SYNP198, ПРОМОТОР ДЛЯ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ В ГАНГЛИОНАРНЫХ КЛЕТКАХ СЕТЧАТКИ, ИЗБИРАТЕЛЬНЫХ В ОТНОШЕНИИ НАПРАВЛЕНИЯ Российский патент 2022 года по МПК A61K48/00 C12N15/85 

Описание патента на изобретение RU2766353C2

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение относится к последовательности нуклеиновой кислоты, приводящей к экспрессии генов, в частности, в ганглионарных клетках сетчатки, избирательных в отношении направления.

ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

С целью экспрессии рекомбинантные гены обычно трансфицируют в целевые клетки, популяции клеток или ткани в виде конструкций cDNA в случае активной кассеты экспрессии для обеспечения транскрипции гетерологичного гена. Конструкция ДНК распознается системой клеточной транскрипции в процессе, который включает активность многих действующих в трансположении факторов транскрипции (TF) в регуляторных элементах, действующих в цисположении, в том числе энхансеров, сайленсеров, инсуляторов и промоторов (в данном документе в целом называемых "промоторами").

Промоторы генов включены во все из этих уровней регуляции, выступая в роли детерминанты транскрипции генов посредством интеграции влияний последовательности ДНК, связывания факторов транскрипции и эпигенетических свойств. Они определяют, например, силу экспрессии трансгена, который кодируется плазмидным вектором, а также то, в каком типе или типах клеток указанный трансген будет экспрессирован.

Наиболее распространенные промоторы, используемые для управления экспрессией гетерологичных генов в клетках млекопитающих, представляют собой основной немедленно-ранний промотор цитомегаловируса (CMV) человека и мыши. Они обеспечивают сильную экспрессию и оказались устойчивыми в нескольких типах клеток. Другие вирусные промоторы, такие как немедленно-ранний промотор SV40 и промотор длинного концевого повтора (LTR) вируса саркомы Рауса (RSV), также часто используются в экспрессионных кассетах.

Вместо вирусных промоторов также могут быть использованы клеточные промоторы. Среди известных промоторов имеются таковые из генов домашнего хозяйства, которые кодируют транскрибируемые в большом количестве клеточные транскрипты, такие как бета-актин, фактор элонгации 1-альфа (EF-1-альфа) или убиквитин. По сравнению с вирусными промоторами экспрессия эукариотических генов является более сложной и требует точной координации многих различных факторов.

Один из аспектов, касающихся применения эндогенных регуляторных элементов для экспрессии трансгена, заключается в образовании стабильной mRNA, и такая экспрессия может происходить в нативном окружении клетки-хозяина, где предусмотрены действующие в трансположении факторы транскрипции соответственно. Поскольку экспрессия эукариотических генов контролируется сложной системой действующих в цис- и трансположении регуляторных элементов, то большинство клеточных промоторов испытывают недостаток подробной функциональной характеристики. Части эукариотического промотора обычно расположены непосредственно выше от своей транскрибируемой последовательности и выступают в качестве точки инициации транскрипции. Коровый промотор непосредственно окружает сайт инициации транскрипции (TSS), что является достаточным для распознавания системой транскрипции. Проксимальный промотор представляет собой участок выше корового промотора и содержит TSS и другие характеристики последовательности, необходимые для регуляции транскрипции. Факторы транскрипции действуют специфически в отношении последовательности посредством связывания с регуляторными мотивами в промоторной и энхансерной последовательностях, за счет чего обеспечивается активация ферментов, модифицирующих хроматин и гистоны, которые изменяют нуклеосомную структуру и ее положение, что в конечном итоге обеспечивает инициацию транскрипции. Идентификация функционального промотора главным образом зависит от присутствия соответствующих вышерасположенных или нижерасположенных энхансерных элементов.

Другой важный аспект, касающийся применения эндогенных регуляторных элементов для экспрессии трансгенов, заключается в том, что некоторые промоторы могут действовать специфическим в отношении клетки образом, и будут приводить к экспрессии трансгена в клетках конкретного типа, или в зависимости от промотора, в клетках определенной подгруппы.

Таким образом, одной целью настоящего изобретения является получение новых последовательностей, подходящих для экспрессии рекомбинантных генов в клетках млекопитающих с высокими уровнями экспрессии и специфическим в отношении клетки образом.

Такие последовательности направлены на удовлетворение потребности в данной области техники в специфических в отношении клеток сетчатки промоторах для разработки систем для исследования нейродегенеративных расстройств, восстановления зрения, изыскания новых лекарственных средств, видов терапии опухолей и диагностики нарушений.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Авторы настоящего изобретения объединили эпигенетику, биоинформатику и нейронауку для поиска промоторов, которые при нахождении в глазу управляют экспрессией генов только в ганглионарных клетках сетчатки, чувствительных в отношении направления.

Последовательность нуклеиновой кислоты последовательности по настоящему изобретению представляет собой GGTTCATTGTAAGCCACTGTAGTCGTGGGTGACTCACATCAAACCACCCCTTCGGGAACACGATGCCGACACTGAAACTACATAGGGGAGAGCAAATAAAACTGTCTTCTCTAGTTTGGGGAAATTGGAGCCTGCCTTAGGGAAACAGTGACTAATTTACAGCTAGTGTTTGGAATGAGATCATCTGTCAAAATAAATGTATCTTTACTTCCTTCTTGAGAGGAAGCAAGCTGTTTTATGATGTTCCTTGGAATCCTTAAAAATACAGAGCAACATTTACATTATTAATGATACGCTTTATTGCTGCAGGCTAACTAGGTCCAAAATTGTCCTTCCATAGATGGAGCTGGAGAGTTACACAGAAGTTTGCATATCGAGCTCTTAGGTCTGCATGTACAGCTAATGTACTTGTGGACCCTGTCACAT (SEQ ID NO:1).

Таким образом, в настоящем изобретении предусмотрена выделенная молекула нуклеиновой кислоты, содержащая последовательность нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO:1 или последовательность нуклеиновой кислоты из по меньшей мере 400 п. о., на по меньшей мере 70% идентичную указанной последовательности нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO:1, или состоящая из них, где указанная выделенная молекула нуклеиновой кислоты приводит к специфической экспрессии в ганглиях сетчатки, избирательных в отношении направления, гена, функционально связанного с указанной последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей указанный ген. В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты составляет по меньшей мере 400 п. о., и на по меньшей мере 80% идентична указанной последовательности нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO:1. В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты составляет по меньшей мере 400 п. о., и на по меньшей мере 85% идентична указанной последовательности нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO:1. В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты составляет по меньшей мере 400 п. о., и на по меньшей мере 90% идентична указанной последовательности нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO:1. В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты составляет по меньшей мере 400 п. о., и на по меньшей мере 95% идентична указанной последовательности нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO:1. В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты составляет по меньшей мере 400 п. о., и на по меньшей мере 96% идентична указанной последовательности нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO:1. В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты составляет по меньшей мере 400 п. о., и на по меньшей мере 97% идентична указанной последовательности нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO:1. В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты составляет по меньшей мере 400 п. о., и на по меньшей мере 98% идентична указанной последовательности нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO:1. В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты составляет по меньшей мере 400 п. о., и на по меньшей мере 99% идентична указанной последовательности нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO:1. В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты составляет по меньшей мере 400 п. о., и на 100% идентична указанной последовательности нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO:1.

Выделенная молекула нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению может дополнительно содержать минимальный промотор, например, минимальный промотор SV40, например, минимальный промотор SV40 или таковой, используемый в примерах.

Также предусмотрена выделенная молекула нуклеиновой кислоты, содержащая последовательность, которая гибридизуется в жестких условиях с выделенной молекулой нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, описанной выше.

В настоящем изобретении также предусмотрена кассета экспрессии, содержащая выделенную нуклеиновую кислоту по настоящему изобретению, описанную выше, где указанный промотор функционально связан с по меньшей мере последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей ген, подлежащий экспрессии, в частности, в ганглиях сетчатки, избирательных в отношении направления.

В настоящем изобретении дополнительно предусмотрен вектор, содержащий кассету экспрессии по настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления указанный вектор представляет собой вирусный вектор.

Настоящее изобретение также включает применение нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, кассеты экспрессии по настоящему изобретению или вектора по настоящему изобретению для экспрессии гена в ганглиях сетчатки, избирательных в отношении направления.

В настоящем изобретении дополнительно предусмотрен способ экспрессии гена в ганглиях сетчатки, избирательных в отношении направления, включающий стадии осуществления трансфекции выделенной клетки, линии клеток или популяции клеток (например, ткани) с помощью кассеты экспрессии по настоящему изобретению, где ген, подлежащий экспрессии, будет экспрессироваться выделенной клеткой, линией клеток или популяцией клеток, если указанная клетка относится к ганглиям сетчатки, избирательным в отношении направления, или указанные клетки образуют их. В некоторых вариантах осуществления выделенная клетка, линия клеток или популяция клеток являются человеческими.

