперационный день 14 Участники, которые Прошли Исследование 2 послеоперационный день 14 25,5
(от 16,3 до 34,8) послеоперационный день 15 Участники, которые Прошли Исследование 1 послеоперационный день 15 16,3
(от 16,3 до 16,3)

Статистический анализ не предоставлен для суточной Интра- и Послеоперационной Скорректированной по Весу Дозы рФфВ с ADVATE или Без него

Вторичный Результат: Результат №7

[00244] 7. Вторичный: Возникновение Нежелательных Явлений [Сроки: От первой инфузии исследуемого препарата до завершения исследования (т.е. через 14 (± 2) дней после операции)].

Таблица 27: Результат №7

Тип Измерения Вторичный Название Измерения Возникновение Нежелательных Явлений Описание Измерения Оценивались нежелательные явления, возникшие в ходе лечении (НЯВЛ) и серьезные нежелательные явления, возникшие в ходе лечении (СНЯВЛ). Сроки Исследования От первой инфузии исследуемого препарата до завершения исследования (т.е. через 14 (± 2) дней после операции)

Таблица 28: Результат №7, Описание Выборки

Набор данных анализа безопасности, включая всех участников, которые получили какое-либо количество исследуемого препарата, был использован для анализа данного критерия эффективности.

Таблица 29: Результат №7, Исследуемые Группы

Описание Рекомбинантный Фактор фон Виллебранда (рФфВ) Участники, подвергшиеся хирургическому вмешательству и получавшие Рекомбинантный Фактор фон Виллебранда (рФфВ)

Таблица 30: Измеренные Значения

Рекомбинантный Фактор фон Виллебранда (рФфВ) Участники, которые Прошли Исследование 15 Возникновение Нежелательных Явлений
[Единицы измерения: Нежелательные Явления] Нежелательные Явлений, Возникшие в ходе Лечения (НЯВЛ) 12 Тяжелые НЯВЛ 1 НЯВЛ, связанные с рФфВ 0 НЯВЛ, связанные с ADVATE 0 НЯВЛ, связанные как с рФфВ, так и с ADVATE 0 Серьезные Нежелательные Явления, Возникшие в ходе Лечении (СНЯВЛ). 2 СНЯВЛ, связанные с рФфВ 0 СНЯВЛ, связанные с ADVATE 0 СНЯВЛ, связанные как с рФфВ, так и с ADVATE 0 НЯВЛ, которые привели к досрочному завершению терапии с помощью рФфВ 0 СНЯВЛ, которые привели к досрочному завершению терапии с помощью ADVATE 0 НЯВЛ, которые привели к досрочному завершению исследования 0 НЯВЛ, которые привели к смерти 0 НЯВЛ, связанные с процедурой, предусмотренной исследованием 0 СНЯВЛ, связанные с процедурой, предусмотренной исследованием 0

Статистический анализ не предоставлен для случаев Возникновения Нежелательных Явлений

Вторичный Результат: Результат №8

[00245] 8. Вторичный: Возникновение Тромботических Явлений [Сроки: От первой инфузии исследуемого препарата до завершения исследования (т.е., через 14 (± 2) дней после операции)].

Таблица 31: Результат №8

Тип Измерения Вторичный Название Измерения Возникновение Тромботических Явлений Описание Измерения Нежелательные явления, возникшие в ходе лечения (НЯВЛ) и серьезные нежелательные явления, возникшие в ходе лечении (СНЯВЛ) оценивались на наличие тромботических явлений. Сроки Исследования От первой инфузии исследуемого препарата до завершения исследования (т.е. через 14 (± 2) дней после операции)

Таблица 32: Результат №8, Описание Выборки

Набор данных анализа безопасности, включая всех участников, которые получили какое-либо количество исследуемого препарата, был использован для анализа данного критерия эффективности.

Таблица 33: Исследуемые Группы

Описание Рекомбинантный Фактор фон Виллебранда (рФфВ) Участники, подвергшиеся хирургическому вмешательству и получавшие Рекомбинантный Фактор фон Виллебранда (рФфВ)

Таблица 34: Результат №8, Измеренные Значения

Рекомбинантный Фактор фон Виллебранда (рФфВ) Участники, которые Прошли Исследование 15 Возникновение Тромботических Явлений
[Единицы измерения: Нежелательные Явления] Тромботические НЯВЛ 2 Тромботические СНЯВЛ 1

Статистический анализ не предоставлен для случаев Возникновения Тромботических Явлений

Вторичный Результат: Результат №9

[00246] 9. Вторичный: Возникновение Тяжелых Аллергических Реакций (например, Анафилаксии) [Сроки: От первой инфузии исследуемого препарата до завершения исследования (т.е., через 14 (± 2) дней после операции)].

Таблица 35: Результат №9

Тип Измерения Вторичный Название Измерения Возникновение Тяжелых Аллергических Реакций (например, Анафилаксии) Описание Измерения Нежелательные явления, возникшие в ходе лечении (НЯВЛ) и серьезные нежелательные явления, возникшие в ходе лечении (СНЯВЛ) оценивались на наличие тяжелых аллергических реакций. Сроки Исследования От первой инфузии исследуемого препарата до завершения исследования (т.е. через 14 (± 2) дней после операции)

Таблица 36: Результат №9, Описание Выборки

Набор данных анализа безопасности, включая всех участников, которые получили какое-либо количество исследуемого препарата, был использован для анализа данного критерия эффективности.

Таблица 37: Результат №9, Исследуемые Группы

Описание Рекомбинантный Фактор фон Виллебранда (рФфВ) Участники, подвергшиеся хирургическому вмешательству и получавшие Рекомбинантный Фактор фон Виллебранда (рФфВ)

Таблица 38: Результат №9, Измеренные Значения

Рекомбинантный Фактор фон Виллебранда (рФфВ) Участники, которые Прошли Исследование 15 Возникновение Тяжелых Аллергических Реакций (например, Анафилаксии)
[Единицы измерения: Нежелательные Явления] Тяжелые Аллергические Реакции НЯВЛ 0 Тяжелые Аллергические Реакции СНЯВЛ 0

Статистический анализ не представлен для случаев Возникновения Тяжелых Аллергических Реакций (например, Анафилаксии)

Вторичный Результат: Результат №10

[00247] 10. Вторичный: Число Участников, Которые Вырабатывали Ингибирующие и Суммарные Связывающие Антитела к Фактору Фон Виллебранда (Ффв) и Ингибирующие Антитела к Фактору VIII (ФVIII) [Сроки: Тестирование проводилось на протяжении всего исследования во время скрининга, до ФК инфузии, до операции, после операции в случае сильного кровотечения или необъяснимого кровотечения, на день 7 после операции и при посещении по завершению исследования (т.е. через 14 (± 2) дней после операции).]

Таблица 39: Результат №10, Описание Выборки

Тип Измерения Вторичный Название Измерения Число Участников, Которые Вырабатывали Ингибирующие и Суммарные Связывающие Антитела к Фактору Фон Виллебранда (Ффв) и Ингибирующие Антитела к Фактору VIII (ФVIII) Описание Измерения Участников лечили рекомбинантным Фактором фон Виллебранда (рФфВ) с ADVATE или без него. Сроки Исследования Тестирование проводилось на протяжении всего исследования во время скрининга, до ФК инфузии, до операции, после операции в случае сильного кровотечения или необъяснимого кровотечения, на день 7 после операции и при посещении по завершению исследования (т.е. через 14 (± 2) дней после операции).

Таблица 40: Результат №10, Описание Выборки

Набор данных анализа безопасности, включая всех участников, которые получили какое-либо количество исследуемого препарата, был использован для анализа данного критерия эффективности.

Таблица 41: Результат №10, Исследуемые Группы

Описание Рекомбинантный Фактор фон Виллебранда (рФфВ) Участники, подвергшиеся хирургическому вмешательству и получавшие Рекомбинантный Фактор фон Виллебранда (рФфВ)

Таблица 55: Результат №10, Измеренные Значения

Рекомбинантный Фактор фон Виллебранда (рФфВ) Участники, которые Прошли Исследование 15 Число Участников, Которые Вырабатывали Ингибирующие и Суммарные Связывающие Антитела к Фактору Фон Виллебранда (Ффв) и Ингибирующие Антитела к Фактору VIII (ФVIII)
[Единицы измерения: Участники]
Количество Участников Выработка Ингибирующих Антител Против ФфВ 0 Выработка Суммарных Связывающих Антител Против ФфВ 1 Выработка Ингибирующих Антител Против ФфВ 0

Статистический анализ не предоставлен для Числа Участников, Которые Вырабатывали Ингибирующие и Суммарные Связывающие Антитела к Фактору Фон Виллебранда (Ффв) и Ингибирующие Антитела к Фактору VIII (ФVIII)

Вторичный Результат: Результат №11

[00248] 11. Вторичный: Число Участников, Которые Вырабатывали Антитела к Белкам Яичника Китайского Хомяка (СНО), Мышиному Иммуноглобулину G (IgG) или Рекомбинантному Фурину (рФурину) [Сроки: Тестирование проводилось на протяжении всего исследования во время скрининга, до ФК инфузии, до операции, после операции в случае сильного кровотечения или необъяснимого кровотечения, на день 7 после операции и при посещении по завершению исследования (т.е. через 14 (± 2) дней после операции).]

Таблица 42: Результат №11

Тип Измерения Вторичный Название Измерения Число Участников, Которые Вырабатывали Антитела к Белкам Яичника Китайского Хомяка (СНО), Мышиному Иммуноглобулину G (IgG) или Рекомбинантному Фурину (рФурину) Описание Измерения Участников лечили рекомбинантным Фактором фон Виллебранда (рФфВ) с ADVATE или без него. Сроки Исследования Тестирование проводилось на протяжении всего исследования во время скрининга, до ФК инфузии, до операции, после операции в случае сильного кровотечения или необъяснимого кровотечения, на день 7 после операции и при посещении по завершению исследования (т.е. через 14 (± 2) дней после операции).

Таблица 43: Результат №11, Описание Выборки

Набор данных анализа безопасности, включая всех участников, которые получили какое-либо количество исследуемого препарата, был использован для анализа данного критерия эффективности.

Таблица 44: Результат №11, Исследуемые Группы

Описание Рекомбинантный Фактор фон Виллебранда (рФфВ) Участники, подвергшиеся хирургическому вмешательству и получавшие Рекомбинантный Фактор фон Виллебранда (рФфВ)

Таблица 59: Результат №11, Измеренные Значения

Рекомбинантный Фактор фон Виллебранда (рФфВ) Участники, которые Прошли Исследование 15 Число Участников, Которые Вырабатывали Антитела к Белкам Яичника Китайского Хомяка (СНО), Мышиному Иммуноглобулину G (IgG) или Рекомбинантному Фурину (рФурину)
[Единицы измерения: Участники]
Количество Участников 0

Статистический анализ не представлен для Числа Участников, Которые Вырабатывали Антитела к Белкам Яичника Китайского Хомяка (СНО), Мышиному Иммуноглобулину G (IgG) или Рекомбинантному Фурину (рФурину)

Вторичный Результат: Результат №12

[00249] 12. Вторичный: Фармакокинетика: Площадь Под Кривой Зависимости Концентрации в Плазме от Времени от 0 до 72 Часов После Инфузии (AUC 0-72 Ч/Доза) [Сроки: Измерения ФК проводились в течение 30 минут до инфузии и после инфузии через 30 (± 5) минут, 60 (± 5) минут, 6 (± 1) часов, 12 (± 1) часов, 24 (± 2) часа, 48 (± 2) часов и 72 (± 2) часа.]

