НАБОР ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ ДЛЯ ПОЛУКОЛИЧЕСТВЕННОЙ ОЦЕНКИ СОДЕРЖАНИЯ ДНК КУРИЦЫ В МЯСНОЙ ПРОДУКЦИИ МЕТОДОМ ПЦР В РЕЖИМЕ РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ Российский патент 2022 года по МПК C12Q1/68 

Описание патента на изобретение RU2769226C1

Изобретение относится к области биотехнологии и молекулярной биологии, и может применяться для расчета содержания ДНК курицы {Gallus gallus) (% ДНК) относительно общего количества ДНК млекопитающих и птиц в образце.

В настоящее время разработано множество методик на основе ПЦР (полимеразная цепная реакция) для определения состава мясной продукции, как в качественном, так и в количественном формате. Качественный формат исследования позволяет детектировать только наличие мяса, не заявленного в составе, однако не позволяют дифференцировать возможную фальсификацию продукции от следовых количеств незаявленных мясных ингредиентов. Количественный же формат исследований позволяет не только выявить замену заявленного мяса в продукции другим видом мяса, но и отличить фальсификацию от контаминации продукта на технологической линии.

Как правило, в качественных ПЦР методиках целевыми являются высококопийные последовательности митохондриальной ДНК (мтДНК), что обеспечивает высокую чувствительность таких методик. Для ПЦР методик, направленных на выявление ДНК курицы (Gallus gallus), использование участков мтДНК в качестве таргетных может привести к ложным идентификациям, если производитель использует яйца или яичные продукты. В таком случае, невозможно будет достоверно отличить добросовестное следование рецептуре мясных продуктов, в составе которых заявлены яйца или меланж, от фальсификации более дешевым куриным мясом.

Большинство молекулярно-генетических количественных методик основано на ПЦР в реальном времени. Количественную оценку при использовании ПЦР в реальном времени получают, когда количество видоспецифичной ДНК соотносят с количеством ДНК внутреннего контроля, которым обычно служит последовательность ДНК, консервативная внутри крупного таксона.

В настоящее время большинство отечественных коммерческих наборов реагентов (Синтол, ФБУН ЦНИИЭ Россия) предназначено только для качественной оценки содержания мясных ингредиентов. Существует также ряд патентов на тест-системы или наборы олигонуклеотидных праймеров для идентификации ДНК различных видов животных и птиц (курица, свинья, овца, бык, индейка, мышь, крыса, собака, кошка, осетровые рыбы и др.) в продовольственном сырье, кормах и пищевых продуктах (RU 2700480 C1, RU 2702858 C1 RU 2560579 C2, RU 2734035 C1, RU 2332463 C1 и др.).

Например, компания «Синтол» (Россия) предлагает наборы для идентификации сырьевого состава мясной и рыбной продукции методом ПЦР в реальном времени. Производителем заявлено, что при использовании некоторых наборов возможно провести и полуколичественную оценку содержания каждого вида мяса относительно общего содержания мяса или при обнаружении в исследуемом образце 2-х и более видов мяса относительно друг друга в диапазоне более или менее 1%. [URL: http://www.syntol.ru/catalog/nabory-reagentov-dlya-ptsr-v-realnom-vremeni/dlya-identifikatsii-syrevogo-sostava-myasnoy-i-rybnoy-produktsii].

В указанных тест-системах и патентах чаще всего в качестве мишеней используются многокопийные митохондриальные последовательности ДНК, например, фрагменты гена cytB. Недостатком использования таких последовательностей ДНК в количественной ПЦР методике является различия по содержанию митохондрий в клетках тканей, отличающихся по энергетическому и метаболическому профилю. Так, в сердечных мышечных клетках и в нейронах количество митохондриальной ДНК (мтДНК) достигает тысяч копий, а в легких и печени клетки содержат на порядок меньшее число мтДНК. Помимо межтканевых различий существуют значительная индивидуальная вариабельность в количестве мтДНК в одних и тех же тканях.