В настоящем изобретении также предусмотрена выделенная клетка, содержащая кассету экспрессии по настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления кассета экспрессии или вектор стабильно интегрированы в геном указанной клетки.

Типичный ген, который может быть функционально связан с промотором по настоящему изобретению, представляет собой ген, кодирующий галородопсин или канальный родопсин.

Кроме того, в настоящем изобретении предусмотрен набор для экспрессии гена в ганглиях сетчатки, избирательных в отношении направления, при этом набор содержит выделенную молекулу нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

Фигура 1. Изображения экспрессии EGFP, выполненные с помощью лазерного сканирующего конфокального микроскопа, из промотора с SEQ ID NO:1, через 3 недели после субретинальной инъекции AAV-synP198-ChR2-EGFP в глаза взрослых мышей C57BL/6 в виде боковой проекции и вида сверху в фоторецепторном слое. Можно наблюдать индуцированную экспрессию в ганглионарных клетках, избирательных в отношении экспрессии (DS). Зеленый цвет=EGFP, управляемый SEQ ID NO:1, красный цвет=ChAT (холинацетилтрансфераза), белый цвет=Хехст.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Авторы настоящего изобретения объединили эпигенетику, биоинформатику и нейронауку для поиска промоторов, которые при нахождении в глазу управляют экспрессией генов только в ганглионарных клетках сетчатки, чувствительных в отношении направления.

Последовательность нуклеиновой кислоты последовательности по настоящему изобретению представляет собой GGTTCATTGTAAGCCACTGTAGTCGTGGGTGACTCACATCAAACCACCCCTTCGGGAACACGATGCCGACACTGAAACTACATAGGGGAGAGCAAATAAAACTGTCTTCTCTAGTTTGGGGAAATTGGAGCCTGCCTTAGGGAAACAGTGACTAATTTACAGCTAGTGTTTGGAATGAGATCATCTGTCAAAATAAATGTATCTTTACTTCCTTCTTGAGAGGAAGCAAGCTGTTTTATGATGTTCCTTGGAATCCTTAAAAATACAGAGCAACATTTACATTATTAATGATACGCTTTATTGCTGCAGGCTAACTAGGTCCAAAATTGTCCTTCCATAGATGGAGCTGGAGAGTTACACAGAAGTTTGCATATCGAGCTCTTAGGTCTGCATGTACAGCTAATGTACTTGTGGACCCTGTCACAT (SEQ ID NO:1).

Таким образом, в настоящем изобретении предусмотрена выделенная молекула нуклеиновой кислоты, содержащая последовательность нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO:1 или последовательность нуклеиновой кислоты из по меньшей мере 400 п. о., на по меньшей мере 70% идентичную указанной последовательности нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO:1, или состоящая из них, где указанная выделенная молекула нуклеиновой кислоты приводит к специфической экспрессии в ганглиях сетчатки, избирательных в отношении направления, гена, функционально связанного с указанной последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей указанный ген. В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты составляет по меньшей мере 400 п. о., и на по меньшей мере 80% идентична указанной последовательности нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO:1. В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты составляет по меньшей мере 400 п. о., и на по меньшей мере 85% идентична указанной последовательности нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO:1. В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты составляет по меньшей мере 400 п. о., и на по меньшей мере 90% идентична указанной последовательности нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO:1. В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты составляет по меньшей мере 400 п. о., и на по меньшей мере 95% идентична указанной последовательности нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO:1. В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты составляет по меньшей мере 400 п. о., и на по меньшей мере 96% идентична указанной последовательности нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO:1. В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты составляет по меньшей мере 400 п. о., и на по меньшей мере 97% идентична указанной последовательности нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO:1. В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты составляет по меньшей мере 400 п. о., и на по меньшей мере 98% идентична указанной последовательности нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO:1. В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты составляет по меньшей мере 400 п. о., и на по меньшей мере 99% идентична указанной последовательности нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO:1. В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты составляет по меньшей мере 400 п. о., и на 100% идентична указанной последовательности нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO:1.

Выделенная молекула нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению может дополнительно содержать минимальный промотор, например, минимальный промотор SV40, например, минимальный промотор SV40 или таковой, используемый в примерах.

Также предусмотрена выделенная молекула нуклеиновой кислоты, содержащая последовательность, которая гибридизуется в жестких условиях с выделенной молекулой нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, описанной выше.

В настоящем изобретении также предусмотрена кассета экспрессии, содержащая выделенную нуклеиновую кислоту по настоящему изобретению, описанную выше, где указанный промотор функционально связан с по меньшей мере последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей ген, подлежащий экспрессии, в частности, в ганглиях сетчатки, избирательных в отношении направления.

В настоящем изобретении дополнительно предусмотрен вектор, содержащий кассету экспрессии по настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления указанный вектор представляет собой вирусный вектор.

Настоящее изобретение также включает применение нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, кассеты экспрессии по настоящему изобретению или вектора по настоящему изобретению для экспрессии гена в ганглиях сетчатки, избирательных в отношении направления.

В настоящем изобретении дополнительно предусмотрен способ экспрессии гена в ганглиях сетчатки, избирательных в отношении направления, включающий стадии осуществления трансфекции выделенной клетки, линии клеток или популяции клеток (например, ткани) с помощью кассеты экспрессии по настоящему изобретению, где ген, подлежащий экспрессии, будет экспрессироваться выделенной клеткой, линией клеток или популяцией клеток, если указанная клетка относится к ганглиям сетчатки, избирательным в отношении направления, или указанные клетки образуют их. В некоторых вариантах осуществления выделенная клетка, линия клеток или популяция клеток являются человеческими.

В настоящем изобретении также предусмотрена выделенная клетка, содержащая кассету экспрессии по настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления кассета экспрессии или вектор стабильно интегрированы в геном указанной клетки.

Типичный ген, который может быть функционально связан с промотором по настоящему изобретению, представляет собой ген, кодирующий галородопсин или канальный родопсин.

Кроме того, в настоящем изобретении предусмотрен набор для экспрессии гена в ганглиях сетчатки, избирательных в отношении направления, при этом набор содержит выделенную молекулу нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению.

Используемый в данном документе термин "промотор" относится к любым действующим в цисположении регуляторным элементам, в том числе энхансерам, сайленсерам, инсуляторам и промоторам. Промотор представляет собой участок ДНК, который, как правило, расположен выше (в направлении 5'-области) гена, который необходимо транскрибировать. Промотор обеспечивает соответствующую активацию или репрессию гена, контроль которого он обеспечивает. В контексте настоящего изобретения промоторы приводят к специфической экспрессии генов, функционально связанных с ними, в ганглиях сетчатки, избирательных в отношении направления. "Специфическая экспрессия", также называемая "экспрессией только в определенном типе клетки" означает, что по меньшей мере более 75% клеток, экспрессирующих ген, представляющий интерес, принадлежат к определенному типу, т. е. в данном случае ганглиям сетчатки, избирательным в отношении направления.

Кассеты экспрессии в типичном случае вводят в вектор, который облегчает вхождение кассеты экспрессии в клетку-хозяина и поддержание кассеты экспрессии в клетке-хозяине. Такие векторы широко используются и хорошо известны специалистам в данной области техники. Такие многочисленные векторы являются коммерчески доступными, например, от Invitrogen, Stratagene, Clontech и т. д., и описаны в многочисленных руководствах, таких как Ausubel, Guthrie, Strathem или Berger, все приведены выше. Такие векторы в типичном случае включают промоторы, сигналы полиаденилирования и т. д., в сочетании с сайтами множественного клонирования, а также дополнительные элементы, такие как точки начала репликации, селектируемые маркерные гены (например, LEU2, URA3, TRP 1, HIS3, GFP), центромерные последовательности и т. д.

Вирусные векторы, например, AAV, PRV или лентивирус, являются подходящими для нацеливания на гены и их доставки в ганглии сетчатки, избирательные в отношении направления, с помощью промотора по настоящему изобретению.

Выход клеток сетчатки может быть измерен с помощью электрического способа, такого как мультиэлектродная матрица или пэтч-кламп, или с помощью визуального способа, такого как детектирование флуоресценции.

Способы с использованием последовательности нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению могут быть использованы для идентификации терапевтических средств для лечения неврологического расстройства или нарушения сетчатки, включающего ганглии сетчатки, избирательные в отношении направления, при этом указанный способ включает стадии приведения в контакт тестируемого соединения с ганглиями сетчатки, избирательными в отношении направления, экспрессирующими один или несколько трансгенов под контролем промотора по настоящему изобретению, и сравнения по меньшей мере одного выхода ганглиев сетчатки, избирательных в отношении направления, полученного в присутствии указанного тестируемого соединения, с таким же выходом, полученным в отсутствие указанного тестируемого соединения.

Кроме того, способы с использованием промоторов по настоящему изобретению также могут быть использованы для исследования восстановления зрения in vitro, при этом указанный способ включает стадии приведения в контакт ганглиев сетчатки, избирательных в отношении направления, экспрессирующих один или несколько трансгенов под контролем промотора по настоящему изобретению, со средством, и сравнения по меньшей мере одного выхода, полученного после приведения в контакт указанного средства с тем же выходом, полученным до указанного приведения в контакт с указанным средством.