Таблица 45: Результат №12

Тип Измерения Вторичный Название Измерения Фармакокинетика: Площадь Под Кривой Зависимости Концентрации в Плазме от Времени от 0 до 72 Часов После Инфузии (AUC 0-72 Ч/Доза) Описание Измерения Эта оценка была необходима только для субъектов, подвергающихся обширному хирургическому вмешательству. Субъекты получали ФK инфузию в дозе 50±5 МЕ/кг рФфВ:РКо в течение 42 дней до операции. Площадь под кривой зависимости концентрации в плазме/время от 0 до 72 часов после инфузии была рассчитана с использованием линейного правила трапеции. Для расчета AUC(0-72ч) уровни через 72 часа были линейно интерполированы/экстраполированы из 2 ближайших точек времени отбора проб.
ФK-анализ проводили для следующих аналитов:
Ристоцетин-Кофакторной Активности ФфВ (ФфВ:РКо), Активности Антигена ФфВ (ФфВ:Аг), Коллаген-Связывающей Активности ФфВ (ФфВ:КС), Активности ФфВ, измеренной тест системой INNOVANCE VWF Ac (ФфВ:Ак (VWF:Ac)), Коагулянтной Активности ФVIII (ФVIII:К) Сроки Исследования Измерения ФК проводились в течение 30 минут до инфузии и после инфузии через 30 (± 5) минут, 60 (± 5) минут, 6 (± 1) часов, 12 (± 1) часов, 24 (± 2) часа, 48 (± 2) часов и 72 (± 2) часа.

Таблица 46: Результат №12, Описание Выборки

Набор данных анализа ФK, включая всех участников, которые прошли оценку ФK с данными, собранными в соответствующие временные точки, был использован для анализа данного критерия эффективности.

Таблица 47: Результат №12, Исследуемые Группы

Описание Рекомбинантный Фактор фон Виллебранда (рФфВ) Участники, подвергшиеся хирургическому вмешательству и получавшие Рекомбинантный Фактор фон Виллебранда (рФфВ)

Таблица 48: Результат №12, Измеренные Значения

Рекомбинантный Фактор фон Виллебранда (рФфВ) Участники, которые Прошли Исследование 11 Фармакокинетика: Площадь Под Кривой Зависимости Концентрации в Плазме от Времени от 0 до 72 Часов После Инфузии (AUC 0-72 Ч/Доза)
[Единицы: часы*МЕ/дл]
Среднее Геометрическое (Геометрический Коэффициент Вариации) ФфВ:РКо Участники, которые Прошли Исследование 11 ФфВ:РКо 31,91
(37,5%) ФфВ:Аг Участники, которые Прошли Исследование 11 ФфВ:Аг 57,08
(25,6%) ФфВ:КС Участники, которые Прошли Исследование 11 ФфВ:КС 63,91
(29,4%) ФфВ:Ак Участники, которые Прошли Исследование 11 ФфВ:Ак 54,61
(28,1%) ФVIII:К Участники, которые Прошли Исследование 5 ФVIII:К 67,49
(31,1%)

Статистический анализ не представлен для Фармакокинетики Площадь Под Кривой Зависимости Концентрации в Плазме от Времени от 0 до 72 Часов После Инфузии (AUC 0-72 Ч/Доза)

Вторичный Результат: Результат №13

[00250] 13. Вторичный: Фармакокинетика: Площадь Под Кривой Зависимости Концентрации в Плазме От Времени от 0 до Бесконечности (AUC 0-∞/Доза) [Сроки: Измерения ФК проводились в течение 30 минут до инфузии и после инфузии через 30 (± 5) минут, 60 (± 5) минут, 6 (± 1) часов, 12 (± 1) часов, 24 (± 2) часа, 48 (± 2) часов и 72 (± 2) часа.]

Таблица 49: Результат №13

Тип Измерения Вторичный Название Измерения Фармакокинетика: Площадь Под Кривой Зависимости Концентрации в Плазме От Времени от 0 до Бесконечности (AUC 0-∞/Доза) Описание Измерения Эта оценка была необходима только для субъектов, подвергающихся обширному хирургическому вмешательству. Субъекты получали ФK инфузию в дозе 50±5 МЕ/кг рФфВ:РКо в течение 42 дней до операции. Площадь под кривой зависимости концентрации в плазме/время от 0 до бесконечности и площадь под первым моментом этой кривой от 0 до бесконечности рассчитывали как сумму AUC или AUMC от времени 0 до времени последней возможной количественной оценки концентрации плюс поправка хвоста распределения рассчитанного как Ct/λz и Ct/λz(t+1/λz) соответственно, где Ct - последняя возможная количественная оценка концентрации, t - время последней возможной количественной оценки концентрации, а λz - константа скорости распределения в конечной фазе.
ФK-анализ проводили для следующих аналитов:
Ристоцетин-Кофакторной Активности ФфВ (ФфВ:РКо), Активности Антигена ФфВ (ФфВ:Аг), Коллаген-Связывающей Активности ФфВ (ФфВ:КС), Активности ФфВ, измеренной тест системой INNOVANCE VWF Ac (ФфВ:Ак (VWF:Ac)), Коагулянтной Активности ФVIII (ФVIII:К) Сроки Исследования Измерения ФК проводились в течение 30 минут до инфузии и после инфузии через 30 (± 5) минут, 60 (± 5) минут, 6 (± 1) часов, 12 (± 1) часов, 24 (± 2) часа, 48 (± 2) часов и 72 (± 2) часа.

Таблица 50: Результат №13, Описание Выборки

Набор данных анализа ФK, включая всех участников, которые прошли оценку ФK с данными, собранными в соответствующие временные точки, был использован для анализа данного критерия эффективности.

Таблица 51: Результат №13, Исследуемые Группы

Описание Рекомбинантный Фактор фон Виллебранда (рФфВ) Участники, подвергшиеся хирургическому вмешательству и получавшие Рекомбинантный Фактор фон Виллебранда (рФфВ)

Таблица 52: Измеренные Значения

Рекомбинантный Фактор фон Виллебранда (рФфВ) Участники, которые Прошли Исследование 11 Фармакокинетика: Площадь Под Кривой Зависимости Концентрации в Плазме От Времени от 0 до Бесконечности (AUC 0-∞/Доза)
[Единицы: часы*МЕ/дл]
Среднее Геометрическое (Геометрический Коэффициент Вариации) ФфВ:РКо Участники, которые Прошли Исследование 11 ФфВ:РКо 34,43
(43,3%) ФфВ:Аг Участники, которые Прошли Исследование 11 ФфВ:Аг 68,87
(31,5%) ФфВ:КС Участники, которые Прошли Исследование 11 ФфВ:КС 71,82
(34,1%) ФфВ:Ак Участники, которые Прошли Исследование 11 ФфВ:Ак 61,90
(32,2%) ФVIII:К Участники, которые Прошли Исследование 3 ФVIII:К 75,00
(30,9%)

Статистический анализ не представлен для Фармакокинетики Площадь Под Кривой Зависимости Концентрации в Плазме От Времени от 0 до Бесконечности (AUC 0-∞/Доза)

Вторичный Результат: Результат №14

[00251] 14. Вторичный: Фармакокинетика: Среднее Время Удержания (СВУ) [Сроки: Измерения ФК проводились в течение 30 минут до инфузии и после инфузии через 30 (± 5) минут, 60 (± 5) минут, 6 (± 1) часов, 12 (± 1) часов, 24 (± 2) часа, 48 (± 2) часов и 72 (± 2) часа.]

Таблица 53: Результат №14

Тип Измерения Вторичный Название Измерения Фармакокинетика: Среднее Время Удержания (СВУ) Описание Измерения Эта оценка была необходима только для субъектов, подвергающихся обширному хирургическому вмешательству. Субъекты получали ФK инфузию в дозе 50±5 МЕ/кг рФфВ:РКо в течение 42 дней до операции. Среднее время удержания рассчитывалось как площадь под первым моментом фармакокинетической кривой от 0 до бесконечности, деленная на площадь под кривой зависимости от времени от 0 до бесконечности минус Т/2, где Т - продолжительность инфузии.
ФK-анализ проводили для следующих аналитов:
Ристоцетин-Кофакторной Активности ФфВ (ФфВ:РКо), Активности Антигена ФфВ (ФфВ:Аг), Коллаген-Связывающей Активности ФфВ (ФфВ:КС), Активности ФфВ, измеренной тест системой INNOVANCE VWF Ac (ФфВ:Ак) Сроки Исследования Измерения ФК проводились в течение 30 минут до инфузии и после инфузии через 30 (± 5) минут, 60 (± 5) минут, 6 (± 1) часов, 12 (± 1) часов, 24 (± 2) часа, 48 (± 2) часов и 72 (± 2) часа.

Таблица 54: Результат №14, Описание Выборки

Набор данных анализа ФK, включая всех участников, которые прошли оценку ФK с данными, собранными в соответствующие временные точки, был использован для анализа данного критерия эффективности.

Таблица 55: Результат №14, Исследуемые Группы

Описание Рекомбинантный Фактор фон Виллебранда (рФфВ) Участники, подвергшиеся хирургическому вмешательству и получавшие Рекомбинантный Фактор фон Виллебранда (рФфВ)

Таблица 56: Измеренные Значения

Рекомбинантный Фактор фон Виллебранда (рФфВ) Участники, которые Прошли Исследование 11 Фармакокинетика: Среднее Время Удержания (СВУ)
[Единицы измерения: Часы]
Среднее Геометрическое (Геометрический Коэффициент Вариации) ФфВ:РКо 22,69
(41,3%) ФфВ:Аг 37,92
(28,4%) ФфВ:КС 29,35
(31,1%) ФфВ:Ак 29,75
(28,6%)

Статистический анализ не представлен для Фармакокинетики Среднее Время Удержания (СВУ)

Вторичный Результат: Результат №15

[00252] 15. Вторичный: Фармакокинетика: Клиренс (Кл) [Сроки: Измерения ФК проводились в течение 30 минут до инфузии и после инфузии через 30 (± 5) минут, 60 (± 5) минут, 6 (± 1) часов, 12 (± 1) часов, 24 (± 2) часа, 48 (± 2) часов и 72 (± 2) часа.]

Таблица 57: Результат №15

Тип Измерения Вторичный Название Измерения Фармакокинетика: Клиренс (Кл) Описание Измерения Эта оценка была необходима только для субъектов, подвергающихся обширному хирургическому вмешательству. Субъекты получали ФK инфузию в дозе 50±5 МЕ/кг рФфВ:РКо в течение 42 дней до операции. Клиренс рассчитывали как дозу (МЕ/кг), деленную на площадь под кривой зависимости от времени от 0 до бесконечности.
ФK-анализ проводили для следующих аналитов:
Ристоцетин-Кофакторной Активности ФфВ (ФфВ:РКо), Активности Антигена ФфВ (ФфВ:Аг), Коллаген-Связывающей Активности ФфВ (ФфВ:КС), Активности ФфВ, измеренной тест системой INNOVANCE VWF Ac (ФфВ:Ак) Сроки Исследования Измерения ФК проводились в течение 30 минут до инфузии и после инфузии через 30 (± 5) минут, 60 (± 5) минут, 6 (± 1) часов, 12 (± 1) часов, 24 (± 2) часа, 48 (± 2) часов и 72 (± 2) часа.

Таблица 58: Результат №15, Описание Выборки

Набор данных анализа ФK, включая всех участников, которые прошли оценку ФK с данными, собранными в соответствующие временные точки, был использован для анализа данного критерия эффективности.

Таблица 59: Результат №15, Исследуемые Группы

Описание Рекомбинантный Фактор фон Виллебранда (рФфВ) Участники, подвергшиеся хирургическому вмешательству и получавшие Рекомбинантный Фактор фон Виллебранда (рФфВ)

Таблица 60: Измеренные Значения

Рекомбинантный Фактор фон Виллебранда (рФфВ) Участники, которые Прошли Исследование 11 Фармакокинетика: Клиренс (Кл)
[Единицы измерения: дл/час/кг]
Среднее Геометрическое (Геометрический Коэффициент Вариации) ФфВ:РКо 0,02904
(43,3%) ФфВ:Аг 0,01452
(31,5%) ФфВ:КС 0,01392
(34,1%) ФфВ:Ак 0,01616
(32,2%)

Статистический анализ не представлен для Фармакокинетики Клиренс (Кл)

Вторичный Результат: Результат №16

[00253] 16. Вторичный: Фармакокинетика: Постепенное Восстановление (ПВ) [Сроки: Измерения ФК проводились в течение 30 минут до инфузии и после инфузии через 30 (± 5) минут, 60 (± 5) минут, 6 (± 1) часов, 12 (± 1) часов, 24 (± 2) часа, 48 (± 2) часов и 72 (± 2) часа.]