Например, есть существенные возрастные различия по количеству митохондрий в клетках сердечной мышцы.

Целью настоящего изобретения является разработка набора олигонуклеотидных праймеров и зондов для ПЦР в реальном времени, используемой для полуколичественной оценки содержания ДНК курицы в мясной продукции, сырье и полуфабрикатах (кроме консервов).

Техническим результатом заявленного изобретения является высокая специфичность набора олигонуклеотидов, который позволяет дифференцировать возможную фальсификацию мясной продукции от следовых количеств незаявленных мясных ингредиентов курицы и от присутствия яичных продуктов.

Заявленный технический результат достигается конструированием набора специфичных олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентных зондов для сравнения содержания ДНК курицы (Galus galus) и ДНК внутреннего контроля, которым служит консервативный у птиц и млекопитающих участок генома. Преимуществом данного изобретения является использование однокопийных хромосомных мишеней (фрагменты Rarres1 и VE1800) вместо традиционных митохондриальных, что позволяет снизить избыточную чувствительность ПЦР и избавиться от проблемы ложных идентификаций из-за применения яиц или яичных продуктов.

Выбранные олигонуклеотиды имеют следующую структуру:

Rarres-F GTGAATGAGATCCACGGAAAGA

Rarres-R CTGCCCTAACTCTGCTGAAA

Rarres-Z (R6G) - CAGCAAAGGGTGAAGGAGGGATCA - (BHQ1)

VE1800-F GCTGCTTGCCTCATTTCATATC

VE1800-R AACTTGCACACTAATTCCCTTTG

VE1800-Z (Cy5) - TTATGACAGGGCTGCAGCCAAGAT - (BHQ2)

Полуколичественная оценка содержания ДНК курицы основана на применении ПЦР в реальном времени для сравнения количества ДНК курицы (ген Rarres1) и ДНК внутреннего контроля (элемент VE1800). Оба участка геномной ДНК детектируют в одной пробирке в двух независимых ПЦР с использованием специфичных праймеров и зондов, меченых разными флуоресцентными красителями. Полученные значения порогового цикла ПЦР используют для расчета содержания ДНК курицы (% ДНК) относительно общего количества ДНК млекопитающих и птиц.

Аналитическая чувствительность ПЦР с использованием данного набора олигонуклеотидов составляет 5*103 копий/см3. Предел обнаружения составляет: 0,01% ДНК курицы для сырой мясной продукции; 0,05% ДНК курицы для продукции, подвергавшейся кулинарной обработке (кроме консервированной). Специфичность набора олигонуклеотидов составляет 100% при исследовании контрольной панели ДНК из образцов тканей позвоночных различных классов (птицы, млекопитающие, рыбы), беспозвоночных (головоногие, ракообразные), растений, а также яиц и меланжа.

Применение настоящего набора олигонуклеотидов в отличие от перечисленных выше аналогов распространяется на мясную продукцию, в том числе подвергавшуюся термической обработке; сырье для ее производства на всех этапах переработки; мясные полуфабрикаты; кулинарные мясные изделия (кроме консервов).

Следует отметить, что однокопийные хромосомные мишени для качественного выявления видоспецифичной ДНК курицы не применимы. Полуколичественную оценку содержания ДНК курицы с использованием настоящего набора олигонуклеотидов необходимо проводить только после качественного подтверждения наличия ДНК курицы в исследуемом образце.

На первом этапе для выбора и анализа целевых мишеней использовали референсные репрезентативные геномы сельскохозяйственных животных и птицы, опубликованные в базе данных NCBI. К анализу были добавлены референсный геном человека (Homo sapiens) и геномы животных, ДНК которых может попасть в анализируемые пробы из-за контаминации на производстве, при хранении продуктов, при отборе проб - мыши (Mus musculus), серой крысы (Rattus norvegicus) и кошки (Felis catus). Подбор олигонуклеотидных праймеров и зондов производили на онлайн-ресурсе «PCR Primer Design», оценивали оптимальную температуру отжига, возможность образования димеров и «шпилек». Специфичность праймеров и зондов оценивали биоинформатически при помощи онлайн-ресурса «Primer-Blast».