Канальные родопсины представляют собой подсемейство белков опсинов, которые функционируют в качестве регулируемых светом ионных каналов. Они выступают в качестве сенсорных фоторецепторов в одноклеточных зеленых водорослях, контролируя фототаксис, т. е. движение в ответ на свет. При экспрессии в клетках других организмов они способны использовать свет для контроля внутриклеточной кислотности, поступления кальция, электрической возбудимости и других клеточных процессов. В настоящее время известны по меньшей мере три "природных" канальных родопсина: канальный родопсин 1 (ChR1), канальный родопсин 2 (ChR2) и канальный родопсин вольвокса (VChR1). Кроме того, также существуют некоторые модифицированные/улучшенные варианты этих белков. Все известные канальные родопсины представляют собой неспецифические катионные каналы, проводящие ионы H+, Na+, K+ и Ca2+.

Галородопсин представляет собой управляемый светом ионный насос, специфический в отношении ионов хлора, и встречается в филогенетически древних "бактериях" (археях), известных как галобактерии. Он представляет собой белок из семи трансмембранных фрагментов семейства ретинилиденовых белков, гомологичный управляемому светом протонному насосу бактериородопсину и схожий по третичной структуре (но не по первичной структуре последовательности) родопсинам позвоночных, пигментам, которые воспринимают свет в сетчатке. Галородопсин также характеризуется сходством последовательности с канальным родопсином, управляемым светом ионным каналом. Галородопсин содержит необходимое подлежащее изомеризации на свету производное витамина А полностью-транс-ретиналь. Галородопсин представляет собой один из нескольких мембранных белков, кристаллическая структура которого является известной. Изоформы галородопсина могут встречаться у многих видов галобактерий, в том числе H. salinarum и N. pharaonis. Во многих текущих исследованиях изучаются эти различия и их применение в целях анализа фотоциклических и насосных свойств. После бактериородопсина галородопсин, по-видимому, является наиболее изученным опсином I типа (микробным). Максимальное поглощение галородопсинового комплекса сетчатки составляет приблизительно 570 нм. В последнее время галородопсин стал инструментом в оптогенетике. Также как и активируемый синим светом ионный канал канальный родопсин 2 обнаруживает способность к активации возбудимых клеток (таких как нейроны, мышечные клетки, клетки поджелудочной железы и иммунные клетки) короткими импульсами синего света, галородопсин обнаруживает способность заглушать возбудимые клетки короткими импульсами желтого света. Таким образом, галородопсин и канальный родопсин совместно обеспечивают многоцветную световую активацию, заглушение и десинхронизацию нервной активности, создавая высокоэффективную панель инструментов для нейроинженерии.

В некоторых вариантах осуществления промотор представляет собой часть вектора, нацеливающегося на сетчатку, при этом указанный вектор экспрессирует по меньшей мере один репортерный ген, который поддается выявлению в живых ганглиях сетчатки, избирательных в отношении направления.

Подходящие вирусные векторы для настоящего изобретения широко известны из уровня техники. Например, AAV, PRV или лентивирус, являются подходящими для нацеливания на гены и их доставки в ганглии сетчатки, избирательные в отношении направления.

При работе с выделенной сетчаткой оптимальная вирусная доставка в случае клеток сетчатки может быть достигнута посредством заключения ганглионарных клеток сбоку вниз, таким образом, чтобы фоторецепторная сторона сетчатки находилась под воздействием и могла, таким образом, подлежать более эффективной трансфекции. Другая методика представляет собой разрезание, например, с помощью лезвия бритвы, внутренней пограничной мембраны сетчатки, таким образом, чтобы доставляемые вирусы могли проникать через внутренние мембраны. Дополнительным способом является заключение сетчатки в агар, разрезание указанной сетчатки и применение доставляемых вирусов со стороны разреза.

Выход трансфицированных клеток может быть измерен с помощью хорошо известных способов, например, электрического способа, такого как мультиэлектродная матрица или пэтч-кламп, или с помощью визуального способа, такого как детектирование флуоресценции. В некоторых случаях внутренняя пограничная мембрана удаляется с помощью микрохирургического вмешательства во внутреннюю пограничную мембрану. В других случаях учет достигается с помощью срезов, осуществляемых в отношении внутренней пограничной мембраны.

Любой источник клеток сетчатки может быть использован для настоящего изобретения. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения клетки сетчатки происходят из человеческой сетчатки или находятся в ней. В других вариантах осуществления сетчатка происходит от животного, например, имеет бычье происхождение или происходит от грызуна. Человеческая сетчатка может быть легко получена из банков роговиц, при этом указанные сетчатки обычно утилизируют после иссечения роговицы. Сетчатка взрослого человека имеет большую поверхность (приблизительно 1100 мм2) и, таким образом, легко может быть разделена на ряд экспериментальных подобластей. Кроме того, сетчатки также могут быть использованы в качестве утонченной модели синаптической передачи, поскольку сетчатка имеет синапсы, которые являются идентичными остальной части головного мозга.

Используемый в данном документе термин "животное" используется в данном документе для включения всех животных. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения отличное от человека животное представляет собой позвоночное. Примерами животных являются человек, мыши, крысы, коровы, свиньи, лошади, куры, утки, гуси, кошки, собаки и т. д. Термин "животное" также включает отдельное животное на всех стадиях развития, в том числе эмбриональных и зародышевых стадиях. "Генетически модифицированное животное" представляет собой любое животное, содержащее одну или несколько клеток, несущих генетическую информацию, измененную или полученную, прямо или косвенно, с помощью тщательной генетической манипуляции на субклеточном уровне, например, с помощью целевой рекомбинации, микроинъекции или инфицирования рекомбинантным вирусом. Термин "генетически модифицированное животное" не предусматривает включение классического кроссбридинга или оплодотворения in vitro, а скорее означает включение животных, у которых одна или несколько клеток изменены с помощью рекомбинантной молекулы ДНК или получают таковую. Рекомбинантную молекулу ДНК можно специфически нацеливать на определенный генетический локус, можно случайно интегрировать в хромосому, или она может представлять собой внехромосомно реплицируемую ДНК. Термин "генетически модифицированное животное зародышевой линии" относится к генетически модифицированному животному, у которого генетическое изменение или генетическая информация были введены в клетки зародышевой линии, за счет чего обеспечивается придание способности переносить генетическую информацию своему потомству. Если такое потомство в действительности обладает частью или всем из такого изменения или генетической информации, то они также являются генетически модифицированными животными.

Изменение или генетическая информация могут быть чужеродными в отношении вида животного, к которому принадлежит реципиент, или чужеродными только в отношении определенного отдельного реципиента, или могут представлять собой генетическую информацию, которой реципиент уже обладает. В последнем случае измененный или введенный ген может экспрессироваться отличным образом от нативного гена или не экспрессироваться вообще.

Гены, используемые для изменения целевого гена, могут быть получены с помощью широкого разнообразия методик, которые включают без ограничения выделение из геномных источников, получение cDNA из выделенных матриц mRNA, прямой синтез или их комбинацию.

Типом целевых клеток для введения трансгенов являются клетки ES. Клетки ES могут быть получены из предымплантационных эмбрионов, культивируемых in vitro и слитых с эмбрионами (Evans et al. (1981), Nature 292:154-156; Bradley et al. (1984), Nature 309:255-258; Gossler et al. (1986), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:9065-9069; Robertson et al. (1986), Nature 322:445-448; Wood et al. (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:4582- 4584). Трансгены могут быть эффективно введены в клетки ES с помощью стандартных методик, таких как траснфекция ДНК с использованием электропорации или с помощью опосредованной ретровирусами трансдукции. Полученные в результате трансформированные клетки ES затем можно комбинировать с морулами посредством агрегации или инъецировать в бластоцисты от отличного от человека животного. Введенные клетки ES затем колонизируют эмбрион и содействуют образованию зародышевой линии полученного в результате химерного животного (Jaenisch (1988), Science 240:1468-1474). Применение нацеливающихся на гены клеток ES в получении генетически модифицированных мышей с нацеливанием на гены было описано в 1987 г. (Thomas et al. (1987), Cell 51:503-512) и рассматривается в других документах (Frohman et al. (1989), Cell 56:145-147; Capecchi (1989), Trends in Genet. 5:70-76; Baribault et al. (1989), Mol. Biol. Med. 6:481-492; Wagner (1990), EMBO J. 9:3025-3032; Bradley et al. (1992), Bio/Technology 10:534-539).

Доступны методики для инактивации или изменения любого генетического участка на любую необходимую мутацию посредством использования целевой гомологической рекомбинации с введением специфических изменений в аллели хромосом.

Используемый в данном документе "целевой ген" представляет собой последовательность ДНК, вводимую в зародышевую линию отличного от человека животного с помощью вмешательства человека, в том числе без ограничения с помощью способов по настоящему изобретению, описанных в данном документе. Целевые гены по настоящему изобретению включают последовательности ДНК, которые разработаны для специфического изменения когнатных эндогенных аллелей.