Таблица 61: Результат №16

Тип Измерения Вторичный Название Измерения Фармакокинетика: Постепенное Восстановление (ПВ) Описание Измерения Эта оценка была необходима только для субъектов, подвергающихся обширному хирургическому вмешательству. Субъекты получали ФK инфузию в дозе 50±5 МЕ/кг рФфВ:РКо в течение 42 дней до операции. Постепенное восстановление рассчитывали как (Cмакс минус Cдо инфузии), деленное на дозу (МЕ/кг), где кг относится к массе тела на момент введения дозы, а Cмакс - наблюдаемая максимальная концентрация перед коррекцией для значений до инфузии.
ФK-анализ проводили для следующих аналитов:
Ристоцетин-Кофакторной Активности ФфВ (ФфВ:РКо), Активности Антигена ФфВ (ФфВ:Аг), Коллаген-Связывающей Активности ФфВ (ФфВ:КС), Активности ФфВ, измеренной тест системой INNOVANCE VWF Ac (ФфВ:Ак) Сроки Исследования Измерения ФК проводились в течение 30 минут до инфузии и после инфузии через 30 (± 5) минут, 60 (± 5) минут, 6 (± 1) часов, 12 (± 1) часов, 24 (± 2) часа, 48 (± 2) часов и 72 (± 2) часа.

Таблица 77: Результат №16, Описание Выборки

Набор данных анализа ФK, включая всех участников, которые прошли оценку ФK с данными, собранными в соответствующие временные точки, был использован для анализа данного критерия эффективности.

Таблица 62: Результат №16, Исследуемые Группы

Описание Рекомбинантный Фактор фон Виллебранда (рФфВ) Участники, подвергшиеся хирургическому вмешательству и получавшие Рекомбинантный Фактор фон Виллебранда (рФфВ)

Таблица 63: Результат №16, Измеренные Значения

Рекомбинантный Фактор фон Виллебранда (рФфВ) Участники, которые Прошли Исследование 11 Фармакокинетика: Постепенное Восстановление (ПВ)
[Единицы измерения: МЕ/дл]
Среднее (Стандартное Отклонение) ФфВ:РКо 1,961 (0,45445) ФфВ:Аг 1,991 (0,38395) ФфВ:КС 2,780 (0,56640) ФфВ:Ак 2,635 (0,38050)

Статистический анализ не представлен для Фармакокинетики Постепенное Восстановление (ПВ)

Вторичный Результат: Результат №17

[00254] 17. Вторичный: Фармакокинетика: Период Полувыведения (T1/2) [Сроки: Измерения ФК проводились в течение 30 минут до инфузии и после инфузии через 30 (± 5) минут, 60 (± 5) минут, 6 (± 1) часов, 12 (± 1) часов, 24 (± 2) часа, 48 (± 2) часов и 72 (± 2) часа.]

Таблица 64: Результат №17

Тип Измерения Вторичный Название Измерения Фармакокинетика: Период Полувыведения (T1/2) Описание Измерения Эта оценка была необходима только для субъектов, подвергающихся обширному хирургическому вмешательству. Субъекты получали ФK инфузию в дозе 50±5 МЕ/кг рФфВ:РКо в течение 42 дней до операции. Конечный период полувыведения (T1/2) рассчитывали как ln2/λz, где λz - константа скорости терминальной элиминации, рассчитанная в WinNonlin NCA с использованием, по меньшей мере, трех количественных оценок концентрации.
ФK-анализ проводили для следующих аналитов:
Ристоцетин-Кофакторной Активности ФфВ (ФфВ:РКо), Активности Антигена ФфВ (ФфВ:Аг), Коллаген-Связывающей Активности ФфВ (ФфВ:КС), Активности ФфВ, измеренной тест системой INNOVANCE VWF Ac (ФфВ:Ак) Сроки Исследования Измерения ФК проводились в течение 30 минут до инфузии и после инфузии через 30 (± 5) минут, 60 (± 5) минут, 6 (± 1) часов, 12 (± 1) часов, 24 (± 2) часа, 48 (± 2) часов и 72 (± 2) часа.

Таблица 65: Результат №17, Описание Выборки

Набор данных анализа ФK, включая всех участников, которые прошли оценку ФK с данными, собранными в соответствующие временные точки, был использован для анализа данного критерия эффективности.

Таблица 66: Результат №17, Исследуемые Группы

Описание Рекомбинантный Фактор фон Виллебранда (рФфВ) Участники, подвергшиеся хирургическому вмешательству и получавшие Рекомбинантный Фактор фон Виллебранда (рФфВ)

Измеренные Значения

Рекомбинантный Фактор фон Виллебранда (рФфВ) Участники, которые Прошли Исследование 11 Фармакокинетика: Период Полувыведения (T1/2)
[Единицы измерения: Часы]
Среднее Геометрическое (Геометрический Коэффициент Вариации) ФфВ:РКо 16,52
(42,7%) ФфВ:Аг 26,88
(26,5%) ФфВ:КС 21,07
(33,2%) ФфВ:Ак 22,19
(28,5%)

Статистический анализ не представлен для Фармакокинетики: Период Полувыведения (T1/2)

Вторичный Результат: Результат №18

[00255] 18. Вторичный: Фармакокинетика: Объем Распределения в Равновесном Состоянии (ОбРС) [Сроки: Измерения ФК проводились в течение 30 минут до инфузии и после инфузии через 30 (± 5) минут, 60 (± 5) минут, 6 (± 1) часов, 12 (± 1) часов, 24 (± 2) часа, 48 (± 2) часов и 72 (± 2) часа.]

Таблица 67: Результат №18

Тип Измерения Вторичный Название Измерения Фармакокинетика: Объем Распределения в Равновесном Состоянии (ОбРС) Описание Измерения Эта оценка была необходима только для субъектов, подвергающихся обширному хирургическому вмешательству. Субъекты получали ФK инфузию в дозе 50±5 МЕ/кг рФфВ:РКо в течение 42 дней до операции. ОбРС был рассчитан как клиренс, умноженный на среднее время удержания.
ФK-анализ проводили для следующих аналитов:
Ристоцетин-Кофакторной Активности ФфВ (ФфВ:РКо), Активности Антигена ФфВ (ФфВ:Аг), Коллаген-Связывающей Активности ФфВ (ФфВ:КС), Активности ФфВ, измеренной тест системой INNOVANCE VWF Ac (ФфВ:Ак) Сроки Исследования Измерения ФК проводились в течение 30 минут до инфузии и после инфузии через 30 (± 5) минут, 60 (± 5) минут, 6 (± 1) часов, 12 (± 1) часов, 24 (± 2) часа, 48 (± 2) часов и 72 (± 2) часа.

Таблица 68: Результат №18, Описание Выборки

Набор данных анализа ФK, включая всех участников, которые прошли оценку ФK с данными, собранными в соответствующие временные точки, был использован для анализа данного критерия эффективности.

Таблица 69: Результат №18, Исследуемые Группы

Описание Рекомбинантный Фактор фон Виллебранда (рФфВ) Участники, подвергшиеся хирургическому вмешательству и получавшие Рекомбинантный Фактор фон Виллебранда (рФфВ)

Результат №18, Измеренные Значения

Рекомбинантный Фактор фон Виллебранда (рФфВ) Участники, которые Прошли Исследование 11 Фармакокинетика: Объем Распределения в Равновесном Состоянии (ОбРС)
[Единицы измерения: дл/кг]
Среднее Геометрическое (Геометрический Коэффициент Вариации) ФфВ:РКо 0,6591
(28,8%) ФфВ:Аг 0,5506
(18,4%) ФфВ:КС 0,4086
(24,0%) ФфВ:Ак 0,4806
(21,5%)

Статистический анализ не представлен для Фармакокинетики: Объем Распределения в Равновесном Состоянии (ОбРС)

[00256] Приведенные выше примеры представлены для того, чтобы дать специалистам в данной области техники полное раскрытие и описание того, как изготавливать и использовать варианты реализации композиций, систем и способов по изобретению, и не предназначены для ограничения объема того, что изобретатели считают своим изобретением. Предполагается, что модификации вышеописанных способов реализации изобретения, очевидные для специалистов в данной области техники, находятся в пределах объема следующей формулы изобретения. Все патенты и публикации, упомянутые в описании, указывают уровни квалификации специалистов в области техники, к которой относится изобретение. Все ссылки, цитируемые в этом раскрытии, включены посредством ссылки в той же степени, как если бы каждая ссылка была включена посредством ссылки во всей своей полноте в отдельности.

[00257] Все заголовки и обозначения разделов используются только для ясности и в справочных целях и никоим образом не должны рассматриваться как ограничивающие. Например, специалисты в данной области техники оценят полезность комбинирования различных аспектов из разных заголовков и разделов, в зависимости от ситуации, в соответствии со смыслом и объемом изобретения, описанного в данном документе.

[00258] Все ссылки, цитируемые в данном документе, тем самым включены в данный документ посредством ссылки во всей их полноте и для всех целей в той же степени, как если бы каждая отдельная публикация, патент или заявка на патент были конкретно и индивидуально указаны для включения в качестве ссылки во всей своей полноте для всех целей.

[00259] Многие модификации и варианты данной заявки могут быть сделаны без отклонения от его сущности и объема, как будет очевидно для специалистов в данной области техники. Конкретные варианты реализации изобретения и примеры, описанные в данном документе, предлагаются только в качестве примера, и применение должно быть ограничено только условиями прилагаемой формулы изобретения, а также полным объемом эквивалентов, на которые имеет право заявленная формула.

--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Baxalta Incorporated

Baxalta GmbH

Chapman, Miranda

Ewenstein, Bruce

Ploder, Bettina

<120> ЛЕЧЕНИЕ ПАЦИЕНТОВ С ТЯЖЕЛОЙ ФОРМОЙ БОЛЕЗНИ ФОН ВИЛЛЕБРАНДА ПОДВЕРГАЮЩИХСЯ ПЛАНОВОМУ ХИРУРГИЧЕСКОМУ ВМЕШАТЕЛЬСТВУ ПУТЕМ ВВЕДЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО ФФВ