В качестве видоспецифичного для курицы участка геномной ДНК был выбран однокопийный хромосомный ген Rarres1, последовательность которого высокополиморфна среди птиц. Для внутреннего контроля была выбрана последовательность однокопийного хромосомного элемента VE1800, которая высококонсервативна у млекопитающих, птиц и рептилий.

Технический результат достигается высокой степенью гомологии выбранных олигонуклеотидов Rarres-F, Rarres-R, Rarres-Z с фрагментом гена Rarres1 у курицы (Galus galus) и значительным отличием от нуклеотидных последовательностей других представителей класса птиц Aves; высокой степенью гомологии выбранных олигонуклеотидов VE1800-F, VE1800-R, VE1800-Z с фрагментом геномного элемента VE1800 млекопитающих и птиц, а также отсутствием формирования шпилек с температурой плавления выше комнатной температуры.

Далее были оптимизированы условия амплификации: концентрации праймеров и зондов, температура отжига и длительность основных стадий амплификации.

Материалом для исследования служат образцы мясной продукции, в том числе подвергавшейся термической обработке; сырья для ее производства на всех этапах переработки; мясных полуфабрикатов; кулинарных мясных изделий (кроме консервированной продукции).

Выделение ДНК осуществляют сорбционным методом. Проводят мультиплексную ПЦР в одной пробирке в конечном объеме 25 мм3 со следующим составом реакционной смеси:

• 10 мм3 ДНК-матрицы;

• 10 мм3 ПЦР-смеси-1 (по 6 пмоль каждого из праймеров Rarres-F, Rarres-R, VE1800-F, VE1800-R; по 3 пмоль каждого из зондов Rarres-Z и VE1800-Z; 0,2 мм3 раствора дНТФ с концентрацией каждого нуклеотида 25 ммоль/дм3 (Синтол, Россия); деионизованная вода);

•0,5 мм3 Taq ДНК-полимеразы (Синтол, Россия);

•5 мм3 ПЦР-буфера с магнием (Синтол, Россия).

Амплификацию осуществляют в приборах Rotor-Gene Q (Qiagen, Германия) или Rotor-Gene 6000 (Corbett Research Pty Ltd., Австралия) в оптимизированном режиме: 95°С - 15 мин; 95°С - 15 с, 62°С - 45 с, 35 циклов. Детектирование результата амплификации (флуоресцентного сигнала) проводится на каналах Cy5/Red для ДНК млекопитающих и R6G/Yellow для ДНК курицы. Результаты амплификации в реальном времени интерпретируют на основании наличия (или отсутствия) пересечения кривой флуоресценции с установленной на уровне 0,05 пороговой линией. Полученные значения порогового цикла ПЦР используют для расчета содержания ДНК курицы (% ДНК) относительно общего количества ДНК млекопитающих и птиц.

Пример 1. Проверка специфичности набора олигонуклеотидов и выявления ДНК курицы и геномного элемента VE1800.

С целью подтверждения специфичности используемой ПЦР, амплификацию ставили с ДНК, выделенной из образцов тканей позвоночных различных классов (птицы, млекопитающие, рыбы), а также беспозвоночных (головоногие, ракообразные) и растений: курицы (Gallus gallus), утки (Anas platyrhynchos), перепела (Coturnix coturnix), домашней индейки (Meleagris gallopavo), быка (Bos taurus), свиньи (Sus scrofa), лошади (Equus caballus), овцы (Ovis aries), кролика (Oryctolagus cuniculus), зайца-русака (Leprus europaeus), лося (Alces alces), косули (Capreolus capreolus), дельфина (Tursiops truncates), норки (Neovison vison), кошки (Felis catus), собаки (Canis lupus familiaris), мыши (Mus musculus), серой крысы (Rattus norvegicus), золотистого хомяка (Mesocricetus auratus), морской свинки (Cavia porcellus), страуса (Struthio camelus camelus), журавля-красавки (Anthropoides virgo), сизого голубя (Columba livia), крокодилового каймана (Caiman crocodilus), трески атлантической (Gadus morhua), северной креветки (Pandalus borealis), кальмара (Teuthida spp.), сои (Glycine max), риса (Oryza sativa), ДНК, выделенной из яиц и меланжа.