В настоящем изобретении "выделенный" относится к материалу, удаленному из своего исходного окружения (например, природного окружения, если он встречается в природе), и, таким образом, измененному "в результате воздействия человека" по отношению к своему природному состоянию. Например, выделенный полинуклеотид может быть частью вектора или композиции, или может содержаться в клетке и по-прежнему быть "выделенным", поскольку этот вектор, композиция или определенная клетка не являются исходным окружением полинуклеотида. Термин "выделенный" не относится к геномным библиотекам или библиотекам cDNA, суммарным препаратам цельных клеток или препаратам mRNA, препаратам геномной ДНК (в том числе таковым, отделенным с помощью электрофореза и перенесенным на блоты), препаратам геномной ДНК, фрагментированной в результате гидродинамического сдвига, цельных клеток, или другим композициям, в которых в соответствии с данным уровнем техники не показаны отличительные признаки полинуклеотида/последовательностей по настоящему изобретению. Дополнительные примеры выделенных молекул ДНК включают рекомбинантные молекулы ДНК, поддерживаемые в гетерологичных клетках-хозяевах, или очищенные (частично или полностью) молекулы ДНК в растворе. Выделенные молекулы РНК включают транскрипты РНК in vivo или in vitro молекул ДНК по настоящему изобретению. Однако нуклеиновая кислота, содержащаяся в клоне, который является членом библиотеки (например, геномной библиотеки или библиотеки cDNA), который не был выделен из других членов библиотеки (например, в форме гомогенного раствора, содержащего клон и другие члены библиотеки), или хромосома, удаленная из клетки или клеточного лизата (например, "хромосомного препарата", как в кариотипе), или препарат случайно фрагментированной в результате гидродинамического сдвига геномной ДНК или препарат геномной ДНК, разрезанной с помощью одного или нескольких рестрикционных ферментов, не является "выделенным" для целей настоящего изобретения. Как обсуждается далее в данном документе, выделенные молекулы нуклеиновой кислоты в соответствии с настоящим изобретением, могут быть получены природным путем, рекомбинантным путем или синтетическим путем.

"Полинуклеотиды" могут состоять из одно- или двунитевой ДНК, при этом ДНК представляет собой смесь одно и двунитевых участков, одно- и двунитевых РНК, при этом РНК представляет собой смесь одно- и двунитевых участков, гибридных молекул, содержащих ДНК и РНК, которые могут быть однонитевыми или в более типичном случае двунитевыми, или смесью однонитевых и двунитевых участков. Кроме того, полинуклеотиды могут состоять из трехнитевых участков, содержащих РНК или ДНК, или как РНК, так и ДНК. Полинуклеотиды могут также содержать одну или несколько модифицированных оснований или остовов ДНК или РНК, модифицированных для стабильности или для других целей. "Модифицированные" основания включают, например, тритилированные основания и необычные основания, такие как инозин. Ряд модификаций может быть выполнен в отношении ДНК и РНК; таким образом, "полинуклеотид" охватывает химически, ферментативно или метаболически модифицированные формы.

Выражение "полинуклеотид, кодирующий полипептид" охватывает полинуклеотид, который содержит только одну кодирующую последовательность для полипептида, а также полинуклеотид, который содержит дополнительную кодирующую и/или некодирующую последовательность.

Выражение "жесткие условия гибридизации" относится к инкубации в течение ночи при 42 градусах C в растворе, содержащем 50% формамида, 5x SSC (750 мM NaCl, 75 мM тринатрийцитрата), 50 мМ натрийфосфата (pH 7,6), 5x раствора Денхардта, 10% декстрансульфата и 20 мкг/мл денатурированной фрагментированной в результате гидродинамического сдвига ДНК из молок лососевых, с последующим промыванием фильтров в 0,1x SSC при приблизительно 50 градусах C. Изменения жесткости гибридизации и детектирование сигнала в основном осуществляются в результате манипуляции с концентрацией формамида (более низкие проценты формамида приводят в результате к пониженной жесткости); солевыми условиями или температурой. Например, умеренно высокие условия жесткости включают инкубацию в течение ночи при 37 градусах C в растворе, содержащем 6X SSPE (20X SSPE=3 M NaCl; 0,2 M NaH2PO4; 0,02 M EDTA, pH 7,4), 0,5% SDS, 30% формамида, 100 мкг/мл блокирующей ДНК из молок лососевых; с последующим промыванием при 50 градусах C 1XSSPE, 0,1% SDS. Кроме того, для достижения даже более низкой жесткости промывания, осуществляемые в соответствии с жесткой гибридизацией, могут быть выполнены при более высоких концентрациях солей (например, 5X SSC). Вариации приведенных выше условий могут осуществляться путем включения и/или замены альтернативных блокирующих реагентов для подавления фона в экспериментах по гибридизации. Типичные блокирующие реагенты включают раствор Денхардта, BLOTTO, гепарин, денатурированную ДНК спермы лосося и коммерчески доступные авторские составы. Включение специфических блокирующих реагентов может требовать модификации условий гибридизации, описанных выше, в связи с проблемами со совместимостью.

Термины "фрагмент", "производное" и "аналог" при обозначении полипептидов означает полипептиды, которые сохраняют по сути ту же биологическую функцию или активность, что и полипептиды. Аналог включает пробелок, который может быть активирован посредством расщепления части пробелка с образованием активного зрелого полипептида.

Термин "ген" означает сегмент ДНК, участвующий в образовании полипептидной цепи; он включает участки, предшествующие кодирующему участку "лидерной и трейлерной последовательности", и следующие за таковым, а также промежуточные последовательности (интроны) между отдельными кодирующими сегментами (экзонами).

Полипептиды могут состоять из аминокислот, соединенных друг с другом пептидными связями или модифицированными пептидными связями, т. е. пептидными изостерами, и могут содержать аминокислоты, отличные от аминокислот, кодируемых 20 генами. Полипептиды могут быть модифицированы как посредством природных процессов, таких как посттрансляционный процессинг, так и посредством методик химической модификации, которые хорошо известны из уровня техники. Такие модификации хорошо описаны в основной документации и более подробных монографиях, а также в многочисленной научной литературе. Модификации могут происходить в любом месте в полипептиде, в том числе пептидном остове, боковых цепях аминокислоты и амино- или карбоксильных концах. Будет понятно, что одинаковый тип модификации может присутствовать в одинаковой или различной степенях в нескольких сайтах в определенном полипептиде. Кроме того, определенный полипептид может содержать много типов модификаций. Полипептиды могут быть разветвленными, например, посредством убиквитирования, и они могут быть циклическими, с разветвлением или без такового. Циклические, разветвленные или разветвленные циклические полипептиды могут образовываться в результате посттрансляционных природных процессов или могут быть получены посредством синтетических способов. Модификации включают без ограничения ацетилирование, ацилирование, биотинилирование, ADP-рибозилирование, амидирование, ковалентное присоединение флавина, ковалентное присоединение фрагмента гема, ковалентное присоединение нуклеотида или производного нуклеотида, ковалентное присоединение липида или производного липида, ковалентное присоединение фосфотидилинозитола, перекрестное сшивание, циклизацию, дериватизацию с помощью известных защитных/блокирующих групп, образование дисульфидных связей, деметилирование, образование ковалентных перекрестных связей, образование цистеина, образование пироглутамата, формилирование, гамма-карбоксилирование, гликозилирование, образование GPI-якоря, гидроксилирование, йодирование, связывание с молекулой антитела или другим клеточным лигандом, метилирование, ацилирование остатком миристиновой кислоты, окисление, пегилирование, протеолитический процессинг (например, расщепление), фосфорилирование, пренилирование, рацемизацию, селеноилирование, сульфатизацию, опосредованное транспортной РНК добавление аминокислот к белкам, например, аргинилирование и убиквитинирование. (См., например, PROTEINS-STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES, 2nd Ed., T. E. Creighton, W. H. Freeman and Company, New York (1993); POSTTRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OF PROTEINS, B. C. Johnson, Ed., Academic Press, New York, pgs. I-12 (1983); Seifter et al., Meth Enzymol 182:626-646 (1990); Rattan et al., Ann NY Acad Sci 663:48-62 (1992).)

Полипептидный фрагмент, "обладающий биологической активностью", относится к полипептидам, проявляющим активность, схожую, но необязательно идентичную активности исходного полипептида, в том числе зрелых форм, измеренной в определенном биологическом анализе, с зависимостью от дозы или без таковой. В случае, если существует зависимость от дозы, она не должна быть идентичной таковой полипептида, а скорее по сути быть схожей зависимости от дозы определенной активности по сравнению с исходным полипептидом (т. е. кандидатный полипептид будет характеризоваться большей активностью и не более чем в приблизительно 25 раз меньше, и в некоторых вариантах осуществления не более чем в приблизительно три раза меньшей активностью по отношению к исходному полипептиду.)