<130> 008073-5186-US

<140> US 16/030,653

<141> 2018-07-09

<150> US 62/530,024

<151> 2017-07-07

<150> US 62/546,999

<151> 2017-08-17

<160> 3

<170> PatentIn версия 3.5

<210> 1

<211> 8833

<212> ДНК

<213> Искусственная Последовательность

<220>

<223> препро-ффВ

<400> 1

agctcacagc tattgtggtg ggaaagggag ggtggttggt ggatgtcaca gcttgggctt 60

tatctccccc agcagtgggg actccacagc ccctgggcta cataacagca agacagtccg 120

gagctgtagc agacctgatt gagcctttgc agcagctgag agcatggcct agggtgggcg 180

gcaccattgt ccagcagctg agtttcccag ggaccttgga gatagccgca gccctcattt 240

gcaggggaag atgattcctg ccagatttgc cggggtgctg cttgctctgg ccctcatttt 300

gccagggacc ctttgtgcag aaggaactcg cggcaggtca tccacggccc gatgcagcct 360

tttcggaagt gacttcgtca acacctttga tgggagcatg tacagctttg cgggatactg 420

cagttacctc ctggcagggg gctgccagaa acgctccttc tcgattattg gggacttcca 480

gaatggcaag agagtgagcc tctccgtgta tcttggggaa ttttttgaca tccatttgtt 540

tgtcaatggt accgtgacac agggggacca aagagtctcc atgccctatg cctccaaagg 600

gctgtatcta gaaactgagg ctgggtacta caagctgtcc ggtgaggcct atggctttgt 660

ggccaggatc gatggcagcg gcaactttca agtcctgctg tcagacagat acttcaacaa 720

gacctgcggg ctgtgtggca actttaacat ctttgctgaa gatgacttta tgacccaaga 780

agggaccttg acctcggacc cttatgactt tgccaactca tgggctctga gcagtggaga 840

acagtggtgt gaacgggcat ctcctcccag cagctcatgc aacatctcct ctggggaaat 900

gcagaagggc ctgtgggagc agtgccagct tctgaagagc acctcggtgt ttgcccgctg 960

ccaccctctg gtggaccccg agccttttgt ggccctgtgt gagaagactt tgtgtgagtg 1020

tgctgggggg ctggagtgcg cctgccctgc cctcctggag tacgcccgga cctgtgccca 1080

ggagggaatg gtgctgtacg gctggaccga ccacagcgcg tgcagcccag tgtgccctgc 1140

tggtatggag tataggcagt gtgtgtcccc ttgcgccagg acctgccaga gcctgcacat 1200

caatgaaatg tgtcaggagc gatgcgtgga tggctgcagc tgccctgagg gacagctcct 1260

ggatgaaggc ctctgcgtgg agagcaccga gtgtccctgc gtgcattccg gaaagcgcta 1320

ccctcccggc acctccctct ctcgagactg caacacctgc atttgccgaa acagccagtg 1380

gatctgcagc aatgaagaat gtccagggga gtgccttgtc acaggtcaat cacacttcaa 1440

gagctttgac aacagatact tcaccttcag tgggatctgc cagtacctgc tggcccggga 1500

ttgccaggac cactccttct ccattgtcat tgagactgtc cagtgtgctg atgaccgcga 1560

cgctgtgtgc acccgctccg tcaccgtccg gctgcctggc ctgcacaaca gccttgtgaa 1620

actgaagcat ggggcaggag ttgccatgga tggccaggac gtccagctcc ccctcctgaa 1680

aggtgacctc cgcatccagc atacagtgac ggcctccgtg cgcctcagct acggggagga 1740

cctgcagatg gactgggatg gccgcgggag gctgctggtg aagctgtccc ccgtctatgc 1800

cgggaagacc tgcggcctgt gtgggaatta caatggcaac cagggcgacg acttccttac 1860

cccctctggg ctggcggagc cccgggtgga ggacttcggg aacgcctgga agctgcacgg 1920

ggactgccag gacctgcaga agcagcacag cgatccctgc gccctcaacc cgcgcatgac 1980

caggttctcc gaggaggcgt gcgcggtcct gacgtccccc acattcgagg cctgccatcg 2040

tgccgtcagc ccgctgccct acctgcggaa ctgccgctac gacgtgtgct cctgctcgga 2100

cggccgcgag tgcctgtgcg gcgccctggc cagctatgcc gcggcctgcg cggggagagg 2160

cgtgcgcgtc gcgtggcgcg agccaggccg ctgtgagctg aactgcccga aaggccaggt 2220

gtacctgcag tgcgggaccc cctgcaacct gacctgccgc tctctctctt acccggatga 2280

ggaatgcaat gaggcctgcc tggagggctg cttctgcccc ccagggctct acatggatga 2340

gaggggggac tgcgtgccca aggcccagtg cccctgttac tatgacggtg agatcttcca 2400

gccagaagac atcttctcag accatcacac catgtgctac tgtgaggatg gcttcatgca 2460

ctgtaccatg agtggagtcc ccggaagctt gctgcctgac gctgtcctca gcagtcccct 2520

gtctcatcgc agcaaaagga gcctatcctg tcggcccccc atggtcaagc tggtgtgtcc 2580

cgctgacaac ctgcgggctg aagggctcga gtgtaccaaa acgtgccaga actatgacct 2640

ggagtgcatg agcatgggct gtgtctctgg ctgcctctgc cccccgggca tggtccggca 2700

tgagaacaga tgtgtggccc tggaaaggtg tccctgcttc catcagggca aggagtatgc 2760

ccctggagaa acagtgaaga ttggctgcaa cacttgtgtc tgtcgggacc ggaagtggaa 2820

ctgcacagac catgtgtgtg atgccacgtg ctccacgatc ggcatggccc actacctcac 2880

cttcgacggg ctcaaatacc tgttccccgg ggagtgccag tacgttctgg tgcaggatta 2940

ctgcggcagt aaccctggga cctttcggat cctagtgggg aataagggat gcagccaccc 3000

ctcagtgaaa tgcaagaaac gggtcaccat cctggtggag ggaggagaga ttgagctgtt 3060

tgacggggag gtgaatgtga agaggcccat gaaggatgag actcactttg aggtggtgga 3120

gtctggccgg tacatcattc tgctgctggg caaagccctc tccgtggtct gggaccgcca 3180

cctgagcatc tccgtggtcc tgaagcagac ataccaggag aaagtgtgtg gcctgtgtgg 3240

gaattttgat ggcatccaga acaatgacct caccagcagc aacctccaag tggaggaaga 3300

ccctgtggac tttgggaact cctggaaagt gagctcgcag tgtgctgaca ccagaaaagt 3360

gcctctggac tcatcccctg ccacctgcca taacaacatc atgaagcaga cgatggtgga 3420

ttcctcctgt agaatcctta ccagtgacgt cttccaggac tgcaacaagc tggtggaccc 3480

cgagccatat ctggatgtct gcatttacga cacctgctcc tgtgagtcca ttggggactg 3540

cgcctgcttc tgcgacacca ttgctgccta tgcccacgtg tgtgcccagc atggcaaggt 3600

ggtgacctgg aggacggcca cattgtgccc ccagagctgc gaggagagga atctccggga 3660

gaacgggtat gagtgtgagt ggcgctataa cagctgtgca cctgcctgtc aagtcacgtg 3720

tcagcaccct gagccactgg cctgccctgt gcagtgtgtg gagggctgcc atgcccactg 3780

ccctccaggg aaaatcctgg atgagctttt gcagacctgc gttgaccctg aagactgtcc 3840

agtgtgtgag gtggctggcc ggcgttttgc ctcaggaaag aaagtcacct tgaatcccag 3900

tgaccctgag cactgccaga tttgccactg tgatgttgtc aacctcacct gtgaagcctg 3960

ccaggagccg ggaggcctgg tggtgcctcc cacagatgcc ccggtgagcc ccaccactct 4020

gtatgtggag gacatctcgg aaccgccgtt gcacgatttc tactgcagca ggctactgga 4080

cctggtcttc ctgctggatg gctcctccag gctgtccgag gctgagtttg aagtgctgaa 4140

ggcctttgtg gtggacatga tggagcggct gcgcatctcc cagaagtggg tccgcgtggc 4200

cgtggtggag taccacgacg gctcccacgc ctacatcggg ctcaaggacc ggaagcgacc 4260

gtcagagctg cggcgcattg ccagccaggt gaagtatgcg ggcagccagg tggcctccac 4320

cagcgaggtc ttgaaataca cactgttcca aatcttcagc aagatcgacc gccctgaagc 4380

ctcccgcatc accctgctcc tgatggccag ccaggagccc caacggatgt cccggaactt 4440

tgtccgctac gtccagggcc tgaagaagaa gaaggtcatt gtgatcccgg tgggcattgg 4500

gccccatgcc aacctcaagc agatccgcct catcgagaag caggcccctg agaacaaggc 4560

cttcgtgctg agcagtgtgg atgagctgga gcagcaaagg gacgagatcg ttagctacct 4620

ctgtgacctt gcccctgaag cccctcctcc tactctgccc cccgacatgg cacaagtcac 4680

tgtgggcccg gggctcttgg gggtttcgac cctggggccc aagaggaact ccatggttct 4740

ggatgtggcg ttcgtcctgg aaggatcgga caaaattggt gaagccgact tcaacaggag 4800

caaggagttc atggaggagg tgattcagcg gatggatgtg ggccaggaca gcatccacgt 4860

cacggtgctg cagtactcct acatggtgac tgtggagtac cccttcagcg aggcacagtc 4920

caaaggggac atcctgcagc gggtgcgaga gatccgctac cagggcggca acaggaccaa 4980

cactgggctg gccctgcggt acctctctga ccacagcttc ttggtcagcc agggtgaccg 5040

ggagcaggcg cccaacctgg tctacatggt caccggaaat cctgcctctg atgagatcaa 5100

gaggctgcct ggagacatcc aggtggtgcc cattggagtg ggccctaatg ccaacgtgca 5160

ggagctggag aggattggct ggcccaatgc ccctatcctc atccaggact ttgagacgct 5220

cccccgagag gctcctgacc tggtgctgca gaggtgctgc tccggagagg ggctgcagat 5280

ccccaccctc tcccctgcac ctgactgcag ccagcccctg gacgtgatcc ttctcctgga 5340

tggctcctcc agtttcccag cttcttattt tgatgaaatg aagagtttcg ccaaggcttt 5400

catttcaaaa gccaatatag ggcctcgtct cactcaggtg tcagtgctgc agtatggaag 5460

catcaccacc attgacgtgc catggaacgt ggtcccggag aaagcccatt tgctgagcct 5520

tgtggacgtc atgcagcggg agggaggccc cagccaaatc ggggatgcct tgggctttgc 5580

tgtgcgatac ttgacttcag aaatgcatgg tgccaggccg ggagcctcaa aggcggtggt 5640

catcctggtc acggacgtct ctgtggattc agtggatgca gcagctgatg ccgccaggtc 5700

caacagagtg acagtgttcc ctattggaat tggagatcgc tacgatgcag cccagctacg 5760

gatcttggca ggcccagcag gcgactccaa cgtggtgaag ctccagcgaa tcgaagacct 5820

ccctaccatg gtcaccttgg gcaattcctt cctccacaaa ctgtgctctg gatttgttag 5880

gatttgcatg gatgaggatg ggaatgagaa gaggcccggg gacgtctgga ccttgccaga 5940

ccagtgccac accgtgactt gccagccaga tggccagacc ttgctgaaga gtcatcgggt 6000

caactgtgac cgggggctga ggccttcgtg ccctaacagc cagtcccctg ttaaagtgga 6060