В рамках проанализированной панели образцов специфичность составляет 100%. По каналу Yellow (видоспецифичный ген Rarres1) наблюдается амплификация только в ПЦР, где использовали ДНК курицы (Gallus gallus), выделенную из мяса курицы, но не из яичных продуктов. По каналу Red (внутренний контроль VE1800) наблюдается амплификация во всех ПЦР, в которых использовали ДНК млекопитающих, птиц (кроме яиц и меланжа) и рептилий. Таким образом, ПЦР внутреннего контроля обладает необходимой универсальностью для полуколичественной оценки содержания ДНК в мясной продукции.

Отсутствие сигнала в ПЦР с ДНК из яиц и меланжа при использовании данного набора олигонуклеотидов является несомненным преимуществом данного набора и позволяет различать присутствие в образцах мясной продукции яичных продуктов или мяса курицы (продуктов убоя).

Пример 2. Оценка аналитической чувствительности набора олигонуклеотидов для полуколичественной оценки ДНК курицы в мясной продукции.

Для определения аналитической чувствительности набора олигонуклеотидов использовали растворы плазмидной ДНК (на основе вектора pAL2-TA), содержащие соответствующие клонированные фрагменты гена Rarres1 и элемента VE-1800. Положительный контрольный образец (ПКО) представляет собой смесь в равной пропорции растворов плазмидной ДНК Rarres1 и ДНК VE-1800.

Для оценки аналитической чувствительности ПЦР использовали серийные разведения ПКО Rarres1/VE-1800 с начальной концентрацией плазмидной ДНК 5×108 копий/см3, готовили серию из семи десятикратных разведений в ТЕ-буфере. Амплификацию проводили в разные дни, разные исполнители на разных приборах.

За аналитическую чувствительность принимали наименьшую концентрацию ПКО, которая воспроизводимо давала продукт в двух повторах ПЦР (значения Ct<31). Аналитическая чувствительность ПЦР с использованием данного набора олигонуклеотидов составляет 5*103 копий/см3.