Видовые гомологи могут быть выделены и идентифицированы посредством получения подходящих зондов или праймеров из последовательностей, предусмотренных в данном документе, и скрининга подходящего источника нуклеиновой кислоты для необходимого гомолога.

"Вариант" относится к полинуклеотиду или полипептиду, отличающемуся от исходного полинуклеотида или полипептида, однако сохраняющему его необходимые свойства. Как правило, варианты в целом являются очень сходными, и во многих участках идентичны исходному полинуклеотиду или полипептиду.

На практике то, являются ли любые определенные молекула нуклеиновой кислоты или полипептид на по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичными нуклеотидной последовательности по настоящему изобретению, может быть определено с помощью известных компьютерных программ. Предпочтительный способ определения наибольшего общего соответствия между искомой последовательностью (последовательностью по настоящему изобретению) и исследуемой последовательностью, также называемый глобальным выравниванием последовательностей, может быть определен с помощью компьютерной программы FASTDB на основе алгоритма Brutlag et al. (Comp. App. Blosci. (1990) 6:237-245). При выравнивании последовательностей как искомая, так и исследуемая последовательности являются последовательностями ДНК. Последовательность РНК можно сравнивать посредством превращения U в T. Результатом указанного глобального выравнивания последовательностей является процент идентичности. Предпочтительные параметры, используемые в выравнивании FASTDB последовательностей ДНК для расчета процента идентичности, представляют собой матрица=одинарная, k-кортеж=4, штраф за неправильное спаривание=1, штраф за связывание=30, длина группы рандомизации=0, граничный балл=l, штраф за гэп=5, штраф за размер гэпа=0,05, размер окна=500 или длина последовательности исследуемого нуклеотида, в зависимости от того, что является короче. Если исследуемая последовательность короче, чем искомая последовательность, в связи с 5'- или 3'-делециями, а не из-за внутренних делеций, то в отношении результатов необходимо провести ручную коррекцию. Это происходит потому, что программа FASTDB не учитывает 5'- и 3'-усечений исследуемой последовательности при расчете процента идентичности. В случае исследуемых последовательностей, усеченных на 5'- или 3'-концах по отношению к искомой последовательности, процент идентичности корректируют посредством расчета числа оснований искомой последовательности, которые представляют собой 5' и 3' исследуемой последовательности, которые не совпадают/не выравнены, в виде процента всех оснований искомой последовательности. Является ли нуклеотид совпадающим/выравненным, определяют по результатам выравнивания последовательности FASTDB. Этот процент затем вычитают из процента идентичности, рассчитанного с помощью вышеуказанной программы FASTDB с использованием определяемых параметров, с получением значения конечного процента идентичности. Это скорректированное значение представляет собой то, что используется для целей настоящего изобретения. Только основания за пределами 5'- и 3'-оснований исследуемой последовательности, как показано с помощью выравнивания FASTDB, которые не совпадают/не выравнены, рассчитывают для целей ручной коррекции значения процента идентичности. Например, исследуемую последовательность из 90 оснований выравнивают по отношению к искомой последовательности из 100 оснований для определения процента идентичности. Делеции происходят на 5'-конце исследуемой последовательности, и, таким образом, выравнивание FASTDB не показывает совпадения/выравнивания первых 10 оснований на 5'-конце. Эти 10 нарушенных оснований представляют собой 10% последовательности (число оснований на 5'-и 3'-концах, которые не совпадают/общее число оснований в искомой последовательности), таким образом, 10% вычитают из значения процента идентичности, рассчитанного с помощью программы FASTDB. Если оставшиеся 90 оснований полностью совпали, то конечный процент идентичности будет составлять 90%. В другом примере исследуемую последовательность из 90 оснований сравнивают с искомой последовательностью из 100 оснований. В этом случае делеции представляют собой внутренние делеции, поэтому на 5' или 3' исследуемой последовательности отсутствуют основания, которые не совпадают/не выравнены по отношению к искомой последовательности. В этом случае процент идентичности, рассчитанный с помощью FASTDB, не корректируется вручную. Снова только основания 5' и 3' исследуемой последовательности, которые не совпадают/не выравнены по отношению к искомой последовательности, корректируют вручную.

В случае наличия полипептида, имеющего аминокислотную последовательность, например, на по меньшей мере 95% "идентичную" искомой аминокислотной последовательности по настоящему изобретению, предполагается, что аминокислотная последовательность исследуемого полипептида является идентичной искомой последовательности за исключением того, что последовательность исследуемого полипептида может включать не более пяти аминокислотных изменений на каждые 100 аминокислот искомой аминокислотной последовательности. Другими словами, для получения полипептида, имеющего аминокислотную последовательность, на по меньшей мере 95% идентичную искомой аминокислотной последовательности, не более 5% аминокислотных остатков в исследуемой последовательности может быть введено, удалено или замещено другой аминокислотой. Эти изменения эталонной последовательности могут происходить в амино- или карбоксиконцевых положениях эталонной аминокислотной последовательности или в любом месте между этими концевыми последовательностями, вставленными как отдельно между остатками в эталонной последовательности, так и в одной или нескольких прилегающих группах в эталонной последовательности.

На практике является ли любой определенный полипептид на по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичным, например, аминокислотным последовательностям, показанным в последовательности, или аминокислотной последовательности, кодируемой депонированным клоном ДНК, может быть определено стандартным путем с помощью компьютерных программ. Предпочтительный способ определения наибольшего общего соответствия между искомой последовательностью (последовательностью по настоящему изобретению) и исследуемой последовательностью, также называемый глобальным выравниванием последовательностей, может быть определен с помощью компьютерной программы FASTDB на основе алгоритма Brutlag et al. (Comp. App. Biosci. (1990) 6:237-245). При выравнивании последовательностей как искомая, так и исследуемая последовательности обе являются нуклеотидными последовательностями или аминокислотными последовательностями. Результатом указанного глобального выравнивания последовательностей является процент идентичности. Предпочтительные параметры, используемые в аминокислотном выравнивании FASTDB, представляют собой матрица=PAM 0, k-строка=2, штраф за неправильное спаривание=1, штраф за связывание=20, длина группы рандомизации=0, граничный балл=l, размер окна=длина последовательности, штраф за гэп=5, штраф за размер гэпа=0,05, размер окна=500 или длина последовательности исследуемой аминокислоты, в зависимости от того, что является короче. Если исследуемая последовательность короче, чем искомая последовательность, в связи с N- или C-делециями, а не из-за внутренних делеций, то в отношении результатов необходимо провести ручную коррекцию. Это происходит потому, что программа FASTDB не учитывает N- или C-концевых усечений исследуемой последовательности при расчете глобального процента идентичности. В случае исследуемых последовательностей, усеченных на N- и C-концах по отношению к искомой последовательности, процент идентичности корректируют посредством расчета числа остатков искомой последовательности, которые представляют собой N- и C-концы исследуемой последовательности, которые не совпадают/не выравнены по отношению к соответствующему исследуемому остатку, в виде процента всех оснований искомой последовательности. Является ли остаток совпадающим/выравненным, определяют по результатам выравнивания последовательности FASTDB. Этот процент затем вычитают из процента идентичности, рассчитанного с помощью вышеуказанной программы FASTDB с использованием определяемых параметров, с получением значения конечного процента идентичности. Это конечное значение процента идентичности представляет собой то, что используется для целей настоящего изобретения. Только остатки на N- и C-концах исследуемой последовательности, которые не совпадают/не выравнены, учитываются для целей ручной коррекции значения процента идентичности. Иными словами, учитываются только положения искомых остатков за пределами самых дальних N- и C-концевых остатков исследуемой последовательности. Только положения остатков за пределами N- и C-терминальных концов исследуемой последовательности, как показано в выравнивании FASTDB, которые не совпадают/не выравнены по отношению к искомой последовательности, корректируют вручную. Никаких других коррекций вручную не выполняется для целей настоящего изобретения.

Встречающиеся в природе варианты белков называются "аллельными вариантами" и относятся к одной из нескольких альтернативных форм гена, занимающего определенный локус на хромосоме организма. (Genes 11, Lewin, B., ed., John Wiley & Sons, New York (1985).) Эти аллельные варианты могут варьировать либо на полинуклеотидном, и/или на полипептидном уровне. В качестве альтернативы, не встречающиеся в природе варианты могут быть получены с помощью методик мутагенеза или с помощью прямого синтеза.

"Метка" относится к средствам, которые способны обеспечивать детектируемый сигнал, как непосредственно, так и посредством взаимодействия с одним или несколькими членами системы образования сигнала. Метки, которые непосредственно детектируются и могут находить применение в настоящем изобретении, включают флуоресцентные метки. Специфические флуорофоры включают флуоресцеин, родамин, BODIPY, цианиновые красители и т. п.

"Флуоресцентная метка" относится к любой метке со способностью испускать свет определенной длины волны при активации светом другой длины волны.

"Флуоресценция" относится к любой детектируемой характеристике флуоресцентного сигнала, в том числе интенсивности, спектру, длине волны, внутриклеточному распределению и т. д.