agagacctgt ggctgccgct ggacctgccc ctgcgtgtgc acaggcagct ccactcggca 6120

catcgtgacc tttgatgggc agaatttcaa gctgactggc agctgttctt atgtcctatt 6180

tcaaaacaag gagcaggacc tggaggtgat tctccataat ggtgcctgca gccctggagc 6240

aaggcagggc tgcatgaaat ccatcgaggt gaagcacagt gccctctccg tcgagctgca 6300

cagtgacatg gaggtgacgg tgaatgggag actggtctct gttccttacg tgggtgggaa 6360

catggaagtc aacgtttatg gtgccatcat gcatgaggtc agattcaatc accttggtca 6420

catcttcaca ttcactccac aaaacaatga gttccaactg cagctcagcc ccaagacttt 6480

tgcttcaaag acgtatggtc tgtgtgggat ctgtgatgag aacggagcca atgacttcat 6540

gctgagggat ggcacagtca ccacagactg gaaaacactt gttcaggaat ggactgtgca 6600

gcggccaggg cagacgtgcc agcccatcct ggaggagcag tgtcttgtcc ccgacagctc 6660

ccactgccag gtcctcctct taccactgtt tgctgaatgc cacaaggtcc tggctccagc 6720

cacattctat gccatctgcc agcaggacag ttgccaccag gagcaagtgt gtgaggtgat 6780

cgcctcttat gcccacctct gtcggaccaa cggggtctgc gttgactgga ggacacctga 6840

tttctgtgct atgtcatgcc caccatctct ggtctacaac cactgtgagc atggctgtcc 6900

ccggcactgt gatggcaacg tgagctcctg tggggaccat ccctccgaag gctgtttctg 6960

ccctccagat aaagtcatgt tggaaggcag ctgtgtccct gaagaggcct gcactcagtg 7020

cattggtgag gatggagtcc agcaccagtt cctggaagcc tgggtcccgg accaccagcc 7080

ctgtcagatc tgcacatgcc tcagcgggcg gaaggtcaac tgcacaacgc agccctgccc 7140

cacggccaaa gctcccacgt gtggcctgtg tgaagtagcc cgcctccgcc agaatgcaga 7200

ccagtgctgc cccgagtatg agtgtgtgtg tgacccagtg agctgtgacc tgcccccagt 7260

gcctcactgt gaacgtggcc tccagcccac actgaccaac cctggcgagt gcagacccaa 7320

cttcacctgc gcctgcagga aggaggagtg caaaagagtg tccccaccct cctgcccccc 7380

gcaccgtttg cccacccttc ggaagaccca gtgctgtgat gagtatgagt gtgcctgcaa 7440

ctgtgtcaac tccacagtga gctgtcccct tgggtacttg gcctcaactg ccaccaatga 7500

ctgtggctgt accacaacca cctgccttcc cgacaaggtg tgtgtccacc gaagcaccat 7560

ctaccctgtg ggccagttct gggaggaggg ctgcgatgtg tgcacctgca ccgacatgga 7620

ggatgccgtg atgggcctcc gcgtggccca gtgctcccag aagccctgtg aggacagctg 7680

tcggtcgggc ttcacttacg ttctgcatga aggcgagtgc tgtggaaggt gcctgccatc 7740

tgcctgtgag gtggtgactg gctcaccgcg gggggactcc cagtcttcct ggaagagtgt 7800

cggctcccag tgggcctccc cggagaaccc ctgcctcatc aatgagtgtg tccgagtgaa 7860

ggaggaggtc tttatacaac aaaggaacgt ctcctgcccc cagctggagg tccctgtctg 7920

cccctcgggc tttcagctga gctgtaagac ctcagcgtgc tgcccaagct gtcgctgtga 7980

gcgcatggag gcctgcatgc tcaatggcac tgtcattggg cccgggaaga ctgtgatgat 8040

cgatgtgtgc acgacctgcc gctgcatggt gcaggtgggg gtcatctctg gattcaagct 8100

ggagtgcagg aagaccacct gcaacccctg ccccctgggt tacaaggaag aaaataacac 8160

aggtgaatgt tgtgggagat gtttgcctac ggcttgcacc attcagctaa gaggaggaca 8220

gatcatgaca ctgaagcgtg atgagacgct ccaggatggc tgtgatactc acttctgcaa 8280

ggtcaatgag agaggagagt acttctggga gaagagggtc acaggctgcc caccctttga 8340

tgaacacaag tgtctggctg agggaggtaa aattatgaaa attccaggca cctgctgtga 8400

cacatgtgag gagcctgagt gcaacgacat cactgccagg ctgcagtatg tcaaggtggg 8460

aagctgtaag tctgaagtag aggtggatat ccactactgc cagggcaaat gtgccagcaa 8520

agccatgtac tccattgaca tcaacgatgt gcaggaccag tgctcctgct gctctccgac 8580

acggacggag cccatgcagg tggccctgca ctgcaccaat ggctctgttg tgtaccatga 8640

ggttctcaat gccatggagt gcaaatgctc ccccaggaag tgcagcaagt gaggctgctg 8700

cagctgcatg ggtgcctgct gctgcctgcc ttggcctgat ggccaggcca gagtgctgcc 8760

agtcctctgc atgttctgct cttgtgccct tctgagccca caataaaggc tgagctctta 8820

tcttgcaaaa ggc 8833

<210> 2

<211> 2783

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная Последовательность

<220>

<223> препро-ФфВ

<400> 2

Met Ile Pro Ala Arg Phe Ala Gly Val Leu Leu Leu Ile Leu Pro Gly

1. 5 10 15

Thr Leu Cys Ala Glu Gly Thr Arg Gly Arg Ser Ser Thr Ala Arg Cys

20 25 30

Ser Leu Phe Gly Ser Asp Phe Val Asn Thr Phe Asp Gly Ser Met Tyr

35 40 45

Ser Phe Ala Gly Tyr Cys Ser Tyr Leu Leu Ala Gly Gly Cys Gln Lys

50 55 60

Arg Ser Phe Ser Ile Ile Gly Asp Phe Gln Asn Gly Lys Arg Val Ser

65 70 75 80

Leu Ser Val Tyr Leu Gly Glu Phe Phe Asp Ile His Leu Phe Val Asn

85 90 95

Gly Thr Val Thr Gln Gly Asp Gln Arg Val Ser Met Pro Tyr Ala Ser

100 105 110

Lys Leu Glu Thr Glu Ala Gly Tyr Tyr Lys Leu Ser Gly Glu Ala Tyr

115 120 125

Gly Phe Val Ala Arg Ile Asp Gly Ser Gly Asn Phe Gln Val Leu Leu

130 135 140

Ser Asp Arg Tyr Phe Asn Lys Thr Cys Gly Leu Cys Gly Asn Phe Asn

145 150 155 160

Ile Phe Ala Glu Asp Asp Phe Met Thr Gln Glu Gly Thr Leu Thr Ser

165 170 175

Asp Pro Tyr Asp Phe Ala Asn Ser Trp Ala Leu Ser Ser Gly Glu Gln

180 185 190

Trp Cys Glu Arg Pro Ser Ser Ser Cys Asn Ile Ser Ser Gly Glu Met

195 200 205

Gln Lys Gly Leu Trp Glu Gln Cys Gln Leu Leu Lys Ser Thr Ser Val

210 215 220

Phe Ala Arg Cys His Pro Leu Val Asp Pro Glu Pro Phe Cys Glu Lys

225 230 235 240

Thr Leu Cys Glu Cys Ala Gly Gly Leu Glu Cys Ala Cys Pro Ala Leu

245 250 255

Leu Glu Tyr Ala Arg Thr Cys Ala Gln Glu Gly Met Val Leu Tyr Gly

260 265 270

Trp Thr Asp His Ser Ala Cys Ser Pro Val Cys Pro Ala Gly Met Glu

275 280 285

Tyr Arg Gln Cys Val Ser Pro Cys Ala Arg Thr Cys Gln Ser Leu His

290 295 300

Ile Asn Glu Met Cys Gln Glu Arg Cys Val Asp Gly Cys Ser Cys Pro

305 310 315 320

Glu Gly Gln Leu Leu Asp Glu Gly Leu Cys Val Glu Ser Thr Glu Cys

325 330 335

Pro Cys Val His Ser Gly Lys Arg Tyr Pro Pro Gly Thr Ser Leu Ser

340 345 350

Arg Asp Cys Asn Thr Cys Ile Cys Arg Asn Ser Gln Trp Ile Cys Ser

355 360 365

Asn Glu Glu Cys Pro Gly Glu Cys Leu Val Thr Gly Gln Ser His Phe

370 375 380

Lys Ser Phe Asp Asn Arg Tyr Phe Thr Phe Ser Gly Ile Cys Gln Tyr

385 390 395 400

Leu Leu Ala Arg Asp Cys Gln Asp His Ser Phe Ser Ile Val Ile Glu

405 410 415

Thr Val Gln Cys Ala Asp Asp Arg Asp Ala Val Cys Thr Arg Ser Val

420 425 430

Thr Val Arg Leu Pro Gly Leu His Asn Ser Leu Val Lys Leu Lys His

435 440 445

Gly Ala Gly Val Ala Met Asp Gly Gln Asp Val Gln Leu Pro Leu Leu

450 455 460

Lys Gly Asp Leu Arg Ile Gln His Thr Val Thr Ala Ser Val Arg Leu

465 470 475 480

Ser Tyr Gly Glu Asp Leu Gln Met Asp Trp Asp Gly Arg Gly Arg Leu

485 490 495

Leu Val Lys Leu Ser Pro Val Tyr Ala Gly Lys Thr Cys Gly Leu Cys

500 505 510

Gly Asn Tyr Asn Gly Asn Gln Gly Asp Asp Phe Leu Thr Pro Ser Gly

515 520 525

Leu Ala Glu Pro Arg Val Glu Asp Phe Gly Asn Ala Trp Lys Leu His

530 535 540

Gly Asp Cys Gln Asp Leu Gln Lys Gln His Ser Asp Pro Cys Ala Leu

545 550 555 560

Asn Pro Arg Met Thr Arg Phe Ser Glu Glu Ala Cys Ala Val Leu Thr

565 570 575

Ser Pro Thr Phe Glu Ala Cys His Arg Ala Val Ser Pro Leu Pro Tyr

580 585 590

Leu Arg Asn Cys Arg Tyr Asp Val Cys Ser Cys Ser Asp Gly Arg Glu

595 600 605

Cys Leu Cys Gly Ser Tyr Ala Ala Ala Cys Ala Gly Arg Gly Val Arg

610 615 620

Val Ala Trp Arg Glu Pro Gly Arg Cys Glu Leu Asn Cys Pro Lys Gly

625 630 635 640

Gln Val Tyr Leu Gln Cys Gly Thr Pro Cys Asn Leu Thr Cys Arg Ser

645 650 655

Leu Ser Tyr Pro Asp Glu Glu Cys Asn Glu Ala Cys Leu Glu Gly Cys

660 665 670

Phe Cys Pro Pro Met Asp Glu Arg Gly Asp Cys Val Pro Lys Ala Gln

675 680 685

Cys Pro Cys Tyr Tyr Asp Gly Glu Ile Phe Gln Pro Glu Asp Ile Phe

690 695 700

Ser Asp His His Thr Met Cys Tyr Cys Glu Asp Gly Phe Met His Cys

705 710 715 720

Thr Met Ser Gly Val Pro Gly Ser Leu Leu Pro Asp Ala Val Leu Ser

725 730 735

Ser Pro Leu Ser His Arg Ser Lys Arg Ser Leu Ser Cys Arg Pro Pro

740 745 750

Met Val Lys Leu Val Cys Pro Ala Asp Asn Leu Arg Ala Glu Gly Leu

755 760 765

Glu Cys Thr Lys Thr Cys Gln Asn Tyr Asp Leu Glu Cys Met Ser Met

770 775 780

Gly Cys Val Ser Gly Cys Leu Cys Pro Pro Gly Met Val Arg His Glu

785 790 795 800

Asn Arg Cys Glu Arg Cys Pro Cys Phe His Gln Gly Lys Glu Tyr Ala

805 810 815

Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Gly Cys Asn Thr Cys Val Cys Arg Asp