Похожие патенты RU2769226C1

название год авторы номер документа
НАБОР ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ДНК ГЕНЕТИЧЕСКИ МОДИФИЦИРОВАННОГО АТЛАНТИЧЕСКОГО ЛОСОСЯ МЕТОДОМ ПЦР В РЕЖИМЕ РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ 2023
  • Богомазова Александра Никитична
  • Путинцева Анастасия Владимировна
  • Крылова Екатерина Викторовна
  • Кирсанова Наталья Александровна
  • Солтынская Ирина Владимировна
  • Киш Леонид Карольевич
RU2808662C1
Набор синтетических олигонуклеотидов для выявления ДНК представителей семейства Оленевые 2018
  • Куцев Максим Геннадьевич
  • Скапцов Михаил Викторович
  • Уварова Ольга Васильевна
  • Иванова Мария Сергеевна
RU2722758C1
Способ определения видовой принадлежности тканей кур и свиней в продовольственном сырье, кормах и пищевых продуктах 2018
  • Котельникова Александра Андреевна
  • Черных Олег Юрьевич
  • Баннов Василий Александрович
  • Донник Ирина Михайловна
  • Лысенко Александр Анатолиевич
  • Кривонос Роман Анатольевич
  • Шевкопляс Владимир Николаевич
  • Кощаев Андрей Георгиевич
  • Дайбова Любовь Анатольевна
  • Дробин Юрий Дмитриевич
  • Малышев Денис Владиславович
  • Егоров Иван Афанасьевич
  • Джавадов Эдуард Джавадович
  • Тюрин Владимир Григорьевич
  • Салеева Ирина Павловна
  • Лоретц Ольга Геннадьевна
  • Дельцов Александр Александрович
  • Кузьминова Елена Васильевна
RU2700479C1
Тест-система для определения видовой принадлежности тканей кур и свиней в продовольственном сырье, кормах и пищевых продуктах 2018
  • Котельникова Александра Андреевна
  • Черных Олег Юрьевич
  • Баннов Василий Александрович
  • Малышев Денис Владиславович
  • Донник Ирина Михайловна
  • Лысенко Александр Анатолиевич
  • Кривонос Роман Анатольевич
  • Шевкопляс Владимир Николаевич
  • Кощаев Андрей Георгиевич
  • Дайбова Любовь Анатольевна
  • Фисинин Владимир Иванович
  • Кочиш Иван Иванович
  • Стекольников Анатолий Александрович
  • Клименко Александр Иванович
  • Шахов Алексей Гаврилович
  • Суханова Светлана Фаилевна
  • Забашта Николай Николаевич
  • Дробин Юрий Дмитриевич
RU2700480C1
НАБОР ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫХ ПРАЙМЕРОВ ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ ДНК ЖИВОТНЫХ В КОРМАХ И МЯСНЫХ ПРОДУКТАХ 2011
  • Прусакова Ольга Вадимовна
  • Глухова Ксения Алексеевна
  • Белецкий Игорь Петрович
RU2560579C2
СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ ТОКСИГЕННЫХ Pasteurella multocida МЕТОДОМ ПЦР В РЕЖИМЕ РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ 2022
  • Яцентюк Светлана Петровна
  • Козлова Александра Дмитриевна
  • Поболелова Юлия Илдаровна
  • Красникова Мария Сергеевна
  • Малик Нина Ивановна
RU2785435C1
Способ детекции ДНК вируса герпеса КРС 6 типа в биологическом материале крупного рогатого скота методом ПЦР в режиме реального времени 2022
  • Яцентюк Светлана Петровна
  • Козлова Александра Дмитриевна
  • Горбачева Наталья Сергеевна
  • Красникова Мария Сергеевна
  • Пчельников Александр Владимирович
RU2787048C1
Способ идентификации ДНК бактерии Ureaplasma diversum в сперме крупного рогатого скота методом ПЦР в режиме реального времени 2021
  • Яцентюк Светлана Петровна
  • Козлова Александра Дмитриевна
  • Поболелова Юлия Илдаровна
  • Горбачева Наталья Сергеевна
  • Лазарева Елена Александровна
RU2770204C1
НАБОР ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ГЕНОВ УСТОЙЧИВОСТИ К ТЕТРАЦИКЛИНАМ ИЗ ГРУППЫ tet У БАКТЕРИЙ МЕТОДОМ ПЦР С ДЕТЕКЦИЕЙ В РЕЖИМЕ "РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ" 2022
  • Иванова Ольга Евгеньевна
  • Прасолова Ольга Владимировна
  • Крылова Екатерина Викторовна
  • Солтынская Ирина Владимировна
  • Кирсанова Наталья Александровна
  • Тимофеева Ирина Александровна
  • Путинцева Анастасия Владимировна
  • Богомазова Александра Никитична
RU2794156C1
НАБОР СИНТЕТИЧЕСКИХ ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ И ДЕТЕКЦИИ ГЕНОВ qnrS и qnrB, ОБЕСПЕЧИВАЮЩИХ УСТОЙЧИВОСТЬ К ФТОРХИНОЛОНАМ БАКТЕРИЙ СЕМЕЙСТВА ENTEROBACTERIACEAE, МЕТОДОМ ПЦР С ДЕТЕКЦИЕЙ В РЕЖИМЕ «РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ» И СПОСОБ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ 2022
  • Киш Леонид Карольевич
  • Прасолова Ольга Владимировна
  • Крылова Екатерина Викторовна
  • Солтынская Ирина Владимировна
  • Тимофеева Ирина Александровна
  • Кирсанова Наталья Александровна
  • Богомазова Александра Никитична
RU2810576C1