"Детектирование" флуоресценции относится к определению флуоресценции клетки с помощью качественных или количественных способов. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения флуоресценцию будут детектировать качественным образом. Другими словами, присутствие флуоресцентного маркера будет указывать на то, экспрессируется или не экспрессируется рекомбинантный слитый белок. Для других случаев флуоресценция может быть определена с помощью количественных средств, например, измерения интенсивности, спектра флуоресценции или внутриклеточного распределения, способствующих статистическому сравнению значений при различных условиях. Уровень также может быть определен с помощью качественных способов, таких как визуальный анализ и сравнение человеком нескольких образцов, например, образцов, детектируемых с помощью флуоресцентного микроскопа или другого оптического детектора (например, системы анализа изображений и т. д.). "Изменение" или "модулирование" в флуоресценции относится к любому детектируемому различию интенсивности, внутриклеточного распределения, спектра, длины волны или другого аспекта флуоресценции при определенном условии по сравнению с другим условием. Например, "изменение" или "модулирование" выявляют количественно, а различие представляет собой статистически значимое различие. Любые "изменения" или "модулирования" флуоресценции можно выявить с помощью стандартного инструмента, такого как флуоресцентный микроскоп, CCD или любой другой флуоресцентный детектор, и можно выявить с помощью автоматической системы, такой как интегрированные системы, или они могут отражать субъективную детекцию изменения со стороны наблюдателя-человека.

"Зеленый флуоресцентный белок" (GFP) представляет собой белок, состоящий из 238 аминокислот (26,9 кДа), изначально выделенный из медузы Aequorea victoria/Aequorea aequorea/Aequorea forskalea, которая флуоресцирует зеленым цветом при воздействии синего света. GFP из A. victoria имеет основной пик возбуждения при длине волны 395 нм и второстепенный пик при 475 нм. Его пик излучения происходит при 509 нм, что находится в нижней зеленой части видимого спектра. GFP из морского пера (Renilla reniformis) имеет один основной пик возбуждения при 498 нм. Благодаря возможности широкого применения и растущим потребностям исследователей, были сконструированы многие другие мутанты GFP. Первым основным усовершенствованием была точечная мутация (S65T), описанная в 1995 г. в Nature Roger Tsien. Эта мутация значительно улучшала спектральные характеристики GFP, приводя к повышенной флуоресценции, фотостабильности и сдвигу основного пика возбуждения к 488 нм, при этом пик излучения сохранялся при 509 нм. Добавление точечной мутации, приводящей к эффективности фолдинга при 37°C (F64L), к этому остову приводила к усовершенствованному GFP (EGFP). EGFP имеет коэффициент экстинкции (обозначаемый ε), также известный как его оптическое сечение, 9,13×10-21 м²/молекула, также приводимый в виде 55000 л/(моль•см). Суперскладчатый GFP, ряд мутаций, которые способствуют тому, что GFP быстро складывается и созревает даже при слиянии со слабоскладывающимися пептидами, был описан в 2006 г.

"Желтый флуоресцентный белок" (YFP) представляет собой генетическую мутацию зеленого флуоресцентного белка, происходящего от Aequorea victoria. Его пик возбуждения составляет 514 нм, пик излучения составляет 527 нм.

Используемые в данном документе формы существительного единственного числа включают ссылку на формы множественного числа, если контекст четко не определяет иное.

"Вирус" представляет собой субмикроскопический возбудитель инфекции, который не способен расти или размножаться за пределами клетки-хозяина. Каждая вирусная частица или вирион состоит из генетического материала, ДНК или РНК, в защитной белковой оболочке, называемой капсидом. Форма капсида варьирует от простых спиральных и икосаэдрических (подиэдральных или околосферических) форм, до более сложных структур с хвостами или оболочкой. Вирусы инфицируют клеточные формы жизни и классифицируются на животные, растительные и бактериальные типы, в соответствии с инфицированным хозяином.

Термин "транссинаптический вирус", используемый в данном документе, относится к вирусам, способным мигрировать от одного нейрона к другому соединительному нейрону посредством синапса. Примерами таких транссинаптических вирусов являются рабдовирусы, например, вирус бешенства, и альфагерпесвирусы, например, вирус псевдобешенства или вирус простого герпеса. Термин "транссинаптический вирус", используемый в данном документе, также включает вирусные субъединицы, сами по себе имеющие способность мигрировать от одного нейрона к другому соединительному нейрону посредством синапса и биологических векторов, таких как модифицированные вирусы, включающие такую субъединицу и демонстрирующие способность мигрировать от одного нейрона к другому соединительному нейрону посредством синапса.

Транссинаптическая миграция может быть как антероградной, так и ретроградной. Во время ретроградной миграции вирус будет передвигаться от постсинаптического нейрона к пресинаптическому нейрону. Соответственно, во время антероградной миграции вирус будет передвигаться от пресинаптического нейрона к постсинаптическому нейрону.

Гомологи относятся к белкам, которые имеют общего предшественника. Аналоги не имеют общего предшественника, однако имеют некоторое функциональное (а не структурное) сходство, которое приводит к включению их в класс (например, трипсинподобные серинпротеиназы и субтилизины явно не связаны, их структуры вне активного сайта полностью отличаются, однако они имеют фактически геометрически идентичные активные сайты, и, таким образом, считаются примером конвергентной эволюции аналогов).

Существует два подкласса гомологов - ортологи и паралоги. Ортологи представляют собой одинаковый ген (например, цитохром 'c') у различных видов. Два гена у одного и того же организма не могут быть ортологами. Паралоги представляют собой результаты дупликации генов (например, гемоглобин бета и дельта). Если два гена/белка представляют собой гомологи и находятся в одном и том же организме, они являются паралогами.

Используемый в данном документе термин "нарушение" относится к недомоганию, заболеванию, расстройству, клиническому состоянию или патологическому состоянию.

Используемый в данном документе термин "фармацевтически приемлемый носитель" относится к несущей среде, которая не влияет на эффективность биологической активности активного компонента, является химически инертной и не является токсичной для пациента, которому ее вводят.

Используемый в данном документе термин "фармацевтически приемлемое производное" относится к любому гомологу, аналогу или фрагменту средства, например, идентифицированного с помощью способа скрининга по настоящему изобретению, т. е. является относительно нетоксичным для субъекта.

Термин "терапевтическое средство" относится к любой молекуле, соединению или средству для лечения, которые способствуют предупреждению или лечению нарушений или осложнений нарушений.

Композиции, содержащие такое средство, составленное в совместимом фармацевтическом носителе, можно получить, упаковать и маркировать для лечения.

Если комплекс является водорастворимым, то его можно составить в подходящем буфере, например, фосфатно-солевом буферном растворе или других физиологически совместимых растворах.

В качестве альтернативы, если полученный в результате комплекс характеризуется слабой растворимостью в водных растворителях, то его можно составить с неионогенными поверхностно-активными веществами, такими как Tween или полиэтиленгликоль. Таким образом, соединения и их физиологически приемлемые сольваты могут быть составлены для введения путем ингаляции или инсуффляции (либо через ротовую полость, либо через нос) или путем перорального, буккального, парентерального, ректального введения, или в случае опухолей, непосредственно инъецированы в солидную опухоль.

В случае перорального введения фармацевтический препарат может находиться в жидкой форме, например, растворах, сиропах или суспензиях, или может присутствовать в виде лекарственного продукта для разбавления водой или другой подходящей средой-носителем перед применением. Такие жидкие препараты могут быть получены с помощью стандартных способов с фармацевтически приемлемыми вспомогательными средствами, такими как суспендирующие средства (например, сорбитный сироп, производные целлюлозы или гидрогенизированные пищевые жиры); эмульгирующие средства (например, лецитин или камедь); неводные среды-носители (например, миндальное масло, жирные сложные эфиры или фракционированные растительные масла) и консерванты (например, метил- или пропил-п-гидроксибензоаты или сорбиновая кислота). Фармацевтические композиции могут принимать форму, например, таблеток или капсул, полученных с помощью стандартных средств с фармацевтически приемлемыми вспомогательными веществами, такими как связывающие средства (например, прежелатинизированный кукурузный крахмал, поливинилпирролидон или гидроксипропилметилцеллюлоза); наполнители (например, лактоза, микрокристаллическая целлюлоза или вторичный кислый фосфат кальция); смазывающие средства (например, стеарат магния, тальк или кремний); дезинтегранты (например, картофельный крахмал или натрия крахмал гликолят) или увлажняющие средства (например, лаурилсульфат натрия). Таблетки могут быть покрыты с помощью способов, хорошо известных из уровня техники.

Препараты для перорального введения могут быть подходящим образом составлены для осуществления контролируемого высвобождения активного соединения.

Соединения могут быть составлены для парентального введения с помощью инъекции, например, болюсной инъекции или непрерывной инфузии. Составы для инъекции могут быть представлены в единичной лекарственной форме, например, в ампулах или многодозных контейнерах, с добавлением консерванта.