820 825 830

Arg Lys Trp Asn Cys Thr Asp His Val Cys Asp Ala Thr Cys Ser Thr

835 840 845

Ile Gly Met Ala His Tyr Leu Thr Phe Asp Gly Leu Lys Tyr Leu Phe

850 855 860

Pro Gly Glu Cys Gln Tyr Val Leu Val Gln Asp Tyr Cys Gly Ser Asn

865 870 875 880

Pro Gly Thr Phe Arg Ile Leu Val Gly Asn Lys Gly Cys Ser His Pro

885 890 895

Ser Val Lys Cys Lys Lys Arg Val Thr Ile Leu Val Glu Gly Gly Glu

900 905 910

Ile Glu Leu Phe Asp Gly Glu Val Asn Val Lys Arg Pro Met Lys Asp

915 920 925

Glu Thr His Phe Glu Val Val Glu Ser Gly Arg Tyr Ile Ile Leu Leu

930 935 940

Leu Gly Lys Ala Leu Ser Val Val Trp Asp Arg His Leu Ser Ile Ser

945 950 955 960

Val Val Leu Lys Gln Thr Tyr Gln Glu Lys Val Cys Gly Leu Cys Gly

965 970 975

Asn Phe Asp Gly Ile Gln Asn Asn Asp Leu Thr Ser Ser Asn Leu Gln

980 985 990

Val Glu Glu Asp Pro Val Asp Phe Gly Asn Ser Trp Lys Val Ser Ser

995 1000 1005

Gln Cys Ala Asp Thr Arg Lys Val Pro Leu Asp Ser Ser Pro Ala

1010 1015 1020

Thr Cys His Asn Asn Ile Met Lys Gln Thr Met Val Asp Ser Ser

1025 1030 1035

Cys Arg Ile Leu Thr Ser Asp Val Phe Gln Asp Cys Asn Lys Leu

1040 1045 1050

Val Asp Pro Glu Pro Tyr Leu Asp Val Cys Ile Tyr Asp Thr Cys

1055 1060 1065

Ser Cys Glu Ser Ile Gly Asp Cys Ala Cys Phe Cys Asp Thr Ile

1070 1075 1080

Ala Ala Tyr Ala His Val Cys Ala Gln His Gly Lys Val Val Thr

1085 1090 1095

Trp Arg Thr Ala Thr Leu Cys Pro Gln Ser Cys Glu Glu Arg Asn

1100 1105 1110

Leu Arg Glu Asn Gly Tyr Glu Cys Glu Trp Arg Tyr Asn Ser Cys

1115 1120 1125

Ala Pro Ala Cys Gln Val Thr Cys Gln His Pro Glu Pro Leu Ala

1130 1135 1140

Cys Pro Val Gln Cys Val Glu Gly Cys His Ala His Cys Pro Pro

1145 1150 1155

Gly Lys Ile Leu Asp Glu Leu Leu Gln Thr Cys Val Asp Pro Glu

1160 1165 1170

Asp Cys Pro Val Cys Glu Val Ala Gly Arg Arg Phe Ala Ser Gly

1175 1180 1185

Lys Lys Val Thr Leu Asn Pro Ser Asp Pro Glu His Cys Gln Ile

1190 1195 1200

Cys His Cys Asp Val Val Asn Leu Thr Cys Glu Ala Cys Gln Glu

1205 1210 1215

Pro Gly Gly Leu Val Val Pro Pro Thr Asp Ala Pro Val Ser Pro

1220 1225 1230

Thr Thr Leu Tyr Val Glu Asp Ile Ser Glu Pro Pro Leu His Asp

1235 1240 1245

Phe Tyr Cys Ser Arg Leu Leu Asp Leu Val Phe Leu Leu Asp Gly

1250 1255 1260

Ser Ser Arg Leu Ser Glu Ala Glu Phe Glu Val Leu Lys Ala Phe

1265 1270 1275

Val Val Asp Met Met Glu Arg Leu Arg Ile Ser Gln Lys Trp Val

1280 1285 1290

Arg Val Ala Val Val Glu Tyr His Asp Gly Ser His Ala Tyr Ile

1295 1300 1305

Gly Leu Lys Asp Arg Lys Arg Pro Ser Glu Leu Arg Arg Ile Ala

1310 1315 1320

Ser Gln Val Lys Tyr Ala Gly Ser Gln Val Ala Ser Thr Ser Glu

1325 1330 1335

Val Leu Lys Tyr Thr Leu Phe Gln Ile Phe Ser Lys Ile Asp Arg

1340 1345 1350

Pro Glu Ala Ser Arg Ile Thr Leu Leu Leu Met Ala Ser Gln Glu

1355 1360 1365

Pro Gln Arg Met Ser Arg Asn Phe Val Arg Tyr Val Gln Gly Leu

1370 1375 1380

Lys Lys Lys Lys Val Ile Val Ile Pro Val Gly Ile Gly Pro His

1385 1390 1395

Ala Asn Leu Lys Gln Ile Arg Leu Ile Glu Lys Gln Ala Pro Glu

1400 1405 1410

Asn Lys Ala Phe Val Leu Ser Ser Val Asp Glu Leu Glu Gln Gln

1415 1420 1425

Arg Asp Glu Ile Val Ser Tyr Leu Cys Asp Leu Ala Pro Glu Ala

1430 1435 1440

Pro Pro Pro Thr Leu Pro Pro Asp Met Ala Gln Val Thr Val Gly

1445 1450 1455

Pro Gly Leu Leu Gly Val Ser Thr Leu Gly Pro Lys Arg Asn Ser

1460 1465 1470

Met Val Leu Asp Val Ala Phe Val Leu Glu Gly Ser Asp Lys Ile

1475 1480 1485

Gly Glu Ala Asp Phe Asn Arg Ser Lys Glu Phe Met Glu Glu Val

1490 1495 1500

Ile Gln Arg Met Asp Val Gly Gln Asp Ser Ile His Val Thr Val

1505 1510 1515

Leu Gln Tyr Ser Tyr Met Val Thr Val Glu Tyr Pro Phe Ser Glu

1520 1525 1530

Ala Gln Ser Lys Gly Asp Ile Leu Gln Arg Val Arg Glu Ile Arg

1535 1540 1545

Tyr Gln Gly Gly Asn Arg Thr Asn Thr Gly Leu Ala Leu Arg Tyr

1550 1555 1560

Leu Ser Asp His Ser Phe Leu Val Ser Gln Gly Asp Arg Glu Gln

1565 1570 1575

Ala Pro Asn Leu Val Tyr Met Val Thr Gly Asn Pro Ala Ser Asp

1580 1585 1590

Glu Ile Lys Arg Leu Pro Gly Asp Ile Gln Val Val Pro Ile Gly

1595 1600 1605

Val Gly Pro Asn Ala Asn Val Gln Glu Leu Glu Arg Ile Gly Trp

1610 1615 1620

Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ile Gln Asp Phe Glu Thr Leu Pro Arg