Реферат патента 2022 года НАБОР ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ ДЛЯ ПОЛУКОЛИЧЕСТВЕННОЙ ОЦЕНКИ СОДЕРЖАНИЯ ДНК КУРИЦЫ В МЯСНОЙ ПРОДУКЦИИ МЕТОДОМ ПЦР В РЕЖИМЕ РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ

Изобретение относится к области биотехнологии и молекулярной биологии и представляет собой набор олигонуклеотидов для полуколичественной оценки ДНК курицы (Galus galus) в мясной продукции методом ПЦР в реальном времени. Набор содержит праймеры и зонд для выявления видоспецифичной ДНК курицы, комплементарные участку гена Rarres1; праймеры и зонд для выявления ДНК млекопитающих и птиц, комплементарные участку ультраконсервативного геномного элемента VE1800. Набор может применяться для расчета содержания ДНК курицы (% ДНК) относительно общего количества ДНК млекопитающих и птиц в образце. При использовании изобретения возможно дифференцировать фальсификацию мясной продукции от следовых количеств незаявленных мясных ингредиентов курицы и от присутствия яичных продуктов. 2 пр.

Формула изобретения RU 2 769 226 C1

Набор олигонуклеотидов для полуколичественной оценки ДНК курицы (Galus galus) в мясной продукции методом ПЦР в режиме реального времени, характеризующийся тем, что имеет следующий нуклеотидный состав:

Rarres-F GTGAATGAGATCCACGGAAAGA

Rarres-R CTGCCCTAACTCTGCTGAAA

Rarres-Z (R6G) - CAGCAAAGGGTGAAGGAGGGATCA - (BHQ1)

VE1800-F GCTGCTTGCCTCATTTCATATC

VE1800-R AACTTGCACACTAATTCCCTTTG

VE1800-Z (Cy5) - TTATGACAGGGCTGCAGCCAAGAT - (BHQ2)

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2022 года RU2769226C1

НАБОР ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫХ ПРАЙМЕРОВ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВИДОВОЙ ПРИНАДЛЕЖНОСТИ ОСЕТРОВЫХ РЫБ И ПРОДУКЦИИ ИЗ НИХ 2007
  • Мюге Николай Сергеевич
  • Барминцева Анна Евгеньевна
RU2332463C1
Тест-система для определения видовой принадлежности тканей кур и свиней в продовольственном сырье, кормах и пищевых продуктах 2018
  • Котельникова Александра Андреевна
  • Черных Олег Юрьевич
  • Баннов Василий Александрович
  • Малышев Денис Владиславович
  • Донник Ирина Михайловна
  • Лысенко Александр Анатолиевич
  • Кривонос Роман Анатольевич
  • Шевкопляс Владимир Николаевич
  • Кощаев Андрей Георгиевич
  • Дайбова Любовь Анатольевна
  • Фисинин Владимир Иванович
  • Кочиш Иван Иванович
  • Стекольников Анатолий Александрович
  • Клименко Александр Иванович
  • Шахов Алексей Гаврилович
  • Суханова Светлана Фаилевна
  • Забашта Николай Николаевич
  • Дробин Юрий Дмитриевич
RU2700480C1
T
KOZLOVA, Safety and quality control raw meat and meat products in Russia, Russian Journal of Agricultural and Socio-Economic Science, N 5 (5), 2012, p.33-38, найдено в Интернет 25.01.2022, адрес сайта https:docviewer.yandex.ru/view/0/?*.

RU 2 769 226 C1

Авторы

Гергель Мария Александровна

Богомазова Александра Никитична

Солтынская Ирина Владимировна

Крылова Екатерина Викторовна

Зайцева Елена Витальевна

Путинцева Анастасия Владимировна

Даты

2022-03-29Публикация

2021-09-14Подача