Композиции могут принимать такие формы, как суспензии, растворы или эмульсии в масляных или водных средах-носителях, и могут содержать вспомогательные вещества, такие как суспендирующие, стабилизирующие и/или диспергирующие средства. В качестве альтернативы, активный компонент может находиться в порошкообразной форме для разбавления подходящей средой-носителем, например, стерильной апирогенной водой, перед применением.

Соединения также могут быть составлены в виде средства для местного применения, такого как крем или лосьон.

Помимо составов, описанных ранее, соединения также могут быть составлены в виде депо-препаратов. Такие составы длительного действия могут быть введены с помощью имплантации (например, внутриглазной, подкожной или внутримышечной) или с помощью внутриглазной инъекции.

Таким образом, например, соединения могут быть составлены с подходящими полимерными или гидрофобными материалами (например, в виде эмульсии в приемлемом масле) или ионообменными смолами, или в виде умеренно растворимых производных, например, в виде умеренно растворимой соли. Липосомы и эмульсии являются хорошо известными примерами сред-носителей или носителей для доставки гидрофильных лекарственных средств.

Композиции могут при необходимости присутствовать в упаковке или дозирующем устройстве, которые могут содержать одну или несколько единичных лекарственных форм, содержащих активный компонент. Упаковка, например, может содержать металлическую или пластиковую фольгу, например, блистерную упаковку. Упаковка или дозирующее устройство могут сопровождаться инструкциями для введения.

В настоящем изобретении также предусмотрены наборы для осуществления терапевтических режимов по настоящему изобретению. Такие наборы содержат в одном или нескольких контейнерах терапевтически или профилактически эффективные количества композиций в фармацевтически приемлемой форме.

Композиция в сосуде или наборе может находиться в форме фармацевтически приемлемого раствора, например, в комбинации со стерильным солевым раствором, раствором декстрозы или буферным раствором, или другой фармацевтически приемлемой стерильной жидкостью. В качестве альтернативы, комплекс может быть лиофилизированным или высушенным; в этом случае набор необязательно дополнительно содержит в контейнере фармацевтически приемлемый раствор (например, солевой раствор, раствор декстрозы и т. д.), предпочтительно стерильный, для разбавления комплекса с образованием раствора для инъекционных целей.

В другом варианте осуществления набор дополнительно содержит иглу или шприц, предпочтительно упакованные в стерильной форме, для инъекции комплекса, и/или упакованный пропитанный спиртом тампон. Инструкции необязательно включены для введения композиций врачом или пациентом.

Восприятие движения при зрительном восприятии позволяет организму выявлять движение в его поле зрения. Это является важным для обнаружения потенциального брачного партнера, жертвы или хищника, и, таким образом, встречается при зрительном восприятии как позвоночных, так и беспозвоночных у многих видов, хотя и не является универсальным свойством, встречающимся у всех видов. У позвоночных этот процесс происходит в сетчатке и более конкретно в ганглионарных клетках сетчатки, которые представляют собой нейроны, которые получают входящую информацию от биполярных клеток и амакринных клеток в отношении зрительной информации и обрабатывают исходящую информацию для более высокорасположенных участков головного мозга, в том числе таламуса, гипоталамуса и среднего мозга.

Ганглионарные клетки, избирательные в отношении направления (DS), в сетчатке определяются как нейроны, которые отвечают дифференциально на направление зрительного раздражителя. В соответствии с Barlow and Levick, этот термин используется для описания группы нейронов, которая "дает значительный разряд импульсов, когда объект-раздражитель движется через ее рецептивное поле в одном направлении". (B. Barlow H., and Levick W. R. "The Mechanism of Directionally Selective Units in Rabbit's Retina". The Journal of Physiology 178.3 (1965): 477-504.). Это направление, на которое совокупность нейронов отвечает наиболее выражено, представляет собой "предпочтительное направление". В отличие от этого, они совсем не отвечают на противоположное направление, "нулевое направление". Предпочтительное направление не зависит от раздражителя, т. е. независимо от размера, формы или цвета раздражителя нейроны отвечают, если он движется в их предпочтительном направлении, и не отвечают, если он движется в нулевом направлении. Существует три известных типа ганглионарных DS клеток сетчатки в сетчатке позвоночных, ON/OFF ганглионарные DS клетки, ON ганглионарные DS клетки и OFF ганглионарные DS клетки. Каждый имеет различные физиологические и анатомические особенности. ON/OFF ганглионарные DS клетки выступают в роли местных детекторов движения. Они активируются в начале и в конце действия раздражителя (источник света). Если раздражитель движется в направлении клеточного предпочтения, то она будет активироваться на переднем и заднем фронте. Их паттерн активации зависит от времени. Анатомические особенности ON/OFF клеток являются таковыми, что дендриты направляются к двум подслоям внутреннего сетчатого слоя и образуют синапсы с биполярными и амакринными клетками. Они имеют четыре подтипа, при этом каждый из них имеет свое предпочтение в направлении. В отличие от ON/OFF ганглионарных DS клеток, которые отвечают как на передний, так и задний фронт раздражителя, ON ганглионарные DS клетки сетчатки являются чувствительными только к переднему фронту. Дендриты ON ганглионарных DS клеток являются моностратифицированными и направляются во внутренний подслой внутреннего сетчатого слоя. Они имеют три подтипа с различными предпочтениями направления. OFF ганглионарные DS клетки сетчатки выступают в роли детектора центростремительного движения, и они отвечают только на задний фронт раздражителя. Они настроены на движение раздражителя вверх. Дендриты являются асимметричными и разветвленными в направлении своего предпочтения.

Если не определено иное, то все технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют то же значение, которое обычно понятно специалисту обычной квалификации в области техники, к которой относится настоящее изобретение. Хотя при осуществлении на практике и тестировании настоящего изобретения могут применяться способы и материалы, подобные или эквивалентные таковым, описанным в данном документе, ниже описываются подходящие способы и материалы. В случае расхождений настоящее описание, включая определения, будет иметь преимущественную силу. Кроме того, материалы, способы и примеры являются исключительно иллюстративными и не предполагаются как ограничивающие.

ПРИМЕРЫ

Генетическая конструкция

Цельногеномные карты метилирования ДНК высокого разрешения получали в клеточном типе, представляющем интерес (ганглиях), для идентификации кандидатных регуляторных участков. Кандидатные энхансеры выбирали на основе наличия специфического в отношении клеточного типа гипометилирования ДНК. Выбранные таким образом элементы подвергали скринингу в отношении экспрессии с помощью высокопроизводительного репортерного анализа in vivo в сетчатке мыши. Специфические в отношении ганглионарных клеток элементы последовательности затем синтезировали и клонировали спереди от минимальной промоторной последовательности ATCCTCACATGGTCCTGCTGGAGTTAGTAGAGGGTATATAATGGAAGCTCGACTTCCAGCTATCACATCCACTGTGTTGTTGTGAACTGGAATCCACTATAGGCCA (SEQ ID NO:2). Кодирующую последовательность ChR2-eGFP вводили непосредственно после этого промотора и оптимизированной последовательности Козака (GCCACC), и после посттрансляционного регуляторного элемента вируса гепатита сурков (WPRE) и сайта полиаденилирования SV40. На нейроны сетчатки нацеливались с помощью AAV серотипа 2/8 с титром в диапазоне от 3,43E+11 до 1,75E+12 GC/мл.

Вирусная трансфекция и получение ткани

Для введения AAV глаза анестезированных животных кололи в склеру недалеко от хрусталики с помощью острой иглы 30 калибра. 2 мкл суспензии частиц AAV инъецировали субретинально с помощью шприца Гамильтона. Через 3 недели выделенные сетчатки фиксировали в течение 30 мин. в 4% PFA в PBS, с последующей стадией промывания в PBS при 4°C. Целые сетчатки обрабатывали 10% нормальной ослиной сывороткой (NDS), 1% BSA, 0,5% Triton X-100 в PBS в течение 1 ч. при комнатной температуре. Обработку моноклональным антителом крысы к GFP (Molecular Probes Inc.; 1:500) и поликлональным антителом кролика к аррестину колбочек мыши (Millipore: 1:200) в 3% NDS, 1% BSA, 0,5% Triton X-100 в PBS осуществляли в течение 5 дней при комнатной температуре. Обработку вторичным антителом осла к Ab крысы с Alexa Fluor-488 (Molecular Probes Inc.; 1:200), антителом к Ig кролика с Alexa Fluor-633 и хехстом осуществляли в течение 2 часов. Срезы промывали, помещали с реагентом, препятствующим выгоранию флуоресценции ProLong Gold (Molecular Probes Inc.), на предметные стекла и фотографировали с помощью лазерного сканирующего конфокального микроскопа Zeiss LSM 700 Axio Imager Z2 (Carl Zeiss Inc.).