1625 1630 1635

Glu Ala Pro Asp Leu Val Leu Gln Arg Cys Cys Ser Gly Glu Gly

1640 1645 1650

Leu Gln Ile Pro Thr Leu Ser Pro Ala Pro Asp Cys Ser Gln Pro

1655 1660 1665

Leu Asp Val Ile Leu Leu Leu Asp Gly Ser Ser Ser Phe Pro Ala

1670 1675 1680

Ser Tyr Phe Asp Glu Met Lys Ser Phe Ala Lys Ala Phe Ile Ser

1685 1690 1695

Lys Ala Asn Ile Gly Pro Arg Leu Thr Gln Val Ser Val Leu Gln

1700 1705 1710

Tyr Gly Ser Ile Thr Thr Ile Asp Val Pro Trp Asn Val Val Pro

1715 1720 1725

Glu Lys Ala His Leu Leu Ser Leu Val Asp Val Met Gln Arg Glu

1730 1735 1740

Gly Gly Pro Ser Gln Ile Gly Asp Ala Leu Gly Phe Ala Val Arg

1745 1750 1755

Tyr Leu Thr Ser Glu Met His Gly Ala Arg Pro Gly Ala Ser Lys

1760 1765 1770

Ala Val Val Ile Leu Val Thr Asp Val Ser Val Asp Ser Val Asp

1775 1780 1785

Ala Ala Ala Asp Ala Ala Arg Ser Asn Arg Val Thr Val Phe Pro

1790 1795 1800

Ile Gly Ile Gly Asp Arg Tyr Asp Ala Ala Gln Leu Arg Ile Leu

1805 1810 1815

Ala Gly Pro Ala Gly Asp Ser Asn Val Val Lys Leu Gln Arg Ile

1820 1825 1830

Glu Asp Leu Pro Thr Met Val Thr Leu Gly Asn Ser Phe Leu His

1835 1840 1845

Lys Leu Cys Ser Gly Phe Val Arg Ile Cys Met Asp Glu Asp Gly

1850 1855 1860

Asn Glu Lys Arg Pro Gly Asp Val Trp Thr Leu Pro Asp Gln Cys

1865 1870 1875

His Thr Val Thr Cys Gln Pro Asp Gly Gln Thr Leu Leu Lys Ser

1880 1885 1890

His Arg Val Asn Cys Asp Arg Gly Leu Arg Pro Ser Cys Pro Asn

1895 1900 1905

Ser Gln Ser Pro Val Lys Val Glu Glu Thr Cys Gly Cys Arg Trp

1910 1915 1920

Thr Cys Pro Cys Val Cys Thr Gly Ser Ser Thr Arg His Ile Val

1925 1930 1935

Thr Phe Asp Gly Gln Asn Phe Lys Leu Thr Gly Ser Cys Ser Tyr

1940 1945 1950

Val Leu Phe Gln Asn Lys Glu Gln Asp Leu Glu Val Ile Leu His

1955 1960 1965

Asn Gly Ala Cys Ser Pro Gly Ala Arg Gln Gly Cys Met Lys Ser

1970 1975 1980

Ile Glu Val Lys His Ser Ala Leu Ser Val Glu Leu His Ser Asp

1985 1990 1995

Met Glu Val Thr Val Asn Gly Arg Leu Val Ser Val Pro Tyr Val

2000 2005 2010

Gly Gly Asn Met Glu Val Asn Val Tyr Gly Ala Ile Met His Glu

2015 2020 2025

Val Arg Phe Asn His Leu Gly His Ile Phe Thr Phe Thr Pro Gln

2030 2035 2040

Asn Asn Glu Phe Gln Leu Gln Leu Ser Pro Lys Thr Phe Ala Ser

2045 2050 2055

Lys Thr Tyr Gly Leu Cys Gly Ile Cys Asp Glu Asn Gly Ala Asn

2060 2065 2070

Asp Phe Met Leu Arg Asp Gly Thr Val Thr Thr Asp Trp Lys Thr

2075 2080 2085

Leu Val Gln Glu Trp Thr Val Gln Arg Pro Gly Gln Thr Cys Gln

2090 2095 2100

Pro Glu Gln Cys Leu Val Pro Asp Ser Ser His Cys Gln Val Leu

2105 2110 2115

Leu Leu Pro Leu Phe Ala Glu Cys His Lys Val Leu Ala Pro Ala

2120 2125 2130

Thr Phe Tyr Ala Ile Cys Gln Gln Asp Ser Cys His Gln Glu Gln

2135 2140 2145

Val Cys Glu Val Ile Ala Ser Tyr Ala His Leu Cys Arg Thr Asn

2150 2155 2160

Gly Val Cys Val Asp Trp Arg Thr Pro Asp Phe Cys Ala Met Ser

2165 2170 2175

Cys Pro Pro Ser Leu Val Tyr Asn His Cys Glu His Gly Cys Pro

2180 2185 2190

Arg His Cys Asp Gly Asn Val Ser Ser Cys Gly Asp His Pro Ser

2195 2200 2205

Glu Gly Cys Phe Cys Pro Pro Asp Lys Val Met Leu Glu Gly Ser

2210 2215 2220

Cys Val Pro Glu Glu Ala Cys Thr Gln Cys Ile Gly Glu Asp Gly

2225 2230 2235

Val Gln His Gln Phe Leu Glu Ala Trp Val Pro Asp His Gln Pro

2240 2245 2250

Cys Gln Ile Cys Thr Cys Leu Ser Gly Arg Lys Val Asn Cys Thr

2255 2260 2265

Thr Gln Pro Cys Pro Thr Ala Lys Ala Pro Thr Cys Gly Leu Cys

2270 2275 2280

Glu Val Ala Arg Leu Arg Gln Asn Ala Asp Gln Cys Cys Pro Glu

2285 2290 2295

Tyr Glu Cys Val Cys Asp Pro Val Ser Cys Asp Leu Pro Pro Val

2300 2305 2310

Pro His Cys Glu Arg Gly Leu Gln Pro Thr Leu Thr Asn Pro Gly

2315 2320 2325

Glu Cys Arg Pro Asn Phe Thr Cys Ala Cys Arg Lys Glu Glu Cys

2330 2335 2340

Lys Arg Val Ser Pro Pro Ser Cys Pro Pro His Arg Leu Pro Thr

2345 2350 2355

Leu Arg Lys Thr Gln Cys Cys Asp Glu Tyr Glu Cys Ala Cys Asn

2360 2365 2370

Cys Val Asn Ser Thr Val Ser Cys Pro Leu Gly Tyr Leu Ala Ser

2375 2380 2385

Thr Ala Thr Asn Asp Cys Gly Cys Thr Thr Thr Thr Cys Leu Pro

2390 2395 2400

Asp Lys Val Cys Val His Arg Ser Thr Ile Tyr Pro Val Gly Gln

2405 2410 2415

Phe Trp Glu Glu Gly Cys Asp Val Cys Thr Cys Thr Asp Met Glu

2420 2425 2430

Asp Ala Val Met Gly Leu Arg Val Ala Gln Cys Ser Gln Lys Pro

2435 2440 2445

Cys Glu Asp Ser Cys Arg Ser Gly Phe Thr Tyr Val Leu His Glu

2450 2455 2460

Gly Glu Cys Cys Gly Arg Cys Leu Pro Ser Ala Cys Glu Val Val

2465 2470 2475

Thr Gly Ser Pro Arg Gly Asp Ser Gln Ser Ser Trp Lys Ser Val

2480 2485 2490

Gly Ser Gln Trp Glu Asn Pro Cys Leu Ile Asn Glu Cys Val Arg

2495 2500 2505

Val Lys Glu Glu Val Phe Ile Gln Gln Arg Asn Val Ser Cys Pro

2510 2515 2520

Gln Leu Glu Val Pro Val Cys Pro Ser Gly Phe Gln Leu Ser Cys

2525 2530 2535

Lys Thr Ser Ala Cys Cys Pro Ser Cys Arg Cys Glu Arg Met Glu

2540 2545 2550

Ala Cys Met Leu Asn Gly Thr Val Ile Gly Pro Gly Lys Thr Val

2555 2560 2565

Met Ile Asp Val Cys Thr Thr Cys Arg Cys Met Val Gln Val Gly

2570 2575 2580

Val Ile Ser Gly Phe Lys Leu Glu Cys Arg Lys Thr Thr Cys Asn

2585 2590 2595

Pro Cys Pro Leu Gly Tyr Lys Glu Glu Asn Asn Thr Gly Glu Cys

2600 2605 2610

Cys Gly Arg Cys Leu Pro Thr Ala Cys Thr Ile Gln Leu Arg Gly

2615 2620 2625

Gly Gln Ile Met Thr Leu Lys Arg Asp Glu Thr Leu Gln Asp Gly

2630 2635 2640

Cys Asp Thr His Phe Cys Lys Val Asn Glu Arg Gly Glu Tyr Phe

2645 2650 2655

Trp Glu Lys Arg Val Thr Gly Cys Pro Pro Phe Asp Glu His Lys

2660 2665 2670

Cys Leu Ala Glu Gly Gly Lys Ile Met Lys Ile Pro Gly Thr Cys

2675 2680 2685

Cys Asp Thr Cys Glu Glu Pro Glu Cys Asn Asp Ile Thr Ala Arg

2690 2695 2700

Leu Gln Tyr Val Lys Val Gly Ser Cys Lys Ser Glu Val Glu Val

2705 2710 2715

Asp Ile His Tyr Cys Gln Gly Lys Cys Ala Ser Lys Ala Met Tyr

2720 2725 2730

Ser Ile Asp Ile Asn Asp Val Gln Asp Gln Cys Ser Cys Cys Ser

2735 2740 2745

Pro Thr Arg Thr Glu Pro Met Gln His Cys Thr Asn Gly Ser Val

2750 2755 2760

Val Tyr His Glu Val Leu Asn Ala Met Glu Cys Lys Cys Ser Pro

2765 2770 2775

Arg Lys Cys Ser Lys

2780

<210> 3

<211> 2050

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная Последовательность

<220>

<223> зрелый ФфВ

<400> 3

Ser Leu Ser Cys Arg Pro Pro Met Val Lys Leu Val Cys Pro Ala Asp

1. 5 10 15

Asn Leu Arg Ala Glu Gly Leu Glu Cys Thr Lys Thr Cys Gln Asn Tyr

20 25 30

Asp Leu Glu Cys Met Ser Met Gly Cys Val Ser Gly Cys Leu Cys Pro

35 40 45

Pro Gly Met Val Arg His Glu Asn Arg Cys Val Ala Leu Glu Arg Cys

50 55 60

Pro Cys Phe His Gln Gly Lys Glu Tyr Ala Pro Gly Glu Thr Val Lys

65 70 75 80

Ile Gly Cys Asn Thr Cys Val Cys Arg Asp Arg Lys Trp Asn Cys Thr

85 90 95

Asp His Val Cys Asp Ala Thr Cys Ser Thr Ile Gly Met Ala His Tyr

100 105 110

Leu Thr Phe Asp Gly Leu Lys Tyr Leu Phe Pro Gly Glu Cys Gln Tyr

115 120 125

Val Leu Val Gln Asp Tyr Cys Gly Ser Asn Pro Gly Thr Phe Arg Ile

130 135 140

Leu Val Gly Asn Lys Gly Cys Ser His Pro Ser Val Lys Cys Lys Lys

145 150 155 160

Arg Val Thr Ile Leu Val Glu Gly Gly Glu Ile Glu Leu Phe Asp Gly

165 170 175

Glu Val Asn Val Lys Arg Pro Met Lys Asp Glu Thr His Phe Glu Val

180 185 190

Val Glu Ser Gly Arg Tyr Ile Ile Leu Leu Leu Gly Lys Ala Leu Ser

195 200 205

Val Val Trp Asp Arg His Leu Ser Ile Ser Val Val Leu Lys Gln Thr

210 215 220

Tyr Gln Glu Lys Val Cys Gly Leu Cys Gly Asn Phe Asp Gly Ile Gln

225 230 235 240

Asn Asn Asp Leu Thr Ser Ser Asn Leu Gln Val Glu Glu Asp Pro Val

245 250 255

Asp Phe Gly Asn Ser Trp Lys Val Ser Ser Gln Cys Ala Asp Thr Arg

260 265 270

Lys Val Pro Leu Asp Ser Ser Pro Ala Thr Cys His Asn Asn Ile Met

275 280 285

Lys Gln Thr Met Val Asp Ser Ser Cys Arg Ile Leu Thr Ser Asp Val

290 295 300

Phe Gln Asp Cys Asn Lys Leu Val Asp Pro Glu Pro Tyr Leu Asp Val

305 310 315 320

Cys Ile Tyr Asp Thr Cys Ser Cys Glu Ser Ile Gly Asp Cys Ala Cys

325 330 335

Phe Cys Asp Thr Ile Ala Ala Tyr Ala His Val Cys Ala Gln His Gly

340 345 350

Lys Val Val Thr Trp Arg Thr Ala Thr Leu Cys Pro Gln Ser Cys Glu

355 360 365

Glu Arg Asn Leu Arg Glu Asn Gly Tyr Glu Cys Glu Trp Arg Tyr Asn

370 375 380

Ser Cys Ala Pro Ala Cys Gln Val Thr Cys Gln His Pro Glu Pro Leu

385 390 395 400

Ala Cys Pro Val Gln Cys Val Glu Gly Cys His Ala His Cys Pro Pro

405 410 415

Gly Lys Ile Leu Asp Glu Leu Leu Gln Thr Cys Val Asp Pro Glu Asp

420 425 430

Cys Pro Val Cys Glu Val Ala Gly Arg Arg Phe Ala Ser Gly Lys Lys

435 440 445

Val Thr Leu Asn Pro Ser Asp Pro Glu His Cys Gln Ile Cys His Cys

450 455 460

Asp Val Val Asn Leu Thr Cys Glu Ala Cys Gln Glu Pro Gly Gly Leu

465 470 475 480

Val Val Pro Pro Thr Asp Ala Pro Val Ser Pro Thr Thr Leu Tyr Val

485 490 495

Glu Asp Ile Ser Glu Pro Pro Leu His Asp Phe Tyr Cys Ser Arg Leu

500 505 510

Leu Asp Leu Val Phe Leu Leu Asp Gly Ser Ser Arg Leu Ser Glu Ala

515 520 525

Glu Phe Glu Val Leu Lys Ala Phe Val Val Asp Met Met Glu Arg Leu

530 535 540

Arg Ile Ser Gln Lys Trp Val Arg Val Ala Val Val Glu Tyr His Asp

545 550 555 560

Gly Ser His Ala Tyr Ile Gly Leu Lys Asp Arg Lys Arg Pro Ser Glu

565 570 575

Leu Arg Arg Ile Ala Ser Gln Val Lys Tyr Ala Gly Ser Gln Val Ala

580 585 590

Ser Thr Ser Glu Val Leu Lys Tyr Thr Leu Phe Gln Ile Phe Ser Lys

595 600 605

Ile Asp Arg Pro Glu Ala Ser Arg Ile Thr Leu Leu Leu Met Ala Ser

610 615 620

Gln Glu Pro Gln Arg Met Ser Arg Asn Phe Val Arg Tyr Val Gln Gly

625 630 635 640

Leu Lys Lys Lys Lys Val Ile Val Ile Pro Val Gly Ile Gly Pro His

645 650 655

Ala Asn Leu Lys Gln Ile Arg Leu Ile Glu Lys Gln Ala Pro Glu Asn

660 665 670

Lys Ala Phe Val Leu Ser Ser Val Asp Glu Leu Glu Gln Gln Arg Asp

675 680 685

Glu Ile Val Ser Tyr Leu Cys Asp Leu Ala Pro Glu Ala Pro Pro Pro

690 695 700

Thr Leu Pro Pro Asp Met Ala Gln Val Thr Val Gly Pro Gly Leu Leu

705 710 715 720

Gly Val Ser Thr Leu Gly Pro Lys Arg Asn Ser Met Val Leu Asp Val

725 730 735

Ala Phe Val Leu Glu Gly Ser Asp Lys Ile Gly Glu Ala Asp Phe Asn

740 745 750

Arg Ser Lys Glu Phe Met Glu Glu Val Ile Gln Arg Met Asp Val Gly

755 760 765

Gln Asp Ser Ile His Val Thr Val Leu Gln Tyr Ser Tyr Met Val Thr

770 775 780

Val Glu Tyr Pro Phe Ser Glu Ala Gln Ser Lys Gly Asp Ile Leu Gln

785 790 795 800

Arg Val Arg Glu Ile Arg Tyr Gln Gly Gly Asn Arg Thr Asn Thr Gly

805 810 815

Leu Ala Leu Arg Tyr Leu Ser Asp His Ser Phe Leu Val Ser Gln Gly

820 825 830

Asp Arg Glu Gln Ala Pro Asn Leu Val Tyr Met Val Thr Gly Asn Pro

835 840 845

Ala Ser Asp Glu Ile Lys Arg Leu Pro Gly Asp Ile Gln Val Val Pro

850 855 860

Ile Gly Val Gly Pro Asn Ala Asn Val Gln Glu Leu Glu Arg Ile Gly

865 870 875 880

Trp Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ile Gln Asp Phe Glu Thr Leu Pro Arg

885 890 895

Glu Ala Pro Asp Leu Val Leu Gln Arg Cys Cys Ser Gly Glu Gly Leu

900 905 910

Gln Ile Pro Thr Leu Ser Pro Ala Pro Asp Cys Ser Gln Pro Leu Asp

915 920 925

Val Ile Leu Leu Leu Asp Gly Ser Ser Ser Phe Pro Ala Ser Tyr Phe

930 935 940

Asp Glu Met Lys Ser Phe Ala Lys Ala Phe Ile Ser Lys Ala Asn Ile

945 950 955 960

Gly Pro Arg Leu Thr Gln Val Ser Val Leu Gln Tyr Gly Ser Ile Thr

965 970 975

Thr Ile Asp Val Pro Trp Asn Val Val Pro Glu Lys Ala His Leu Leu

980 985 990

Ser Leu Val Asp Val Met Gln Arg Glu Gly Gly Pro Ser Gln Ile Gly

995 1000 1005

Asp Ala Leu Gly Phe Ala Val Arg Tyr Leu Thr Ser Glu Met His

1010 1015 1020

Gly Ala Arg Pro Gly Ala Ser Lys Ala Val Val Ile Leu Val Thr

1025 1030 1035

Asp Val Ser Val Asp Ser Val Asp Ala Ala Ala Asp Ala Ala Arg

1040 1045 1050

Ser Asn Arg Val Thr Val Phe Pro Ile Gly Ile Gly Asp Arg Tyr

1055 1060 1065

Asp Ala Ala Gln Leu Arg Ile Leu Ala Gly Pro Ala Gly Asp Ser

1070 1075 1080

Asn Val Val Lys Leu Gln Arg Ile Glu Asp Leu Pro Thr Met Val

1085 1090 1095

Thr Leu Gly Asn Ser Phe Leu His Lys Leu Cys Ser Gly Phe Val

1100 1105 1110

Arg Ile Cys Met Asp Glu Asp Gly Asn Glu Lys Arg Pro Gly Asp

1115 1120 1125

Val Trp Thr Leu Pro Asp Gln Cys His Thr Val Thr Cys Gln Pro

1130 1135 1140

Asp Gly Gln Thr Leu Leu Lys Ser His Arg Val Asn Cys Asp Arg

1145 1150 1155

Gly Leu Arg Pro Ser Cys Pro Asn Ser Gln Ser Pro Val Lys Val

1160 1165 1170

Glu Glu Thr Cys Gly Cys Arg Trp Thr Cys Pro Cys Val Cys Thr

1175 1180 1185

Gly Ser Ser Thr Arg His Ile Val Thr Phe Asp Gly Gln Asn Phe

1190 1195 1200

Lys Leu Thr Gly Ser Cys Ser Tyr Val Leu Phe Gln Asn Lys Glu

1205 1210 1215

Gln Asp Leu Glu Val Ile Leu His Asn Gly Ala Cys Ser Pro Gly

1220 1225 1230

Ala Arg Gln Gly Cys Met Lys Ser Ile Glu Val Lys His Ser Ala

1235 1240 1245

Leu Ser Val Glu Leu His Ser Asp Met Glu Val Thr Val Asn Gly

1250 1255 1260

Arg Leu Val Ser Val Pro Tyr Val Gly Gly Asn Met Glu Val Asn

1265 1270 1275

Val Tyr Gly Ala Ile Met His Glu Val Arg Phe Asn His Leu Gly

1280 1285 1290

His Ile Phe Thr Phe Thr Pro Gln Asn Asn Glu Phe Gln Leu Gln

1295 1300 1305

Leu Ser Pro Lys Thr Phe Ala Ser Lys Thr Tyr Gly Leu Cys Gly

1310 1315 1320

Ile Cys Asp Glu Asn Gly Ala Asn Asp Phe Met Leu Arg Asp Gly

1325 1330 1335

Thr Val Thr Thr Asp Trp Lys Thr Leu Val Gln Glu Trp Thr Val

1340 1345 1350

Gln Arg Pro Gly Gln Thr Cys Gln Pro Ile Leu Glu Glu Gln Cys

1355 1360 1365

Leu Val Pro Asp Ser Ser His Cys Gln Val Leu Leu Leu Pro Leu

1370 1375 1380

Phe Ala Glu Cys His Lys Val Leu Ala Pro Ala Thr Phe Tyr Ala

1385 1390 1395

Ile Cys Gln Gln Asp Ser Cys His Gln Glu Gln Val Cys Glu Val

1400 1405 1410

Ile Ala Ser Tyr Ala His Leu Cys Arg Thr Asn Gly Val Cys Val

1415 1420 1425

Asp Trp Arg Thr Pro Asp Phe Cys Ala Met Ser Cys Pro Pro Ser

1430 1435 1440

Leu Val Tyr Asn His Cys Glu His Gly Cys Pro Arg His Cys Asp

1445 1450 1455

Gly Asn Val Ser Ser Cys Gly Asp His Pro Ser Glu Gly Cys Phe

1460 1465 1470

Cys Pro Pro Asp Lys Val Met Leu Glu Gly Ser Cys Val Pro Glu

1475 1480 1485

Glu Ala Cys Thr Gln Cys Ile Gly Glu Asp Gly Val Gln His Gln

1490 1495 1500

Phe Leu Glu Ala Trp Val Pro Asp His Gln Pro Cys Gln Ile Cys

1505 1510 1515

Thr Cys Leu Ser Gly Arg Lys Val Asn Cys Thr Thr Gln Pro Cys

1520 1525 1530

Pro Thr Ala Lys Ala Pro Thr Cys Gly Leu Cys Glu Val Ala Arg

1535 1540 1545

Leu Arg Gln Asn Ala Asp Gln Cys Cys Pro Glu Tyr Glu Cys Val

1550 1555 1560

Cys Asp Pro Val Ser Cys Asp Leu Pro Pro Val Pro His Cys Glu

1565 1570 1575

Arg Gly Leu Gln Pro Thr Leu Thr Asn Pro Gly Glu Cys Arg Pro

1580 1585 1590

Asn Phe Thr Cys Ala Cys Arg Lys Glu Glu Cys Lys Arg Val Ser

1595 1600 1605

Pro Pro Ser Cys Pro Pro His Arg Leu Pro Thr Leu Arg Lys Thr

1610 1615 1620

Gln Cys Cys Asp Glu Tyr Glu Cys Ala Cys Asn Cys Val Asn Ser

1625 1630 1635

Thr Val Ser Cys Pro Leu Gly Tyr Leu Ala Ser Thr Ala Thr Asn

1640 1645 1650

Asp Cys Gly Cys Thr Thr Thr Thr Cys Leu Pro Asp Lys Val Cys

1655 1660 1665

Val His Arg Ser Thr Ile Tyr Pro Val Gly Gln Phe Trp Glu Glu

1670 1675 1680

Gly Cys Asp Val Cys Thr Cys Thr Asp Met Glu Asp Ala Val Met

1685 1690 1695

Gly Leu Arg Val Ala Gln Cys Ser Gln Lys Pro Cys Glu Asp Ser

1700 1705 1710

Cys Arg Ser Gly Phe Thr Tyr Val Leu His Glu Gly Glu Cys Cys

1715 1720 1725

Gly Arg Cys Leu Pro Ser Ala Cys Glu Val Val Thr Gly Ser Pro

1730 1735 1740

Arg Gly Asp Ser Gln Ser Ser Trp Lys Ser Val Gly Ser Gln Trp

1745 1750 1755

Ala Ser Pro Glu Asn Pro Cys Leu Ile Asn Glu Cys Val Arg Val

1760 1765 1770

Lys Glu Glu Val Phe Ile Gln Gln Arg Asn Val Ser Cys Pro Gln

1775 1780 1785

Leu Glu Val Pro Val Cys Pro Ser Gly Phe Gln Leu Ser Cys Lys

1790 1795 1800

Thr Ser Ala Cys Cys Pro Ser Cys Arg Cys Glu Arg Met Glu Ala

1805 1810 1815

Cys Met Leu Asn Gly Thr Val Ile Gly Pro Gly Lys Thr Val Met

1820 1825 1830

Ile Asp Val Cys Thr Thr Cys Arg Cys Met Val Gln Val Gly Val

1835 1840 1845

Ile Ser Gly Phe Lys Leu Glu Cys Arg Lys Thr Thr Cys Asn Pro

1850 1855 1860

Cys Pro Leu Gly Tyr Lys Glu Glu Asn Asn Thr Gly Glu Cys Cys

1865 1870 1875

Gly Arg Cys Leu Pro Thr Ala Cys Thr Ile Gln Leu Arg Gly Gly

1880 1885 1890

Gln Ile Met Thr Leu Lys Arg Asp Glu Thr Leu Gln Asp Gly Cys

1895 1900 1905

Asp Thr His Phe Cys Lys Val Asn Glu Arg Gly Glu Tyr Phe Trp

1910 1915 1920

Glu Lys Arg Val Thr Gly Cys Pro Pro Phe Asp Glu His Lys Cys

1925 1930 1935

Leu Ala Glu Gly Gly Lys Ile Met Lys Ile Pro Gly Thr Cys Cys

1940 1945 1950

Asp Thr Cys Glu Glu Pro Glu Cys Asn Asp Ile Thr Ala Arg Leu

1955 1960 1965

Gln Tyr Val Lys Val Gly Ser Cys Lys Ser Glu Val Glu Val Asp

1970 1975 1980

Ile His Tyr Cys Gln Gly Lys Cys Ala Ser Lys Ala Met Tyr Ser

1985 1990 1995

Ile Asp Ile Asn Asp Val Gln Asp Gln Cys Ser Cys Cys Ser Pro

2000 2005 2010

Thr Arg Thr Glu Pro Met Gln Val Ala Leu His Cys Thr Asn Gly

2015 2020 2025

Ser Val Val Tyr His Glu Val Leu Asn Ala Met Glu Cys Lys Cys

2030 2035 2040

Ser Pro Arg Lys Cys Ser Lys

2045 2050

<---

Изобретение относится к способу предварительного лечения субъекта с тяжелой формой болезни фон Виллебранда перед хирургическим вмешательством, включающему введение субъекту дозы в диапазоне от около 20 МЕ/кг до около 60 МЕ/кг рФфВ в период от около 12 часов до около 24 часов до хирургического вмешательства, и в котором фактор VIII не вводят вместе с рФфВ до хирургического вмешательства. Изобретение позволяет с высокой степенью эффективности осуществлять предварительное лечение перед хирургическим вмешательством у субъекта с тяжелой формой болезни фон Виллебранда. 20 з.п. ф-лы, 6 ил., 69 табл.

1. Способ предварительного лечения субъекта с тяжелой формой болезни фон Виллебранда (БфВ) перед хирургическим вмешательством, в котором указанное предварительное лечение включает введение 20-60 МЕ/кг рекомбинантного Фактора фон Виллебранда (рФфВ) указанному субъекту в период от 12 часов до 24 часов до хирургического вмешательства, и при этом фактор VIII (ФVIII) не вводится вместе с ФфВ до хирургического вмешательства.

2. Способ по п.1, в котором указанное предварительное лечение дополнительно включает введение 5-90 МЕ/кг рФфВ указанному субъекту за 1 час до указанного хирургического вмешательства.

3. Способ по п.1, в котором ФVIII не вводят после указанного хирургического вмешательства.

4. Способ по п.1, в котором указанное хирургическое вмешательство выбрано из группы, состоящей из обширного хирургического вмешательства, малого хирургического вмешательства или челюстно-лицевого хирургического вмешательства.

5. Способ по п.1, в котором указанному субъекту вводят около 50-60 МЕ/кг рФфВ в период от 12 часов до 24 часов до указанного хирургического вмешательства и указанное хирургическое вмешательство представляет собой малое хирургическое вмешательство.

6. Способ по п.1, в котором указанному субъекту вводят около 35-60 МЕ/кг рФфВ в период от 12 часов до 24 часов до указанного хирургического вмешательства и указанное хирургическое вмешательство представляет собой обширное хирургическое вмешательство.

7. Способ по п.1, в котором указанному субъекту вводят около 20-40 МЕ/кг рФфВ в период от 12 часов до 24 часов до указанного хирургического вмешательства и указанное хирургическое вмешательство представляет собой челюстно-лицевое хирургическое вмешательство.

8. Способ по п.1, в котором указанному субъекту вводят около 5-50 МЕ/кг рФфВ за 1 час до хирургического вмешательства и указанное хирургическое вмешательство представляет собой малое хирургическое вмешательство.

9. Способ по п.1, в котором указанному субъекту вводят около 15-90 МЕ/кг рФфВ за 1 час до указанного хирургического вмешательства и указанное хирургическое вмешательство представляет собой обширное хирургическое вмешательство.

10. Способ по п.1, в котором указанному субъекту вводят около 20-50 МЕ/кг рФфВ за 1 час до указанного хирургического вмешательства и указанное хирургическое вмешательство представляет собой челюстно-лицевое хирургическое вмешательство.

11. Способ по п.1, в котором указанному субъекту вводят около 10-50 МЕ/кг рФфВ во время указанного хирургического вмешательства и указанное хирургическое вмешательство представляет собой челюстно-лицевое хирургическое вмешательство.

12. Способ по п.1, в котором указанному субъекту вводят около 70-220 МЕ/кг рФфВ после указанного хирургического вмешательства.

13. Способ по п.1, в котором указанному субъекту вводят 70-150 МЕ/кг рФфВ после указанного хирургического вмешательства и указанное хирургическое вмешательство представляет собой малое хирургическое вмешательство.

14. Способ по п.1, в котором указанному субъекту вводят 150-220 МЕ/кг рФфВ после указанного хирургического вмешательства и указанное хирургическое вмешательство представляет собой обширное хирургическое вмешательство.

15. Способ по п.1, в котором указанному субъекту вводят около 20-50 МЕ/кг рФфВ после указанного хирургического вмешательства и указанное хирургическое вмешательство представляет собой челюстно-лицевое хирургическое вмешательство.

16. Способ по п.1, в котором указанному субъекту вводят суммарную дозу 100-220 МЕ/кг рФфВ и указанное хирургическое вмешательство представляет собой малое хирургическое вмешательство.

17. Способ по п.1, в котором указанному субъекту вводят суммарную дозу 220-320 МЕ/кг рФфВ и указанное хирургическое вмешательство представляет собой обширное хирургическое вмешательство.

18. Способ по п.1, в котором указанному субъекту вводят суммарную дозу 70-190 МЕ/кг рФфВ и указанное хирургическое вмешательство представляет собой челюстно-лицевое хирургическое вмешательство.

19. Способ по п.1, в котором указанное хирургическое вмешательство представляет собой обширное хирургическое вмешательство и указанное предварительное лечение включает введение по меньшей мере двух приблизительно равных доз рФфВ до хирургического вмешательства.

20. Способ по п.1, в котором указанное хирургическое вмешательство представляет собой малое хирургическое вмешательство и указанное предварительное лечение включает введение по меньшей мере двух доз рФфВ до хирургического вмешательства, при этом первая доза больше, чем вторая доза.

21. Способ по п.1, в котором указанное хирургическое вмешательство представляет собой челюстно-лицевое хирургическое вмешательство и указанное предварительное лечение включает введение по меньшей мере двух приблизительно равных доз рФфВ до хирургического вмешательства.