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Friedrich Miescher Institute for Biomedical Research

<120> SYNP198, ПРОМОТОР ДЛЯ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ В ГАНГЛИОНАРНЫХ

КЛЕТКАХ СЕТЧАТКИ, ИЗБИРАТЕЛЬНЫХ В ОТНОШЕНИИ НАПРАВЛЕНИЯ

<130> PAT057494

<160> 2

<170> PatentIn версия 3.5

<210> 1

<211> 426

<212> ДНК

<213> Mus musculus

<400> 1

ggttcattgt aagccactgt agtcgtgggt gactcacatc aaaccacccc ttcgggaaca 60

cgatgccgac actgaaacta cataggggag agcaaataaa actgtcttct ctagtttggg 120

gaaattggag cctgccttag ggaaacagtg actaatttac agctagtgtt tggaatgaga 180

tcatctgtca aaataaatgt atctttactt ccttcttgag aggaagcaag ctgttttatg 240

atgttccttg gaatccttaa aaatacagag caacatttac attattaatg atacgcttta 300

ttgctgcagg ctaactaggt ccaaaattgt ccttccatag atggagctgg agagttacac 360

agaagtttgc atatcgagct cttaggtctg catgtacagc taatgtactt gtggaccctg 420

tcacat 426

<210> 2

<211> 106

<212> ДНК

<213> Mus musculus

<400> 2

atcctcacat ggtcctgctg gagttagtag agggtatata atggaagctc gacttccagc 60

tatcacatcc actgtgttgt tgtgaactgg aatccactat aggcca 106

<---

Похожие патенты RU2766353C2

название год авторы номер документа
SYNP161, ПРОМОТОР ДЛЯ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ В ПАЛОЧКОВЫХ ФОТОРЕЦЕПТОРАХ 2016
  • Хартль Доминик
  • Шубелер Дирк
  • Роска Ботонд
  • Кребс Арнауд
  • Юттнер Жозефин
RU2758211C2
ПРОМОТОР, СПЕЦИФИЧЕСКИЙ В ОТНОШЕНИИ КЛЕТОК ПИГМЕНТНОГО ЭПИТЕЛИЯ СЕТЧАТКИ ПРИМАТОВ 2018
  • Юттнер, Жозефин
  • Кроль, Яцек
  • Роска, Ботонд
RU2773940C2
ПОЛИПЕПТИДЫ, ПРОИСХОДЯЩИЕ ИЗ ТРИПТОФАНИЛ-ТРНК-СИНТЕТАЗЫ, И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ РЕГУЛЯЦИИ РАЗВИТИЯ КРОВЕНОСНЫХ СОСУДОВ 2002
  • Шиммель Пол
  • Вакасуги Кейсуке
  • Фрэдлэндер Мартин
RU2297425C2
ПРОТЕИН, СВЯЗАННЫЙ С ЗАБОЛЕВАНИЕМ 2002
  • Левейар Тьерри
  • Саель Жозе Ален
  • Моханд-Саид Саддек
  • Хикс Дейвид
RU2384586C2
АДЕНОАССОЦИИРОВАННЫЕ ВИРУСНЫЕ ВЕКТОРЫ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ МИОЦИЛИНОВОЙ (MYOC) ГЛАУКОМЫ 2015
  • Печан, Питер
  • Скариа, Абрахам
  • Ардингер, Джеффри
RU2746991C2
АДЕНОАССОЦИИРОВАННЫЕ ВИРУСНЫЕ ВЕКТОРЫ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ МИОЦИЛИНОВОЙ (MYOC) ГЛАУКОМЫ 2015
  • Печан Питер
  • Скариа Абрахам
  • Ардингер Джеффри
RU2718047C2
СПОСОБ СОЗДАНИЯ Т-КЛЕТОК, ПРИГОДНЫХ ДЛЯ АЛЛОГЕННОЙ ТРАНСПЛАНТАЦИИ 2015
  • Пуаро Лорен
  • Сурдиве Давид
  • Дюшато Филипп
  • Кабаньоль Жан-Пьерр
RU2752933C2
ОЧИЩЕННЫЙ ИММУНОГЕННЫЙ БЕЛОК, ЕГО ФРАГМЕНТЫ И ПРОИЗВОДНЫЕ 1999
  • Шваб Мартин Э.
  • Чен Майо С.
RU2304585C2
ГЕННОЕ РЕДАКТИРОВАНИЕ ГЛУБОКИХ ИНТРОННЫХ МУТАЦИЙ 2016
  • Жуань, Госян
  • Скариа, Абрахам
RU2759335C2
РАСТЕНИЯ ПШЕНИЦЫ С ПОВЫШЕННОЙ ТОЛЕРАНТНОСТЬЮ К ИМИДАЗОЛИНОНОВЫМ ГЕРБИЦИДАМ 2004
  • Конзак Калвин
  • Бирк Ивона
  • Сингх Биджей
RU2425152C2

Иллюстрации к изобретению RU 2 766 353 C2

Реферат патента 2022 года SYNP198, ПРОМОТОР ДЛЯ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ В ГАНГЛИОНАРНЫХ КЛЕТКАХ СЕТЧАТКИ, ИЗБИРАТЕЛЬНЫХ В ОТНОШЕНИИ НАПРАВЛЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, в частности к выделенной молекуле нуклеиновой кислоты-промотора. Изобретение может быть использовано в качестве эндогенного регуляторного элемента и позволяет осуществлять специфическую экспрессию представляющего интерес гена в ганглионарных клетках сетчатки, избирательных в отношении направления, при условии наличия функциональной связи промотора с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей указанный ген. Изобретение может быть применимо для разработки систем для исследования нейродегенеративных расстройств, восстановления зрения и диагностики различных нарушений глаз. 5 н. и 8 з.п. ф-лы, 1 пр., 1 ил.

Формула изобретения RU 2 766 353 C2

1. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты для управления экспрессией представляющего интерес гена в ганглионарной клетке сетчатки, избирательной в отношении направления, где выделенная молекула нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 1, где указанная выделенная молекула нуклеиновой кислоты эффективно управляет экспрессией гена в ганглионарной клетке сетчатки, избирательной в отношении направления, если последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая указанный ген, функционально связана с указанной выделенной молекулой нуклеиновой кислоты.

2. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты по п. 1, дополнительно содержащая минимальный промотор.

3. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты по п. 2, где минимальный промотор содержит последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 2.

4. Кассета экспрессии для экспрессии представляющего интерес гена, где кассета экспрессии содержит выделенную молекулу нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-3, где указанная выделенная молекула нуклеиновой кислоты функционально связана по меньшей мере с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей представляющий интерес ген, подлежащий экспрессии, в частности, в ганглионарных клетках сетчатки, избирательных в отношении направления.

5. Вектор экспрессии, содержащий кассету экспрессии по п. 4.

6. Вектор экспрессии по п. 5, где указанный вектор экспрессии представляет собой вирусный вектор.

7. Вектор экспрессии по п. 5, где указанный вектор экспрессии представляет собой аденоассоциированный вирусный (AAV) вектор.

8. Применение выделенной молекулы нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-3, кассеты экспрессии по п. 4 или вектора экспрессии по любому из пп. 5-7 для экспрессии представляющего интерес гена в ганглионарной клетке сетчатки, избирательной в отношении направления.

9. Способ экспрессии представляющего интерес гена в ганглионарной клетке сетчатки, избирательной в отношении направления, включающий осуществление трансфекции выделенной клетки, линии клеток или популяции клеток с помощью кассеты экспрессии по п. 4, где выделенная клетка представляет собой ганглионарную клетку сетчатки, избирательную в отношении направления, или линию клеток, или популяцию клеток, содержащую ганглионарную клетку сетчатки, избирательную в отношении направления.

10. Выделенная клетка для экспрессии представляющего интерес гена, где выделенная клетка содержит кассету экспрессии по п. 4 или вектор экспрессии по любому из пп. 5-7.

11. Выделенная клетка по п. 10, где кассета экспрессии или вектор экспрессии стабильно интегрирован в геном указанной выделенной клетки.

12. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-3, кассета экспрессии по п. 4, вектор экспрессии по любому из пп. 5-7, применение по п. 8, способ по п. 9 или выделенная клетка по п. 10 или 11, где продукт представляющего интерес гена представляет собой светочувствительную молекулу.

13. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, кассета экспрессии, вектор экспрессии, применение, способ или выделенная клетка по п. 12, где светочувствительная молекула выбрана из группы, состоящей из галородопсина и канального родопсина.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2022 года RU2766353C2

DATABASE EMBL, SEQ ID NO: AC133200, Mus musculus BAC clone RP23-292C19 from 3, 10.09.2002
DATABASE EMBL, SEQ ID NO: AC127260, Mus musculus BAC clone RP24-315I3 from chromosome 3, 18.07.2002
DOLFERUS R
et al
Differential interactions of promoter elements in stress responses of the Arabidopsis Adh gene, Plant Physiol, 1994, v
Транспортер для перевозки товарных вагонов по трамвайным путям 1919
  • Калашников Н.А.
SU105A1
Очаг для массовой варки пищи, выпечки хлеба и кипячения воды 1921
  • Богач Б.И.
SU4A1

RU 2 766 353 C2

Авторы

Хартль, Доминик

Юттнер, Жозефин

Кребс, Арнауд

Роска, Ботонд

Шубелер, Дирк

Даты

2022-03-15Публикация

2017-11-01Подача